Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан"

00501оиЬ/

На правах рукописи а/

МУСТАФИН РУСТАМ НАИЛЕВИЧ

/

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОФИБРОМАТОЗА I ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 ДПР 1Ш

Уфа-2012

005018052

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: Мустафина Ольга Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН зав. лабораторией физиологической генетики

Спицын Виктор Алексеевич доктор биологических наук, профессор ГУ Медико-генетический научный центр РАМН зав. лабораторией экологической генетики

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится апреля 2012 г. в «/ /» часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН. П _

у ""

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН, по адресу: 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71, с авторефератом - на сайте: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: molgen@anrb.ru, mbb@anrb.ru

Автореферат разослан «-¿/>> марта 2012 г.

Ученый секретарь /)

диссертационного совета J^n/^i Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Нейрофиброматоз I типа (НФ1) - аутосомно-доминантное заболевание с синдромом опухолевой предрасположенности тканей нейроэктодермалыюго генеза, встречающееся с частотой 1:3500 населения в мире (Rasmussen et al., 2000; Vandenbroucke, 2004; Johannessen et al., 2005; Ismat et al., 2006; Jeong et al., 2006; Hawes et al., 2007; McDaniel et al., 2008; Boyd et al., 2009; Ponti et al., 2011). Примерно в 50% случаев болезнь развивается в результате мутаций de novo (D'Angelo et al., 2006; Шнайдер, 2007; Ponti et al., 2011). Основные клинические признаки НФ1: нейрофибромы, пигментные пятна на коже (CALM), гамартомы радужной оболочки глаза, глиомы зрительных нервов, когнитивные нарушения и костные дисплазии. Больные подвержены повышенному риску развития миелолейкоза и злокачественных опухолей из оболочек периферических нервов (MPNST) (Jeong et al., 2006; Bottillo et al., 2007; Gregorian et al., 2009; Chen et al., 2010).

НФ1 возникает в результате мутаций в гене нейрофиброматоза I типа (AT7/), локализованного на 17ql 1.2 (Upadhyaya et al., 1990; Le et al., 2007). Продукт гена NF1, белок нейрофибромин, функционирует в качестве онкосупрессора с негативной регуляцией активации прото-онкогена p21-ras. В базе данных генных мутаций человека (The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff, 2010) зарегистрировано более 1000 различных мутаций в гене NF1, расположенных практически во всех экзонах. «Горячих точек» мутагенеза не выявлено (Rasmussen et al., 2000; Горбунова и др., 2004). У 95% больных обнаруживаются внутригенные мутации, у 5% -делеции протяженного участка, включающего NF1 с соседними генами (Kluwe et al., 2004; De Raedt et al., 2006; Pasmant et al., 2009; Sabbagh et al., 2009). Описаны также случаи НФ1, обусловленные цитогенетическими перестройками, затрагивающими критический хромосомный сегмент 17ql 1.2 (Шнайдер, 2007). Несмотря на открытие огромного количества мутаций в гене NF1, большинством исследователей не выявлено гено-фенотипических

корреляций, за исключением случаев с делениями всего гена. Широкая вариабельность фенотипа, даже у больных с идентичной мутацией, говорит о вовлечении других факторов в детерминацию клинических проявлений, выявление которых имеет большое значение для разработки терапевтических моделей болезни (Rasmussen et al., 2000; Kluwe et al., 2004; Le et al, 2007; Sabbagh et al., 2009).

Благодаря применению молекулярно-генетических методов стало возможным описание случаев НФ1 со стертым течением без кожных и плексиформных нейрофибром (Upadhyaya et al., 2007) и атипичной клиникой, проявляющейся исключительно опухолями спинного мозга (Kaufmann et al., 2001), а таюке мозаичной формы без четких клинических проявлений (Kaplan et al, 2010).

Молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан (РБ) не проводилось. Наши исследования, направленные на выявление первичного генетического дефекта, являются необходимыми для проведения ДНК-диагностики НФ1 в отягощенных семьях.

Цель работы:

Изучение эпидемиологических и молекулярно-генетических особенностей нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Определить территориальные особенности распространения нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.

2. Дать клиническую характеристику больных нейрофиброматозом I типа.

3. Создать банк ДНК больных нейрофиброматозом I типа и членов их семей.

4. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене NF1 у больных нейрофиброматозом I типа.

5. Провести анализ микросателлитных локусов маркеров lint/STR(TCCA)n, IVS27AC28.4, D17S2237 (GXAlu), IVS38TG53.0 и диаллельных

полиморфных вариантов «1801052, «2066736, «9894862 в гене АТ1 в семьях с нейрофиброматозом I типа.

6. Провести анализ корреляций обнаруженных мутаций в гене N11 с клиническими проявлениями заболевания.

Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан с учетом административно-территориальной и этнической подразделенности населения региона. Впервые проведено исследование структурных изменений в гене №7 у больных НФ1 из РБ, при этом выявлено 7 мутаций, ранее не описанных в литературе: С.12780А (р.Тгр426Х), С.15700А (р.01и541 ЬуБ), с. 1973_1974с1е1ТС (рХеиббвРгс^ХЮ), с.3526_3528<1е1АОА (р.Л^1176с1с1), c.3826delC (р.Аг§127601иГ5Х8), С.4514+50А, с.5758_576Ые1ГЮА (р.Ьеи1920А5п£зХ7), а также 2 полиморфных варианта с.1674Т>С (р.11е55811е), с.7584А>С (р.8ег25288ег). Проведен подробный анализ гено-фенотипических корреляций у больных с идентифицированными мутациями.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о молекулярно-генетических основах развития нейрофиброматоза I типа. В связи с трудностью выявления мутаций в гене АТ7/, пренатальная диагностика НФ1 в Республике Башкортостан до проведения настоящего исследования была невозможна. На основании полученных нами результатов создана пополняемая база данных мутаций больных НФ1 из РБ, которая позволяет проводить пренатальную диагностику данного заболевания в семьях с нейрофиброматозом I типа. Наша работа служит основой для дальнейшего усовершенствования ДНК-диагностики НФ1, оптимальной для РБ, и внедрения в практику медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ, медицинских диагностических центров и лечебных учреждений республики.

Полученные данные исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в

медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Международной конференции европейского общества генетиков человека (Амстердам, 2011), П Всероссийской школе-семинаре «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (175 источников). Иллюстративный материал содержит 80 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения эпидемиологических исследований использована база данных по больным нейрофиброматозом I типа, состоящим на учете в медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ и членов их семей за 40-летний период. Карта территориальной распространенности НФ1 в РБ построена с помощью пакета программы АГСУюууСКУ.З .0.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований были использованы образцы ДНК 69 больных с установленным клиническим диагнозом «нейрофиброматоз I типа» из 56 семей из Республики Башкортостан и 50 их родственников. В качестве контроля использовалась ДНК здоровых индивидов (п=50).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (МаШе\у, 1984). Поиск изменений

нуклеотидной последовательности в гене NF1 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) с щелочной и температурной денатурацией (Orita et al., 1989). Использованы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие экзоны и прилегающие интронные области, подобранные с помощью программы Primer Select 5.05 из пакета DNASTAR (1993-2002). После денатурации образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ) с глицерином; электрофорез проводили при температуре 4-25°С при напряжении 100 вольт в течение 40 часов. Гель окрашивали 0,09% раствором азотнокислого серебра. Анализ образцов осуществляли по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос по сравнению с контрольной ДНК (норма). Определение последовательности нуклеотидов у образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюорисцентного мечения DYEnamic™ ET, согласно протоколу фирмы-производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamic™ ET Terminator Cycle Sequencing Kit). Для «прочтения» последовательности нуклеотидов использовали приложение BioEdit v.5.0.9. (1997-2001), для анализа полученных результатов - MegAlign из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002).

С целью выявления протяженных делеций гена NF1 проведен анализ семи внутригенных полиморфных локусов. При анализе четырех микросателлитных маркеров: STR(TCCA)n в интроне 1, IVS27AC28.4 в интроне 27а, D17S2237 (GXAlu) в интроне 27b, IVS38TG53.0 в интроне 38, образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ) с последующей окраской 0,09% раствором AgN03. Детекцию полиморфного варианта /.si 801052 проводили методом ПДРФ-анэлиза/RsaI, образцы инкубировали при 37°С в течение 12 часов, с последующим их нанесением на 7% ПААГ, гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Генотипирование локусов «2066736 и «9894862 проводили методом SSCP.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Эпидемиология нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан

В Республике Башкортостан на учете в медико-генетической консультации состоит 238 больных НФ1 из 192 семей. Распространенность нейрофиброматоза I типа в РБ составила в среднем 4,7 на 100000 населения, тогда как среднемировая распространенность НФ1 - 28 на 100000 населения (Rasmussen et al., 2000; Johannessen et al., 2005; Ismat et al., 2006; Bottillo et al., 2007; Chen et al., 2010; Ponti et al., 2011).

Заболевание зарегистрировано в 38 из 54 административных районов и в 18 из 21 города республики. Минимальные показатели распространенности (менее 3 на 100000 населения) выявлены в городе Ишимбай; Абзелиловском и Баймакском районах; наивысшие показатели (более 13 на 100000 населения) - в Мишкинском и Нуримановском районах (рис. 1).

Рис. 1. Распространенность НФ1 в Республике Башкортостан.

Соотношение между долей больных среди жителей городов к доле больных среди сельских жителей, а также между долей больных мужского и женского пола не достигает статистически значимой разницы.

Распределение больных НФ1 по этническому составу в РБ оказалось следующим: татары - 31,9%, русские - 20,7%, башкиры - 14,8%, марийцы -6%, чуваши - 3%, немцы - 1,5%, мордва - 1,5%, белорусы - 0,7%, украинцы -0,7%. 19,2% больных НФ1 составили метисы.

Выяснение семейного анамнеза с последующим уточнением клинических признаков и составлением родословных проводилось во всех 192 семьях. На основании этих данных для 45% больных НФ1 определены семейные случаи заболевания (наследование от матери - 25%, от отца - 20%), в 55% случаев диагноз установлен только у одного члена семьи.

Клиническая характеристика больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан

При анализе клинических проявлений нейрофиброматоза I типа в РБ с оценкой возраста манифестации, первых симптомов, характеристики проявлений болезни но основным и дополнительным признакам, выявлены определенные особенности (табл. 1). У всех обследованных больных НФ1 из РБ диагноз установлен в соответствии с диагностическими критериями нейрофиброматоза I типа, принятыми Национальными институтами здоровья и рекомендованными Международным комитетом экспертов по нейрофиброматозу (Макурдумян, 2001; Vandenbroucke, 2004; Bottillo et al., 2007; Sabol et al., 2011). У 10% больных соответствующих данным критериям пятен цвета кофе-с-молоком (CALM) на коже не обнаружено. Нейрофибромы выявлены только у 58% пациентов, это может быть обусловлено тем, что возраст последнего обследования у 64% пациентов составлял младше 20 лет, у 29% - младше 10 лет. Тогда как нейрофибромы диагностируются у 95% больных НФ1 после 30 лет (North, 2000; Vandenbrucke, 2004; Бочков, 2011).

Таблица 1

Сравнительная клиническая характеристика больных НФ1 из Республики Башкортостан с данными мировых исследований

Клинический признак Частота встречаемости у больных НФ1 в РБ, % Частота встречаемости у больных НФ1 в мире, %

CALM 90 100

Нейрофибромы 58 95

Низкий рост 18 34

Скелетные аномалии 28 38

Сколиоз 19 12-33

Псевдоартроз 2 5

Когнитивные нарушения 20 30-60

(North, 2000; Ebinger, 2005; Stevenson et al., 2006; Boyd et al., 2009)

У больных, наследовавших НФ1 от матери нами прослежено утяжеление клинической картины заболевания по четким клиническим признакам (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная клиническая характеристика больных НФ1 из Республики Башкортостан в зависимости от наследования

Клинический признак Частота встречаемости у больных со спорадическим случаем НФ1, % Частота встречаемости у больных с наследованием НФ1 от отца, % Частота встречаемости у больных с наследованием НФ1 от матери, %

Низкий рост 1 16 46

Сколиоз 16 22 34

Псевдоартроз 1 - 5

Когнитивные нарушения 15 22 36

Развитие осложнений нейрофиброматоза I типа у больных из РБ значительно отличается от данных по миру (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная оценка осложнений, выявленных у больных НФ1 из Республики Башкортостан, относительно мировых статистических данных

Осложнения Частота встречаемости у больных НФ1 в РБ, % Частота встречаемости у больных в мире, %

Опухоли ЦНС 4 2

Глиомы зрительных нервов 2 7-20

Гидроцефалия 3 5

Плексиформные нейрофибромы 2 30

Кисты головного мозга 1,7 1-10

МРКБ'Г - 5 - 10

(Rasmussen et al., 2000; Gregorian et al., 2009; Melean et al., 2010; Бочков, 2011)

При оценке клинических проявлений НФ1 больных из РБ по степени тяжести, у 54% пациентов диагностировано тяжелое течение заболевания, у 46% - средней тяжести и легкое.

Поиск мутаций в гене NF1 у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан

Нами проведен поиск мутаций в 42 экзонах гена NF1 у 69 больных с установленным клиническим диагнозом «нейрофиброматоз I типа» из 56 семей, проживающих на территории Республики Башкортостан и 50 их родственников. Как контроль использовалась ДНК здоровых индивидов (п=50).

В качестве основного метода поиска мутаций нами был использован метод SSCP (Orita et al., 1989). Обнаруженные при SSCP-анализе образцы с измененной, по сравнению с контролем, подвижностью одноцепочечной ДНК, в дальнейшем исследовались с помощью метода секвенирования.

В результате исследования выявлено 18 типов изменений подвижности однонитевых фрагментов ДНК в 18 экзонах и прилегающих к ним интронных областях. Секвенирование образцов с измененной подвижностью позволило идентифицировать 10 различных мутаций (табл. 4) и 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов (БМР) (табл. 5).

Таблица 4

Спектр мутаций в гене №1 у больных НФ1 из Республики Башкортостан

Образец, № Мутация Локализация Изменение аминокислотной последовательности Тип наследования

29.0 29.2 С.12780А 10а экзон р.Тгр426Х от отца

39.0 39.1 с.15700>А 10с экзон р.аи541Ьу5 от матери

46.0 с.1973 1974 с!е1ТС 12Ь экзон р Хеиб 5 вРгс^Х 10 спорадический

48.0 48.1 51.0 с.2991-Ш>С 17 интрон мутация сайта сплайсинга от матери спорадический

43.0 45.0 45.2 с.3526 3528 сЫАОА 21 экзон р.Аг§1176с!е1 от матери от отца

25.0 с.3826с!е1С 22 экзон р.Аг§12760МзХ8 спорадический

47.0 С.4514+50А 26 интрон мутация сайта сплайсинга от отца

16.0 с.4537С>Т 27а экзон р.Ащ1513Х спорадический

44.0 с.5758 5761 (1е1ТТСА 31 экзон р.Ьеи1920А5п1зХ7 от отца

35.0 с.6792С>А 37 экзон р.Туг2264Х спорадический

Таблица 5

Полиморфные варианты в гене NF1

у больных НФ1 из Республики Башкортостан.

Полиморфный вариант Локализация Эффект изменения Частота, %

с.1674Т>С 11 экзон р.11е55811е 1,4

c.2851-16I>C, «17880825 16 интрон однонуклеотидная замена в интроне 5,7

С.3496+330А, «2066736 20 интрон однонуклеотидная замена в интроне 59

с.3974+38 T>G, «9894862 23-1 интрон однонуклеотидная замена в интроне 42

c.4368-46G>C, «17881285 25 интрон однонуклеотидная замена в интроне 2,9

c.5172G>A, «17887014 28 экзон p.Lysl724Lys 4,3

c.7584A>G 43 экзон р.8ег25288ег 1,4

c.8050+20G>A, «55747230 46 интрон однонуклеотидная замена в интроне 1,4

В экзоне 10а гена NF1 обнаружена нонсенс-мутация c,1278G>A (р.Тгр426Х) у двух больных из одной семьи татарской этнической принадлежности (рис. 2). У пробанда женского пола, №29.0, очаговые кожные нейрофибромы больших размеров, CALM, сколиоз II степени. У отца пробанда, № 29.2, множественные кожные и подкожные нейрофибромы, CALM.

В экзоне Юс гена NF1 выявлена миссенс-мутация c,1570G>A (p.Glu541Lys) у двух больных НФ1 из одной семьи русской этнической принадлежности (рис. 3). У пробанда мужского пола, № 39.0, множественные CALM, задержка физического и умственного развития тяжелой степени. У матери пробанда, № 39.1, очаговые кожные нейрофибромы, множественные CALM.

В экзоне 12Ь гена NFI обнаружена делеиия c.l973_1974delTC (p.Leu658ProfsX10) у одного больного башкирской этнической принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 4). У пробанда № 46.0, мужского пола, диагностированы множественные CALM, плексиформная нейрофиброма области шеи с прорастанием в кости черепа и позвоночник.

В интроне 17 гена NFJ обнаружена описанная ранее мутация сайта сплайсинга c.2991-lG>C у 3-х больных из 2-х неродственных семей (рис. 5). В одной семье у 2-х больных башкирской этнической принадлежности: у пробанда мужского пола, № 48.0, очаговые кожные нейрофибромы, CALM, острый лимфолейкоз с 3 лет; у матери пробанда, № 48.1, множество кожных и подкожных нейрофибром, CALM. В другой семье татарской этнической принадлежности у пробанда мужского пола со спорадическим случаем заболевания, № 51.0, диагностированы единичные нейрофибромы области шеи, CALM. Мутация c.2991-lG>C выявлена ранее у больных НФ1 в Германии (Fahsold et al., 2000).

Рис. 5. Идентификация мутации с.2991-Ю>С в гене NF1.

с.2991-Ю>С

В экзоне 21 гена NF1 выявлена деления c.3526_3528delAGA (p.Argll76del) у 3-х больных из 2-х неродственных семей (рис. 6). В одной семье у 2-х больных русской этнической принадлежности у пробанда мужского пола, № 45.0, множественные CALM, врожденная гидроцефалия, эпилепсия; у отца пробанда, № 45.2, множественные подкожные нейрофибромы, CALM. В другой семье русской этнической принадлежности у пробанда мужского пола, № 43.0, с наследованием мутантного аштеля от матери, диагностированы задержка умственного развития, низкий рост, CALM, очаговые подкожные нейрофибромы, компенсированная гидроцефалия.

Рис. 6. Идентификация мутации c.3526_3528delAGA (p.Argl 176del) в NFL

3528delAGA

(p.Argl 176del)

В экзоне 22 гена NFl обнаружена делеция c.3826delC (p.Argl276GlufsX8) у одного больного, метиса (татарин/башкир), со спорадическим случаем заболевания (рис. 7). У пробанда мужского пола, № 25.0, диагностированы множественные подкожные нейрофибромы, в том числе больших размеров, множественные CALM. При проведении МРТ головного мозга у пациента выявлено объемное образование в области миндалины мозжечка.

c.3826delC

Рис. 7. Идентификация мутации c.3826delC (p.Argl276GlufsX8) в гене NF1.

В интроне 26 гена NF1 обнаружена мутация сайта сплайсинга c.4514+5G>A (рис. 8) у одной больной русской этнической принадлежности с наследованием мутантного аллеля от отца. У пробанда № 47.0 диагностированы множественные CALM и характерные для НФ1 очаги Т2-взвешенной гиперинтенсивности при проведении МРТ головного мозга.

c.4514+5G>A

Рис. 8. Идентификация мутации c.4514+5G>A в гене NF1.

В экзоне 27а гена NF1 обнаружена описанная ранее нонсенс-мутация с.4537С>Т (p.Arg)513X) у одной больной татарской этнической принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 9). У иробанда № 16.0 множественные кожные и подкожные нейрофибромы небольших размеров, CALM. Мутация с.4537С>Т выявлена ранее у больных НФ1 в Германии (Fahsold et al., 2000), Бельгии (Messiaen et al., 2000), Корее (Jeong et al, 2006) и Испании (Ars et al, 2000).

Рис. 9. Идентификация мутации c.4537C>T (p.Argl 513X) в гене NF1.

В экзоне 31 гена NF1 выявлена делеция c.5758_5761delTTGA (p.Leu 1920AsnfsX7) у одной больной, № 44.0, метиса (русская/татарка), с наследованием мутантного аллеля от отца (рис. 10). У пробанда очаговые кожные нейрофибромы в области грудной клетки, CALM, сколиоз II степени.

с.4537С>Т

(p.Argl513X)

|p.Leul920AsnlsX7)l

с.5758 5761delTTGA

I

Рис, 10. Идентификация мутации с.5758 5761delTTGA (p.Leul920AsnfsX7) в

гене NF1.

В экзоне 37 гена NF1 обнаружена описанная ранее нонсенс-мутация С.67920А (р.Туг2264Х) у одной больной башкирской этнической принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 11). У пробанда № 35.0 множественные CALM, ложный сустав голени, гидроцефалия. Мутация с.6792С>А ранее выявлена у больных НФ1 в Испании (Ars et al., 2000), Германии (Fahsold et al., 2000), Бельгии (Messiaen et al., 2000) и Корее (Jeong et al, 2006).

Рис. И. Идентификация мутации c.6792C>A (p.Tyr2264X) в гене NF1.

Таким образом, нами идентифицированы внутригенные мутации в гене МР1 у 23% исследованных больных НФ1 из РБ. При сопоставлении выявленных мутаций с клиническими проявлениями болезни гено-фенотипических корреляций не обнаружено.

Идентификация протяженных делеций гена NF1 у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан

С целью выявления протяженных делеций гена NF1 проведен анализ микросателлитных локусов STR(TCCA)n в интроне 1, IVS27AC28.4 в интроне 27, D17S2237 (GXAlu) в интроне 27b, IVS38TG53.0 в интроне 38 и диаллельных полиморфных вариантов «1801052 в экзоне 5, «2066736 в интроне 20, rs9894862 в интроне 23-1 у 69 больных НФ1 из РБ, проживающих на территории Республики Башкортостан и 50 их родственников.

В результате проведенного исследования было выявлено два пробанда, гомозиготных по всем анализируемым маркерам. У пробанда № 3.0, женского пола, метиса (русская/татарка), со спорадическим случаем заболевания, диагностированы: врожденная гидроцефалия (прооперирована), CALM, множественные подкожные нейрофибромы, отставание в физическом и умственном развитии, сколиоз III степени. У пробанда № 52.0, женского пола, татарской этнической принадлежности, со спорадическим случаем заболевания, диагностированы: плексиформная нейрофиброма, CALM, множественные подкожные нейрофибромы, дизморфизм лица, поперечные ладонные складки.

Таким образом, делении протяженного участка гена NF1 обнаружены у 3% исследованных больных НФ1 из РБ. У данных больных определено тяжелое течение заболевание с развитием осложнений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эпидемиологическое исследование нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан выявило распространенность заболевания на уровень ниже, чем в среднем но миру. Распределение больных нейрофиброматозом I типа по этническому составу отражает демографическую ситуацию в республике.

При клиническом обследовании больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан обнаружено более тяжелое течение заболевания при наследовании болезни от матери - у данных пациентов низкий рост, скелетные

аномалии и задержка умственного развития диагностировались чаще. При анализе осложнений зафиксирована значительно более высокая частота развития опухолей головного мозга и низкая регистрация глиом зрительных нервов и плексиформных нейрофибром в сравнении с таковыми в мире. Злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов не диагностированы ни у одного больного. Более чем у 50% пациентов установлено тяжелое течение заболевания.

В результате анализа нуклеотидной последовательности 42 экзонов гена М7/ у 69 больных из 56 семей из Республики Башкортостан выявлено 10 мутаций у 16 пациентов, что составило 23% в выборке больных. Мутации с.2991-Ш>С, С.45370Т (р.А^1513Х), с.6792С>А (р.Туг2264Х) представлены в базе данных. Большинство идентифицированных мутаций приводят к укорочению белковой молекулы. При сопоставлении выявленных мутаций с клиническими проявлениями болезни гено-фенотипических корреляций не установлено, даже у членов одной и той же семьи. У больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан идентифицировано 8 полиморфных вариантов, 2 из которых описаны впервые.

В результате проведенного анализа микросателлитных маркеров 01782237 (СХА1и), 1т1/5"ЩТССЛ)п, 1У527АС28.4, ГУ838ТС53.0 и диагшельных полиморфных вариантов ге 1801052, «'2066736, «9894862 в семьях с нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан выявлены два неродственных пробанда, гомозиготных по всем маркерам, что является основанием для предположения о наличии у них протяженной делеции гена ЫП. У данных больных отмечено тяжелое течение болезни с осложнениями.

21

ВЫВОДЫ

1. Распространенность нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан составляет 4,7:100000 населения, что значительно ниже среднемировых показателей (28:100000 населения). Установлено неравномерное территориальное распределение заболевания по районам.

2. Выявлено 10 мутаций в гене Л7Г/ у 16 пациентов, что составило 23% в выборке больных нейрофиброматозом I типа. Мутации с.1278С>А (р.Тгр426Х), С.15700А (р.01и541Ъу5), с.1973_1974с!е1ТС (р.Ьеи658Рго1зХ10), с.3526_3528с!е1АСА (р.Лг3117бс1е1), с.3826с1е1С (р. Агё127601^X8), с.4514+50>А, с.5758_576Ые1ТТОА (р.Ьеи1920АзпГзХ7) описаны впервые.

3. Идентифицированы протяженные делеции гена МП у 3% обследованных больных нейрофиброматозом I типа. У данных пациентов диагностировано тяжелое течение заболевания.

4. Установлено, что у 45% больных нейрофиброматозом I типа наследственная форма заболевания, у 55% - спорадические случаи. Из выявленных мутаций 8 являются уникальными для каждой семьи, из них 4 - спорадические случаи. Описанная ранее в литературе мутация с.2991-Ш>С обнаружена в двух неродственных семьях: со спорадическим случаем и с наследованием от матери. Мутация с.3526_3528с!е1АОА (р.Аг§1176с!е1) выявлена в двух неродственных семьях: в одной семье наследование от матери, в другой - от отца.

5. У больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан обнаружено 8 полиморфных вариантов в гене МР1, из которых с.1674Т>С (р.Ие55811е) и с.7584А>0 (р.8ег25288ег) описаны впервые.

6. Выявлено утяжеление течения нейрофиброматоза I типа по четким критериям у больных, наследовавших заболевание от матери.

7. Корреляции между типом мутации в гене МП и особенностями клинических проявлений у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан не выявлено.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Клинико-эпидемиологическое исследование нейрофиброматоза 1 типа в Республике Башкортостан // Якутский медицинский журнал. 2009. № 2 (26). С. 23-25.

2. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Комплексный подход в изучении особенностей нейрофиброматоза 1 типа // Креативная хирургия и онкология. 2012. № 1. С. 98-102.

3. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Особенности нейрофиброматоза 1 типа // Медицинская генетика. 2012. № 3. С. 3-16.

4. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза 1 типа в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. 2010. Ростов-на-Дону. С. 122.

5. Mustafin R., Bermisheva М., Khusnutdinova Е. Epidemiological and molecular genetic study of Neurofibromatosis type 1 in the Republic of Bashkortostan // European Human Genetics Conference. 2011. Amsterdam, Netherlands. P. 428.

6. Мустафин P.H., Бермишева M.A., Хуснутдинова Э.К. Клинико-эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза 1 типа в Республике Башкортостан // Биомика. Электронный журнал ИБГ УНЦРАН. 2011. № 2. С. 86-88.

7. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Поиск мутаций в гене NF1 больных нейрофиброматозом 1 типа в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы конференции «Актуальные вопросы онкогенетики». 2011. С. 16-17.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

МРТ Магнитно-резонансная томография

НФ1 Нейрофиброматоз I типа

РБ Республика Башкортостан

CALM Пятна цвета кофе-с-молоком

MPNST Злокачественные опухоли из оболочек периферических

нервов

NF1 Ген нейрофиброматоза I типа

SSCP Single strand conformation polymorphism

(конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК) SNP Single-nucleotide polymorphism (однонуклеотидный

полиморфизм)

Подписано в печать 23.03.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 641. Гарнитура «ТцаевКетеКотап». Отпечатано в типографии ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мустафин, Рустам Наилевич, Уфа

61 12-3/1222

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН

На правах рукописи

Мустафин Рустам Найлевич

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОФИБРОМАТОЗАI ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ

БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Э.К. Хуснутдинова

Уфа-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................... Ю

1.1. Эпидемиология нейрофиброматоза I типа........................................ 10

1.2. Клинические особенности нейрофиброматоза I типа...................... 12

1.3. Генетические аспекты нейрофиброматоза I типа............................. 15

1.4. Структура, функция и процессинг белка нейрофибромина.............. 18

1.4.1. Альтернативный сплайсинг гена А7*7.................................. 24

1.5. Особенности патогенеза нейрофиброматоза I типа........................ 25

1.5.1. Иммунологические изменения при нейрофиброматозе I типа... 25

1.5.2. Патогенез нейрофибром.................................................. 27

1.5.3. Патогенез пятен цвета кофе-с-молоком............................... 34

1.5.4. Патогенез дефектов костной системы.................................. 35

1.5.5. Патогенез когнитивных нарушений.................................... 37

1.6. Гено-фенотипические и межсимптомные корреляции у больных нейрофиброматозом I типа....................................................... 38

1.7. Диагностика нейрофиброматоза I типа........................................... 40

1.8. Лечение нейрофиброматоза I типа............................................ 45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................... 48

2.1. Материалы исследования....................................................... 48

2. 2. Молекулярно-генетические методы исследования........................ 48

2.2.1. Выделение геномной ДНК человека................................... 49

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК........................ 50

2.2.3. Метод гель-электофореза................................................. 52

2.2.4. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (88СР-анализ)...................................................................... 53

2.2.5. Секвенирование............................................................. 54

2.2.6. Идентификация протяженных делеций гена Л7^7.................... 54

2.3. Статистическая обработка результатов....................................... 55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................ 56

3.1. Эпидемиологическое исследование нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.............................................................. 56

3.2. Особенности клинических проявлений нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан........................................................ 60

3.3. Биоэтические аспекты нейрофиброматоза I типа........................... 74

3.4. Поиск мутаций в гене ЫП у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан....................................................... 79

3.4.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена ИП у больных нейрофиброматозом I типа.................................. 79

3.4.2. Идентификация протяженных делеций гена ЫП у больных нейрофиброматозом I типа.............................................. 126

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................. 131

ВЫВОДЫ..................................................................................... 134

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................... 135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК

ктг

МРТ

НФ1

ПЦР

ПДРФ

РБ

CALM

CSRD

GAP

jDNA

МС

MIA

MPNST

NF1 Nfl

PATRR

SSCP

SNP

■ Дезоксирибонуклеиновая кислота

■ Компьютерная томография

• Магнитно-резонансная томография Нейрофиброматоз I типа Полимеразная цепная реакция Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов Республика Башкортостан Cafe-au-lait Macules (пятна цвета кофе-с-молоком) Cysteine/serine rich domain (цистеин/серин богатый домен) Ras-GTPase activating protein (Ras-ГТФаз-активирующий протеин)

Junk DNA («мусорная» ДНК) Mast cells (мастоциты)

Melanoma-inhibitory activity/cd-rap (ингибитор активности меланомы)

Malignant peripheral nerve sheath tumors (злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов) Ген нейрофиброматоза I типа Нейрофибромин

Palindromic AT-Rich Repeat (палиндромные АТ-богатые повторы)

Single strand conformation polymorphism (конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК) Single-nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

ВВЕДЕНИЕ

Нейрофиброматоз I типа (НФ1) - распространенное аутосомно-

доминантное заболевание с синдромом опухолевой предрасположенности

тканей нейроэктодермального генеза, встречающееся с частотой 1:3500

населения в мире [Rasmussen et al., 2000; Vandenbroucke, 2004; Johannessen et

al., 2005; Ismat et al., 2006; Jeong et al., 2006; Hawes et al., 2007; McDaniel et al.,

2008; Boyd et al., 2009; Ponti et al., 2011]. Примерно в 50% случаев болезнь

развивается в результате мутаций de novo [D'Angelo et al., 2006; Шнайдер,

2007; Ponti et al., 2011]. Основные клинические признаки НФ1:

нейрофибромы, пигментные пятна на коже (CALM), гамартомы радужной

оболочки глаза, глиомы зрительных нервов, когнитивные нарушения и

костные дисплазии. Больные подвержены повышенному риску развития

миелолейкоза и злокачественных опухолей из оболочек периферических

нервов (MPNST) [Jeong et al., 2006; Bottillo et al., 2007; Gregorian et al., 2009; Chen etal., 2010].

НФ1 возникает в результате мутаций в гене нейрофиброматоза I типа {NF1), локализованного на 17ql 1.2 [Upadhyaya et al., 1990; Le et al., 2007]. Продукт гена NF1, белок нейрофибромин, функционирует в качестве онкосупрессора с негативной регуляцией активации прото-онкогена p21-ras и митогенеза. В базе данных генных мутаций человека [The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff, 2010] зарегистрировано более 1000 различных мутаций в гене NF1, расположенных практически во всех экзонах. «Горячих точек» мутагенеза не выявлено [Rasmussen et al., 2000; Горбунова и др., 2004]. У 95% больных обнаруживаются внутригенные мутации, у 5% - делеции протяженного участка, включающего NF1 с соседними генами [Kluwe et al., 2004; De Raedt et al., 2006; Pasmant et al., 2009; Sabbagh et al., 2009]. Описаны также случаи НФ1, обусловленные цитогенетическими перестройками, затрагивающими критический хромосомный сегмент 17qll.2 [Шнайдер, 2007]. Несмотря на открытие огромного количества изменений в гене NF1, большинством

исследователей не выявлено гено-фенотипических корреляций, за исключением случаев с протяженнми делециями. Широкая вариабельность фенотипа, даже у больных с идентичной мутацией, говорит о вовлечении других факторов в детерминацию клинических проявлений, выявление которых имеет большое значение для разработки терапевтических моделей НФ1 [Kluwe et al., 2004; Le et al, 2007; Sabbagh et al., 2009].

Благодаря применению молекулярно-генетических методов, стало возможным описание случаев НФ1 со стертым течением - без кожных и плексиформных нейрофибром [Upadhyaya et al., 2007] и атипичной клиникой, проявляющейся исключительно опухолями спинного мозга [Kaufmann et al.,

2001], а также мозаичной формы НФ1 без четких клинических проявлений [Kaplan et al., 2010].

Молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза I типа в

Республике Башкортостан (РБ) не проводилось. Наши исследования,

направленные на определение первичного генетического дефекта, являются

необходимыми для проведения ДНК-диагностики НФ1 в отягощенных семьях.

Цель работы:

Изучение эпидемиологических и молекулярно-генетических особенностей нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Определить территориальные особенности распространения нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.

2. Дать клиническую характеристику больных нейрофиброматозом I типа.

3. Создать банк ДНК больных нейрофиброматозом I типа и членов их семей.

4. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене ЫП у больных нейрофиброматозом I типа.

5. Провести анализ микросателлитных локусов маркеров Пп1/8ТК(ТССА)П, т27АС28.4, 01782237 (ОХА1и), 1У838Т053.0 и диаллельных полиморфных вариантов га 1801052, ^2066736, го9894862 в гене 7У7<7 в семьях с нейрофиброматозом I типа.

6. Провести анализ корреляций обнаруженных мутаций в гене Ас клиническими проявлениями заболевания.

Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан с учетом административно-территориальной и этнической подразделенное™ населения региона. Впервые проведено исследование структурных изменений в гене ЫП у больных НФ1 из РБ, при этом выявлено 7 мутаций, ранее не описанных в литературе: с.1278С>А (р.Тгр426Х), с.1570С>А (р.01и541Ьуз), с. 1973_1974ёе1ТС (р.Ьеи658РгоГ8Х10), с.3526_3528с!е1АОА (р.Аг§1176с1е1), с.3826с!е1С (р.А^12760МзХ8), с.4514+50>А, с.5758_5761ёе1ТТСА (p.Leul920AsnfsX7), а также 2 полиморфных варианта с. 1674Т>С (р.11е558Ие), с.7584А>С (р.8ег25288ег). Проведен подробный анализ гено-фенотипических корреляций у больных с идентифицированными мутациями.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о молекулярно-генетических основах развития нейрофиброматоза I типа. В связи с трудностью выявления мутаций в гене ЫП, пренатальная диагностика НФ1 в Республике Башкортостан до проведения настоящего исследования была невозможна. На основании полученных нами результатов создана пополняемая база данных мутаций больных НФ1 из РБ, которая позволяет проводить пренатальную диагностику данного заболевания в семьях с нейрофиброматозом I типа.

Наша работа служит основой для дальнейшего усовершенствования ДНК-диагностики НФ1, оптимальной для РБ, и внедрения в практику медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ, медицинских диагностических центров и лечебных учреждений республики.

Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Неравномерность территориального распространения нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан с преобладанием тяжелых форм по клиническому течению.

2. Выявление десяти мутаций в гене NF1: c.l278G>A (р.Тгр426Х), с. 1570G>A (p.Glu541 Lys), с.2991 -1 G>C, с. 1973_1974delTC (p.Leu658ProfsX10), c.3526_3528delAGA (p.Argl 176del), c.3826delC (p.Argl276GlufsX8), c.4514+5G>A, c.4537C>T (p.Argl513X), c.5758_5761delTTGA (p.Leul920AsnfsX7), c.6792C>A (p.Tyr2264X) y больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан.

3. Обнаружение восьми полиморфных локусов с.1674Т>С (р.11е55811е), с.2851-16Т>С (га 17880825), С.3496+330А (га2066736), с.3974+38 T>G (rs9894862), c.4368-46G>C (гЛ7881285), c.5172G>A (p.Lysl724Lys) (Г517887014), c.7584A>G (p.Ser2528Ser), c.8050+20G>A (^55747230) в гене NF1 y больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан.

4. Анализ гено-фенотипических корреляций мутаций c.l278G>A (р.Тгр426Х), с. 1570G>A (p.Glu541 Lys), с. 1973_1974delTC (p.Leu658ProfsX 10), c.2991-lG>C, c.3526_3528delAGA (p.Argl 176del), c.3826delC (p.Argl276GlufsX8), c.4514+5G>A, c.4537C>T (p.Argl513X),

с.5758_576Ые1ГГСА (р.Ьеи 192(^81^X7), с.6792С>А (р.Туг2264Х) у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан. 5. Выявление двух образцов с делецией протяженного участка гена №1 при помощи анализа 4 микросателитных и 3 диаллельных внутригенных маркеров.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Спорадические данные о больных с характерными для НФ1 кожными опухолями впервые описаны немецким натуралистом Конрадом фон Мегенбергом (1303-1374), французским хирургом Амбруазом Паре (15101590) и итальянским натуралистом Улиссе Альдрованди (1522-1605) в трактате «История Монстров» (1642). Характеристику заболевания можно встретить в трудах Тилезиуса за 1793 год [Ruggieri et al., 2003]. Однако первое полное научное описание клинических и морфологических изменений нейрофиброматоза I типа было сделано в 1882 году немецким патологоанатомом Фридрихом фон Реклингхаузеном [Шнайдер, 2007; Boyd et al, 2009].

1.1. Эпидемиология нейрофиброматоза I типа

Нейрофиброматоз I типа - одно из самых распространенных наследственных заболеваний у людей. Средняя частота встречаемости НФ1 составляет 1 на 3500 новорожденных [Vandenbroucke, 2004; Jeong et al., 2006; Bottillo et al., 2007; Hawes et al., 2007; Zhu et al., 2008; Staser et al., 2010; Ponti et al., 2011], варьируя в большинстве популяционных исследований от 1:2000 до 1:5000 [Rasmussen et al., 2000; North, 2000]. По нижеследующим причинам распространенность НФ1 точно определить довольно сложно. Во-первых, из-за широкой вариабельности экспрессивности с преобладанием легких форм. Во-вторых, из-за отсутствия достоверных признаков болезни при обследовании больных в раннем детском возрасте. Так, при подробном клиническом исследовании детей до 16 лет в Северной Ирландии распространенность НФ1 составила 1:5681 (17,6:100000) [McKeever et al., 2008]. В то же время, при исследовании лиц мужского пола, достигших 17-летнего возраста в Израиле, частота встречаемости составила 1:960 (104:100000) [Garty et al., 1994]. В-третьих, из-за снижения распространенности заболевания, обусловленной растущей с возрастом смертности больных НФ1, так как средняя продолжительность их жизни на

15-20 лет меньше, чем в общей популяции [Lasater, 2010; Duong et al., 2011; Masocco et al., 2011]. Частота встречаемости НФ1 в различных странах мира, по данным эпидемиологических исслеований, значительно варьирует (рис. 1) [Rasmussen et al., 2000].

Рис. 1. Распространенность НФ1 в разных странах [Казтшзеп е1 а1., 2000].

Заболевание с одинаковой частотой поражает все расы независимо от половой принадлежности и места жительства. У больных нейрофиброматозом I типа не выявлено географических и популяционных особенностей мутаций в гене [Ье е1 а1., 2007; МсКееуег ег а1., 2008; ЬаБа1ег et а1., 2010].

Достоверное определение распространенности НФ1 возможно при комплексном исследовании населения с максимально большой выборкой. Так, при подобном исследовании 732000 жителей Финляндии частота встречаемости НФ1 составила 1 к 3716, что близко к среднемировым данным [РоуИопеп et а!., 1997]. Для уточнения диагноза в каждом подозрительном

населения

п/100000

случае (с учетом семейного анамнеза) необходимо применение инструментальных методов обследования (магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТГ), радиоизотопное сканирование). В детском возрасте у больных НФ1, когда клинические проявления не достаточно выражены, в установлении диагноза нейрофиброматоза I типа может помочь МРТ головного мозга с выявлением характерных изменений [Ferner et al, 2007; Hyman et al., 2007; Sabol et al., 2011]. Большое значение имеет применение лабораторных методов исследования [Ferner et al., 2004], в том числе молекулярно-генетических. Данное обстоятельство особенно актуально в связи с выявлением, по данным литературы [Kaufmann et al., 2001; Upadhyaya et al, 2007; Kaplan et al, 2010] больных НФ1 с атипичными фенотипическими проявлениями.

1.2. Клинические особенности нейрофиброматоза I типа

Симптоматика НФ1 разнообразна, в патологический процесс вовлекается несколько систем, что подтверждает плейотропный эффект гена NF1 [Бочков, 2011]. Диагностические критерии нейрофиброматоза I типа приняты Национальными институтами здоровья и рекомендованы Международным комитетом экспертов по нейрофиброматозу в 1987 году. К ним относятся:

1) не менее 6 пятен цвета кофе-с-молоком более 5 мм в максимальном диаметре для детей и более 15 мм в максимальном диаметре - для постпубертатного возраста;

2) не менее двух нейрофибром любого типа или одна плексиформная нейрофиброма;

3) веснушчатость в подмышечной и паховой областях;

4) глиома зрительного нерва;

5) два и более узелка Лиша радужной оболочки глаза (гамартомы);

6) характерные костные поражения, такие как дисплазия крыла клиновидной кости или истончение кортикального слоя длинных трубчатых костей (с наличием или без псевдоартроза);

7) наличие у родственников первой степени родства НФ1 по тем же критериям. Диагноз устанавливается при наличии двух и более признаков [Макурдумян, 2001; Vandenbroucke, 2004; Bottillo et al., 2007; Sabol et al., 2011]. Некоторые эксперты требуют пересмотра принятых данных с включением позитивного результата молекулярного анализа как безусловного диагностического критерия [Boyd et al., 2009].

Особенностью болезни является специфическая последовательность проявления симптомов в зависимости от возраста пациента, что затрудняет клиническую диагностику НФ1 у детей. С рождения и в первые годы жизни могут существовать лишь некоторые признаки НФ1, такие как крупные пигментные пятна, плексиформные нейрофибромы, скелетные дисплазии. Другие симптомы могут проявиться значительно позднее (к 15-и годам). При этом степень выраженности клинических проявлений, течение и быстрота прогрессирования нейрофиброматоза I типа у разных больных неодинаковы и колеблются в широких пределах. В настоящее время не установлено, чем обусловлены такие различия. Фактически пенетрантность заболевания составляет 100% в возрасте 20 лет [Boyd et al., 2009; Ponti et al., 2011].

Пятна цвета кофе-с-молоком (CALM) могут встречаться уже у новорожденных, с годами их количество и размеры неуклонно растут. Первые нейрофибромы чаще всего появляются в возрасте 10-20 лет, после 30 лет они обнаруживаются у 95% больных НФ1 [North, 2000; Бочков, 2011]. Плексиформные нейрофибромы развиваются приблизительно у 15-30% больных НФ1 и обусловливают тяжелые клинические проявления [Rasmussen et al., 2000; Staser et al., 2010; Ponti et al., 2011].

Узелки Лиша представляют собой гамартомы радужной оболочки глаза. Часто не определяемые в детском возрасте, они наблюдаются у 96% больных НФ1 в возрасте старше 20 лет. Глиомы зрительных нервов

обнаруживаются приблизительно у 7-20% больных НФ1, при этом большинство данных опухолей не вызывают офтальмологических и других симптомов [North, 2000; Ebinger, 2005; Zhu et al., 2005].

Помимо развития характерных признаков болезни, пациенты с НФ1 подвержены пов