Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Атрофия зрительных нервов Лебера (АЗНЛ): молекулярно-генетический и клинический анализ у российских больных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Повалко, Наталия Борисовна,

российская академия медицинских наук

гу медико-генетический научный центр

На правах рукописи

Ю4.20 0.6 19175"

повалко наталия борисовна

атрофия зрительных нервов лебера (азнл): молекулярно-генетический и клинический анализ у российских больных

03.00.15 - «Генетика» 14.00.13 - «Нервные болезни»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: к.м.н. Захарова Е.Ю. д.м.н. Руденская Г.Е.

МОСКВА 2006

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

A3HJI (LHON) — атрофия зрительных нервов Лебера (Leber's hereditary optic neuropathy) MELAS — акроним по основным клиническим составляющим симптомам: митохондриальная энцефалопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды MERRF — акроним по основным клиническим составляющим симптомам: миоклонус-эпиленсия, «рваные красные волокна»

NARP — акроним по основным клиническим составляющим симптомам: нейропатия, атаксия, пигментная дегенерация сетчатки KSS — синдром Кернса-Сейра

СРЕО — акроним по основным клиническим составляющим симптомам: хроническая

прогрессирующая наружная офтальмоплегия

ДЦМ — дыхательная цепь митохондрий

КДЦМ — комплексы дыхательной цепи митохондрий

мтДНК — митохондриальная ДНК

яДНК — ядерная ДНК

тРНК — транспортная РНК

мРНК — матричная РНК

рРНК — рибосомальная РНК

ND1, ND2,ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6 — гены, кодирующие полипептиды I комплекса дыхательной цепи

СОХ2 — ген, кодирующий полипептиды IV комплекса дыхательной цепи ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПДРФ-анализ — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов

KT — компьютерная томография

МРТ — магнитная резонансная томография

ЭКГ — электрокардиография

Эхо-КГ — эхо-кардиография

ЗВП — зрительные вызванные потенциалы

ВВЕДЕНИЕ

Атрофия зрительных нервов Лебера (A3HJI; в англоязычной литературе LHON: Leber hereditaty optic neuropathy), MIM 53500, — нейроофтальмологическое заболевание митохондриальной природы, проявляющееся быстрой, обычно необратимой, потерей зрения и поражающее преимущественно молодых мужчин. A3HJI распространена повсеместно и составляет значимую долю в структуре слепоты, особенно у лиц молодого возраста. Если такие митохондриальные заболевания, как синдромы MELAS, MERRF, NARP, выделены сравнительно недавно, то A3HJI известна со второй половины XIX века. Уже в первых описаниях было отмечено наследование по материнской линии, в начале 1970-х годов предположена связь с мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК), что подтвердилось в конце 1980-х годов: A3HJ1 стала первой нозологической формой, при которой была обнаружена патогенная точковая мутации мтДНК (Wallace et al, 1988). В последующем была установлена связь подавляющего большинства случаев с тремя первичными мутациями мтДНК (Gl 1778A, G3460A, Т14484С), появилась возможность ДНК-диагностики. При A3HJI она является единственным надежным диагностическим методом, поскольку в отличие от ряда других митохондриальных болезней A3IIJI не имеет патоморфологических и биохимических методов диагностики, а клиническая картина характерна, но неспецифична и требует дифференциальной диагностики с рядом неврологических и офтальмологических болезней, особенно в несемейных случаях. Практическое значение молекулярно-генетических исследований A3HJI обусловлено ее достаточно высокой распространенностью (не менее 3 — 4 случаев на 100 тыс. чел.), тяжестью (практически все больные — инвалиды I группы по зрению) и отсутствием эффективного лечения.

Наряду с общими признаками, характерными для митохондриальной патологии (цитоплазматический тип наследования, связь с мутациями генов мтДНК, поражение органа зрения), A3HJ1 имеет ряд отличий: помимо отсутствия биохимических и патоморфологических маркеров это выраженная неравномерность поражения полов и моносистемность поражения в большинстве случаев. Хотя причина большинства случаев A3HJI установлена, многие проблемы ее генетики и патогенеза требуют дальнейшего изучения: причины ограниченной пенетрантности первичных мутаций, особенно у женщин; зависимость различных характеристик болезни от вида первичной мутации; этиология случаев без известных первичных

мутаций; феномен гетероплазмии; роль так называемых «вторичных» мутаций мтДНК; влияние внешних провоцирующих факторов и др. Эти проблемы усугубляют сложность медико-генетического консультирования. Их изучение важно не только с точки зрения самой болезни. АЗНЛ является информативной моделью в исследованиях митохондриальной патологии в целом и патофизиологических механизмов поражения глазного нерва, с этими исследованиями связывают разработку новых подходов к лечению.

Таким образом, клинико-молекулярно-генетические исследования АЗНЛ имеют теоретическую важность и практическое значение. Молекулярно-генетическое изучение АЗНЛ в России в последние годы проводится учеными из Новосибирска и США на материале сибирских семей (Володько и соавт. 2006; гЬас1апоу й а1., 2006; 211ас1апоу е1 а1., 2005). Комплексные исследования, включающие молекулярно-генетический и клинико-генеалогический анализ АЗНЛ в российских семьях из разных регионов, раньше не проводились.

Целью настоящей работы является молекулярно-генетический и клинико-генеалогический анализ АЗНЛ у российских больных и разработка протокола диагностики этого заболевания.

В соответствии с этой целью решали следующие задачи:

1. определение спектра приводящих к АЗНЛ первичных мутаций мтДНК в выборке российских семей;

2. определение частоты основных вторичных мутаций мтДНК в этих семьях;

3. провести анализ генеалогических характеристик и факторов, влияющих на пенетрантность первичных мутаций

4. провести анализ основных клинических характеристик АЗНЛ, а также частоты и спектра сопутствующих внеглазных проявлений.

Научная новизна результатов

Впервые на репрезентативной многонациональной выборке российских семей установлено соотношение трех первичных мутаций мтДНК, приводящих к АЗНЛ, определены частота и спектр основных вторичных мутаций, доля случаев с гетероплазмией. Доказана возможность развития болезни при низком содержании мутантной мтДНК (40% в клетках крови) при наличии внешнего провоцирующего фактора (прием нейротоксичного препарата). Определены частота и спектр сопутствующих неврологических симптомов при АЗНЛ. В семье с первичной мутацией Т14484С обнаружена ранее не описанная мутация в гене АТФ-азы-6,

модифицирующая клиническую картину; впервые при данной мутации описано сочетание АЗНЛ с сахарным диабетом типа I.

Практическая значимость результатов

Определен спектр клинических симптомов, особенности течения, возраст манифестации заболевания, которые могут помочь практикующим врачам-генетикам, невропатологам и офтальмологам заподозрить данное заболевание.

Разработан оптимизированный протокол диагностики АЗНЛ на основании клинических и молекулярно-генетических данных, позволяющий проводить дифференциальную диагностику между АЗНЛ и другими заболеваниями, сопровождающимися поражением зрительных нервов. Это позволяет избежать применения необоснованного лечения гормональными препаратами, а также хирургического вмешательства.

Положения, выносимые на защиту.

1. Относительные частоты встречаемости и спектр мутаций мтДНК у больных АЗНЛ из различных регионов России сходны с таковыми в различных популяциях мира, существенно преобладает мутация 011778А, второй по частоте является мутация 03460А, наиболее редкой — мутация Т14484С.

2. У российских больных АЗНЛ первичным мутациям сопутствуют вторичные мутации мтДНК Т4216С, С13708А, 015257А и 015812А в разных сочетаниях.

3. Обнаружена новая мутация в гене АТФазы 6, которая в сочетании с первичной мутацией Т14484С, возможно, модифицирует клинический фенотип. Выявлена возможность манифестации заболевания при небольшом содержании мутантной мтДНК в клетках крови.

4. Выявленная неполная пенетрантность первичных мутаций, преимущественно определяется полом. Зависимость пенетрантности от пола определяет значительное преобладание мужчин среди больных. Показаны достоверные различия в возрасте начала заболевания у мужчин и женщин.

5. Начальный период болезни типичен и сходен вне зависимости от пола, возраста больных и первичной мутации. В хронической стадии болезни у 14,6% обследованных больных отмечено частичное восстановление зрения (мутации 011778А, С3460А, Т14484С).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая история генетических исследований A3HJI

Атрофия зрительных нервов Лебера (АЗНЛ) получило название по имени немецкого офтальмолога Теодора Лебера (Theodore Leber, 1840-1917), который в 1871 году в своей работе описал четыре семьи с атрофией зрительных нервов, манифестировавшей во взрослом возрасте. Две из этих четырех семей имели четкие признаки наследственной природы заболевания. Также Лебер отметил, что мужчины болеют чаще, чем женщины. У некоторых пациентов наблюдались приступы тахикардии. В дальнейшем большое количество родословных с этим заболеванием были описаны исследователями из стран Европы, Северной Америки, Азии и Австралии. Ранние исследования фокусировались главным образом на выяснении типа наследования заболевания. Озадачивали особенности передачи заболевания: исключительное наследование по материнской линии и превалирующее поражение лиц мужского пола. Imai и Moriwaki (1936) в своем исследовании предположили, что болезнь передается через цитоплазму. Это же предположение вновь сделал Rönne (Ronne H., 1944, 1945). Предполагали Х-сцепленное рецессивное наследование (Эфроимсон, 1964; Fraser, 1970; Truelle et al., 1975), АД наследование с неполной пенетрантностью, особенно низкой у женщин (Lundsgaard, 1944). Wallace в 1970 описал большую австралийскую родословную, в которой амавроз и неврологическое заболевание наследовались по материнской линии, и предположил, что заболевание переносилось цитоплазматическим вирусом. Эти и схожие исследования были обобщены Erikson (1972), который сделал вывод, что АЗНЛ имеет материнский тип наследования.

В начале 1980-х годов Giles et al., Case и Wallace доказали, что мтДНК человека наследуется по материнской линии, и предположили, что заболевания, имеющие материнский тип наследования имеют в своей основе мутации мтДНК (Giles et al, 1980; Case and Wallace, 1981). Материнский тип наследования АЗНЛ в дальнейшем был документирован Nikoskelainen et al. (1984, 1987), она в своих работах подчеркивала возможную митохондриальную этиологию заболевания. Эта гипотеза была подтверждена Wallace et al. (1988). Они продемонстрировали, что большинство родословных с АЗНЛ имеют одну и ту же мутацию мтДНК — G11778A в гене ND4. Вскоре были обнаружены еще две мутации — G3460A и Т14484С (Brown et al.,1992; Johns et al., 1993; Mackey and Howell 1992; Huoponen et al., 1992; Majander et al., 1991; Paulus et al., 1993). Была установлена связь

подавляющего большинства случаев A3HJ1 с этими тремя мутациями мтДНК — так называемыми первичными, получила развитие практическая ДНК-диагностика.

1.2. Общая характеристика митохондриального генома

Митохондриальная ДНК (мтДНК) человека представляет собой кольцевую двух цепочечную молекулу длиной 16569 пар нуклеотидов, в которой отсутствуют интроны. мтДНК человека содержит 37 генов: 2 рРНК, 22 тРНК и 13 структурных генов, кодирующих субъединицы дыхательной цепи митохондрий. Цепи имеют асимметрическое распределение нуклеотидов G и С, причем богатая гуанином тяжелая цепь (Н) — это главная кодирующая цепь, содержащая гены рРНК, большинства мРНК и тРНК, в то время как богатая цитозином легкая цепь (L) включает лишь один структурный ген (ND6) и 8 из 22 генов тРНК. Гены рРНК и тРНК необходимы для внутримитохондриального синтеза белка. В мтДНК выделяют область приблизительно 1000 п.н., так называемую D-петлю. Эта часть молекулы мтДНК является основной регуляторной областью мтДНК. D-петля содержит два промотора мтДНК (один для Н-цепи — Рц, другой для L-цепи — Р],), 3 нетранслирующихся последовательных участка (CSBI; CSBII; CSBIII), необходимых для начала транскрипции, и терминально-ассоциативную последовательность (TAS, 16147-16172 п.н.), на которой заканчивается синтез мтДНК. В ходе эволюции мтДНК потеряла много первоначальных генов, которые мигрировали в ядро, поэтому мтДНК — это полуавтономная система, строго зависящая от ядерного генома в продукции факторов, необходимых для транскрипции, трансляции и репликации мтДНК (рис. 1).

Направление

репликации

Н-цепи

Направление репликации L-цепи >

D-петл*

7SäHKn Pl_ I2S рРНК

TASs

16S рРНК

iZ

ND4L

СОИ

СО

ЛТР6

'1К ох I

АТР8

Рисунок ¡.Функционально-генетическая карта мтДНК человека. Митохондриальный геном человека состоит из 16 569 п.н. и включает следующие элементы:

ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6 - гены, кодирующие полипептиды I комплекса дыхательной цепи; С01,С0П,С0Ш - гены, кодирующие полипептиды IV комплекса дыхательной цепи; ATPase 6,8 - гены, кодирующие полипептиды V комплекса дыхательной цепи; 16S рРНК, 12S рРНК - гены, кодирующие субъединицы рРНК; Он, Ol - области начала репликации для тяжелой и легкой цепей мтДНК соответственно; Рн, Рь - промоторы для тяжелой и легкой цепей мтДНК соответственно; Т, Е, S, L, Н, R, G, К, D, Y, С, N, А W, М, I, V, Q, F - гены, кодирующие тРНК

Репликация мтДНК

Митохондриальная ДНК имеет две области начала репликации, расположенные друг от друга на большом расстоянии. Область начала репликаци для Н-петли (Он) начинается с нуклеотида 1121 (D петля). Репликация Н-цепи мтДНК происходит против часовой стрелки и начинается с синтеза 7S ДНК. Пройдя 2/3 генома вдоль L-цепи, репликация достигает точки инициации репликации легкой цепи (Ol), расположенной в кластере из пяти генов тРНК. Синтез L-цепи инициируется специфической праймазой (Chang, Clayton 1987) и продолжается в обратном направлении вдоль матрицы Н-цепи. Двунаправленность и асинхронность — отличительные особенности процесса репликации, свойственные только митохондриальному геному (Madsen et al,1993; Doda et al,1981; Clayton, 1982).

Регуляция репликации мтДНК является ключевым элементом, который определяет наследование мтДНК и мутаций мтДНК (Clayton, 1991).

Транскрипция мтДНК

Транскрипция мтДНК начинается с двух промоторов (Рц и Рц), которые находятся в D-петле и удалены друг от друга приблизительно на 150 n.H.(Clayton et al.,1984; Hixson, Clayton, 1985; Topper, Clayton, 1990). Рц транскрибирует 12 структурных генов, 2 рРНК и 14тРНК. Pl промотор транскрибирует 8 тРНК и ND6. Синтез первичных матричных транскриптов РНК происходит в обоих направлениях. В процессе инициации транскрипции задействован транскрибирующий фактор (mtTFl), который важен и для репликации мтДНК (Shadel, Clayton, 1993). Специфическая мгРНК-полимераза, двигаясь вдоль расплетенной цепи, образует полицистронную мРНК. В дальнейшем специфическая эндонуклеаза разрезает полицистронную РНК, высвобождая рибосомальные, транспортные и матричные РНК. мРНК не копируются, но полиаденилируются (Attardi et al., 1982; Attardi, Montoya, 1983; Clayton, 1984).

Транскрипция мтДНК регулируется концентрацией АТФ: терминация транскрипции стимулируется высокими концентрациями АТФ, а при низких концентрациях происходит полная транскрипция Н-цепи. Особенности расположения участков терминации создают некоторый избыток рРНК по отношению к мРНК, поэтому считают, что терминация транскрипции играет определенную роль в регуляции экспрессии генов окислительного фосфорилирования в зависимости от потребности в митохондриальной энергии.

Трансляция мтДНК

Трансляция митохондриальных мРНК происходит на 55S рибосомах митохондрий, каждая из которых состоит из одной большой (39S) и одной малой (28S) субъединиц. Эти рибосомы содержат меньшее количество рРНК, чем бактериальные или эукариотические рибосомы, но у них больше рибосомальных белков (Hamilton, O'Brien, 1974; O'Brien et al., 1990; Mattews et ah, 1982). Трансляция инициируется путем связывания малой рибосомальной субъединицы со специфичным районом мРНК, состоящим из 40 п.н. Предполагается, что мРНК оборачивается вокруг рибосомы и таким образом ограничивает образование полисом (Liao, Spremulli, 1990; Shoffiier, Wallace, 1995).

мтДНК млекопитающих имеет уникальный, отличный от ядерного, генетический код, где UGA кодирует триптофан, AUA — метионин, AGA и AGG являются стоп-кодонами (Wallace, 1982). Поэтому, образующиеся в митохондриях мРНК, не могут быть использованы для синтеза белка в цитозоле клетки. Процесс трансляции мтДНК подчиняется модифицированному «правилу качания кодонов», в результате чего для считывания всех кодонов достаточно лишь 22 тРНК.

Физические характеристики и тип наследования мтДНК определяют несколько законов митохондриальной генетики, которые отличают ее от менделевской генетики (Andreu, DiMauro, 2003). Наиболее важные особенности генетики митохондрий следующие:

а) гетеротшзмия и пороговый эффект

Каждая соматическая клетка содержит от сотен до тысяч копий мтДНК. Количество мтДНК в клетке зависит от вида ткани или типа клетки, от уровня их метаболизма и потребности в энергии. В процессе клеточного развития молекулы мтДНК случайным образом распределяются по дочерним клеткам. В нормальных тканях все копии мтДНК одинаковы (феномен гомоплазмии). Патогенные мутации мтДНК обычно поражают некото