Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека

Лебедев, Игорь Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека"

На правах рукописи

Лебедев Игорь Николаевич

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА

03 00 15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 2008

003446991

Диссертация выполнена в лаборатории цитогенетики Государственного учреждения Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные консультанты академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Пузырёв Валерий Павлович

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Назаренко Сергей Андреевич I

Официальные оппоненты член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор, Воевода Михаил Иванович

доктор биологических наук, профессор Рубцов Николай Борисович

доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич

Ведущая организация ГУ Медико-генетический научный центр РАМН,

г. Москва

Защита диссертации состоится « » на утреннем заседании

диссертационного совета Д-003 011 01 в Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу 630090, г Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10 тел (383)333-12-78, e-mail dissov@bionet nsc ш

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан « /I

Ученый секретарь > ^___

диссертационного совета — хТТ^Р^^

доктор биологических наук у А Д Груздев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетическая регуляция активности генов, обеспечивающая установление и поддержание их дифференциальной экспрессии (Holhday, 1991; Голубовский, 2000, Li, 2002, Jablonka, Lamb, 2005, Чураев, 2006) Согласно современным представлениям, под эпигенетическими процессами понимают наследуемые, стабильные, но потенциально обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушениями их нуклеотидной последовательности (Russo et al, 1996, Bird, 2002, Ванюшин, 2006) Молекулярной основой эпигенетических феноменов являются кова-лентные модификации структуры хроматина, представленные метилированием ДНК и модификациями гистоновых белков Подобные изменения ответственны за осуществление таких генетических процессов как дифференциальная экспрессия генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, репрессия мобильных генетических элементов (Robertson, Wolfe, 2000, Costello, Plass, 2001) Нарушение этих процессов через повреждение эпигенетических механизмов приводит к аномалиям развития организма человека, проявляющимся в виде особого класса патологии, который предложено называть эпигенетическими болезнями (Beaudet, 2002) Примерами таких заболеваний являются болезни геномного импринтинга (Hall, 1990, Баранов, 1991, Пузырев, 1995, Reik, Walter, 2001), хроматиновые болезни (Johnson, 2000, Hendnch, Bickmore, 2001, Назарен-ко, 2004, Santos-Rebougas, Pimentel, 2007) Значительным является вклад аберрантных эпигенетических модификаций генома в развитие злокачественных новообразований (Feinberg et al, 2002, Немцова, Залетаев, 2004, Киселёва, Киселёв, 2005) Обсуждается роль эпигенетических нарушений и в этиологии мультифак-ториальных заболеваний (Petroms, 2001, Pembrey, 2002, Whitelaw, 2006)

Интенсивно накапливающаяся информация о патогенетической значимости аберрантных эпигенетических модификаций обусловливает актуальность исследований, направленных на изучение молекулярных и онтогенетических механизмов возникновения эпимутаций (Holhday, 1987, 1991, Horsthemke, 2006) Показано, что особенностью ранних этапов онтогенеза млекопитающих является тотальное эпигенетическое репрограммирование генома, заключающееся в закономерном чередовании волн деметшшрования и рсмстилирования ДНК в половых клетках и на начальных стадиях развития зародыша (Li, 2002, Dean et al, 2003, Sasaki, Matsui, 2008) Эпигенетическое репрограммирование обеспечивает удаление аберрантных эпигенотипов, последовательную индукцию тотипотент-ности и дифференциальной экспрессии генов Нарушения этих процессов могут вести к формированию аберрантных эпигенотипов, обусловливающих установление и долговременное поддержание аномальных профилей генной экспрессии, приводящих к патологии развития организма (Dohnoy et al, 2007, Gicquel et al, 2008) Однако до сих пор остается неустановленным вклад аномальных эпигенетических модификаций генома в нарушение эмбрионального периода онтогенеза, который у человека характеризуется высокой частотой репродуктивных потерь - около 60 % зигот элиминируется на пре- и ранних постимплантационных этапах развития, а 15-20% клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра (Macklon et al, 2002) Доминирующим фактором, обусловливающим раннюю остановку эмбрионального развития у человека, являются геномные мутации, представленные в основном чи-

еловыми нарушениями хромосом (Назаренко, 1993, Griffin, 1996, Hassold, Hunt, 2001, Баранов, Кузнецова, 2007) Что касается внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, то генетические причины прекращения их развития остаются, как правило, неустановленными

Одной из групп генов, в обеспечении функций которых существенная роль отводится эпигенетическим механизмам, являются импринтированные гены Их моноаллельная экспрессия определяется родительским происхождением активного аллеля и связана с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей, формирующимся строго специфичным образом в гаметоге-незе (Reik, Walter, 2001, Solter, 2006, Trasler, 2006) Нарушение функций им-принтированных генов, большинство из которых вовлечены в регуляцию диф-ференцировки плацентарных и плодных тканей, рассматривается как весомый фактор нарушений внутриутробного развития млекопитающих (Туско, 2006) В экспериментах на мышах было показано, что однородительские дисомии хромосом (ОРД), содержащих импринтированные локусы, как правило, несовместимы с нормальным прохождением эмбрионального развития (Cattanach, Jones, 1994) В то же время попытки найти ОРД у внутриутробно погибших эмбрионов человека пока не увенчались заметным успехом (Fritz et al, 2001, Kondo et al, 2004, Tsukishiro et al, 2005) Учитывая эпигенетический характер регуляции экспрессии импринтированных генов можно предположить, что ожидаемый негативный эффект нарушений их дозы в эмбриональном периоде онтогенеза человека будет связан не только с формированием ОРД, но и с эпимутациями - аномалиями дифференциального метилирования регуляторных областей Для изучения разнообразия и эффектов эпимутаций возникает необходимость в их систематизации, учитывающей стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов генома

Следующим аспектом действия аберрантных эпигенетических процессов может оказаться возрастание частоты мутаций Этот эффект наиболее изучен при злокачественной трансформации клеток, при которой глобальное деметили-рование генома, с одной стороны, и аномальное метилирование промоторов генов репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптоза, с другой стороны, сопровождают появление микросателлитной и хромосомной нестабильности (Costello, Plass, 2001, Femberg, 2001, Geigl, 2008) Что касается эмбрионального периода развития, то имеются сообщения о повышенной частоте мутаций мик-росателлитных последовательностей ДНК в клетках погибших эмбрионов (Kians et al, 1996, Spandidos et al, 1998), а также данные о высоком уровне хромосомного мозаицизма при нарушениях пре- и постимшантационных стадий онтогенеза (Harper et al, 1995, Griffin et al, 1997, Delhanty, 2005, Vorsanova et al, 2005) Наличие высокой частоты мозаичных кариотипов свидетельствует о том, что наряду с ошибками мейотической сегрегации хромосом, существенную роль в возникновении летальных геномных мутаций могут играть и нарушения митотиче-ского распределения хромосом в соматических клетках зародыша Однако цито-генетические и молекулярные механизмы индукции хромосомного нерасхождения и, как следствие, возникновения мозаицизма в эмбриональном периоде онтогенеза остаются неясными

Отмечено, что максимальное накопление мозаичных нарушений кариотипа приходится на этап дробления бластомеров (Los et al, 2004), причем эта особен-

ность характерна и для других изученных видов млекопитающих (Shi et al, 2004) Поскольку преимплантационный период развития характеризуется интенсивной эпигенетической реорганизацией генома, то не исключено, что нарушения этого процесса могут приводить к формированию аберрантных профилей экспрессии генов, ответственных за поддержание геномной стабильности, а также тех локусов, функционирование которых является принципиально важным для обеспечения нормального эмбрионального развития организма.

Цель исследования заключалась в установлении вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека.

Задачи исследования:

1 Установить спектр и частоту хромосомных аномалий при эмбриональной гибели у человека и разработать подходы к оценке факторов, оказывающих влияние на достоверность регистрации цитогенетических показателей при анализе репродуктивных потерь

2 Оценить вклад однородительского наследования хромосом во внутриутробную гибель эмбрионов с нормальным кариотипом.

3 Обосновать подходы к систематизации эпимутаций импринтированных генов и предложить их классификацию

4 Определить роль эпимутаций импринтированных локусов генома в нарушении эмбрионального развития человека

5 Провести сравнительный анализ частоты гамстических мутаций микроса-теллитных последовательностей ДНК в семьях с нормальной репродуктивной функцией и в супружеских парах с невынашиванием беременности

6 Оценить частоту соматических мутаций микросателлитных повторов ДНК при нарушениях эмбрионального развития

7 Изучить цитогенетические механизмы возникновения мозаичных форм нарушений кариотипа при ранней эмбриональной гибели

8 Определить роль эпигенетической инактивации генов контроля клеточного цикла в формировании хромосомного мозаицизма при нарушении внутриутробного развития

Научная новизна работы. Основным научным результатом исследования явилось определение роли аберрантных эпигенетических модификаций генома в детерминации нарушений эмбрионального развития человека Получены новые данные об эпигенетических механизмах, изменяющих дозу импринтированных генов при патологии внутриутробного периода онтогенеза. Впервые показано, что нарушения геномного импринтинга связаны с аномалиями поддержания дифференциального метилирования импринтированных генов в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах развития Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов в геноме человека

развивающихся из зигот с анеуплоидным кариотипом, эпигенетическая инактивация исследованных генов клеточного цикла может сопровождать коррекцию анеуплоидии и также приводить к возникновению хромосомного мозаицизма Обоснованы теоретические подходы к анализу цитогенетических механизмов формирования мозаичных вариантов хромосомного набора в эмбриональном периоде онтогенеза, основанные на учете закономерностей возникновения и распределения клеток с числовыми нарушениями хромосом в производных различных зародышевых листков

Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследования проведена оценка факторов, оказывающих влияние на достоверность цитогенетического анализа хромосомных нарушений в клетках внутриутробно погибших эмбрионов человека Предложен подход к оценке уровня полиплоидизации эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro Разработана математическая модель оценки эффектов контаминации культур клетками материнского организма С ее использованием становится возможной коррекция частоты регистрируемых хромосомных нарушений и показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным кариотипом при проведении цитогенетического анализа Предложенная модель может быть использована в качестве одного из элементов контроля качества лабораторных цитогенетических исследований

Разработанные подходы к анализу механизмов формирования хромосомного мозаицизма могут представлять ценность для оценки риска таких клинически значимых феноменов в репродукции человека, как ограниченный плацентарный мозаицизм, гонадный мозаицизм, однородительские дисомии хромосом Результаты исследования могут способствовать повышению эффективности медико-генетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беременности Полученные данные представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной и пре-имплантационной генетической диагностики, акушерства и гинекологии Материалы исследования используются в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей вузов, а также в циклах постдипломной подготовки специалистов

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Предложена классификация эпимутаций импринтированных генов, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных ло кусов

2 Нарушение функций импринтированных генов при патологии эмбрионального развития человека связано с изменениями дифференциального характера метилирования их регуляторных областей Возникновение эпимутаций обусловлено аномалиями поддержания геномного импринтинга в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах онтогенеза

3 Однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором

4 Индукция хромосомного нерасхождения в клетках эмбрионов с нормальным кариотипом ассоциирована с аберрантным метилированием промоторных регионов генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Возникновение эпимутаций приходится на преимплантационный период развития и связано

с нарушением деметилирования родительских геномов при их эпигенетическом репрограммировании

5 Аномальное метилирование генов контроля клеточного цикла на постим-плантационных этапах развития сопровождает коррекцию анеуплоидии мей-отического происхождения с возникновением хромосомного мозаицизма.

6 Мутационный процесс в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК в половых клетках родителей не оказывает заметного влияния на нарушение эмбрионального развития потомства, тогда как в клетках внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором обнаруживаются мутации микросателлитных последовательностей ДНК постзи-готического происхождения

7 Контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на частоту регистрируемых аномалий ка-риотипа и на величину показателя «соотношение полов» в группе внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором

Апробация работы. Результаты исследования были представлены в форме устных докладов на 3 Европейской конференции по количественной молекулярной цитогенетике (Стокгольм, 2002), 38 конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2006), 22-24 Ежегодных конференциях Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (Прага, 2006, Лион, 2007, Барселона, 2008), конференциях Фонда Марии Кюри «Молекулярное профилирование генома» (Амстердам, 2007) и «Взаимодействие генетики, эпигенетики и некодирующих РНК» (Мадрид, 2008), III Международной конференции «Проблемы вида и видообразования» (Томск, 2004), XV Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Чебоксары, 2005), Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); VII и VIII научных конференциях ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН «Генетика человека и патология» (Томск, 2004; 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» (Новосибирск, 2008), научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические диагностические технологии в практическом здравоохранении» (Новосибирск, 2002), «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» (Новосибирск, 2003), «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы» (Москва, 2006), «Молекулярная генетика наследственных заболеваний и нарушений репродукции» (Новосибирск, 2008), школе-семинаре «Актуальные вопросы цитогенетики» (Москва, 2007) Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2005) и Президиума СО РАМН (Новосибирск, 2007), а также на межлабораторных семинарах в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2008) и в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2008)

Публикации. По теме исследования опубликовано 62 работы, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

Структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения Библиографический указатель включает 569 источников, из них 81 - публикации в отечественной литературе, 488 - в зарубежной печати Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и содержит 42 таблицы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом настоящего исследования явились группы спонтанно абортированных эмбрионов человека, медицинских абортусов первого триместра беременности, супружеские пары с невынашиванием беременности, а также семьи с нормальной репродуктивной функцией, имеющие живорожденных детей Проведение исследования было одобрено Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (протокол № 7 от 31 03 2006)

Для работы были использованы внезародышевые ткани 1986 спонтанных абортусов, полученные после оперативного или самопроизвольного прерывания беременности от женщин с диагнозами анэмбриония, неразвивающаяся беременность или собственно спонтанный аборт Ультразвуковая диагностика нарушений внутриутробного развития проводилась в Генетической клинике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН Плацентарные ткани медицинских абортусов были получены от женщин, отказавшихся сохранить нормально протекавшую беременность

Фрагменты плодных оболочек были введены в культуры с целью получения препаратов метафазных хромосом Образцы экстраэмбриональной мезодермы (ЭМ) и цитотрофобласта хориона (ЦХ) от каждого эмбриона хранились при -70 °С для проведения последующих молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических исследований, а также дня анализа статуса метилирования ДНК Выбор данных тканей для проведения исследования был обусловлен их происхождением из производных различных эмбриональных и внезародышевых листков (ЭМ - производная эпибласта, дифференцирующегося из внутренней клеточной массы бластоцисты, ЦХ - производное трофэктодермы), что позволило определить механизмы и стадии возникновения мозаичных хромосомных аномалий и нарушений характера метилирования ДНК в изученных локусах

Ретроспективный анализ частоты тетраплоидных клеток у эмбрионов с тет-раплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме, установленным в ходе цитогенетического исследования, был проведен с помощью двухцветной флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) на интерфазных ядрах некультивированных клеток с центромероспецифичными ДНК-зондами Dl 1Z1 и D17Z1 Присутствие тетраплоидного клона подтверждали, если его частота статистически значимо превышала верхнюю границу доверительного интервала предела обнаружения мутации при интерфазном FISH-анализе Определение предела и его доверительного интервала проводили при обследовании некультивированных тканей контрольной группы 12 медицинских абортусов с нормальным кариотипом в

соответствии с формулами, предложенными Ломаке с соавторами (Lomax et al, 1994) Средняя продолжительность внутриутробного развитая зародышей в анализируемой и контрольной группе не имела статистически значимых отличий

Для исследования эффектов контаминации культур клетками материнского организма был проведен анализ содержания последовательностей ДНК Y-хромосомы у 112 эмбрионов с кариотипом 46,XX, установленным в ходе культивирования клеток Анализ был выполнен с использованием образцов ДНК, выделенных из некультивированных тканей зародышей, с помощью ПЦР с праймерами на гомологичный локус хромосом X и Y - ген амелогенина AMELX (Хр22 3)IAMELY (Ypl 1 2) (Sullivan et al, 1993) Дм регистрации возможных числовых нарушений хромосом, невыявленных у 60 эмбрионов вследствие контаминации, использовался анализ наследования 16 полиморфных тетрануклеотид-ных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 11,16, 19,20 и 21

Анализ однородительского наследования хромосом был проведен в 100 семьях, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом Исследование выполняли с помощью анализа сегрегации 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11,15, 16, 19, 20 и 21 Критериями отбора хромосом являлись локализация в них импринтированных генов, участвующих в регуляции роста и развития плода и плаценты, наличие ор-тологичных с хромосомами мыши участков, ОРД по которым ведет к ранней эмбриональной гибели животных, отсутствие ОРД по исследуемой хромосоме у живорожденных индивидов, регистрация ОРД у спонтанных абортусов в других исследованиях; частое вовлечение хромосомы в мейотическое нерасхождение, увеличивающее риск формирования ОРД

Поиск эпимутаций импринтированных локусов (SNURF-SNRPN', H19, KCNQIOTI, CDKN1C) осуществляли у 84 спонтанных абортусов с нарушениями клеточной пролиферации. 30 эмбрионов имели морфологически определяемую гиперплазию ворсин трофобласта, у 54 зародышей клетки оказались неспособными к нормальной пролиферации в культуре В качестве контрольной группы были обследованы экстраэмбриональные ткани 24 медицинских абортусов Средний возраст родителей и продолжительность внутриутробного развития эмбрионов в сравниваемых группах не имели статистически значимых отличий После бисульфитной конверсии геномной ДНК была проведена метилепецифич-ная ПЦР локусов SNURF-SNRPN, Н19, CDKN1C с использованием праймеров, предложенных в работах Kubota et al, 1997, Poon et al, 2002, Li et al, 2002 Исследование метилирования центра импринтинга KCNQIOTI было выполнено с помощью метилчувствительной ПЦР после обработки геномной ДНК метилчув-ствительной эндонуклеазой Notl в течение 16 час при 37 °С (Engel et al, 2000)

Анализ гаметических мутаций 15 микросателлитных последовательностей ДНК, локализованных на хромосомах 2, 9,11,16, 17, 19 и 21, был проведен в 103 супружеских парах, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом В качестве контрольной группы обследовано 95 семей с нормальной репродуктивной функцией (мать, отец, ребенок) Средний возраст родителей в семьях с невынашиванием беременности и в контрольной выборке на момент рождения ребенка статистически значимо не отличался Критерием регистрации мутации гаметического происхождения являлось наличие у потомка алледя, несовпадающего по своему размеру ни с одним из родительских аллелей исследуемого локуса. При этом вероятность биологического родства определялась при анализе

наследования аллелей как минимум 10 других информативных микросателлит-ных локусов и составляла во всех случаях не менее 99,99 %

Анализ соматических мутаций был проведен через исследование сегрегации аллелей 10 микросатеялитных локусов в 95 семьях с невынашиванием беременности, а также в контрольной группе, представленной 51 медицинским абор-тусом и 102 родителями Продолжительность развития эмбрионов и средний возраст родителей в сравниваемых группах не имели значимых отличий Наличие соматической мутации в исследуемом локусе предполагалось в случае выявления у зародыша с нормальным кариотипом дополнительного третьего аллеля, отличающегося по размеру от двух других аллелей, наследованных от родителей Присутствие мутации принималось после исключения с помощью интерфазного FISH-анализа триплоидии или трисомии, невыявленных вследствие контаминации кулыур клетками матери или хромосомного мозаицизма Критериями отбора ДНК-маркеров для анализа мутаций являлись тетрануклеотидная повторяющаяся последовательность, гетерозиготность не менее 0,70, размер продуктов амплификации не более 300 п н Информация о локализации ДНК-маркеров в геноме, последовательностях праймеров и условиях амплификации была получена из баз данных www genome ucsc edu и www gdb org Частоты аллелей и генотипов, а также их соответствие ожидаемому распределению при равновесии Харди-Вайнберга вычисляли с помощью программы «RxC», основанной на алгоритме, предложенном Рольфом и Бентзеном (Rolf, Bentzen, 1989) Сравнение частот мутаций проводили с использованием ф-критерия Фишера для значений частот, близких к нулю (Лакин, 1973)

Изучение частоты и межтканевого распределения анеуплоидных клеток у 39 эмбрионов с аномальным кариотипом, установленным в ходе цитогенетиче-ского исследования, проводили в некультивированных тканях с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на соответствующие хромосомы Исследуемая выборка была дополнена 11 спонтанными абортусами из архивного материала лаборатории цитогенетики, мозаичный кариотип которых был установлен с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на все хромосомы набора Анализ достоверности межтканевых различий по частотам анеуплоидных клеток проводили с помощью критерия

Исследование статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (RBI, CDKN2A, CDKN2B, P14ARF) было выполнено в экстраэмбриональных тканях 50 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, 20 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и 23 медицинских абортусов Средняя продолжительность развития эмбрионов в исследованных группах не отличалась Метилспецифичную ПЦР проводили с использованием праймеров и условий, предложенных в работах Herman et al, 1996, Esteller et al, 2001, Gonzalez-Gomez et al, 2003 В гене CDKN2A характер метилирования был определен в эк-зоне I с помощью метилспецифичной и метилчувствительной ПЦР (Herman et al, 1996, Xing et al, 1999), а также в промоторе с помощью метилчувствительной ПЦР (Землякова с соавт, 2004), при этом объем контрольной выборки был увеличен до 36 эмбрионов Частоту эпимутаций определяли как отношение числа метилированных аллелей к общему числу проанализированных последовательностей исследуемого локуса.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Цитогенетическое исследование спонтанных абортусов человека

Первым этапом работы явился цитогенетический анализ внутриутробно погибших эмбрионов с целью выделения групп зародышей с нормальным карио-типом и с хромосомными аномалиями для проведения дальнейших разделов исследования Успешное культивирование клеток и стандартный метафазный анализ выполнены для 717 из 1986 спонтанных абортусов, клетки которых были введены в культуры Нормальный хромосомный набор определен у 42,9 % эмбрионов 116 зародышей имели кариотип 46,XY, а 191 - 46,XX Нормальное число хромосом было определено также у 19 из 47 спонтанных абортусов с пузырным заносом, что составило 2,6 % от общего объема выборки

Хромосомные нарушения выявлены у 391 эмбриона (54,5 %) Наиболее частыми аномалиями кариотипа оказались трисомии аутосом - их частота составила 35,8 % от всех выявленных хромосомных аберраций Далее следовала тетраплоидия, частота которой (23,8 %) заметно превышала известные в литературе значения - от 1,7 % (Takahaia et al, 1977) до 14 % (Kalousek, 1993) Наиболее вероятными причинами такого отличия могут служить полиплоидизация эмбриональных фибробластов в длительных культурах in vitro, а также учет тстраплондно-диплоидного мозаицизма. Так, 73 из 93 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом по результатам цитогенетического анализа имели дополнительную эуплоидную клеточную линию, тогда как только у 20 спонтанных абортусов (22 %) были выявлены исключительно тетраплоидные клетки Таким образом, среди всех спонтанных абортусов с хромосомными аномалиями только 5 % эмбрионов имели немозаичный вариант тетраплоидного кариотипа. Интерфазный FISH-анализ некультивированных тканей 30 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме позволил зарегистрировать тетраплоидные клетки только у 13 зародышей (43 %) У всех этих эмбрионов частота тетраплоидных клеток статистически значимо превышала верхнюю границу предела обнаружения мутации (1,40% для ЦХ и 0,99 % для ЭМ) Экстраполируя полученные данные на всю обследованную выборку спонтанных абортусов можно заключить, что частота тетраплоидии в группе эмбрионов с нарушениями кариотипа снизится с 23,8 до 10,2 %, что находится в соответствии с данными литературы.

Частота триплоидии в проведенном исследовании составила 20,5 % Нарушения числа половых хромосом найдены в 11,7 % случаев, при этом на долю моносомии по Х-хромосоме (в чистой и мозаичной форме) пришлось 6,6 % выявленных аномалий кариотипа. Частота структурных перестроек хромосом составила 2,8 % В целом полученные данные по спектру и частоте основных типов хромосомных аномалий (с учетом коррекции частоты тетраплоидии) соответствуют результатам наиболее масштабных цитогенетических исследований спонтанных абортусов (Boue et al, 1975; Hassold et al, 1980, Kline et al., 1987, Kalousek, 1993; Griffin et al, 1997, Menasha et al, 2005)

Необходимо отметить, что полиплоидизация клеток является не единственным феноменом, влияющим на достоверность цитогенетического исследования при анализе репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития Еще одним заметным фактором может выступать контаминация культур клетками материнского происхождения, затрагивающая, по разным оценкам, от 15 до 40 % культур спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX (Griffin et al, 1997, Bell et al, 1999) Предполагается, что материнская контаминация (МК) может приво-

дить к занижению частоты регистрируемых нарушений кариотипа, а также к уменьшению показателя «соотношение полов» в исследуемой выборке Учитывая необходимость анализа спонтанных абортусов с нормальным кариотипом для решения задач, связанных с изучением эпигенетических феноменов, нами была разработана математическая модель для оценки частот кариотипов и достоверности цитогенетического исследования с учетом риска МК Для построения модели предложено использовать коэффициент материнской контаминации (к), равный вероятности обнаружения последовательностей ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX, установленным после культивирования клеток В таблице 1 приведены итоговые формулы для расчета ожидаемых частот кариотипов и определения достоверности проведенного цитогенетического анализа о учетом материнской контаминации Полное математическое обоснование модели изложено в тексте диссертации, а также в публикациях (Никитина и др, 2004, Nikitina et al, 2005)

С помощью анализа локуса амелогенина у 18 из 112 эмбрионов с кариотипом 46,XX, установленным в результате цитогенетического исследования, было обнаружено наличие ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях (£=16%) Отмечено, что продолжительность пролиферации клеток этих спонтанных абортусов до момента фиксации культур и приготовления хромосомных препаратов оказалась статистически значимо выше, чем продолжительность культивирования клеток эмбрионов, не продемонстрировавших наличие последовательностей Y-хромосомы в некультивированных тканях (35,08 ±3,98 и 24,05 ±1,43 дней, соответственно, р = 0,02) Таким образом, позднее вступление клеточных культур в фазу активной пролиферации, на которой обычно получают препараты метафазных хромосом, может являться маркером МК и требует особого внимания в случае установления повышенной частоты эмбрионов с кариотипом 46,XX в исследуемой выборке и при уменьшении показателя соотношения полов

С целью определения пропорций кариотипов, маскируемых МК, к части цитогенетически обследованной группы эмбрионов (Ж =450) была применена предложенная модель Показано, что с учетом МК частота хромосомных аномалий среди зародышей женского пола в исследованной выборке увеличилась с 51,5 до 62,2 % (р = 0,01) Также была отмечена тенденция к возрастанию частоты нарушений кариотипа в общей выборке - с 51,8 до 57,8 % (р = 0,07) Кроме того, наблюдалось увеличение показателя «соотношение полов» в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом - с 0,66 до 1,02 (р = 0,03) Необходимо отметить, что статистическая значимость всех регистрируемых изменений определяется величиной коэффициента к и объемом исследуемой выборки N

Верификация предложенной модели была проведена с помощью анализа наследования аллелей 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-локусов, расположенных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21, в 60 семьях, имевших спонтанный аборт с кариотипом 46,XX, установленным после культивирования клеток Согласно модели, ожидаемая частота нарушений кариотипа при к - 16 % должна составлять 20,7 % (табл 1), т е у 12 эмбрионов можно предполагать наличие невыявленных вследствие МК хромосомных аберраций Использованный набор микросателлитных ДНК-маркеров позволяет детектировать как триплоидии, так и наиболее частые у спонтанных абортусов трисомии по хромосомам 16 и 21 В среднем, эти аномалии составляют около 40 % регистрируемых нарушений кариотипа Следовательно, с помощью данного подхода могли бы быть выявлены

Таблица 1. Моделирование частот кариотипов и вероятности ошибки цитогене-тического анализа спонтанных абортусов с учетом риска контаминации эмбриональных культур клетками материнского организма.

Показатель Наблюдаемое значение Ожидаемое значение

Частота кариотипа 46,XX A/N IN

Частота кариотипа 46,XY CI N IN

Частота эмбрионов женского пола с хромосомными аномалиями BIN IN

Частота эмбрионов мужского пола с хромосомными аномалиями DIN к^з»

Частота хромосомных аномалий в общей выборке (B+D)IN VB+D{I+ лк) L I C+DJ IN

Частота хромосомных аномалий в группе «46,XX» k(B + D) C + D

Соотношение полов у эмбрионов с нормальным кариотипом CIA C+D)J ' ' C+DJ

Вероятность обнаружения любого из вариантов хромосомного набора (В, С или D), пропущенного при цитогенетиче-ском анализе вследствие МК (Q) Ak Ak + C + D

Доля эмбрионов с истинным кариотипом 46,XX в выборке спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX, установленным после культивирования клеток (Afn - female normal) A(l-k)- Ш 4 C + D

Доля кариотипов «46,XX», выявленных при анализе материнских клеток (М) A-A^l-Q) A

Частота эмбрионов с иным хромосомным набором в исследованной выборке (вероятность ошибки, Е) Ak(B + C+D) N(C + D)

Точность цитогенетического анализа (Я1) N(C+D)

Примечание: А - число абортусов с кариотипом 46,XX в обследованной выборке, В - число абортусов женского пола с хромосомными аномалиями, С - число абортусов с кариотипом 46,ХУ, £ - число абортусов мужского пола с хромосомными аномалиями, Ы- объем выборки (Д = А+В+С+Б)

не менее 5 из 12 ожидаемых эмбрионов с хромосомными аберрациями В действительности числовые нарушения хромосом были найдены у 9 спонтанных абортусов (4 случая триплоидии, 4 трисомии по хромосоме 16 и двойная трисо-мия по хромосомам 16 и 20) Все аномалии были подтверждены интерфазным FISH-анализом с центромероспецифичными ДНК-зондами У двух эмбрионов женского пола с трисомией по хромосоме 16 был установлен мозаицизм с наличием нормальной клеточной лиши (с частотой 24 % и 92 %) Клетки с нормальным кариотипом могли иметь преимущество при длительном культивировании т vitro, поэтому ошибочный результат цитогенетического анализа мог бьггь связан как с МК, так и с мозаицизмом У остальных 7 эмбрионов хромосомные аномалии присутствовали в немозаичном состоянии, свидетельствуя о том, что дитогенетический анализ этих зародышей был выполнен на материнских клетках, случайным образом попавших в культуры Таким образом, числовые нарушения хромосом, невыявленные вследствие МК, были обнаружены как минимум у 7 из 60 абортусов с кариотипом 46,XX (11,7 %), что хорошо согласуется частотой 8,3 %, предсказанной моделью и дизайном экспериментальной проверки (р = 0,54) В целом, точность цитогенетического анализа (W) при использованных в настоящей работе условиях культивирования клеток составила 91,8 %

Мутации импринтированных локусов генома при патологии эмбрионального развития

С целью изучения вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриональную гибель в настоящем исследовании был проведен анализ наследования 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2,9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21, в 100 семьях с невынашиванием беременности при нормальном кариотипе в клетках спонтанного абортуса В ходе анализа из дальнейшего исследования были исключены четыре семьи, в которых было выявлено несоответствие аллелей микросателлитных локусов у отца и эмбриона («ложное» отцовство), а также 9 зародышей, продемонстрировавших отклонения от нормального числа хромосом, причиной которых послужила контаминация культур клетками матери, либо хромосомный мозаицизм Таким образом, анализ ОРД был проведен у 87 эмбрионов Ни одного случая ОРД по 8 исследованным хромосомам при информативности анализа, варьировавшей по отдельным локусам в пределах от 55,8 до 89,5 %, обнаружено не было

К настоящему времени опубликованы результаты 7 исследований, направленных на поиск ОРД у спонтанных абортусов (Henderson et al, 1994, Shaffer et al, 1994, Smith et al, 1998, Евдокимова, Назаренко, 2000, Fritz et al, 2001, Kondo et al, 2004, Tsukishiro et al, 2005) При обследовании в общей сложности 392 эмбрионов, с учетом настоящей работы, было найдено 7 абортусов с ОРД по одному случаю ОРД по хромосомам 7 и 9, три случая ОРД по хромосоме 21, из которых у одного эмбриона ОРД сочеталась с двойной трисомией по хромосомам 7 и 9 У одного зародыша была выявлена сегментная ОРД хромосомы 14 Еще один эмбрион имел сегментную ОРД хромосомы 16 Во всех случаях ОРД имела материнское происхождение, что указывает на ведущую роль хромосомного нерасхождения в мейозе у матери в формировании первично анеуплоидных зигот В целом, проанализировано 6156 событий наследования хромосом, из которых найдено только 6 случаев ОРД, не сочетающейся с другими типами хромосомных аномалий Таким образом, частота формирования ОРД составила 1 1000

событий наследования хромосом и оказалась сопоставимой с ожидаемой частотой (1,65 1000), рассчитанной на основании данных о хромосомном нерасхождении в мейозе (Engel, DeLozier-Blanchet, 1991) Вместе с тем, только лишь 2 случая (ОРД хромосомы 7 и сегментная ОРД хромосомы 14) могут рассматриваться в качестве доказательства возможной ассоциации нарушений дозы им-принтированных генов с ранней эмбриональной гибелью Что касается хромосом 9, 16 и 21, то до настоящего времени отсутствует информация о локализации в них импринтированных генов Таким образом, частота абортусов с вариантами ОРД, затрагивающими непосредственно импринтированные гены, составляет только 0,5 % (2/392) Более того, в части исследований (Henderson et al, 1994, Shaffer et al, 1994) поиск ОРД проводился без предварительного цитогенетиче-ского анализа, что не исключает попадания в обследованные выборки эмбрионов с хромосомными нарушениями и еще более снижает полученную оценку вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриолетальность

Необходимо отметить, что ОРД является только лишь одним из механизмов, нарушающих дозу импринтированных генов Поэтому решение вопроса о вкладе мутаций импринтированных локусов генома в нарушение эмбрионального развития человека, решаемое до настоящего времени через поиск ОРД, не должно ограничиваться анализом этого редкого, с цитогенетической точки зрения, феномена. Действительно, образование ОРД зависит от целого ряда мутационных событий, связанных с последовательными нарушениями сегрегации хромосом в мейозе и при последующих митотических делениях эмбриональных клеток Тот факт, что геномный импринтинг является эпигенетическим феноменом и его молекулярные основы связаны с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей генов позволяет выдвинуть предположение о том, что нарушение экспрессии импринтированных локусов в раннем эмбриогенезе человека может быть связано в большей степени с их эпимутациями, чем с ошибками сегрегации хромосом, ведущими к формированию ОРД Очевидно, что в отношении затрагиваемого гена эффекты эпимутаций будут функционально эквивалентны однородительскому наследованию хромосом, содержащих импринтированные гены Эпимутации импринтированных локусов были описаны при биродительском полном пузырном заносе (Van den Veyver, Al-Hussaim, 2006), онкологических заболеваниях (Plass, Soloway, 2002), у пациентов с болезнями геномного импринтинга (синдромы Видемана-Беквита, Энгельмана, Рассе-ла-Сильвера), в том числе и у детей с данными заболеваниями, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Сох et al, 2002, DeBaun et al, 2003, Kagami et al, 2007) Однако разнообразие и закономерности возникновения аберрантных эпигенетических модификаций импринтированных генов при нарушениях эмбрионального развития остаются неизвестными

В настоящем исследовании была предложена классификация эпимутаций импринтированных генов В основу систематизации было положено 3 критерия Так, предложено выделять эпимутации, затрагивающие все или отдельные импринтированные локусы генома, а также центры импринтинга Следующим критерием явилось происхождение эпимутаций, которое может быть связано либо с нарушениями установления импринтинга в гаметогенезе родителей, либо с потерей устойчивости импринтированных локусов к волне эпигенетического ре-программирования генома в соматических клетках эмбриона на самых ранних этапах развития (рис 1) Соответственно, было предложено выделять гамети-

Рис. 1. Динамика эпигенетического репрограммирования генома - материнский и отцовский геномы,

■ ......импринтированные гены, метилируемые на отцовских хромосомах,

-------- - отцовский геном (неимпршггированные локусы),

------ - импринтированные гены, метилируемые на материнских хромосомах,

— — — - материнский геном (неимпринтированные локусы),

•••••••• - импринтированные гены, неметилируемые на материнских хромосомах,

— • ™ ■ импринтированные гены, неметилируемые на отцовских хромосомах

Цифрами обозначены критические периоды репрограммирования импринтированных генов

ческие и соматические эпимутации Наконец, третий критерий дифференцирует эпимутации по их функциональной значимости гипер- либо гипометилирование импринтированных локусов, приводящее к потере импринтинга В таблице 2 представлен спектр теоретически ожидаемых эпимутации, основанный на комбинации двух критериев (происхождение и функциональная значимость), а также приведены примеры некоторых наследственных и онкологических заболеваний, в этиологии которых была продемонстрирована роль нарушений характера метилирования импринтированных генов

С целью установления вклада эпимутаций импринтированных локусов в нарушение эмбрионального развития был проведен анализ статуса метилирования трех центров импринтинга (SNURF-SNRPN, HI 9, KCNQIOTI), координирующих экспрессию кластеров импринтированных генов на хромосомах 11 и 15, а также импринтированного гена CDKN1C, вовлеченного в контроль дифферен-цировки плацентарных тканей В обоих типах внезародышевых тканей (ЭМ и ЦХ) у всех эмбрионов был выявлен дифференциальный характер метилирования SNURF-SNRPN, Н19 и CDKN1C На электрофореграммах выявлялось два продукта метилспецифичной ПЦР, соответствующих неметилированному отцовскому и метилированному материнскому аллелям SNURF-SNRPN, либо неметилированному материнскому и метилированному отцовскому аллелям HI 9 и CDKN1C

Таблица 2. Классификация эпимутаций импринтированных генов

Тип эпимутаций Аберрантное гипометилирование Аберрантное гиперметнлирование

материнского аплеля отцовского аллеля материнского аллеля отцовского аллеля

Гаметические эпимутации Ошибки стирания импринтинга с сохранением метальных групп (КП 1) ЮР2/Н19 (СВБ) ЦИ-СПВ (СПВ), РЕвИМЕЗТ (СРС)

Отсутствие метилирования аллелей, которые должны подвергаться метилированию (КП2) БППЗ, ЦИ-СПВ (СЭ), LIT1 (СВБ, ТНСД), 24С(ТНСД, СВБ) 1GF2/H19 (СРС)

Аберрантное метилирование аллелей, которые не должны метилироваться (КП2) ЮР21Н19 (СВБ) ЦИ-СПВ (СПВ), РЕа/МЕБТ (СРС)

Соматические эпимутации Нарушение защиты метилированных аллелей от демети-лирования при репрограммиро-вании генома (КПЗ) ЦИ-СПВ (мозаичные варианты СЭ), «синдром материнского ги-пометилирова-ния», мозаичные варианты ТНСД частичное гипометилирование IGF2/H19 (СРС)

Нарушение поддержания дифференциального метилирования импринтированных генов в соматических клетках (КП4) LIT! (карцинома пищевода, рак печени), PEG3 (хорион-карцинома) Р73 (карцинома почек, рак легкого) ЮР2/Н19 (опухоль Вильмса, ге-патобласто-мы, рак легких, почек), Р73 (острая лейкемия, лимфома Бер-кнтга), СТЬ2 (карцинома почек) ЦИ-СПВ (мозаичные варианты СПВ), РЕвЗ (рак шейки матки и эндометрия), 2АС (рак яичников)

Примечание. БППЗ - биродительский полный пузырный занос, СВБ - синдром Видема-на-Беквита, СПВ - синдром Прадера-Вилли, СРС - синдром Рассела-Сильвера, СЭ -синдром Энгельмана, ТНСД - транзиторный нсонаталышй сахарный диабет, ЦИ-СПВ -центр импринтинга хромосомы 15, мутации которого ответственны за формирование синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана, КП - критические периоды репрограммщюва-ния в соответствии с рис 1, прочерками обозначены несуществующие типы эпимутаций

KCNQI0T1 -контрольный -локус KvL2

ШШШ

■ Ur*

■500 ■404 ■331

-242

- 190

- 147

-Ш п.в.

pUC19/ Mspl

Что касается центра имприн-тинга КСМд/ОТ!, то у 8 из 84 спонтанных абортусов (9,5 %) было зарегистрировано его гипометилирование на материнском гомологе. Свидетельством гипометилиро-вания явилось отсутствие на электрофореграмме продукта метилчувствительной ПЦР размером 400 п. н., соответствующего материнскому метилированному аллелю КСЩ10Т1 (рис.2). Амплификация нативной ДНК, не обработанной рестриктазой МоЛ, приводила к синтезу продукта, исключая возможность делеции данного локу-са на материнской хромосоме. Теоретически аналогичная картина результатов метилчувствительной ПЦР могла наблюдаться и при одно-родительском наследовании хромосомы 11 от отца, поскольку в этом случае на электрофореграмме также отсутствовали бы метилированные аллели материнского происхождения. Однако у всех эмбрионов наличие ОРД представляется маловероятным событием, поскольку статус метилирования двух других им-принтированных генов в регионе 11р15.5 (Я 19 и С7Ж.¥/С) являлся нормальным. Таким образом, выявленные изменения характера метилирования KCNQ10T1 следует рассматривать как эпимутации.

При сравнительном анализе метилирования KCNQ10T1 в разных тканях было отмечено, что у 7 из 8 абортусов обнаруженные эпимутации затрагивали производные только одного зародышевого листка, т. е. регистрировались либо в ЭМ (5 эмбрионов), либо в ЦХ (2 зародыша). Ещё у одного абортуса для обследования оказалась доступной только ЭМ. Учитывая, что обособление и дифферен-цировка ЦХ и ЭМ происходит уже после этапа имплантации бластоцисты и завершения тотального деметилирования генома, полученные в ходе исследования данные о тканеспецифичности эпимутации указывают на их соматическое происхождение. Наиболее вероятным механизмом возникновения таких эпимутации является потеря эмбриональными клетками способности к поддержанию родительского импринтинга через нарушение воспроизводства характера метилирования ДНК в регуляторных последовательностях импринтированных генов на постимплантационных этапах развития (критический период № 4, рис. 1).

Гипометилирование КСК(2ЮТ1 на материнском гомологе является одной из наиболее частых форм молекулярной патологии, выявляемой у 50 % пациентов с синдромом Видемана-Беквита (ЮеВаип й а1., 2003). Более того, оно отме-

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов метил-чувствительной ПЦР локуса KCNQ10T1.

1 - материнский метилированный аллель в ЦХ эм-

бриона с низкой пролифератавиой активностью клеток in vitro;

2 - гипометилирование материнского аллеля в ЭМ

того же эмбриона;

3 - гипометилирование материнского аллеля в ЦХ

эмбриона с гиперплазией трофобласта;

4 - материнский метилированный аллель в ЭМ того

же эмбриона;

5 - материнский метилированный аллехгь в ЦХ ме-

дицинского абортуса.

чено практически у всех детей с данным синдромом, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Mäher, 2005) Обсуждаемый в современной литературе вопрос о возможном влиянии вспомогательных репродуктивных технологий на увеличение риска рождения детей с болезнями геномного импринтинга (Niemitz, Femberg, 2004, Дыбан А П, Дыбан П А, 2006) делает актуальными исследования механизмов и факторов, вызывающих эпиму-тации импринтированных генов Доминирующей гипотезой является предположение о том, что используемые для культивирования гамет и эмбрионов среды, а также протоколы гормональной гиперстимуляции яичников, могут не обеспечивать нормального установления и поддержания геномного импринтинга в период тотальных эпигенетических модификаций генома половых и соматических клеток (Khosla et al, 2001, Lucífero et al, 2004) Полученные в ходе проведенного нами исследования данные указывают на то, что эпимутации, по крайней мере в локусе KCNQIOTI, могут регистрироваться и при спонтанном прерывании беременностей, наступивших естественным путем Эти результаты свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы, согласно которой технологии искусственного оплодотворения, позволяя преодолевать некоторые репродуктивные барьеры, могут приводить к проявлению у потомства скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, в том числе и несовместимой с нормальным течением эмбриогенеза (Horsthemke, Ludwig et al, 2005) Возможно, что некоторые супружеские пары с нарушениями фертильности или невынашиванием беременности имеют предрасположенность к эпигенетической нестабильности, что делает геном их потомства подверженным эпигенетическим изменениям, независимо от того, использовались или нет методы искусственного оплодотворения

Анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК при нарушении эмбрионального развития

С целью характеристики уровня мутационной изменчивости генома при ранней остановке внутриутробного развитая в настоящем исследовании был проведен анализ частот гаметических и соматических мутаций микросателлит-ных последовательностей ДНК, а также хромосомного мозаицизма в клетках спонтанных абортусов первого триместра беременности Для изучения вопроса о вкладе гаметических мутаций микросателлитных локусов ДНК в этиологию нарушений внутриутробного развития нами был выполнен анализ сегрегации аллелей 15 тетрануклеотидных повторяющихся последовательностей в семьях с невынашиванием беременности (при нормальном кариотипе у спонтанного абортуса) и в супружеских парах с нормальной репродуктивной функцией В исследованных выборках гетерозиготность всех изученных локусов варьировала от 0,80 до 0,94, а число выявленных по каждому локусу аллелей колебалось от 6 до 17 Распределение частот генотипов не отличалось от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга (р > 0,05).

В семьях с невынашиванием беременности было проанализировано 2294 информативных результатов мейоза и обнаружено 10 мутаций - две мутации в локусе D16S2624, по одной мутации - в 8 локусах Средняя частота мутаций составила 4,36x10"3 на локус/гамету/поколение В семьях с нормальной репродуктивной функцией было изучено 1725 событий передачи аллелей микросателлитных локусов от родителей потомкам и выявлено 4 мутации в 4 разных локусах -D17S1185, D19S394, D21S11 и D21S1435 Средняя частота мутаций всего ком-

плекса изученных микросателлитных ДНК-маркеров составила 2,32x10"3 на ло-кус/гамету/поколение Достоверных различий по частоте гаметических мутаций между исследованными группами семей не обнаружено (р = 0,25) Полученные данные свидетельствуют о том, что мутации в микросателлитных ло кусах ДНК в половых клетках родителей потомства с остановкой внутриутробного развития и у родителей живорожденных детей возникают с одинаковой частотой

Следующим разделом работы явился анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, возникающих непосредственно в соматических клетках самих эмбрионов При обследовании 95 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом у 13 зародышей было обнаружено наличие дополнительного аллеля микросателлитного локуса, отличающегося по размеру от двух родительских аллелей, что указывало на возможные соматические мутации Однако дополнительный интерфазный ИБН-анализ показал, что в 4 случаях эмбрионы имели три'плоидный кариотип, невыявленный вследствие материнской контаминации Еще у 5 зародышей были найдены трисомии по хромосомам 16 или 20, в том числе и в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией Таким образом, наличие соматических мутаций было подтверждено только у 4 из 95 эмбрионов (4,2 %) Из 10 изученных локусов мутации были зарегистрированы в четырех, при этом в локусе 0208168 было выявлено два мутационных события, по одной мутации найдено в локусах 01652624, Б16Б685 и 02181413 Один эмбрион имел соматические мутации в двух локусах

В среднем частота соматических мутаций тетрануклсотидных повторов ДНК у спонтанных абортусов составила 5,96x10"3 на локус/поколение (5 мутаций в 839 обследованных генотипах) В то же время в 504 проанализированных генотипах эмбрионов контрольной группы ни одной мутации постзиготического происхождения обнаружено не было (р = 0,01) При сравнительном анализе частот гаметических и соматических мутаций в обследованных выборках достоверных отличий между ними не наблюдалось (р = 0,57) Этот факт, с одной стороны, подчеркивает то, что в основе возникновения мутаций микросателлитных последовательностей в половых и соматических клетках, по-видимому, лежат повреждения общих механизмов репарации ДНК С другой стороны, наличие соматических мутаций исключительно у внутриутробно погибших эмбрионов свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах развития Как правило, появление мутаций микросателлитных последовательностей служит индикатором функциональных нарушений в системе репарации ошибочного спаривания оснований ДНК Полученные данные подтверждают гипотезу об ассоциации нарушений мисс-матч репарации ДНК в соматических клетках с ранней эмбриолетальностью у человека (Кипе а1, 1996) Возможно, что нестабильность генома, выявляемая на уровне повторяющихся последовательностей ДНК, затрагивает не только генетически нейтральные локусы, но и участки генома, играющие существенную роль в раннем развитии организма.

Эпигенетические модификации генов клеточного цикла у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом

Хромосомный мозаицизм, определяемый как наличие у организма, развившегося Из одной зиготы, двух или более клеточных линий с разным кариотипом является следствием нарушений сегрегации хромосом при митотическом деле-

нии клеток Согласно результатам стандартных цитогенетических исследований, около 13-20% спонтанных абортусов имеют мозаичные нарушения кариотипа, ограниченные производными различных зародышевых листков (Kalousek et al, 1992, Lombardi, Dev, 1992, Gnffin et al, 1997) Однако наиболее существенное возрастание частоты мозаицизма наблюдается на преимплантационных этапах дробления бластомеров, когда около 60 % зародышей на стадии 8-клеточной мо-рулы демонстрируют мозаичную хромосомную конституцию (Los et al, 2004) Столь высокая частота хромосомного мозаицизма позволяет рассматривать его в качестве одной из форм нестабильности эмбрионального генома Следует отметить, что увеличение частоты мозаичных кариотипов приходится на период тотального эпигенетического репрограммирования генома на преимплантационных стадиях развития Возможно, что деметилированное состояние гетерохро-матина негативным образом сказывается на точности хромосомной сегрегации, а нарушения последующих этапов установления метилирования ДНК могут приводить к аберрантной эпигенетической инактивации генов, ответственных за контроль клеточного цикла и распределение хромосом

Существенная часть мозаичных эмбрионов элиминирует уже на преимплантационных этапах развития, однако некоторые из них могут проходить имплантацию и продолжать свое развитие Вероятность такого события зависит от типа хромосомной аномалии, вовлеченной в мозаичное состояние, от частоты аномальных клеток, а также от их локализации в производных различных зародышевых листков Кроме того, возникновение мозаицизма возможно и на пост-имплантационных этапах развития В рамках настоящего исследования был проведен анализ особенностей распределения анеуплоидных клеток в тканях эмбрионов с мозаичной хромосомной конституцией На основе разработанной модели формирования хромосомного мозаицизма (Лебедев, Назаренко, 2001) было определено, что в подавляющем большинстве случаев (90 %) возникновение мозаичного кариотипа являлось следствием коррекции анеуплоидии мейотического происхождения в одной или обеих обследованных тканях У остальных эмбрионов возникновение мозаицизма было связано с аномалиями сегрегации хромосом в соматических клетках зародышей, развивающихся из эуплоидных зигот.

Далее спонтанные абортусы с хромосомным мозаицизмом были обследованы на предмет характера метилирования генов RBI, CDKN2A, CDKN2B и P14ARF, вовлеченных в RB- и Р53-зависимые пути регуляции клеточного цикла Анализ проводили в ЦХ и ЭМ с целью определения тканеспецифичности эпиму-таций и периодов их наиболее вероятного возникновения У 9 из 45 эмбрионов (20 %) впервые было зарегистрировано метилирование промоторной области гена RB1 (рис 3) При этом у 5 зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы как в ЭМ, так и в ЦХ, что свидетельствовало о возникновении эпимутаций еще до обособления исследованных тканей (табл 3)

Аберрантное метилирование промотора гена P14ARF (рис 4) было выявлено у 4 из 45 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, что составило 9 % При этом у 2 эмбрионов оно оказалось ограниченным ЦХ, у одного эмбриона - ЭМ, еще у одного зародыша метилированные аллели выявлялись в обеих тканях (табл 3) При анализе статуса метилирования гена CDKN2B у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом ни одной эпимутации обнаружено не было Метилирования генов RBI, P14ARF и CDKN2B также не было найдено в тканях спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и в контрольной группе

500404331 -242190147111 •

pUC19/ UMUMUMUM Mspl 12 3 4 5 6 7 8

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов метилспецифичиой ПЦР промоторного региона гена RB1.

U - неметшшрованный аллель (172 п.н.); М - метилированный алеллъ (172 п.н.);

1 - геномная ДНК из лимфоцитов периферической крови здорового индивида;

2 - геномная ДНК из лимфоцитов периферической крови, обработанная CpG-метилазой M.SssI;

3, 4 - геномная ДНК из ЭМ медицинского абортуса;

5,6- геномная ДНК из ЭМ эмбриона с мо-заицизмом и метилированными аллелями; 7, 8 - геномная ДНК из ЦХ эмбриона с мо-заицизмом с неметилированньш и метилированным аллелями.

1-331

-242

; > ; ¿в*, ■ 1W § -147 i) -111

ми М и М и риС 19/ 1 2 3 4 5 6 Мэр1

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов метилспецифичиой ПЦР промоторного региона гена Р14 АИР. и - неметшшрованный аллель (132 п.н.); М - метилированный алелль (122 п.н.); 1,2- геномная ДНК из ЦХ эмбриона с хромосомным мозаицизмом с метилированным и неметилированным аллелями; 3, 4 - геномная ДНК из ЭМ абортуса с мозаицизмом и неметилированными аллелями;

5 - геномная ДНК из лимфоцитов периферической крови здорового индивида, обработанная СрО-метилщой \lSssl;

6 - геномная ДНК из лимфоцитов периферической крови здорового индивида.

При исследовании характера метилирования гена CDKN2A с помощью метилспецифичиой ПЦР у 22 из 36 эмбрионов контрольной группы (61 %) были выявлены метилированные последовательности в составе экзона I. Для уточнения эпигенетического статуса этого гена в плаценте нормально развивающихся эмбрионов нами были проведены дополнительные исследования. С помощью метилчувствительной ПЦР после предварительного гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой Hpall, метилированные аллели были выявлены у всех 36 эмбрионов. Отличия между результатами исследования, полученными с помощью двух различных подходов, могут быть объяснены анализом 8 потенциальных сайтов метилирования (CpG-динуклеотиды) в составе экзона I в случае применения метилспецифичиой ПЦР и только одного из этих 8 сайтов при использовании метилчувствительной ПЦР.

Имеются противоречивые данные относительно влияния метилирования последовательности экзона I гена CDKN2A на уровень его экспрессии. С одной стороны, сообщается о значимом снижении экспрессии гена при метилировании экзона (Huang et al., 2002; Xue et al., 2004). С другой стороны показано, что метилирование CpG-динуклеотидов в составе экзона I ассоциировано с присоединением метилцитозин-связывающего белка МеСР2, запускающего каскад реакций компактизации хроматина, однако это не препятствует транскрипции. Существенное снижение транскрипции наблюдается только в том случае, если метилирование затрагивает промоторный регион, где наряду с присоединением

Таблица 3. Профили метилирования генов контроля клеточного цикла у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом

№ Циготрофобласт хориона Экстраэмбриональная мезодерма Механизм возникновения мозаицизма Механизм возникновения эпимутаций

Кариотип статус метилирования Кариотип статус метилирования

дш P1S РМелг/ RB1 Р14 W5 Р16ех1

1 47,XY,+7/46,XY (3 97) м/и м/и и/и м/и 46 ДУ м/м м/и и/и м/и Миготическое нерасхождение в ЦХ Нарушение деметшшрования

2 47 ДХ,+8/46,XX (3 97) м/и м/и и/и м/и 46 ДХ м/и и/и и/и м/и Миготическое нерасхождение в ЦХ Нарушение деметилирования

3 45ДУ,-15/46ДУ (18 82) м/и и/и н/о м/и 46,XY м/и и/и н/о м/и Анафазное отставание в ЦХ Нарушение деметшшрования

4 47ДХ,+16/46 ДХ (52 48) м/и и/и и/и м/и 47ДХ,+16/46ДХ (65 35) м/и и/и и/и м/и Коррекция трисомии Нарушение деметилирования

5 47ДУ,+16/46ДУ (24 76) и/и и/и и/и м/и 47 Д Y,+l 6/46,XY (5 95) м/и и/и и/и м/и Коррекция трисомии Аномальное метилирование RB1 в ЭМ

6 47ДХ.+16/46ДХ (74 26) н/о и/и и/и U/U 47 ДХ,+16/46,XX (81 19) м/и и/и и/и и/и Коррекция трисомии —

7 47ДУ,+16/46ДУ (67 33) и/и м/и и/и м/и 47ДУ,+16/46ДУ (82 18) н/о и/и и/и м/и Коррекция трисомии Аномальное метилирование Р14 в ЦХ

8 47 ДХ,+9/46,XX (72 28) и/и и/и и/и м/и 47ДХ.+9/46ДХ (60 40) м/и и/и и/и м/и Коррекция трисомии Аномальное метилирование RB1 в ЭМ

9 47 ДХ,+10/46 ДХ (18 82) м/и и/и и/и м/и 47 ДХ,+10/46,XX (30 70) м/м м/и и/и м/и Коррекция трисомии Нарушение деметилирования

10 47PCYY/46PCY (68 32) м/и в/о н/о н/о 47ДУУ и/и н/о н/о н/о Коррекция анеуплощши в ЦХ Аномальное метилирование RB1 в ЦХ

Примечание: в скобках указано соотношение клеточных клонов в %, установленное с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток, н/о - не обследован, М (Methylated) - метилированный аллель, U (Unmethylated) - неметилиро-ванный аллель, Р14 - промоторный регион гена P14ARF, Р15 - промоторный регион гена CDKN2B (P15INK4B), Р1бех1 -экзон I гена CDKN2A (P16INK4A)

МеСР2 происходит деацетшшрование гистонов и ремоделирование хроматина (Nguyen et al, 2001) Нами был проведен анализ характера метилирования про-моторной области гена CDKN2A с помощью метилчувствительной ПЦР У всех 36 эмбрионов контрольной группы были выявлены метилированные последовательности Таким образом, метилирование наблюдалось как в экзоне I, так и в промоторном регионе

Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о значимости эпигенетической регуляции активности гена CDKN2A в плацентарных тканях Следует отметить, что в литературе имеются сообщения о метилировании ряда опухолесупрессорных генов (PTENRASSF1A) в плаценте человека на протяжении нормально протекающей беременности (Chen et al, 2005, Chiu et al, 2007) Высказывается гипотеза, что такой эпигенетический статус генов может обеспечивать необходимый инвазивный и пролиферативный потенциал клеток плаценты (Chiu et al, 2007) Что касается гена CDKN2A, то его метилирование описано в 20,4 % случаев пузырного заноса и в 40 % хорионкарцином (Xue et al, 2004), а также у 14% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом (Park et al, 2008) Однако, при анализе 10 плацент нормально развивающихся эмбрионов I триместра беременности в одном из исследований (Xue et al, 2004), 5 плацент 1-го и 5 плацент Ill-го триместров в другой работе (Chiu et al, 2007) метилирования данного гена обнаружено не было Необходимо отметить, что во всех этих работах на небольших по объему выборках анализировался исключительно эк-зон I и только с помощью метилспецифичной ПЦР Что касается частоты метилирования последовательности из 8 CpG-динуклеотидов в составе экзона I гена CDKN2A у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, то в нашем исследовании она составила 76 % и статистически значимо не отличалась от соответствующего показателя (61 %) в контрольной группе (р = 0,28)

Таким образом, информативными для анализа связи аберрантного метилирования генов клеточного цикла с возникновением мозаицизма оказались гены RB1 и P14ARF, эпимутации которых были обнаружены у 10 из 50 спонтанных абортусов с мозаичным кариотипом (табл 3) Отсутствие или недостаток протеина pRB в клетке приводит к изменению уровня основных белков-регуляторов клеточного цикла (CDC20, MAD2, циклины В и Е) и, как следствие, к появлению разрывов хромосом, мостов, анеу- и полиплоидии (Knudsen, Knudsen, 2006) Кроме того, нарушение взаимодействий pRB с хроматин-ремоделирующими факторами (HDAC1-3, DNMT, BRC1) обусловливает дефекты центромерного гетерохроматина и нерасхождение хромосом (Gonzalo et al, 2005). Белковый продукт гена P14ARF связывает Р53- и RB-зависимые пути регуляции клеточного цикла, препятствуя взаимодействию Mdm2 и pRB белков, что приводит к накоплению последнего и остановке клеточного цикла. Уменьшение количества или полное отсутствие р14 приводит к снижению уровня pRB (Chang et al, 2007)

С целью определения характера связи между метилированием исследованных генов и возникновением мозаицизма нами были изучены особенности распределения клеток с эпимутациями и с хромосомными нарушениями в производных различных зародышевых листков (трофэктодермы и эпибласта), обособляющихся в период имплантации бластоцисты и характеризующихся разной ди-

намикой установления метилирования Геном клеток трофэктодермы подвергается незначительному метилированию на постимплантационных этапах развития, тогда как уровень метилирования ДНК в производных эпибласта, из которого впоследствии будут развиваться все эмбриональные структуры, существенно возрастает (рис 1)

Известно, что анеуплоидия в эмбриональных клетках может являться следствием нерасхождения гомологичных хромосом в гамегогенезе у родителей, либо возникать при митотическом делении соматических клеток зародыша Однако появление мозаицизма всегда является результатом митотических ошибок на по-стзиготических этапах развития При этом если зигота имеет нормальный карио-тип, то митотическое нерасхождение хромосом будет продуцировать два клона клеток - с трисомией и моносомией Поскольку клетки с моносомией аутосом обычно не жизнеспособны, то в дальнейшем в организме будут присутствовать только два типа клеток - с нормальным кариотипом и с трисомией Маркером митотического нерасхождения в этом случае будет являться невысокая доля анеуплоидного клона, ограниченного, как правило, одним типом ткани Альтернативным механизмом возникновения мозаицизма может являться анафазное отставание хромосомы, приводящее к появлению моносомных клеток, что и было обнаружено в одном из обследованных нами случаев (№ 3, табл 3)

В случае наличия трисомии в зиготе, мозаицизм может быть следствием анафазного отставания дополнительной хромосомы па постзиготических этапах развития Этот механизм, известный как «коррекция трисомной зиготы» (Ка1ошек, 2000), также приводит к формированию двух клеточных клонов - с трисомией и с нормальной хромосомной конституцией Нерасхождение в случае трисомного кариотипа зиготы даст нормальный клеточный клон и тетрасомию, которая обнаруживается в эмбриональных клетках достаточно редко Маркером коррекции выступает небольшой процент эуплоидных клеток, присутствующих в одном или в нескольких типах тканей Однако частота таких клеток в определенной степени зависит и от стадии развития, на которой произошла коррекция, а также от пролиферативной активности нормальных и анеуплоидных клеток

В проведенном нами исследовании суммарная частота эпимутаций генов КВ1 и Р14АНР статистически значимо возрастала от 2,6х10"2 на аллель в группе спонтанных абортусов с высоким уровнем анеуплоидных клеток до 32,5x10"2 на аллель у абортусов с низким уровнем анеуплоидных клеток в обследованных тканях (р < 0,05) Кроме того, эпимутации обнаруживались у абортусов с преимущественной локализацией анеуплоидных клеток либо в экстраэмбриональной мезодерме, либо в цитотрофобласте хориона При этом ни одного случая аберрантного метилирования промоторных регионов исследованных генов у абортусов с равномерным распределением анеуплоидных клеток в производных двух зародышевых листков зарегистрировано не было Полученные данные свидетельствуют об ассоциации псанеспецифичного хромосомного мозаицизма с аномальным метилированием генов контроля клеточного цикла

У эмбрионов с тканеспецифичными хромосомными нарушениями, ограниченными цитотрофобластом (Кг 1-3, табл 3), возникновение мозаицизма было связано с ошибками митотической сегрегации хромосом на постимплантационных этапах дифференцировки трофэктодермы При этом у всех зародышей ме-

тилирование RBI было выявлено как в цитотрофобласте, так и в экстраэмбриональной мезодерме, что свидетельствовало о возникновении эпимутации еще до выделения трофобласта и внутренней клеточной массы, и, соответственно, до появления хромосомного нарушения Поскольку обособление трофэктодермы и внутренней клеточной массы происходит во время имплантации бластоцисты на фоне гипометилированного состояния генома, полученные данные указывают на нарушение процесса деметилирования родительских геномов при эпигенетическом репрограммировании в преимплантационном периоде

У 7 из 10 зародышей возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения до или после обособления цито-трофобласта и экстраэмбриональной мезодермы У эмбрионов с мозаичными трисомиями по хромосомам 16 и 10 в обеих тканях (№ 4 и № 9, табл 3) метилирование промоторного региона гена RB1 также присутствовало в производных обоих зародышевых листков, что может свидетельствовать о потенциальной значимости такого эпигенетического статуса данного гена в механизме коррекции трисомии Ассоциация тканеспецифичного метилирования ЛВ1 с коррекцией анеуплоидии прослеживалась и для эмбрионов № 5, 8 и 10 у всех этих зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы в ткани с более интенсивными процессами коррекции трисомии, приводящими к значимому увеличению частоты эуплоидных клеток, по сравнению с другой тканью При рассмотрении всех возможных случаев формирования мозаицизма за счет коррекции трисомии частота эмбрионов с метилированными последовательностями RB1 в экстраэмбриональной мезодерме составила 27,8 %, тогда как в цитотрофобласте хориона - только 5,7 % (р - 0,04) Полученные данные указывают на то, что метилирование промоторного региона гена RB1 у анеуплоидных зародышей может являться одним из эпигенетических механизмов, который повышает шансы коррекции трисомии с восстановлением нормального числа хромосом При этом вероятность такого события оказывается выше для клеток производных внутренней клеточной массы, из которой впоследствии формируются все эмбриональные ткани. Не исключено, что подобный механизм может обеспечивать выживание некоторой части зародышей с аутосомными трисомиями за счет коррекции анеуплоидии непосредственно в эмбриональных клетках на ранних этапах развития с формированием ограниченного плацентарного мозаицизма

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование было направлено на оценку вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека Предпосылками к его проведению явились, с одной стороны, данные об интенсивных процессах эпигенетической реорганизации генома эмбриональных клеток на начальных этапах онтогенеза, а с другой стороны, отсутствие концепций, удовлетворительно объясняющих высокую частоту внутриутробной гибели зародышей с нормальным хромосомным набором Исследование было сфокусировано на анализе изменчивости характера метилирования промоторных регионов генов, как одного из основных эпигенетических механизмов контроля их экспрессии Предметом изучения явились импринтированные локусы генома, в регуляции экспрессии которых существенное значение отводится эпигенетическим механизмам, а также ряд генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла

Исследование проводилось на выборке спонтанных абортусов, кариотип которых был установлен и верифицирован с использованием комплекса цитоге-нетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа В работе были предложены подходы, позволяющие учитывать возможность возникновения ошибок при проведении цитогенетического анализа клеток внутриутробно погибших зародышей человека, связанных с полиплоиди-зацией эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro, а также с контаминацией культур клетками материнского организма В то же время необходимо отметить, что у части спонтанных абортусов с нормальным кариотипом могут иметься микроструктурные аберрации хромосом, выявить которые с использованием стандартного метафазного анализа не представляется возможным Согласно результатам исследований, выполненных с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации, доля таких эмбрионов может составлять 4-5 % (Schaeffer et al, 2004, Shimokawa et al, 2006)

Изменение баланса дозы родительских геномов вследствие наличия феномена геномного импринтинга признается весомым фактором, нарушающим ранние этапы онтогенеза млекопитающих Вместе с тем, молекулярные и цитогене-тические механизмы, приводящие к нарушению такого баланса в эмбриональном периоде развития человека, за исключением случаев пузырного заноса, до настоящего времени оставались практически неизученными В настоящем исследовании был проведен поиск ОРД у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, однако ни одного случая ошибочного наследования хромосом выявлено не было При обобщении полученных данных с результатами аналогичных исследований было показано, что частота внутриутробно погибших эмбрионов с ОРД по хромосомам, несущим импринтированные гены, не превышает 0,5 % Полученные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии заметного влияния ОРД на нарушение эмбрионального развития человека Однако данный вывод не снимает вопроса о роли мутаций импринтированных локусов генома в этиологии нарушений эмбрионального периода онтогенеза

Учитывая, что экспрессия импринтированных генов контролируется эпигенетическими механизмами, в настоящей работе был проведен анализ дифференциального метилирования ряда импринтированных локусов хромосом 11 и 15 Впервые у эмбрионов с нарушениями клеточной пролиферации обнаружено ги-пометилирование центра импринтинга KCNQ10T1 на материнской хромосоме 11 Получены данные, свидетельствующие о возникновении эпимутаций на постимплантационных этапах развития Принимая во внимания тот факт, что аналогичные эпимутации в локусе KCNQ10T1 зарегистрированы практически у всех детей с синдромом Видемана-Беквита, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения, результаты выполненного исследования подтверждают гипотезу о проявлении у потомства супружеских пар с репродуктивными проблемами скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, несовместимой с нормальным развитием организма

Еще одним ожидаемым эффектом аберрантных эпигенетических модификаций генома могло явиться увеличение частоты мутаций и в целом повышение нестабильности генома при нарушениях эмбрионального развития С целью регистрации этих феноменов в настоящем исследовании были изучены мутации микросателлитных последовательностей ДНК и хромосомный мозаицизм в тканях внутриутробно погибших эмбрионов Исследование микросателлитных ло-

кусов было сфокусировано на сравнительном анализе частоты мутаций гамети-ческого и соматического происхождения при нарушении внутриутробного развития организма Установлено, что мутации микросателлитных последовательностей ДНК возникают примерно с сопоставимой частотой в гаметах родителей, имеющих живорожденных детей, и в супружеских парах с невынашиванием беременности, тогда как соматические мутации микросателлитных последовательностей ДНК были выявлены исключительно в клетках спонтанных аборггусов с нормальным хромосомным набором Полученные данные свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах онтогенеза человека

Данные о мутационном процессе в эмбриональных клетках были дополнены результатами исследования хромосомного мозаицизма, возникновение которого также приходится на постзиготические этапы развития С использованием интерфазного FISH-анализа была изучена частота анеуплоидных клеток и их распределение в производных различных зародышевых листков, что позволило определить механизмы и стадии развития, на которых произошло появление мозаичного кариотипа В результате все эмбрионы были дифференцированы на две группы Первую группу составили спонтанные абортусы с мозаичным кариоти-пом, сформированным вследствие ошибок митотической сегрегации хромосом в клетках зародышей, развивающихся из зигот с нормальным кариотипом Примечательно, что у этих эмбрионов аномальное метилирование гена клеточного цикла RB1 было выявлено в производных трофэкгодермы и внутренней клеточной массы, что свидетельствовало о раннем возникновении эпимутации, предшествующем событию хромосомного нерасхождения

Во второй более многочисленной группе спонтанных абортусов возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения У этих зародышей также была продемонстрирована ассоциация аномального метилирования гена RB1 с возникновением хромосомного мозаицизма Показано, что частота эпимутации оказывается выше в тканях с более интенсивными процессами коррекции трисомии При этом аномальное метилирование было выявлено преимущественно в экстраэмбриональной мезодерме, производной эпибласта, из которого формируются все эмбриональные структуры Возможно, что метилирование некоторых генов, вовлеченных в контроль клеточного деления и сегрегации хромосом, при аутосомных трисомиях мейотического происхождения повышает шансы коррекции анеуплоидии в эмбриональных клетках с восстановлением нормального хромосомного набора Это предположение требует дополнительных исследований, вместе с тем, полученные в ходе настоящей работы данные относительно статуса метилирования еще одного гена клеточного цикла (CDKN2A) в плацентарных тканях контрольной группы зародышей указывают на значимость эпигенетической регуляции клеточного деления в обеспечении нормального эмбрионального развития

Обобщая результаты исследования можно отметить, что нарушения эмбрионального периода онтогенеза человека сопровождаются повышением уровня мутационной изменчивости генома Ее возникновение может являться следствием повреждения некоторых универсальных механизмов регуляции структурно-функциональной организации генома, в том числе и через аберрантные Эпигенетические процессы Наиболее вероятной причиной эпигенетических аномалий являются ошибки репрограммирования генома, приводящие к формированию аберрантных эпигенотяпов, несовместимых с нормальным течением эмбрионального развития Патогенетические механизмы нарушений развития

эмбрионов с аномальными эпигенотипами могут быть связаны, как с повышением частоты мутаций в их соматических клетках, так и с повреждением эпигенетически контролируемых феноменов (в частности, геномного импринтинга), обеспечивающих нормальное течение эмбриогенеза

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что нарушение эмбрионального развития человека может быть обусловлено эпимутациями импринтированных генов У 9,5 % спонтанных абортусов выявлено тканеспецифичное гипометилирование центра импринтинга KCNQ10T1 на материнском гомологе хромосомы 11 Тканеспеци-фичность эпимутаций свидетельствует об их соматическом происхождении после обособления экстраэмбриональных и зародышевых листков на постим-плантационных этапах развития

2 Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов генома человека, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возникают нарушения характера метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных генов

3 Установлено, что однородительская дисомия хромосом 2, 9, И, 15, 16,19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным кариотипом

4 Возникновение хромосомного мозаицизма при нарушениях эмбрионального развития преимущественно связано с механизмом коррекции анеуплоидии мейотического происхождения Только у 10 % эмбрионов мозаичная хромосомная конституция является следствием ошибок митотической сегрегации хромосом в соматических клетках зародыша, развивающегося из зиготы с нормальным кариотипом

5 В плацентарных тканях спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом впервые выявлено метилирование промоторных регионов генов контроля клеточного цикла P14ARF и RB1 с частотой 9 и 20 %, соответственно Установлено, что эпимутации исследованных генов ассоциированы с риском тка-неспецифичного хромосомного нерасхождения Наличие эпимутаций в производных трофэктодермы и внутренней клеточной массы указывает на нарушение деметилирования родительских геномов в ходе их эпигенетического репрограммирования на преимплантационных этапах развития

6 Впервые показано, что метилирование гена RB1 у эмбрионов с апеуплоидией мейотического происхождения повышает вероятность коррекции хромосомного нарушения с возникновением мозаицизма Частота аберрантного метилирования оказывается статистически значимо выше в экстраэмбриональной мезодерме, по сравнению с цитотрофобластом хориона, что свидетельствует о более интенсивных процессах коррекции анеуплоидии в производных внутренней клеточной массы

7 В цитотрофобласте хориона и экстраэмбрионалыюй мезодерме эмбрионов человека в первом триместре беременности имеется метилирование промо-торного региона и экзона I гена CDKN2A, что указывает на значимость эпигенетической регуляции активности данного локуса в обеспечении нормальной дифференцировки плацентарных тканей

8 Частота гаметических мутаций в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК не отличается в потомстве супружеских пар с нормальной репродуктивной функцией и в семьях с невынашиванием беременности, тогда как у 4,2 % спонтанных абортусов с нормальным кариотипом выявляются соматические мутации микросателлитных последовательностей

9 Остановка внутриутробного развития эмбрионов человека в 54,5 % случаев обусловлена аномалиями кариотипа, среди которых доминирующими оказываются числовые нарушения хромосом - трисомия аутосом, моносомия по X-хромосоме и полиплоидия Установлено, что регистрация тетраплоидного кариотипа при цитогенетическом анализе в 57 % случаев связана с полиплоиди-зацией эмбриональных клеток в ходе культивирования in vitro

10 Показано, что контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на регистрируемую частоту нарушений кариотипа и на значение показателя соотношение полов у спонтанных абортусов с нормальным хромосомным набором, а также определяет достоверность цитогенетического анализа репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кашеварова, А А, Саженова, Е А, Лебедев, И Н, Назаренко, С А Статус метилирования импринтированного гена SNRPN при ранней эмбриональной гибели у человека//Бюллетень СО РАМН -2006 -№1(119) -С 101-105

2 Кашеварова, А А, Суханова, Н Н, Толмачёва, Е Н, Саженова, Е А, Лебедев, И Н Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомного мо-заицизма по трисомии 16 при ранней эмбриональной гибели у человека // Генетика человека и патология - Томск Печатная мануфактура, 2007 - Выл 8 -С 231-235

3 Кашеварова А А, Суханова, Н Н, Толмачёва, Е Н, Саженова, Е А, Лебедев, И Н Ретроспективная молекулярно-цитогенетическая характеристика тет-раплоидии при ранней эмбриолетальности у человека // Цитология - 2007 -Т 49 -№4 - С 322-328

4 Лебедев, И Н Современные молекулярно-цитогенетические технологии в репродуктивной биологии и медицине // Медицинская генетика. - 2007 - Т 6 -№ 10 - С 21-26

5 Лебедев, И Н Цигогенетика эмбрионального развития человека, исторические аспекты и современные концепции // Молекулярно-биологические технологии в медицинской пракппсе - Новосибирск Альфа-Виста Н, 2008 - Выл 12 - С 127— 140

6 Лебедев, И Н Эпигенетическая регуляция активности генов при патологии эмбрионального развития человека / Материалы IV Съезда Российского об-ва биохимиков и молекулярных биологов -Новосибирск Арга,2008 -С 243

7 Лебедев,И Н, Кашеварова,А А, Саженова,Е А Оценка статуса метилирования центра импринтинга хромосомы 15 при ранней эмбриолетальности у человека//Медицинская генетика -2005 -Т 4 -№5 -С 217

8 Лебедев, И Н, Назаренко, С А Современные технологии молекулярной цито-генетики в диагностике хромосомных болезней человека // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск Альфа-Виста, 2002 -Вып 2 -С 74-88

9 Лебедев, И H, Назаренко, С А Особенности фенотипической экспрессии ауто-сомных моносомий при патологии постимплантационного развития человека // Онтогенез -2004 -Т 35 -№ 1 -С 53-60

10 Лебедев, И H, Назаренко, С А Эпигенетические модификации генома и рак // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск Альфа-Виста, 2003 -Вып 4 -С 150-157

11 Лебедев, И H, Назаренко, С А Эпигенетические факторы нестабильности генома при патологии пренаталыюго развития человека Н Генетика человека и патология - Томск Печатная мануфактура, 2004 - Выл 7 - С 102-107

12 Лебедев, И H, Никитина, Т В, Назаренко, С А Эпигенетические модификации генома и проблема внутриутробного естественного отбора у человека // Ноосферные знания и технологии Сб науч тр -Томск НТЛ, 2006 -Вып 2 -С 93-105

13 Лебедев,И Н, Никитина,Т В, Суханова,H H, Назаренко,С А Ранняя эмбриональная гибель реальные масштабы мозаичных форм аномалий кариоти-па II Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск Манускрипт, 2001 -Вып 1 -С 49-57

14 Лебедев, И H , Никитина, Т В , Суханова, H H , Токарева, А Г , Назаренко, С А Пренатальный отбор у человека возможная роль эпигенетических нарушений в индукции нестабильности генома / Материалы III Международ конф «Проблемавида и видообразования» - Томск, 2005 -С 300-313

15 Лебедев,И Н, Никитина,ТВ, Токарева,А Г, Суханова,H,H, Назаренко, С А Патогенетические эффекты нестабильности эмбрионального генома в развитии человека//Информационный вестник ВОГИС -2006 -Т 10 -№3 -С 520-529

16 Лебедев, И H, Пузырив, В П Эпигенетические аспекты безопасности вспомогательных репродуктивных технологий // Генетика. - 2007 - Т 43 - № 9 -С 1157-1171

17 Лебедев, И Н, Саженова,Е А Болезни геномного импринтинга и ВРТ роль наследственных факторов или влияние технологий / Материалы Международ науч -практ конф «Иммунологические аспекты репродукции человека» - Новосибирск, 2008 - С 62-64

18 Лебедев, И Н, Толмачёва, Е Н, Кашеварова,А А Эпигенетические аспекты этиологии хромосомного мозаицизма при патологии раннего эмбрионального развития человека ! Сб тр III Международ конф «Фундаментальные науки -медицине» - Новосибирск, 2007 -С 37

19 Лебедев, И H , Толмачёва, Е H, Саженова, Е А, Кашеварова, А А Эпигенетические аспекты патологии эмбрионального развития человека / Сб тр Международ молодежной науч -метод конф «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» -Томск Изд-воТомскогогос ун-та, 2007 - С. 108-109.

20 Лебедев, И H , Толмачёва, Е H , Саженова, Е А, Светланов, А В Эпигенетические факторы риска вспомогательных репродуктивных технологий / Материалы XV Международ конф Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» - Чебоксары, 2005 - С 59-60

21 Лебедев, И H , Черемных, А Д, Назаренко, С А Сравнительная геномная гибридизация возможности и перспективы применения в цитогенетике человека // Медицинская генетика.-2006 -Т 5 -Прил 1 -С 60-64

22 Лебедев, И H, Черемных, А Д, Назаренко, С А, Светлаков, А В Полногеномная амплификация ДНК современные достижения и перспективы использования в преимплантационной генетической диагностике // Проблемы репродукции -2005 -Т 5 - С 60-67

23 Маркова, Е В, Артюхова, В Г, Светлаков, А. В, Лебедев, И Н, Черем-ных, А Д Преимплантационная генетическая диагностика современные подходы / Материалы XV Международ конф Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» - Чебоксары, 2005 -С 54-55

24 Назаренко, М С, Пузырйв, В П, Лебедев, И Н Полиморфизм систем эпигенетической регуляции активности генов при патологии эмбрионального развития // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск: Альфа-Виста Н, 2008 -Выл 12 -С 141-150

25 Назаренко, С А, Лебедев, И Н, Черемных, А Д Современные технологии полногеномной амплификации ДНК в преимппантационной генетической диагностике // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике -Новосибирск Альфа-Висга, 2005 -Вып 7 - С 200-215

26 Никитина, Т В , Лебедев, И Н, Суханова, Н Н, Назаренко, С А Гаметические мутации тетрануклеотидных повторов ДНК в норме и патологии раннего периода онтогенеза человека//Генетика. - 2005 -Т 41 -№7 -С 770-778

27 Никитина, Т В , Лебедев, И Н, Суханова, Н. Н, Саженова, Е А, Назаренко, С А Контаминация культур фибробластов спонтанных аборту сов клетками матери значение для цитогенетического анализа причин эмбриональной летальности//Генетика-2004 -Т 40 - №7 -С 800-809

28 Никитина, Т В , Саженова, Е А, Суханова, Н Н, Лебедев, И Н, Назаренко, С А Оценка роли однородительской дисомии в ранней эмбриональной летальности человека//Онтогенез -2004 -Т 35 -№4 -С 238-246

29 Островерхова, Н В , Назаренко, С А , Лебедев, И Н , Черемных, А Д , Никитина, Т В , Суханова, Н Н Детекция анеуплоидии у спонтанных аборту-сов методом сравнительной геномной гибридизации // Генетика - 2002 - Т 38 -№12 -С 1435-1442

30 Саженова, Е А, Лебедев, И Н Анализ эпимутаций импринтированных локусов хромосомы 11 при ранней эмбриональной гибели у человека // Генетика человека и патология - Томск • Печатная мануфактура, 2007 -Вып 8.-С 247-251

31. Саженова,Е А, Лебедев,И Н Селективная значимость эпимутаций импринтированных генов в эмбриональном периоде развития человека / Материалы IV Съезда Российского об-ва биохимиков и молекулярных биологов - Новосибирск • Арта, 2008 - С 233

32 Саженова,Е А, Лебедев,И Н Цитогенетические и эпигенетические аспекты пузырного заноса // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике-Новосибирск Альфа-ВистаН,2008 -Вьш 12-С 151-161

33 Суханова, Н Н, Лебедев, И Н, Никитина, Т В , Саженова, Е А, Назаренко, С А Структура хромосомных нарушений у 552 спонтанных абортусов Томской популяции// Медицинская генетика. -2002 -№6 - С 271-276

34 Суханова, Н Н, Никитина, Т В, Саженова, Е А, Толмачёва, Е Н, Кашеваро-ва,А А, Назаренко,С А, Лебедев,И Н Цитогенетическая характеристика хромосомных нарушений при ранней эмбриональной летальности // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск Альфа-ВистаН,2008 -Вьш 12 -С 70-77

35 Толмачёва, Е Н, Кашеварова, А А , Суханова, Н Н, Саженова, Е А, Лебедев, И Н Эпигенетическая инактивация гена контроля клеточного цикла RB1 как фактор геномной нестабильности при ранней эмбриональной летальности у человека // Генетика человека и патология - Томск Печатная мануфактура, 2007 -Вьш 8 -С 255-258.

36 Черемных, А Д, Лебедев, И Н, Суханова, Н Н, Назаренко, С А Применение метода сравнительной геномной гибридизации в молекулярной цитогенетике человека//Медицинская генетика -2005 -Т 4 -№ 5 -С 288

37 Kashevarova, А А, Sukhanova, N N , Tolmacheva, Е N , Sazhenova, Е А, Lebedev, I N Pathogenetic effects of tetraploid cells m the different extra-embryonic compartments during early human embryo development И Hum Reprod - 2006 - V 21 - Suppl 1 -P il71-il72

38 Kashevarova, A A, Sukhanova, N N , Tolmacheva, E N , Sazhenova, E A, Lebedev, I N Pathogenetic effects of tissue-specific abnormal cell line compartmentahzation during human embryo development a new insight for tetraploidy from interphase FISH II Third Mane Curie Conference on arrayCGH and Molecular Cytogenetics -2006 - V 3 -P 140

39 Kashevarova, A A, Tolmacheva, E N , Lebedev, I N Epigenetic status of the Gl/S checkpoints genes in miscarriages with chromosomal mosaicism // Cellular Oncology -2007 -V 29 -№2 -P 125-126

40 Kashevarova, A A, Tolmacheva, E N , Sazhenova, E A , Sukhanova, N N , Lebedev, I N Retrospective FISH-analysis of tetraploidy in native extraembryonic tissues of first-tnmester spontaneous abortions with 4n or mosaic 2n/4n karyotype after conventional cytogenetics // Eur J Hum Genet - 2006 - V 14 - Suppl 1 -P 188

41 Lebedev, I N Molecular cytogenetics of recurrent spontaneous abortions // Indian Journal of Medical Research -2006 -V 124 -P 9-10

42 Lebedev, I N , Ostroverkhova, N V , Nazareriko, S A Molecular cytogenetic analysis of cell culture failures by interphase FISH a new data about chromosomal abnormalities m human spontaneous abortions / Thud Euroconference on Quantitative Molecular Cytogenetics - Stockholm, 2002 -P 190-195

43 Lebedev, I N , Ostroverkhova, N V, Nazarenko, S A The incidence of confined placental mosaicism m non-cultured cells of human spontaneous abortions // Eur J Hum Genet-2002 -V 10 -Suppl 1 -Poster0948

44 Lebedev, I N, Ostroverkhova, N V, Nikitina, T V, Sukhanova, N N, Nazarenko, S A Features of chromosomal abnormalities in spontaneous abortion cell culture failures detected by interphase FISH analysis II Eur J Hum Genet - 2004 -

V 12 -№7 -P 513-520

45 Lebedev, I N , Sazhenova, E A Loss of methylation in imprinting control region KVLQTIOTin first-tnmester spontaneous abortions// Eur J Hum Genet -2007 -

V 15 -Suppl 1 -P 110

46 Lebedev, I N, Tolmacheva, E N, Kashevarova, A A, Sazhenova, E A Chromosomal mosaicism and early embryo loss a new insight from the epigenetic points of view// Cellular Oncology -2008 -V 30 -№3 -P 262-263

47 Lebedev, I N , Tolmacheva, E N, Kashevarova, A A , Sazhenova, E A Epigenetics of human placenta a new insight into etiology of chromosomal mosaicism // Hum Reprod -2008 -V 23 -Suppl 1 -P i7-i8

48 Lebedev, I N , Tolmacheva, E N , Sazhenova, E A , Kashevarova, A A Chromosomal mosaicism, DNA methylation and embiyolethahty a possible link between cytogenetic and epigenetic factors in the etiology of embryo aneuploidy // Eur J Hum Genet -2006 -V 14 - Suppl 1 -P 92

49 Lebedev, I N , Tolmacheva, E N, Sazhenova, E A , Kashevarova, A A Epigenetic and cytogenetic mechanisms for chromosomal mosaicism arising m human spontaneous abortions//Hum Reprod -2006 -V 21 -Suppl 1 -P 114—115

50 Nazarenko, S A, Nikitma, T V, Lebedev, I N A model for evaluation of maternal cell contamination in spontaneous abortions cultured cells significance for cytogenetic analysis of prenatal selection factors//Eur J Hum Genet-2004 -V 12 -Suppl 1 -P 121

51 Nazarenko, S A , Nikitma, T V , Lebedev, I N , Sukhanova, N N , Sazhe-nova, E A, Nazarenko, M S, Beljaeva, A Yu Molecular evaluation of maternal cell contamination in spontaneous abortions cultured cells // Am. J Hum Genet, - 2003 -

V 73 -P 306

52 Nikitma, T V, Lebedev, I N, Sukhanova, N N , Sazhenova, E A, Nazarenko, S A A mathematical model for evaluation of maternal cell contamination in cultured cells from spontaneous abortions significance for cytogenetic analysis of prenatal selection factors//Fertility Sterility -2005 -V 83 -№4 -P 964-972

53 Ostroverkhova, N V, Nazarenko, S A, Lebedev, I N , Cheremnykh, A D Detection of chromosomal aneuploidy in spontaneous abortions using comparative genomic hybridization (CGH) // Eur J Hum Genet - 2002 - V 10 - Suppl 1 -Poster 0095

54 Sazhenova, E A, Kashevarova, A A, Lebedev, I. N, Nazarenko, S A Epigenetic status of the SNRPN in human spontaneous abortions // Eur J Hum Genet -2005 -

V 13 -Suppl 1 -P 239

55 Sazhenova, E A, Kashevarova, A A, Lebedev, I N, Nazarenko, S A Search for imprinting center of chromosome 15 epimutations in human spontaneous abortions // Hum Reprod -2006 -V 21 -Suppl l.-P il3-il4

56 Sazhenova, E A, Lebedev, I N, Eremeev, A V, Svetlakov, A V Differential susceptibility of imprinted genes to epimutations under DNA demethylation influence //Eur J Hum Genet -2008 -V 16 - Suppl 2 - P 260

57 Sazhenova, E A, Lebedev, I N, Nazarenko, S A Epimutations of KvDMRl imprinting control region on chromosome 11 m first-trimester spontaneous abortions after non-ART pregnancies//Hum Reprod -2007 -V 22 - Suppl 1 -P il2-il3

58 Tolmacheva, E N, Kashevarova, A A, Lebedev, I N Epigenetic background of chromosomal mosaicism in human miscarriages // Eur J Hum Genet - 2007 - V 15 -Suppl 1 -P 107-108

59 Tolmacheva, E N , Kashevarova, A A , Lebedev, I N Evidence for epigenetic regulation of CDKN2A in human placenta // Eur J Hum Genet - 2008 - V 16 -Suppl 2 -P 131

60 Tolmacheva, E N, Kashevarova, A. A, Lebedev, I N , Sazhenova, E A Linkage between cytogenetic and epigenetic instability in the embryogenesis // Hum Reprod -2007 -V 22 -Suppl 1 -P i9

61 Tolmacheva, E N , Sazhenova, E A, Kashevarova, A A, Lebedev, IN High frequency of RBI aberrant methylation in spontaneous abortions with chromosomal mosaicism//Eur I Hum Genet -2006 -V. 14 -Suppl 1 -P 176

62 Tolmacheva, E N, Sazhenova, E A, Lebedev, I N , Kashevarova, A A Tissue-specific cell line compartmentahzation and aberrant RBI methylation in first-trimester spontaneous abortions with chromosomal mosaicism // Third Mane Curie Conference on arrayCGH and Molecular Cytogenetics -2006 - V 3 -P 141

Подписано в печать 6 08.2008

Тираж 200 экз. Заказ 470

Печать трафаретная Формат 60x84/16

Бумага офсетная Усл.-печ л 2

Издательство ООО «Дельтаплан» 634041, г Томск, ул Тверская, 81 Тел: (3822) 435-400,435-600

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лебедев, Игорь Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Предмет эпигенетики: исторические аспекты.

1.2 Основные закономерности эпигенетической регуляции активности генов.

1.3 Эпигенетические модели патологии человека.

1.4 Геномный импринтинг и его нарушения при аномалиях пре- и постнатального онтогенеза.

1.4.1 Нарушения импринтинга на уровне целого генома.

1.4.2 Однородительские дисомии хромосом в нарушении развития человека.

1.4.3 Хромосомные перестройки, затрагивающие импринтированные гены.

1.4.4 Мутации в центрах импринтинга и импринтированных генах.

1.5 Эпигенетические модификации и нестабильность генома при аномалиях эмбрионального развития человека.

1.5.1 Хромосомный мозаицизм при нарушениях внутриутробного развития

1.5.2 Мутации микросателлитных последовательностей ДНК при патологии эмбрионального развития.

1.5.3 Проблема эпигенетической нестабильности генома при ранней эмбриолетальности у человека.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика обследованных выборок.

2.2 Культивирование фибробластов экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов и приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.2.1 Приготовление препаратов интерфазных ядер клеток экстраэмбриональных тканей для проведения флюоресцентной in situ гибридизации.

2.3 Методы выделения ДНК.

2.3.1 Выделение ДНК из периферической крови.

2.3.2 Выделение ДНК из экстраэмбриональных тканей.

2.3.3 Выделение плазмидной ДНК.

2.4 Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH).

2.4.1 Получение центромероспецифичных ДНК-зондов.

2.4.2 Флюоресцентная in situ гибридизация на интерфазных ядрах.

2.5 Анализ однородительского наследования хромосом.

2.6 Методы анализа мутаций микросателлитных повторов ДНК.

2.7 Методы анализа метилирования ДНК.

2.7.1 Анализ дифференциального метилирования импринтированных локусов генома.

2.7.2 Анализ метилирования генов контроля клеточного цикла.

2.8 Методы статистического анализа.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Цитогенетическое исследование спонтанных абортусов человека.

3.1.1 Оценка контаминации культур эмбриональных фибробластов клетками материнского происхождения.

3.1.2 Ретроспективная молекулярно-цитогенетическая характеристика частоты тетраплоидии при ранней эмбриональной гибели.

3.2 Мутации импринтированных локусов генома при патологии внутриутробного развития.

3.2.1 Оценка вклада однородительской дисомии хромосом в раннюю эмбриолетальность у человека.

Классификация эпимутаций импринтированных генов в геноме человека.

3.2.2.1 Эпимутации импринтинга на уровне целого генома.

3.2.2.2 Эпимутации в центрах импринтинга.

3.2.2.3 Эпимутации в импринтированных генах.

3.2.2.4 Причины возникновения эпимутаций импринтированных генов.

3.2.3 Анализ статуса метилирования импринтированных локусов генома при ранней эмбриональной гибели у человека.

3.3 Мутации микросателлитных последовательностей ДНК при нормальном развитии и при невынашивании беременности.

3.3.1 Гаметические мутации микросателлитных последовательностей ДНК при невынашивании беременности.

3.3.2 Соматические мутации микросателлитных последовательностей ДНК при ранней эмбриональной гибели.

3.4 Эпигенетические модификации генов клеточного цикла у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека"

Изучение механизмов регуляции индивидуального развития организма, наряду с установлением молекулярно-биологических основ нарушений различных этапов онтогенеза, являются приоритетными направлениями исследований в области генетики развития (Рэфф, Кофмен, 1986; Назарен-ко, 1993; Корочкин, 2002; Баранов, Кузнецова, 2007). Традиционно, существование определенных форм патологии у человека объясняется действием генетических или средовых факторов. Однако, наряду с этим, накапливается все большее количество данных, указывающих на то, что здоровье и некоторые формы патологических состояний могут быть обусловлены действием эпигенетических систем реализации наследственной информации (Пузырёв, 1995; Голубовский, 2000; Petronis, 2001; Pembrey, 2002; Бочков, 2002; Гинтер, 2003; Назаренко, 2004; Немцова, Залетаев, 2004; Jablonka, 2004; Horsthemke, 2006; Santos-Rebouqas, Pimentel, 2007).

Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетическая регуляция генома, обеспечивающая установление и поддержание дифференциальной экспрессии генов. Согласно классическому определению, эпигенетика может быть обозначена как «исследование причинных взаимодействий между генами и их продуктами, приводящих к формированию фенотипа» (Waddington, 1942b). В настоящее время определение эпигене-тики в значительной степени трансформировалось, что обусловлено стремительным прогрессом в области изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов (Bird, 2002; Чуриков, 2005; Ванюшин, 2006; Разин, 2006). Согласно современным представлениям, под эпигенетикой понимают «исследование митотически и/или мейотически наследуемых изменений экспрессии генов, не связанных с нарушениями их нуклеотидной последовательности» (Russo et al., 1996). Материальную основу таких изменений составляют обратимые модификации хроматина, представленные метилированием ДНК и ковалентными модификациями гистоновых белков 8

Ng, Bird, 1999; Hendrich, Bickmore, 2001; Саложин и др., 2005). Благодаря функционированию особого класса ферментов - ДНК-метилтрансфераз (Бурьянов, Шевчук, 2005; Ванюшин, 2005), статус метилирования генома воспроизводится в ряду клеточных поколений, обеспечивая долговременное поддержание определенных профилей генной экспрессии.

В соматических клетках организма метилирование ДНК ответственно за поддержание и реализацию таких генетических процессов как регуляция тканеспецифичной экспрессии генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, репрессия мобильных генетических элементов (Robertson, Wolfe, 2000; Plass, Soloway, 2002; Дерфлер, 2005). Нарушение этих фундаментальных процессов через повреждение эпигенетических механизмов приводит к особому классу патологии у человека, который предложено называть эпигенетическими болезнями (Beaudet, 2002). В основе этиологии этих заболеваний лежат нарушения эпигенотипа - стабильные и наследуемые изменения экспрессии генов, не связанные со структурными мутациями в их кодирующей последовательности (Jiang et al., 2004; Horsthemke, 2006; Osborne, Thornton, 2006; Rodenhiser, Mann, 2006; Santos-Rebouqas, Pimentel, 2007). Примерами эпигенетических заболеваний могут служить болезни геномного импринтинга (Hall, 1990; Баранов, 1991; Назаренко, 1994; Пузырёв, 1995; Пузырёв, Назаренко, 1997; Гинтер, 2003; Reik, Walter, 2001), хроматиновые болезни (Johnson, 2000; Hendrich, Bickmore, 2001, Huang et al., 2003; Назаренко, 2004), заболевания, связанные с нарушениями равновероятной инактивации Х-хромосомы (0rstavik, 2006; Minks et al., 2008). Значительным является вклад аберрантных эпигенетических модификаций генома в этиологию злокачественных новообразований (Costello, Plass, 2001; Feinberg et al., 2002, 2004, 2006; Залетаев и др., 2002; Немцова, Залетаев, 2004; Киселёва, Киселёв, 2005) и мультифакториальной патологии (Petronis, 2001, 2006; Wong et al., 2005).

Учитывая интенсивно накапливающуюся информацию о патогенетической значимости аберрантных эпигенетических модификаций генома, 9 особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение молекулярных и онтогенетических механизмов возникновения эпиму-таций (Holliday, 1987, 1991; Horsthemke, 2006). Недавно было установлено, что особенностью ранних этапов онтогенеза млекопитающих является тотальное эпигенетическое репрограммирование генома, затрагивающее как половые клетки, так и начальные стадии развития зародыша (Li, 2002; Dean et al., 2003; Sasaki, Matsui, 2008). Эпигенетическое репрограммирование заключается в закономерном чередовании волн деметилирования и реметилирования ДНК, которые, как предполагают, обеспечивают стирание в гаметах аберрантных эпигенотипов, исключая тем самым их передачу потомству, а также обусловливают последовательную индукцию тоти-потентности и установление дифференциальной экспрессии генов. Высказывается мнение, что нарушение процессов эпигенетического репрограм-мирования может приводить к формированию аберрантных эпигенотипов, обеспечивающих появление аномальных профилей генной экспрессии. В свою очередь, подобные долговременные изменения активности генов, поддерживаемые эпигенетическими механизмами, могут лежать в основе формирования различных форм патологии в постнатальном онтогенезе (Dolinoy et al., 2007; Gicquel et al., 2008). Вместе с тем, спектр и частота аберрантных эпигенетических модификаций генома в эмбриональном периоде развития человека остаются практически неизученными.

Известно, что для человека характерна высокая частота репродуктивных потерь. Согласно некоторым оценкам, шансы наступления беременности, ее нормального протекания и рождения здорового ребенка у женщины в возрасте 20-30 лет составляют всего 21-28% в течение одного менструального цикла (Bonde et al., 1998). Около 60% зигот элиминируется на пре-и ранних постимплантационных этапах развития, а 15-20%» клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра беременности (Головачёв, 1983; Macklon et al., 2002). Установлено, что доминирующим фактором, обусловливающим раннюю эмбрио

10 летальность зародышей человека, являются геномные мутации, представленные в основном числовыми нарушениями хромосом. В среднем около 50% внутриутробно погибших эмбрионов в первом триместре беременности имеют аномалии кариотипа (Кулаженко, 1975; Кулешов, 1979; Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990; Назаренко, 1993; Griffin et al., 1997; Баранов, Кузнецова, 2007). На преимплантационных этапах развития частота регистрируемых хромосомных аберраций, как правило, еще выше и может достигать 60-85% (Harper, Delhanty, 1996; Tempest, Griffin, 2005).

Что касается внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором, то цитогенетические (и генетические) причины остановки их развития остаются неясными. Не исключено, что в некоторых случаях нарушения эмбрионального развития могут быть связаны с аномалиями эпигенетической регуляции активности генов. Основаниями для данного предположения являются, в частности, случаи такой патологии развития эмбриона, как пузырный занос, формирование которого связано с нарушениями дозы импринтированных локусов генома вследствие ошибок сегрегации хромосомных наборов в гаметах и аномалий оплодотворения (Назаренко, 1993; Kajii, Ohama, 1997; Golubovsky, 2003; Devrindt, 2005). Более того, как показано в недавних исследованиях, нарушение дозы импринтированных генов при редкой форме биродительского полного пузырного заноса может быть связано не с аномалиями цитогенетических механизмов сегрегации хромосом и оплодотворения, а с эпимутациями, а именно с ошибками установления геномного импринтинга в оогенезе у матери (Bestor, Bourc'his, 2006; Slim, Mehio, 2007).

Необходимо отметить, что нарушение функций импринтированных генов, большинство из которых вовлечены в регуляцию роста и дифферен-цировки плацентарных и плодных тканей, рассматривается как возможный весомый фактор нарушений внутриутробного развития эмбриона (Туско, 2006). В экспериментах на мышах было показано, что однородительские дисомии хромосом (ОРД), содержащих импринтированные локусы генома,

11 как правило, несовместимы с нормальным прохождением внутриутробного развития (Cattanach, Jones, 1994). В то же время немногочисленные попытки найти ОРД у внутриутробно погибших эмбрионов человека не увенчались заметным успехом (Henderson et al., 1994; Fritz et al., 2001a; Kondo et al., 2004; Tsukishiro et al., 2005). При обследовании в общей сложности около 300 эмбрионов было найдено всего 7 случаев ОРД, при этом только 2 из них (сегментные ОРД по хромосомам 7 и 14 материнского происхождения) могли быть связаны с нарушением дозы известных импринтиро-ванных генов, локализованных на этих хромосомах. Более того, некоторые из этих исследований были проведены без предварительного цитогенети-ческого анализа абортивного материала, что не исключало возможности попадания в изученные выборки эмбрионов с хромосомными аномалиями.

Учитывая появившиеся данные о роли эпимутаций импринтирован-ных генов в этиологии пузырного заноса, можно предположить, что ожидаемый негативный эффект дисфункции импринтированных локусов генома в эмбриогенезе человека связан не только с редкими событиями формирования ОРД, но и с нарушением дифференциального метилирования регуляторных последовательностей импринтированных генов. Не исключено, что аномалии эпигенетического репрограммирования генома эмбриональных клеток могут привести к установлению аберрантных эпиге-нотипов импринтированных генов. Активно дискутируемый в современной литературе вопрос о влиянии технологий искусственного оплодотворения на риск возникновения болезней геномного импринтинга (De Rycke et al., 2002; Maher et al., 2003a; Maher, 2005; Horsthemke, Ludwig, 2005; Ды-бан А.П., Дыбан П.А., 2006; Trasler, 2006) делает акцент на возможности средовой модификации эпигенетического статуса импринтированных локусов генома. С другой стороны, современные методы искусственного оплодотворения позволяют преодолевать множество репродуктивных барьеров. В связи с этим, не исключено, что нарушения развития некоторых эмбрионов, полученных в циклах ЭКО и ИКСИ, могут быть связаны с прояв

12 лением у них скрытой генетической (и эпигенетической) изменчивости. Вместе с тем, до настоящего времени отсутствуют данные об уровне такой изменчивости в естественных репродуктивных циклах, а также о её влиянии на развитие зародыша. Кроме того, встает вопрос и о систематизации эпимутаций импринтированных локусов в геноме человека.

Следующим аспектом действия аберрантных эпигенетических процессов на развитие организма может являться повышение нестабильности генома. Этот эффект наиболее изучен при онкологических заболеваниях, при которых аномальное гиперметилирование генов репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптоза часто сопровождает злокачественную трансформацию клеток, обусловливая возникновение микросателлитной и хромосомной нестабильности (Costello, Plass, 2001; Feinberg, 2001; Geigl, 2008). Нарушение эмбрионального развития человека также, по всей видимости, может быть связано с нестабильностью генома. Так, в конце 90-х годов прошлого столетия появились первые сообщения о повышенной частоте мутаций микросателлитных последовательностей ДНК у внутриутробно погибших эмбрионов человека (Kiaris et al., 1996; Spandidos et al., 1998). Что касается хромосомной нестабильности, то применение молеку-лярно-цитогенетических технологий для анализа репродуктивных потерь (Лебедев и др., 2003; Vorsanova et al., 2005), а также развитие преимплан-тационной генетической диагностики (Kuliev, Verlinsky, 2004; Delhanty, 2005; Tempest, Griffin, 2005) продемонстрировали высокую частоту мозаичных нарушений кариотипа при патологии ранних этапов развития эмбриона. Эти данные впервые указали на то, что наряду с аномалиями мей-отической сегрегации хромосом (Hassold, Hunt, 2001), существенную роль в возникновении летальных хромосомных аберраций могут играть и нарушения митотического распределения хромосом в соматических клетках развивающегося зародыша.

Было отмечено, что максимальное накопление мозаичных нарушений кариотипа приходится на период дробления бластомеров (Los et al., 2004), причем эта особенность, по всей видимости, характерна и для других изученных видов млекопитающих (Shi et al., 2004). Преимплантационный этап развития характеризуется тотальной эпигенетической реорганизацией генома, поэтому не исключено, что нарушения этого процесса могут приводить к установлению аберрантных эпигенетических профилей генов, ответственных за контроль хромосомной сегрегации и клеточного деления.

Цель настоящего исследования заключалась в установлении вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека. Задачи исследования:

1. Установить спектр и частоту хромосомных аномалий при эмбриональной гибели у человека и разработать подходы к оценке факторов, оказывающих влияние на достоверность регистрации цитогенетиче-ских показателей при анализе репродуктивных потерь.

2. Оценить вклад однородительского наследования хромосом во внутриутробную гибель эмбрионов с нормальным кариотипом.

3. Обосновать подходы к систематизации эпимутаций импринтирован-ных генов и предложить их классификацию.

4. Определить роль эпимутаций импринтированных локусов генома в нарушении эмбрионального развития человека.

5. Провести сравнительный анализ частоты гаметических мутаций мик-росателлитных последовательностей ДНК в семьях с нормальной репродуктивной функцией и в супружеских парах с невынашиванием беременности.

6. Оценить частоту соматических мутаций микросателлитных повторов ДНК при нарушениях эмбрионального развития.

7. Изучить цитогенетические механизмы возникновения мозаичных форм нарушений кариотипа при ранней эмбриональной гибели.

8. Определить роль эпигенетической инактивации генов контроля клеточного цикла в формировании хромосомного мозаицизма при нарушении внутриутробного развития.

Научная новизна: Основным научным результатом исследования явилось установление вклада аберрантных эпигенетических модификаций генома в нарушение эмбрионального развития человека. Получены новые данные об эпигенетических механизмах нарушений функций импринтиро-ванных генов при патологии внутриутробного периода онтогенеза. Впервые показано, что нарушения геномного импринтинга связаны с аномалиями поддержания дифференциального характера метилирования им-принтированных генов в соматических клетках эмбрионов на постимплан-тационных этапах развития. Предложена классификация эпимутаций им-принтированных локусов в геноме человека.

Продемонстрировано увеличение мутационной изменчивости генома соматических клеток при внутриутробной гибели эмбрионов, проявляющейся в форме мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также мозаичных вариантов нарушений кариотипа. Впервые получены данные о связи аномального метилирования генов контроля клеточного цикла с возникновением хромосомного мозаицизма в эмбриональных клетках. Установлено, что нарушения эпигенетического репрограммиро-вания генома зигот с нормальным хромосомным набором ведут к формированию аберрантных эпигенотипов, ассоциированных с тканеспецифич-ным хромосомным мозаицизмом. В то же время у эмбрионов, развивающихся из зигот с анеуплоидным кариотипом, эпигенетическая инактивация исследованных генов клеточного цикла может сопровождать коррекцию анеуплоидии и возникновение хромосомного мозаицизма. Обоснованы теоретические подходы к анализу цитогенетических механизмов формирования мозаичных вариантов хромосомного набора в эмбриональном периоде онтогенеза, основанные на учете закономерностей возникновения и

15 распределения клеток с числовыми нарушениями хромосом в производных различных зародышевых листков.

Практическая значимость: В ходе выполнения исследования проведена оценка факторов, оказывающих влияние на достоверность цитогене-тического анализа хромосомных нарушений в клетках внутриутробно погибших эмбрионов человека. Предложен подход к оценке уровня поли-плоидизации эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro. Разработана математическая модель оценки эффектов контаминации культур клетками материнского организма. С её использованием становится возможной коррекция частоты регистрируемых хромосомных нарушений и показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным кариотипом при проведении цитогенетического анализа. Предложенная модель может быть использована в качестве одного из элементов контроля качества лабораторных цитогенетических исследований.

Разработанные подходы к анализу механизмов формирования хромосомного мозаицизма могут представлять ценность для оценки риска таких клинически значимых феноменов в репродукции человека, как ограниченный плацентарный мозаицизм, гонадный мозаицизм, однородительские дисомии хромосом. Результаты исследования могут способствовать повышению эффективности медико-генетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беременности. Полученные данные представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной и преимплантационной генетической диагностики, акушерства и гинекологии. Материалы исследования используются в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей ВУЗов, а также в циклах постдипломной подготовки специалистов.

Положения, выносимые на защиту:

Предложена классификация эпимутаций импринтированных генов, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов.

Нарушение функций импринтированных генов при патологии эмбрионального развития человека связано с изменениями дифференциального характера метилирования их регуляторных областей. Возникновение эпимутаций обусловлено аномалиями поддержания геномного импринтинга в соматических клетках эмбрионов на постимпланта-ционных этапах онтогенеза.

Однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором.

Индукция хромосомного нерасхождения в клетках эмбрионов с нормальным кариотипом ассоциирована с аберрантным метилированием промоторных регионов генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Возникновение эпимутаций приходится на преимплантацион-ный период развития и связано с нарушением деметилирования родительских геномов при их эпигенетическом репрограммировании. Аномальное метилирование генов контроля клеточного цикла на пост-имплантационных этапах развития сопровождает коррекцию анеуп-лоидии мейотического происхождения с возникновением хромосомного мозаицизма.

Мутационный процесс в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК в половых клетках родителей не оказывает заметного влияния на нарушение эмбрионального развития потомства, тогда как в клетках внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным

17 хромосомным набором обнаруживаются мутации микросателлитных последовательностей ДНК постзиготического происхождения. 7. Контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на частоту регистрируемых аномалий кариотипа и на величину показателя «соотношение полов» в группе внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором.

Публикации:

По теме исследования опубликовано 62 работы, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Структура диссертации:

Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиографический указатель включает 569 источников, из них 81 - публикации в отечественной литературе, 488 - в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и содержит 42 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лебедев, Игорь Николаевич

314 ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что нарушение эмбрионального развития человека может быть обусловлено эпимутациями импринтированных генов. У 9,5% спонтанных абортусов выявлено тканеспецифичное гипометили-рование центра импринтинга KCNQ10T1 на материнском гомологе хромосомы 11. Тканеспецифичность эпимутаций свидетельствует об их соматическом происхождении после обособления экстраэмбриональных и зародышевых листков на постимплантационных этапах развития.

2. Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов генома человека, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возникают нарушения характера метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных генов.

3. Установлено, что однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным кариотипом.

4. Возникновение хромосомного мозаицизма при нарушениях эмбрионального развития преимущественно связано с механизмом коррекции анеуплоидии мейотического происхождения. Только у 10% эмбрионов мозаичная хромосомная конституция является следствием ошибок ми-тотической сегрегации хромосом в соматических клетках зародыша, развивающегося из зиготы с нормальным кариотипом.

5. В плацентарных тканях спонтанных абортусов с хромосомным мозаи-цизмом впервые выявлено метилирование промоторных регионов генов контроля клеточного цикла P14ARF и RB1 с частотой 9 и 20%, соответственно. Установлено, что эпимутации исследованных генов ассоциированы с риском тканеспецифичного хромосомного нерасхождения. Наличие эпимутаций в производных трофэктодермы и внутренней клеточной массы указывает на нарушение деметилирования родительских геномов в ходе их эпигенетического репрограммирования на преим-плантационных этапах развития.

6. Впервые показано, что метилирование гена RB1 у эмбрионов с анеуп-лоидией мейотического происхождения повышает вероятность коррекции хромосомного нарушения с возникновением мозаицизма. Частота аберрантного метилирования оказывается статистически значимо выше в экстраэмбриональной мезодерме, по сравнению с цитотрофобластом хориона, что свидетельствует о более интенсивных процессах коррекции анеуплоидии в производных внутренней клеточной массы.

7. В цитотрофобласте хориона и экстраэмбриональной мезодерме эмбрионов человека в первом триместре беременности имеется метилирование промоторного региона и экзона I гена CDKN2A, что указывает на значимость эпигенетической регуляции активности данного локуса в обеспечении нормальной дифференцировки плацентарных тканей.

8. Частота гаметических мутаций в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК не отличается в потомстве супружеских пар с нормальной репродуктивной функцией и в семьях с невынашиванием беременности, тогда как у 4,2% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом выявляются соматические мутации микросателлитных последовательностей .

9. Остановка внутриутробного развития эмбрионов человека в 54,5% случаев обусловлена аномалиями кариотипа, среди которых доминирующими оказываются числовые нарушения хромосом - трисомия аутосом, моносомия по Х-хромосоме и полиплоидия. Установлено, что регистрация тетраплоидного кариотипа при цитогенетическом анализе в 57% случаев связана с полиплоидизацией эмбриональных клеток в ходе культивирования in vitro.

10. Показано, что контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на регистрируемую частоту нарушений кариотипа и на значение показателя соотношение полов у спонтанных абортусов с нормальным хромосомным набором, а также определяет достоверность цитогенетического анализа репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития.

316

Автор выражает свою глубокую признательность научному консультанту директору ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН академику РАМН, профессору, доктору медицинских наук Валерию Павловичу Пузырёву за неизменную поддержку на всех этапах выполнения настоящего исследования, за ценные предложения и советы в обсуждении полученных результатов.

Автор благодарит научных сотрудников лаборатории цитогенетики института к.б.н. Екатерину Николаевну Толмачёву, к.б.н. Елену Александровну Саженову, к.б.н. Татьяну Владимировну Никитину, к.б.н. Владимира Анатольевича Тимошевского, Анну Александровну Кашеварову, Александра Дмитриевича Черемных, а также врача клинической лабораторной диагностики Генетической клиники института к.б.н. Наталью Нестеровну Суханову за помощь в проведении экспериментальной части работы и за моральную поддержку. Автор благодарен врачам Генетической клиники института к.м.н. Мирославе Орестовне Филипповой и Марии Павловне Корф за проведение ультразвуковой диагностики нарушений эмбрионального развития у беременных женщин.

Особая благодарность заместителю директора института по научной и лечебной работе профессору, доктору медицинских наук Людмиле Павловне Назаренко, заместителю директора института по научной работе доктору биологических наук Вадиму Анатольевичу Степанову и заведующей лабораторией молекулярной генетики института доктору биологических наук Аксане Николаевне Кучер за моральную поддержку, участие в обсуждении полученных данных, а также за ценные советы по оформлению диссертационной работы.

317

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование было направлено на оценку вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека. Предпосылками к его проведению явились, с одной стороны, данные об интенсивных процессах эпигенетической реорганизации генома эмбриональных клеток на начальных этапах онтогенеза (Li, 2002; Dean et al., 2003), а с другой стороны, отсутствие концепций, удовлетворительно объясняющих высокую частоту внутриутробной гибели зародышей с нормальным хромосомным набором с генетических или цитоге-нетических позиций. Исследование было сфокусировано на анализе изменчивости характера метилирования регуляторных областей генов, как одного из эпигенетических механизмов контроля их экспрессии.

Предметом изучения явились некоторые импринтированные локусы генома, а также ряд генов контроля клеточного цикла. Выбор импринтиро-ванных генов был обусловлен особенностями эпигенетической регуляции их экспрессии, связанными с дифференциальным метилированием промо-торных регионов, устанавливаемым строго специфичным образом в сперматогенезе и оогенезе. Соответственно, ожидаемый спектр эпигенетической изменчивости импринтированных генов является более широким, по сравнению с другими локусами генома, и может быть представлен как гипер-, так и гипометилированием аллелей на разных родительских копиях хромосом, возникающим в ходе гаметогенеза или на начальных этапах эмбрионального развития. В настоящем исследовании были обозначены критерии, позволяющие систематизировать разнообразие нарушений характера метилирования последовательностей ДНК, подверженных геномному импринтингу, и предложена классификация эпимутаций.

Что касается генов контроля клеточного цикла, то исследование их эпигенетического статуса представляло интерес с позиции анализа вклада аберрантных эпигенетических модификаций в этиологию хромосомного мозаицизма в эмбриональном периоде онтогенеза. Современные данные,

307 получаемые в результате развития технологий преимплантационной генетической диагностики, а также внедрения методов молекулярно-цитогенетического исследования в анализ причин ранних репродуктивных потерь, свидетельствуют о высоком уровне мозаичных нарушений карио-типа при аномалиях эмбрионального развития. При этом частота хромосомного мозаицизма существенно возрастает в период глобальных эпигенетических реорганизаций генома на преимплантационных стадиях развития (Los et al., 2004). В связи с этим, в рамках настоящего исследования впервые был проведен анализ вклада нарушений характера метилирования ДНК в локусах, контролирующих поддержание стабильности генома, в возникновение хромосомного мозаицизма при патологии внутриутробного развития человека.

В соответствии с этими направлениями исследований на первом этапе работы была поставлена задача дифференцировки внутриутробно погибших эмбрионов человека на группы зародышей с нормальным кариотипом и с хромосомными аномалиями. С этой целью был проведен цитогенетиче-ский анализ 717 спонтанных абортусов первого триместра беременности. В целом, спектр и частота выявленных нарушений кариотипа соответствовали опубликованным данным о структуре геномных и хромосомных мутаций в клетках спонтанных абортусов человека. Исключение составила повышенная частота тетраплоидии. Однако, с использованием интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток было показано, что только 43% эмбрионов с тетраплоидным кариотипом, выявленным после длительного культивирования экстраэмбриональных тканей, в действительности имеют полиплоидные клетки.

В цитогенетическом разделе исследования также были разработаны подходы к анализу эффектов контаминации культур эмбриональных фиб-робластов клетками материнского происхождения. Предложена модель, позволяющая установить теоретически ожидаемые частоты нарушений ка-риотипов у спонтанных абортусов, не выявляемых вследствие материн

308 ской контаминации. Кроме того, данная модель позволяет провести коррекцию регистрируемого показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным хромосомным набором, а также определить вероятность ошибки при проведении цитогенетического исследования, возникающей вследствие кариотипирования клеток материнского происхождения, случайным образом попавших в культуры эмбриональных фибробластов. С использованием предложенного подхода у всех эмбрионов с кариотипом 46,XX, включенных в обследованные в дальнейшем выборки, была исключена вероятность ошибочного определения хромосомного набора вследствие материнской контаминации.

Таким образом, после проведения культивирования клеток и стандартного метафазного анализа были выделены группы спонтанных аборту-сов с нормальным кариотипом и с хромосомными нарушениями для выполнения дальнейших этапов исследования. Здесь необходимо отметить, что в группе эмбрионов с нормальным хромосомным набором некоторая часть зародышей может иметь микроструктурные аберрации хромосом, которые не выявляются при метафазном анализе. Согласно результатам исследований, проведенных с использованием матричной сравнительной геномной гибридизации, было установлено, что в выборках спонтанных абортусов с нормальным кариотипом (по данным метафазного анализа) доля эмбрионов с несбалансированными структурными перестройками хромосом составляет 4-5% (Schaeffer е1 а1., 2004; БЫтокалуа е1 а1., 2006).

В настоящей работе в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом был проведен анализ сегрегации полиморфных аутосомных ДНК-маркеров с целью поиска однородительского наследования хромосом. Основными критериями отбора хромосом для такого анализа явились наличие в них известных импринтированных генов или локусов, синтен-ных импринтированным регионам хромосом мыши, однородительская ди-сомия по которым приводит к ранней эмбриональной гибели животных; отсутствие вариантов ОРД у живорожденных индивидов; частое участие

309 хромосомы в мейотическом нерасхождении, повышающее вероятность формирования ОРД при последующей коррекции анеуплоидии. При обследовании 87 спонтанных аборту сов ни одного случая ОРД выявлено не было. После обобщения полученных данных с результатами аналогичных исследований было показано, что вероятность формирования ОРД в клетках эмбрионов человека составляет 1:1000 событий наследования хромосом от родителей. Эта величина сопоставима с теоретически ожидаемой частотой возникновения ОРД (1,65:1000), рассчитанной на основании уровня хромосомного нерасхождения в мейозе (Engel, DeLozier-Blanchet, 1991). Вместе с тем, только лишь два из 7 опубликованных к настоящему времени случаев однородительского наследования хромосом у спонтанных абортусов (табл. 6), а именно сегментные ОРД по хромосомам 7 и 14 материнского происхождения, могут рассматриваться в качестве доказательства возможной ассоциации нарушений дозы импринтированных генов с ранней эмбриональной гибелью.

Поскольку известно, что молекулярную основу геномного имприн-тинга составляет дифференциальное метилирование регуляторных последовательностей импринтированных генов или центров импринтинга, то нарушение дозы импринтированных локусов генома может быть связано не только с чрезвычайно редким феноменом ОРД, но и с изменениями характера их метилирования. С целью проверки данного предположения в рамках настоящего исследования был проведен анализ статуса метилирования ряда импринтированных локусов (SNURF-SNRPN, Н19, KCNQ10T1, CDKN1C) у внутриутробно погибших эмбрионов человека.

У 8 из 84 обследованных зародышей (9,5%) впервые было выявлено гипометилирование центра импринтинга KCNQ10T1 на материнском гомологе хромосомы 11. Более того, обнаруженные эпимутации у всех эмбрионов оказались тканеспецифичными, т.е. присутствовали либо в цито-трофобласте хориона, либо в экстраэмбриональной мезодерме. Полученные данные указывают на то, что возникновение эпимутаций происходит

310 после обособления экстраэмбриональных и зародышевых листков. По всей видимости, появление аберрантного эпигенотипа может быть объяснено деметилированием центра импринтинга на материнском гомологе в части клеток эмбриона на постимплантационных этапах развития.

Примечательно, что гипометилирование KCNQ10T1 на материнской хромосоме 11 является наиболее частой мутацией, приводящей к развитию синдрома Видемана-Беквита. Более того, оно описано практически у всех детей с данным заболеванием, родившихся в результате использования методов искусственного оплодотворения (Chang et al., 2005). Развернувшаяся в современной литературе дискуссия о возможном влиянии вспомогательных репродуктивных технологий на риск возникновения болезней геномного импринтинга в значительной степени сфокусирована на рассмотрении гипотезы о средовой модификации экспрессии импринтированных генов. В то же время, полученные в ходе настоящего исследования данные свидетельствуют о том, что аналогичные эпимутации импринтированных генов могут возникать и в естественных циклах репродукции. Более того, их возникновение приходится уже на постимплантационные этапы онтогенеза и не затрагивает те ранние периоды развития, на которых обычно проводится культивирование гамет и эмбрионов in vitro.

Таким образом, результаты проведенного исследования импринтированных генов в большей степени свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы, согласно которой используемые методы искусственного оплодотворения ведут к проявлению в онтогенезе скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости вследствие преодоления репродуктивных барьеров. Возможно, что некоторые супружеские пары имеют такие генотипы (или эпигенотипы), которые несовместимы с нормальным развитием их потомства, либо приводят к рождению детей с эпигенетическими формами патологии. Недавно были получены первые доказательства существования генетической предрасположенности к формированию первичных

311 эпимутаций в импринтированных локусах хромосом 11 и 15 у человека (Murrel et al, 2004; Zogel et al., 2006).

Еще одним ожидаемым эффектом аберрантных эпигенетических модификаций генома могло явиться увеличение частоты мутаций и в целом повышение уровня нестабильности генома при патологии эмбрионального развития. С целью регистрации этих феноменов в настоящем исследовании были изучены мутации микросателлитных последовательностей ДНК и хромосомный мозаицизм в тканях внутриутробно погибших эмбрионов. Исследование микросателлитных локусов впервые было сфокусировано на сравнительном анализе частоты мутаций гаметического и соматического происхождения при нарушении развития организма. Установлено, что мутации микросателлитных последовательностей ДНК возникают примерно с сопоставимой частотой в гаметах родителей, имеющих живорожденных детей, и в супружеских парах с невынашиванием беременности. Однако, соматические мутации этих же тетрануклеотидных повторяющихся локусов были найдены исключительно в клетках внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, что указывает на повышение нестабильности генома (на уровне микросателлитных последовательностей ДНК) при патологии эмбрионального развития.

312

В результате проведенного исследования впервые было показано, что аберрантное метилирование промоторных регионов генов P14ARF и RB1 выявляется у 9 и 20% спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, соответственно. Суммарная частота эпимутаций этих двух генов оказалась максимальной в группе спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом низкого уровня, что указывает на ассоциацию эпигенетической инактивации систем контроля клеточного цикла с индукцией хромосомного нерасхождения в соматических клетках зародышей.

Наличие эпимутаций в производных трофэктодермы и эпибласта свидетельствовало о возникновении аномального метилирования еще до обособления этих эмбриональных и внезародышевых листков. Учитывая тот факт, что дифференцировка трофобласта и эпибласта запускается в период имплантации бластоцисты на фоне продолжающегося деметилирования генома, полученные в ходе настоящего исследования данные указывают на то, что появление эпимутаций наиболее вероятно было связано с нарушениями деметилирования родительских геномов при их эпигенетическом репрограммировании на постзиготических этапах развития.

С другой стороны, у части спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом было выявлено тканеспецифичное метилирование промоторно-го региона гена RB1. Анализ частоты анеуплоидных клеток и их межтканевого распределения свидетельствовал о мейотическом происхождении хромосомной мутации. Формирование мозаицизма в этом случае могло быть связано с феноменом коррекции анеуплоидии. При этом вероятность коррекции оказывалась выше в производных тех зародышевых листков, в которых обнаруживалось метилирование промоторного региона RB1.

В настоящем исследовании был изучен характер метилирования еще двух генов контроля клеточного цикла - CDKN2A и CDKN2B. В отношении гена CDKN2B ни одного случая аномального метилирования в анализируемых группах эмбрионов выявлено не было. Что же касается гена CDKN2A, то и в цитотрофобласте хориона и в экстраэмбриональной мезо

313 дерме нормально развивавшихся зародышей первого триместра беременности было зарегистрировано метилирование экзона I и промоторного региона. Известно, что метилирование этих последовательностей ведет к существенному снижению уровня экспрессии CDKN2A (Nguyen et al., 2001). Функциональная значимость такого эпигенетического статуса опухолесу-прессорного гена в плаценте пока остается неясной. Вместе с тем, полученные данные, наряду с появившимися сообщениями о метилировании ряда других опухолесупрессорных генов в плаценте - PTEN (Chen et al., 2005), RASSF1A (Chiu et al., 2007), позволяют предполагать наличие в плацентарных тканях человека особых эпигенетических механизмов, обеспечивающих их нормальную пролиферацию, дифференцировку, а возможно и инвазивные свойства.

Обобщая результаты исследования можно отметить, что нарушения эмбрионального периода онтогенеза человека сопровождаются повышением уровня мутационной изменчивости генома. Ее возникновение может являться следствием повреждения некоторых универсальных механизмов регуляции структурно-функциональной организации генома, в том числе и через аберрантные эпигенетические процессы. Наиболее вероятной причиной эпигенетических аномалий являются ошибки репрограммирования генома, приводящие к формированию аберрантных эпигенотипов, не совместимых с нормальным течением эмбрионального развития. Патогенетические механизмы нарушений развития эмбрионов с аномальными эпи-генотипами могут быть связаны, как с повышением частоты мутаций в их соматических клетках, так и с повреждением эпигенетически контролируемых феноменов (в частности, геномного импринтинга), обеспечивающих нормальное течение эмбриогенеза.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лебедев, Игорь Николаевич, Томск

1. Андреева JI.E., Серова И.А. Влияние микроманипуляционной техники, применяемой для трансгенеза, на развитие мышей // Онтогенез. 1992. Т. 23. №6. С. 637-643.

2. Баранов B.C. Хромосомный импринтинг и межхромосомные взаимодействия в раннем развитии млекопитающих // Успехи современной биологии. 1988. Т. 105. № 3. С. 25-33.

3. Баранов B.C. Хромосомный импринтинг и наследственные болезни // Биополимеры и клетка. 1991. Т. 7. № 2. С. 73-79.

4. Баранов B.C., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты. СП.: Издательство H-JI, 2007. - 640 с.

5. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЕОТАР-МЕД, 2002. - 448 с.

6. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. ДНК-метилтрансферазы и структурно-функциональная специфичность модификации эукариотических ДНК // Биохимия. 2005. Т. 70. № 7. С. 885-899.

7. Ванюшин Б.Ф., Белозерский А.Н. // Доклады АН СССР. 1959. Т. 129. С. 944-946.

8. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. 2005. Т. 70. №5. С. 598-611.

9. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. 2006. Т. 42. №9. С. 1186-1199.

10. Вострюхина O.A., Никифорова А.Г. Повреждение гена рецептора типа II трансформирующего фактора роста TGF-альфа и микросателлитная нестабильность генома в клетках карцином ЖКТ // Вопросы онкологии. 1998. Т. 44. С. 667-671.

11. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: Учебник. М.: Медицина, 2003. -448 с.

12. Головачёв Г.Д. Наследственность человека и внутриутробная гибель. М.: Медицина, 1983. 152 с.

13. Дерфлер В. О биологическом значении метилирования ДНК // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 618-640.

14. Дыбан А.П., Дыбан П.А. Теоретические и прикладные аспекты эпигенетического репрограммирования развития млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 12. С. 1615-1620.

15. Евдокимова В.Н., Назаренко С.А. Отсутствие однородительского наследования Х-хромосом у спонтанных абортусов с 46,XX-кариотипом// Онтогенез. 2000. Т. 31. № 3. С. 201-204.

16. Киселёва Н.П., Киселёв Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. 2005. Т. 70. № 7. С. 900-911.

17. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. М.: Изд-во МГУ, 2002.-264 с.

18. Кулаженко В.П. Морфологические и цитогенетические нарушения при спонтанных абортах у человека: Автореф. дисс. докт. мед. наук.-М., 1975.-68 с.

19. Кулешов Н.П. Частота возникновения и судьба хромосомных аномалий у человека: Автореф. дисс. докт. мед. наук. М., 1979. - 45 с.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование,- М.: Мир, 1984,- 286 с. Назаренко С.А. Изменчивость хромосом и развитие человека. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1993. - 200 с.

21. Назаренко С.А., Саженова Е.А. Однородительские дисомии и болезни геномного импринтинга.- Томск: Печатная мануфактура, 2004. 37 с.

22. Назаренко С.А., Суханова H.H. Феномен хромосомного импринтинга и хромосомные болезни человека // Тез. докл. I съезда ВОГиС. Саратов, 1994. С. 36.

23. Немцова М.В. Нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов как новый класс молекулярной патологии: Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 2002. - 48 с.

24. Немцова М.В., Залетаев Д.В. Эпигенетические нарушения экспрессии гена и наследственная патология у человека // Введение в молекулярную медицину / Под ред. М.А. Пальцева. М.: Медицина, 2004.-С. 94-146.

25. Никитина Т.В., Назаренко С.А. Мутации в микросателлитных повторах ДНК и эмбриональная гибель человека // Генетика. 2000. Т. 36. №7. С. 965-971.

26. Никитина Т.В., Назаренко С.А. Микросателлитные последовательности ДНК человека: мутационный процесс и эволюция // Генетика. 2004. Т. 40. №Ю. С. 1301-1318.

27. Нэнни Д. Роль цитоплазмы в наследственности. В кн.: Химические основы наследственности. М.: Мир, 1961.-е. 112-133.

28. Пендина A.A., Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Баранов B.C. Особенности метилирования прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 у эмбрионов человека // Цитология. 2001. Т. 43. № 8. С. 772-776.

29. Пендина A.A., Ефимова O.A., Каминская А.Н., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Иммуноцитохимический анализ статуса метилирования метафаз-ных хромосом человека // Цитология. 2005. Т. 47. № 8. С. 731-737.

30. Пендина A.A., Ефимова O.A., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Болезни геномного импринтинга // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. Т. 56. № 1. С. 73-80.

31. Перепечина И.О., Гришечкин С.А. Вероятностные расчеты в ДНК-дактилоскопии: Методические рекомендации. М.: ЭКЦ МВД России, 1996.- 16 с.

32. Разин C.B. Пространственная организация эукариотического генома и работа эпигенетических механизмов // Генетика. 2006. Т. 42. № 12. С. 1605-1614.

33. Светлов П.Г. Онтогенез как целенаправленный (телеономический) процесс // Архивы анатомии, гистологии и эмбриологии. 1972. Т. 63. № 8. С. 5-16.

34. Светлов П. Г. Роль внешних воздействий при реализации наследственных признаков в онтогенезе // Проблемы медицинской генетики. -Л.: Медицина, 1965. С. 106-136.

35. Светлов П. Г. Физиология (механика) развития. Л.: Наука, 1978. - Т. 1. 279 е., Т. 2. 262 с.

36. Светлов П.Г., Корсакова Г.Ф. Зависимость фенотипа микроофтальми-ческой мутации у мышей от внешних воздействий на гаметы самок двух предшествующих поколений // Генетика. 1966. № 5. С. 66-81.

37. Стегний В.Н. Эволюционное значение архитектоники хромосом как формы эпигенетического контроля онто- и филогенеза эукариот // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1215-1224.

38. Уоддингтон К.Х. Канализация развития и наследование приобретенных признаков // Успехи современной биологии. 1944. Т. 18. № 3. С. 393-396.

39. Уоддингтон К.Х. Организаторы и гены. М.: Изд-во иностранной литературы, 1947. - 240 с.

40. Уоддингтон К.Х. Морфогенез и генетика. М.: Мир, 1964. - 259 с.

41. Уоддингтон К.Х. Основные биологические концепции // В кн. На пути к теоретической биологии. I. Пролегомены. М.: Мир, 1970. С. 11-38.

42. Хесин Р.Б. Некоторые неканонические механизмы наследования // Генетика. 1981. Т. 17. №7. С. 1159-1172.

43. Хесин Р.Б. Непостоянство генома М.: Наука, 1984. - 472 с.

44. Чураев Р.Н. Генные и эпигенные сети: два уровня организации наследственной системы // Информационный вестник ВОГИС. 2005. Т. 9. С. 199-208.

45. Чураев Р.Н. Эпигенетика: генные и эпигенные сети в онто- и филогенезе // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1276-1296.

46. Чуриков H.A. Молекулярные механизмы эпигенетики // Биохимия.3242005. Т. 70. №4. С. 493-513.

47. Шишкин М.А. Индивидуальное развитие и эволюционная теория // Эволюция и биоценотические кризисы. М.: Наука, 1987. С. 76-124.

48. Шишкин М.А. Эволюция как эпигенетический процесс // Современная палеонтология. М.: Недра, 1988. С. 142-169.

49. Шишкин М.А. Индивидуальное развитие и уроки эволюционизма // Онтогенез. 2006. Т. 37. № 3. С. 179-198.

50. Шмальгаузен И.И. Факторы эволюции. Теория стабилизирующего отбора. М.: Наука, 1968. - 451 с.

51. Шмальгаузен И.И. Организм как целое в индивидуальном и историческом развитии. М.: Наука, 1982. -228 с.

52. Albaneze V., Biguet N.F., Kiefer Н., Bayard Е., Mallet J., Meloni R. Quantitative effects on gene silencing by allelic variation at a tetranucleotide microsatellite // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 1785-1792.

53. Alberio R., Campbell K.H., Johnson A.D. Reprogramming somatic cells into stem cells //Reproduction. 2006. V. 132. P. 709-720.

54. Amos W., Sawcer S.J., Feakes R.W., Rubinsztein D.C. Microsatellites show mutational bias and heterozygote instability // Nat. Genet. 1996. V.13. P. 390-391.

55. Andrews Т., Dunlop W., Roberts D.F. Cytogenetic studies in spontaneous abortuses // Hum. Genet. 1984. V. 66. P. 77-84.

56. Arima Т., Kamikihara Т., Hayashida T. et al. ZAC, LIT1 (KCNQIOTI) and1. K1P2p57 (CDKN1Q are in an imprinted gene network that may play a role in Beckwith-Wiedemann syndrome // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 8. P. 2650-2660.

57. Arnaud Ph., Feil R. Epigenetic deregulation of genomic imprinting in human disorders and following assisted reproduction // Birth Defects Research (Part C). 2005. V. 75. P. 81-97.

58. Barker D.J. Fetal growth and adult disease // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1992. V. 99. P. 275-276,

59. Bastepe M., Lane A.H., Juppner H. Paternal uniparental isodisomy of chromosome 20q and the resulting changes in GNAS1 methylation as a plausible cause of pseudohypoparathyroidism // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. P. 1283-1289.

60. Bateson W., Pellew C. On the genetics of 'rogues' among culinary peas (Pisum sativum) // J Genet. 1915. V. 5. P. 15-36.

61. Be C.R., Velasquez P.M., Youlton R.R. A cytogenetic study in 609 abortions//Rev. Med. Chile. 1997. V. 125. P. 317-322.

62. Beard J. Embryological aspects and etiology of carcinoma // Lancet. 1902. V. l.P. 1758.

63. Beaudet A.L. Is medical genetics neglecting epigenetics? // Genetics in Medicine. 2002. V. 4. P. 399-402.

64. Bell A.C., West A.G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999 a. V. 98. P. 387-396.

65. Bell K.A., van Deerlin P.G., Haddad B.R., Feinberg R.F. Cytogenetic diagnosis of «normal 46,XX» karyotypes in spontaneous abortions frequently may be misleading // Fertil. Steril. 1999 b. V. 71. P. 334-341.

66. Benchaib M., Braun V., Ressnikof D., et al. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results // Hum. Reprod. 2005. V. 20. P. 768-773.

67. Bender K., Beller G., Lautsch S. Tetranucleotide short tandem repeat polymorphisms and their possible mode of origin // Cytogenet. Cell Genet.-1998. V. 80. P. 34-36.

68. Benkhalifa M., Kasakyan S., Clement P., et al. Array comparative genomic hybridization profiling of first-trimester spontaneous abortions that fail to grow in vitro // Prenat. Diagn. 2005. V. 25. P. 894-900.

69. Bennett S.T., Wilson A.J., Esposito L. et al. Insulin VNTR allele-specific effect in type 1 diabetes depends on identity of untransmitted paternal allele. The IMDIAB Group //Nat. Genet. 1997. V. 17. P. 350-352.

70. Bernasconi F., Karagezel A., Celep F. et al. Normal phenotype with maternal isodisomy in a female with two isochromosomes: i(2p) and i(2q) // Am. J. Hum. Genet. 1996. V. 59. № 5. P. 1114-1118.

71. Bestor T.H., Bourc'his D. Genetics and epigenetics of hydatidiform moles //Nat. Genet. 2006. V. 38. P. 274-276.

72. Bielanska M., Tan S.L., Ao A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type and relevance to embryo outcome // Hum. Reprod. 2002. V. 17. № 2. P. 413-419.

73. Bielinska B., Blaydes S.M., Buiting K. et al. De novo deletions of SNRPN exon 1 in early human and mouse embryos result in a paternal to maternal imprinting switch // Nat. Genet. 2000. V. 25. P. 74-78.

74. Bilko A., Altbacker V., Hudson R. Transmission of food preference in the rabbit: the means of information transfer // Physiol. Behav. 1994. V. 56. P. 907-912.

75. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes and Development. 2002. V. 16. P. 6-21.

76. Bliek J., Maas S.M., Ruijter J.M. et al. Increased tumour risk for BWS patients correlates with aberrant H19 and not KCNQ10T1 methylation: occurrence of KCNQ10T1 hypomethylation in familial cases of BWS // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 467-476.

77. Bliek J., Terhal P., van den Bogaard M-J. et al. Hypomethylation of the H19 gene causes not only Silver-Russell syndrome (SRS) but also isolated asymmetry or an SRS-like phenotype // Am. J. Hum. Genet. 2006. V. 78. P. 604-614.

78. Blouin J.-L., Avramopulos D., Pangalos C., Antonarakis S.E. Normal phenotype with paternal uniparental isodisomy for chromosome 21 // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 53. № 5. P. 1074-1078.

79. Boerrigter P., de Bie J., Mannaerts B., et al. Obstetrical and neonatal outcome after controlled ovarian stimulation for IVF using the GnRH antagonist ganirelix // Hum. Reprod. 2002. V. 17. P. 2027-2034.

80. Bonduelle M., Liebaers I., Deketelaere V. et al. Neonatal data on a cohort of 2889 infants born after ICSI (1991-1999) and of 2995 infants born after IVF (1983-1999) // Hum. Reprod. 2002. V. 17. P. 671-694.

81. Boue J., Boue A., Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions // Teratology. 1975. V. 12. P. 11-26.

82. Brajenovic-Milic B., Petrovic O., Krasevic M., Ristic S., Kapovic M. Chromosomal anomalies in abnormal human pregnancies // Fetal Diagnosis and Therapy. 1998. V. 13. № 3. P. 187-191.

83. Braude P., Bolton V., Moore S. Human gene expression first occurs between the four- and eight-cell stages of preimplantation development // Nature. 1988. V. 332. P. 459-461.

84. Breivik J., Gaudernack G. Genomic instability, DNA methylation and natural selection in colorectal carcinogenesis // Seminars in Cancer Biology. 1999. V. 9. P. 245-254.

85. Bretherick K., Gair J., Robinson W.P. The association of skewed X chromosome inactivation with aneuploidy in humans // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 111. P. 260-265.

86. Brink R.A. A genetic change associated with the R locus in maize which is directed and potentially reversible // Genetics. 1956. V. 41. P. 872-889.

87. Brinkmann B., Klintschar M., Neuhuber F., Huhne J., Berkhard R. Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 1408-1415.

88. Buiting K., Gross S., Lich C. et al. Epimutations in Prader-Willi and An-gelman syndromes: a molecular study of 136 patients with an imprinting defect // Am. J. Hum. Genet. 2003. V. 72. P. 571-577.

89. Burger J., Horn D., Tonnies H., Neitzel H., Reis A. Familial interstitial 570 kbp deletion of the UBE3A gene region causing Angelman syndrome but not Prader-Willi syndrome // Am. J. Med. Genet. 2002. V. 111. P. 233-237.

90. Burke L.J., Zhang R., Bartkuhn M. et al. CTCF binding and higher order chromatin structure of the H19 locus are maintained in mitotic chromatin // EMBO J. 2005. V. 24. P. 3291-3300.

91. Calin G.A., Dumitru C.D., Shimizu M. et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia//PNAS. 2002. V. 99. P. 15524-15529.

92. Calin G.A., Sevignani C., Dumitru C.D. et al. Human micro-RNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancer //PNAS. 2004. V. 101. P. 2999-3004.

93. Calkhoven C.F., Müller C., Leutz A. Translational control of gene expression and disease // Trends Mol. Med. 2002. V. 8. P. 577-583.

94. Carr D.H. Cytogenetics and the pathologist // Pathol. An. 1975. V. 10. P. 93-144.

95. Carr D.H., Gedeon M.M. Q-banding of chromosomes in human spontaneous abortions // Canad. J. Genet. Cytol. 1978. V. 20. P.415-425.

96. Cattanach B.M. Pointers for chromosome imprinting in man from studies in mice // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 49. Suppl. № 4. P. 49.

97. Cattanach B.M., Kirk M. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice //Nature. 1985. V. 315. P. 496-498.

98. Cattanach B.M., Jones J. Genetic imprinting in the mouse: Implications for gene regulation // J. Inher. Metabol. Disease. 1994. V. 17. № 4. P. 403-421.

99. Chakraborty R., Kimel M., Stivers D. N., Davison L.J., Deka R. Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide microsatellite loci // PNAS. 1997. V. 94. P. 1041-1046.

100. Chandler V.L., Stam M. Chromatin conversations: mechanisms and implications of paramutation // Nat. Rev. Genet. 2004. V. 5. P. 532-544.

101. Chang A.S., Moley K.H., Wangler M., et al. Association between Beckwith-Wiedemann syndrome and assisted reproductive technology: a case series of 19 patients // Fertil. Steril. 2005. V. 83. P. 349-354.

102. Chang D.L.F., Qiu W., Ying H., et al. ARF promotes accumulation of retinoblastoma protein through inhibition of MDM2 // Oncogene. 2007. V. 26. P. 4627-4634.

103. Chao W., Huynh K.D., Spencer R.J., Davidow L.S., Lee J. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice // Science. 2002. V. 295. P. 345-347.

104. Chen X., Stroun M., Magnenat J.L. Microsatellite alterations in plasma DNA of small lung cancer patients //Nat. Med. 1996. V. 2. P. 1033-1035.

105. Chen H, Ye D., Xie X., Lu W., Zhu C., Chen X. PTEN promoter methyla-tion and protein expression in normal early placentas and hydatidiform moles // J. Soc. Gynecol. Invest. 2005. V. 12. P. 214-217.

106. Chess A. Expansion of the allelic exclusion principle? // Science. 1998. V. 279. P. 2067-2068.

107. Chitayat D., Friedman J.M., Anderson L., Dimmick J.E. Hepatocellular carcinoma in a child with familial Russell-Silver syndrome // Am. J. Med. Genet. 1988. V. 31. P. 909-914.

108. Christophorou M.A, Ringshausen I, Finch A.J. et al. The pathological response to DNA damage does not contribute to p53-mediated tumor suppression//Nature. 2006. V. 443. P. 214-217.

109. Chudoba I, Franke Y, Senger G. et al. Maternal UPD 20 in a hyperactive child with severe growth retardation // Eur. J. Hum. Genet. 1999. V. 7. P. 533-540.

110. Collinge J. Prion diseases of human and animals: their causes and molecular basis //Ann RevNeurosci. 2001. V. 24. P. 519-550.

111. Corn P.G, Kuerbitz S.J, van Noesel M.M. et al. Transcriptional silencing of the p73 gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkitt's lymphoma is associated with 5' CpG island methylation // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3352-3356.

112. Costello J.F, Plass C. Methylation matters // J. Med. Genet. 2001. V. 38. P. 285-303.331

113. Cox G.F., Burger J., Lip V. et al. Intracytoplasmie sperm injection may increase the risk of imprinting defects // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 71. P. 162-164.

114. Crane J.P., Cheung S.W. An embryonic model to explain cytogenetic inconsistencies observed in chorionic villus versus fetal tissue // Prenatal Diagnosis. 1988. V. 8. № 2. P. 119-129.

115. Creasy M.R, Crolla J.A, Alberman E.D. A cytogenetic study of human spontaneous abortions using banding techniques // Hum. Genet. 1975. V. 31. P. 177-196.

116. Crouse H.V. The controlling element in sex chromosome behavior in Sci-ara // Genetics. 1960. V. 45. P. 1429-1443.

117. Crouse H.V. An inducible change in state on the chromosomes of Sciara: its effects on the genetic components of the X // Chromosoma. 1966. V. 16. P. 391-340.

118. Daniely M., Aviram-Goldring A., Barkai G., Goldman B. Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from recurrent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization // Hum. Reprod. 1998. V.13.P. 805-809.

119. Davies W., Isles A.R., Wilkinson L.S. Imprinted gene expression in the brain // Neuroscience and Behavior Rev. 2005. V. 29. P. 421-430.

120. De Rycke M., Liebaers I., Van Steirteghem A. Epigenetic risks related to assisted reproductive technologies: Risk analysis and epigenetic inheritance // Hum. Reprod. 2002. V. 17. P. 2487-2494.

121. Dean W., Santos F., Reik W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer // Seminars in Cell and Developmental Biology. 2003. V. 14. P. 93-100.

122. DeBaun M.R., Niemitz E.L., McNeil D.E. et al. Epigenetic alterations of H19 and LIT1 distinguish patients with Beckwith-Wiedemann syndrome with cancer and birth defects // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 604-611.

123. DeBaun M.R., Niemitz E.L., Feinberg A.P. Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT1 and H19!/ Am. J. Hum. Genet. 2003. V. 72. P. 156-160.

124. Dejmek J., Vojtassak J., Malova J. Cytogenetic analysis of 1508 spontaneous abortions originating from south Slovakia // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1992. V. 46. P. 129-136.

125. Délavai K., Wagschal A., Feil R. Epigenetic deregulation of imprinting in congenital diseases of aberrant growth // BioEssays. 2006. V. 28. P. 453-459.

126. Delhanty J.D. Mechanisms of aneuploidy induction in human oogenesis and early embryogenesis // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 111. P. 237-244.

127. Delozier-Blanchet C.D. Cytogenetic anomalies and placental function // Revue Française de Gynecologie et d'Obstetrique. 1991. V. 86. № 12. P. 723-729.

128. Derhaag J.G., Coonen E., Bras M. Chromosomally abnormal cells are not selected for the extra-embryonic compartment of the human preimplantation embryo at the blastocyst stage // Hum. Reprod. 2003. V. 18. № 2. P. 2565-2575.

129. Devriendt K. Hydatidiform mole and triploidy: the role of genomic imprinting in placental development // Hum. Reprod. Upd. 2005. V. 11. P. 137-142.

130. DiRienzo A., Peterson A.C., Garza J.C., Valdes A.M. Mutational processes of simple sequence repeat loci in human populations // PNAS. 1994. V. 91. P. 3166-3170.

131. Dobrovolny R. et al. Relationship between X-inactivation and clinical involvement in Fabry heterozygotes. Eleven novel mutations in the alpha-galactosidase A gene in the Czech and Slovak population // J. Mol. Med. 2005. V. 83. P. 647-654.

132. Doherty A.S., Mann M.R.W., Tremblay K.D., et al. Differential effects of culture on imprinted H19 expression in the preimplantation mouse embryos 11 Biol. Reprod. 2000. V. 62. P. 1526-1535.

133. Dolinoy D.C., Weidman J.R., Jirtle R.L. Epigenetic gene regulation: Linking early developmental environment to adult disease // Reprod Toxicol, 2007. V. 23. P. 297-307.

134. Dowdy S.C., Gostout B.S., Shridhar V. et al. Biallelic methylation and silencing of paternally expressed gene 3 (PEG3) in gynecologic cancer cell lines // Gynecol. Oncol. 2005. V. 99. P. 126-134.

135. Dutly F., Baumer A., Kayserili H. et al. Seven cases of Wiedemann-Beckwith syndrome, including the first reported case of mosaic paternal isodisomy along the whole chromosome 11 // Am. J. Med. Genet. 1998. V. 79. P. 347-353.

136. Edgar B.A., Orr-Weaver T.L. Endoreplication cell cycles: more for less // Cell. 2001. V. 105, P. 297-306.

137. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy // Nature. 2004. V. 429. P. 457-463.

138. Eggermann T., Mergenthaler S., Eggermann K. et al. Identification of interstitial maternal uniparental disomy (UPD) (14) and complete maternal UPD (20) in a cohort of growth retarded patients // J. Med. Genet. 2001. V. 38. P. 86-89.

139. Ehrlich M. DNA methylation: normal development, inherited diseases and cancer // J. Clin. Ligand Assay. 2000. V. 23, P. 144-146.

140. Ellegren H. Heterogeneous mutation processes in human microsatellite DNA sequences // Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 400-402.

141. Engel E. A new genetic concept: uniparental disomy and its potential effect, isodisomy //Am. J. Med. Genet. 1980. V. 6. P. 137-143.

142. Engel E., Antonarakis S.E. Genomic imprinting and uniparental disomy in

143. Engel E., DeLozier-Blanchet C.D. Uniparental disomy, isodisomy, and imprinting: probable effects in man and strategies for their detections // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 40. P. 432-439.

144. Engel J.R., Smallwood A., Harper A. et al. Epigenotype-phenotype correlations in Beckwith-Wiedemann syndrome // J. Med. Genet. 2000. V. 37. P. 921-926.

145. Ephrussi B. The cytoplasm and somatic cell variation. New-York: Holt, Rinehart & Winston, 1964 - 320 p.

146. Esteller M., Cordon-Cardo C., Corn P.G., et al. pl4ARF silencing by promoter hypermethylation mediates abnormal intracellular localization of MDM2//Cancer Res. 2001. V. 61. P. 2816-2821.

147. Everett C.A., West J.D. Evidence for selection against tetraploid cells in teteraploid <—> diploid mouse chimaeras before the late blastocyst stage // Genetics Research., Camb. 1998. V. 72. № 3. P. 225-228.

148. Evsikov, S., Verlinsky Y. Mosaicism in the inner cell mass of human blastocysts//Hum. Reprod. 1998. V. 13. № 11. P. 3151-3155.

149. Falls J.G., Pulford D.J., Wylie A.A., Jirtle R.L. Genomic imprinting: implications for human disease // Am. J. Path. 1999. V. 154. P. 635-647.

150. Faustino P., Lavinha J., Marini M.G., Moi P. beta-Thalassemia mutation at -90CT impairs the interaction of the proximal CACCC box with both erythroid and nonerythroid factors // Blood. 1996. V. 88. P. 3248-3249.

151. Fazzari M.J., Greally J.M. Epigenomics: beyond CpG islands // Nat. Rev. Genet. 2004. V. 5. P. 446-455.

152. Feinberg A. Methylation meets genomics //Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 9-10.

153. Feinberg A.P., Cui H., Ohlsson R. DNA methylation and genomic imprinting: insights from cancer into epigenetic mechanisms // Seminars in Cancer Biol. 2002. V. 12. P. 389-398.

154. Feinberg A.P., Tycko B. The history of cancer epigenetics // Nat. Rev. Cancer. 2004. V. 4. P. 143-153.

155. Feinberg A.P., Ohlsson R., Henikoff S. The epigenetic progenitor origin of human cancer // Nat. Rev. Genet. 2006. V. 7. P. 21-33.

156. Ferrel J.E. Jr. Self-perpetuating states in signal transduction: positive feedback, double negative feedback and biostability // Curr Opin Cell Biol. 2002. V. 14. P. 140-148.

157. Ford C.E. Mosaicism and chimaeras // Br. Med. Bull. 1969. V. 25. P. 104-109.

158. Fraga M.F., Ballestar E., Paz M.F. et al. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins //PNAS. 2005. V. 102. P. 10604-10609.

159. Fragouli E., Wells D., Thornhill A., et al. Comparative genomic hybridization analysis of human oocytes and polar bodies // Hum. Reprod. 2006. V. 21. P. 2319-2328.

160. Fritz B., Asian M., Kalscheuer V. Low incidence of UPD in spontaneous abortions beyond the 5th gestational week // Eur. J. Hum. Genet. 2001 a. V. 9. P. 910-916.

161. Garfinkel M.D, Ruden D.M. Chromatin effects in nutrition, cancer, and obesity //Nutrition. 2004. V. 20. P. 56-62.

162. Garzicic B., Guc-Scekic M., Pilic-Radivojevic G., Ignjatovic M., Vilhar N. A case of monosomy 21 // Annales de Genetique. 1988. V. 31. № 4. P. 247-249.

163. Gatchel J.R., Zoghbi H.Y. Diseases of unstable repeat expansion: mechanisms and common principles //Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 743-755.

164. Geigl J.B., Obenauf A.C., Schwarzbraun T., Speicher M.R. Defining «chromosomal instability» // Trends in Genetics. 2008. V. 24. P. 64-69.

165. Geisler M., Kleinebrecht J. Cytogenetic and histologic analyses of spontaneous abortions // Hum. Genet. 1978. V. 45. P. 239-251.

166. Gicquel C., Gaston V., Mandelbaum J., et al. In vitro fertilization may increase the risk of Beckwith-Wiedemann syndrome related to the abnormal imprinting of the KCNQIOT gene // Am. J. Hum. Genet. 2003. V. 72. P. 1338-1341.

167. Gicquel C., Rossignol S., Cabrol S. et al. Epimutation of the telomeric imprinting center region on chromosome 1 lpl5 in Silver-Russell syndrome // Nat. Genet. 2005. V. 37. P. 1003-1007.

168. Gicquel C., El-Osta A., Le Bouc Y. Epigenetic regulation and fetal reprogramming // Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 2008. V. 22. P. 1-16.

169. Goldschmidt R. The material basis of evolution. New Haven: Yale University Press, 1940. - 436 p.

170. Golubovsky M.D. Postzygotic diploidization of triploids as a source of unusual cases of mosaicism, chimerism and twinning // Hum. Reprod. 2003. V. 18. P. 236-242.

171. Gonzalez-Gomez P., Bello M.J., Alonso M.E., et al. CpG island methylation status and mutation analysis of the RBI gene essential promoter region337and protein-binding pocket domain in nervous system tumour // Brit. J. Cancer. 2003. V. 88. P. 109-114.

172. Gonzalo S, Garcia-Gao M, Fraga M.F, et al. Role of the RBI family in stabilizing histone methylation at constitutive heterochromatin // Nat. Cell Biol. 2005. V. 7. P. 420-428.

173. Goto Y, Matsui J, Takagi N. Developmental potential of mouse tetraploid cells in diploid <r> tetraploid chimeric embryos // Int. J. Dev. Biol. 2002. V.46. P. 741-745.

174. Griffin D.K. The incidence, origin and etiology of aneuploidy // Int. Rev. Cytol. 1996. V. 167. P. 263-296.

175. Griffin D.K, Millie E.A, Redline R.W, Hassold T.J, Zaragoza M.V. Cytogenetic analysis of spontaneous abortions: Comparison of techniques and assessment of the incidence of confined placental mosaicism // Am. J. Med. Genet. 1997. V. 72. P. 297-301.

176. Guerneri S, Bettio D, Simoni G, Brambati B, Lanzani A, Fraccaro M. Prevalence and distribution of chromosome abnormalities in a sample of first trimester internal abortions // Hum. Reprod. 1987. V. 2. № 8. P. 735-739.

177. Gutierrez-Mateo C, Benet J, Wells D, et al. Aneuploidy study of human oocytes first polar body comparative genomic hybridization and metaphase II fluorescence in situ analysis // Hum. Reprod. 2004. V. 19. P. 2859-2868.

178. Hackman P, Gabbany G, Osterholm A.M. Spontaneous length variation in microsatellite DNA from human T-cell clones // Gen. Chrom. Cancer. 1995. V. 14. P. 215-219.

179. Hahnemann J.M, Vejerslev L.O. European collaborative research on mosaicism in CVS (EUROCROMIC) fetal and extrafetal cell lineages in 192 gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy // Am. J. Med. Genet. 1997. V. 70. P. 179-187.

180. Haig D. The (dual) origin of epigenetics // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 2004. V. LXIX. P. 1-4.

181. Haig D., Graham C. Genomic imprinting and the strange case of the insulin-like growth factor II receptor// Cell. 1991. V. 64. P. 1045-1046.

182. Hall J.G. Genomic imprinting: review and relevance to human diseases // Am. J. Hum. Pathol. 1990. V. 46. P. 857-873.

183. Halliday J., Оке К., Breheny S., et al. Beckwith-Wiedemann syndrome and IVF: a case-control study // Am. J. Hum. Genet. 2004. V. 75. P. 526-528.

184. Han Y.M., Wang W.H., Abeydeera L.R., Petersen A.L., Kim J.H., Murphy C., Day B.N., Prather R.S. Pronuclear location before the first cell division determines ploidy of polyspermic pig embryos // Biol. Reprod. 1999. V. 61. P. 1340-1346.

185. Hansmann M., Hackeloer B-J., Staudach A. Ultrasound diagnosis in obstetrics and gynecology.- Berlin.: Springer-Verlag, 1985. 495 p.

186. Harper J.C., Coonen E., Handy side A.H., Winston R.M., Hopman A.H., Delhanty J.D. Mosaicism of autosomes and sex chromosomes in morphologically normal, monospermic preimplantation human embryos // Prenat. Diagn. 1995. V. 15. № 1. P. 41-49.

187. Harper J.C., Delhanty J.D.A. Detection of chromosome abnormalities in human preimplantation embryos using FISH // J. Assist. Reprod. Genet. 1996. V. 13. P. 137-139.

188. Hassold Т., Chen N., Funkhouser J., Jooss Т., Manuel В., Matsuura J., Ma-tsuyama A., Wilson C., Yamane J.A., Jacobs P.A. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions //Ann. Hum. Genet. 1980. V. 44. P. 151-178.

189. Hassold T., Quillen S.D., Yamane J.A. Sex ratio in spontaneous abortions. Ann. Hum. Genet. 1983. V. 47. P. 39-47.

190. Hassold T., Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy //Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 280-291.

191. Heide E., Heide K.G., Rodewald A. Maternal uniparental disomy (UPD) for chromosome 2 discovered by exclusion of paternity // Am. J. Med. Genet. 2000. V. 92. P. 260-263.

192. Henderson D.J., Sherman L.S., Loughna S.C. Early embryonic failure associated with uniparental disomy for human chromosome 21 // Hum. Mol. Genet. 1994. V. 3. № 8. P. 1373-1376.

193. Henderson K.G., Shaw T.E., Barrett I.J., Telenius A.H.P., Wilson R.D., Kalousek D.K. Distribution mosaicism in human placenta // Hum. Genet. 1996. V. 97. P. 650-654.

194. Hendrich B., Bickmore W. Human disease with underlying defects in chromatin structure and modification // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2233-2242.

195. Hermeking H., Lengauer C., Polyak K., He T.C., Zhang L., Thiagalingam S., Kinzler K.W., Vogelstein B. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression // Molecular Cell. 1997. V. 1. P. 3-11.

196. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., Baylin S.B. Methyla-tion-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // PNAS. 1996. V. 93. P. 9821-9826.

197. Hernando E., Nahle Z., Juan G., et al. Rb inactivation promotes genomic instability by uncoupling cell cycle progression from mitotic control // Nature. 2004 V. 430. P. 797-802.340

198. Heyer E., Puymirat J., Dieltiers P., Bakker E., De Knijff P. Estimating Y chromosome specific microsatellite mutation frequencies using deep rooting pedigrees // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 799-803.

199. Higashimoto K., Soejima H., Saito T., Okumura K., Mukai T. Imprinting disruption of the CDKNIC/KCNQIOTI domain: the molecular mechanisms causing Beckwith-Wiedemann syndrome and cancer // Cytogenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 306-312.

200. Hile S.E., Yan G., Eckert K.A. Somatic mutation rates and specificities at TC/AG and GT/CA microsatellite sequences in nontumorogenic human lymphoblastoid cells // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 1698-1703.

201. Hitchins M.P., Wong J.J.L., Suthers G. et al. Inheritance of a cancer-associated MLH1 germ-line epimutation // N. Engl. J. Med. 2007. V. 356. P. 697-705.

202. Holliday R. The inheritance of epigenetic defects // Science. 1987. V. 238. P. 163-170.

203. Holliday R. Mutations and epimutations in mammalian cells // Mut. Res. 1991. V. 250. P. 351-363.

204. Holliday R. The significance of DNA methylation in cellular aging. In: Woodhead A.D., Blackett A.D., Hollaender A (eds). Molecular Biology of Aging. New-York: Plenum, 1984, pp. 269-283.

205. Holliday R., Pugh J. DNA modification mechanisms and gene activity during development// Science. 1975. V. 187. P. 226-232.

206. Honda R., Tanaka H., Yasuda H. Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53 // FEBS Letters. 1997. V. 420. P. 25-27.

207. Horiuchi I., Hashimoto T., Tsuji Y., Shimada H., Furuyama J., Koyama K. Direct assessment of triploid cells in mosaic human fetuses by fluorescence in-situ hybridization // Mol. Hum. Reprod. 1997. V. 3. № 5. P. 445-450.

208. Horsthemke B. Epimutations in human disease // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. V. 310. P. 45-59.

209. Horsthemke B., Ludwig M. Assisted reproduction: the epigenetic perspective // Hum. Reprod. Upd. 2005. V. 11. P. 473-482.

210. Hotchkiss R.D. The quantitative separation of purines, pirimidines and nucleosides by paper chromatography //J. Biol. Chem. 1948. V. 168. P. 315-332.

211. Huang M-J., Yeh K-T, Shin H-C, Wang Y-F., Lin T-H., Chang J-Y, Shin M-C., Chang J-G. The correlation between CpG methylation and protein expression of P16 in oral squamous carcinomas // Int. J. Mol. Med. 2002. V. 10. P. 551-554.

212. Huang C., Sloan E.A., Boerkoel C.F. Chromatin remodeling and diseases // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. V. 13. P. 246-252.

213. Huang Q.-Y., Xu F.-H., Shen H., Deng H.-Y. Mutation pattern at dinucleo-tide microsatellite loci in humans // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 625-634.

214. Hunt P.A., Hassold T.A. Human female meiosis: what makes a good egg go bad? // Trends in Genetics. 2008. V. 24. № 2. P. 86-93.

215. Hunt P.A., Jacobs P.A. In vitro growth and chromosome constitution of placental cells // Cytogenet. Cell Genet. 1985. V. 39. P. 1-6.

216. Hurst L.D., Ellegren H. Sex biases in the mutation rate // Trends Genet. 1998. V. 14. P. 446-452.

217. Huxley J. Epigenetics //Nature. 1956. V. 177. P. 807.

218. Huxley J. Cancer biology: Viral and epigenetic // Biol. Rev. 1957. V. 32. P. 1.

219. Ionov Y., Peinado M.A., Malkhosyan S., Shibata D., Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis //Nature. 1993. V. 363. P. 558-561.342

220. Isaac C.E., Francis S.M., Martens A.L. et al. The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin // Mol. Cell Biol. 2006. V. 26. № 9. P. 3659-3671.

221. ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaeffer L.G., Tommerup N. (eds); S. Karger, Basel. 2005. 130 p.

222. Jablonka E. Epigenetic epidemiology // Int. J. Epidemilogy. 2004. V. 33. P. 929-935.

223. Jablonka E., Lamb M. The changing concepts of epigenetics // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. V. 981. P. 82-96.

224. Jablonka E., Lamb M. Epigenetic inheritance systems. In: Jablonka E., Lamb M. Evolution in four dimensions, MIT Press, 2005, P. 242-265.

225. Jacob S., Moley K. Gametes and embryo epigenetic reprogramming affect developmental outcome: Implication for assisted reproductive technologies // Pediatr. Res. 2005. V. 58. P. 437-446.

226. Jacobs P.A. The chromosomal complement of human gametes // Oxford. Rev. Repr. Biol. 1992. V. 14. P. 48-72.

227. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat. Genet. 2003. V. 33 (Suppl.). P. 245-254.

228. James R.M., Klerkx A.H., Keighren M., Flockhart J.H., West J.D. Restricted distribution of tetraploid cells in mouse tetraploid diploid chimeras // Dev. Biol. 1995. V. 167. P. 213-226.

229. James R.S., Jacobs P.A. Molecular studies of the aetiology of trisomy 8 in spontaneous abortions and the liveborn population // Hum. Genet. 1996. V. 97. P. 283-286.

230. Jenuwein T, Allis C.D. Translating the histone code // Science. 2001. V. 293. P. 1074-1080.

231. Ji Y, Eichler E.E, Schwartz S, Nicholls R.D. Structure of chromosomal duplicons and their role in mediating human genomic disorders // Genome Res. 2000. V.10.P. 597-610.

232. Jiang Y-H, Bressler J, Beaudet A. Epigenetics and human disease // Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2004. V. 5. P. 479-510.

233. Jirtle R.L. Genomic imprinting and cancer // Exp. Cell Res. 1999. V. 248. P. 18-24.

234. Jirtle R.L, Skinner M.K. Environmental epigenomics and disease susceptibility //Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. P. 253-262.

235. Jobanputra V, Sobrino A, Kinney A, Kline J, Warburton D. Multiplex interphase FISH in spontaneous abortions // Hum. Reprod. 2002. V. 17. P. 1166-1170.

236. Johns MB Jr, Paulus-Thomas JE. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol // Anal Bio-chem. 1989. V. 180. P. 276-278.

237. Johnson C.A. Chromatin modification and disease // J Med Genet. 2000. V. 37. P. 905-915.

238. Jones P.A, Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer//Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P. 415-428.

239. Johnson A, Wapner R.J. Mosaicism: implication for postnatal outcome // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 1997. V. 9. P. 126-135.

240. Judson H, Hayward B.E, Sheridan E, Bonthron D.T. A global disorder of imprinting in the human female germ line //Nature. 2002. V. 416. P. 539-542.

241. Kaati G, Bygren L.O, Edvinsson S. Cardiovascular and diabetes mortality determined by nutrition during parents' and grandparents' slow growth period // Eur. J. Hum. Genet. 2002. V. 10. P. 682-688.

242. Kagami M, Nagai T, Fukami M. et al. Silver-Russell syndrome in a girl born after in vitro fertilization: partial hypermethylation at the differentiallymethylated region of PEG1/MESTII J. Assist. Reprod. Genet. 2007. V. 24. P. 131-136.

243. Kajii T., Ferrier A., Niikawa N., Takahara H., Ohama K., Avirachan S. Anatomic and chromosomal anomalies in 639 spontaneous abortuses // Hum. Genet. 1980. V. 55. P. 87-98.

244. Kajii T., Ohama K. Androgenetic origin of hydatidiform mole // Nature. 1977. V. 268. P. 633-634.

245. Kalousek D.K. Confined placental mosaicism and uniparental disomy // Functional and Developmental Morphology. 1994a. V. 4. № 2. P. 93-98.

246. Kalousek D.K. Current topic: confined placental mosaicism and intrauterine fetal development // Placenta. 1994b. V. 15. P. 219-230.

247. Kalousek D.K. Early spontaneous abortion: morphologic and karyotypic findings in 3912 cases // Birth Defects Original Article Series. 1993. V. 29. № 1. P. 53-61.

248. Kalousek D.K. Pathogenesis of chromosomal mosaicism and its effect on early human development // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 91. P. 39-45.

249. Kalousek D.K., Barrett I. Genomic imprinting related to prenatal diagnosis //Prenat. Diagn. 1994. V.14. №13. P. 1191-1201.

250. Kalousek D.K., Barrett I.J., Gartner A.B. Spontaneous abortions and confined placental mosaicism // Hum. Genet. 1992. V. 88. № 6. P. 642-646.

251. Kalousek D.K., Dill F.J. Chromosomal mosaicism confined to the placenta in human conceptions // Science. 1983. V. 221. P. 665-667.

252. Kamijo T., Weber J.D., Zambetti G., et al. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2 // Med. Sci. 1998. V. 95. P. 8292-8297.

253. Kamikihara T., Arima T., Kato K. et al. Epigenetic silencing of the imprinted gene ZAC by DNA methylation in the progression of human ovarian cancer // Int. J. Cancer. 2005. V. 115. P. 690-700.345

254. Kaneko-Ishino Т., Kohda Т., Ono R., Ishino F. Complementation hypothesis: the necessity of a monoallelic expression mechanism in mammalian development // Cytogenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 24-30.

255. Kawakami Т., Chano Т., Minami K. et al. Imprinted DLK1 is a putative tumor suppressor gene and inactivated by epimutation at the region upstream of GTL2 in human renal cell carcinoma // Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. P. 821-830.

256. Kayser M., Roewer L., Hedman M. Characteristic and frequency of germline mutations at microsatellite loci from the human Y chromosome, as revealed by direct observation in father/son pairs // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 66. P. 1580-1588.

257. Khosla S., Dean W., Brown D., et al. Culture of preimplantation mouse embryos affects fetal development and the expression of imprinted genes // Biol. Reprod. 2001a. V. 64. P. 918-926.

258. Kiaris H., Ergazaki M., Spandidos D.A. Microsatellite instability in aborted embryos // Mol. Hum. Reprod. 1996. V. 2. P. 72-74.

259. Kimura M., Crow J.F. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics. 1964. V. 49. P. 725-738.

260. Klenova E.M., Morse H.C.III, Ohlsson R, Lobanenkov V.V. The novel BORIS + CTCF gene family is uniquely involved in the epigenetics of normal biology and cancer // Seminars in Cancer Biology. 2002. V. 12. P. 399-314.

261. Knudsen E.S., Knudsen K.E. Retinoblastoma tumor suppressor: where cancer meets the cell cycle // Exp. Biol. Med. 2006. V. 231. P. 1271-1281.

262. Knudson A.G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // PNAS. 1971. V. 69. P. 820-823.

263. Kobayshi S., Uemura H., Kohda T. et al. No evidence of PEG 1/MEST gene mutations in Silver-Russell syndrome patients // Am. J. Med. Genet. 2001. V. 104. P. 225-231.

264. Kohlhase J., Janssen B., Weidenauer K. et al. First confirmed case with paternal uniparental disomy of chromosome 16 // Am. J. Med. Genet. 2000. V. 91. P. 190-191.

265. Kondo M., Matsuoka S., Uchida H. et al. Selective maternal-allele loss in human lung cancers of the maternally expressed p57KIP2 gene at 1 lpl5.5 //Oncogene. 1996. V. 12. P. 1365-1368.

266. Kondo Y., Tsukishiro S., Tanemura M., Sugiura-Ogasawara M., Suzumori K., Sonta S. Maternal uniparental disomy of chromosome 16 in a case of spontaneous abortion // J. Hum. Genet. 2004. V. 49. P. 177-181.

267. Kops G.J.P.L., Weaver B.A.A., Cleveland D.W. On the road to cancer: ane-uploidy and the mitotic checkpoint // Nat. Rev. Genet. 2005. V. 5. P. 773-785.

268. Kornberg A., Bertsch L.L., Jackson J.F., Korana H.G. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XIV. Oligonucleotides as templates and the mechanism of their replication // PNAS. 1964. V. 51. P. 315-323.

269. KotzotD. Abnormal phenotypes in uniparental disomy: Fundamental aspects and a critical review with bibliography of UPD other than 15 // Am. J. Med. Genet. 1999. V. 82. P. 265-274.

270. Kotzot D. Prenatal testing for uniparental disomy: indications and clinical relevance // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2008. V. 31. P. 100-105.

271. Koudstaal J., Braat D., Bruinse H., et al. Obstetric outcome of singleton pregnancies after IVF: a matched control study in four Dutch university hospitals//Hum. Reprod. 2000. V. 15. P. 1819-1825.

272. Krebs E.T. Pathology of the trophoblast//JAMA. 1946 a. V. 131. P. 1527.

273. Krebs E.T. Trophoblast elements in cancer // Science. 1946 b. V. 104. P. 302.

274. Kristiansen M. et al. High frequency of skewed X inactivation in young breast cancer patients // J. Med. Genet. 2002. V. 39. P. 30-33.

275. Kubota T., Das S., Christian L.S. et al. Methylation-specific PCR simplifies imprinting analysis //Nat. Genet. 1997. V. 16. P. 16-17.

276. Kuliev A., Verlinsky Y. Meiotic and mitotic nondisjunction: lessons from preimplantation genetic diagnosis // Hum. Reprod. Upd. 2004. V. 10. P. 401-407.

277. Kuroiwa Y., Kaneko-Ishino T., Kagitani F. et al. Peg3 imprinted gene on proximal chromosome 7 encodes for a zinc finger protein // Nat. Genet. 1996. V. 12. P. 186-190.

278. Kuslich C.D., Kobori J.A., Mohapatra G. Prader-Willi syndrome is caused by disruption of the SNRPN gene // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 70-76.

279. Lamb M.J. Epigenetic inheritance and aging // Rev. Clin. Gerontol. 1994. V. 4. P. 97-105.

280. Landman O.E. The inheritance of acquired characteristics // Ann. Rev. Genet. 1991. V. 25. P. 1-20.

281. Lau A.W., Brown C.J., Penaherrera M., Langlois S., Kalousek D.K., Robinson W.P. Skewed X-chromosome inactivation is common in fetuses or newborns with confined placental mosaicism // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 61. P. 1353-1361.

282. Lauritsen JG. Aetiology of spontaneous abortion // Acta Obstet Gynecol Scand. 1976. Suppl. 52. P. 1-29.

283. Lauster R., Trautener T.A., Noyer-Widner M. Cytosin-specific type II DNA methyltransferases. A conserved enzyme core with variable target-recognizing domains // J. Mol. Biol. 1989. V. 206. P. 305.

284. Ledbetter D.H., Engel E. Uniparental disomy in humans: development of an imprinting map and its implications for prenatal diagnosis // Hum. Mol. Genet. 1995. V. 4. P. 1757-1764.

285. Ledbetter D.H., Zachary J.M., Simpson J.L., Golbus M.S., Pergament E.,

286. Lederberg J. Genetic approaches to somatic cell variation: Summary comment//J. Cell Comp. Physiol. 1958. V. 52. (Suppl. 1). P. 383.

287. Leduc C., Claverie P., Eymin B. et al. pl4ARF promotes RB accumulation through inhibition of its Tip60-dependent acetylation // Oncogene. 2006. V. 25. P. 4147-4154.

288. Lee J.T. Molecular links between X-inactivation and autosomal imprinting: X-inactivation as a driving force for the evolution of imprinting? // Current Biol. 2003. V. 13. P. 242-254.

289. Lefebvre L., Viville S., Barton S.C. et al. Abnormal maternal behaviour and growth retardation associated with loss of the imprinted gene Mest II Nat. Genet. 1998. V. 20. P. 163-169.

290. Leopoldino A.M., Pena S.D. The mutational spectrum of human autosomal tetranucleotide microsatellites // Hum. Mutat. 2003. V. 21. P. 71-79.

291. Lestou V.S., Kalousek D.K. Confined placental mosaicism and intrauterine fetal growth // Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 1998. V. 79. P. 223-226.

292. Levinson G., Gutman G.A. Slipped strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 203-221.

293. Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development//Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P. 662-673.

294. Li Y., Hirokazu N., Ohno T., et al. Aberrant DNA methylation of p57kip2 gene in the promoter region in lymphoid malignancies of B-cell phenotype //Blood. 2002. V. 100. P. 2572-2577.

295. Lin C., De Braekeleer M., Jamro H. Cytogenetic studies in spontaneous abortions: the Calgary experience // Can. J. Genet. Cytol. 1985. V. 27. P. 565-570.

296. Loeb L.A. Cancer cells exhibit a mutator phenotype // PNAS. 1997. V. 94. P. 2103-2105.

297. Lomax B.L, Kalousek D.K, Kuchiuca B.D, Barrett I.J, Harrison K.J, Sa-favi H. The utilization of interphase cytogenetic analysis for the detection of mosaicism // Hum. Genet. 1994. V. 93. P. 243-247.

298. Lomax B.L, Tang S, Separovic E, et al. Comparative genomic hybridization in combination with flow cytometry improves results of cytogenetic analysis of spontaneous abortions // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 66. P. 1516-1521.

299. Lombardi S.J, Dev V.G. Cytogenetic discrepancies in spontaneous abortions with direct and culture analysis of chorionic villi // Am. J. Obstet. Gynecol. 1992. V. 170. P. 264.

300. Los F J, van Opstal D, van den Berg C. The development of cytogeneti-cally normal, abnormal and mosaic embryos: a theoretical model // Hum. Reprod. Upd. 2004. V. 10. № 1. P. 79-94.

301. Lucifero D, Mann M.R.W, Bartolomei M.S. Trasler J.M. Gene-specific timing and epigenetic memory in oocyte imprinting // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. P. 839-849.

302. Ludwig M, Katalinic A, Groß S. et al. Increased prevalence of imprinting defects in patients with Angelman syndrome born to subfertile couples // J. Med. Genet. 2005. V. 42. P. 289-291.

303. Lumey L.H. Decreased birthweights in infants after maternal in utero exposure to the Dutch famine of 1944-1945 // Paediatr Perinat Epidemiol. 1992. V. 6. P. 240-253.

304. Mackay D.J.G, Hahnemann J.M.D, Boonen S.E. et al. Epimutation of the TNDM locus and the Beckwith-Wiedemann syndrome centromeric locus in individuals with transient neonatal diabetes mellitus // Hum. Genet. 2006. V. 119. P. 179-184.

305. Macklon N.S., Geraedts J.P., Fauser B.C. Conception to ongoing pregnancy: the "black box" of early pregnancy loss // Hum. Reprod.Upd. 2002. V. 8. P. 333-343.

306. Magli M.C., Jones G.M., Gras L., Gianaroli L., Korman I., Trounson A.O. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro II Hum. Reprod. 2000. V. 15. P. 1781-1786.

307. Maher E.R. Imprinting and assisted reproductive technology // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. Review Issue 1. R. 133-138.

308. Maher E.R., Afnan M., Barratt C.L. Epigenetic risks related to assisted reproductive technologies: Epigenetics, imprinting, ART and icebergs? // Hum. Reprod. 2003a. V. 18. P. 2508-2511.

309. Maher E.R., Brueton L.A., Bowding S.C. et al. Beckwith-Wiedemann syndrome and assisted reproductive technology (ART) // J. Med. Genet. 2003b. V. 40. P. 62-64.

310. Mahmood R., Brierley C.H., Faed M.J. Mechanisms of maternal ane-uploidy: FISH analysis of oocytes and polar bodies in patients undergoing assisted conception // Hum. Genet. 2000. V. 106. P.620-626.

311. Mahtani M.M., Willard H.F. A polymorphic X-linked tetranucleotide repeat locus displaying a high rate of new mutation: implications for mechanisms of mutation at short tandem repeat loci // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 431-437.

312. Mai M., Qian C., Yokomizo A. et al. Loss of methylation and allele switching ofp73 in renal cell carcinoma// Oncogene. 1998a. V. 17. P. 1739-1741.

313. Mai M., Yokomizo A., Qian C. et al. Activation ofp73 silent allele in lung cancer // Cancer. Res. 1998b. V. 58. P. 2347-2349.

314. Makova K.D., Li W.H. Strong male-driven evolution of DNA sequences in humans and apes // Nature. 2002. V. 416. P. 624-626.

315. Malmgren H., Sahlen S., Inzunza J., Aho M., Rosenlund B., Fridstrom M., Hovatta O., Ahrlund-Richter L., Nordenskjold M., Blennow E. Single cell

316. CGH analysis reveals a high degree of mosaicism in human embryos from patients with balanced structural chromosome aberrations // Mol. Hum. Reprod. 2002. V. 8. P. 502-510.

317. Malumbres M., Perez De Castro I., Hernandez M.I., Jimenez M., Pellicer A. Cellular response to oncogenic ras involves induction of the Cdk4 and Cdk6 inhibitor pl5 (INK4b) // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. P. 2915-2925.

318. Mann M., Lee S., Doherty A., et al. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture // Development. 2004. V. 131. P. 3727-3735.

319. Manning M., Lissens W., Bonduelle M., et al. Study of DNA-methylation patterns at chromosome 15ql 1-ql3 in children born after ICSI reveals no imprinting defects //Mol. Hum. Reprod. 2000. V. 6. P. 1049-1053.

320. Margolis R.L., Lohez O.D., Andreassen P.R. G1 tetraploidy checkpoint and the suppression of tumorigenesis // J. Cell. Biochem. 2003. V. 88. P. 673-683.

321. Marques C.J., Carvalho F., Sousa M., et al. Genomic imprinting in disruptive spermatogenesis // Lancet. 2004. V. 363. P. 1700-1702.

322. Martin D.I., Tsai S.F., Orkin S.H. Increased gamma-globin expression in a nondeletion HPFH mediated by an erythroid-specific DNA-binding factor //Nature. 1989. V. 338. P. 435-438.

323. Martin D.I.K., Ward R., Suter C.M. Germline epimutation: a basis for epi-genetic disease in human // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1054. P. 68-77.

324. Matzke M.A., Mette M.F., Kanno T., Matzke A.J., Does the intrinsic instability of aneuploid genomes have a causal role in cancer? // Trends Genetics. 2003.V. 19. P.253-256.

325. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both maternal and paternal genomes // Cell. 1984. V. 37. P. 179-183.

326. McLaughlin K.J., Szabo P., Haegel H., Mann J.R. Mouse embryos with paternal duplication of an imprinted chromosome 7 region die at midgestation and lack placental spongiotrophoblast // Development. 1996. V. 122. № 1. P. 265-270.

327. Menasha J., Levy B., Hirschhorn K., Kardon N.B. Incidence and spectrum of chromosomal abnormalities in spontaneous abortions: New insights from a 12-year study // Genet. Med. 2005. V. 7. P. 251-263.

328. Merz E. Ultrasound in gynecology and obstetrics. Stuttgart.: Georg Thieme Verlag, 1991. - 343 p.

329. Midgley C.A., Desterro J.M.P., Saville M.K., Howard S., Sparks A., Hay R.T., Lane D.P. An N-terminal pl4ARF peptide blocks Mdm2-dependent ubiquitination in vitro and can activate p53 in vivo II Oncogene. 2000. V. 19. P. 2312-2323.

330. Minelli E., Buchi C., Granata P., et al. Cytogenetic findings in echographi-cally defined blighted ovum abortions //Ann. Genet. 1993. V. 36. P. 107-110.

331. Minks J., Robinson W.P., Brown C.J. A skewed view of X chromosome inactivation //J. Clin. Invest. 2008. V. 118. P. 20-23.

332. Miyoshi N., Barton S.C., Kaneda M., Hajkova P., Surani M.A. The continuing quest to comprehend genomic imprinting // Cytogenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 6-11.

333. Monk M. Mammalian development. A practical approach. Oxford: IRL, 1987.-280 p.

334. Morgan H.D., Sutherland H.G.E., Martin D.I.K., Whitelaw E. Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse // Nat. Genet. 1999. V. 23. P. 314-318.

335. Morison I.M., Reeve A.E. A catalogue of imprinted genes and parent-of-origin effects in human and animals // Hum. Mol. Genet. 1998. V. 7. № 10. P. 1599-1609.

336. Munne S., Weier H.U., Grifo J., Cohen J. Chromosome mosaicism in human embryos // Biology of Reproduction. 1994. V. 51. P. 373-379.353

337. Murdoch S., Djuric U., Mazhar B. et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans // Nat. Genet. 2006. V. 38. P. 300-302.

338. Murphy S.K., Jirtle R.L. Imprinting evolution and the price of silence // BioEssays. 2003. V. 25. P. 577-588.

339. Murrell A., Heeson S., Cooper W.N. et al. An association between variants in the IGF2 gene and Beckwith-Wiedemann syndrome: interaction between genotype and epigenotype // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. P. 247-255.

340. Nagaishi M., Yamamoto T., Iinuma K., Shimomura K., Berend S.A., Knops J. Chromosome abnormalities identified in 347 spontaneous abortions collected in Japan // J. Obstet. Gynaecol. Res. 2004. V. 30. P. 237-241.

341. Nanney D.L. Epigenetic control systems // PNAS. 1958. V. 44. P. 712.

342. Nanney D.L. Epigenetic factors affecting mating type expression in certain ciliates // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 1959. V. 23. P. 327.

343. Nawros H., Koch W., Anker P. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients //Nat. Med. 1996. V. 2. P. 1035-1037.

344. Nazarenko S.A., Sazhenova E.A., Baumer A., Schinzel A. Segmental maternal heterodisomy of the proximal part of chromosome 15 in an infant with Prader-Willi syndrome // Eur. J. Hum. Genet. 2004. V. 12. P. 411-414.

345. Nazarenko S.A., Puzyrev V.P., Sukhanova N.N. Parental origin of Turner's syndrome in the Siberian populations in connection with analysis of chromosomal imprinting // Intern. Conf. "Genomic imprinting". Florence, Italy. 1994. P. 100.

346. Nazlican H., Zeschnigk M., Claussen U. et al. Somatic mosaicism in patients with Angelman syndrome and an imprinting defect // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. P. 2547-2555.

347. Ng H-H., Bird A. DNA methylation and chromatin modification // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 158-163.

348. Nicholls R.D., Ohta T., Gray T.A. Genetic abnormalities in Prader-Willi syndrome and lessons from mouse models // Acta Paediatr. 1999. V. 88. P. 99-104.

349. Nicholls R.D., Knepper J.L. Genome organization, function, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes // Ann. Rev. Genomics. Hum. Genet. 2001. V. 2. P. 153-175.

350. Niemitz E.L., Feinberg A. Epigenetics and assisted reproductive technology: a call for investigation // Am. J. Hum. Genet. 2004. V. 74. P. 599-609.

351. Nomura S., Goto S., Nakanashi T. et al. Autocrine mechanism of epidermal growth in choriocarcinoma cell proliferation // Mol. Cell Endocrinol. 1996. V. 124. P. 63-69.

352. Novik K.L., Nimmrich I., Gene B., Maier S., Pieppenbrock C., Olek A., Beck S. Epigenomics: Genome-wide study of methylation phenomena // Current Issues Molecular Biology. 2002. V. 4. P. 111-128.

353. Ohno M., Maeda T., Matsunobi A. A cytogenetic study of spontaneous abortions with direct analysis of chorionic villi // Obstet. Gynecol. 1991. V. 77. P. 394-398.

354. Ohlsson R., Holmgren L., Glaser A. et al. Insulin-like growth factor and short-range stimulatory loops in control of human placental growth // EMBO J. 1989. V. 8. P. 1993-1999.

355. Ohta T., Gray T.A., Rogan P.K. et al. Imprinting-mutation mechanisms in Prader-Willi syndrome // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 397-413.

356. Ohta T, Kimura M. The model of mutation appropriate to calculate the number of electrophoretically detectable alleles in a genetic population // Genet. Res. 1973. V. 22. P. 201-204.

357. Okada K, Hirota E, Mizutani Y. et al. Oncogenic role of NALP7 in testicular seminomas // Cancer Sci. 2004. V. 95. P. 949-954.

358. Olivennes F, Fanchin R, Ledee N, et al. Perinatal outcomes of pregnancy after GnRH antagonist treatment during ovarian stimulation for conventional IVF: a preliminary report//Hum. Reprod. 2001. V. 16. P. 1588-1591.

359. Orstavik K.H. Skewed X-inactivation in healthy individuals and in different diseases // Acta Pediatrica. 2006. Suppl 451. P. 24-29.

360. Orstavik K.H, Eiklid K, van der Hagen C.B, et al. Another case of imprinting defects in a girl with Angelman syndrome who was conceived by intracytoplasmic semen injection // Am. J. Hum. Genet. 2003. V. 72. P. 218-219.

361. Osborne R.J, Thornton C.A. RNA-dominant diseases // Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. R162-R169.

362. Park J.J, Kang J.K, Hong S, Ryu E.S, Kim J-Il, Lee J.H, Seo J-S. Genome-wide combination profiling of copy number and methylation offers an approach for deciphering misregulation and development in cancer cells // Gene. 2008. V. 407. P. 139-147.

363. Pearson C.E, Edamura K.N, Cleary J.D. Repeat instability: mechanisms of dynamic mutations // Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 729-742.

364. Pegoraro E, Whataker J, Mowery-Rushton P, Surti U, Lanasa M, Hoffman EP. Familial skewed X inactivation: a molecular trait associated with high spontaneous abortion rate maps to Xq28 // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 61. P. 160-170.

365. Pellisier M.C., Philip N., Voelckel-Baeteman M.A. Mattei M.G., Mattei J.F. Monosomy 21: a new case confirmed by in situ hybridization // Human Genetics. 1987. V. 75. № 1. P. 95-96.

366. Pembrey M.E. Imprinting and transgenerational modulation of gene expression: human growth as a model // Acta. Genet. Med. Gemellol (Roma). 1996. V. 45. P. 111-125.

367. Pembrey M.E. Time to take epigenetic inheritance seriously // Eur J Hum Genet. 2002. V. 10. P. 669-671.

368. Pembrey M.E., Bygren L.O., Kaati G. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans // Eur J Hum Genet. 2006. V. 14. P. 159-166.

369. Perk J. Makedonski K., Lande L. The imprinting mechanism of the Prader-Willi/Angelman region // EMBO J. 2002. V. 21. P. 5807-5814.

370. Petronis A. Human morbid genetics revisited: relevance of epigenetics // Trends Genet. 2001. V. 17. P. 142-146.

371. Petronis A. Epigenetics and twins: three variations on the theme // Trends Genet. 2006. V. 22. P. 347-350.

372. Plass C., Soloway P.D. DNA methylation, imprinting and cancer // Eur. J. Hum. Genet. 2002. V. 10. P. 6-16.

373. Plenge R.M., Stevenson R.A., Lubs H.A, Schwartz C.E., Willard H.F. Skewed X-chromosome inactivation is a common feature of X-linked mental retardation disorders // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 71. P. 168-173.

374. Poon L.L., Leung T.N., Lau T.K., Chow K.C. Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 35-41.

375. Procter SE, Watt JL, Gray ES. Cytogenetic analysis in 100 spontaneous abortions in North-East Scotland // Clin. Genet. 1986. V. 29. P. 101-103.

376. Qumsiyeh M.B. Chromosome abnormalities in the placenta and spontaneous abortions // J. Maternal-Fetal Med. 1998. V. 7. P. 210-212.

377. Rakyan V.K., Blewitt M.E., Druker R., Preis J.I., Whitelaw E. Metastable epialleles in mammals // Trends in Genetics. 2002. V. 18. № 7. P. 348-351.

378. Rassoulzadegan M., Grandjean V., Gounon P. et al. RNA-mediated non-mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse // Nature. 2006. V. 441. P. 469-474.

379. Redline R.W., Hassold T., Zaragoza M. Determinants of villous trophoblastic hyperplasia in spontaneous abortions // Mod. Pathol. 1998. V. 11. P. 762-768.

380. Rehder H., Coerdt W., Eggert R., Klink F., Schwinger E. Is there a correlation between morphological and cytogenetic findings in placental tissue from early missed abortions? // Hum. Genet. 1989. V. 82. № 4. P. 377-385.

381. Reik W., Surani A. Genomic imprinting. Oxford: Oxford University Press, 1997.-245 p.

382. Reik W., Dean W., Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development// Science. 2001. V. 293. P. 1089-1093.

383. Reik W., Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome //Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 21-32.

384. Rice J.C., Briggs S.D., Ueberheide B. et al. Histone methytransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains // Mol Cell. 2003. V. 12. P. 1591-1598.

385. Rieffel S.M., Crouse H.V. The elimination and differentiation of chromosomes in the germ line of Sciara // Chromosoma. 1966. V. 25. P. 357-364.

386. Robertson K.D. DNA methylation and human disease // Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 597-610.

387. Robertson K.D., Wolffe A.P. DNA methylation in health and disease // Nat. Rev. Genet. 2000. V. 1. P. 11-19.

388. Robinson W.P., Bernasconi F., Lau A., McFadden D.E. Frequency of mei-otic trisomy depends on involved chromosome and mode of ascertainment // Am. J. Med. Genet. 1999. V. 88. P. 34-42.

389. Robinson W.P. Mechanisms leading to uniparental disomy and their clinical consequences // Bioessays. 2000. V. 22. P. 452-459.

390. Rodenhiser D., Mann M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications // CMAJ. 2006. V. 174. P. 341-348.

391. Rolf D.A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: % and the problem of small samples // Mol. Biol. Evol. 1989. V. 6. P.539-545.

392. Rooney D.E., Czepulkowski B.H. Human cytogenetics. A practical approach. New York: Oxford University Press, 1992. V. 1. - 274 p.

393. Rougeulle C., Cardoso C., Fontes M. et al. An imprinted antisense RNA overlaps UBE3A and a second maternally expressed transcript // Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 15-16.

394. Rush E.B., Calvano J.E., vanZee K.J. Microsatellite instability in breast cancer//Ann. Surg. Oncol. 1997. V. 4. P. 310-315.

395. Russo D., Cogliati F., Viri M., Cavalleri F., Selicorni A. Novel mutations of ubiquitin protein ligase 3A gene in Italian patients with Angelman syndrome // Hum. Mutat. 2000. V. 15. P. 387.

396. Russo V.E.A., Martienssen R.A., Riggs A.D. Epigenetic mechanisms of gene regulation. New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996. - 692 p.

397. Saito S., Sakakura S., Enomoto M. et al. Hepatocyte growth factor promotes the growth of cytotrophoblast by paracrine mechanism // J. Biochem. (Tokyo). 1995. V. 117. P. 671-676.

398. Sajantila A., Lukka M., Syvanen A-C. Experimentally observed germline mutations at human micro- and minisatellite loci // Eur. J. Hum. Genet. 1999. V. 7. P. 263-266.

399. Salafsky I.S., MacGregor S.N., Claussen U., von Eggeling F. Maternal UPD 20 in an infant from a pregnancy with mosaic trisomy 20 // Prenat. Diagn. 2001. V. 21. P. 860-863.359

400. Salisbury J.L. The contribution of epigenetic changes to abnormal centro-somes and genomic instability in breast cancer // J. Mammal Gland Biology and Neoplasia. 2006. V. 6. P. 203-212.

401. Sanchez J.M., Franzi L., Collia F., De Diaz S.L., Panal M., Dubner M. Cytogenetic study of spontaneous abortions by transabdominal villus sampling and direct analysis of villi // Prenat. Diagn. 1999. V. 19. P. 601-603.

402. Sandalinas M., Sadowy S., Alikani M., Calderón G., Cohen J., Munne S. Developmental ability of chromosomal abnormal embryos to develop to the blastocysts stage // Hum. Reprod. 2001. V. 16. P. 1954-1958.

403. Santos-Rebouqas C.B., Pimentel M.M.G. Implication of abnormal epigenetic patterns for human diseases // Eur. J. Hum. Genet. 2007. V. 15. P. 10-17.

404. Sasaki H., Matsui Y. Epigenetic events in mammalian germ-cell development: reprogramming and beyond // Nat. Rev. Genet. 2008. V. 9. P. 129-140.

405. Scelfo R.A., Schwienbacher C., Veronese A. et al. Loss of methylation at chromosome llpl5.5 is common in human adult tumors // Oncogene. 2002. V. 21. P. 2564-2572.

406. Schaeffer A.J., Chung J., Heretis K., et al. Comparative genomic hybridization array analysis enhances the detection of aneuploidies and submicro-scopic imbalances in spontaneous miscarriages // Am. J. Hum. Genet. 2004. V. 74. P. 1168-1174.

407. Schonherr N. Meyer E., Eggermann K. et al. (Epi)mutations in lip 15 significantly contribute to Silver-Russell syndrome: but are they generally involved in growth retardation? // Eur. J. Med. Genet. 2006. V. 49. P. 414-418.

408. Schonherr N., Meyer E., Roos A. et al. The centromeric llpl5 imprinting centre is also involved in Silver-Russell syndrome // J. Med. Genet. 2007. V. 44. P. 59-63.

409. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosome // Lancet. 1971. V. 2. P. 971-972.

410. Shaffer L.G., McCaskill C., Adkins K., Hassold T.J. Systematic search for uniparental disomy in early fetal losses: the results and a review of the literature // Am. J. Med. Genet. 1998. V. 79. P. 366-372.

411. Shi W., Dirim F., Wolf E., Zakhartchenko V., Haaf T. Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos // Biol. Reprod. 2004. V. 71. P. 340-347.

412. Shimmin L.C., Chang B.H.J., Li W.H. Male-driven evolution of DNA sequences //Nature. 1993. V. 362. P. 745-747.

413. Shimokawa O., Harada N., Miyake N. et al. Array comparative genomic hybridization in first-trimester spontaneous abortions with 'normal' karyotypes // Am. J. Med. Genet. Part A. 2006. V. 140A. P. 1931-1935.

414. Siafakas N.M., Tzortzaki E.G., Sourvinos G. Microsatellite DNA instability in COPD // Chest. 1999. V. 116. P. 47-51.

415. Simoni G., Sirchia S.M. Confined placental mosaicism // Prenatal Diagnosis. 1994. V. 14. P. 1185-1189.

416. Slater H.R., Ralph A., Daniel A. et al. A case of maternal uniparental disomy of chromosome 9 diagnosed prenatally and the related problem of residual trisomy // Prenat. Diagn. 2000. V. 20. P. 930-932.

417. Slim R., Mehio A. The genetics of hydatidiform moles: new light on an ancient disease // Clin. Genet. 2007. V. 71. P. 25-34.

418. Slimane-Bureau W., Bordignon V., Leveillee C., Smith L.C., King W.A. Assessment of chromosomal abnormalities in bovine nuclear transfer embryos and in their donor cells // Cloning Stem Cells. 2003. V. 5. P. 123-132.

419. Smith L.E., Denissenko M.F., Bennett W.P. et al. Targeting of lung cancer mutational hotspots by polycyclic aromatic hydrocarbons // J Nat Cancer Inst. 2000. V. 92. P. 803-811.

420. Smith M., Creasy M.R., Clarke A., Upadhyaya M. Sex ratio and absence of uniparental disomy in spontaneous abortions with a normal karyotype // Clin. Genet. 1998. V. 4. P. 258-261.

421. Soejima H, Joh K, Mukai T. Gene silencing in DNA damage repair // Cell Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 2168-2172.

422. Solter D. Imprinting today: end of the beginning or beginning of the end? // Cytogenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 12-16.

423. Sotillo R, Hernando E, Diaz-Rodriguez E. et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice // Cancer Cell. 2007. V. 11.P. 9-23.

424. Spandidos D.A, Ergasaki M, Avarnitis D. Microsatellite instability in human atherosclerotic plaques // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 7. P. 137-140.

425. Spandidos D.A, Koumantakis E, Sifakis S, Sourvinos G. Microsatellite mutations in spontaneous aborted embryos // Fert. Ster. 1998. V. 70. № 5. P. 892-895.

426. Spence J.E, Perciaccante R.G, Greig G.M. et al. Uniparental isodisomy as a mechanism for human genetic disease // Am. J. Hum. Genet. 1988. V. 42. P. 217-226.

427. Spinner N.B, Rand E, Bucan M. et al. Paternal uniparental isodisomy for human chromosome 20 and absence of external ears // Am. J. Hum. Genet. 1994. V. 55 (Suppl.). A118. P. 674.

428. Stankiewicz P, Lupski J.R. Genome architecture, rearrangements and genomic disorders // Trends in Genetics. 2002. V. 18. P. 74-82.

429. Steffenburg S, Gillberg C.L, Steffenburg U, Kyllerman M. Autism in Angelman syndrome: a population-based study // Pediatr. Neurol. 1996. V. 14. №2. P. 131-136.

430. Storchova Z, Pellman D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. V. 5. P. 45-54.

431. Strathdee G, Brown R. Aberrant DNA methylation in cancer: potential clinical interventions // Expert Reviews in Molecular Medicine. 2002. 4 March. Available at http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/02004222h.htm.

432. Strom C.M., Ginsberg N., Applebaum M., Bozorgi N., White M., Caffarelli M., et al. Analyses of 95 first-trimester spontaneous abortions by chorionic villus sampling and karyotype // J. Assist. Reprod. Genet. 1992. V. 9. P. 458-461.

433. Sulisalo T., Makitie O., Sistonen P. et al. Uniparental disomy in cartilage-hair hypoplasia // Eur. J. Hum. Genet. 1997. V. 5. P. 35-42.

434. Sullivan KM, Mannucci A, Kimpton C.P., Gill P. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenin//BioTechiques 1993. V. 15. P. 637-641.

435. Surani M.A., Barton S.C. Development of gynogenetic eggs in the mouse: Implications for parthenogenetic embryos // Science. 1983. V. 222. P. 1034-1036.

436. Surani M.A., Barton S.C., Norris M.L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis // Nature. 1984. V. 308. P. 548-550.

437. Surani M.A., Kothary R., Allen N., Singh P.B., Fundele R., FergusonSmith A., Barton S.C. Genome imprinting and development in the mouse // Development. 1990. Suppl. P. 89-98.

438. Sutcliffe A.G., D'Souza S.W., Cadman J., et al. Outcome in children from cryopreserved embryos // Arch. Dis. Child. 1995. V. 72. P. 290-293.

439. Swales A.K., Spears N. Genomic imprinting and reproduction // Reproduction. 2005. V. 130. P. 389-399.

440. Takahara H., Ohama K., Fujiwara A. Cytogenetic study in early spontaneous abortions // Hiroshima J. Med. Sciences. 1977. V. 26. № 4. P. 291-296.

441. Talbot C.C., Avramoulos D., Gerken S., Chakravarti A. The tetranucleotide repeat polymorphism D21S1245 demonstrates hypermutability in germline and somatic cells // Hum. Mol. Genet. 1995. V. 4. P.193-199.

442. Tang P.C., Ritchie W.A., Wilmut I., West J.D. The effects of cell size and ploidy on cell allocation in mouse chimaeric blastocysts // Zygote. 2000. V. 8. P. 33-43.

443. Taniguchi T., Okamoto K., Reeve A.E. Human p57(KIP2) defines a new imprinted domain on chromosome 1 lp but is not a tumour suppressor gene in Wilms tumour // Oncogene. 1997. V. 14. P. 1201-1206.

444. Tao W., Levine A.J. P19ARF stabilizes p53 by blocking nucleo-cytoplasmic shuttling of Mdm2 //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 6937-6941.

445. Tarkowski A.K., Witkowska A., Opas J. Development of cytochalasin B-induced tetraploid and diploid tetraploid mosaic mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morph. 1977. V. 41. P. 47-64.

446. Tempest H.G., Griffin D.K. The cytogenetics of preimplantation human development: insights provided by traditional and novel techniques // Chromosoma. 2005. V. 114. P. 295-299.

447. Temple I.K., Shield J.P. Transient neonatal diabetes, a disorder of imprinting // J. Med. Genet. 2002. V. 12. P. 872-875.

448. Thibodeau S.N., Bren G., Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon // Lancet. 1993. V. 260, P. 816-819.

449. Thieffry D., Sanchez L. Alternative epigenetic states understood in terms of specific regulatory structures // Ann NY Acad Sci. 2002. V. 981. P. 135-153.

450. Thomas J.H. Genomic imprinting proposed as a surveillance mechanism for chromosome loss // PNAS. 1995. V. 92. P. 480-482.

451. Thompson D.A., McHenry C.L., Li Y. et al. Retinal dystrophy due to paternal isodisomy for chromosome 1 or chromosome 2, with homoallelism for mutations in RPE65 or MERTK, respectively // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 224-229.

452. Toth A., Arato G., Szepesi J., Hajdu K., Szigetvary I., Laszlo J. Tetraploidy in human placenta. A dilemma in molar and non-molar pregnancies // Gynecol. Obstet. Invest. 1992. V. 33. № 3. P. 153-156.

453. Trasler J.M. Gamete imprinting: setting epigenetic patterns for the next generation // Reprod. Fertil. Dev. 2006. V. 18. P. 63-69.

454. Trussler J.S., Pickering S.J., Ogilvie C.M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization // Reproductive Biomedicine Online. 2004. V. 8. № 6. P. 701-711.

455. Tschopp J., Martinon F., Burns K. NALP7: a novel protein family involved in inflammation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4. P. 95-104.

456. Tsukishiro S., Li Q.Y., Tanemura M., Sugiura-Qgasawara M., Suzumori K., Sonta S. Paternal uniparental disomy of chromosome 14 and unique exchange of chromosome 7 in cases of spontaneous abortion // Hum. Genet. 2005. V. 50. P. 112-117.

457. Tufarelli C., Stanley J.A., Garrick D. et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease //Nat Genet. 2003. V. 34. P. 157-165.

458. Tycko B. Imprinted genes in placental growth and obstetric disorders // Cy-togenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 271-278.

459. Tycko B., Morison R. Physiological functions of imprinted genes // J. Cell Phys. 2002. V. 192. P. 245-258.

460. Van den Veyver I.B., Al-Hussaini T.K. Biparental hydatidiform moles: a maternal effect mutation affecting imprinting in the offspring // Hum. Re-prod. Upd. 2006. V. 12. P. 233-242.

461. Vanyushin B.F., Tkacheva S.G., Belozersky A.N. // Nature. 1970. V. 225. P. 948-949.

462. Vanyushin B.F., Mazin A.L., Vasilyev A.N., Belozersky A.N. // Biochem. Biophys. Acta. 1973. V. 299. P. 397-403.

463. Velissariou V., Antoniadi T., Gyftodimou J. et al. Maternal uniparental isodisomy 20 in a foetus with trisomy 20 mosaicism: clinical, cytogenetic and molecular analysis // Eur. J. Hum. Genet. 2002. V. 10. P. 694-698.

464. Villard J. Transcription regulation and human diseases // Swiss Med Wkly. 2004. V. 134. P. 571-579.

465. Voullaire L., Slater H., Williamson R., Wilton L. Chromosome analysis of blastomeres from human embryos by using comparative genomic hybridization // Hum. Genet. 2000. V. 106, P. 210-217.

466. Waddington C.H. An introduction to modern genetics.- New York: Mac-millan. 1939,- 230 p.

467. Waddington C.H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters //Nature. 1942a. V. 150. P. 563-564.

468. Waddington C.H. The epigenotype // Endevaour. 1942b. V. 1. P. 18-20.

469. Waddington C.H. Genetic assimilation of an acquired character // Evolution. 1953. V. 7. P. 118-126.

470. Waddington CM. Selection of the genetic basis for an acquired character // Nature. 1952. V. 169. P. 278.

471. Waddington CM. Genetic assimilation of the bithorax phenotype // Evolution. 1956. V. 10. P. 1-13.

472. Waddington CM. Inheritance of acquired characters // Proc. Linnean Soc. London. 1958. V. 169. P. 54-61.

473. Waddington CM. Canalization of development and genetic assimilation of acquired characters //Nature. 1959. V. 183. P. 1654-1655.

474. Waddington CM. Genetic assimilation // Adv. Genet. 1961. V. 10. P. 257-293.

475. Waddington CM. The Evolution of an Evolutionist. Edinburgh: Edinburgh Univ. Press, 1975. 328 p.

476. Wahls W.P., Wallace L.J., Moore P.D. The Z-DNA motif d(TG)30 promotes reception of information during gene conversion events while stimulating homologous recombination in human cells in culture // Mol. Cell Biol. 1990. V. 10. P. 785-793.

477. Wang Y. H., Griffin J. Expanded CTG triplet blocks from myotonic dystrophy gene create the strongest known natural nucleosome positioning elements // Genomics. 1995. V. 25. P. 570-573.

478. Wapner R., Jackson L., Davies G., Barr M., Hux C. Cytogenetic discrepancies found at chorionic villus sampling // Am. J. Hum. Genet. 1985. V. 37 (suppl.). A 122.

479. Warburton D., Kinney A. Chromosomal differences in susceptibility to meiotic aneuploidy // Environmental and Molecular Mutagenesis. 1996. V. 28. №3. P. 237-247.

480. Warburton D., Stein Z., Kline J. et al. Chromosome abnormalities in spontaneous abortion. Data from New York city studies // Human embryonic and fetal death. Porter I.H., Hook E.B. eds.- New York.: Academic Press, 1980. P. 261-314.

481. Warburton D., Yu C.Y., Kline J., Stein Z. Mosaic autosomal trisomy in cultures from spontaneous abortions // Am. J. Hum. Genet. 1978. V. 30. P. 609-617.

482. Waterland R.A., Garza C. Potential mechanisms of metabolic imprinting that lead to chronic disease //Am. J. Clin. Nutr. 1999. V. 69. P. 179-197.

483. Webb A., Beard J., Wright C. et al. A case of paternal uniparental disomy for chromosome 11 // Prenat. Diagn. 1995. V. 15. № 8. P. 773-777.

484. Webb A., Sturgiss S., Warwicker P. et al. Maternal uniparental disomy for chromosome 2 in association with confined placental mosaicism for trisomy 2 and severe intrauterine growth retardation // Prenat. Diagn. 1996. V. 16. № 10. P. 958-962.

485. Weber J.L., May P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 338-396.

486. Weber J.L., Wong C. Mutation of human short tandem repeats // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 1123-1128.

487. Weber J.D, Jeffers J.R, Rehg J.E. et al. p53-independent functions of the pl9ARF tumor suppressor// Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2358-2365.

488. Weier J.F, Weier H.G, Jung C.J, Gormley M, Zhou Y, Chu L.W, Gen-bacev O, Wright A.A, Fisher S.J. Human cytotrophoblasts acquire ane-uploidies as they differentiate to an invasive phenotype // Dev. Biol. 2005. V. 279. P. 420-432.

489. Wells D, Delhanty J.D. A. Comprehensive chromosomal analysis of human preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative genomic hybridization // Mol. Hum. Reprod. 2000. V. 6. P. 1055-1062.

490. Wey E, Bartholdi D, Riegel M. et al. Mosaic imprinting defect in a patient with an almost typical expression of the Prader-Willi syndrome // Eur. J. Hum. Genet. 2005. V. 13. P. 273-277.

491. Whitelaw E. Sins of the fathers, and their fathers // Eur. J. Hum. Genet. 2006. V. 14. P. 131-132.

492. Whitelaw N.C, Whitelaw E. How lifetimes shape epigenotype within and across generations //Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. R131-R137.

493. Wierdl M, Dominska M, Petes T.D. Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite // Genetics. 1997. V. 146. P. 769-779.

494. Wilkinson T.A, James R.S, Crolla J.A, Cockwell A.E, Cambell P.L, Temple I.K. A case of maternal uniparenatal disomy of chromosome 9 in association with confined placental mosaicism for trisomy 9 // Prenatal Diagnosis. 1996. V. 16. № 4. P. 371-374.

495. Wirth J, Back E, Huttenhofer A, Nothwang H.G, Lich C. A translocation breakpoint cluster disrupts the newly defined 3end of the SNURF-SNRPN368transcription unit on chromosome 15 // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 201-210.

496. Wolstenholme J. Confined placental mosaicism for trisomies 2, 3, 7, 8, 9, 16 and 22: their incidence, likely origins and mechanisms for cell lineage compartmentalization // Prenat. Diagn. 1996. V. 16. P. 511-524.

497. Wolstenholme J., Rooney D.E., Davison E.V. Confined placental mosaicism, IUGR and adverse pregnancy outcome: a controlled retrospective U.K. collaborative study // Prenat. Diagn. 1994. V. 14. P. 345-361.

498. Wolstenholme J., White I., Sturgiss S. et al. Maternal uniparental hetero-disomy for chromosome 2: detection through 'atypical' maternal AFP/hCG levels, with an update on a previous case // Prenat. Diagn. 2001. V. 21. P. 813-817.

499. Wong A.H.C., Gottesman 1.1., Petronis A. Phenotypic differences in genetically identical organisms: the epigenetic perspective // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. R11-R18.

500. Xing E.P., Nie Y., Song Y., Yang G-Y., Cai Y.C., Wang Li-D., Yang C.S. Mechanisms of inactivation of pl4ARF, pi51NK4b, and pl6JNK4a genes in human esophageal squamous cell carcinoma // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. P. 2704-2713.

501. Xu Y.Q., Grundy P., Polychronakos C. Aberrant imprinting of the insulinlike growth factor II receptor gene in Wilms' tumor // Oncogene. 1997. V. 14. P. 1041-1046.

502. Xu X., Peng M., Fang Z., Xu X. The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length //Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 396-399.

503. Xu Y., Zhuang G., Shu Y. Preliminary analysis of chromosome mosaicism in preimplantation embryos // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2000. V. 35. P. 456-458.

504. Xue W-C., Chan K.Y.K., Feng H-C., Chiu P-M., Ngan H.Y.S., Tsao S-W., Cheung A.N.Y. Promoter hypermethylation of multiple genes in hydatidi-form mole and chorioncarcinoma// J. Mol. Diagn. 2004. V. 6. P. 326-334.

505. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor T.H. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 335-340.

506. Young L.E., Fernandes K., McEvoy T.G. et al. Epigenetic changes in Igf2r is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture // Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 153-154.

507. Yong P.J., Marion S.A., Barrett I.J. et al. Evidence for imprinting on chromosome 16: the effect of uniparental disomy on the outcome of mosaic trisomy 16 pregnancies // Am. J. Med. Genet. 2002. V. 112. P. 123-132.

508. Yu W., Giniala V., Pant V. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation // Nat. Genet. 2004. V. 36. P. 1105-1110.

509. Zaragoza M.V., Millie E., Redline R.W., Hassold T.J. Studies of nondisjunction in trisomies 2,1, 15 and 22: does the parental origin of trisomy influence placental morphology? // J. Med. Genet. 1998. V. 35. P. 924-931.

510. Zhang Y., Xiong Y., Yarbrough W.G. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways 11 Cell. 1998. V. 92. P. 725-734.

511. Zhivotovsky L.A., Feldman M.W., Grishechkin S.A. Biased mutations and microsatellite variation//Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 926-933.

512. Zogel C., Bohringer S., Gross S. et al. Identification of cis- and trans-acting factors possibly modifying the risk of epimutations on chromosome 15 // Eur. J. Hum. Genet. 2006. V. 14. № 6. P. 752-758.370

Информация о работе

Лебедев, Игорь Николаевич
доктора биологических наук
Томск, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы