Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ассоциаций генетических вариантов факторов роста с формированием и клиническим течением первичной открытоугольной глаукомы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение ассоциаций генетических вариантов факторов роста с формированием и клиническим течением первичной открытоугольной глаукомы"

На правах рукописи

КИРИЛЕНКО Михаил Юрьевич

ИЗУЧЕНИЕ АССОЦИАЦИЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ ФАКТОРОВ РОСТА С ФОРМИРОВАНИЕМ И КЛИНИЧЕСКИМ ТЕЧЕНИЕМ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 ->щг;

—' I. Ч. I ^

Белгород - 2014

005558358

005558358

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Чурносов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

Зинченко Репа Абульфазовна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией генетической эпидемиологии Голубцов Виктор Иванович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет», заведующий кафедрой биологии с курсом медицинской генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный^ медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « Г » -Л-^ р"< *** года в часов

на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Автореферат разослан

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 доктор медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Глаукома - это хроническая патология глаз различной этиологии, характеризующаяся периодическим или постоянным повышением внутриглазного давления (ВГД) и сопровождающаяся прогрессирующей оптической нейропатией, которая проявляется атрофией зрительного нерва (с экскавацией) и характерными изменениями поля зрения [Sacca S.C. et al., 2009; Кански Д., 2010; Егоров Е.А., 2013]. В настоящее время по данным ВОЗ в мире около 68 млн. человек страдает глаукомой. Число ослепших вследствие глаукомы составляет 5,2 - 9,1 млн. человек, и их число неуклонно увеличивается [Quigley H., 2006; Pascolini D. et al., 2012]. Среди причин неустранимой слепоты в России глаукома занимает одно из ведущих мест, превышая среднеевропейский показатель в 1,5-2 раза [Либ-ман Е.С., 2010]. По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований за последние пять лет удельный вес глаукомы среди причин инвалидности по зрению значительно возрос с 20 до 28%, распространенность увеличилась с 0,12 до 0,62 и более на 10 тысяч населения субъекта федерации в зависимости от его особенностей и возрастной группы жителей [Либман Е.С., 2009]. При этом только половина заболевших знают о своем диагнозе и лишь четверть из них получает адекватное лечение [Quigley H., 2011]. В начальной стадии таукома протекает практически бессимптомно, данное заболевание часто выявляется на стадиях, когда изменения зрительного нерва уже необратимы [Нестеров А.П., 2008].

Первичная ~ открытоугольная глаукома (ПОУГ) - это форма глаукоматозного процесса встречающаяся наиболее часто (от 72,3 до 96,1% всех видов глауком) [Нестеров А.П., 2008]. ПОУГ является мультифакториальным заболеванием [Baneijee D. et al., 2012], в этиопатогенезе которого важная роль принадлежит факторам роста (VEGF-A, IGF-1, TGFß-1, IGFR-1), регулирующим продукцию внеклеточного матрикса, участвующим в процессах репарации, влияющим на ангиогенез, пролиферацию и апоптоз клеток [Никитин H.A. и др., 2009; Fingert J., 2011; Kirwan R. et al., 2012].

В последние годы проводятся активные исследования ПОУГ ассоциированных генов [Fuse N., 2010]. Однако, следует отметить, что большинство исследований по изучению генов предрасположенности к ПОУГ проведены за рубежом [Ray К. et al., 2009; Wolf С. et al., 2009; Fan В. et al., 2011; Fingert J., 2011; Agarwal R., 2012; Gemenetzi M. et al., 2012; Fuchshofer R. et al., 2012; Lin H. et al, 2014; McDonnell F. et al., 2014]. Единичные работы, проводимые в России, фрагментарны и посвящены оценке вовлеченности в подверженность к ПОУГ лишь генов миоцилина (MYOC), оптиневрина (ОРТЫ), цитохрома Р450 (CYP1B1), факторов некроза опухолей и их рецепторов (TNFa, TNFß, TNFR1, TNFR2) [Белоусова A.C., 2010; Бикбов М.М и др., 2010; Мотущук А.Е., 2010; Тикунова Е.В., 2014]. Исследования роли полиморфных вариантов генов факторов роста в отношении

ПОУГ в РФ до сих пор не проведены, что диктует необходимость выполнения данного исследования.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№ 511/2014).

Цель: Изучить ассоциации генетических вариантов факторов роста с формированием и клиническим течением первичной открытоугольной глаукомы.

Задачи:

1. Исследовать роль полиморфных вариантов сосудисто-эндотелиального (УЕСР-А с.-958С>Т), инсулиноподобного (ЮР-1 с.-1410Т>С), трансформирующего (ТС^/?-/ с.-1347Т>С), рецептора инсулиноподобного (ЮРЯ-1 g.991816бЗC>T) факторов роста и их комбинаций в формировании ПОУГ.

2. Проанализировать ассоциации молекулярно-генетических маркеров с клиническим течением ПОУГ.

3. Изучить связи генетических вариантов факторов роста с развитием ПОУГ в зависимости от наличия сопутствующей неинфекционной патологии глаз.

4. Установить вовлеченность генетических полиморфизмов в формирование ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

5. Разработать математическую модель прогнозирования риска развития ПОУГ на основе генетических предикторов.

Научная новизна. Впервые выявлены ассоциации генетических полиморфизмов факторов роста УЕСР-А с.-958С>Т (гб 833061), ЮР-1 с.-1410Т>С (г.ч 35767), ТС¥р-\ с.-1347Т>С (п- 1800469), ЮРЯ-1 &99181663 С>Т (гб 4965425) с развитием ПОУГ у русского населения Центрального Черноземья РФ. Установлены генетические маркеры предрасположенности к развитию ПОУГ. Впервые выявлены особенности ассоциаций генов факторов роста с риском развития ПОУГ в зависимости от возраста манифестации и стадии заболевания. Показаны различия в формировании ПОУГ у индивидуумов в зависимости от наличия сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз. Выявлена вовлеченность генов-кандидатов в предрасположенность к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением. Впервые с использованием данных о генетических полиморфизмах факторов роста разработаны модели индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ.

Научно-практическое значение. Результаты проведенного исследования дополняют представления о молекулярно-генетических факторах развития ПОУГ. Разработанные математические модели прогнозирования риска развития ПОУГ могут быть использованы в практической офтальмологии с целью формирования групп риска по развитию данного заболевания, что позволит своевременно проводить необходимые лечебно-диагностические мероприятия. Полученные в ходе

исследования результаты используются в практической деятельности врачей-офтальмологов медицинского центра микрохирургии глаза «Ковчег» и в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на IV Международной научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2013), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), Международной научно-практической конференции «Интегративные процессы в медицине и образовании-2013» (Москва, 2013), XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье» (СПб, 2013), V международной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2013), научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием «Восток-Запад» (Уфа, 2013), X научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения региональной офтальмологии» (Тамбов, 2014).

Личный вклад автора. Автор лично участвовал в выполнении всех этапов исследования: сбор современных литературных данных по изучаемой теме, определении цели и постановке задач исследования, разработке методических подходов их решения, формировании выборок больных ПОУГ и группы контроля, молекулярно-генетическом исследовании, обработке и анализе полученных результатов, подготовке публикаций, написании и оформлении рукописи, апробации проведенной работы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в числе которых 4 в журналах рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вовлеченность генетических вариантов факторов роста в формирование ПОУГ различается у индивидуумов с наличием/отсутствием сопутствующей неинфекционной патологии глаз.

2. Полиморфизмы генов факторов роста и их комбинации ассоциированы с клиническим течением ПОУГ.

3. Подверженность к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением связана с полиморфными вариантами генов факторов роста.

4. Генетические варианты по локусу VEGF-A с.-958С>Т, возраст, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень

пигментации угла передней камеры являются прогностически ценными маркерами при формировании группы риска развития ПОУГ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 136 страницах машинописного текста и содержит 23 таблицы и 15 рисунков. Библиографический указатель содержит 230 наименований, из которых 166 иностранных.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика исследуемых групп.

Объектом исследования послужила выборка из 443 человек. Из которых 252 человека составили больные ПОУГ различных стадий и 191 человек контрольной группы. Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. В группу больных включались пациенты с ранее установленным или впервые выявленным диагнозом ПОУГ, подтвержденного клиническими, инструментальными и лабораторными методами обследования. Группа контроля была сформирована из индивидуумов, не имеющих острых и хронических заболеваний глаз, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также они не имели тяжелых соматических патологий, в том числе приводящих к поражениям глаз. Обследование проводили в офтальмологическом отделении ОГБУЗ Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа и медицинском центре микрохирургии глаза «Ковчег».

Среди больных первичной открытоугольной глаукомой (252 человека), как и в группе контроля (191 человек), распределение по полу было одинаковым (больные ПОУГ: женщины - 127 (50,4%), мужчины - 125 (49,6%); контроль: женщины - 98 (51,3%), мужчины - 93 (48,7%)) (р>0,05). Средний возраст больных ПОУГ составил 70,53±8,43 лет (изменялся от 46 лет до 89 лет), в контрольной группе 69,24±10,14 лет (изменялся от 40 лет до 87 лет) (р>0,05). Распределение соматической патологии среди больных ПОУГ и в контрольной группе было одинаковым (р>0,05). Таким образом, группа больных ПОУГ не отличалась от группы контроля по полу, возрасту, национальности, месту рождения и отягощенности соматопатологией.

В исследуемой группе больных I стадия ПОУГ установлена на 66 глазах (14,67%), II стадия — на 236 глазах (52,44%), Ш стадия - на 97 глазах (21,56%), IV стадия выявлена в 51 случае (11,33%). Если на разных глазах у одного пациента определялись разные стадии ПОУГ, показатели оценивались по наибольшей стадии, второй глаз в исследование не включался [Рожко Ю.И., 2009; Аветисов С.Э. и др., 2012]. Двусторонность поражения на момент манифестации ПОУГ была выявлена у 198 пациентов (78,57%), односторонний процесс - у 54 (21,43%) (р>0,05).

Молекулярно-генетические методы.

Типирование генетических полиморфизмов факторов роста: VEGF-A С.-9580Т (rs 833061), IGF-1 с.-1410Т>С (rs 35767), TGFfl-1 с.-1347Т>С (rs 1800469), IGFR-1 g.99181663 С>Т (rs 4965425) производилось в НИЛ «Молекулярной генетики человека» НИУ «БелГУ».

Анализ генетических маркеров осуществлялся методом ПЦР синтеза ДНК, которая проводилась на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, USA) с использованием олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР фирмы «Синтол» (флюоресцентная детекция методом TaqMan).

Генетико-статистические и биометрические методы.

Формирование базы данных и статистические расчеты производились с применением программных пакетов «Statistica» версия 6.0, «Microsoft Office Excel 2007». Вычисление фенотипических и генных частот производили по стандартным методикам [Вейр Б., 1995; Животовский Л.А., 1983; Ли Ч., 1995]. С помощью критерия у} (хи-квадрат) проверяли соответствие наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из правила Харди-Вайнберга. Выявление ассоциаций генетических вариантов анализируемых локусов с формированием ПОУГ проводили с помощью таблиц сопряженности 2x2, на основе вычисления критерия ■£ (хи-квадрат) с поправкой Иетса на непрерывность. Характер ассоциаций различных аллелей и генотипов с ПОУГ оценивали при помощи показателя отношения шансов (OR) [Реброва О.Ю., 2006]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. За статистически значимый уровень принимали Pboni< 0,05.

Роль комбинаций аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов в формировании генетической предрасположенности к ПОУГ изучена с помощью программного обеспечения «APSampler\Cygwin» [Favorov A.V. et al., 2005; http: // sources, redhat. com/cygwin/]. Для валидации найденных ассоциаций использовался точный критерий Фишера (ру) и пермутационный анализ (pperm) [Царева Е.Ю., 2012; Басова P.M., 2013]. Значимыми считали различия сравниваемых частот, если pj < 0,05 и pperm < 0,005, при условии, что значения 95% CI для OR не пересекают 1.

При изучении связей молекулярно - генетических маркеров с количественными признаками, характеризующими клинические и клинико-лабораторные показатели пациентов с ПОУГ использовали методы непараметрической статистики.

С целью прогнозирования риска развития ПОУГ в работе использован метод математического моделирования (дискриминантный анализ) [Реброва О.Ю, 2006].

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование роли полиморфных вариантов факторов роста и их комбинаций в формировании ПОУГ

В результате изучения частот генотипов исследуемых полиморфизмов установлено, что для всех анализируемых локусов как в группе контроля, так

и в группе больных ПОУГ выполнялось равновесие Харди-Вайнберга (р>0,05). В настоящей работе не выявлено достоверных различий в частотах генетических вариантов полиморфных локусов факторов роста между больными ПОУГ и контролем. Это согласуется с материалами работы Sripriya S., в которой не установлено статистически значимых отличий между больными ПОУГ и группой контроля по локусу TGFp-1 с.-1347Т>С в индийской популяции [Sripriya S. et al., 2007]. В китайской популяции, наоборот, были выявлены значительные различия в распределении полиморфизма VEGF-A между контрольной группой и пациентами ПОУГ: СС гомозиготы отсутствовали в контрольной группе [Lin H. et al., 2014].

Наряду с этим наши данные, свидетельствуют о вовлеченности генетических полиморфизмов в формирование ПОУГ у индивидуумов в зависимости от наличия/отсутствия сопутствующей неинфекционной патологии глаз. Определены рисковые и протективные молекулярно-генетические варианты факторов роста и их комбинации, вовлеченные в формирование подверженности к ПОУГ.

Генетический вариант Т IGFR-1 (64,63%) и комбинации аллелей С VEGF-A, Т IGFR-1 (75,73%), С VEGF-A, Т IGF-1, Т TGFfl-1 (17,09%) и Т VEGF-A, Т IGF-1, С TGF/S-1 (29,06%) встречаются среди больных ПОУГ чаще, чем в контроле (54,47%, -/2=4,78, р=0,03, OR=l,53, 95%CU,10-2,20; 49,58%, pperm = 0,000001, OR=3,17, 95%CI 1,89-5,32; 7,02%, pperm = 0,003, OR=2,72, 95%CI 1,37-5,43 и 16,11%, pperm = 0,003, OR=2,13, 95%CI 1,26-3,61, соответственно) и являются факторами риска формирования ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей патологии глаз (OR>l,û). Наоборот, среди пациентов контрольной группы наблюдается более высокая частота генотипа СС IGFR-1 (22,18%) и сочетания Т VEGF-A и СС IGF-1 (58,54%) по сравнению с группой больных ПОУГ без сопутствующей патологии глаз (9,43%, у>7,28, p=0,01,pbonf=0,03, OR=0,36; 95%CI 0,17-0,78 и 43,70%, pperm = 0,003, OR=0,55; 95%CI 0,35-0,85) (рисунок 1).

Сочетание генетических вариантов С IGF-1 и С TGFfl-1 встречается среди больных ПОУГ с наиболыцей частотой (85,99%) по сравнению с группой контроля (72,31%, pperm=0,003, OR=2,72, 95%CI 1,25-4,42) и является фактором риска развития ПОУГ у индивидуумов с сопутствующей патологией глаз. Обращает внимание то, что комбинация из трех генетических вариантов С VEGF-A, ТС IGF-1 и С TGF/3-1 встречается среди больных ПОУГ (17,59%) в 11,3 раз чаще, чем в контроле (1,56%, pperm = 0,0002, OR=13,44, 95%CI 1,82-99,08). Данное сочетание исследуемых полиморфизмов также повышает риск развития ПОУГ у индивидуумов с сопутствующей патологией глаз. Выявлена более низкая частота генотипа ТТ TGFfi-1 (9,49%) у пациентов ПОУГ по сравнению с группой контроля (21,54%, х2=6,52, р=0,01,рьоп(=0,03, OR=0,38; 95%CI 0,18-0,82) (рисунок 2).

Таким образом, следует отметить различия в вовлеченности генетических полиморфизмов факторов роста в формирование ПОУГ у

^ХЧ-— Л--?-?

<Ж=3.17

С УЕвР-А N_

С -N ТТСРР-1 |(Ж=2,72 ]

ТЮР-1

С Тврр-1

Т ШвР-Л

¡СЖ=2ЛЗ |

о

%

Ч -

8

=-== £

Ё I §

о о

I |

^ I «

>> В а

С § §

- " |

а 2 3

£ «в §

£

№ В

3 5

я 3

к г

<Ж=0.36

[<Ж=0,55

ССЮРЯ!

СС ЮР-1

Т УЕвР-А

Рис. 1. Генетические факторы формирования ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей неинфекционной патологии глаз

Рис. 2. Ассоциации генетических вариантов факторов роста с развитием ПОУГ у индивидуумов с сопутствующей неинфекционной патологией глаз

индивидуумов в зависимости от наличия или отсутствия сопутствующей неинфекционной патологии глаз. Подверженность к ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей неинфекционной патологии связана с 4 комбинациями генетических маркеров и 2 «моноэффектами» генетических полиморфизмов (4 из которых являются факторами риска и 2 комбинации оказывают протективное влияние). Тогда, как предрасположенность к формированию ПОУГ у индивидуумов с сопутствующей неинфекционной патологией глаз определяют 2 комбинации генетических вариантов и 1 «моноэффект» генетического полиморфизма (2 из них являются факторами риска и 1 -протективным фактором). Выявленная нами вовлеченность генетических полиморфизмов факторов роста в формирование ПОУГ согласуется с литературными данными по этому вопросу. Известно, что при ПОУГ потеря нейротрофических влияний на аксоны зрительного нерва обусловлена атрофией глии. Избыточный синтез ГС/7/?-7 совместно с другими факторами роста (ЮР-1, ЮРЯ-1, УЕОР-А) приводит к тому, что активированная глия оказывает повреждающее, а не защитное действие на зрительный нерв и сетчатку, обуславливая развитие глаукомной оптической нейропатии [5сЫо12ег-8сЬгеЬаг(11 и. е1 а1., 2001; ЗсИиейаиГ Е е1 а1., 2005; Ктоап Я. е1 а1. 2005; Курышева Н.И., 2006; РисЬвИоГег Я. й а1„ 2012].

2. Анализ ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с клиническим течением ПОУГ

Проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов роста в формирование определенных стадий заболевания. Установлено, что комбинации из трех генетических вариантов Т ЮР-1, С ТвРр-1, Т ЮР 11-1 и Т ЮР-1, С ТСР/3-1, ТТ ЮРЯ-1 встречаются среди больных I стадией ПОУГ (38,89% и 20,37%, соответственно) в 2-4 раз чаще, чем среди контрольной группы (18,84%, ррегт=0,002 и 5,07%, ррегт=0,002, соответственно). При наличии этих сочетаний полиморфных маркеров риск развития I стадии ПОУГ повышен (ОЯ=2,74, 95% С1 1,46-5,12 и 011=4,78, 95% С1 2,04-11,23 соответственно). Аналогичной направленности различия зарегистрированы и по комбинации из двух генетических вариантов - Т ЮР- / с С ТОР[1-1. Данная комбинация среди больных I стадией ПОУГ (39,06%) встречается чаще по сравнению с контролем (22,78%, р;)егт=0,004, 011=2,17). Сочетания генетических маркеров, распространенность которых выще в контрольной группе (54,80% и 72,88%), в сравнении с больными I стадией ПОУГ (37,50% и 57,81%), включают следующие комбинации генетических вариантов: Т УЕОР-А с СС ЮР-1 и Т УЕСР-А с С ЮР-1. Данные сочетания снижают риск развития I стадии заболевания (011=0,49, ррег„=0,004, 95% С1 0,28-0,85 и 011=0,50, ррегт=0,004, 95% С10,29-0,88) (рисунок 3).

Подверженность к развитию II стадии ПОУГ связана с аллелем Т ЮРЯ-1 (Х2=4,25, р=0,04, 011=1,39; 95%С1 1,02-1,90). Сочетание аллелей С УЕвР-А и Т ЮРЯ-1 встречается среди больных ПОУГ (74,05%) в 1,4 чаще, чем в контроле (52,60%, ррегт=0,00001). Также среди больных II стадией ПОУГ

зарегистрирована наибольшая частота сочетания трех генетических маркеров С VEGF-A, TIGF-1, Т TGF/]-l (17,57%) по сравнению с контролем (7,84%, /V-m=0,0006). Данные комбинации полиморфных вариантов генов факторов роста являются факторами риска развития II стадии ПОУГ (OR=2,57, 95% CI 1,72-3,83 и OR=2,50, 95% CI 1,46-4,30, соответственно) (рисунок 4).

Обращают на себя внимание выявленные различия в вовлеченности генетических вариантов факторов роста в формирование I и II стадии ПОУГ. Подверженность к формированию I стадии ПОУГ связана с 5 комбинациями генетических маркеров (в составе которых 3 комбинации генетических полиморфизмов являются факторами риска развития I стадии ПОУГ и 2 комбинации генетических маркеров оказывают протективное действие). Тогда как в формирование II стадии ПОУГ вовлечены 2 комбинации генетических вариантов факторов роста и 1 «моноэффект» генетического полиморфизма. Все выявленные генетические маркеры являются факторами риска развития II стадии ПОУГ. Полученные данные согласуются с результатами работы Тикуновой Е.В., в которой также были выявлены различия в формировании подверженности к ПОУГ определенных стадий по генам факторов некроза опухолей и их рецепторов [Тикуновой Е.В., 2014].

ПОУГ является возраст-ассоциированным заболеванием, проявляясь в большинстве случаев после 65 лет [Кански Д., 2010]. Установлено, что возраст возникновения ПОУГ в исследуемой выборке составил 70 лет (Me) (нижний квартиль Q25=62 года, верхний квартиль Q75=74 лет). Выявлены ассоциации возраста манифестации заболевания с генетическим полиморфизмом VEGF-A с.-958С>Т. Индивидуумы с генетическими вариантами 7Т VEGF-A и СТ VEGF-A имели более позднее возникновение ПОУГ (Ме = 70 лет, Q25 - 63 лет, Q75 - 75 лет) по сравнению с индивидуумами с генотипом СС VEGF-A (Ме = 66 лет, Q25 - 60 лет, Q75 -73 лет) (р=0,04) (рисунок 5). Таким образом, генотип СС VEGF-A (rs 833061) является генетическим маркером ранней манифестации ПОУГ.

Одними из значимых факторов характеризующих развитие и прогрессирование ПОУГ являются показатели гидродинамики глаз (истинное ВГД (Р0, мм рт. ст.), коэффициент легкости оттока ВГЖ (С, мм3/мин./мм рт. ст.)) [Егоров Е.А., 2008]. Установлено, что индивидуумы с генотипом СС и ТС по локусу IGF-1 имели более высокое значение истинного ВГД (Ме = 22,3 мм рт. ст., Q25=18,4, Q75=24,9) и соответственно более низкий показатель коэффициента легкости оттока ВПК (Ме = 0,15 мм3/мин./мм рт. ст., Q25=0,ll, Q75=0,23) в сравнении с индивидуумами с генотипом ТТ IGF-1, у которых Р„ (Мс = 19,7 мм рт. ст., Q25=16,7, Q75=21,7, р=0,04) и С (Ме = 0,20 мм3/мин./мм рт. ст., Q25=0,16, Q75=0,25, р=0,02) были ниже (рисунок 6).

Таким образом, у индивидуумов с генотипами СС и ТС IGF-1 зарегистрированы более высокие значения истинного ВГД и низкие показатели коэффициента легкости оттока ВГЖ, что может служить генетическим маркером неблагоприятного течения глаукоматозного процесса.

11

Рис. 3. Вовлеченность генетических вариантов факторов роста в формирование I стадии ПОУГ

Рис. 4. Ассоциации полиморфных вариантов факторов роста с развитием II стадии ПОУГ

6 *ч

о

i #

TT л CT VEGF-A; <X VE6F-A

Median

25%-75%

Min-Max

Рис. 5. Возраст манифестации заболевания у больных ПОУГ в зависимости от генетических вариантов полиморфизма VEGF-A С.-9580Т(rs 833061)

Согласно результатам работы Tsai F. et al. (2003) у населения Китая IGF-2 может выступать в качестве генетического маркера ПОУГ. Генотип СС полиморфного участка гена IGF-2 ассоциирован с высоким ВГД и выраженной ишемией, что влияет на процесс апоптоза зрительного нерва.

3. Исследование вовлеченности генетических полиморфизмов в формирование ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением

Повышенное ВГД является одним из ведущих факторов риска прогрессирования ГОН [Куроедов A.B. и др., 2008; Jonas J., 2014]. Медикаментозное лечение различными комбинациями гипотензивных препаратов не всегда способно удерживать ВГД на уровне толерантного [Егоров Е.А., 2013]. Установлена более высокая концентрация аллеля T1GFR-1 (63,06%) у больных ПОУГ по сравнению с группой контроля, где анализируемый показатель составил 56,02% (х2=4,47, р=0,03, OR=l,34; 95% CI 1,02-1,76). Концентрация сочетания генетических вариантов С VEGF-A и Т IGFR-1 среди больных ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (67,82%) выше, чем среди контрольной группы (52,60%, pperm = 0,0003). Данное сочетание аллелей исследуемых полиморфизмов повышает риск развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (OR=1,90, 95%С1 1,29-2,80). Литературные данные по этому вопросу, свидетельствуют, что в водянистой влаге пациентов ПОУГ уровень IGF-1 и IGFR-1 повышен [Zilfyan А., 2013]. По данным ряда работ их высокие

□ Median I I 25%-75% I Min-Max

Рис. 6. Показатель истинного ВГД (Р0) у больных ПОУГ в зависимости от генетических вариантов локуса IGF-1 с.-1410Т>С (rs

35767)

концентрации связаны с нарушенной дренажной функцией трабекулярной сети, что обусловливает увеличение ВГД [Tripathi В. et al., 2004; Ко J. et al., 2009]. В результате других исследований было определено, что уровень VEGF-A увеличен в плазме крови и во внутриглазной жидкости пациентов с глаукомой по сравнению с контрольной группой [Lip P. et al., 2002; Ни D. et al., 2002; Ergorul С. et al, 2008].

4. Прогнозирование риска развития ПОУГ с использованием генетических данных

С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогноза риска развития ПОУГ на основании исследованных полиморфных вариантов генов факторов роста и других возможных факторов риска с целью выявления индивидуумов, предрасположенных к глаукоме. Для решения этой задачи нами использован метод многомерной статистики — линейный дискриминантный анализ (ЛДФ) [Реброва О.Ю., 2006].

Согласно разработанной модели прогностически значимыми факторами развития ПОУГ являются возраст (х0, уровень систолического и диастолического артериального давления (САД - х2, ДАД - х3), отягощенный семейный анамнез (х4), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (х5), микрососудистых изменений в конъюнктиве (х6), степень пигментации угла передней камеры (х7), генетический вариант по

14

во ■

Ь Ё.

| 40

¡5 30

ш

г __._|

щ 1

U

* 10 --...........—......................................—.......

о - --

-10 -'-1-1-

1 2

TTK3F-1: TChCCIGF-I

локусу УЕСЕ-А с.-958С>Т (х8) (таблица 1). С помощью полученных коэффициентов диекриминантной функции, на основе значений конкретных показателей у индивидуумов можно определить их вероятностную принадлежность к группе больных ПОУГ или к группе контроля. Точность распознания индивидуумов относящихся к группе больных ПОУГ составляет 91,70%, а к группе контроля - 91,06%. Для валидизации модели в уравнения ЛДФ подставляются значения соответствующих показателей у конкретного индивидуума и высчитываются новые признаки - Б. Индивидуумы включаются в ту группу (больные или контроль), для которой полученный признак Б будет наибольшим [Боровиков В.П., 2001].

Таблица 1

Параметры линейных дискриминантных функций

для пациентов ПОУГ и контрольной группы_

Признаки Больные ПОУГ Группа контроля

1. Возраст (лет) 1,175 1,089

2. САД (мм рт. ст.) 0,383 0,308

3. ДАД (мм рт. ст.) 0,892 0,953

4. Отягощенный семейный анамнез (нет-0; есть-1) 5,434 3,483

5. Наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (нет-0; есть-1) 2,742 0,243

6. Микрососудистые изменения в конъюнктиве (нет-0; есть-1) -14,578 -11,515

7. Степень пигментации угла передней камеры (нет-0; I степень-1; II степень-2; III степень-3; IV степень-4) -0,391 -2,607

8. Генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958С>Т(ТТ+СТ-1; СС-2) 8,193 7,026

Константа -110,685 -94,672

Например, у индивидуума А. определены следующие показатели: возраст - 71 год, уровень систолического артериального давления - 130 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 80 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - есть (1), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве - есть (1), III степень пигментации угла передней камеры (3), генетический вариант по локусу УЕСЕ-А - СС (2).

Б (больные ПОУГ) = -110,685 + 1,175*71 + 0,383*130 + 0,892*80 + 5,434*1 + 2,742*1 - 14,578*1 - 0,391*3+8,193*2= 102,7

Б (группа контроля) = -94,672 + 1,089*71 + 0,308*130 + 0,953*80 + 3,483*1 + 0,243*1 -11,515*1-2,607*3 + 7,026*2= 97,4

Наибольшее значение нового признака Б для этого индивидуума получено при расчётах в уравнении ЛДФ для больных ПОУГ, что позволяет включить данного пациента в эту группу. Дальнейшее наблюдение и

детальное клинико-ннструментальное обследование этого индивидуума выявило у него ПОУГ.

На следующем этапе работы построена статистическая модель прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, включающая следующие предикторы: возраст (хД наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (х2), микрососудистых изменений в конъюнктиве (хз), степень пигментации угла передней камеры (хД наличие псевдоэксфолиативного синдрома (ПЭС) (х5), генетический вариант, по локусу ,VEGF-A с.-958С>Т (хД В данном случае, исследуемые нами группы по набору из шести изученных признаков демонстрируют неслучайную межгрупповую вариацию. Полученные значения критериев Уилкса, F-критериев, вероятности Р и показателей толерантности исключают мультиколлениарность признаков (р<0,05, Т<0,10) [Дерябин В.Е., 2001]. Для пациентов ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и контрольной группы получены следующие уравнения ЛДФ:

- для включения в группу больных ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением:

D = -41,126 + 0,994*х,+ 0,654*х2 - 9,637*х3 + 1,471*х4 + 1,869*х5 + 8,208*х6

- для включения в контрольную группу:

D = -30,164+ 0,910*Xi -1 ,009*х2 - 6,575*х3 - 1,561 *Х4 + 0,511 *х5 + 7,094*х6

Выявление пациентов группы риска неблагоприятного течение ПОУГ, у которых даже максимальная комбинация гипотензивных препаратов не позволяет достичь «давления цели» (толерантного ВГД), требует более частого диагностического контроля и раннего оперативного антиглаукоматозного лечения, вследствие высокого риска прогрессирования заболевания.

Выводы

1. Генетические варианты сосудисто-эндотелиального (VEGF-A с.-958С>Т, rs 833061), инсулиноподобного (1GF-1 с.-1410Т>С, rs 35767), трансформирующего (TGFfi-1 с.-1347Т>С, rs 1800469), рецептора инсулиноподобного (IGFR-1 g.99181663C>T, rs 4965425) факторов роста и их комбинации ассоциированы с развитием и клиническим течением ПОУГ.

2. Генетический вариант ТIGFR-1 (OR=l,55) и комбинации аллелей С VEGF-A с TIGFR-1 (OR=3,17), С VEGF-A, ТIGF-1, Т TGFfi-1 (OR=2,72), Т VEGF-A, Т IGF-1, С TGF[1-1 (OR=2,13) являются факторами риска, а генотип СС IGFR-1 (OR=0,36) и сочетание Т VEGF-A с СС IGF-1 (OR=0,55) оказывают протективное влияние на формирование ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей патологии глаз. Сочетание генетических вариантов С IGF-1 с С TGFfl-1 (OR=2,72) и С VEGF-A, ТС IGF-1, С TGFfi-1 (OR=13,44) является фактором риска развития ПОУГ, а генотип 7Т TGFfi-1 снижает риск развития ПОУГ (OR=0,38) у индивидуумов с сопутствующей патологией глаз.

3. Развитие I стадии ПОУГ ассоциировано с комбинациями генетических вариантов TIGF-1, С TGFfi-1, TIGFR-1 (OR=2,74), ТIGF-1, С TGFfi-1, ТТIGFR-1 (OR=4,78), TIGF-1 с С TGFfi-1 (OR=2,17). Снижают риск развития I стадии заболевания сочетания генетических маркеров Т VEGF-A с

16

СС ЮР-1 (011=0,49) и Т УЕСР-А с С ЮР-1 (011=0,50). Подверженность к развитию II стадии ПОУГ связана с аллелем Т ЮРЯ-1 (СЖ=1,39) и комбинациями генетических вариантов С УЕСР-А с Т ЮРЯ-1 (СЖ=2,57), С УЕвР-А, ТЮР-1, ТТврр-1 (СЖ=2,50).

4. Генетическим маркером ранней манифестации ПОУГ является генотип СС УЕСР-А. Индивидуумы с генотипами ТС и СС ЮР-1 имеют более высокие значения истинного внутриглазного давления и низкие показатели коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости, по сравнению с пациентами с генетическим вариантом ТТЮР-1.

5. Сочетание генетических вариантов С УЕОР-А с Т ЮРЯ-1 (011=1,90) и аллель Т 1СРЯ-1 (011=1,34) повышают риск развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением. Прогностически значимыми факторами развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением являются генетический маркер УЕСР-А с.-958С>Т, возраст, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры, наличие псевдоэксфолиативного синдрома.

6. Прогностически значимыми факторами развития ПОУГ являются генетический полиморфизм УЕСР-А с.-958С>Т, возраст, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры.

Практические рекомендации

1. С целью индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ использовать уравнения линейных дискриминантных функций, включающие в себя следующие признаки: генетический полиморфизм УЕСР-А с.-958С>Т, возраст, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры.

2. Для прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением рекомендовано использовать модель, включающую следующие факторы: генетический маркер УЕСР-А с.-958С>Т, возраст, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры, наличие псевдоэксфолиативного синдрома.

3. При комплексном диагностическом обследовании больных ПОУГ рекомендуется использовать в качестве маркеров неблагоприятного течения глаукоматозного процесса генетические варианты ТС и СС ЮР-1 ассоциированные с более высокими значениями истинного внутриглазного давления и низкими показателями коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости.

Список сокращений

IGF инсулиноподобный фактор роста

IGFR рецептор инсулиноподобного фактора роста

TGFß трансформирующий фактор роста

VEGF сосудисто-эндотелиальный фактор роста

вгд внутриглазное давление

ЛДФ линейная дискриминантная функция

ПОУГ первичная открытоугольная глаукома

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Тнкунова, Е.В. Роль генетических факторов в формировании клинических особенностей первичной открытоугольной глаукомы у пациентов Центрального Черноземья России / Е.В. Тикунова, М.Ю. Кириленко // Клинические и теоретические аспекты современной медицины: материалы IV международной научной конференции, Москва, 18-21 апр. 2012 г. / РУДН, Ун-т Семмелвейс, Будапешт, Венгрия — Москва,

2012.-С. 64.

2. Тикунова, Е.В. Клинические и медико-биологические характеристики больных первичной открытоугольной глаукомы / Е.В. Тикунова, М.Ю. Кириленко // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2012. - Т. 3, № 1-2. - С. 74.

3. Тикунова, Е.В. Анализ клинических особенностей первичной открытоугольной глаукомы / Е.В. Тикунова, М.Ю. Кириленко // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: сб. тр. X науч.-практ. конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последипломн. мед. образования; редкол.: Ю.А. Хощенко [и др.]. - Белгород, 2012. - С. 101-102.

4. Кириленко, М.Ю. Клинические особенности глаукомы и роль наследственных факторов в ее формировании / М.Ю. Кириленко, Е.В. Тикунова // Материалы VII Международной научная конференции молодых ученых-медиков, Курск, 1-2 марта 2013 г. / Курск, гос. мед. ун-т, Воронеж, гос. мед. акад. им. H.H. Бурденко, Казан, гос. мед. акад. [и др.]. -Курск, 2013.-Т. 1.-С. 555-559.

5. Кириленко, М.Ю. Некоторые результаты клинико-генетического исследования больных первичной открытоугольной глаукомой / М.Ю. Кириленко, Е.В. Тикунова, Д.Г. Воронина // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2013. - Специальный выпуск № 1. - С. 251-252.

6. Кириленко, М.Ю. Офтальмологические и генетические особенности прооперированных по поводу глаукомы пациентов / М.Ю. Кириленко, Е.В. Тикунова // Восток-Запад: сборник научных трудов научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием, Уфа, 6-7 июня 2013 г. / Уфим. научн.-исслед. ин-т глазных болезней АН Респ. Башкортостан»; под ред. проф. М.М. Бикбова. — Уфа,

2013.-С. 185-187.

7. Воронина, Д.Г. Популяционно-генетический анализ полиморфизма гена эндотелиального фактора роста VEGF-A (-460Т/С; rs 833061) среди

населения Центрального Черноземья / Д.Г. Воронина, М.Ю. Кириленко, М.С. Сергеева // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье. - СПб, 2013. - С. 90. - (материалы XVI всерос. медико-биологической конференции молодых исследователей с международным участием, СПб, 20 апреля 2013 г.).

8. Кириленко, М.Ю. Изучение генетических вариантов сосудистого эндотелиального фактора роста (-460Т/С VEGF-A) у больных глаукомой / Кириленко М.Ю. // Интегративные процессы в медицине и образовании-2013: материалы международной научно-практической конференции. -Москва, 2013.-С. 3-6.

9. Кириленко, М.Ю. Связь полиморфизма -509С/Т гена трансформирующего фактора роста с формированием первичной открытоугольной глаукомы / Кириленко М.Ю. // Материалы пятой международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» / КГМУ, Центр.-Чернозем. научн. Центр РАМН, Общерос. общест. организ. «Рос. союз молодых ученых» / Под ред. проф. В.А. Лазаренко, проф. П.В. Калуцкого. - Курск, 2013. - С. 95-99.

Ю.Кириленко, М.Ю. Вовлеченность полиморфизма гена инсулиноподобного фактора роста -G1245A IGF-1 в развитие первичной открытоугольной глаукомы / Кириленко М.Ю. // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация». - 2013. - № 25 (168), выпуск 24. - С. 170-173.

П.Кириленко, М.Ю. Исследование полиморфизмов генов факторов роста с развитием первичной открытоугольной глаукомы / Кириленко М.Ю. // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 12, (2). - С. 222-225.

12. Кириленко, М.Ю. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров факторов роста с первичной открытоугольной глаукомой / Кириленко М.Ю., Воронина Д.Г., Тикунова Е.В., Чурносов М.И. // Генетика человека и патология. Проблемы эволюционной медицины: сб. науч. трудов / под ред. В.А. Степанова. - Томск, 2014. - Вып. 10. - С. 177-178. - (Материалы X научной конференции НИИ медицинской генетики СО РАМН, Томск, 15-17 октября 2014 г.)

13. Кириленко, М.Ю. Генетические исследования первичной открытоугольной глаукомы / Кириленко М.Ю., Чурносов М.И. // Вестник Тамбовского государственного университета имени Г.Р. Державина. - 2014. -Т. 19, №4.-С. 1140-1142.

Подписано в печать 22.12.2014. Формат 60*84/16 Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 341. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ». 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85