Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наследственные заболевания человека как часть проблемы изменчивости генома эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Патрушев, Лев Иванович

Работа, результаты которой изложены в настоящем автореферате, заключает в себе три основных этапа: 1) разработку универсальной системы ПЦР-диагностики для выявления точковых мутаций в геноме человека; 2) использование разработанных систем ДНК-диагностики для исследования частот встречаемости мутаций, ассоциированных с тромбофилиями, у пациентов московских клиник при разных патологиях; 3) разработку количественной модели, выявляющей новый механизм контроля возникновения спонтанных мутаций в геноме человека и других эукариотических организмов.

1. РАЗРАБОТКА УНИВЕРСАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧКОВЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА

Разработка систем ДНК-диагностики, основанных на ГЩР, требовала прежде всего наличия в нашем распоряжении достаточного количества высококачественной термостабильной 7аг?-ДНК-полимеразы, ключевого фермента, обеспечивающего функционирование таких систем. В то же время, в начале нашей работы в 1989 году. Taq-ДНК-полимеразу выделяли в России исключительно из природных термофильных бактерий, и имеющиеся препараты недостаточно очищенного фермента не удовлетворяли предъявляемым требованиям. Поэтому долгосрочная программа по реализации данного проекта была начата с создания генно-инженерными методами бактериального штамма-продуцента Гя^-ДНК-полимеразы и разработки эффективного метода ее очистки.

Успешное завершение этой части работы позволило нам перейти непосредственно к созданию универсальных систем ПЦР-диагностики, отвечающим современным требованиям. Освоив системы, основанные на использовании эндонуклеаз рестрикции для обнаружения измененных под действием мутаций сайтов рестрикции в анализируемых образцах геномной ДНК, мы разработали новые, более простые и эффективные системы, в основу которых была положена аллель-специфическая амплификация генетических локусов. При этом наши усилия были сосредоточены на разработке систем обнаружения мутаций в трех вышеупомянутых генах человека, повреждение которых ассоциировано с тромбофилиями, одними из наиболее опасных патологических состояний организма человека.

1.1. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ Escherichia coli ГЕНА ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Thermjjs aqua ticus YT

Перед началом работы по созданию бактериального штамма-продуцента Tctq-ДНК-полимеразы в 1989 г. в нашем распоряжении была последовательность нуклеотидов гена [Innis et al., 1988] и данные о том, что его собственные регуляторные последовательности функционируют в клетках Е. coli неэффективно [Loweyer et al, 1989]. Поэтому при решении поставленной задачи наши усилия были направлены на то, чтобы клонировать полноразмерный ген 7а?-полимеразы и поместить его кодирующую часть в экспрессирующий вектор под контроль регуляторных элементов бактерии-хозяина.

1.1.1 КЛОНИРОВАНИЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ГЕНА Taq -ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

В соответствии с имевшимися в литературе данными, ген Го^-полимеразы не ¿одержит сайта рестрикции So/Gl. По этой причине рестриктаза SalGl была использована нами для расщепления геномной ДНК Т. aquaticus YT1 при получении клонотеки с использованием фазмидного вектора pSL5, любезно предоставленного лабораторией Н.К.Янковского [Yankovski et al, 1989]. Фрагменты ДНК центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы, и фракцию фрагментов ДНК со средней длиной 15-20 т.п.о. лигировали с фазмидой pSL5, предварительно расщепленной рестриктазой SalGl и дефосфорилированной [Патрушев и др., 1993]. Смесью ДНК после лигирования трансформировали компетентные клетки Е, coli ОТ-14. Суспензия образовавшихся фаговых частиц, хромосомная ДНК которых содержала фрагменты геномной ДНК Т. aquaticus, далее была использована для отбора полноразмерной копии гена Тод-полимеразы.

Были синтезированы три олигонуклеотидных зонда TPZ-1-3 (рис. 1), соответствовавшие 5'-концевой, центральной и З'-концевой эволюционно консервативным частям гена Тад-полимеразы, которые после введения радиоактивной метки были использованы для отбора клонов, содержащих нужную последовательность нуклеотидов. Разработанные нами зонды позволили исключить при скрининге ложноотрицательные результаты, как следствие возможных штаммоспецифических различий в первичной структуре гейа у известной из литературы и использованной нами бактерий Т. aquaticus, а также быть уверенным, что клонированный фрагмент действительно содержит полную копию искомого гена.

В результате отбора были получены четкие гибридизационные сигналы с зондом TPZ-1 с частотой ~0,25%. Анализ ДНК фаговых частиц из бляшек, давших положительный ответ при гибридизации, с помощью зондов TPZ-2, TPZ-3, а также рестриктаз Bglll, Kpnl, Hindlll, Pstl и ВатШ показал, что все полученные клоны содержали один и тот же ген Taq-полимёразы, первичная структура которого по рестриктазной карте не отличалась от опубликованной. Одна из таких рекомбинантных плазмид была использована далее для конструирования штамма-продуцента.

S'-Gixyiv.iiw>wiAJViu-a з -WAlCCUAATCCAGÄACAATCCGCGT-i'

Рис. 1. Рестриктазная карта гена ДНК-полимеразы ТИегтги- адиаИсиэ УТ1. ТР2-1, -2 и Л -олигонуклеотидные зонды, использованные для клонирования этого гена и построения его рестриктазной карты.

5' -GTGGTCTTTGACGCCAAGG- 3'

1.1.2 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ, ЭФФЕКТИВНО ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ ГЕН

Та g-ПОЛИМЕР АЗЫ

В соответствии с данными литературы, в лизатах бактериальных клеток, зараженных рекомбинантными фаговыми частицами, нам не удалось обнаружить активность Taq-полимеразы. Этот результат мог указывать на то, что собственные регуляторные элементы гена Taq-полимеразы неэффективно используются белоксинтезирующей системой Е. coli и по разным причинам могут быть неактивны в этой системе вообще. Для проверки этого предположения мы субклонировали фрагмент ДНК Т. aquaticus длиной ~5 т.п.о., который содержал полный ген 7о<?-полимеразы, по ВатШ-сшгу полилинкера плазмиды pUC19, что приводило к потере данного сайта рестрикции (рис. 2). При этом субклонированный фрагмент помимо гена Та^-ДНК-полимеразы длиной ~2,5 т.п.о. содержал фланкирующие его последовательности геномной ДНК, причем один из SgflI-caftTOB был расположен на расстоянии всего лишь 110 п.о. от инициирующего ATG-кодона структурной части гена. В этой фланкирующей последовательности отсутствовал промотор гена Гя^-ДНК-полимеразы, и имелся природный сайт Шайна-Дальгарно за 4 п.о. перед ATG-кодоном. Оказалось, что рекомбинантная плазмида рРА-I (рис. 2), содержащая вышеупомянутый Д^/Н-фрагмент ДНК в прямой ориентации по отношению к /ас-промотору векторной плазмиды в условиях дерепрессии промотора под действием изопропил-ДБ-галактопиранозида (IPTG) не обеспечивала заметного синтеза То^-ДНК-полимеразы в клетках E.coli С600, хотя особенности генно-инженерной конструкции должны были бы обеспечивать образование дативного фермента. полимеразы в прямой ориентации под контролем Р)ас-промотора.

Исходя из этого, мы интерпретировали полученные результаты в пользу неэффективности использования регуляторных элементов гена Тад-ДНК-полимеразы аппаратом белкового синтеза клеток-хозяев Е. coli. Поэтому для достижения сверхпродукции Уад-ДНК-полимеразы в клетках Е. coli было решено поместить ее ген полностью под контроль гомологичных регуляторных элементов в другой экспрессирующий вектор.

Для конструирования данной плазмиды мы использовали экспрессирующий вектор pPR-TGATG, полученный в лаборатории C.B. Машко и любезно им предоставленный [Mashko et al, 1990]. В этом векторе структурная часть экспрессируемого гена соединяется через уникальный сайт рестрикции Sacl с инициирующим ATG-кодоном (рис. 3).

Рис. 3. Схема конструирования плазмиды рТА23, обеспечивающей сверхпродукцию в клетках E.coli. ДНК плазмиды рРА1, полученной на предыдущем этапе, использовали в качестве матрицы в ПЦР. Продукт ПЦР далее клонировали в экспрессирующем векторе pPR-TGATG, а недостающую часть природного гена ввели в плазмиду pNO-TA в виде Крп\-фрагмента плазмиды pPA-I. SD - последовательность Шайна-Дальгарно, Арг - ген устойчивости к ампициллину, tt - терминатор транскрипции.

В результате образуется гибридный оперон, транскрибируемый с А-Ря-промотора, в котором клонируемый ген является дистальным цистроном этого оперона. Эффективно экспрессируемый гибридный цистрон cro'-cat'-trpE расположен проксимально промотору PR. 3'-Конец этого цистрона является областью реинициации трансляции и содержит последовательность Шайна-Дальгарно гена trpD Е. coli, а также терминирующий и инициирующий кодоны, которые перекрываются друг с другом (TGATG). В этой последовательности З'-концевой остаток G является первым нуклеотидом уникального сайта рестрикции Stocl (GAGCTC). Во время синтеза белка, направляемого этим вектором, образуется короткий гибридный пептид Cro-Cat-TrpE длиной ~120 аминокислотных остатков, и после терминации его синтеза происходит немедленная реинициация трансляции мРНК клонируемого гена. Поскольку активность промотора PR в векторе pPR-TGATG-1 контролируется температурочувствительным репрессором XCIts857, индукция транскрипции клонированного гена происходит при повышении температуры до 42°С. Основные этапы конструирования плазмиды, экспрессирующей ген Та^-ДНК-полимеразы, представлены на рис. 3.

Для проведения необходимых модификаций 5'-концевой последовательности гена на первом этапе мы амплифицировали с помощью ПЦР фрагмент ДНК гена Тад-ЩК-полимеразы длиной в 674 и.о., кодирующий N-концевую часть фермента, который содержал инициаторный кодон ATG. В качестве матрицы в этом случае использовали вышеописанную плазмиду рРА-1. 5'-Концевой праймер-1: 5'

CACGAGCTCGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAG содержал искусственный сайт рестрикции SacI (подчеркнут), позволяющий клонировать амплифицированный фрагмент по тому же сайту экспрессирующего вектора pPR-TGATG-1. При этом клонируемый фрагмент оказывался в одной рамке считывания с инициаторным ATG-кодоном вектора. В качестве встречного праймера использовали 25-звенный олигонуклеотид 5'-CAGCCGGTCGACGTTCTTGAGGAGG. По окончании амплификации очищенный с помощью электрофореза в агарозном геле продукт амплификации расщепляли рестриктазами Sad и Kpnl и клонировали в дефосфорилированном векторе pPR-TGATG-1, предварительно линеаризованном теми же рестриктазами. Полученная в итоге плазмида pNO-TA (рис. 3) содержала 5'-конец гена 7ст^-ДНК-полимеразы в одной рамке считывания с ATG-кодоном экспрессирующего вектора полностью под контролем регуляторных элементов Е. coli и фага Л.

На втором этапе конструирования в вектор pNO-TA вводили Л^риГ-фрагмент ДНК плазмиды рРА-1, продуктами лигирования трансформировали клетки Е. coli С600 и отбирали трансформантов, которые содержали клонируемый фрагмент ДНК в нужной ориентации. Полученная таким образом плазмида рТА-23 содержала ген Тад-ДНК-полимеразы, отличающийся от природного наличием на 5'-конценового сайта рестрикции SacI, а также дополнительного кодона, что приводило к изменению последовательности аминокислот в N-концевой части полипептидной цепи Гад-ДНК-полимеразы: NHj-Met-Ser-Ser-, вместо NH2-Met-Arg. Как показали дальнейшие исследования, данная замена не оказывала влияния на основные свойства фермента. Мы используем ее в качестве молекулярного маркера, который позволяет легко отличать препараты нашего фермента от 7а^-ДНК-полимеразы другого происхождения.

Клетки Е. coli С600 трансформировали плазмидой рТА-23 и полученный в результате штамм Е. coli PVG-A1 выращивали на богатой питательной среде в присутствии ампициллина при 28°С. Повышение температуры культуральной жидкости до 42°С сопровождалось при дальнейшем выращивании клеток более, чем 100-кратным возрастанием внутриклеточной активности термостабильной Гл^-ДНК-полимеразы, а ее содержание составило после термоиндукции 1-2% от суммарного клеточного белка (рис. 4). Экстракты разработан двухстадийный метод оптимизации экспрессии чужеродных генов в гетерологичном генетическом окружении. При реализации этого метода сначала необходимо провести ПЦР-амплификацию короткого 5'-концевого фрагмента экспрессируемого гена с введением с помощью праймеров новых сайтов рестрикции, позволяющих дальнейшее клонирование этого фрагмента гена в экспрессирующем векторе в требуемой рамке считывания и оптимальном положении по отношению к регуляторным элементам промоторного участка вектора. На втором этапе в подготовленный таким образом вектор по уникальному сайту рестрикции вводится основная недостающая часть природного гена. Такой подход позволяет избегать возникновения мутаций в экспрессируемом гене, которые с высокой вероятностью могут появиться в кодирующей части в результате ее полной ПЦР-ампяификации.

1.1.3 ОЧИСТКА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ Гад-ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Для выделения рекомбинантиого фермента нами была взята за основу методика, предложенная Д.Р. Энгельке с соавт. [Егще1ке е1 а1, 1990]. Устойчивость 7а<?-ДНК-полимеразы к длительному прогреванию при повышенных температурах является характерным свойством данного белка, которое было использовано на первых этапах его очистки. После индукции синтеза Гад-ДНК-полимеразы бактериальные клетки собирали центрифугированием, лизировали лизоцимом в присутствии неионных детергентов с последующим прогреванием экстракта в течение 1 ч при 75°С. В этих условиях происходила таких бактериальных клеток были далее использованы для очистки рекомбинантиого фермента.

-д»—■ ЖС 42'С Гемпсрмда

Рис. 4. Экспрессия рекомбинантной Та^-ДНК-полимеразы во время выращивания клеток E.coli при разных температурах. В экстрактах бактериальных клеток, выращенных при указанных температурах, определяли активность Гад-ДНК-полимеразы. В качестве контроля использовали изогенные клетки, содержащие исходный вектор, в которых активность фермента не была обнаружена.

Гемлеыпург инкубации

В ходе выполнения этой части работы нами был инактивация большинства термолабильных бежов бактерии-хозяина, которые вместе с большей частью бактериальной ДНК выпадали в осадок. Эти белки и нуклеиновые кислоты удаляли низкоскоростным центрифугированием, а супернатант, содержащий Tag-ДНК-полимеразу, фракционировали полимином Р [Патрушев и др., 1993]. На этой стадии очистки происходит освобождение от большинства нуклеиновых кислот, содержащихся в экстракте, а также ряда белков Е. coli. Элюент с полимина Р наносили на колонку с ДЭАЭ-сефацелем и Гвд-ДНК-полимеразу элюировали линейным градиентом KCl. При этом фермент элюировался узким пиком при 0,2 М KCl. Фракции, содержащие активность Taq-fflK-полимеразы, объединяли, наносили на колонку с катионообменной смолой Bio-Rex 70 (BioRad, США) и проводили ступенчатое элюирование 0,25 М KCl. При этом происходило концентрирование Гяд-ДНК-полимеразы и ее дальнейшая очистка от следов полимина и нуклеиновых кислот, а также оставшихся примесных белков, не отделившихся на предыдущих стадиях очистки.

Анализ чистоты конечного препарата 7а^-ДНК-полимеразы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na, показал, что рекомбинантный фермент представлен одной полипептидной цепью с молекулярной массой ~90 кДа (рис. 5,а). Кроме того, дополнительные эксперименты с ПЦР-амплификацией генов рРНК E.coli не выявили присутствия в препаратах фермента примесей бактериальной ДНК.

Определение термостабильности рекомбинантной 7ад-ДНК-полимеразы показало, что время ее полужизни в очищенном состоянии при 95°С составляет ~1 ч (рис. 5,6). При

Рис. 5. Характеристика препарата очищенной 7ад-ДНК-полимеразы. а - Электрофорез фермента (1) в полиакриламидном геле, 2 - маркер молекулярных масс. Указаны молекулярные массы белков (кДа); б - Термостабильность. После прогревания фермента в течение указанного времени при 95°С в пробах определяли его активность; в ~ Амплификация участков Л-ДНК очищенным ферментом, указаны длины ПЦР-продуктов (п.о.), слева - молекулярный маркер. этом фермент не терял своей активности после инкубации в течение трех дней при 37°С. Оптимум рекомбинантной Гяд-ДНК-полимеразы в отношении одно- и двухвалентных катионов при ПЦР соответствовал таковому природного фермента. Кроме того рекомбинантный фермент обладал значительной процессивностыо и был в состоянии амплифицировать во время ПЦР участки Л-ДНК не менее 5,5 т.п.о. (рис. 5в). При хранении при -20°С в течение двух лет препараты фермента утрачивали не более 20% своей исходной активности. Совокупность всех полученных данных указывает на то, что клонирование гена и проведенные аминокислотные замены не ухудшили свойств рекомбинантной Tag-ДНК -полимеразы по сравнению с природной и, кроме того, значительно облегчили ее очистку, сделав 7а<?-ДНК-полимеразу легко доступной для решения всех вышеупомянутых задач данной работы.

1.1.4 ПОЛУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ Га9-ДНК-ПОЛИМЕР АЗЫ, РАСШИРЯЮЩИХ

ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФЕРМЕНТА

Природная Tag-ДНК-полимераза дикого типа обладает рядом свойств, ограничивающих ее непосредственное применение в молекулярно-биологических приложениях. В частности, низкое сродство фермента к дидезоксирибонуклеозидтрифосфатам (ddNTPs) делают невозможным эффективное использорание фермента для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. Кроме того, проведение ДНК-диагностики в широких масштабах в клинических лабораториях сопряжено с использованием экспресс-методов выделения ДНК, наиболее результативное применение которой в качестве матрицы в ПЦР может быть достигнуто в искусственно создаваемых условиях, в том числе «горячего старта» реакции. Для решения этих задач нами с помощью направленного мутагенеза был получен мутантный фермент с повышенным сродством к ddNTPs, а также препараты фермента, модифицированного моноклональными антителами, который обладал способностью осуществлять «горячий старт» ПЦР.

Изменение способности рекомбинантной Täq-ДНК-полимеразы использовать ddNTPs в качестве субстратов. В основу данной части работы были положены результаты, полученные С.Табором и С.Ричардсоном (Tabor, Richardson, 1995), а также группой Г. Ваксмана (Ying et al., 1999), которые установили, что замена в полипептидной цепи Taq-ДНК-полимеразы аминокислотного остатка Phe-667—»Туг приводит к увеличению скорости включения ddNTPs в ДНК в 600-3000 раз. Кроме того, замена Arg-660—>Asp) нормализует включение ddGTP в строящиеся цепи ДНК, который в отсутствие замены встраивается в ДНК гораздо быстрее других аналогов, что затрудняет интерпретацию результатов, получаемых при секвенировании ДНК. С учетом этих данных мы осуществили с помощью направленного мутагенеза обе замены аминокислотных остатков в нашем рекомбинантном ферменте.

Основные этапы работы, из которых складывалось конструирование мутантного фермента, схематически отражены на рис. 6. ДНК плазмиды рТА23 нашего штамма-продуцента была использована в качестве матрицы в ПЦР для синтеза фрагмента С, в который с помощью перекрывающихся праймеров Т80-1 (5'-ССССОТАСТТОАТООТСТТСОСОСОТСОСОСАТС) и ТБО-4 (5'

ОАТОСОСОАСССООССААОАССАТСААСТАСОООО) были введены требуемые мутации, а фланкирующие праймеры Т8-1 (5'-ССАТСОТООАОААОАТССТОСАОТ и Т8-4 (5'-ООСОСТОСТССАОООТООТАТСАСТССТТСОСОО), содержащие сайты Рзй (подчеркнуты), были использованы для амплификации всего фрагмента. После его инкубации с рестриктазой Рей и очистки образовавшегося фрагмента О, последним заменяли соответствующий участок ДНК исходной плазмиды.

В заключительной серии экспериментов мы исследовали влияние всех четырех <1<1МТР8 на активность модифицированной нами с помощью направленного мутагенеза Тад-ДНК-полимеразы. В этом случае синтез ДНК осуществляли на матрице ДНК тимуса

Рис. 6. Схема введения двух мутаций в рекомбинантный ген Taq-JЩK-шшшеразы, повышающих сродство фермента к <1<ШТР8. С помощью перекрывающихся праймеров Т80-1 и Т8Б-4 и ПЦР в две стадии были введены мутации во фрагмент С, соответствующий правой части гена Гад-ДНК-полимеразы, фланкированной сайтами рестрикции /VI. После этого 3'-концевая часть природного гена была заменена на мутантный фрагмент Б. Т - терминатор транскрипции; обозначены измененные кодоны. теленка, сррагментированнои с помощью ультразвука, в присутствии изменяющихся концентраций отдельных ёёМТРэ, а также обычных <1СТР, с1ТТР, сЮТР и 33Р-с1АТР в концентрации 15 мкМ каждый. Именно при этих концентрациях сШТв обычно секвенируют ДНК по методу Сэнгера.

Результаты одного из таких опытов представлены на рис. 7. Четко видно, что произведенное нами изменение двух аминокислотных остатков в полипептидной цепи Taq-ДНК-полимеразы резко изменяют чувствительность фермента к ингибированию (1сЮТРз. Если активность мутантной Тяд-ДНК-полимеразы подавляется в ~2 раза уже при

В целом, осуществленные нами с помощью направленного мутагенеза модификации рекомбинантной Та^-ДНК-полимеразы, позволили получить препараты фермента, пригодные для дальнейшего использования при секвенировании ДНК по методу Сэнгера.

Получение комплексов Тщ-ДНК-полимеразы с монотональными антителами, способных осуществлять «горячий старт» ПЦР. Технология «горячего старта», широко используемая в современной ПЦР, позволяет избежать артефактов, обусловленных неспецифической инициацией синтеза ДНК термостабильными ДНК-полимеразами, которая происходит в первом цикле реакции, во время постепенного повышения температуры реакционной смеси до температуры денатурации матричной ДНК. В этот момент при низких температурах чаще всего происходит неспецифическое взаимодействие праймеров с ДНК и ошибочная инициация синтеза новых молекул, которые в последующих циклах активно вовлекаются в амплификацию. Имеется несколько подходов, позволяющих преодолеть данное затруднение [Патрушев, 2004]. Во всех случаях в реакционной смеси создаются условия, при которых термостабильные ДНК-полимеразы неактивны в начале первого цикла и активируются в процессе прогревания смеси выше расчетной температуры отжига праймеров.

Мы использовали коммерческие мышиные моноклональные антитела фирмы Инвитек (Москва) для обратимой инактивации Та^-ДНК-полимеразы. Очищенный фермент инкубировали с антителами в эквимолярным количестве при 37°С для образования специфического комплекса и в виде комплекса с антителами хранили при -20°С. Оказалось, что способность фермента синтезировать ДНК при 37°С в составе комплекса снижена в 3050 раз по сравнению с таковой исходного фермента, что оценивалось по включению 32Р-(1АТР в ДНК при 37°С. Кратковременный прогрев препарата при 70°С возвращал ферменту исходные свойства. Эта простая процедура заметно повысила специфичность амплификации исследуемых нами генетических локусов человека, и препараты фермента в виде комплекса с антителами использовались далее во всех системах ДНК-диагностики, которые описываются во второй части автореферата.

1.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ ЧЕЛОВЕКА, ИССЛЕДОВАННЫЕ В ДАННОЙ

РАБОТЕ

Приступая к разработке основанной на ПЦР системы выявления мутаций и 8МР-маркеров, мы, руководствовались двумя принципами. Во-первых, такая система должна была обладать универсальностью, то есть потенциально быть пригодной для обнаружения любых точковых мутаций и в геноме. Во-вторых, первоначальный вариант системы должен был обладать выраженной прикладной направленностью и решать проблемы, актуальные для современной клинической медицины.

После консультаций с врачами-клиницистами было решено сосредоточить внимание на мутациях, ассоциированных с повышенным тромбообразованием (тромбофилиями) у человека. Действительно, сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время стоят на первом месте среди причин смерти. В то же время, венозные и артериальные тромбозы и тромбоэмболии, проявляющиеся, в том числе, в инфарктах миокарда и инсультах головного мозга, являются значительной составляющей этих болезней. Кроме того, к началу проведения наших исследований в литературе появились указания на важную роль генетических факторов в развитии тромбозов. В частности, к началу выполнения данной работы появились данные о трех мутациях, широко распространенных в Западноевропейской популяции и США, которые в настоящее время рассматриваются как серьезный генетический фактор риска возникновения тромбозов. При этом какие-либо сведения о распространенности этих мутаций в РФ отсутствовали. Исходя из таких соображений, мы взяли в качестве объектов исследования мутации в генах фактора V (FV Leiden), протромбина (G20210A) и 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (МТГФР - С677Т).

Мутация FVLeiden. Фактор V (FV) свертывания крови человека представляет собой гликопротеин, состоящий из одной полипептидной цепи. После протеолитической активации тромбином превращается в активированный FV (FVa) - кофактор фактора X (FXa) [Rosing, Tans, 1997]. Ген FV расположен на участке хромосомы lq23, состоит из 25 экзонов, и его длина составляет ~80 т.п.о. Обнаружены мутационные повреждения гена FV двух типов. При одних мутациях имеет место дефицит FV, при других - устойчивость FVa к инактивации под действием активированного протеина С (АРС, феномен APC-резистентности), что фенотипически проявляется соответственно в кровотечениях или тромбофилиях [Guasch et al, 1998, Bertina et al, 1994]. APC-резистентность, обусловленная мутацией FV Leiden (точковая мутация G1691 А, приводящая к замене Arg506Gln в полипептидной цепи FV) является одной из самых распространенных причин наследственных тромбофилий в Европейской популяции [Bertina et al, 1994]. Мутация FV Leiden обнаруживается у 2-15% населения Земли, а среди больных венозными тромбозами ее встречаемость может достигать 50% [Rees et al, 1995]. Риск возникновения тромбоза глубоких вен у носителей гетерозиготной мутации возрастает в ~1 раз и в ~20-80 раз у гомозигот по Лейденской мутации по сравнению с людьми, у которых данная мутация отсутствует [Rosendaal et al, 1995],

Мутация G20210A в гене протромбина. Тромбин - полифункциональная сериновая протеиназа, один из основных участников гемостаза. С одной стороны, тромбин функционирует как мощный прокаогулянт: через рецепторы PARI и PAR4 активирует тромбоциты, а также расщепляет фибриноген с образованием фибрина, что приводит к формированию тромба. С другой стороны, тромбин выполняет роль специфического антикоагулянта, активируя систему протеина С [Becker, Spencer, 1998]. Ген протромбина расположен на участке хромосомы 1 lpl l-ql2, состоит из 14 экзонов, и его длина составляет ~21 т.п.о. Мутация G20210A, локализованная в 3'-концевой некодирующей части гена, стабилизирует мРНК [Rosendaal et al, 1997]. Это сопровождается ~30% повышением уровня протромбина в плазме носителей гетерозиготной мутации и соответственно возрастанием уровня образующегося тромбина [Kyrie et al, 1998]. Мутация широко распространена среди населения США и Западной Европы и является одним из самых серьезных из известных генетических факторов риска венозных и артериальных тромбозов. В частности, 2-4% здоровых людей вышеупомянутых популяций являются гетерозиготными носителями этой мутации [Rosendaal et. al, 1998]. Встречаемость мутации у больных с тромбозами глубоких вен достигает 6-18%, а бессимптомное носительство сопряжено с 2-5-кратным повышением риска возникновения тромботических заболеваний [Margaglione et al, 1998].

Мутация С677Т в гене МТГФР. Врожденные нарушения метаболизма также интенсивно исследуются в связи с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний. Среди этих направлений исследований особое место занимает изучение патологических состояний организма человека, связанных с повышенным содержанием в плазме гомоцистеина: гипергомоцистеинемии и гомоцистинурии. Аминокислота гомоцистеин (HS-CH2-CH2-CH(NíÍ2)COOH) не входит в состав белков и является промежуточным метаболитом, участвующим в биосинтезе метионина. В организме человека и животных гомоцистеин не синтезируется de novo, а образуется из S-аденозилгомоцистеина, который в свою очередь возникает из S-аденозилметионина после переноса метальной группы последнего на многочисленные субстраты метилтрансферазами в реакциях метилирования. Нарушение путей метаболизма гомоцистеина приводит к его повышенному содержанию в плазме крови, которое в норме составляет 5-15 цМ. Имеются многочисленные, хотя и противоречивые данные, указывающие на то, что умеренная гипергомоцистеинемия является серьезным независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая артериальные и венозные тромбозы (см. например обзоры [Hajjar, 2001, Fonseca et al, 1999, D'Angelo, Selhub, 1997]).

В связи с наследственной гипергомоцистеинемией объектом интенсивных исследований в последнее время являются мутационные повреждения гена МТГФР. Ген МТГФР, содержащий 11 экзонов, локализован на хромосоме 1рЗб.З [Goyette et al, 1998]. Полиморфизм С677Т сопровождается заменой Ala222Val в полипептидной цепи МТГФР, что приводит к образованию термолабильного фермента, свойства которого в настоящее время хорошо изучены [Kraus et al, 1998]. Приблизительно 8% мировой популяции (10-15% европейцев, жителей США и Японии) содержат данный аллельный вариант гена в гомозиготном состоянии, а 30-50% - в гетерозиготном. У гомозиготных носителей аллеля, при недостатке фолиевой кислоты развивается умеренная гипергомоцистеинемия, и этот фактор является наиболее распространенной генетической причиной повышения уровня гомоцистеина.

1.3. СИСТЕМА ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРОМБОФИЛИЯМИ, ОСНОВАННАЯ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЦР И ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ

Наши исследования по разработке тест-систем ДНК-диагностики точковых мутаций в геноме человека были начаты с отработки условий, позволяющих обнаруживать локальные изменения первичной структуры ДНК с использованием реальных или потенциальных сайтов рестрикции, расположенных в соответствующих генетических локусах. В мировой генетической практике такие системы были разработаны одними из первых и, несмотря на ряд недостатков, к которым можно отнести их многоэтапность и недостаточную универсальность (необходимые сайты рестрикции можно найти не в каждой последовательности), благодаря своей надежности, такие системы не утратили своего значения и в настоящее время. Они активно использовались и используются нами при проведении анализа точковых мутаций.

При разработке систем ДШС-диагностики, основанных на использовании рестриктаз, в настоящее время реализуют три подхода. В том случае, если исследуемая мутация изменяет природный сайт рестрикции, исходно присутствующий в исследуемой ДНК, то продукт ПЦР-амплификации соответствующего генетического локуса перестает расщепляться соответствующей рестриктазой. В другом случае точковая мутация напротив создает в исследуемом локусе новый сайт рестрикции и это изменение можно легко обнаружить по приобретению способности мутантного продукта ПЦР расщепляться эндонуклеазой рестрикции. Наконец, при реализации третьего подхода с помощью одного из праймеров, не полностью комплементарного матричной ДНК, в продукте ПЦР-амплификации создают искусственный сайт рестрикции или его предшественник, который исследуемой мутацией превращается в полноценный сайт. Таким образом, в системах ДНК-диагностики, основанных на использовании рестриктаз, амплифицируют с помощью ПЦР участок геномной ДНК, в котором должна находиться предполагаемая мутация, и продукт ПЦР инкубируют с соответствующей рестриктазой. Расщепление продукта ПЦР или его устойчивость к действию фермента свидетельствует о наличии или отсутствии мутации в анализируемом генетическом локусе.

Как уже упоминалось выше, мутация FV Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы Mnll (детали см. на рис. 8). Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубировали с рестриктазой Мпй и продукты реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле. При отсутствии мутации после электрофореза обнаруживали две низкомолекулярные полосы, образовавшиеся под действием фермента. Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазе свидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации FV Leiden, а частичная - гетерозиготной [Зыкова и др., 1997] (рис. 8а).

FV Leiden Мп!\

Протромбин

МТГФР

Рис. 8. Выявление трех исследуемых мутаций в геноме человека с использованием эндонуклеаз рестрикции. Продукты ПЦР, образовавшиеся после амплификации соответствующих локусов, инкубировали с указанными рестриктазами и разделяли электрофорезом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. +/н— гомозиготная мутация, +/- - гетерозиготная мутация, К - контрольный образец без инкубации с рестриктазами.

Мутация 020210А в гене протромбина нарушает в ПЦР-продукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазы Тад1, недостающие нуклеотиды которого вводятся в ПЦР-продукт с помощью одного из праймеров. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный амплифицированный фрагмент ДНК. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубировали с рестриктазой Тщ1 и продукты реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле. При наличии гомозиготной мутации исходный продукт ПЦР не расщепляется ферментом. Полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствии мутации 020210А в анализируемой ДНК, а частичное -гетерозиготной (рис. 86). Во втором варианте системы ДНК-диапюстики мутации 02021ОА с помощью праймера изменяли последовательность нуклеотидов в продукте ПЦР таким образом, что в результате возникновения такой мутации создается новый сайт рестрикции для рестриктазы НтсйII [НиЬег е1 а1, 2000]. Поэтому расщепление продукта ПЦР в этом случае происходит при наличии в анализируемой ДНК искомой мутации: полное - в случае гомозиготной мутации и частичное - при наличии мутации в гетерозиготном состоянии. Особенностью данной системы является то, что в анализируемом продукте ПЦР всегда присутствует второй сайт рестрикции НтсйИ, расщепление по которому является внутренним контролем, расщепление по которому является внутренним контролем, позволяющим оценивать эффективность функционирования рестриктазы в каждом конкретном образце (данные не представлены).

Мутация С677Т в гене МТГФР приводит к образованию нового сайта рестрикции для рестриктазы Шгф. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубировали с рестриктазой Нт/1 и продукты реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле. При наличии мутации обнаруживали появление двух новых низкомолекулярных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием фермента. При этом полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации С677Т, а частичное - гетерозиготной (рис. 8в). Последовательности всех олигонуклеотидных праймеров, использованных нами в этой части работы, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Первичная структура праймеров, примененных для выявления мутаций с использованием эндонуклеаз рестрикции.

Праймер Мутация (ген)

1R TCTCTTGAAGGAAATGCCCCATTA FV Leiden

2R GGGCTAATAGGACTACTTCTAATC (Фактор V)

3R CAATAAAAGTGACTCTCATC G20210A

4R AGGTGGTGGATTCTTAAGTC (протромбин, Taql)

5R GCACAGACGGCTGTTCTCTT G20210A

6R ATAGCACTGGGAGCATTGAdOC (протромбин, Hindlll)

7R GCCCATGTCGGTGCATGCCTTCA С677Т

8R CCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCC (МТГФР)

Как следует из результатов, представленных в этой части автореферата, система ДНК-диагностики, основанная на поиске изменений сайтов рестрикции в продуктах ПЦР, позволяет надежно обнаруживать точковые мутации в геноме человека. Однако она обладает рядом недостатков, в том числе отсутствием универсальности (требуемые сайты рестрикции могут не всегда присутствовать в анализируемых последовательностях), и многоэтапностью:

1) ПЦР, (2) электрофоретический анализ, (3) рестрикция, (4) электрофоретический анализ, что увеличивает время проведения анализов. Кроме того, использование систем данного типа иногда может приводить к получению ложноположительных результатов из-за недорестрикции. Такие недостатки указывали на необходимость разработки систем ДНК-диагностики, основанных на других принципах. Поэтому в нашей системе ДНК-диагностики второго поколения были использованы принципы аллель-специфической ПЦР, не требующей для своей реализации использования эндонуклеаз рестрикции.

1.4. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ, ОСНОВАННОЙ НА АЛЛЕЛЬ

СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР

Известно, что для эффективного осуществления ПЦР З'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов уменьшается значительно (см. монографии [Патрушев, 2000, 2004]. Именно эта особенность ПЦР лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР, иначе называемой аллель-специфической элонгацией праймера. При исследовании способности 2в#-ДНК-полимеразы инициировать синтез ДНК на праймерах, З'-концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной ДНК, было установлено, что не все пары ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково эффективно предотвращают синтез ДНК. По способности направлять синтез ДНК все такие пары З'-концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий ряд: С.С, A:G, G.A, G:G < А:А < Т:С, С:Т, Т:Т « А:С, С:А « G:T, T:G (данные фирмы "Perkin-Elmer Cetas")- При этом наименее благоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин.

1.4.1 РАЗРАБОТКА АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ FV LEIDEN В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА

На рис. 9-11 представлены схемы разработанного нами высокоэффективного варианта аллель-специфической ПЦР, примененного для выявления мутации FV Leiden при тромбофилиях, а также полученные с помощью данного метода результаты [Miroshnikov, Patrushev, 1997; Зыкова и др., 1997; Patrushev et al, 1998]. При дизайне аллель-специфических праймеров, использованных для ДНК-диагностики мутаций в генах протромбина и МТГФР использовался аналогичный подход.

Оценка аллельного состояния исследуемых мутаций имеет большое значение для как правило, сопровождается повышенной тяжестью протекания заболеваний. Гомозиготные < Лейденские мутации встречаются редко, а гомозиготную мутацию G20210A в гене протромбина нам не удалось обнаружить вообще (см. ниже, раздел 3). Поэтому на первых этапах разработки наших систем ДНК-диагностики этих мутаций мы использовали искусственные матричные ДНК, которые имитировали гетерозиготное и гомозиготное состояние мутаций.

Для синтеза фрагментов ДНК, содержащих требуемую мутацию, были использованы перекрывающиеся встречные праймеры, содержащие мутантные нуклеотиды [Но, et al., 1989]. Схема синтеза представлена в нижней части рис. 9. На первом этапе с помощью праймеров 1 и 3, а также В и 9 на матричной ДНК пациента, содержащей гетерозиготную мутацию FV Leiden, были синтезированы промежуточные фрагменты А и В (рис. 10а, дорожки 2 и 3), содержащие в своих перекрывающихся частях измененный нуклеотид. После электрофоретической очистки фрагменты использовали в качестве матрицы для синтеза фрагмента С с праймерами 1 и 8 (рис. 10а, дорожка 4). Как

Рис. 10. Результаты анализа искусственных матричных ДНК, содержащих требуемый мутантный нуклеотид. я - Дорожки 2, 3,4 и 5 - соответственно фрагменты В, А, С и О (рис. 9), 1 - молекулярные маркеры; б - Подтверждение первичной структуры синтезированных фрагментов. Продукты ПЦР, образовавшиеся в присутствии праймеров 1 и 2 (рис. 9) на искусственной матричной ДНК, не содержащей мутации (дорожки 1 и 2), а также содержащей ее в «гетерозиготном» (дорожки 3 и 4) или «гомозиготном» (дорожки 5 и 6) состоянии, инкубировали с рестриктазой МпЯ (дорожки 2,4 и б) и разделяли электрофорезом в 3% агарозном геле. Образцы 1,3 и 5 не подвергали рестрикции. 7 - молекулярные маркеры. видно, в этом случае среди ПЦР-продуктов доминировал фрагмент ДНК, размер которого (~300 п.о.) соответствовал таковому продукта ПЦР (фрагмент В), синтезированного с помощью праймеров 1 и 8 на ДНК-матрине пациента, не содержащей мутации (рис. 10а, дорожка 5). После очистки с помощью электрофореза нормальный и мутантйый фрагменты ДНК были использованы в качестве матриц при разработке системы аллель-специфической

FV Leiden J!

Пряймер

C-A =i> ■ÜM>G(fX-C —

ПЦР для выявления мутации FV Leiden. При этом гетерозиготное состояние мутации имитировалось эквимолярной смесью фрагментов С и D. Наличие мутации в синтезированном фрагменте ДНК подтвердили, анализируя его первичную структуру по методу Бертины (1994) в нашей модификации, как это было описано выше, с использованием рестриктазы Mnll (рис. 106).

В соответствии с последовательностью нуклеотидов анализируемого участка генома были синтезированы аллель-специфические праймеры, З'-концевые нуклеотиды которых комплементарны мутантному нуклеотиду матричной ДНК или нуклеотиду дикого типа (см. рис. 9,11, таблица 2).

Рис. 11. Предполагаемый механизм действия аллель-специфических праймеров (а) и их функционирование на искусственных матричных ДНК (б). а - З'-Концевой нуклеотид праймера 4 комплементарен мутантному нуклеотиду матрицы Т (в кружке), но не комплементарен нормальному нуклеотиду С. Обратное верно для праймера 6. Нуклеотид С в третьем положении от 3'-конца праймеров всегда некомплементарен матричной ДНК. 6 -Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле, образующихся в присутствии указанных праймеров на искусственных матричных ДНК, содержащих «мутацию» в гомозиготном (дорожки 2,6,7) или гетерозиготном (дорожки 5,9) состоянии, а также без мутации (дорожки 3,4, 8). В контрольных пробах (4 и 7) было проведено 11 дополнительных циклов ПЦР. Стрелки указывают направление элонгации праймеров, перечеркнутые стрелки - на отсутствие элонгации.

Норма

III), C-G =i>

-C-g<CJ-C

AA GO CO AG,, AA AA GG AG,

Циклы

Уже первые опыты с аллель-специфическим праймером 3 (рис. 9, табл. 2) показали, что введение в него 3'-концевого нуклеотида, комплементарного мутантному нуклеотиду матрицы, но не нормальному нуклеотиду, не предотвращало элонгации праймера на матрице дикого типа в обычных условиях проведения ПЦР (данные не представлены). Существенным моментом, значительно усилившим специфичность функционирования аллель-специфических праймеров в нашей системе, было введение вблизи их 3'-концов некомплементарных матрице нуклеотидов (модификация, впервые примененная Ю.А. Берлиным при анализе других последовательностей генома человека). При таком подходе наличие на З'-конце аллель-специфического праймера одновременно двух некомплементарных матрице нуклеотидов значительно сильнее блокировало его элонгацию 7д#-ДНК-полимеразой. Для исключения ложноотрицательных результатов в пробах, где продукт ПЦР отсутствует, повышали число циклов ПЦР сверх оптимального, после чего, при нормальной работе системы, продукт ПЦР появлялся и в них (рис. 116, дорожки 4 и 7), что далее использовалось нами в качестве дополнительного внутреннего контроля.

Дальнейшее подтверждение функциональности разрабатываемой системы ДНК-диагностики было получено при ее использовании для анализа генотипа реальных пациентов московских клиник (рис. 12). В этом случае были использованы препараты ДНК больных тромбофилюши, предварительно исследованные нами с помощью вышеописанной методики с рестриктазой Mnll. Для исключения ложноотрицательных результатов во всех пробах присутствовала дополнительная пара праймеров,

Таблица 2. Первичная структура праймеров, использованных для выявления мутации FV Leiden с помощью аллель-специфической ПЦР пп Первичная структура праймера Назначение

1 TCTCTTGAAGGAAATGCCCCATTA неа

2 GGGCTAATAGGACTACTTCTAATC неа

3 TAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCA а, им

4 TAAGAGCAGATCCCTGGACAGCCA а

5 TAAGAGCAGATCCCTGGACACGCA а

6 AAGAGCAGATCCCTGGACAGCCG а

7 GAGCAGATCCCTGGACAGGCGAC У

8 GGAACAACACCATGATCAGAGCA им

9 ACAAAATACCTGTATTCCTTGCCTG им

10 ATCGTGCCACTGAACCGTAGCCT MC

11 TCCTGGACTCAAGCGATCCACTT MC

Примечание. Полярность олигонуклеотидных праймеров - 5'—>3'; их положение и особенности структуры отображены на рис. 9; подчеркнуты дополнительные некомплементарные матрице нуклеотиды; неа-не аллель-специфический, а - аллель-специфический, им - искусственная матрица, у -универсальный, мс -микросателлитный амплифицирующих микросателлитный локус, локализованный на коротком плече хромосомы 1 человека. В этом опыте продукт ПЦР микросателлитного локуса присутствует во всех пробах, в которые вносились соответствующие праймеры (тонкая стрелка). В то же время, продукт ПЦР, соответствующий мутантному аллелю (обозначен толстой стрелкой), синтезировался только в пробах 1, 3 и 5, содержащих ДНК с гетерозиготной мутацией FV Leiden.

Праймсры 1+4 1+4 1+4 1+4 1+

ДНК FVL WT FVL WT FVL ММ

Рис. 12. Выявление мутации FV Leiden в ДНК пациентов с помощью разработанных аллель-специфических праймеров.

Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле. Дорожки Ч, 3 и 5 - ДНК, содержащие гетерозиготную мутацию, дорожки 2, 4 и 7 - ДНК без мутации. Все реакционные смеси, за исключением 7, содержали микросателлитные праймеры 10 и 11 (рис. 9, табл. 2) для внутреннего контроля (тонкая стрелка). Продукт амплификации гена фактора V обозначен толстой стрелкой. Вверху указаны номера праймеров гена фактора V, а также наличие (FVL) или отсутствие (WT) Лейденской мутации в анализируемом образце ДНК.

Подход с использованием аллель-специфической ПЦР, разработанный для выявления мутации FV Leiden в гене фактора V генома человека, был успешно применен нами и для выявления двух других исследуемых мутаций, ассоциированных с тромбофилиями -G20210A в гене протромбина и С677Т в гене МТГФР (данные не представлены).

Таким образом, разработанная нами полная система аллель-специфической ПЦР включает два набора праймеров: 1) три праймера: два аллель-специфических, соответствующих мутантному и нормальному аллелям анализируемого гена и один обратный общий праймер, 2) пару праймеров, служащих для обеспечения внутреннего контроля, которые позволяют исключать ложноотрицательные результаты. В соответствии с этим, каждая реакционная смесь содержит две пары праймеров. В такой системе первичное выявление мутаций осуществляется с помощью праймера, специфичного в отношении данной мутации. После обнаружения мутации, ее аллельное состояние (гомозиготное или гетерозиготное) определяется с помощью праймера, специфичного в отношении нормального аллеля.

Хотя разработанная нами система с аллель-специфическими праймерами для своей реализации требовала заметно меньше времени и ресурсов, чем соответствующая система, основанная на использовании эндонуклеаз рестрикции, она обладала одним существенным недостатком - позволяла обнаруживать единственную точковую мутацию, которой соответствовал З'-концевой нуклеотид аллель-специфического праймера. Расширить возможности диагностических систем такого типа позволила наша разработка универсальных аллель-специфических праймеров, принцип действия которых описан ниже.

1.4.2 РАЗРАБОТКА УНИВЕРСАЛЬНЫХ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРАЙМЕРОВ

Другой тип разработанных нами универсальных аллель-специфических праймеров содержит 3'-концевой нуклеолид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть (рис. 13а, праймер 7) [Patrushev et al, 1998, Патрушев, 2000, 2004]. В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации.

Один из результатов использования универсального праймера 13 (см. табл. 2 и рис. 9) для обнаружения мутации FV Leiden в искусственной матричной ДНК представлен на рис. 13 б. Видно, что при наличии гомозиготной мутации в ДНК (дорожка 1, аллели АА) продукт амплификации не обнаруживается. В то же время повышение количества циклов амплификации сверх оптимального (дорожка 2) приводит к появлению продукта ПЦР, что, как и в случае с описанными выше обычными аллель-специфическими праймерами, может служить дополнительным внутренним контролем.

Праймер 7 —G-G-C'0-^ ъ ишеп ^¿c^ t-T-cif Leiden {б).

Рис 13. Принцип действия универсальных аллель-специфических праймеров (а) и их использование для выявления мутации РУ

Верхняя часть рисунка (а) отражает положение универсального праймера относительно нуклеотида (в кружке), изменяемого в I [II ^ результате мутации. З'-Концевой нуклеотид универсального

Норма ст-с праймера всегда некомплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. (б) -Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле, образующихся в присутствии указанного праймера на искусственных матричных ДНК с «мутацией» в гомозиготном (дорожки 1, 2) или гетерозиготном (дорожка 4) состоянии, а также без мутации (дорожка 3). В контрольной пробе (2) было проведено 11 дополнительных циклов ПЦР. Дорожка 5 - молекулярные маркеры.

Для оценки разрешающей способности универсальных аллель-специфических праймеров представляло интерес выяснить: на каком расстоянии от 3'-конца они в состоянии распознавать ошибочно спаренные нуклеотиды. Иными словами, Цяклы необходимо было ответить на вопрос: какой длины участок матричной ДНК можно исследовать на наличие мутаций с помощью одного универсального праймера? В серии опытов, результаты которых представлены на рис. 14 и в таблице 3, было установлено, что наличие ошибочно спаренного нуклеотида в гибриде «универсальный праймер-матрица» на расстоянии до 8 нуклеотидов от 3'-конца праймера ингибирует его

12 3 4 Аллели |АА АА GG AG| Праймеры I ■'! элонгацию 7а<7-ДНК-полимеразой. При этом эффект не зависел от того, какой конкретно неспаренный с матрицей

5'-ТСТААСАССА6АТСССТС6АСА6СС Д АСбААТАСАбСТАТТТТСГССТТС-З' З'-АСАТТСТСбТСТАСббАССТЕТССб Т ТССТТАТ6ТССАТААААСА6СААС-5'

5' -САССАбАТСССТвбАСАвбС в АД -> 5'-6А6СА6АТСССТ6САСАвЗС й АС -5'-GAGCAGATCCCTGGACAGGC в АТ

Ь' -GCAG¡A'ÍCCC^:GGAC№GC в АввАв

5Г-ТСССТССАСАССС в кССААГАСАА

- Зге С ТССТГАТСТССАТААААСА6-5'

- ТСТвТССб С ТССТТАТбТССАТААА- 5'

- ТГАСССАССТСГССб С ТССТТАТв-5' (±

- ЛЗТСТАСССАССТСГССС С ТССТТ-5' (+

Рис. 14. Структура универсальных аллель-специфических праймеров и их функционирование при выявлении мутации FV Leiden на искусственной ДНК-матрице. Вверху изображена первичная структура обеих цепей ДНК части экзона 10 фактора V человека, содержащего мутацию FV Leiden в положении 1691; ниже - последовательности нуклеотидов праймеров. Отражено их положение относительно нуклеотида 1691, изменяемого в результате мутации. В структуре праймеров жирным шрифтом и курсивом выделены нуклеотиды, некомплементарные матрице; (-) - отсутствие элонгации праймера; (+) - слабая элонгация, (+) - нормальная элонгация; направление элонгации праймеров обозначено стрелками. нуклеотид был расположен на 3'-конце универсального праймера. В целом, универсальные праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов, а кроме ДНК-диагностики могут использоваться для типирования гаплоидных микроорганизмов (грибов, бактерий и вирусов).

Разработанная нами система аллель-специфической ПЦР для диагностики трех мутаций, ассоциированных с тромбофилиями, является простым, эффективным и универсальным методом обнаружения мутаций в геномной ДНК. В отличие от всех рассмотренных выше методов аллель-специфическая ПЦР в такой постановке позволяет находить небольшое количество мутантных ДНК на фоне большого числа молекул ДНК дикого тина. Аналогичная генетическая ситуация может иметь место в том случае, если соматические мутации возникают в процессе онтогенетического развития организмов, и лишь небольшая часть (клон) соматических клеток таких организмов-мозаиков содержит анализируемые мутации. В этом случае, например при онкологических заболеваниях, мутантные ДНК в препаратах суммарной ДНК сильно разбавлены соответствующими последовательностями дикого типа и их трудно обнаружить другими методами. Аллель-специфические праймеры, полностью комплементарные лишь мутантным

Таблица 3. Влияние 3'-концевого неснаренного нуклеотида универсальных праймеров и их смещения относительно мутантного нуклеотида на эффективность элонгации праймеров в присутствии искусственной ДНК, содержащей гомозиготную «мутацию» FV Leiden.

3'-Концевой неспаренный нуклеотид (праймер:матрица) Смещение 3'-конца праймера относительно мутантного нуклеотида (нт) Эффективность элонгации праймеров на матрице*

FV Leiden Без мутации

T:G 3 - +++

T:G $ — ++

T:G 15 + +++

T:G 18 ++ +++

A:C 2 +/- +-Н

A:C 10 +/- +++

G:T 5 - ++

C:C 2 - +++

T:C 2 — +++

Примечание. *- эффективность элонгации праймера оценивалась визуально по образованию продукта ПЦР, видимого на электрофореграммах: (-) - отсутствие видимого продукта; (+/-) - небольшое количество продукта, обнаруживаемого не во всех опытах. последовательностям анализируемой ДНК, вовлекаются в амплификацию таких мутантных последовательностей, а последовательности нуклеотидов ДНК дикого типа амшшфицируются гораздо менее эффективно. Подобный подход позволяет обнаруживать несколько десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК дикого типа.

1.5. СРАВНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ СИСТЕМ ДИК-ДИАГНОСТИКИ

Хотя оба использованных нами метода (рестриктазный подход и аллель-специфическая ПНР) позволяют эффективно обнаруживать мутации и дифференцировать их аллельное состояние в геномной ДНК человека, ни один из них не свободен от недостатков. Сравнительные характеристики методов, основанных на двух использованных подходах, приведены в таблице 4. При проведении расщепления продуктов ПЦР рестриктазами часто наблюдаются артефакты в виде неполного гидролиза олигонуклеотвдов, что может быть источником ложноположительных результатов. В ряде случаев с помощью этого метода бывает особенно сложно различить гомозиготные и гетерозиготные мутации. В то же время метод, основанный на использовании аллель-специфических праймеров, требует внутреннего контроля, который, тем не менее, не может полностью исключить ложноотрицательные результаты. По нашему опыту лишь сочетание этих двух методов позволяет в сложных случаях дать правильный ответ на вопрос об аллельном состоянии исследуемых мутаций.

Подводя итог первой части диссертационной работы, можно заключить, что в ходе ее выполнения были усовершенствованы и разработаны системы ДНК-диагностики трех исследуемых мутаций в геноме человека, имеющих важное клиническое значение. Ключевой

Таблица 4. Сравнение эффективности и функциональных возможностей систем ДНК-диагностики, основанных на использовании эндонуклеаз рестрикции и аллель-специфической ПЦР

Параметры и возможности системы Система

Рестриктазная Аллель- специфическая ПЦР

Количество стадий при проведении анализа

Необходимость в рестриктазах Да Нет

Способность дифференцировать гомозиготные и гетерозиготные мутации Да Да

Количество необходимых праймеров для выявления и оценки аллельного состояния одной мутации 2 5 (включая внутренний контроль

Количество ПЦР-реакций, необходимых для получения полной характеристики мутации

Универсальность подхода Нет Да

Способность выявлять небольшое количество мутаций в смеси мутантных и нормальных ДНК Нет Да

Способность одновременно выявлять несколько рядом расположенных мутаций Да (в пределах сайта рестрикции) Да (для гомозиготных мутаций) компонент всех этих систем - Гя^-ДНК-полимераза - была получена в ходе специального исследования путем создания высокоэффективного штамма-продуцента этого фермента и разработки нового метода его очистки. При этом использование «горячего старта» ПЦР с помощью обратимой инактивации фермента моноклональными антителами существенно повысило специфичность реакции при амплификации геномной ДНК человека. Метод аллель-специфической ПЦР был впервые применен нами для выявления данных конкретных мутаций, что стало возможным благодаря конструированию набора оригинальных Л праймеров и выявления критических компонентов реакции. При этом принципы, использованные при их создании, могут быть легко применены для создания аналогичных систем, ориентированных на анализ иных мутаций в геноме человека и других организмов.

Разработанные системы были далее применены нами на практике в клинических исследованиях трех вышеупомянутых мутаций.

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ СИСТЕМ ДНК-ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧАСТОТ ВСТРЕЧАЕМОСТИ МУТАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРОМБОФИЛИЯМИ, У ПАЦИЕНТОВ МОСКОВСКИХ КЛИНИК ПРИ РАЗНЫХ ПАТОЛОГИЯХ

Венозные тромбозы возникают в результате взаимодействия многочисленных негенетических и генетических факторов риска [Bertina, 1997, März et al, 2000]. Среди негенетических факторов следует отметить как наиболее важные возраст человека, травматическое или физиологическое повреждение тканей, беременность, использование оральных контрацептивов, ожирение и отсутствие физической активности. Сочетание данных факторов с врожденными нарушениями гемостаза (в том числе и исследуемыми нами мутациями) формирует группы риска возникновения тромбозов. В многочисленных недавних исследованиях была отмечена связь развития тромбозов с различными заболеваниями человека, которые на биохимическом уровне могут имитировать действие вышеупомянутых негенетических факторов риска. Например, аутоантитела, образующиеся при антифосфолипидном синдроме и системной красной волчанке, нарушают функционирование эндотелия кровеносных сосудов и индуцируют тромбообразование. Повреждения тканей имеют место и при онкологических заболеваниях в местах формирования опухолей.

Несмотря на большое практическое значение, до начала нашей работы отсутствовали какие-либо данные о распространенности мутаций FV Leiden, G20210A в гене протромбина, а также С677Т в гене МТГФР среди населения РФ. Поэтому свои исследования связи данных мутаций с конкретными заболеваниями мы начали с оценки частот встречаемости мутаций у здоровых представителей населения г. Москвы и продолжили анализом их частот при различных заболеваниях человека у пациентов московских клиник.

2.1. ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХ МУТАЦИЙ У ЗДОРОВЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НАСЕЛЕНИЯ г. МОСКВЫ

В исследование, проведенное нами совместно с Медико-генетическим научным центром РАМН, были включены 255 представителей русского мужского и женского населения г. Москвы (средний возраст 34,8 лет), не перенесших тромбозов и отсутствием тромбозов у родственников первой линии. Критерием включения в исследование для женщин было отсутствие акушерской патологии на момент включения и в анамнезе. Аллельное состояние исследуемых генов оценивали с помощью описанных выше методов. Как было установлено в ходе предварительных исследований, результаты применения этих методов полностью совпадают. В редких спорных случаях данные, полученные с помощью одного метода, уточняли с использованием другого. Оказалось, что среди 255 обследованных представителей здорового населения г. Москвы шесть (2,4%) оказались носителями гетерозиготной мутации FV Leiden, у пятерых (1,8%) была обнаружена гетерозиготная мутация G20210A в гене протромбина, 22 человека (8,6%) были носителями гомозиготной, а 106 (41,6%) - гетерозиготной мутации в гене МТГФР. Обобщенные результаты по частотам генотипов и аллелей обсуждаемых мутаций в обследованной группе населения представлены в таблице 5.

Таблица 5. Частоты генотипов и аллелей исследуемых генов у здоровых представителей русского населения г. Москвы и их сравнение с соответствующими параметрами некоторых других популяций.

Ген, Русские, п=255 Французы, Китайцы (Хань), мутация п=858 п=

Генотип Частота Аллель Частота (значение Р в сравнении с русскими)*

FS, А/А 0.000 А 0.012 0.027 (0,048) 0.000 (0,027)

FV Leiden, G/A 0.024 G 0.988 0.973 1.

G1691A G/G 0.

F2, А/А 0.000 А 0,010 0.021 (0,099) 0.000 (0,043)

G20210A G/A 0.018 G 0,990 0,979 1.

G/G 0.

MTHFR, Т/Т 0.086 Т 0,294 0,352 (0,015) 0.222 (0,013)

С677Т С/Т 0.416 С 0,706 0,648 0, с/с 0.

Статистическую значимость частот в сравниваемых выборках оценивали с помощью критерия %2 (р<0,05). Данные о частотах аллелей исследуемых генов в зарубежных популяциях взяты из базы данных по частотам аллелей ALFRED (Allele Frequency Database): http://alfred.med.yale.edu/alfred/index.asp.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Наследственные заболевания человека как часть проблемы изменчивости генома эукариот"

Данные, представленные в таблице 5 были использованы в качестве контроля при проведении дальнейших исследований.

2.2. ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХ МУТАЦИЙ У ПАЦИЕНТОВ МОСКОВСКИХ КЛИНИК ИРИ РАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, ОТЯГОЩЕННЫХ ТРОМБОТИЧЕСКИМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

Для выявления возможной связи между наличием в геноме пациентов исследуемых мутаций и тромботическими осложнениями в исследование были включены группы больных, первичные заболевания которых сами по себе могли быть негенетическими факторами риска возникновения тромбоза. Результаты анализа генотипа пациентов московских клиник в отношении исследуемых генов представлены в таблице .£Г

Таблица 6. Количество и частоты аллелей исследуемых генов у пациентов московских клиник с разными заболеваниями, осложненными тромбозами

Заболевание Гены, мутации, аллели

FV Leiden G1691A F2 G20210A MTHFR С677Т

G А G А С Т

Контрольная группа (п=255, аллелей 510) 504 (0,988) 6 (0,012) Г01 505 (0,990) 5 (0,010) Г01 360 (0,706) 150 (0,294) Г441

Отягощенный акушерский анамнез и тромботические осложнения беременности (п=128, аллелей 256)1 251 (0,980) 5 (0,020) [0] р= 0,3941 254 (0,992) 2 (0,008) [0] р= 0,7847 183 (0,715) 73 (0,285) [22] р= 0,7968

Антифосфолипидный синдром и системная красная волчанка (п=94, аллелей 188)2 184 (0,979) 4 (0,021) И р= 0,3482 183 (0,973) 5 (0,027) [0] р= 0,0977 123 (0,346) 65 (0,654) [22] р= 0,1900

Мерцательная аритмия и сопутствующий тромбоз (п=32, аллелей 64)3 60 (0,938) 4 (0,063) [0] р= 9,0035 63 (0,984) 1 (0,016) [0] р= 0,6660 44 (0,688) 20 (0,313) [6] р= 0,7614

Инсульт головного мозга в молодом возрасте (п=20, аллелей 40)4 40 (1,000) 0 (0,000) [0] р= 0,4903 37 (0,925) 3 (0,075) Ю1 р= 0,0009 27 (0,675) 13 (0,325) [0] р= 0,6804

Разные патологии, осложненные тромбозом (п=1522, аллелей 3044)5 2959 (0,972) 85 (0,028) [16J р= 0,0325 2985 (0,981) 59 (0,019) [0] р= 0,1322 2141 (0,703) 903 (0,297) [264] р= 0,9078

Примечание, п - Число обследованных людей в группе; в круглых скобках - частоты аллелей, в квадратных скобках - количество мутантных аллелей в гомозиготном состоянии; жирным курсивом выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля (критерий х2, р<0,05). Работа выполнена совместно со следующими лечебными учреждениями г. Москвы: 1 - Кафедра акушерства и гинекологии РГМУ и AHO Центр иммунологии и репродукции, 2 -НИИ ревматологии РАМН, 3 - Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова * РКМПК, 4 - НИИ неврологии РАМН, 5 - кроме вышеупомянутых НЦ сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Клинические больницы № 15, 20, 83, Детские городские клинические больницы №13 им. Н.Ф. Филатова, Тушинская и Измайловская, Клиника детских болезней ММА им. И.М. Сеченова, Клинические госпитали ГУВД и ракетных войск, Городская клиническая больница им. С.П. Боткина.

Из данных, представленных в таблице, следует, что при всех исследованных патологиях частота встречаемости мутаций FV Leiden или/и G20210A в гене протромбина достоверно (в 2 и более раз) превышает соответствующие значения, характерные для контрольной группы. Следовательно, в соответствии с данными литературы, две вышеупомянутых мутации являются дополнительными факторами риска возникновения тромбоза при исследованных заболеваниях у пациентов Российской Федерации, что указывает на необходимость генотипирования пациентов по аллелям исследуемых генов для проведения более эффективной терапии.

2.3. ПОИСК ПРОМОТОРНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ MTHFR ПАЦИЕНТОВ С ГЕТЕРОЗИГОТНОЙ МУТАЦИЕЙ С677ТИ УМЕРЕННОЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИЕЙ

Как уже упоминалось выше (раздел 1.2), гипергомоцистеинемия (повышенный уровень гомоцистеина в плазме крови), является независимым фактором риска многих заболеваний человека, включая венозные и артериальные тромбозы [Fonseca et al., 2005, Патрушев, 1998, 2002], хотя данные о связи гипергомоцистеинемии с последними заболеваниями противоречивы [Brattström et al., 1998, Perna et al., 2003]. Нормальный уровень гомоцистеина в плазме составляет 5-15 цмоль/л. Гомозиготная (но не гетерозиготная) мутация С677Т в гене МТГФР, которая приводит к термолабильности мутантного фермента, является одной из причин умеренной гипергомоцистеинемии (15-25 цмоль/л). Результаты проведенных нами исследований, представленные в двух предыдущих разделах, демонстрируют высокую частоту встречаемости полиморфизма С677Т у населения РФ, что указывает на большую вероятность возникновения гипергомоцистеинемии у пациентов российских клиник по этому механизму.

В ходе выполнения наших исследований выяснилось, что имеется группа больных с тромбофилиями, у которых по непонятным причинам развивается умеренная и средняя гипергомоцистеинемия на фоне гетерозиготной мутации С677Т [Коваленко и др., 2005]. Для объяснения этого феномена мы предположили, что у таких больных гипергомоцистеинемия может возникать в результате инактивации нормального аллеля гена МТГФР под действием промоторной мутации, что фенотипически могло бы проявляться как гомозиготная мутация С677Т. Для проверки этого предположения мы определили первичную структуру двух участков минимального промотора гена МТГФР, расположенных вблизи инициаторного ATG-кодона (рис 13) [Коваленко и др., 2005].

В исследование было взято 10 пациентов с гетерозиготной мутацией С677Т и повышенным уровнем гомоцистеина в плазме (16-41 ^molesAi). В анамнезе всех больных имелись венозные тромбозы. Гомоцистеин в плазме определяли с помощью ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Соответствующие участки промотора (МТНРЛ-] и МТНРК-2, рис. 15) амплифицировали с помощью ПЦР, используя пары праймеров (МТНРЯ-1) (1) 5'-ТАССТОАТОСААСХЖЮСАСАОАООА, (2) 5'-ТСАССССТТССАТССТСТССАССАА и (МТНШ-2) (1) 5 '-АСТАТСТТГССАОСТСТСАСТОССА, (2) 5'-ТСССТАООААТАТОССССТСССАСОТ. Продукты ПЦР реамплифицировали с помощью праймеров, содержащих на 5'-концах последовательности промоторов Т7- и ЭРб-РИК-полимераз, и образовавшиеся фрагменты ДНК после очистки секвенировали по двум цепям методом Сэнгера. В результате проведенных исследований было rrHFR-2

Кодирующая часть гена установлено, что секвенированные

Рис. 15. Секвенированные участки промотора гена МТГФР пациентов с гипергомоцистеинемией. Обозначены исследованные участки промотора и их длины, а также положения праймеров, использованных для амплификации МТНР11-1 этих участков (стрелки, направленные навстречу друг-другу); загнутые стрелки обозначают сайты инициации транскрипции; стрелка вверху - направление транскрипции; кружки - места связывания фактора транскрипции Бр 1; АТв - инициирующий кодон. участки промотора гена МТГФР не содержат каких-либо мутаций, а следовательно причиной гипергомоцистеинемии в этих случаях должны быть другие молекулярные механизмы, например, инактивация промотора под действием ошибочных эпигенетических модификаций (его гиперметилирование) или другие причины, например, мутации в других генах метаболизма гомоцистеина.

Результаты проведенных нами исследований, представленные во второй части диссертационной работы, впервые продемонстрировали высокую частоту встречаемости трех исследуемых мутаций среди населения РФ. Более того, в ходе выполнения работы была подтверждена, а в ряде случаев (например, с мерцательными аритмиями) впервые показана ассоциированность данных мутаций с тромбозами при конкретных патологических состояниях организма человека. Все это способствовало распространению среди врачей-клиницистов РФ новых знаний о важной роли генетических факторов в развитии тромботических осложнений и осознанию необходимости генотипирования пациентов по обсуждаемым генам. С учетом данных, представленных в автореферате, врачами-клиницистами были разработаны практические рекомендации, в соответствии с которыми рецидивирование тромбозов в молодом возрасте, независимо от нозологии, является показанием для проведения ДНК-диагностики обсуждаемых мутаций в генах РУ, Р2 и

MTHFR, результаты которых следует учитывать при наблюдении за пациентом. Нашей исследовательской группой налажено сервисное обслуживание лечебных отделений многих клинических учреждений в отношении генотипирования их пациентов. Все это помогает врачам-клиницистам выявлять группы риска повышенного тромбообразования, проводить профилактическую терапию и адекватное лечение тромбофилий.

3. НОВЫЙ МЕХАНИЗМ ЗАЩИТЫ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ ОТ ХИМИЧЕСКОГО

МУТАГЕНЕЗА С УЧАСТИЕМ ЕГО НЕКОДИРУЮЩИХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ

Во второй части нашей работы была продемонстрирована генетическая изменчивость в исследованных группах населения РФ, проявляющаяся в наличии аллельных вариантов генов системы свертывания крови и метаболизма гомоцистеина, а также в разных частотах их встречаемости в популяциях человека. Истинные масштабы генетической изменчивости у человека прояснились после полного секвенирования нескольких геномов разных индивидуумов, когда стало ясно, что геномы двух человек различаются более, чем ~1 500 ООО SNP [Weissman et ai., 2001]. В общей сложности к настоящему времени обнаружено более 10 000 000 различий в последовательностях генома человека (Crawford et al., 2005). Анализ 510 генов человека, ассоциированных с его наследственными заболеваниями, показал, что в среднем каждый ген имеет 126 биаллельных полиморфизмов, из которых 46 встречаются с высокой частотой (>5%), причем 5 из них локализованы в кодирующих последовательностях.

Величина и характер генетической изменчивости в популяциях живых организмов определяется многими факторами, среди которых отбор, инбридинг, генетический дрейф, генный поток и мутации рассматриваются в качестве основных [Хедрик, 2003]. При этом мутации играют особую роль в возникновении и поддержании генетической изменчивости в популяциях. Действительно, в основе генетической изменчивости лежат мутационные изменения генома живых организмов, и мутации всегда увеличивают изменчивость в популяциях. В этой связи исследование механизмов возникновения мутаций в геноме живых организмов и контроля самого процесса мутагенеза приобретает особую важность. Поскольку объектом нашего исследования является мутационный процесс, протекающий в геноме человека - типичного представителя эукариотических видов, связанного с остальными ввдами вполне определенными филогенетическими отношениями, представлялось целесообразным проанализировать особенности строения и функционирования генома эукариот в целом, с точки зрения механизмов его возможных мутационных изменений.

Суммарное содержание ДНК в гаплоидном наборе хромосом эукариотических организмов разных видов, обозначаемое латинским символом С, различается более, чем в 200 ООО раз [Cavalier-Smith, 2005]. У позвоночных животных одними из самых больших геномов обладают хвостатые амфибии (протей Necturus lewisi - ~120 пг ДНК). Для сравнения, размер генома человека составляет 3,5 пг [Animal Genome Size Database: http://www.genomesize.com]. Несоответствие между размером генома и биологической сложностью живого организма, который им обладает, получило название парадокса С [Thomas, 1971].

Известно, что основная масса ДНК больших геномов эукариот представлена некодирующими последовательностями. В частности, кодирующие части генов в геноме человека составляют лишь -3% от всех его последовательностей [Lander et al., 2001]. При этом мобильные генетические элементы (транспозоны) рассматриваются в качестве одного из основных эволюционных факторов, определяющих размер эукариотического генома. (Под кодирующими последовательностями в данной работе мы подразумеваем экзоны и регуляторные участки генов, не входящих в состав транспозонов). Причины, определяющие размер генома конкретных биологических видов, а также функции большинства некодирующих последовательностей ДНК эукариот в настоящее время неизвестны.

Попытки объяснения парадокса С привели к разработке ряда концепций, разделяемых Т.Р. Грегори на две основных группы [Gregory, 2001]. Теории первой группы рассматривают некодирукяцую ДНК генома эукариот как остатки ранее существовавших генов, инактивированных под действием мутаций (junk DNA) [Pagel, Johnstone, 1992], или «эгоистическую» (паразитическую) ДНК (selfish DNA), между отдельными представителями которой происходит внутриядерная конкурентная борьба за максимальную представленность в геноме [Doolittle., Sapienza, 1980; Orgel, Crick, 1980]. Вторая группа моделей указывает на возможную прямую связь между размером генома и объемом ядра, с одной стороны, а также фенотипом клеток и организма, с другой. Среди этих теорий наиболее известными являются модель скелетной ДНК (nucleoskeletal theory) Т. Кавалье-Смита [Cavalier-Smith, 2005] и близкая к ней теория нуклеотипа Б. Коммонера и М.Д. Беннета [Bennett, 1996]. В соответствии с моделью скелетной ДНК, поддержание объема клеток, детерминированного генетически, требует определенного объема ядер, который, в свою очередь, определяется количеством заключенной в ядре ДНК. Размеры клеток и ядер коэволюционируют, причем давление отбора в этом процессе направлено на поддержание требуемого размера клеток, что косвенно оказывает влияние и на содержание ДНК в их ядрах, объем которых должен соответствовать размеру клеток. Близкая к рассмотренной теория нуклеотипа предполагает, что случайные изменения размера генома оказывают влияние (через изменение объема ядер) на фенотип клеток, который находится под давлением естественного отбора. В том случае, если изменения оказываются благоприятными для организма, происходит фиксация изменений размера генома. По определению авторов нуклеотип в отличие от фенотипа - это совокупность признаков, определяемых размером генома, но не заключенной в нем генетической информацией. Ни одна из вышеупомянутых моделей не является в настоящее время общепризнанной [Gregory, 2001,2005].

Для объяснения межвидовых различий в размерах эукариотических геномов нами разработана новая модель, принципиально отличающаяся от уже имеющихся. В соответствии с данной моделью одним из основных факторов эволюции генома эукариот является мутационный процесс, вызываемый эндогенными мутагенами. При этом некодирующие последовательности создают дополнительный уровень защиты кодирующих последовательностей от повреждений, вызываемых химическими мутагенами. Чем меньше доля кодирующих последовательностей во внутриядерном микрокомпартменте, тем меньше вероятность их взаимодействия с химическим мутагеном и тем больше вероятность нейтрализации мутагена некодирующей последовательностью. Ниже более подробно рассмотрены основные положения предлагаемой модели [Patrushev, 1997; Патрушев, 2000; Патрушев, Минкевич, 2005].

3.1. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ НАХОДИТСЯ В ПОСТОЯННОМ КОНТАКТЕ С ЭНДОГЕННЫМИ МУТАГЕНАМИ И ФОРМИРУЕТСЯ ПОД ИХ ВОЗДЕЙСТВИЕМ

В реакциях окисления-восстановления субстратов с участием кислорода, лежащих в основе жизнедеятельности эукариотических организмов, в качестве побочных продуктов постоянно образуются свободные радикалы, которые повреждают молекулы геномной ДНК. У аэробных организмов в процессе дыхания 4-5% молекул Ог превращается в активные формы кислорода (супероксид анион, перекись водорода, радикалы гидроксила и т.п.), обладающие мутагенной активностью, которые реагируют с азотистыми основаниями или дезоксирибозой нуклеотидов с образованием мутагенных аддуктов. Мутагенным действием также обладают и другие молекулы эндогенного происхождения [De Bont, van Larebeke, 2004]. В результате такого рода реакций в геноме возникают десятки видов модифицированных оснований ДНК разной структуры, которые в стационарном состоянии постоянно присутствуют в количестве сотен тысяч в геномной ДНК каждой клетки. Те из них, которые не подверглись репарации, становятся источником мутаций. В соответствии с этим, защита кодирующих последовательностей от эндогенных мутагенов является « жизненно-важной задачей каждого вида организмов, а способность преодолевать вредные последствия эндогенных повреждений ДНК находится под постоянным давлением естественного отбора.

Известно, что биологические виды преодолевают вредные последствия эндогенного мутагенеза с помощью двух систем защиты: антимутагенеза и репарации повреждений ДНК [Barnes, Lindahl, 2004]. С участием антимутагенов (ферментов и низкомолекулярных соединений-ловушек свободных радикалов) происходит химическая или ферментативная инактивация мутагенов, а также подавление метаболической активации промутагенов. Две системы эксцизионной репарации, использующие удаление азотистых оснований (BER -base excision repair) и удаление нуклеотидов (NER - nucleotide excision repair) вносят основной вклад в восстановление повреждений ДНК, вызванных свободными радикалами. Поскольку ни одна из вышеперечисленных систем защиты ДНК не обладает абсолютной эффективностью, в процессе репликации поврежденные нуклеотиды ДНК в дочерних цепях могут замениться на другие - мутантные.

3.2. НЕКОДИРУЮЩИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК СОЗДАЮТ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ УРОВЕНЬ ЗАЩИТЫ КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВА ТЕЛЬНОСТЕЙ ОТ ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ

Количественно действие мутагенов в ядре можно описать следующей моделью. На данном этапе моделирования будем учитывать только три процесса - образование мутагенов, их взаимодействие с ДНК, в результате которого молекулы мутагенов отактивируются, а нуклеотиды, с которыми они реагируют, повреждаются, и репарацию поврежденных нуклеотидов. Поскольку структурные особенности отдельных внутриядерных микрокомлартментов и конкретных генетических локусов пока не учитываются, данная модель носит усредненный характер.

Обозначения: для кодирующей и некодирующей частей генома примем индексы «с» и «пс», соответственно; jVcT и NmT - общее количество (total), соответственно, кодирующих и некодирующих нуклеотидов в геноме, NcS и jVnl.s - числа неповрежденных (safe) нуклеотидов, VRc и VfJlc - скорости репарации (repair) кодирующих и некодирующих нуклеотидов; С и Vu - количество мутагенов в ядре и скорость их появления в ядре (складывается из поступивших извне и образовавшихся в ядре). При обычном содержании мутагенов количество этих событий достаточно велико, чтобы ввести уравнения типа используемых в химической кинетике: dNjdt = -kDCNcS+VRc (1) àNjdt^CN^+V^ (2) dC/dt = Vu-k0C{N^NnJ (3) где к0 - кинетическая константа взаимодействия мутагена с нуклеотидом. Скорости репарации пропорциональны числу поврежденных нуклеотидов (разности между полным числом нуклеотидов и числом неповрежденных): = Ф* -Я*). Гш = ФпОТ"О (4)

Кинетическая константа обеих скоростей кя в данной модели одна и та же.

Рассмотрим стационарный процесс. Тогда производные в (1)-(3) равны нулю, и система (1)-(4) приобретает вид:

5)

6) квфГл+Ы^Гч (7)

Поскольку уравнения (5) и (6) идентичны, отношение числа неповрежденных нуклеотидов к общему числу нуклеотидов в кодирующей ^а/М^) и некодирующей (А^/Л^пст) частях генома одинаково. Обозначим это отношение как а, а долю поврежденных нуклеотидов как /? = 1 - а. Тогда А^ = аЫл, Л'пс5 = а/УпсТ. Подставляя последние выражения в (5)-(7), получаем после преобразований:

Р = Г*№Ф« +Л-т)]=А/(1+Л,-г/ЛГ<г) (8) где Д = Д0™ поврежденных нуклеотидов при полном отсутствии некодирующих последовательностей в геноме. Если некодирукяцая часть генома намного превосходит кодирующую (№псТ » А^), то (8) можно представить в виде: /?»

Из формулы (8) следует, что доля поврежденных нуклеотидов р пропорциональна скорости появления мутагенов в ядре, обратно пропорциональна кинетической константе процесса репарации и обратно пропорциональна полному числу всех нуклеотидов в геноме, как кодирующих, так и некодирующих. Присутствие члена, относящегося к кодирующим нуклеотидам в (8) означает, что кодирующие нуклеотиды также защищают друг друга (молекула мутагена, прореагировавшая с одним нуклеотидом, нейтрализуется им). Существование некодирующей части генома усиливает этот эффект в (1 + Л''„т/Л^сТ)«Л^11<,т/ЛГс1 раз. Например, для человека вышеупомянутая доля кодирующей .ДНК -3% означает Л^т/ЛГд ~ 0,97/0,03 » 32.

3.3. О ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИЩЕННОСТИ КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Основные выводы, полученные при анализе последствий эндогенного мутагенеза для целых геномов, могут быть применены и к отдельным внутриядерным микрокомпартментам, включая конкретные генетические локусы. Действительно, расположение генетического материала в интерфазных ядрах высоко упорядочено [Taddei et al. 2004]. Индивидуальные хромосомы организованы в виде дискретных хромосомных территорий, а содержание в них некодирующих последовательностей значительно различается и уникально для индивидуальных хромосом [Lander et al., 2001]. Более того, соотношение длин интронов и экзонов в конкретных генах является стабильной характеристикой биологических видов.

Доступность генетических локусов как для химических мутагенов, так и для ферментов репарации ДНК зависит и от пространственной организации локусов внутри ядра, в том числе от уровня конденсированности хроматина. Из общих соображений концентрация мутагенов должна быть больше у поверхности ядра. В этой связи особенно характерная для клеток растений конфигурация Рабла, при которой в интерфазных ядрах некодирующие теломерные и центромерные последовательности хромосом располагаются напротив друг друга по периферии ядер, недавно была подтверждена для клеток мышей и человека [Weierich et al, 2003, Solovei et al. 2004]. Кроме того в соответствии с этим показано, что большинство хромосом человека, содержащих много генов (например, хромосома 19), локализуются преимущественно внутри ядра, а бедные генами (в частности, хромосома 18) -снаружи [Boyle et al., 2001]. Скорость накопления мутаций в микрохромосомах птиц достоверно выше, чем в макрохромосомах и хромосомах промежуточного размера [Axelsson et al. 2005].

В геноме эукариот мутабильность отдельных генетических локусов значительно различается. Недавно на основании анализа распределения синонимических замен нуклеотидов в ~15 000 генах человека было продемонстрировано наличие в геноме участков с высокой и низкой частотой возникновения мутаций [Chuang, Li, 2004]. То же характерно и для генома мышей [Gaffney, Keightley, 2005]. Такого рода данные позволяют предполагать, что, в соответствии с развиваемой нами концепцией, частота возникновения спонтанных мутаций в отдельных эукариотических локусах может быть генетически детерминирована.

3.4. БОЛЬШИЕ РАЗЛИЧИЯ В РАЗМЕРАХ ГЕНОМОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВИДОВ

МОГУТ БЫТЬ СЛЕДСТВИЕМ РАЗЛИЧИЙ В МЕХАНИЗМАХ ЗАЩИТЫ

ГЕНОМА ОТ ЭНДОГЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

Как следует из вышеизложенного, в эукариотическом геноме число нуклеотидов, поврежденных химическими мутагенами, а следовательно и частота мутаций, должны в значительной степени зависеть от концентрации мутагенов в ядре, размера генома и эффективности функционирования систем репарации ДНК. Можно предполагать, что у близких биологических видов с низким соотношением длин кодирующих и некодирующих последовательностей (большим размером генома) в ядре присутствует бблыпее количество химических мутагенов (эндогенного или экзогенного происхождения) или же менее эффективно осуществляется репарация повреждений ДНК. В этом случае некодирующие последовательности обеспечивают снижение частоты мутаций в кодирующих последовательностях до приемлемого уровня.

Скачкообразное увеличение размера генома в результате полиплоидизации вначале должно резко снижать частоту мутаций, вызываемых химическими (в том числе эндогенными) мутагенами. После этого могут реализоваться два сценария эволюционных событий. Во-первых, из-за отсутствия у таких полиплоидов давления отбора на поддержание избыточных последовательностей будет происходить их спонтанное удаление из генома в результате неравного кроссинговера и тому подобных механизмов. Во-вторых, у полиплоидов могут произойти мутации, понижающие эффективность работы систем репарации и/или антимутагенеза без вредных последствий для организма, поскольку избыточные последовательности возьмут на себя часть защитных функций этих систем. В этом случае уменьшение размеров полиплоидного генома будет невозможно из-за вредных мутагенных последствий для всего организма.

В целом, разработанная нами модель раскрывает неизвестную ранее защитную функцию «избыточных» последовательностей ДНК в геноме эукариот и по-новому объясняет большие межвидовые различия в размерах генома эукариот (парадокс С), указывая на возможный путь его эволюции. Кроме того, она уточняет механизм мутагенеза, происходящего у этих организмов, включая человека, что может в будущем способствовать разработке новых подходов к защите жизненно важных генов от химических мутагенов, а также облегчить преодоление наследственных и приобретенных заболеваний. Действительно, создание методами генной инженерии искусственной защиты высокомутабильных генетических локусов путем изменения их пространственной структуры могло бы стабилизировать такие участки генома. выводы

1. С целью создания новых систем ПЦР-диагностики мутаций в геноме человека впервые в России клонирован ген термостабильной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, сконструирован высокопродуктивный штамм-продуцент Taq-ДВК-лолимеразы, разработан эффективный метод очистки фермента, а также получены производные Гад-ДНК-полимеразы, расширяющие возможности ее применения.

2. На основе препаратов Jag-ДНК-полимеразы впервые разработана система аллель-специфической ПЦР для выявления трех мутаций, ассоциированных с тромбофилиями: FV Leiden в гене фактора V свертывания крови, G20210A в гене протромбина и С677Т в гене 5,10-метилентерагидрофолатредуктазы (МТГФР).

3. Предложен и реализован на практике новый принцип разработки универсальных аллель-специфических праймеров, пригодных для обнаружения гомозиготных точковых мутаций и мутаций у гаплоидных организмов.

4. Разработанные системы использованы для первого систематического исследования частот встречаемости трех исследуемых мутаций среди населения г. Москвы. Высказано предположение, что по этому показателю (мутации FY Leiden, G20210A в гене протромбина и С677Т в гене MTHFR) население г. Москвы могут занимать промежуточное положение (р<0,05) между Западно-Европейской (Франция) и Азиатской (Китай) популяциями.

5. Подтверждена, а также впервые продемонстрирована ассоциированность мутаций FV Leiden и G20210A в гене протромбина с тромбофилиями при различных заболеваниях, осложненных тромбозами.

6. Разработанные системы ДНК-диагностики внедрены в клиническую практику, что позволяет осуществлять своевременное выявление факторов риска наследственных тромбофилий при различных патологиях.

7. Разработана количественная модель, обнаруживающая защитную функцию некодирующих последовательностей генома эукариот, которые защищают кодирующие последовательности генома от действия химических мутагенов. На основании модели предложено новое объяснение больших межвидовых различий в размерах геномов эукариот.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Монографии:

1. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М., Наука, 528 е., 2000.

2. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т. 1, Генная и белковая инженерия. М„ Наука, 526 е., 2004.

Главы в книгах:

Патрушев Л.И. Биосинтез белка в искусственных генетических системах. В монографин

Проблемы белка», М., Наука, 354-478, 1995.

Обзоры:

1. Патрушев Л.И. Тромбофилические состояния и современные методы их диагностики. Русский Медицинский Журнал, г. 6, № 3,181-185, 1998.

2. Патрушев Л.И. Генетические механизмы наследственных нарушений гемостаза. Биохимия, т. 67, вып. 1,40-55,2002.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Патрушев Л.И., Валяев А.Г., Головченко ПЛ., Виноградов C.B., Чикивдас М.Л., Киселев В.И. Клонирование и экспрессия в клетках E.coli гена термостабильной ДНК-цолимеразы íTieraítóíarg'ueíicMí'YTl. Молекулярная биология, т. 27, №5,1100-1112, 1993.

2. Зыкова Е.С., Патрушев Л.И., Кагошин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И., Бокарев И.Н., Леонтьев С.Г., Кошкин В.М., Северин Е.С. Новые аллель-специфические праймеры для обнаружения мутации Leiden в экзоне 10 гена фактора V при тромбофилиях. Биоорганическая химия, т.23, №3,205-210,1997.

3. Patrushev L.I. Altruistic DNA. About protective fonctions of the abundant DNA in eukaryotic genome and its role in stabilizing genetic information. Biochem. Mol. Biol. Int., Vol. 41, № 4, 851-860,1997.

4. Патрушев Л.И., Зыкова E.C., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И. Новая система ДНК-диагностики, позволяющая обнаруживать и дифференцировать гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации. Биоорганическая Химия, т. 24, № 3, 194-200, 1998.

5. Patrushev L.I., Zykova E.S., Kayushin A.L., Korosteleva M.D., Miroshnikov A.I., Severin E.S. New DNA diagnostic system for detection of factor V Leiden. Thrombosis Res., "Vol. 92, No 6, 251-259,1998.

6. Решетняк Т.М., Патрушев Л.И., Стукачева Е.А., Мирошников А.И., Тихонова Т.Л., Насонов Е.Л., Алекберова З.С. Мутации Leiden, G20210A в гене протромбина и антифосфолипидные антитела при системной красной волчанке и антифосфолипидном синдроме. Терапевтический архив, № 5,34-38,2000.

7. Бокарев М.И., Патрушев Л.И., Воробьев Г.С., Козлова Т.В., Мамонтов P.E. Рецидивирующий тромбоз глубоких вен нижних конечностей у пациента с гипергомоцистеинемией. Клиническая Медицина, т. 79, № 12, 54-56,2001.

8. Тихонова Т.Л., Коваленко Т.Ф., Патрушев Л.И., Мач Э.С., Решетняк Т.М. Первичный антифосфолипидный синдром в сочетании с гетерозиготной мутацией в гене протромбина (G20210A): описание случая. Клиническая медицина, №10, 66-69,2002.

9. Решетняк Т.М., Патрушев Л.И., Тихонова Т.Л., Коваленко Т.Ф., Мач Е.С., Александрова E.H., Мирошников А.И., Насонова В.А. Мутации в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы при системной красной волчанке и антифосфолипидном синдроме. Терапевтический архив, т. 74, № 5, 28-32,2002.

10. Варданян A.B., Мумладзе Р.Б., Ройтман Е.В., Коваленко Т.Ф., Патрушев Л.Й., Зорина H.A., Варенкова Н.Ю., Логинов C.B. Оценка эффективности лечебно-диагностического комплекса, используемого для профилактики венозных тромбоэмболических осложнений. Российские медицинские вести, т. 10, №3,42-48,2005.

11. Коваленко Т.Ф., Ванюшева О.В.,. Шилов И.А, Сосин Д.В., Суховерхова A.C., Козлова Т.В., Бокарев И.Н., Сорокина A.B., Озолиня Л.А., Патрушев Л.И. Исследование промоторой генов MTHFR при гилергомоцистеинемии и PTEN при злокачественных и доброкачественных опухолях эндометрия и яичников. Биоорганическая химия, г. 32, № 3, 2006 (принята в печать)

12. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Некодирующие последовательности генома эукариот создают* дополнительный уровень защиты генов от химических мутагенов. Биоорганическая химия,| Т. 32, № 3,2006 (Принята вП£чать)

Тезисы докладов:

1. Патрушев Л.И., Валяев А.Г., Головченко П.А., Виноградов C.B. Клонирование генов термостабильных ДНК-полимераз из природных штаммов Thermus thermophilus и Thermus aquaticus. 2 Всесоюзный симпозиум «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии», Самарканд, 40,1991.

2. Патрушев Л.И., Валяев А.Г., Головченко П.А., Виноградов C.B., Чикиндас М.Л., Киселев В.И. E.coli PVG-A23: бактериальный штамм-продуцент термостабильной ДНКполимеразы Thermits acquaticus YT1. 5 Конференция Российской федерации: «Новые направления биотехнологии», Пущино на Оке, 126,1992.

3. Сологуб В.К., Крамаров В.М., Головченко П.А., Валяев А.Г., Патрушев Л.И. Получение моноклональных антител к термостабильной ДНК-полимеразе Thermus thermophihs. 5 Конференция Российской федерации: «Новые направления биотехнологии», Пущино на Оке, 124, 1992.

4. Патрушев Л.И., Громадский М.В., Зыкова Е.С., Леонтьев С.Г., Бокарев И.Н., Мирошников А.И., Кошкин В.М, Северин Е.С. Молекулярно-биологические подходы к диагностике тромбофшшй. Патология гемокаогуляции, часть IV, М., 122-123,1995.

5. Патрушев Л.И., Зыкова Е.С., Громадский М.В., Леонтьев С.Г., Бокарев И.Н., Мирошников А.И., Кошкин В.М., Северин Е.С. I Всероссийская научно-практическая конференция «Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения», Сочи, 71-73, 1996.

6. Patrushev L.I., Zykova E.S., Kayushin A.L., Miroshnikov A.I., Leont'ev S.O., Bokarev I.N., Koshkin V.M., Severin E.S. Detection of the factor V gene mutations in thrombosis patients by improved allele-specific PCR. 10th Meeting of the Danubian League Against Thrombosis and Haemorragic Disorders, Poznan, Poland, 57, 1996.

7. Патрушев Л.И., Зыкова E.C., Каюшин А.Л., Мирошников А.И., Леонтьев С.Г. Бокарев И.Н., Кошкин В.М., Северин Е.С., Сухих Г.Т, Квасов А.В., Серебряков В.Г. Молекулярно-диагностические исследования мутации Leiden в гене фактора V, ассоциированной с венозньми тромбофилиями. П1 Всероссийская конференция «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения», Москва, 1997.

8. Miroshnikov A.I., Patrushev L.I. New universal PCR based method for detection of point mutations. FASEB J., Vol. 11,№9,A948,1997.

9. Bokarev I.N., Zykova E.S., Patrushev L.I., Kayushin A.L, Korosteleva M.D., Miroshnikov A.I., Leont'ev S.G., Koshkin V.M., Severin E.S. New DNA diagnostic system for detection of the mutation Leiden in patients with thrombophilia. Thrombosis and Haemostasis, Suppl. 19-20, 1997.

Ю.Патрушев Л.И., Головченко П.А. На пути к пониманию архитектоники ядра. О функциональной роли шпронов и других некодирующих последовательностей в геноме эукариот. IV чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущино. 60,1998.

11. Patrushev L.I., Zykova E.S., Guseva N.A., Kayushin A.L., Korosteleva M.D. The development of a universal PCR-based system for point mutation screening. Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistiy. Scientific Report 1996-1997, 113-114, 1998.

12. Patrushev L.I. Altruistic DNA. Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry. Scientific Report 1996-1997, 114-116, 1998.

13.Шполянская Н.Ю., Озолиня JI.А., Патрушев Л.И., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Гуссва Н.А., Струкова С.М., Мирошников А.ИЛЗысокая частота встречаемости мутации Leiden у больных с венозными тромбоэмболическими осложнениями в акушерстве и гинекологии. Атеротромбоз - проблема современности, Москва, 126-128,1999.

14.Patrushev L.I., Guseva N.A., Ionova V.G., Maksimova L.I., Strukova S.M. Small deep infarction and resistance to activated protein C. Atherosclerosis, Vol. 144, Suppl. 1, 195,1999.

15. Patrushev L.I., Guseva N.A., Zykova E.S., Shpolyanskaya N.Yu., Ozolinya L.A., Ionova V.G., Maksimova L.I., Reshetnyak T.M., Strukova S.M., Makarov O.V., Bokarev I.N., Alekberova Z.S., Miroshnikov A.I. Prevalence of factor V Leiden among patients with venous thrombosis, small deep infarction, antiphospholipid syndrome or venous thromboembolic complications in obstetrics and gynecology. The results of investigations performed in Moscow hospitals. Thrombosis and Haemostasis, Suppl., 769,1999.

16. Патрушев Л.И., Шполянская Н.Ю., Озолиня Л.А., Мирошников А.И., Зыкова Е.С., Бокарев И.Н. Современные методы ДНК-диагностики тромбофилических состояний. Клиническая лабораторная диагностика, № 10,40-41,1999.

17. Макаров О.В., Патрушев Л.И., Озолиня Л.А., Шполянская Н.Ю. Роль генетических аномалий в развитии тромбозов в акушерстве и гинекологии. Юбилейный сборник, посвященный 90-летию кафедры акушерства и гинекологии РГМУ, Москва, 36-37,1999.

18. Озолиня Л.А., Патрушев Л.И., Игнатченко О.Ю., Макаров О.В. Генетические аспекты рака эндометрия (по материалам обзора литературы). Юбилейный сборник, посвященный 90-летию кафедры акушерства и гинекологии РГМУ, Москва, 130-131, 1999.

19. Озолиня Л.А., Шполянская Н.Ю., Керчелаева С.Б., Патрушев Л.И., Стукачева Е.А. Значение генетических факторов и антител к фосфолипидам в развитии венозных тромбозов в акушерстве и гинекологии и их профилактика. V Всероссийская конференция: "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения", Москва, 128129,2000.

20. Макаров О.В., Патрушев Л.И., Озолиня Л.А., Игнатченко О.Ю., Коваленко Т.Ф. Нестабильность микросателлитов как маркер дестабилизации генома при раке и гиперпластических процессах эндометрия. II Российский форум "Мать и дитя", Москва, 239-240,2000.

21. Макаров О.В., Озолиня Л.А., Шполянская Н.Ю., Патрушев Л.И. Роль генетических факторов в развитии тромбофилии в акушерстве и гинекологии. Акушерство и гинекология, №4,7-9,2000.

22. Патрушев Л.И., Стукачева Б.А., Озолиня Л.А., Шполянская Н.Ю., Тихонова Т.Л., Решетняк Т.М. Роль генетических факторов в развитии тромбозов. Распространенность мутаций в генах фактора V (G1691A, Leiden), протромбина (G20210A) и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) среди больных тромбофилиями Московских клиник. Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика 2000), Москва - Пущине, 48-49,2000.

23. Kovalenko T.F., Ozolinya L.A., Patrushev L.I., Shpolyanskaya N.Yu., Stukacheva E.A., Makarov O.V. Prevalence of factor V Leiden, prothrombin G20210A and 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutations in pregnant women of Moscow population and their possible role in the pathogenesis of obstetric and thromboembolic complications. Thrombosis and Haemostasis, Suppl., P3024,2001

24. Tikhonova T.L., Reshetnyak T.M., Patrushev L.I., Kovalenko T.F., Stukacheva E.A., Alexandrova E.N. Accompanying risk factors for recurrent thrombosis in patients with antiphospholipid syndrome. Thrombosis and Haemostasis, Suppl., CD3255,2001.

25.Reshetnyak Т., Popkova Т., Tichonova Т., Patrushev L., Kovalenko Т., Match E., Oserova I., Perova N., Fomicheva O., Alexandrova E., Nassonova V., Nassonov E. Is antiphospholipid antibodies a risk factor for atherosclerosis? Atherosclerosis, v. 3, No 2, 583,2002.

26. Патрушев Л.И., Головченко П.А. Упорядоченное расположение жизненно важных генов на хромосомах дрожжей Saccharomyces cerevisiae предполагает существование новых уровней пространственной организации хроматина, а также механизмов регуляции экспрессии генов эукариот. VI Чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва - Пущино, 7,2002.

27. Патрушев Л.И., Коваленко Т.Ф., Шполянская Н.Ю., Игнатченко О.Ю., Озолиня Л.А., Решетняк Т.М., Тихонова Т.Л., Козлова Т.В., Бокарев И.Н., Шевченко А.О., Гузов И.И., Жукова И.Ю., Кропачева Е.С., Жаркова Т.В., Добровольский А.Б., Панченко Е.П., Калашникова Л.А. Встречаемость мутаций в генах факторов V (G1691A, FV Leiden), протромбина (G20210A) и 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) у больных венозными тромбозами и раком эндометрия (результаты обследования пациентов ведущих Московских клиник). VI Чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва - Пущино, 43-44,2002.

28. Kalashnikova L-, Patrusheva N., Patrashev L., Kovalenko Т., Dobrynina L., Alexandrova E., Nassonov E. Factor V Leiden, prothrombin G20210A, and MTHFR C677T gene mutations in patients with primary anti-phospholipid syndrome and cerebrovascular disorder. J Thrombosis and Haemostasis, Vol. 1, Suppl. 1, P0994,2003.

29. Bokarev I. N., Kozlova Т. V., Patrushev L. I., Efunov V. S. The role of thrombophilias in the origin of cerebrovascular accidents at the patients with Atrial Fibrillation. J Thrombosis and Haemostasis, Vol. 1, Suppl. 1, P0988,2003.

30. Kropacheva E., Panchenko E., Dobrovolsky A., Ataullahanova D., Titaeva E., Zharkova Т., Kovalenko Т., Suhoverhova A., Patrusheva N., Patrushev L. Efficacy of 1-year acenocumarol therapy and its relation with gene polymorphism related to thrombophilia in patients with nonvalvular atrial fibrillation. J Thrombosis and Haemostasis, Vol. 1, Suppl. 1, P0524, 2003.

31.Guzov I. I., Patrushev L. I., Kovalenko T. F., Kukhoreva T. A. Inheritable thrombophilias in women with high risk of obstetric complications in the Moscow population. J Thrombosis and Haemostasis, Vol. 1, Suppl. 1,P0857,2003.

32. Коваленко Т.Ф., Суховерхова A.C., Сосин Д.В., Финковская А.В., Озолиня Л.А., Патрушев Л.И. Изменения промотора гена PTEN человека при онкологических заболеваниях эндометрия и яичников. VII Чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущино, 2004.

33. Kovalenko T.F., Sukhoverkhova A.S., Patrusheva N.L., Vanyusheva O.V., ShilovI.A., Kozlova T.V., Bokarev I.N., Patrushev L.I. Study of the methylenetetrahydrofolate reductase gene promoter in patients with heterozygous C677T MTHFR gene polymorphism and hyperhomocysteinemia. J Thrombosis Haemostasis, Volume 3, Supplement 1, PI083, 2005.