Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в развитии первичной открытоугольной глаукомы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в развитии первичной открытоугольной глаукомы"

ТИКУНОВА Евгения Викторовна

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В РАЗВИТИИ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

25 СЕН 2014

Белгород -2014

005552781

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Чурносов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

Петрин Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Назаренко Людмила Павловна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ медицинской генетики» СО РАМН, заведующая лабораторией наследственной патологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13, доктор биологических наук

Кочкаров В.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатологии, имеющая большое медико-социальное значение ввиду высокой распространенности, постоянного роста заболеваемости и тяжести исходов заболевания, ведущего к слепоте и инвалидности. По данным ВОЗ, число больных глаукомой в мире превысило 100 млн человек. В России в 2011 году общее количество больных глаукомой составило более 1,1 млн, а уровень заболеваемости с 2005 по 2011 г. вырос с 1,021 до 1,091 на 1 тысячу взрослого населения [http://www.mednet.ru]. Среди клинических форм заболевания наиболее распространенной является первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), на долю которой приходится от 72,3 до 96,1% всех форм глауком [Егоров Е.А., 2013]. ПОУГ - мультифакториальное заболевание глаз, характеризующееся повышением внутриглазного давления за пределы толерантного для зрительного нерва уровня, глаукомной оптической нейропатией и типичным снижением зрительных функций [Нестеров А.П., 2008]. Установлено, что в возрастной группе до 59 лет распространенность ПОУГ составляет 0,88 случая на 1000 человек, от 60 до 70 - 6,44 на 1000 человек, среди лиц старше 75 лет глаукома встречается с частотой 17,3 на 1000 населения [Егоров Е.А., 2013].

Несмотря на достаточно многочисленные данные научных исследований по проблеме глаукомы, представленные в литературе [Leite М.Т. et al., 2009; Kang J.H. et al„ 2010; Mookherjee S. et al., 2012; Jonas J.B. et al., 2014], многие аспекты этиопатогенеза ПОУГ являются дискуссионными и продолжают оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных исследователей [Волков В.В., 2008; Нестеров А.П., 2008]. В настоящее время важное этиопатогенетическое значение при ПОУГ придается нарушениям в системе апоптоза [Алексеев В.Н. и др., 2005]. Одно из центральных звеньев в этом процессе занимают факторы некроза опухолей и их рецепторы [Agarwal R. et al., 2012]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [Tezel G., 2008; Fan В J. et al., 2010; Al-Dabbagh N.M. et al., 2011].

Проведенные молекулярно-генетические исследования ПОУГ выявили 4 причинных гена и 70 генов-кандидатов, ассоциированных с развитием ПОУГ [Киселева O.A. и др., 2011]. Однако следует отметить, что подавляющее число работ по исследованию роли различных генов-кандидатов в развитии ПОУГ проведены за рубежом, и при этом результаты, полученные разными группами исследователей противоречивы [Guo Y. et al., 2012; Huang W. et al., 2013; Huo Y. et al., 2013; Xin X. et al., 2013]. В Российской Федерации лишь несколько работ посвящено молекулярно-генетическим аспектам ПОУГ [Рахманов В.В., 2006; Белоусова А.И., 2010]. Роль генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании и клиническом течении ПОУГ в нашей стране изучена крайне слабо, что диктует необходимость проведения данных исследований в Российской Федерации.

Цель: Изучить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование и клиническое течение ПОУГ.

Задачи:

1. Изучить распространённость полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли а (-308G/A TNFa), лимфотоксина а (+250A/G Ltá), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36A/G TNFR1), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663A/G TNFR2) у больных ПОУГ и в контрольной группе.

2. Исследовать роль генетических вариантов цитокинов и их комбинаций в формировании ПОУГ.

3. Оценить влияние генетических полиморфизмов на возраст манифестации и клиническое течение ПОУГ.

4. Проанализировать роль генов-кандидатов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативной терапии.

5. Определить предикторы развития ПОУГ и разработать математическую модель прогноза развития данного заболевания с учетом генетических данных.

Научная новизна. Впервые установлено важное клиническое значение генетических полиморфизмов -308G/A TNFa, +250A/G Lía, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 у больных ПОУГ русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ.

Впервые установлены генетические маркеры предрасположенности к формированию ПОУГ. Выявлены молекулярно-генетические маркеры ранней манифестации заболевания и различных стадий ПОУГ. Показаны различия в подверженности к ПОУГ у индивидуумов в зависимости от сопутствующей патологии глаз. Установлена вовлеченность генов-кандидатов в формирование ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативной терапии.

Научно-практическое значение. Результаты проведенных исследований расширяют представления о молекулярно-генетических детерминантах ПОУГ. Генетический полиморфизм -308G/A TNFa может быть рекомендован для тестирования с целью выделения группы риска по формированию ПОУГ. Разработанная математическая модель прогнозирования риска развития ПОУГ, а также ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением может быть использована в практической офтальмологии с целью формирования групп риска по развитию этого заболевания.

Результаты исследования используются в практической деятельности врачей-офтальмологов ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» и в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на 5-й Юбилейной международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2012» (Белгород, 2012), VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012), 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012), 40-й Конференции молодых ученых и 64-й Студенческой научной конференции Смоленской государственной медицинской академии (с международным участием), V Съезде Межрегиональной общественной организации «Федерация представителей молодежных научных обществ медицинских вузов» (Смоленск, 2012), XIII-й научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященной 25-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2012), 66-й итоговой научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2012), X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования (Белгород, 2012), IV Международной научной конференции «Science4health 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2012), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием (Уфа, 2013), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013).

Личный вклад автора. Автор лично принимал участие в выполнении всех этапов работы: анализе сведений литературы по изучаемой проблеме, определении цели и задач исследования, разработке методических подходов для их решения, проведении клинического обследования больных ПОУГ и контрольной группы, молекулярно-генетическом исследовании образцов ДНК, обработке и обобщении полученных результатов. Соискателем написана и оформлена рукопись, проведена подготовка основных публикаций и апробация выполненной работы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетические варианты факторов некроза опухолей и их сочетания ассоциированы с развитием ПОУГ.

2. Полиморфизмы генов цитокинов влияют на возраст манифестации заболевания и клиническое течение ПОУГ.

3. Вовлеченность генетических полиморфизмов в развитие ПОУГ различается у индивидуумов в зависимости от сопутствующей патологии глаз.

4. Гены-кандидаты ассоциированы с офтальмологическими показателями у больных ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативного лечения.

5. Генетические варианты по локусу +1663А/в ТЫРЯ2, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического артериального давления, уровень диастолического артериального давления, наличие ПОУГ среди родственников, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры являются прогностически значимыми факторами развития ПОУГ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста и содержат 24 таблицы и 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 239 наименований, из которых 176 иностранных.

Материалы и методы исследования

Клиническая характеристика исследованных групп.

В соответствии с поставленными целями и задачами исследования проведен анализ результатов обследования 443 человек: 252 больных с первичной открытоугольной глаукомой и 191 человека контрольной группы.

Формирование выборок больных и контроля осуществлялись на базе отделения микрохирургии глаза Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье РФ и не связанные между собой узами родства.

2. Пациенты, добровольно согласившиеся на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы с впервые установленным или подтвержденным диагнозом глаукомы. Диагностика осуществлялась на основании стандартов по исследованию ДЗН и состоянию полей зрения с учетом данных офтальмотонометрии [Национальное руководство по глаукоме, 2011].

4. В контрольную группу, включались индивидуумы, не имеющие острых заболеваний глаз на момент обследования, а также соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз.

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом.

2. Больные, у которых глаукома сочеталась с иной глазной патологией или системным заболеванием, влияющими на состояние поля зрения.

3. Пациенты с тяжелой соматической патологией (сердечная, дыхательная, почечная недостаточность).

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Средний возраст больных ПОУГ составил 70,53±8,43 лет (варьировался

от 46 до 89), контрольной группы - 69,24±10,14 лет (варьировался от 40 до

87) (р>0,05). Среди 252 больных первичной открытоугольной глаукомой мужчин было 125 (49,6%), женщин - 127 (50,4%). В контрольной выборке распределение по полу было аналогичным: мужчины - 93 человека (48,7%), женщины - 98 (51,3%) (р>0,05). Таким образом, группа контроля не отличалась от группы больных по полу, возрасту, национальности и месту рождения. Среди 252 (450 глаз) пациентов, страдающих первичной открытоугольной глаукомой, начальная стадия выявлена в 14,67% случаев (66 глаз), развитая стадия - 52,44% (236 глаз), далекозашедшая стадия в 21,56% (97 глаз) и терминальная стадия в 11,33% случаев (51 глаз). В группе больных ПОУГ двусторонний процесс наблюдался у 198 человек (78,57%), односторонний процесс - у 54 человек (21,43%). Среди больных ПОУГ 92,46% имели различную соматопатологию, а среди группы контроля сопутствующая патология зарегистрирована у 86,91% (р>0,05).

Молекулярно-генетические методы.

Всем больным с ПОУГ и индивидуумам контрольной группы проводилось типирование следующих локусов: -308G/A TNFa, +250A/G Lta, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2.

Генотипирование молекулярно-генетических маркеров проводилось в лаборатории «Молекулярная генетика человека» медицинского института НИУ «БелГУ».

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 5-6 мл. Забор крови осуществлялся из локтевой вены пробанда в вакутейнеры с 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).

Типирование локусов -308G/A TNFa, +250G/A Lta, +36A/G TNFR1, + I663A/G TNFR2 проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе 1Q5 (Bio-Rad) в режиме real time. Использовались: ДНК-полимераза Thermus aquaticus («Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды («Синтол»). Анализ полиморфных локусов проводился методом дискриминации аллелей с использованием программы Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».

Статистические методы.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами [Вейр Б., 1995; Ли Ч., 1978]. Соответствие наблюдаемого распределения ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга оценивали с помощью %2.

Различия в концентрациях генетических вариантов между группой больных с ПОУГ и контрольной группой оценивали с помощью таблиц сопряженности 2x2 на основе критерия с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95%С1) [Реброва О.Ю., 2006]. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ПОУГ проводили с помощью программного обеспечения APSampler [Favorov A.V. et al., 2005].

При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. За статистически значимый уровень принимали рсог< 0,05.

При изучении связей молекулярно-генетических маркеров с количественными признаками, характеризующими клинические и клинико-лабораторные показатели пациентов с ПОУГ, использовали методы непараметрической статистики.

С целью прогнозирования риска развития ПОУГ в работе использованы методы математического моделирования (логистический регрессионный анализ и дискриминантный анализ) [Реброва О.Ю., 2006].

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование роли генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании ПОУГ

В результате проведенного исследования определены рисковые и протективные генетические варианты исследуемых генов-кандидатов и их комбинаций, отличающие больных с ПОУГ от контрольной группы (рис. 1). Установлено, что среди больных с ПОУГ частота аплеля -308С ТАР'а (92,11%) была наибольшая, а концентрация генотипа -308АА ТЫРа (0%) -наименьшая по сравнению с контрольной группой, где анализируемые показатели составили 86,74% (%2=6,01, р=0,01, 011=1,78 95%С1 1,12-2,85) и 3,31% ОГ=6,08, р=0,01, 011=0,01 95%С1 0,001-0,67), соответственно. Таким образом, фактором риска развития ПОУГ является аллель -308С Т.ЫРа (ОЯ=1,78), а протективным фактором по данной патологии служит генетический маркер -308АА ТМРа (011=0,01).

-3080 ГМчх

ОК=1,78

-308АА ГМч*

0^0,01

п

У

г

01^=0,09

0к=0.34

01^=0,09

-308АА ГМч*

+250в Ш

+1663АА Т№Я2

+36А ТЫРк!

Рис. 1. Вовлеченность генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование ПОУГ

Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют о вовлеченности в генетическую подверженность к ПОУГ полиморфизма -308С/А ТЫРа. Следует отметить, что литературные материалы по данному вопросу достаточно противоречивы. Так, китайские исследователи в 2010 г.

[Fan B.J. и др.] при изучении роли полиморфизма -308G/A TNFa в развитии ПОУГ выявили повышенную концентрацию аллеля G у пациентов с ПОУГ по сравнению с контрольной группой (OR=l,89, 95%С1 1,14-3,13), что согласуется с нашими результатами. Другие исследователи, наоборот, показали, что высокопродуктивный аллель -308А TNFa является фактором риска развития ПОУГ [Lin H.J. et al., 2003; Razeghinejad M.R. et al., 2009; Al-Dabbagh N.M. et al., 2011]. Наряду с этим в ряде работ не установлено значимой связи между генетическим полиморфизмом -308G/A TNFa и ПОУГ [Funayama T. et al., 2004; Mossbock G. et al., 2006].

С помощью биоинформатических подходов определены три комбинации исследуемых генетических полиморфизмов, которые ассоциированы с развитием ПОУГ. Установлено, что в группе больных ПОУГ комбинации генетических вариантов +1663АА TNFR2 с +250G Lia (5,65%); -308АА TNFa с +250G Lia (0%) и -308A A TNFa с +36А TNFR1 (0%) встречаются в 2,68-3,41 раза реже, чем среди контрольной группы (15,12%, Рсог=0,007; 3,39%, рсог=0,03 и 3,41%, рсог=0,03, соответственно). Данные сочетания полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов являются протективными факторами развития ПОУГ (0,09<OR<0,34).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важном патогенетическом значении генетических маркеров -308G/A TNFa, +250A/G Lia, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 в формировании ПОУГ. Согласно данным литературы, эти генетические полиморфизмы вовлечены в процесс апоптоза, что может играть значимую роль в развитии ПОУГ [Tezel G., 2008; Agarwal R. et al., 2012].

2. Гены-кандидаты и особенности клинического течения ПОУГ

Исследование вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование определенных стадий заболевания выявило следующее. Во-первых, достоверных различий в концентрациях аллелей и генотипов между больными с I стадией ПОУГ и контрольной группой не обнаружено.

Во-вторых, при И стадии заболевания наблюдается более высокая распространенность аллеля -308G TNFa (91,38%), чем в контроле (86,74%, Х2=5,55, р=0,02, OR=l,62, 95%С1 1,08-2,44), а частота генотипов -308АА TNFa (0%) и +1663АА TNFR2 (12,07%) статистически достоверно меньше по сравнению с группой контроля (3,31%, х2=6,26, р=0,01, pcor=0,03, OR=0,01, 95%С1 0,001-0,66 и 20,57%, х2=6,50, р=0,01, рСОг=0,03, OR=0,53, 95%С1 0,320,87, соответственно). Проведенный биоинформатический анализ показал, что развитие II стадии ПОУГ ассоциировано с комбинациями: -308G TNFa с + 1663G TNFR2 (OR=2,19), +36А TNFR1 с +1663AG TNFR2 и +250A Lta (OR= 1,65) (рис. 2).

Рис. 2. Вклад генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в генетическую предрасположенность к развитию II стадии ПОУГ

В-третьих, выявлены различия в распространенности аллеля -308G TNFa (94,1%) и генотипа -308GG TNFa (88,19%) между больными с 111-IV стадиями заболевания и контрольной выборкой: среди больных концентрации данных маркеров выше, чем в контрольной группе (86,74%, Х2=Ю,51, р=0,002, OR=2,44, 95%С1 1,39-4,32 и 76,80%, %2=1,68, р=0,007, pcor=0,02, OR=2,26, 95%С1 1,25-4,13, соответственно). При III-IV стадиях заболевания также наблюдается максимальная концентрация аллеля +250А Lta (78,13%) и генотипа +250АА Lta (61,81%), чем в контроле (69,34%, Х2=7,44, р=0,007, OR=l,58, 95%С1 1,13-2,21 и 46,96%, х2=8,50, р=0,005, pcor=0,015, OR=l,83, 95%С1 1,21-2,77, соответственно).

Следует отметить, что с увеличением степени тяжести течения ПОУГ (стадии заболевания) увеличивается концентрация генетических вариантов -308G TNFa, -308GG TNFa (рис. 3) и +250А Lta. Так, частоты молекулярно-генетических маркеров -308G TNFa и -308GG TNFa возрастают от 86,74% и 76,80%, соответственно, в контроле до 89,84% и 79,69%, соответственно, у больных с I стадией заболевания, 91,38% и 82,76% - при II стадии, и наибольшего значения они достигают у индивидуумов с 1II-IV стадиями ПОУГ - 94,1% и 88,19%, соответственно. Также концентрация генетического варианта +250А Lta увеличивается от 69,34% и 68,94% среди контроля и больных с I стадией ПОУГ до 72,01% при II стадии заболевания и 78,13% при III-IV стадиях заболевания.

контроль I стадия П стадия Ш-1У стадии

Рис. 3. Частота генотипа -308Сй ТТЧРа в группе больных с ПОУГ в зависимости от стадии заболевания и в контроле

Подверженность к развитию ПОУГ ПЫУ стадий связана с комбинациями: -308в ТЫРа с +250АА Па (011=1,87), -ШСв ТЫРа с +36А ТЫРЯ! (011=1,90), -308А ТЫРа с +36А ТЫРЯ1 и +250в ЬТа (011=0,33), -308А ТЫРа с +36А ТЫРЯ1 (011=0,34) (рис. 4).

На следующем этапе нашей работы проведено изучение распределения частот генотипов и аллелей исследуемых факторов некроза опухолей и их рецепторов среди больных ПОУГ в зависимости от наличия/отсутствия сопутствующей патологии глаз. С помощью биоинформатического анализа установлено, что среди больных с ПОУГ без сопутствующей патологии глаз частоты сочетаний +16бЗв ТЫРЯ2 с -3080 ТМРа (86,99%) и +¡663С ТЫРЯ2 с +360 ТЫРЯ! (70,25%) статистически достоверно выше по сравнению с группой контроля (76,05%,х2=5,52, р=0,008, рсог=0,03 и 58,11%, х2=4,69, р=0,01, рсог=0,04, соответственно). Эти комбинации генетических вариантов повышают риск развития ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей патологии глаз (ОЯ=2,11 и 011=1,70 соответственно).

Выявлено, что пациенты с ПОУГ с сопутствующей патологией глаз имеют более высокую частоту генетического варианта +36А ТЫРЯ! (51,72%) по сравнению с контролем с сопутствующей патологией глаз (40,36%, Х2=6,36, р=0,01, 011=1,58, 95%С1 1,10-2,27), а комбинация +36АА ТЫРЮ с + 166ЗА ТЫРЯ2 встречается среди больных с ПОУГ (17,30%) в 4,55 раз чаще, чем в контроле (3,80%, х2=8,19, р=0,0008, рсог=0,005). Наряду с этим зарегистрированы различия в распространенности сочетания +36АА ТЫРЯ! с

Рис. 4. Вклад генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в генетическую предрасположенность к развитию III-IV стадий Г10УГ

+250G Lta между больными с ПОУГ (11,56%) и контролем (2,60%, х2=4,67, р=0,009, рсог=0,05). Данные комбинации являются факторами риска формирования ПОУГ при сопутствующей патологии глаз (OR=5,30 и OR=4,90 соответственно). Наоборот, среди пациентов контрольной группы наблюдаются более высокие частоты сочетаний +36G TNFR1 с +250А LTa (81,82%) и +36G TNFR1 с -308G TNFa (85,54%) по сравнению с группой с ПОУГ (66,88%, х2=5,88, р=0,006, рсог=0,02 и 72,87%, %2=5,05, р=0,01, Рсог=0,04, соответственно). Эти комбинации оказывают протективное влияние на формирование ПОУГ при сопутствующей патологии глаз (OR=0,45).

Изучены ассоциации генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов с возрастом манифестации заболевания. Установлено, что индивидуумы с генотипом -308GG TNFa имели более раннее возникновение ПОУГ (Ме - 68 лет, Q25 - 62 лет, Q75 - 74 лет) по сравнению с пациентами с генотипом -308GA TNFa (Ме - 70 лет, Q25 - 62 лет, Q75 - 73 лет, р=0,045). Также установлено, что в группе больных без наследственной отягощенное™ индивидуумы с генотипами +36GG TNFR1 и +36AG TNFR1 имели более ранний возраст манифестации заболевания (Ме -70 лет, Q25 - 63 лет, Q75 - 74 лет) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипом +36АА TNFR1 (Мс - 71 лет, Q25 - 62 лет, Q75 - 76,5 лет, р=0,007). А в группе больных без сопутствующей патологии глаза индивидуумы с генотипом +250АА Lta имели более раннее возникновение ПОУГ (Ме - 62,5 лет, Q25 - 56 лет, Q75 - 68 лет) по сравнению с пациентами с генотипами +250GG Lta и +250AG Lta (Ме - 64 лет, Q25 - 58 лет, Q25 - 71 лет, р=0,03).

3. Ассоциация генетических вариантов цитокинов с офтальмологическими показателями у больных ПОУГ с неэффективным консервативным лечением

Согласно данным литературы, на фоне медикаментозного гипотензивного лечения целевое внутриглазное давление (ВГД) достигается лишь в 33,7% случаев [Балалин C.B. и др., 2012]. Поэтому на следующем этапе работы мы выделили группу больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения. Проведено изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов с офтальмологическими показателями у больных ПОУГ этой группы (п=162).

Получено, что индивидуумы с генотипом -308GG TNFa имели более высокий уровень ВГД (Ме - 27 мм.рт.ст., Q25 - 25 мм.рт.ст., Q75 -31 мм.рт.ст) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипом -308GA TNFa (Ме - 26 мм.рт.ст., Q25 - 24 мм.рт.ст., Q75 -29 мм.рт.ст., р=0,02) (рис. 5).

Рис. 5. Ассоциация генетического полиморфизма -308G/A TNFa с уровнем ВГД у больных ПОУГ

Выявлены ассоциации истинного внутриглазного давления (р0) с генетическими полиморфизмами +250A/G Lta и +1663A/G TNFR2. Индивидуумы с генотипами +250АА Lta и +250AG Lta имели более высокий уровень р0 (Ме - 24,2 мм.рт.ст., Q25 - 21,5 мм.рт.ст., Q75 - 27,3 мм.рт.ст.) по сравнению с пациентами с генотипом+250СС Lta (Ме - 22,4 мм.рт.ст., Q25 -20,6 мм.рт.ст., Q75 - 24,5 мм.рт.ст.). Данные различия являются статистически достоверными (р=0,02). Также установлено, что значение истинного внутриглазного давление было выше у индивидуумов с генотипами +1663GG TNFR2 и +1663AG TNFR2(Ме - 24,6 мм.рт.ст, Q25 -22,1 мм.рт.ст., Q75 - 27,3 мм.рт.ст.) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипом +1663АА TNFR2 (Ме -22,75 мм.рт.ст., Q25 -20,6 мм.рт.ст., Q75 -24,4 мм.рт.ст., р=0,01).

Таким образом, генотип -30800 ТЫРа ассоциирован с более высоким уровнем ВГД, а генетические варианты +250АА и +250АС Ыа, +1663АО и +166300 ТМРЯ2 связаны с более высоким уровнем истинного внутриглазного давления у больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии.

4. Прогнозирование риска развития ПОУГ с использованием генетических данных

С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ на основании исследованных генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов и других возможных факторов риска с целью выявления больных, предрасположенных к ПОУГ.

С помощью методов математического моделирования

(дискриминантный анализ) [Реброва О.Ю., 2006] нами разработан способ прогнозирования риска развития ПОУГ. Согласно этой модели, наиболее прогностически ценными в отношении риска развития ПОУГ были следующие факторы: возраст (р=0,0000), наличие сердечно-сосудистых заболеваний (р=0,04), уровень систолического (р=0,0000) и диастолического (р=0,04) давления, наличие ПОУГ среди родственников (р=0,002), наличие сопутствующей патологии глаз (р=0,00000), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз (р=0,00000), состояние радужной оболочки (р=0,04), степень пигментации угла передней камеры (р=0,00000), генетический вариант по локусу +1663А/0 ТМРЯ2 (р=0,05) . Для группы больных с ПОУГ и контрольной группы получены два уравнения линейных дискриминантных функций (ЛДФ):

— для отнесения в контрольную группу:

у= -99,183+ 1,096x1 -5,681х2+0,310x3+0,976x4+1,801х5+0,845х6-10,976х7 -6,057x8 +0,886x9+11,665х10;

- для отнесения в группу больных с ПОУГ:

у= -116,796+1,202х1 -6,693х2+0,392х3+0,920х4+3,507x5+3,175х6-14,243х7 -6,939х8+4,184х9+12,587 х10,

где X] - возраст (лет), х2 - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (нет-0; да-1), х3 - систолическое артериальное давление, мм.рт. ст., Х4- диастолическое артериальное давление, мм.рт.ст., х5 - наличие ПОУГ у родственников (нет-0; да-1), х6- наличие сопутствующей патологии глаз (нет-0; да-1), х7 - микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаза (нет-0; да-1), х8 - состояние пигментной каймы зрачкового края радужной оболочки глаза (неизменена-0; слабая атрофия пигментной каймы-1; выраженная атрофия пигментной каймы-2), х9 - степень пигментации угла передней камеры (нет-0; слабая пигментация в задней части трабекулы-1; интенсивная пигментация в задней части трабекулы-2; интенсивная пигментация всей трабекулярной зоны-3; интенсивная пигментация всех структур угла передней камеры-4), х10 - генетический вариант по локусу +1663А/Ь ТМРЯ2 (АА-I; АО н 00-2).

С помощью полученных уравнений дискриминантных функций, на основе значений конкретных показателей у пациентов можно определить их вероятностную принадлежность к группе больных с ПОУГ или к контрольной группе. Точность распознания индивидуумов относящихся к группе больных с ПОУГ составляет 91,43%, а контрольной группы - 93,14%. В среднем процент правильных дискриминаций в исследуемых группах составляет 92,14%.

В вышеуказанные уравнения ЛДФ подставляются значения соответствующих показателей у конкретного индивидуума и высчитываются новые признаки - у. Индивидуума следует включить в ту группу - больных ПОУГ или здоровых, для которой новый признак у является максимальным.

Например, у пациента А. определены следующие показатели: возраст -71 год, наличие сердечно-сосудистых заболеваний - да (1), уровень систолического артериального давления - 130 мм.рт.ст., уровень диастолического артериального давления - 80 мм.рт.ст., наличие ПОУГ среди родственников - да (1), наличие сопутствующей патологии глаз - да (1), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - да (1), состояние радужной оболочки - выраженная атрофия пигментной каймы (2), степень пигментации угла передней камеры - интенсивная пигментация всей трабекулярной зоны (3), генетический вариант по локусу +1663АЮ ТШЛ2 -¿О (2). Подставляем эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения ЛДФ и находим в каждом уравнении новый признак у.

у (контрольная группа) =-99,183+ 1,096*71 -5,681*1+0,310*130+0,976*80+1,801*1+0,845*1 -10,976*1 -6,057*2 +0,886*3 +11,665*2=96,876; у (больные ПОУГ)

=-116,796+1,202*71-6,693*1+0,392*130+0,920*80+3,507*1+3,175*1-4,243*1-6,939*2+4,184*3 +12,587*2=112,7

Наибольшее значение нового признака у для данного пациента выявлено при расчётах в уравнении ЛДФ для больных с ПОУГ, что позволяет отнести этого пациента в группу больных ПОУГ. Дальнейшее детальное клиническое обследование данного пациента подтвердило наш прогноз - у пациента А. была обнаружена ПОУГ.

На следующем этапе работы методом бинарной логистической регрессии построена статистическая модель прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией:

у=15-0,099Х1+1,232х2-0,099хз+0,091x4-1,292x5-1,825х6-0,911х7, где хгвозраст, лет (р=0,00000), х2-наличие сердечно-сосудистых заболеваний (нет-0, да-1), (р=0,007), х3 - уровень систолического артериального давления, мм.рт.ст. (р=0,00000), х4 - уровень диастолического артериального давления, мм.рт.ст. (р=0,001), х5 - наличие ПОУГ у родственников (нет-0, да-1) (р=0,013), х6- наличие сопутствующей патологии глаз (нет-0, да-1) (р=0,00000), х7 - генетический вариант по локусу -308С/А Т№а (АА-1,Ав-2, вв-З) (р=0,023).

Величина отношения шансов данной модели составляет OR=22,56 (Х2=196,63, df=7, р=0,0000). Разработанная модель в 83% случаев правильно классифицирует контрольную группу и в 82% случаев репрезентативно предсказывает вероятность возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением, что позволяет своевременно предложить пациенту в этом случае лазерное или хирургическое лечение.

Выводы

1. Генетические полиморфизмы фактора некроза опухоли a (-308G/A TNFá), лимфотоксина а (+250A/G Lt а), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36A/G TNFR1) и 2-го (+1663A/G TNFR2) типов ассоциированы с формированием и течением ПОУГ, офтальмологическим статусом больных.

2. Генетическим маркером повышенного риска развития ПОУГ является аллель -308G TNFa (OR=l,78), а протективными факторами по данной патологии служат генотип -308АА TNFa (OR=0,01) и комбинации генетических вариантов: +1663АА TNFR2 с +250G Lta (OR=0,34); -308АА TNFa с +250G Lta (OR=0,09) и -308A A TNFa с +36А TNFR1 (OR=0,09). Генотипы -308GG TNFa, +250АА Lta, +36GG TNFRI и +36AG TNFR1 связаны с ранней манифестацией ПОУГ.

3. Развитие ПОУГ II стадии ассоциировано с генетическими вариантами -308G TNFa (OR=l,62), -308АА TNFa (OR=0,01), +1663A A TNFR2 (OR=0,53) и комбинациями: -308G TNFa с +1663G TNFR2 (OR=2,19), +36А TNFR1 с +1663AG TNFR2 и +250А LTa (OR=l,65). Подверженность к развитию ПОУГ III-IV стадий связана с генетическими вариантами -308G TNFa (OR=2,44), +250A Lta (OR=l,58), -308GG TNFa (OR=2,26), +250AA Lta (OR=l,83) и комбинациями: -308G TNFa с +250AA Lta (OR=l,87), -308GG TNFa с +36A TNFRI (OR=1,90), -308A TNFa с +36A TNFRI и +250G LTa (OR=(),33), -308A TNFa с +36A TNFRI (OR=0,34).

4. Подверженность к формированию ПОУГ среди индивидуумов с сопутствующей патологией глаз определяют генетический вариант +36А TNFRI (OR=l,58) и комбинации +36АА TNFR1 с +¡66ЗА TNFR2 (OR=5,30) и +250G Lta с +36АА TNFRI (OR=4,90), а протективную направленность при развитии ПОУГ в группе с сопутствующей патологией глаз имеют комбинации +250А LTa с +36G TNFRI (OR=0,45) и -308G TNFa с +36G TNFRI (OR=0,45). Развитие ПОУГ у индивидуумов без сопутствующей патологии глаз ассоциировано с комбинациями: -308G TNFa с +I663G TNFR2 (0R=2,11) и +36G TNFR1 с +1663G TNFR2 (OR=1,70).

5. Прогностически значимыми факторами развития ПОУГ являются генетический полиморфизм +1663A/G TNFR2, возраст, наличие сердечнососудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры.

6. Среди больных ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативной терапии генотип -308GG TNFa

ассоциирован с более высоким уровнем внутриглазного давления, а генетические варианты +250АА и +250AG Lta, +1663AG и +1663GG TNFR2 связаны с более высоким уровнем истинного внутриглазного давления. Прогностически значимыми факторами развития ПОУГ с неэффективным консервативным лечением являются генетический полиморфизм -308G/A TNFa, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующей патологии глаз.

Практические рекомендации

1. Для индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ использовать уравнения линейных дискриминантных функций, включающие в себя следующие факторы: генетический полиморфизм +1663A/G TNFR2, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры.

2. С целью прогнозирования развития ПОУГ с неэффективным консервативным лечением рекомендовано использовать модель, включающую следующие факторы: генетический полиморфизм -308G/A TNFa, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующей патологии глаз.

3. При обследовании больных ПОУГ рекомендуется использовать в качестве маркеров риска развития III-IV стадий заболевания генетические варианты -308G TNFa (OR=2,44), +250А Lía (OR=l,58), -308GG TNFa (OR=2,26), +250AA Lta (OR=l,83) и комбинации: -308G TNFa с +250AA Lta (OR=l,87), -308GG TNFa с +36A TNFR1 (OR=1,90), -308A TNFa с +36A TNFR1 и +250G LTa (OR=0,33), -308A TNFa с +36A TNFR1 (OR=0,34).

Список сокращений

лимфотоксин а фактор некроза опухоли а

рецептор фактора некроза опухоли первого типа рецептор фактора некроза опухоли второго типа первичная открытоугольная глаукома внутриглазное давление истинное внутриглазное давление полимеразная цепная реакция линейная дискриминантная функция

Lta

TNFa -

TNFR1 -

TNFR2 -

ПОУГ -

вгд -

Ро

ПЦР -

ЛДФ -

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Тикунова, Е. В. Клинические и медико-биологические характеристики больных первичной открытоугольной глаукомы / Е. В. Тикунова, М. Ю. Кириленко // Геронтологический журнал и м. В. Ф. Купревича. - 2012. - Т. 3, № 1-2. - С. 74.

2. Тикунова, Е. В. Исследование молекулярно-генетических маркеров первичной открытоугольной глаукомы / Е. В. Тикунова // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2012. - Спец. вып. -С. 62-63. - (Материалы 40-й конф. молодых ученых и 64-й студ. науч. конф. Смолен, гос. мед. акад. (с междунар. участием). Материалы V Съезда межрегион, обществ, организации «Федерация представителей молодежных науч. о-в мед. вузов» / гл. ред. И. В. Отвагин).

3. Тикунова, Е. В. Клинико-генетические аспекты первичной открытоугольной глаукомы / Е. В. Тикунова // Вестник РГМУ. - 2012. -Спец. вып. № 1. - С. 519-520. - (Материалы VII междунар. (XVI всерос.) Пироговской науч. мед. конф. студентов и молодых ученых, Москва, 15 марта 2012 г.).

4. Тикунова, Е. В. Изучение влияния полиморфизма -308G/A TNFa на клиническое течение первичной открытоугольной глаукомы / Е. В. Тикунова // Молодежь медицинская наука в XXI веке : сб. тр. ХШ-ой науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 25-летию Киров, гос. мед. акад. / Киров, гос. мед. акад., Упр. по делам молодежи Киров, обл., Совет молодых ученых и специалистов при Губернаторе Киров, обл. [и др.]; гл. ред. И.В. Шешунов. - Киров, 2012. - С. 71.

5. Тикунова, Е. В. Оценка вклада полиморфизма -308G/A TNFa в формирование предрасположенности к первичной открытоугольной глаукоме / Е. В. Тикунова // Молодежная наука и современность : материалы 77-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 18-19 апр. 2012 г.: в 3 ч. / Курск, гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр. РАМН, Рос. акад. естеств. наук; редкол.: В.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2012.-Ч. 1.-С. 106-107.

6. Тикунова, Е. В. Роль генетических факторов в формировании клинических особенностей первичной открытоугольной глаукомы у пациентов Центрального Черноземья России / Е. В. Тикунова, М. Ю. Кириленко // Клинические и теоретические аспекты современной медицины : материалы 1Умеждунар. науч. конф., Москва, 18-21 апр. 2012 г. / РУДН, Ун-т Семмелвейс, Будапешт, Венгрия - Москва, 2012. - С. 64.

7. Тикунова, Е. В. Анализ клинических особенностей первичной открытоугольной глаукомы // Е. В. Тикунова, М. Ю. Кириленко // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины : сб. тр. X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последиплом. мед. образования, Белгород, 27 апр. 2012 г. / Белгор. гос. нац. исслед. ун-т, Ин-т последиплом. мед. образования ; редкол.: Ю.А. Хощенко [и др.]. - Белгород, 2012. - С. 101-102.

8. Тикунова, Е. В. Ассоциация первичной открытоугольной глаукомы с генетическими вариантами TNFR1 / Е. В. Тикунова // 66-я итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета, Ростов-на-Дону, 20 апр. 2012 г. : материалы конф. / Ростов, гос. мед. ун-т ; гл. ред. И. В. Дударев. - Ростов-на-Дону, 2012. - С. 331.

9. Тикунова, Е. В. Молекулярные основы этиопатогенеза первичной открытоугольной глаукомы / Е. В. Тикунова // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2013. - №11(154), вып. 22. - С. 160-164.

10. Кириленко, М. Ю. Клинические особенности глаукомы и роль наследственных факторов в ее формировании / М. Ю. Кириленко, Е. В. Тикунова // Материалы VII Международной научная конференции молодых ученых-медиков, Курск, 1-2 марта 2013 г. / Курск, гос. мед. ун-т, Воронеж, гос. мед. акад. им. Н. Н. Бурденко, Казан, гос. мед. акад. [и др.]. -Курск, 2013.-Т. 1.-С. 555-559.

П.Кириленко, М. Ю. Некоторые результаты клинико-генетического исследования больных первичной открытоугольной глаукомой / М. Ю. Кириленко, Е. В. Тикунова, Д. Г. Воронина // Вестник РГМУ. -2013. - Спец. вып. №1. - С. 251-252. - (Материалы VIII междунар. (XVII всерос.) Пироговской науч. мед.конф. студентов и молодых ученых, Москва, 21 марта 2013 г.).

12. Кириленко, М. Ю. Офтальмологические и генетические особенности прооперированных по поводу глаукомы пациентов / М. Ю. Кириленко, Е. В. Тикунова // Восток-Запад : сб. науч. тр. науч.-практ. конф. по офтальмохирургии с междунар. участием, Уфа, 6-7 июня 2013 г. / Уфим. науч.-исслед. ин-т глазных болезней АН Респ. Башкортостан ; под ред. М. М. Бикбова. - Уфа, 2013. - С. 185-187.

13. Подпорина, A.A. Вовлеченность генетических полиморфизмов TNFR1, TNFa в развитие первичной открытоугольной глаукомы / А. А. Подпорина, М. А. Топоркова, Е. В. Тикунова [и др.] // II сборник трудов молодых ученых и специалистов Белгородской области / Упр. проф. образования Белгор. обл., Совет молодых ученых и специалистов Белгор. обл. - Белгород, 2013. - Т.2. - С. 72-74.

Подписано в печать 07.07.2014. Формат 60*84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 192. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85