Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза

Минниахметов, Илдар Рамилевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза"

005005923

МИННИАХМЕТОВ ИЛДАР РАМИЛЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 ДЕК 2011

Уфа-2011

005005923

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мустафина Ольга Евгеньевна Учреждение Российской академии наук Институт биохимии генетики УНЦ РАН

доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «¿3:» декабря 2011 г. в «№ »~часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «Д5~» ноября 2011г.

Ученый секретарь

С.М. Бикбулатова

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Хронический миелолейкоз (XMJ1) является формой лейкоза, которая характеризуется усиленным и нерегулируемым ростом преимущественно миелоидных клеток в костном мозге с их накоплением в крови. XMJ1 развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22),(q34;qll), с образованием филадельфийской хромосомы (Ph-хромосома). Транслокация приводит к возникновению онкогенного химерного гена BCR-ABL, который кодирует цитошшматический химерный белок, обладающий выраженной тирозинкиназной активностью. Именно белок BCR-ABL имеет ключевое значение в патогенезе ХМЛ (Kurzrock R. et al., 2004). Исследования молекулярных основ патогенеза ХМЛ подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, заключающейся в применении специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы (ИТК). Создание первого из них - иматиниба (STI571), стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии (Куцев С.И., 2009).

Несмотря на высокую эффективность препарата, у больных в 20-30% случаев наблюдается первичная (рефрактерность) или вторичная (приобретенная) резистентность к проводимой терапии (Quintas-Cardama А. et al., 2009). Предполагают, что устойчивость к терапии, в основном, связана с возникновением точечных мутаций внутри гена BCR-ABL, приводящих к нарушению связывания препарата (Hochhaus А. et al., 2002; Soverini S. et al., 2006).

Возникновение мутаций киназного домена является наиболее частой причиной резистентности, однако у некоторых больных ХМЛ признаки резистентности проявляются и в отсутствии мутаций (Gromicho М. et al., 2011). Это указывает на наличие дополнительных механизмов образования резистентного к лекарственному препарату фенотипа. Предполагают, что в развитии резистентности к терапии у больных ХМЛ большую роль играют гены, участвующие в метаболизме препаратов ИТК, а также абберантная экспрессия некоторых онкогенов и супрессоров опухолевого роста (Копнин Б.П., 2004; Lepper E.R. et al., 2005). Кроме того, в последнее время уделяется большое внимание эпигенетическим механизмам регуляции экспрессии генов

при онкологических заболеваниях, в частности, роли микроРНК в развитии ХМЛ (Bueno MJ. et al., 2006). Таким образом, в то время как у большинства больных ХМЛ достигается определенный ответ на лечение иматинибом, у некоторых из них интенсивность, качество и продолжительность этого ответа являются субоптимальными, что лежит в основе развития резистентности. Механизм резистентности к иматинибу далеко не полностью понятен, и требует продолжения активных исследований в этой области.

Цель работы - изучение молекулярно-генетических основ хронического миелолейкоза и развития резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Задачи псследовапня:

1. Изучить уровень экспрессии химерного гена BCR-ABL в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и оценить эффективность терапии ингибиторами тирозинкиназ.

2. Определить спектр и частоту изменений нуклеотидной последовательности химерного гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

3. Провести поиск, генотипирование и анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов, приводящих к образованию сайтов связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL - rs7457 (мкРНК-323), rs9762 (мкРНК-608), и полиморфного локуса rs4919510 в гене мкРНК-608 у больных ХМЛ. Изучить уровень экспрессии гена BCR-ABL у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов.

4. Провести анализ уровня экспрессии генов мкРНК-203, мкРНК-196 и мкРНК-323, в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы.

5. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов CYP3A5 (rs776746) и hOCTl (rs683369), участвующих в метаболизме ингибиторов тирозинкиназ, у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии.

6. Провести анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (ABCG2, hOCTl) и генов онкосупрессоров (PTPN1, NF1) в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы.

Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза в Республике Башкортостан. Впервые определен спектр и частота встречаемости мутаций в гене ВСЯ-АВЬ у больных ХМЛ из РБ с высоким уровнем экспрессии химерного гена в лейкоцитах периферической крови. Выявлено 4 мутации в гене ВСЯ-АВЬ (М244Г, Т3151, М351Т, Н396В), приводящих к развитию резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у 32% больных ХМЛ с высокой экспрессией химерного гена. Показана роль полиморфных вариантов генов, отвечающих за фармакокинетику ИТК (кОСТГ), а также однонуклеотидных замен, в сайтах связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ (ггп11-323), в развитии резистентности к терапии больных ХМЛ. Выявлены различия уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (АВСБ2, 1гОСТ1), микроРНК (мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323) и онкосупрессоров (РТРМ1, Л7-7) в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, индивидов контрольной группы и в клеточной линии К562.

Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты расширяют имеющиеся знания о механизмах развития и прогрессирования ХМЛ, вносят вклад в формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания и развития резистентности к терапии ИТК. Высокая частота встречаемости мутаций киназного домена гена ВСЯ-АВЬ у резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ свидетельствует о необходимости проведения своевременной диагностики данных мутаций и корректировки тактики лечения. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих генетических исследований ХМЛ. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены и обсуждены на: конференции Европейского общества генетики человека (Вена, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010), II Всероссийской школе-конференции «Биомика - наука 21 века» (Уфа, 2011), II Всероссийской школе-конференции «ЭкоБиотех-2011» «Современные методы и подходы в биологии и экологии»

(Уфа, 2011), научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе, 5 в журналах из Перечня ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 201 работу. Диссертация содержит 19 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. В работе использованы образцы ДНК, РНК и кДНК, выделенные из периферической крови 114 больных с клинически и цитогенетически установленным диагнозом «Хронический миелолейкоз», проходивших обследование в Республиканской клинической больнице имени Г.Куватова г. Уфы. Все больные получали лечение препаратом ингибитором тирозинкиназ (ИТК) иматинибом в дозе 400, 600 или 800 мг/сутки согласно рекомендациям Европейского общества по лечению лейкозов ЕШ (Вассагаш М. й а1., 2009). В группе пациентов, включенных в исследование, медиана возраста на момент постановки диагноза составила 43 года, минимальный возраст 14 лет, максимальный - 76 лет. В состав группы входили 55 (48,0%) мужчин и 59 (52,0%) женщин. В контрольную выборку были отобраны практически здоровые индивиды в возрасте от 26 до 50 лет, не имеющие гематологических и онкологических заболеваний (N=60). Медиана возраста в группе здоровых лиц составила 34 года. Определение уровня экспрессии генов АВС02, НОСТ1, РТРКЧ, Л771 и микроРНК было также проведено в клеточной линии хронического миелолейкоза К562. Исследование одобрено Этическим комитетом ИБГ УНЦ РАН. Все больные ХМЛ дали информированное согласие на участие в исследовании.

Методы исследования. ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (МаЛеш С. сЛ а!., 1984). Анализ полиморфных ДНК-локусов генов ИОСТ1, СУРЗА5, в сайтах связывания мкРНК-323, мкРНК-608 в 3' области гена ВСК-АВЬ и в гене мкРНК-608 осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и ПДРФ-

анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле. Тотальную РНК выделяли из 8-10 мл венозной крови реагентом TriZol (Invitrogene) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Эффективность выделения мРНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Качество препаратов РНК оценивали по соотношению оптических плотностей А260/А280 и электрофорезом в 1%-ном агарозном геле по соотношению количества 28S и 18S рРНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора «RevertAid™ First Strand cDNA» (Fermentas) с помощью гекса- и дексануклеотидных праймеров, руководствуясь рекомендациями производителя. Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена BCR-ABL проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM модель 310 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamicTM ET, согласно протоколу фирмы производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Kit). ПЦР в режиме реального времени осуществляли с помощью системы детекции продуктов ПЦР в реальном времени CFX96™ (BioRad). Для анализа экспрессии гена BCR-ABL использовали набор реагентов Онкоскрин-1-l-Q (ООО «ГеноТехнология»). Интенсивность экспрессии химерного онкогена BCR-ABL и контрольного гена ABL определяли согласно протоколу производителя. Для анализа уровня экспрессии генов ABCG, hOCTl, PTPN1, NF1 и мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323-Зр использовали соответствующие праймеры RT2 qPCR Primer Assays и RT2 SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (SuperArray Bioscience Corporation, США).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0. (StatSoft), BIOSTAT (Гланц С., 1999), GraphPad Prism v.5. (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий х2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman J. et al., 1982). Соответствие наблюдаемого распределения значений количественных показателей нормальному закону распределения оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. При сравнении групп по количественному признаку в случае соответствия его нормальному

распределению использовали t-критерий Стьюдента для независимых групп, равенство дисперсий распределений признаков проверяли при помощи критерия Левена, в противном случае применяли U-критерий Манна-Уитни. Биоинформативный анализ микроРНК, имеющих специфические сайты узнавания в 3' области гена BCR-ABL, был выполнен с использованием специализированных алгоритмов miRBase (http://www.mirbase.org/), PoiymiRTS Database 2.0 (http://TOmpbio.uthsc.edu/miRSNP/), TargetScan (http://www.targetscan.orgO.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL в лейкоцитах периферической крови у больных хроническим миелолейкозом

Анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL является высокоинформативным методом для определения эффективности лечения больных XMJI ингибиторами тирозинкиназ. Молекулярный мониторинг экспрессии гена BCR-ABL методом ПЦР в реальном времени является в настоящее время рекомендованным методом контроля лечения XMJ1 у пациентов, получающих ингибиторы тирозинкиназ 1 и 2 поколения (Baccarani M.etal.,2009).

С целью молекулярного мониторинга эффективности терапии у пациентов с XMJ1, получавших иматиниб, нами был проведен анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL. Относительная экспрессия гена BCR-ABL определяется как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 100%.

В результате проведенного нами анализа было выявлено, что уровень экспрессии гена BCR-ABL в общей выборке пациентов с XMJI варьирует от 0 до 2345% (BCR-ABL/ABLxl 00%). Медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 23,77% (10 - 90-ый процентиль, 0 - 316,8%). У 32 больных ХМЛ из РБ (28%) транскрипты BCR-ABL не выявлялись, что свидетельствует о достижении ими полного молекулярного ответа на терапию ИТК. Умеренный уровень экспрессии был обнаружен в 10 случаях (9%). Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в этой группе пациентов колебался от 0,05% до 0,94%. Медиана экспрессии гена BCR-ABL соответствовала 0,15% (10 - 90-ый процентиль, 0,05 -0,93%). У 72 больных ХМЛ (63%) уровень экспрессии гена BCR-ABL был высоким (>1%). Медиана экспрессии составила 79,9%, максимальное значение -2345%, минимальное 1,6%.

Таким образом, проведенный анализ уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ показал неоднородность в структуре молекулярного ответа на терапию ИТК, что свидетельствует о разной эффективности лечения пациентов препаратами ИТК. Молекулярный мониторинг является важным инструментом в оценке эффективности лечения больных ИТК. Проведение регулярного (раз в три месяца) мониторинга позволяет по уровню молекулярного ответа судить об опухолевой нагрузке.

Анализ мутаций в гене ВСЯ-АВЬ

Возникновение устойчивости к ИТК является следствием взаимодействия многих факторов. Наиболее широко обсуждается влияние мутаций гена ВСЯ-АВЬ на развитие резистентности. По современным данным, частота мутаций в гене ВСК-АВЬ в разных группах больных колеблется от 15% до 90% и зависит от критериев определения резистентности, методов обнаружения мутаций и фазы течения ХМЛ (Боуегш Б. й а1., 2006). Своевременное выявление мутаций, приводящих к появлению резистентности, является важным этапом молекулярного мониторинга ХМЛ, что, в свою очередь, позволит откорректировать тактику лечения пациентов.

В результате проведенного нами исследования у 50 пациентов с ХМЛ из РБ с наиболее высокими значениями уровня экспрессии химерного гена выявлены 4 миссенс-мутации (М244У, Т3151, М351Т и Н396Я) и два полиморфных варианта (К247Я и (¿346(2).

У 7 больных с ХМЛ из РБ (14%) при секвенировании кДНК обнаружена замена цитозина на тимин в 944 положении, приводящая к замене треонина на изолейцин в 315 положении (Т3151) (рис. 1. А). Наличие мутации у всех больных с выявленными при секвенировании изменениями последовательности нуклеотидов подтверждено методом ПДРФ-анализа с помощью эндонуклеазы рестрикции (рис. 1. В). Анализ проводился после амплификации фрагмента кДНК длиной 482 и.о., который в норме содержит 4 сайта рестрикции для эндонуклеазы Ос!е1, гидролизующей кДНК на 5 фрагментов длиной 35, 55, 114, 116,162 п.о. При возникновении замены цитозина на тимин пропадает один из сайтов рестрикции Ос1е1, и у мутантного варианта АВЬ транскрипта появляется дополнительный негидролизованный фрагмент длиной 197 п.о. В образцах с мутацией также были выявлены фрагменты длиной 162 и 35 и.о., }ПО

свидетельствует о клоновом характере мутаций, т.е. мутантные образцы представлены разным соотношением транскриптов дикого и мутантного типов.

И I» МИ» ' '|||||1 № ' тт ■ ■■-■•:

мм М К

-1971 1—1621

А В 1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Секвенирование и ПДРФ-анализ образцов кДНК с мутацией ТЗ151 в гене ВСЯ-АВЬ. А. Секвенирование образца кДНК с мутацией Т3151. В. Электрофореграмма ПДРФ-анализа гена ВСк-АВЬ с помощью эндонуклеазы рестрикции DdeI: 1 - маркер молекулярного веса р1ГС19/Мзр1; 2 - контрольный образец, не обработанный рестриктазой; 3, 4, 5, 7 - образцы кДНК с мутацией ТЗ 151; 6 - образец кДНК без мутации ТЗ 151.

Мутация ТЗ 151 в гене ВСЯ-АВЬ является, по данным литературы, наиболее распространенной мутацией, вызывающей резистентность ко всем известным ингибиторам тирозинкиназ (Куцев С.И. и соавт., 2008; С?шп1аз-Са^ата А. е1 а)., 2009). Резистентность к терапии при этой мутации гена ВСК-АВЬ невозможно преодолеть увеличением дозы иматиниба, так же как и терапией ингибиторами тирозинкиназ 2 поколения, поэтому при наличии совместимого донора пациентам с мутацией Т3151 показана аллогенная трансплантация костного мозга (Куцев С.И. и соавт., 2008).

У 10 пациентов с ХМЛ из РБ (20%) при секвенировании кДНК гена ВСЯ-АВЬ нами была обнаружена замена тимина на цитозин в 1052 положении, приводящая к замене метионина в положении 351 на треонин (М351Т) (рис. 2. А). Для подтверждения наличия мутации М351Т проводился ПДРФ-анализ с использованием специфической эндонуклеазы Ысо1 (рис. 2. В). Гидролиз амплифицированного фрагмента кДНК без мутации приводит к образованию трех фрагментов длиной 219, 215 и 48 п.о. При наличии мутации М351Т пропадает один из двух сайтов узнавания эндонуклеазы Ысо1 и образуется два фрагмента длиной 434 п.о. и 48 п.о.

А В

Рис. 2. Секвенирование и ПДРФ-анализ образцов с мутацией М351Т в гене BCR-ABL. А. Секвенирование образа кДНК с мутацией МЗ 51Т. В. Электрофореграмма ПДРФ-анализа гена BCR-ABL с помощью эндонуклеазы рестрикции Ncol: 1 - маркер pUC19/MspI; 2, 3 - контрольные образцы, не обработанные рестриктазой; 4, 6, 7, 8 - образцы кДНК с мутацией М351Т; 5 - образец кДНК без мутации М351Т.

Мутация М351Т в гене BCR-ABL является одной из часто встречаемых при XMJI мутаций, связанных с развитием резистентности к терапии. Данная мутация приводит к умеренному снижению чувствительности к иматинибу в тестах in vitro, которая восстанавливается при концентрации препарата 1-4 мкмоль (концентрация 4 мкмоль соответствует суточной дозе иматиниба 800 мг/сут). Показано, что терапия высокими дозами иматиниба может привести к преодолению резистентности, однако более эффективный результат достигается при применении ингибиторов тирозинкиназ 2 поколения (O'Hare Т. et al., 2007; Куцев С.И. и соавт., 2008).

Мутация H396R в гене BCR-ABL, возникающая в результате замены аденина на гуанин в 1187 положении, обнаружена у одного больного (2%) из РБ (рис. 3. А). Показано, что наличие данной мутации может являться причиной резистентности к терапии иматинибом. Мутация H396R дестабилизирует расположение активационной (А) петли так, что домен киназы не может перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом. По экспериментальным данным, это приводит к снижению чувствительности к препарату в 7,3 раза в биохимическом тесте и в 10,8 раз в клеточном тесте на пролиферацию по сравнению с диким типом BCR-

ABL (Corbin A. et al., 2003; Куцев С.И. и соавт., 2008).

Рис. 3. Секвенирование образцов кДНК с мутацией H396R (А) в гене BCR-ABL и без мутации (В).

Обнаружение данной мутации является основанием для повышения дозы иматиниба. В случае отсутствия положительного результата необходимо перейти на терапию препаратами второго поколения (нилотиниб и дазатиниб) (Куцев С.И. и соавт., 2008).

У одного больного с ХМЛ из РБ (2%) нами выявлена замена аденина на гуанин в 730 позиции, приводящая к замене метионина в 244 положении на валин (M244V) (рис. 4. А). Несмотря на то, что фосфорилирующая активность ABL-киказы с данной мутацией незначительно отличается от активности ABL киназы дикого типа, по мнению Corbin А. и O'Hare Т. и соавт., при обнаружении данной мутации у пациентов необходимо увеличить дозу иматиниба или назначить ингибиторы тирозинкиназ второго поколения (Corbin

Рис. 4. Секвенирование образцов кДНК с мутацией М244У (А) в гене ВСЯ-АВ1 и без мутации (В).

В целом, в результате проведенного исследования мутаций в гене ВСЯ-АВЫ у больных с высоким уровнем экспрессии ВСЯ-АВЬ из РБ у 16 пациентов

из 50 (32%) были выявлены мутации в киназном домене. У семи пациентов с ХМЛ была обнаружена мутация М351Т, у четырех пациентов - мутация ТЗ151, у трех пациентов было выявлено по две мутации - ТЗ 151 и М351Т, и у двух пациентов было определено по одной мутации - М244У и Н396Я.

Частота встречаемости обнаруженных нами в гене ВСЯ-АВЬ мутаций варьировала при различных фазах заболевания. У большинства пациентов с высоким уровнем экспрессии химерного гена была хроническая фаза заболевания. У семи из них (17%) были обнаружены мутации в гене ВСЕ-АБЬ: М351Т (4 больных), ТЗ 151 (1), М244У (1) и Н396Я (1). У всех пациентов, находившихся в фазе акселерации, были выявлены мутации: у трех больных -мутация М351Т, у двух - мутация Т3151, у одного - две мутации, Т3151 и М351Т. Из трех пациентов, у которых наблюдался бластный криз, у одного была определена мутация ТЗ 151, у двух - по две мутации, ТЗ 151 и М351Т.

Нами проведен сравнительный анализ уровня экспрессии химерного гена у больных с различными мутациями в киназном домене ВСЯ-АВЬ (рис. 5).

£ -г

Рис. 5. Диапазон экспрессии химерного гена у больных с различными мутациями в киназном домене ВСЯ-АВЬ.

Установлено, что наиболее высокий средний уровень экспрессии химерного гена наблюдается у пациентов с компаунд-мутацией Т3151+М351Т (от 61,0% до 2344,5%, медиана 442,3%), а также у пациентов с мутацией М351Т (от 55,8% до 1097,7%, медиана 94,6%).

Кроме мутаций, являющихся причиной развития резистентности, в нашем исследовании мы также обнаружили полиморфный вариант К247И. (замена лизина на аргинин) у одного пациента с ХМЛ (2%). У двух пациентов выявлена

♦ Г315ИЛ11ЯГ « ,Ш5!Т

1097.7%*

«00 » мм«.' к Т31Я

ем-.- г н.ч»в в

404Г.' Ш* ~ г ♦г

гоо:.' ***

] 11|щ|*т*> 10%« *

^Щ'щщчммпмищпшпивинчщцщм1!

Пациенты с высоким \ |ювнем -»ыпрегаш гена ВСЯ-ЛВ1.

замена гуанина на аденин в позиции 1038, которая не приводит к замене аминокислоты глутамина в 346 положении (Q346Q). Предполагается, что присутствие только полиморфных вариантов не требует изменения тактики лечения (рис. 6) (Borrow J., 2007).

Рис. 6. Секвенирование образцов ДНК с полиморфными вариантами в гене ВСЯ-АВЬ. А. Секвенирование образца «ДНК с полиморфным вариантом К247И. В. Секвенирование образца кДНК с полиморфным вариантом <3346<3.

Таким образом, в результате проведенного анализа мутаций в гене ВСЯ-АВЬ было установлено, что мутации киназного домена встречаются у 32% больных ХМЛ из РБ с высокой экспрессией гена ВСЯ-АВЬ, что свидетельствует о необходимости проведения своевременной диагностики данных мутаций и корректировки тактики лечения. Мутации гена ВСЯ-АВЬ являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с ХМЛ, что подтверждается данными, полученными в нашем исследовании. Анализ мутаций в гене ВСЯ-АВЬ необходим для выяснения причин резистентности к иматинибу и поиска путей ее преодоления, определения прогноза течения заболевания, особенно, в случае продолжения терапии иматинибом. В 14% случаев у больных ХМЛ из РБ встречается мутация Т3151, приводящая к резистентности ко всем видам лечения НТК, что свидетельствует о необходимости проведения скрининга данной мутации у всех пациентов с ХМЛ, демонстрирующих признаки резистентности. Раннее обнаружение мутации ТЗ151 позволит своевременно начать поиск подходящих доноров и назначить трансплантацию костного мозга.

Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов CYP3AS и hOCTl, участвующих в метаболизме ИТК, у больных ХМЛ; изучение уровня экспрессии гена BCR-ABL у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов

Рядом авторов было показано, что у больных ХМЛ, получающих ИТК, наблюдается значительная вариабельность концентрации препаратов в плазме крови (Coutre P. et al., 2004; Peng В. et al., 2004), поэтому в настоящее время уделяется большое внимание изучению генов, участвующих в метаболизме ИТК. С целью изучения влияния полиморфных вариантов генов, участвующих в фармакокинетике ИТК, на лекарственную устойчивость у больных ХМЛ проведен анализ распределения частот генотипов полиморфного локуса rs776746 гена изофермента РЗА5 цитохрома р450 (CYP3A5) и полиморфного локуса rs683369 в гене переносчике органических катионов hOCTl.

В ходе проведенного анализа распределения частот генотипов выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии химерного гена BCR-ABL у носителей различных генотипов для полиморфного локуса rs683369 гена hOCTl (рис. 7).

CYP3A5 rs776746 hOCTl rs683369

Рис. 7. Уровень экспрессии химерного гена BCR-ABL у больных ХМЛ, носителей различных генотипов полиморфных локусов ге776746 в гене СУРЗА5 и «683369 в гене ИОСТ1, *-р= 0,0112.

Средний уровень экспрессии гена ВСР-АВЬ у носителей различных генотипов полиморфного локуса гв683369 в гене переносчике органических катионов (кОСТ1) составил: *С*С - 52,88±10,80; *С*0 - 120,4±29,07; *0*0 -26,11±14,75. Обнаружено повышение среднего уровня экспрессии химерного гена BCR-ABL у лиц, носителей гетерозиготного генотипа ге683369*С*0.

Анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов

АВСС2 и ИОСТ1 в клеточной линии ХМЛ К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы

Количество иматиниба, которое фактически проникает в клетки-мишени, зависит от баланса между его притоком и оттоком. Важными участниками в регуляции абсорбции, распределения и экскреции многих лекарств являются транспортные белки (Ьеррег Е.Я. й а1., 2005).

Проведен анализ уровня экспрессии генов АБСа и ИОСТ1 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ, находящихся в хронической фазе с полным молекулярным ответом, у больных ХМЛ, резистентных к терапии НТК, у здоровых индивидов и в линии клеток К562 (рис. 8).

АВС02 ЬОСТ1

Зт - * --4-1

Рис. 8. Экспрессия гена АБСа и ИОСТ1 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и лини клеток К562 (1 - контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 - больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562). АВСв2 *-р= 0,036; ИОСТ1 *-р= 0,014; **-р=0,037; ***р=0,025; ****р=0,025

Обнаружено статистически значимое повышение уровня экспрессии гена АВСС2 у больных, достигших полного молекулярного ответа. При анализе уровня экспрессии гена ИОСТ1 выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой и резистентными к терапии больными ХМЛ, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом на лечение ИТК.

Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в сайтах связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена В CRAB L у больных ХМЛ; изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов

Полиморфные варианты генов мкРНК и их мишеней способны оказывать влияние на регуляцию мРНК таргетных генов (Chen К. et al., 2006). Предполагается, что целый ряд мкРНК, контролирующих экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, могут принимать участие в патогенезе хронического миелолейкоза (ХМЛ), в связи с чем интересным является анализ полиморфных вариантов сайтов связывания мкРНК в 3' области гена BCR-ABL.

В настоящем исследовании проведен анализ трех полиморфных локусов (rs4919510, rs9762 и rs7457), в сайтах связывания мкРНК-608 и мкРНК-323 в З'-нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL, а также анализ уровня экспрессии химерного гена BCR-ABL у лиц с различными генотипами по данным полиморфным локусам (рис. 9).

miR-323 rs7457

m 100-

m <

К 50'

■О

Рис. 9. Уровень экспрессии химерного гена BCR-ABL у больных ХМЛ, носителей различных генотипов полиморфного локуса гэ7457 в сайте связывания мкРНК-323.

В результате анализа показано, что уровень экспрессии гена BCR-ABL варьирует в зависимости от генотипов по всем трем исследуемым локусам, но статистически значимые отличия были выявлены только по локусу ге7457 в сайте связывания мкРНК-323. У носителей гомозиготного генотипа *Т*Т средний уровень экспрессии химерного гена был статистически значимо ниже среднего уровня экспрессии у больных ХМЛ, носителей гетерозиготного генотипа *С*Т и лиц, носителей гомозиготного генотипа *С*С. Появление сайта связывания для мкРНК-323 в 3' области гена BCR-ABL у носителей генотипа гз7457*Г*Г может являться дополнительным фактором, содействующим ингибирующему эффекту ИТК при лечении ХМЛ.

Анализ уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК-196 и мкРНК-323 в клеточной линии ХМЛ К562, в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ и индивидов контрольной группы

В настоящее время почти все исследования мкРНК, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, основаны на изучении профиля экспрессии мкРНК в раковых клетках по сравнению с нормальными, что позволяет выявить потенциальную роль микроРНК в развитии рака.

Для оценки влияния мкРНК на уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ, а также для выявления возможности использования малых некодирующих РНК при лечении ХМЛ нами был проведен анализ уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК- 196Ь и мкРНК-323 у пациентов с ХМЛ с различной степенью молекулярного ответа на лечение ИТК, в группе контроля здоровых доноров и в линии клеток К562. Кандидатные мкРНК были отобраны на основании наличия специфических сайтов связывания в таргетном гене ВСЯ-АВЬ.

В лейкоцитах периферической крови обнаружено значительное различие в уровне экспрессии мкРНК-203 между больными ХМЛ, клеточной линией К562 и контрольной группой (рис. 10).

Рис. 10. Уровень экспрессии мкРНК-203 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и линии клеток К562 (1 -контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 - больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562)

По сравнению с контрольной группой больные ХМЛ с полным молекулярным ответом имели 7-кратное снижение уровня экспрессии мкРНК-203, больные, резистентные к терапии - 25-кратное снижение. Наиболее низкая экспрессия мкРНК-203 наблюдалась в клеточной линии К562 - 50-кратное снижение экспрессии по сравнению с группой контроля.

Сравнительный анализ экспрессии мкРНК-196Ь показал, что у резистентных к терапии больных, с высоким уровнем экспрессии гена ВСЯ-АВЬ экспрессия данной мкРНК была в 2 раза ниже, чем у здоровых индивидов. В то же время уровень экспрессии мкРНК-196Ь у больных с полным молекулярным

т'|К-203

ответом отличался незначительно от уровня экспрессии у здоровых индивидов (рис. 11).

96Ь

Рис. 11. Уровень экспрессии мкРНК-196Ь в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и лини клеток К562 (1 - контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 - больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562)

МкРНК-196Ь, у которой есть соответствующий сайт узнавания на 3' конце транскриптов ВСЯ-ЛВЬ, обладает потенциальной возможностью ингибирования экспрессии гена ВСК-АВЬ, однако необходимо дальнейшее изучение данной мкРНК у больных ХМЛ.

Анализ уровня экспрессии мкРНК-323, отобранной при изучении полиморфного локуса ге7457, показал, что у больных, резистентных к терапии ИТК, уровень экспрессии мкРНК-323 снижен примерно в 4 раза (рис. 12). Уровни экспрессии мкРНК-323 у больных с полным молекулярным ответом, а также в клеточной линии К562 значимо не различались с контрольной группой.

гшР?-323

1.5-1

Рис. 12. Уровень экспрессии мкРНК-323 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и лини клеток К562 (1 - контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 -больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562)

Учитывая, что уровень экспрессии мкРНК-323 в 4 раза снижен у больных, резистентных к терапии ИТК, можно предположить, что данная мкРНК играет онкосупрессорную роль, однако низкая представленность этой мкРНК почти во всех органах, и низкая копийность в лимфоцитах крови, дает основание полагать, что роль мкРНК-323 при развитии ХМЛ несущественна.

Анализ экспрессии генов онкосупрессоров PTPN1 и NF1 в клеточной линии

XMJl К562, в лейкоцитах периферической крови больных XMJI и индивидов контрольной группы

Ключевую роль в возникновении онкологических заболеваний играют нарушения функции протоонкогенов, опухолевых супрессоров и так называемых мутаторных генов (Копнин Б.П., 2004). В настоящем исследовании проведен анализ уровня экспрессии генов тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1 и нейрофиброматоза первого типа NFI, предположительно являющихся супрессорами опухолевого роста в развитии многих онкологических заболеваний.

При анализе уровня экспрессии гена PTPN1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия между контрольной группой и больными, резистентными к терапии ИТК. В клеточной линии К562 наблюдался довольно низкий уровень экспрессии гена PTPN1 по сравнению со всеми исследованными выборками (рис. 13).

Рис. 13. Уровень экспрессии гена PTPN1 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и линии клеток К562 (1 - контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 -больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562). *-р= 0,022; **-р= 0,018; ***-р= 0,006; ****-р= 0,002

При анализе уровня экспрессии гена NF1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой и больными XMJI, резистентными к терапии ИТК, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом. В клеточной линии К562 наблюдалось статистически значимое снижение уровня экспрессии гена NF1 по сравнению со всеми исследованными выборками, кроме группы контроля (рис. 14).

Ген NF1 действует как негативный регулятор активности Ras белков, и тем самым, проявляет себя в роли онкосупрессора. Повышение уровня экспрессии гена NF1 у больных онкологическими заболеваниями ранее было обнаружено только в исследовании Cacev и соавт. (2005) при развитии рака

PTPN 1

толстого кишечника (Сасеу Т. й а1., 2005). Увеличение уровня экспрессии данного гена у больных ХМЛ свидетельствует о важности изучения именно тканеспецифичной экспрессии гена NF1 и необходимости дальнейшего изучения профиля экспрессии данного гена.

Рис. 14. Уровень экспрессии гена в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ с различной эффективностью терапии, в контрольной группе и линии клеток К562 (1 - контроль; 2 - больные с полным молекулярным ответом; 3 -больные, резистентные к терапии ИТК; 4 - линия клеток К562). *-р= 0,016; **-р= 0,026; ***-р= 0,022; ****-р= 0,025

Таким образом, мутации в киназном домене ВСТАВЬ являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с ХМЛ, что подтверждается данными, полученными в нашем исследовании. Тем не менее, очевидно, что в развитии резистентности к лечению препаратами ИТК и прогрессировании ХМЛ в сторону акселерации и бластного криза могут играть важную роль множество других клеточных, генетических и эпигенетических факторов, которые в совокупности определяют индивидуальное развитие болезни у больных ХМЛ. Полученные нами данные о роли экспрессии мкРНК, генов переносчиков лекарственных препаратов и онкосупрессоров раскрывают некоторые патогенетические аспекты ХМЛ и вносят вклад в общее представление о молекулярно-генетических основах развития данного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом, получавших терапию ингибиторами тирозинкиназ, широко варьирует, медиана экспрессии - 23,77%. У 63% больных ХМЛ наблюдался высокий уровень экспрессии гена ВС11-АВ1^ у 9% больных уровень экспрессии был умеренным. У 28% пациентов с ХМЛ не обнаружено транскриптов

ЫР1

химерного гена, что свидетельствует о достижении ими полного молекулярного ответа на терапию ИТК.

2. Обнаружено, что у 32% резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ с высоким уровнем экспрессии гена ВСТАВЬ встречаются мутации киназного домена гена ВСЯ-АВЬ. Выявлены четыре мутации (М244У, Т3151, М351Т, Н396Я) и два полиморфных варианта гена ВСЯ-АВЬ (К247Ц Q346Q). Высокая частота мутаций в гене ВСЯ-АВЬ определяет необходимость их диагностики для своевременного изменения тактики лечения ИТК.

3. Установлено, что у больных ХМЛ, носителей гомозиготного генотипа *Т*Т полиморфного варианта ге7457 в сайте связывания мкРНК-323 в 3'-нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ, средний уровень экспрессии химерного гена статистически значимо ниже, чем у носителей генотипов *С*Т и *С*С. Появление сайта связывания для мкРНК-323 в 3' области гена ВСЯ-АВЬ у носителей генотипа гз7457*Т*Т может являться дополнительным фактором, содействующим ингибирующему эффекту ИТК при лечении ХМЛ.

4. Обнаружено снижение уровня экспрессии мкРНК-203 в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ с эффективным ответом на терапию, резистентных к терапии больных ХМЛ и в клеточной линии ХМЛ К562 по сравнению со здоровыми индивидами; выявлено снижение уровня экспрессии мкРНК-196Ь и мкРНК-323 у резистентных к терапии больных ХМЛ, что свидетельствует о возможной роли мкРНК в формировании ответа на терапию ИТК.

5. Установлено, что у резистентных к терапии ИТК больных ХМЛ статистически значимо чаще, чем у больных с эффективным ответом на терапию, встречается генотип *С*С полиморфного локуса ге683369 гена переносчика органических катионов кОСТ1. У носителей генотипа ге683369*С*0 средний уровень экспрессии химерного гена ВСЯ-АВЬ выше, чем у носителей генотипов Г5683369*С*С и гз683369*0*0.

6. Выявлено повышение уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов АВСй2 и ИОСТ1 у больных ХМЛ в лейкоцитах периферической крови, что свидетельствует об участии белковых продуктов данных генов в метаболизме ИТК и их влиянии на эффективность ответа на терапию.

7. Обнаружено, что у больных ХМЛ в лейкоцитах периферической крови повышен уровень экспрессии гена нейрофиброматоза 1 типа NFI и снижен уровень экспрессии гена тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1, что указывает на вовлеченность этих генов в процесс развития ХМЛ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мишшахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Карунас A.C., Рябчикова Н.Р., Хуснутдинова Э.К. Молекулярные основы патогенеза и фармакогенетики хронического миелолейкоза// Медицинская генетика. - 2009. №11. С. 3-12.

2. Рябчикова Н.Р., Мишшахметов И.Р., Сафуанова Г.Ш., Бакиров Б.А., Бакиров А.Б. Хронический миелолейкоз у лиц пожилого возраста в Республике Башкортостан // Вестник Санкт-Петербургской Государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. - 2009. - № 2/1 (31). С. 293-294.

3. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Карунас A.C., Рябчикова Н.Р., Хуснутдинова. Изучение роли полиморфных вариантов микроРНК в развитии лекарственной устойчивости у больных хроническим миелолейкозом // Креативная хирургия и онкология. - 2010. №4. С. 37-39.

4. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р., Карунас A.C., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. - 2011. №12. С. 22-29.

5. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р., Карунас A.C., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутации T315I в гене BCR-ABL1 у больных хроническим миелолейкозом из Республики Башкортостан // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. Т. 13, № 5 (3). С. 263-267.

6. Рябчикова Н.Р., Сафуанова Г.Ш., Бакиров А.Б., Минниахметов И.Р., Бакиров Б.А., Янтурина Н.Х., Гайсарова Г.А. Ингибиторы тирозинкиназы в лечении больных хроническим миелолейкозом в Республике Башкортостан // Здравоохранение и социальное развитие. Спецвыпуск. - 2010. С. 241-243.

7. Рябчикова Н.Р., Сафуанова Г.Ш., Минниахметов И.Р. и др. Хронический миелолейкоз. Методические рекомендации. Уфа. - 2010. С. 1-18.

8. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Карунас A.C., Рябчикова Н.Р., Хуснутдинова Э.К. Изучение роли микроРНК-608 в развитии лекарственной

устойчивости у больных хроническим миелолейкозом // Медицинская генетика. Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. - 2010. С. 115.

9. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р., Карунас A.C., Хуснутдинова Э.К. Анализ изменений нуклеотидной последовательности в гене BCR-ABL1 у больных хроническим миелолейкозом из Республики Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики». - 2011. №10. С. 15-16.

10.Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р., Карунас A.C., Хуснутдинова Э.К. Поиск мутации T315I в гене BCR-ABL1 у больных хроническим миелолейкозом из Республики Башкортостан // Биомика. II Всероссийская школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. -2011. Том 1, №2. С. 80-81.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ХМЛ - Хронический миелолейкоз

ИТК - Ингибитороры тирозинкиназ

кДНК - Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ОТ - Обратная транскрипция

ПДРФ - Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - Полимеразная цепная реакция в реальном времени

К562 - Линия клеток хронического миелолейкоза К562

OR Odds Ratio (Соотношение шансов)

PTPN1 - Тирозиновая фосфатаза первого типа

NF1 - Нейрофиброматоз первого типа

ABCG2 - АТФ-зависимый мембранный транспортер G2

hOCTl - Переносчик органических катионов первого типа

CYP3A5 - Цитохром Р450 класса ЗА

мкРНК - МикроРНК

Подписано в печать 24.11.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 572. Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п. л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минниахметов, Илдар Рамилевич

ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи исследования.

Научная новизна исследования.

Практическая значимость.

Основыне положения, выносимые на защиту.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика генов BCR, ABL, BCR-ABL и их белковых продуктов.

1.2 Клиническая характеристика, диагностика и особенности терапии хронического миелолейкоза.

1.3 Молекулярный мониторинг хронического миелолейкоза.

1.4 Механизм резистентности у больных хроническим миелолейкозом при лечении ИТК.

1.4.1 BCR-ABL-зависимый механизм устойчивости.

1.4.2 BCR-ABL-независимый механизм.устойчивости.

1.5 Роль протоонкогенов и генов супрессоров опухолевого роста в этиологии ХМЛ и резистентности к лечению препаратами ИТК.

1.6 Эпигенетическая регуляция хронического миелолейкоза.

1.6.1 Митилирование.

1.6.2 Роль микроРНК в развитии хронического миелолейкоза.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы исследования.

2.2Методы исследования.

2.2.1 Выделение геномной ДНК.

2.2.2 Выделение суммарной РНК.

2.2.3 Синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции.

2.2.4 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.

2.2.5 Рестрикционный анализ.

2.2.6 Метод электрофореза.

2.2.7 Определение нуклеотидной последовательности гена ВСЯ-АВЬ

2.2.8 Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2.2.9 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Анализ уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в лейкоцитах периферической крови у больных хроническим миелолейкозом из

3.2 Анализ мутаций в гене ВСЯ-АВЬ у больных из РБ.

3.3 Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме ИТК, у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов.

3.3.1 Анализ полиморфного варианта гб776746 гена изофермента цитохрома р450 СУРЗА5 у больных хроническим миелолейкозом.

3.3.2 Анализ полиморфного варианта гб683369 гена переносчика органических катионов ИОСТ1 у больных хроническим миелолейкозом.

3.4Анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.4.1 Анализ уровня экспрессии гена переносчика АВСС2 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.4.2 Анализ уровня экспрессии гена переносчика органических катионов ИОСТ1 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.5 Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в сайте связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ у больных хроническим миелолейкозом. Изучение уровня экспрессии химерного гена у носителей различных генотипов исследованных полиморфных локусов.

3.6Анализ уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК-196 и мкРНК-323, в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.6.1 Анализ уровня экспрессии мкРНК-203 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.6.2 Анализ уровня экспрессии мкРНК-196 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.6.3 Анализ уровня экспрессии мкРНК-323 в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.7Анализ уровня экспрессии генов онкосупрессоров в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.7.1 Анализ уровня экспрессии гена тирозиновой фосфатазы РТРИ1 в клеточной линии К562, у больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

3.7.2 Анализ уровня экспрессии гена нейрофиброматоза первого типа ЫП в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных хроническим миелолейкозом и индивидов контрольной группы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза"

Онкологические заболевания являются одной из самых актуальных проблем современной медицины. Данные Всемирной организации здравоохранения, впервые приведенные еще в 1962 г., о том, что смертность от онкологических заболеваний в экономически развитых странах вышла на второе место (уступая лишь смертности от несчастных случаев), не изменились и в настоящее время [World health statistics, 2009]. Злокачественные новообразования (ЗНО) лимфатической и кроветворной ткани (гемобластозы) входят в число наиболее распространенных опухолей [World health statistics, 2009]. По урону, наносимому обществу, гемобластозы в экономически развитых странах занимают 2-е место после рака легкого [Воробьев А.И. и соавт., 1995; Волкова М.А., 2007].

Хронический миелолейкоз (XMJI) в странах Европы и Северной Америки по распространенности занимает третье место среди лейкозов (после острых лейкозов и хронического лимфолейкоза), в азиатских странах, где заболеваемость хроническим лимфолейкозом очень низка, - второе место. По данным эпидемиологических исследований, заболеваемость XMJ1 в мире составляет 1-2 случая на 100 тыс. населения [Волкова М.А., 2003].

В общероссийском Регистре больных XMJI на август 2010 года содержится информация о 7855 больных из 80 субъектов РФ [Виноградова, 2011]. Заболевание выявляется в основном у людей социально активного возраста, что серьезно усугубляет проблему и делает ее крайне актуальной [Волкова М.А., 2003].

Хронический миелолейкоз является формой лейкоза, которая характеризуется усиленным и нерегулируемым ростом преимущественно миелоидных клеток в костном мозге с их накоплением в крови. Основной причиной XMJ1 является реципрокная транслокация t(9;22),(q34;ql 1) с образованием филадельфийской хромосомы (Ph-хромосома) [Savona М. et al., 2008], обнаруживаемой у 90-95% больных. В результате транслокации 7 образуется химерный ген BCR-ABL, продуктом которого является патологический белок, обладающий выраженной тирозинкиназной активностью. Именно белок BCR-ABL, продуцируемый химерным геном, имеет ключевое значение в патогенезе XMJI [Kurzrock R. et al., 2003].

Исследования молекулярных основ патогенеза XMJI подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, заключающейся в применении специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы (ИТК). Создание первого из них - иматиниба (STI571), стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии [Куцев С.И., 2009]. Иматиниб селективно ингибирует BCR-ABL-тирозинкиназу, встраиваясь в АТФ-связывающий карман киназного домена белка. Благодаря этому АТФ не может встроиться в АТФ-связывающий карман, BCR-ABL-тирозинкиназа остается в неактивном состоянии и тем самым блокируется сигнальный путь пролиферации опухолевых клеток [Куцев С.И., 2009].

Несмотря на высокую эффективность препарата, у некоторых больных в 20-30% случаев наблюдается первичная (рефрактерность) или вторичная (приобретенная) резистентность к проводимой терапии [Quintas-Cardama А. et al., 2009Ь]. Предполагают, что устойчивость к терапии в основном связана с возникновением точечных мутаций внутри гена BCR-ABL, кодирующего тирозинкиназный домен, приводящих к нарушению связывания препарата. Частота мутаций в гене BCR-ABL у больных, резистентных к иматинибу, колеблется от 15% до 90%, а частота обнаружения мутаций зависит от критериев определения резистентности, методов выявления мутаций и фазы течения XMJI [Hochhaus А. et al., 2002; Soverini S. et al., 2006].

Возникновение мутаций киназного домена является наиболее частой причиной резистентности, однако у некоторых больных XMJI признаки резистентности проявляются и в отсутствии мутаций [Gromicho М. et al., 2011]. Это указывает на наличие дополнительных механизмов образования резистентного к лекарственному препарату фенотипа.

Появлению резистентности к препаратам ИТК может способствовать абберантная экспрессия генов переносчиков лекарственных препаратов. Резистентность к ИТК может являться результатом активного АТФ-зависимого транспорта лекарственных препаратов из клеток посредством переносчиков, принадлежащих к семейству транспортеров ATP-binding cassette (ABC). В исследованиях Gromicho и соавт. (2011) было обнаружено, что в большинстве изученных ими резистентных клеточных линий были сверхэкспрессированы несколько белков переносчиков, а именно АВСВ1, ABCG2, МУР и hOCT-1. Установлена ассоциация полиморфных вариантов генов, кодирующих эти белки, с эффективностью лечения XMJI ингибиторами тирозинкиназ [Thomas J. et al., 2004; Kim D.H. et al., 2007].

Кроме абберантной экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов, вероятно, существуют другие молекулярные нарушения, которые смогли бы объяснить изменчивость клинического течения во время хронической фазы и прогрессирования болезни в более агрессивные стадии. Главной стратегией для идентификации предполагаемых генов, участвующих в развитии XMJI, является анализ различных генетических мишеней, которые часто вовлечены в развитие других видов опухолей [Копнин Б.П., 2004], а также исследование влияния микроРНК на соответствующие гены-мишени.

Ключевую роль в возникновении онкологических заболеваний играют нарушения функции протоонкогенов и опухолевых супрессоров. Геном человека содержит несколько десятков опухолевых супрессоров и мутаторных генов. Кроме того, выявлено еще несколько десятков участков хромосом, потери которых обнаруживаются при различных новообразованиях, что указывает на возможную локализацию в них потенциальных опухолевых супрессоров [Копнин Б.П., 2000]. Таким образом, перспективными являются исследования по изучению профиля экспрессии протоонкогенов и опухолевых супрессоров во время развития хмл.

В исследовании онкологических заболеваний, в том числе и XMJI, большое внимание уделяется эпигенетической регуляции экспрессии генов, вовлеченных в патогенез болезни посредством действия микроРНК (мкРНК, miR). МкРНК представляют собой короткие (20-24 п.н.) некодирующие РНК, основной функцией которых является постранскрипционное подавление экспрессии генов. Показано, что они играют ключевую роль в дифференцировке клеток и эмбриональном развитии, в процессе гемопоэза, функционировании нервной системы и онкогенезе [Pushparaj P.N. et al., 2006]. При XMJI обнаружена ярко выраженная корреляция прогрессии заболевания с профилем экспрессии ряда микроРНК: miR-150, miR-20a, miR-17, miR-19a, miR-103, miR-144, miR-155, miR-181a, miR-221 [Lu J., 2005; Ramkissoon S.H., 2006; Venturini L., 2007; Machova Polakova K, 2009]. Кроме того, мкРНК также участвуют в регуляции работы онкогенов и генов опухолевой супрессии, и могут способствовать развитию рака [Cheng A.M. et al., 2005; Tanno В. et al., 2005].

Таким образом, в то время как у большинства больных XMJ1 достигается определенный ответ на лечение иматинибом, у некоторых из них интенсивность, качество и продолжительность этого ответа являются субоптимальными, что лежит в основе развития резистентности. Механизм резистентности к иматинибу далеко не полностью понятен, и требует продолжения активных исследований в этой области.

Цель работы - изучение молекулярно-генетических основ хронического миелолейкоза и развития резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Задачи исследования:

1. Изучить уровень экспрессии химерного гена BCR-ABL в лейкоцитах периферической крови больных XMJI и оценить эффективность терапии ингибиторами тирозинкиназ.

2. Определить спектр и частоту изменений нуклеотидной последовательности химерного гена BCR-ABL у больных XMJI, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

3. Провести поиск, генотипирование и анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов, приводящих к образованию сайтов связывания мкРНК в З'-нетранслируемой области транскриптов гена BCR-ABL - rs7457 (мкРНК-323), rs9762 (мкРНК-608), и полиморфного локуса rs4919510 в гене мкРНК-608 у больных XMJI. Изучить уровень экспрессии гена BCR-ABL у носителей различных генотипов исследованных полиморфных л оку сов.

4. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов CYP3A5 (rs776746) и hOCTl (rs683369), участвующих в метаболизме ингибиторов тирозинкиназ, у больных XMJI с различной эффективностью терапии.

5. Провести анализ уровня экспрессии генов мкРНК-203, мкРНК-196Ь и мкРНК-323, в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных XMJI и индивидов контрольной группы.

6. Провести анализ уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (ABCG2, hOCTl) и генов онкосупрессоров (PTPN1, NF1) в клеточной линии К562, в лейкоцитах периферической крови больных XMJI и индивидов контрольной группы.

Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза в Республике Башкортостан. Впервые определен спектр и частота встречаемости мутаций в гене ВСЯ-АВЬ у больных ХМЛ из РБ с высоким уровнем экспрессии химерного гена в лейкоцитах периферической крови. Выявлено 4 мутации в гене ВСЯ-АВЬ (.М244У\ Т3151, М351Т, Н396Я), приводящие к развитию резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у 32% больных ХМЛ с высокой экспрессией химерного гена. Показана роль полиморфных вариантов генов, отвечающих за фармакокинетику НТК (НОСТ1), а также однонуклеотидных замен, создающих новые сайты связывания в З'-нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ (мкРНК-323), в развитии резистентности к терапии больных ХМЛ. Выявлены различия уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов (АВС02, НОСТ1), микроРНК (мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323) и онкосупрессоров {РТРИ1, №1) в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, индивидов контрольной группы и в клеточной линии К562.

Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты расширяют имеющиеся знания о механизмах развития и прогрессирования ХМЛ, вносят вклад в формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания и развития резистентности к терапии НТК. Обнаруженная высокая частота встречаемости мутаций киназного домена гена ВСЯ-АВЬ у резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ, что свидетельствует о необходимости проведения своевременной диагностики данных мутаций и корректировки тактики лечения. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих генетических исследований ХМЛ. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, получавших терапию ингибиторами тирозинкиназ, варьирует от 0 до 2345%. У 63% больных ХМЛ наблюдается высокий уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ, у 28% пациентов с ХМЛ не обнаружено копий химерного гена.

2. Мутации тирозинкиназного домена гена ВСЯ-АВЬ (М244У] Т3151, М351Т, Н396Я), приводящие к развитию резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ, встречаются у 32% больных ХМЛ с высоким уровнем экспрессии гена ВСЯ-АВЬ.

3. Снижение уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК-196Ь и мкРНК-323 в лейкоцитах периферической крови у больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

4. Повышение уровня экспрессии гена переносчика органических катионов ИОСТ1, гена нейрофиброматоза 1 типа ЫП и снижение уровня экспрессии гена тирозиновой фосфатазы первого типа РТРИ в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

5. Повышение уровня экспрессии генов АВС02, М*У и ИОСТ1 в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ с полным молекулярным ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Минниахметов, Илдар Рамилевич

выводы

1. Установлено, что уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в лейкоцитах периферической крови больных ХМЛ, получавших терапию ингибиторами тирозинкиназ, широко варьирует, медиана экспрессии -23,77%. У 63%) больных ХМЛ наблюдался высокий уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ, у 9% больных уровень экспрессии был умеренным. У 28% пациентов с ХМЛ не обнаружено транскриптов химерного гена, что свидетельствует о достижении ими полного молекулярного ответа на терапию ИТК.

2. Обнаружено, что у 32% резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ с высоким уровнем экспрессии гена ВСЯ-АВЬ встречаются мутации киназного домена гена ВСЯ-АВЬ. Выявлено четыре мутации (М244У\ Т3151, М351Т, Н396Я) и два полиморфных варианта гена ВСЯ-АВЬ {К247Я, ()346()). Высокая частота мутаций в гене ВСЯ-АВЬ определяет необходимость их диагностики для своевременного изменения тактики лечения ИТК.

3. Установлено, что у больных ХМЛ, носителей гомозиготного генотипа *Т*Т полиморфного варианта гб7457 в сайте связывания мкРНК-323 в 3'-нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ, средний уровень экспрессии химерного гена статистически значимо ниже, чем у носителей генотипов *С*Т и *С*С. Появление сайта связывания для мкРНК-323 в 3' области гена ВСЯ-АВЬ у носителей генотипа гз7457*Т*Т может являться дополнительным фактором, содействующим ингибирующему эффекту ИТК при лечении ХМЛ.

ХМЛ К562 по сравнению со здоровыми индивидами; выявлено снижение уровня экспрессии мкРНК-196Ь и мкРНК-323 у резистентных к терапии

141 больных ХМЛ, что свидетельствует о возможной роли мкРНК в формировании ответа на терапию ИТК.

5. Установлено, что у резистентных к терапии ИТК больных ХМЛ статистически значимо чаще, чем у больных с эффективным ответом на терапию, встречается генотип *С*С полиморфного локуса гз683369 гена переносчика органических катионов ИОСТ1. У носителей генотипа гб683369*С*0 средний уровень экспрессии химерного гена ВСЯ-АВЬ выше, чем у носителей генотипов гб683369*С*С и гб683369*0*0.

6. Выявлено повышение уровня экспрессии генов переносчиков лекарственных препаратов АВС02 и ИОСТ1 у больных ХМЛ в лейкоцитах периферической крови, что свидетельствует об участии белковых продуктов данных генов в метаболизме ИТК и их влиянии на эффективность ответа на терапию.

7. Обнаружено, что у больных ХМЛ в лейкоцитах периферической крови повышен уровень экспрессии гена нейрофиброматоза 1 типа ЫП и снижен уровень экспрессии гена тирозиновой фосфатазы первого типа РТРЫ1, что указывает на вовлеченность этих генов в процесс развития ХМЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Этиология ХМЛ, связанная с образованием химерного гена ВСЯ-АВЬ играет главную роль в развитии данного заболевания. Трансформированные клетки ХМЛ, экспрессирующие ВСЯ-АВЬ, характеризуются снижением клеточной дифференцировки, экспансивной пролиферацией, независимой от ростовых факторов и ингибированием апоптоза. Все это является следствием дисбаланса генных сетей, управляющих ростом и дифференцировкой гемопоэтических клеток предшественников. Тем не менее, очевидно, что ВСЯ-АВЬ киназа действует согласованно с множеством других клеточных и генетических факторов, которые, накапливаясь со временем, неизбежно ведут к прогрессированию заболевания в бластный криз. Зависимость клеток ХМЛ от основного действия киназы ВСЯ-АВЬ обеспечило возможность для разработки высокоэффективных целенаправленных агентов, ингибирующих онкогенную тирозинкиназную активность. Если не рассматривать аллогенную трансплантацию костного мозга, ХМЛ остается в настоящее время неизлечимым, хотя и управляемым заболеванием. Раскрытие механизмов, связанных с прогрессированием ХМЛ в терминальную стадию и регулирующих развитие резистентности к ИТК, инактивацию онкосупрессоров и геномную нестабильность, имеет важное значение для разработки эффективной стратегии лечения больных ХМЛ.

В рамках данного исследования проведен анализ молекулярногенетических основ развития хронического миелолейкоза в РБ. У всех пациентов с ХМЛ проводилось определение уровня экспрессии гена ВСЯ

АВЬ. С целью идентификации мутаций в гене ВСЯ-АВЬ у 50 пациентов с

ХМЛ из Республики Башкортостан проведен анализ изменений нуклеотидной последовательности тирозинкиназного домена гена ВСЯ-АВЬ путем прямого секвенирования к ДНК. Проведено исследование трех однонуклеотидных замен, создающих новые сайты связывания в 3'нетранслируемой области транскриптов гена ВСЯ-АВЬ (гз9762 и ге7457) или

132 нарушающих связь микроРНК с комплексом RISC (rs4919510) для мкРНК-323 и мкРНК-608, а также двух полиморфных вариантов в гене фермента биотрансформации ксенобиотиков CYP3A5 и переносчика органических катионов hOCTl. Определены профили экспрессии гена ABCG2, кодирующего белок резистентности к раку молочной железы, генов транспортера органических катионов hOCTl, тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1, нейрофиброматоза первого типа NF1, а также мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323-Зр в лейкоцитах периферической крови у пациентов с XMJI и группе контроля.

В результате проведенного анализа экспрессии гена BCR-ABL было выявлено, что 32 больных XMJI из РБ (28%) достигли полного молекулярного ответа на терапию ИТК (0% гена BCR-ABL). Умеренный уровень экспрессии был выявлен в 10 случаях (9%). Группа больных XMJI из РБ с высоким уровнем экспрессии гена BCR-ABL состояла из 72 человек (63%). Уровень экспрессии гена BCR-ABL в общей выборке пациентов с XMJI варьирует от 0 до 2345% (BCR-ABL/ABLx 100%). Медиана экспрессии составила 23,77%. Проведенный анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL, методом ПЦР в реальном времени в периферической крови больных XMJI, показал неоднородность в структуре молекулярного ответа, что объясняется разной эффективностью лечения пациентов препаратами ИТК.

В результате проведенного исследования мутаций в гене BCR-ABL у больных с высоким уровнем экспрессии BCR-ABL из РБ у 16 пациентов из 50 (32%) были выявлены четыре мутации в киназном домене: M244V, ТЗ151, М351Т и H396R. У семи пациентов с XMJI была обнаружена мутация М351Т, у четырех пациентов - мутация ТЗ 151, у трех пациентов было выявлено по две мутации - T315I и М351Т, и у двух пациентов было определено по одной мутации - M244V и H396R. Также у одного пациента с XMJI был обнаружен полиморфный вариант K247R (2%), у двух пациентов - полиморфный вариант Q346Q (4%).

Частота встречаемости обнаруженных нами в гене BCR-ABL мутаций варьировала при различных фазах заболевания. У большинства пациентов с высоким уровнем экспрессии химерного гена была хроническая фаза заболевания. У семи из них (17%) были обнаружены мутации в гене BCR-ABL: М351Т (4 больных), T315I (1), M244V (1) и H396R (1). У всех пациентов, находившихся в фазе акселерации, были выявлены мутации: у трех больных - мутация М351Т, у двух - мутация ТЗ151, у одного - две мутации, T315I и М351Т. Из трех пациентов, у которых наблюдался бластный криз, у одного была определена мутация ТЗ 151, у двух - по две мутации, T315I и М351Т.

Таким образом, у больных XMJI из РБ с высокой экспрессией гена BCR-ABL мутации киназного домена встречаются в 32% случаев, что свидетельствует о необходимости проведения своевременной диагностики данных мутаций и корректировки тактики лечения. Мутации киназного домена гена BCR-ABL являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с XMJ1, что подтверждается данными, полученными в нашем исследовании. В 14% случаев у больных XMJ1 из РБ встречается мутация ТЗ 151, приводящая к резистентности ко всем видам лечения ИТК, что свидетельствует о необходимости проведения скрининга данной мутации у всех пациентов с XMJI, демонстрирующих признаки резистентности. Раннее и своевременное обнаружение мутации T315I позволит своевременно начать поиск подходящих доноров и назначить трансплантацию костного мозга.

Предполагается, что целый ряд мкРНК, контролирующих экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, могут принимать участие в патогенезе XMJI, в связи с чем интересным является анализ полиморфных вариантов сайта связывания мкРНК, лежащих в 3' области гена BCR-ABL или в генах мкРНК. В ходе проведенного анализа полиморфного локуса rs7457 мкРНК-323 не выявлено статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между пациентами с XMJ1 с разным уровнем

134 экспрессии химерного гена BCR-ABL. У носителей гомозиготного генотипа *Т*Т средний уровень экспрессии химерного гена составил 13,33±2,82 и был статистически значимо ниже среднего уровня экспрессии у больных ХМЛ, носителей гетерозиготного генотипа *С*Т (112,5±28,65; р=0,021) и лиц, носителей гомозиготного генотипа *С*С (116,9±24,09; р=0,016). Аллель *Т приводит к образованию нового сайта связывания для мкРНК-323 (PolymiRTS Database), что может оказывать ингибирующее влияние на уровень белка BCR-ABL в клетке. Снижение уровня химерного белка у больных ХМЛ из-за негативного влияния мкРНК-323 может приводить к снижению количества лейкозных клеток.

Проведенный анализ полиморфных локусов rs9762 и rs4919510 в мкРНК-608 не выявил статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между больными ХМЛ с разной эффективностью лечения ИТК. В ходе проведенного анализа выявлены выраженные различия в уровне экспрессии химерного гена BCR-ABL у носителей различных генотипов полиморфных локусов rs9762 и rs4919510, однако они не достигли статистически значимых различий из-за малого объема выборки

Одним из важных факторов регуляции внутриклеточной доступности

ИТК является нарушение притока препаратов через переносчики органических катионов hOCTl (Crossman С, 2005). Полиморфизмы этих белковых переносчиков могут изменить способность проникновения ИТК в клетки, что является причиной развития лекарственной устойчивости. В ходе проведенного анализа полиморфного локуса rs683369 гена hOCTl выявлено, что генотип *С*С статистически значимо выявлялся у пациентов с ПМО

75,00% по сравнению с больными с высокой экспрессией BCR-ABL - 53,57% х2=3,94, р=0,04, OR=0,38 (95%С1 0,14-1,00). Частота встречаемости генотипа *C*G была почти в два раза выше у больных ХМЛ с высокой экспрессией - 42,86, по сравнению с группой пациентов с ПМО - 21,88

2=3,92, р=0,04, OR=2,67 (95%С1 0,99-7,21). Кроме того, были обнаружены статистически значимые различия в уровне экспрессии химерного гена BCR

135

ABL у носителей различных генотипов по данному ДНК-локусу. Выявлено повышение среднего уровня экспрессии химерного гена BCR-ABL у лиц, носителей гетерозиготного генотипа rs683369*C*G (р= 0,0112). Средний уровень экспрессии гена BCR-ABL у носителей генотипа *С*С полиморфного локуса rs683369 составил 52,88±10,80; *C*G - 120,4±29,07; *G*G -26,11±14,75. Полиморфный вариант rs683369 (480G>C) приводит к функциональной замене аминокислоты лейцин на фенилаланин и является возможным механизмом, влияющим на степень притока ИТК в клетки. Нарушение биодоступности иматиниба может привести к увеличению экспрессии гена BCR-ABL, что, в свою очередь, может вызвать ухудшение ответа у пациентов, получающих лечение препаратами ИТК.

Для оценки потенциальной роли мкРНК в развитии XMJI нами проведен анализ уровня экспрессии мкРНК-203, мкРНК-196Ь, мкРНК-323-Зр. В ходе проведенного исследования обнаружены различия уровня экспрессии мкРНК-203 у больных XMJI, в клеточной линии К562 и контрольной группе. По сравнению с контрольной группой, больные XMJI с полным молекулярным ответом имели 7-кратное снижение уровня экспрессии мкРНК-203, больные с высокой экспрессией - 25-кратное снижение. Наиболее низкая экспрессия мкРНК-203 наблюдалась в клеточной линии К562 - 50-кратное снижение экспрессии по сравнению с группой контроля. Учитывая тот факт, что одной из предсказанных мишеней мкРНК-203 является онкоген ABL, можно предположить, что мкРНК-203 способна непосредственно регулировать его активность. Низкая экспрессия данной мкРНК у больных XMJI позволяет предположить, что мкРНК-203 функционирует как онкосупрессор, который подавляет действие химерного гена BCR-ABL и снижает его трансформирующую активность. Таким образом, мкРНК-203 обладает перспективным потенциалом для лечения хмл.

Сравнительный анализ экспрессии мкРНК-196Ь показал, что у больных с высоким уровнем экспрессии гена BCR-ABL экспрессия данной мкРНК

136 была в 2 раза ниже, чем у здоровых индивидов. В то же время экспрессия мкРНК-196Ь у больных с полным молекулярным ответом отличалась незначительно от уровня экспрессии у здоровых индивидов. Анализ уровня экспрессии мкРНК-196Ь показал, что в клеточной линии XMJI К562 экспрессия данной мкРНК была в 2,3 раза выше по сравнению с экспрессией у здоровых индивидов. Можно предположить, что мкРНК-196Ь, у которой есть соответствующий сайт узнавания на 3' конце транскриптов BCR-ABL, обладает потенциальной возможностью ингибирования экспрессии гена BCR-ABL, однако механизмы действия мкРНК-196Ь в различных раковых клетках до сих пор в значительной степени неизвестны.

При изучении экспрессии мкРНК-323 было обнаружено, что у больных с высокой экспрессией химерного гена BCR-ABL уровень экспрессии мкРНК-323 был снижен в 4 раза по сравнению с остальными группами обследованных. Несмотря на важную роль данной мкРНК в процессах вирусной защиты организма, имеется мало данных о роли мкРНК-323 в процессе канцерогенеза.

Известно, что в появлении резистентного к иматинибу фенотипа большую роль играют гены переносчиков лекарственных препаратов.

Несмотря на большое число опубликованных статей, мало известно, какой из этих транспортеров является самым решающим для приобретения резистентности клетками XMJI к иматинибу. При исследовании профиля экспрессии гена ABCG2 в лейкоцитах периферической крови, нами обнаружено статистически значимое повышение уровня его экспрессии у больных XMJI с полным молекулярным ответом (M±se: 2,294±0,3665) по сравнению с группой контроля (р=0,03). У больных с высокой экспрессией гена BCR-ABL уровень мРНК ABCG2 был ниже, чем, у больных с ПМО.

Снижение уровня экспрессии ABCG2 в этой группе больных, возможно, происходит на фоне повышения дозы иматиниба. Резистентный к препарату фенотип может быть первоначально опосредован одним доминантным транспортером, однако, с увеличением дозировки препарата происходит компенсаторное переключение с этого транспортера на дополнительные ABC переносчики, экспрессирующиеся в опухоли. Полученные нами результаты, указывают, что роль изученного гена переносчиков оттока препаратов может быть важна на начальных стадиях резистентности, но после длительного воздействия и для высоких доз ИТК, могут иметь место другие механизмы.

При анализе экспрессии гена переносчика органических катионов hOCTl в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,379±0,3732) и больными XMJI с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:2,492±0,3842) - р=0,01, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом (M±se:2,275±0,3962) - р=0,03. Как и в случае с ABCG2, в клеточной линии К562 наблюдался довольно низкий уровень экспрессии гена hOCT. Вероятно, повышение активности переносчика hOCTl происходит, главным образом, под действием повышающихся концентраций химических агентов во внеклеточной среде. Экспрессия гена hOCTl показала линейный характер зависимости с уровнем экспрессии гена BCR-ABL. Повышение экспрессии гена hOCTl с течением времени, при постоянных дозах препарата предполагает, что анализ уровня экспрессии этого гена у больных XMJI до лечения не будет иметь большой прогностической значимости для терапевтического исхода.

Изменение профиля экспрессии различных протоонкогенов и опухолевых супрессоров играет ключевую роль при развитии онкологических заболеваний. По некоторым данным, ген тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1 вовлечен в развитие раковых заболеваний, однако, сравнительные данные показывают, что в различных клеточных линиях ген PTPN1 может обладать как онкосупрессорными, так и онкогенными свойствами. При анализе экспрессии гена PTPN1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,061±0,08468) и больными

ХМЛ с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:0,7683±0,07513) - р=0,02.

138

Данные, полученные в нашем исследовании, показывают, что у пациентов с XMJ1 ген PTPN1, выполняет онкосупрессорную роль, посредством своей дефосфорилирующей активности. Вероятно, низкая экспрессия PTPN1 у пациентов с XMJ1, на фоне повышения уровня химерного гена BCR-ABL, является одним из факторов развития болезни в сторону прогрессирования. Таким образом, рост экспрессии BCR-ABL у больных со сниженным уровнем PTPN1 является потенциальным механизмом возникновения резистентности к лечению ИТК у больных XMJI.

Кандидатным онкосупрессором, который, возможно, вовлечен в развитие XMJT является ген нейрофиброматоза первого типа NF1. Его абберантная экспрессия показана при развитии многих онкологических заболеваний. Известно, что дети с нейрофиброматозом первого типа имеют 500-кратный риск развития миелоидных лейкозов, в частности XMJ1, по сравнению со здоровыми. У половины из этих больных наблюдается потеря гетерозиготности в гене NF1. С целью выявления роли гена NF1 в развитии XMJI был проведен анализ экспрессии этого гена. При анализе экспрессии гена NF1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой (M±se:l,025± 0,1020) и больными XMJI с высокой экспрессией BCR-ABL (M±se:l,844± 0,2756) - р=0,01, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом (M±se: 1,407± 0,1570) - р=0,02. Повышенная экспрессия гена NF1 у больных XMJI поднимает вопрос о том, является ли повышение уровня экспрессии гена NF1 одним из механизмов защиты раковых клеток.

Таким образом, мутации в киназном домене BCR-ABL являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с XMJI, что подтверждается данными, полученными в нашем исследовании. Тем не менее, очевидно, что в развитии резистентности к лечению препаратами ИТК и прогрессировании XMJI в сторону акселерации и бластного криза могут играть важную роль множество других клеточных,

139 генетических и эпигенетических факторов, которые в совокупности определяют индивидуальное развитие болезни у больных ХМЛ. Полученные нами данные о роли экспрессии мкРНК, генов переносчиков лекарственных препаратов и онкосупрессоров раскрывают некоторые патогенетические аспекты ХМЛ и вносят вклад в общее представление о молекулярно-генетических основах развития данного заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минниахметов, Илдар Рамилевич, Уфа

1. Аксенова Е.В., Крутов A.A., Солдатова И.Н., Ахлынина Т.В., Лапшина H.A., Мисюрин A.B. Стандартизация молекулярной диагностики хронического миелолейкоза // Клиническая онкогематология, 2010, №2, С.160-165.

2. Виноградова О. Ю. Клиническая эволюция хронического миелолейкоза в процессе лечения ингибиторами тирозинкиназ // Автореферат диссертации доктора мед. наук. М., 2011.

3. Виноградова О.Ю., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Организация терапии хронического миелолейкоза. Первый общероссийский регистр больных хроническим миелолейкозом: анализ и перспективы // Гематология и трансфузиология. 2008. - Т. 53, № 5. - С. 54-58.

4. Волкова М.А. Гливек революция в терапии хронического миелолейкоза // Фарматека. -2003. - Т.77, №14. - С. 39-47.

5. Волкова М.А. Клиническая онкогематология: руководство для врачей. -2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина. - 2007. - С.1120.

6. Волкова М.А. Новые возможности в терапии хронического миелолейкоза: дазатиниб // Клиническая онкогематология: фундаментальные исследования и клиническая практика. 2008. - Том 1, №3.-С. 218-226.

7. Воробьев А.И. Лейкозы: проблемы и достижения // Клин, фармакология и терапия. 1995. - Т. 4, № 4. - С. 16-17.

8. Галицкий В.А. Гипотеза о механизме инициации малыми РНК метилирования ДНК de novo и аллельного исключения // Цитология. -2008. 50(4): 277-286.

9. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями населения России и стран СНГ в 2007 г. // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. 2009. - Т. 20, № 3 (прил. 1). - С.52-90.

10. Дубина М.В., Куевда Д.А., Хомякова Т.Е., Цаур Г.А., Куцев С.И., Зарицкий А.Ю. Молекулярный мониторинг эффективности терапии больных хроническим миелолейкозом в России // Современная онкология №4. 2010. - Т. 12. - С. 11-17.

11. П.Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000.-65.-С. 5-33.

12. Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. В кн: Канцерогенез. Москва // Медицина. 2004:125-156.

13. Куцев С.И. Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелоидного лейкоза // Автореферат диссертации доктора мед. наук. -М., 2009.

14. Куцев С.И., Вельченко М.В. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миело лейкоза // Клиническая онкогематология. 2008а. - Т. 1, №3. - С. 190-199.

15. Куцев С.И., Вельченко М.В., Зельцер А.Н. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ // Онкогематология. 2008b. - №4. - С. 17-25.

16. Куцев С.И., Вельченко М.В., Морданов C.B. Роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом // Клиническая онкогематология. 2008с - Т.1, №4. - С. 303-309.

17. Мисюрин A.B., Аксенова Е.В., Крутов A.A. и соавт. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематол трансфузиол. 2007. -2:35-40.

18. Рогаев Е.И., Боринская С.А., Исламгулов Д.В., Григоренко А.П. МикроРНК человека в норме и патологии // Молекулярная биология. -2008. Т.42, №5. - С.751-764.

19. Телегеев Г.Д. и соавт. Роль белка BCR-ABL в лейкозогенезе // Экспериментальная онкология. 1999. - Том 21. - 182-194.

20. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных путей STI 571 (Signal Transductor Inhibitor) новое направление в лечении хронического миелолейкоза // Современная Онкология. - 2001. - Том 3, №2. - С. 46-48.

21. Туркина А.Г., Челышева Е.Ю. Цитогенетический и молекулярный ответ — ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+-хроническим миелолейкозом. Фарматека 2004; 18(95).

22. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня BCR-ABL-транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематол трансфузиология. 2007. - 2:50-51.

23. Четверина Е.В., Четверин А.Б. Наноколонии и диагностика онкологических заболеваний, ассоциированных с хромосомными транслокациями // Успехи биологической химии. 2010. - 50. - С. 387446.

24. Шнайдер Н. А. Нейрофиброматоз 1-го типа: этиопатогенез, клиника, диагностика, прогноз // Международный неврологический журнал. -2007.-№5 (15)-С. 162-168.

25. Abram C.L., Courtneidge S.A. Src family tyrosine kinases and growth factor signaling // Exp Cell Res. 2000. - Vol.254, №1. - P. 1-13.

26. Allan N., Richards S., Shepherd P. et al. Medical Research Council randomized multicenter trial of interferon a nl for chronic myeloid leukemia // Lancet. 1995.-345.- 1392.

27. Baccarani M., Saglio G, Goldman J et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia. Recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. 2006. - Vol.108. -P. 1809- 1820.

28. Baccarani M., Castagnetti F, Gugliotta G, et al. Response definitions and European Leukemianet Management recommendations // Best Pract Res Clin Haematol. 2009. - Vol. 22. - P.331-341.

29. Barnes D.J., Palaiologou D., Panousopoulou E., et al. Bcr-Abl expression levels determine the rate of development of resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia // Cancer Res. 2005. - Vol.65, №19. - P.8912-8919.

30. Berezikov E.et al. Phylogenetic shadowing and computational identification of human microRNA genes // Cell. 2005. - 120:21-24.

31. Biernaux C., Loos M., Seis A., Huez G., Stryckmans P. Detection of major bcr-abl gene expression at a very low level in blood cells of some healthy individuals // Blood. 1995. Vol.86. - P.3118-3122.

32. Bloomston M., Frankel W.L., Petrocca F., et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis // JAMA. 2007. - 297:1901-1908.

33. Borrow J. Guidelines for Mutation Analysis of BCR/ABL Kinase Domain // WMRGL. 2007. - P. 1-32.

34. Bostjancic E., Glavac D. Importance of microRNAs in skin morphogenesis and diseases // Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. 2008. - 17 (3): 95-102.

35. Boyd S.D. Everything you wanted to know about small RNA but were afraid to ask // Lab Invest. 2008. - Vol.88. - P.569-578.

36. Branford S., Hughes T.P., Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics // Br J Haematol. 1999. - Vol.107. - P.587-599.

37. Braun B.S., Shannon K. Targeting Ras in myeloid leukemias // Clin Cancer Res.-2008.- 14:2249-52.

38. Brendel C., Scharenberg C., Dohse M., et al. Imatinib mesylate and nilotinib (AMN107) exhibit high-affinity interaction with ABCG2 on primitive hematopoietic stem cells // Leukemia. 2007. - 21:1267-1275.

39. Brodeur G.M. The NF1 gene in myelopoiesis and childhood myelodysplastic syndromes // N Engl J Med. 1994. - 330:637-638

40. Buchberg A.M., Cleveland L.S., Jenkins N.A., et al. Sequence homology shared by neurofibromatosis type 1 gene and IRA-1 and IRA-2 negative regulators of the Ras cyclic AMP pathway // Nature. 1990. - 347:291-294.

41. Burger H, vanTol H, Boersma AW, et al. Imatinib mesylate (STI571) is a substrate for the breast cancer resistance protein (BCRP)/ABCG2 drug pump // Blood. 2004. - 104:2940-2942.

42. Cacev T., Radosevic S., Spaventi R., Pavelic K., Kapitanovic S. NF1 gene loss of heterozygosity and expression analysis in sporadic colon cancer // Colon cancer. 2005. - 54:1129-1135.

43. Calabretta B., Perrotti D. The biology of CML blast crisis // Blood. 2004. -Vol.103, №11.- P.4010-4022.

44. Calin G.A. et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2002. - 99:15524-15529.

45. Cawthon RM, Weiss R, Xu GF, et al. A major segment of the neurofibromatosis type 1 gene: cDNA sequence, genomic structure, and point mutations // Cell. 1990. - 62:193-201.

46. Chen C., Zhang Y., Zhang L., Weakley S.M., Yao Q. MicroRNA-196: critical roles and clinical applications in development and cancer // J Cell Mol Med. -2011.- 15(l):14-23.

47. Chen K., Rajewsky N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data // Nature Genetics. 2006. - 38. - P.1452-1456.

48. Cheng, A.M., Byrom, M.W., Shelton, J., Ford, L.P. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis // Nucleic Acids Res. 2005. - 33:1290-1297.

49. Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. Several BCR-ABL kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib // Blood. 2003. - 101(11):4611-4614.

50. Cortes J. Natural history and staging of chronic myelogenous leukemia // Hematol Oncol Clin North Am. 2004. -Vol.18. - P.569-584.

51. Crossman L.C., Druker B.J., Deininger M.W., et al. hOCT 1 and resistance to imatinib // Blood. 2005. - Vol.106, №3. - P. 1133-1134.

52. Danhauser-Riedl S., Warmuth M., Druker B.J., et al. Activation of Src kinases p53/561yn and p59hck by p210bcr/abl in myeloid cells // Cancer Res. 1996. - Vol.56, №1. - P.3589-3596.

53. Eckford PD, Sharom FJ. ABC efflux pump-based resistance to chemotherapy drugs // Chem Rev. 2009. - 109:2989-3011.

54. Eis P.S. et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2005. - 102:3627-3632.

55. Faber J., Gregory R., Armstrong S. Linking miRNA Regulation to BCR-ABL Expression: The Next Dimension // Cancer Cell. 2008. - Vol.13. - P.467-469.

56. Fausel C. Targeted Chronic Myeloid Leukemia Therapy: Seeking a Cure // J Manag Care Pharm. 2007. - Vol.13, №8. - Suppl S-a:S8-S12.

57. Fukada T.,Tonks N.K. The reciprocal role of Egr-land Sp family proteins in regulation of the PTP1B promoter in response to the p210 Bcr-Abl oncoprotein-tyrosine kinase // JBiol Chem. 2001. - 276:25512:9.

58. Furukawa T., Sunamura M., Horii A. Molecular mechanisms of pancreatic carcinogenesis // Cancer Sci. 2006. - 97:1-7.

59. Gillet J.P., Efferth T., Remacle J. Chemotherapy-induced resistance by ATP-binding cassette transporter genes // Biochim Biophys Acta. 2007. -1775:237-262.

60. Goldman J., Gordon M. Why do chronic myelogenous leukemia stem cells survive allogeneic stem cell transplantation or imatinib: does it really matter? // Leuk. Lymphoma. 2006. - Vol.47. - P. 1-7.

61. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia-still a few questions // Exp Hematol. -2004.-32:2-10.

62. Gorre M., Mohammed M., Ellwood K. et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification // Science. 2001. - 293:876-880.

63. Graham S.M., Jorgensen H.G., Allan E., et al. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro // Blood. 2002. - Vol.99, №1. - P.319-325.

64. Griffiths-Jones S.et al. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature // Nucleic Acids Res. 2006. - 34:140-144.

65. Gromicho M., et al. Development of imatinib and dasatinib resistance: dynamics of expression of drug transporters ABCB1, ABCC1, ABCG2, MVP, and SLC22A1 // Leukemia & Lymphoma. 2011. - 52 (10): 1980-1990.

66. Guilhot F., Chastang C., Michallet M. et al. Interferon-alfa 2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia // N Engl J Med. 1997.-337.-223.

67. Haj F.G., Verveer P.J., Squire A., Neel B.G., Bastiaens P.I. Imaging sites of receptor dephosphorylation by PTP1B on the surface of the endoplasmic reticulum // Science. 2002. - 295. - 1708-1711.

68. Hao Y. et al. Tumour-suppressor activity of H19 RNA // Nature. 1993. -365:764-767.

69. Hehlmann R., Heimpel H., Hasford J., et al. Randomized comparison of busulfan and hydroxyurea in chronic myelogenous leukemia: prolongation of survival by hydroxyurea // Blood. 1993. - Vol. 82. - P. 398.

70. Heisterkamp N., Stam D., Groffen J. et al. Structural organization of the bcr gene and its role in the Ph' translocation // Nature. 1985. - 315:758-761.

71. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S., et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia. 2002. -Vol.16, №11.-P.2190-2196.

72. Hochhaus A., O'Brien S.G., Guilhot F., et al. Six-year follow-up of patients receiving imatinib for the first-line treatment of chronic myeloid leukemia // Leukemia. 2009. - 23:1054-1061.

73. Hornstein E., Mansfield J.H., Yekta S., et al. The microRNA miR-196 acts upstream of Hoxb8 and Shh in limb development // Nature. 2005. - 438: 671-674.

74. Houghton P.J., Germain G.S., Harwood F.C., et al. Imatinib mesylate is a potent inhibitor of the ABCG2 (BCRP) transporter and reverses resistance to topotecan and SN-38 in vitro // Cancer Res. 2004. - 64:2333-2337.

75. Hu Y., Liu Y., Pelletier S., et al. Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia // Nat Genet. 2004. - Vol.36, №5. - P.453-461.

76. Hughes T., Branford S. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia // Blood Reviews. 2006. -20:29-41.

77. Hui A.B., Shi W., Boutros P.C., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues // Lab Invest. -2009. 89:597-606.

78. Jha C.B., Kucheria K., Choudhary V.P. Diagnostic role of conventional cytogenetics and fluorescence in situ hybridization (FISH) in chronic myeloid leukemia patients // Kathmandu Univ Med J (KUMJ). 2006. - Vol.4, №2. -P.171-175.

79. Johansson B., Fioretos T., Mitelman F. Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia // Acta Haematol. 2002. - Vol.107, №2. - P.76-94.

80. Jordanides N.E., Jorgensen H.G., Holyoake T.L., et al. Functional ABCG2 is overexpressed on primary CML CD34+ cells and is inhibited by imatinib mesylate // Blood. 2006. - Vol. 108, №4. - P.1370-1373.

81. Kaeda S.A., Chase A., Goldman J.M. Cytogenetic and molecular monitoring of residual desease in chronic myeloid leukemia // Acta Hematol. 2002. -107:64-75.

82. Kantarjian H., O'Brien S., Shan J., et al. Cytogenetic and molecular responses and outcome in chronic myelogenous leukemia: need for new response definitions // Cancer. 2008. - Vol. 112 (4): 837-845.

83. Kawasaki H., Taira K. MicroRNA-196 inhibits HOXB8 expression in myeloid differentiation of HL60 cells // Nucleic Acids Symp Ser. 2004. - 48:211212.

84. Komarova N.L., Wodarz D. Effect of cellular quiescence on the success of targeted CML therapy // PLoS ONE. 2007. - Vol.2, №10. - E990.

85. Konopka J.B., Watanabe S.M., Witte O.N. An alteration of the human c-abl protein in K562 leukemia cells unmasks associated tyrosine kinase activity // Cell. 1984. Vol.1, №37. - P.1035-1042.

86. Koyama N., Koschmieder S., Tyag S. et. al. Inhibition of Phosphotyrosine Phosphatase IB Causes Resistance in. BCR-ABL-Positive Leukemia Cells to the ABL Kinase Inhibitor STI571. Clin Cancer Res 2006; 12:2025-2031

87. Krumlauf R. Hox genes in vertebrate development // Cell. 1994. - 78: 191-201.

88. Kurzrock R., Bueso-Ramos C.E., Kantarjian H., Freireich E., Tucker S.L., Siciliano M., et al. BCR rearrangement-negative chronic myelogenous leukemia revisited // J Clin Oncol. 2001. Vol.19. - P.2915-2926.

89. Kurzrock R., Guttrman J.U., Talpaz M. The molecular genetics of Philadelphia chromosome-positive leukemias // N. Engle. J. Med.-1988.-Vol.319.- P.990-8.

90. Kurzrock R., Kantarjian H., Druker B., Talpaz M. Philadelphia chromosome-positive leukemias: from basic mechanisms to molecular therapeutics // Annals of internal medicine. 2003. - Vol.138. - P.819-830.

91. Lage H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem // Cell Mol Life Sei. 2008. - 65:3145-3167.

92. Lai EC. et al. Computational identification of Drosophila microRNA genes // Genome Biol. 2003. - 4, R42.

93. LaMontagne K.R. Jr., Hannon G.,Tonks N.K. Protein tyrosine phosphatase PTP1B suppresses p210 bcrabl-induced transformation of rat-1 fibroblasts and promotes differentiation of K562 cells // Proc Natl Acad Sei USA. 1998. -95:14094:9.

94. LaMontagne K.R., Jr., Flint AJ, Franza BR, Jr., Pandergast AM,Tonks NK. Protein tyrosine phosphatase IB antagonizes signalling by oncoprotein tyrosine kinase p210 bcr-abl in vivo // Mol Cell Biol. 1998. - 18:2965:75.

95. LaMontagne K.R., Jr., Hannon G., Tonks N.K. Protein tyrosine phosphatase PTP1B suppresses p210 bcr-abl-induced transformation of rat-1 fibroblasts and promotes differentiation of K562 cells // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. -1998. 14094-14099.

96. Larson R. A., Druker B. J., Guilhot F. et al. Imatinib pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study // Blood. 2008. - 111:4022-4028.

97. Laurent E., Talpaz M., Kantarjian H., Kurzrock R. The BCR gene and Philadelphia chromosome-positive leukemogenesis // Cancer Res. 2001. -Vol.61.-P.2343-2355.

98. Le Coutre P., Kreuzer K.A., Pursche S., et al. Pharmacokinetics and cellular uptake of imatinib and its main metabolite CGP74588 // Cancer Chemother Pharmacol. 2004. - Vol.53, №4. - P.313-323.

99. Lepper E.R., Nooter K., Verweij J., Acharya M.R., Figg W.D., Sparreboom A. Mechanism of resistance to anticancer drugs: the role of the polymorphic ABC transporters ABCB1 and ABCG2 // Pharmacogenomics. 2005. - Vol.6.- P.115-138.

100. Lessard L., Stuible M., Tremblay M.L. The two faces of PTP1B in cancer // Biochim Biophys Acta. 2010. - 1804(3):613-619.

101. Li Y., O'Connel P., Huntsman H., et al. Genomic organisation of the neurofibromatosis 1 gene (NF1)// Genomics. 1995. -25:9-18.

102. Li Y., Zhang M., Chen H., et al. Ratio of miR-196s to HOXC8 messenger RNA correlates with breast cancer cell migration and metastasis // Cancer Res. -2010.-70:7894-904.

103. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2A(-AACt) Method // METHODS.- 2001. V.25. -P.402-408

104. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J., Witte O.N. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. -1990. -Vol.247. P. 1079-1082.

105. Machova Polakova K., Lopotova T., Klamova H., Burda P., Trneny M., Stopka T., Moravcova J. Expression patterns of microRNAs associated with CML phases and their disease related targets // Mol Cancer Res. 2009. -7(10):1693-1703.

106. Mahon F.X., Hayette S., Lagarde V., et al. Evidence that resistance to nilotinib may be due to BCR-ABL, Pgp, or Src kinase overexpression // Cancer Res. 2008. - 68:9809-9816.

107. Marin D., Marktel S., Szydlo R. et al. Survival of patients with chronic phase chronic myeloid leukemia after failed response to interferon-alfa // Lancet. 2003. - 362:617-619.

108. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M. N.Y.; Haman press. 1984. -V.2. - P.31-34.

109. Mayer B.J., Baltimore D. Mutagenic analysis of the roles of SH2 and SH3 domains in regulation of the Abl tyrosine kinase // Mol Cell Biol. 1994. -14:2883.

110. Melo J.V. Imatinib and ABCG2: who controls whom? // Blood. 2006. -108:1116-1117.

111. Metzler M. et al. High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma // Genes Chromosomes Cancer. 2004. - 39: 167-169.

112. Michael M.Z. et al. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia // Mol.Cancer Res. 2003. - 1:882-891.

113. Miething C., Mugler C., Grundler R., et al. Phosphorylation of tyrosine 393 in the kinase domain of Bcr-Abl influences the sensitivity towards imatinib in vivo // Leukemia. 2003. - 17:169:9.

114. Momparler R.L., Cote S., Eliopoulos N. Pharmacological approach for optimization of the dose schedule of 5-Aza-2'-deoxycytidine (Decitabine) for the therapy of leukemia // Leukemia. 1997. - Vol.11. - P.175-180.

115. Nagar B., Bornmann W.G., Pellicena P., et al. Crystal structures of the kinase domain of c-Abl in complex with the small molecule inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571) // Cancer Res. 2002. - Vol.62, №15. -P.4236-4243.

116. Nishimura T., et al. Total number of genome alterations in sporadic gastrointestinal cancer inferred from pooled analyses in the literature, Tumour Biol. 29 (2008) 343-350.

117. Nishizaki T., Ozaki S., Harada K., Ito H., Arai H., Beppu T., Sasaki K. Investigation of genetic alterations associated with the grade of astrocytic tumor by comparative genomic hybridization // Genes Chromosomes Cancer. 1998.-21:340-346.

118. Nowell P.C. Discovery of the Philadelphia chromosome: a personal perspective // Journal of Clinical Investigation. 2007. - Vol. 117 (8). - P. 2033-2035.

119. Nowell P.C., Hungerford, D.A. A minute chromosome in chronic granulocytic leukemia // Science. 1960. - Vol. 132. - P. 1488-1501.

120. O'Brien SG, Guilhot F, Larson RA et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia // N Engl J Med. 2003. - 348 (11): 994-1004.

121. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia // Blood 2007. 110(7):2242-9.

122. Okabe S., Tauchi T., Ohyashiki K. Characteristics of dasatiniband imatinib-resistant chronic myelogenous leukemia cells // Clin Cancer Res. 2008. -14:6181-6186.

123. Pasternak G., Hochhaus A., Schultheis B., Hehlmann R. Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1998. - Vol. 12. - P.643-60.

124. Pear W.S., Miller J.P., Xu L., Pui J.C., Soffer B. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving p210 bcr-abl-transduced bone marrow // Blood. 1998. -Vol.92. -P.3780-3792.

125. Pehlivan M., Sercan Z., Sercan H.O. sFRPl promoter methylation is associated with persistent Philadelphia chromosome in chronic myeloid leukemia // Leukemia Research. 2008. - Vol.33, №8. - P.1062-1067.

126. Picard S., Titier K., Etienne G. et al. Though imatinib plasma levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukemia // Blood. 2007. - Vol. 109:3496-3499.

127. Pushparaj P.N., Melendez A.J. Short interfering RNA (siRNA) as a novel therapeutic // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2006. - Vol.33. - P.504-510.

128. Qian J., Wang Y., Lin J., Yao D., Xu W., Wu Ch. Aberrant methylation of the death-associated protein kinase 1 (DAPK1) CpG island in chronic myeloidleukemia // European Journal of Haematology. 2008. - Vol.82. - P. 119-123.158

129. Quintas-Cardama A., Cortes J. Molecular biology of bcr-abll-positive chronic myeloid leukemia // Blood. 2009. - Vol.113, №8. - P. 1619 - 1630.

130. Quintas-Cardama A., Kantarjian H., Cortes J. Mechanisms of Primary and Secondary Resistance to Imatinib in Chronic Myeloid Leukemia // Cancer Control. 2009. - Vol.16, №2. - P. 122-131

131. Ramkissoon S.H., Mainwaring L.A., Ogasawara Y., Keyvanfar K., McCoy J.P. Jr, Sloand E.M., Kajigaya S., Young N.S. Hematopoietic-specific microRNA expression in human cells // Leukemia Research. 2006. -30:643-647.

132. Richards S.M., Apperley J., Carella A., et al. Autografting in chronic myeloid leukemia: a metaanalysis of six randomized trials // Haematologica. -2005. -Vol. 90 (Suppl 2): 152-3

133. Roeder I., Horn M., Glauche I., et al. Dynamic modeling of imatinib treated chronic myeloid leukemia: functional insights and clinical implications // Nat Med. 2006. - Vol.12, №10. - P.l 181-1184.

134. Roman-Gomez J., Jimenez-Velasco A., Agirre X., Castillejo J. A., Navarro G. Epigenetic regulation of PRAME gene in chronic myeloid leukemia // Leukemia Research. 2007. - Vol.31. - P. 1521-1528.

135. S. Brown-Shimer, K.A. Johnson, J.B. Lawrence, C. Johnson, A. Bruskin, N.R. Green, D.E. Hill, Molecular cloning and chromosome mapping of the human gene encoding protein phosphotyrosyl phosphatase IB // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. - 5148-5152.

136. Sanchez-Beato M., Sanchez-Aguilera A., Piris M.A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas // Blood. 2003. - 101:1220-1235.

137. Savona M., Talpaz M. Getting to the stem of chronic myeloid leukaemia // Nat Rev Cancer. 2008. - Vol.8. - P.341-350.

138. Schaid D.J. The complex genetic epidemiology of prostate cancer // Hum. Mol. Genet.-2004.- 13.-R103-R121.

139. Schimanski C.C., Frerichs K., Rahman F., et al. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells // World J Gastroenterol. 2009. - 15:2089-2096.

140. Schlesselman J., Case-control studies. Design, conduct, analysis // New York, Oxford: Oxford University Press. 1982. - P.58-96.

141. Sessions J. Chronic Myeloid Leukemia in 2007 // J Manag Care Pharm. -2007. Vol.13. - Suppl S-a: S4-S7.

142. Shafi G., Jamil K., Kapley A.et al.RNAi as a novel therapeutic platform technology for oncological solutions // Biotechnology and Molecular Biology Review. 2008. - 4(4):55-70.

143. Shannon K.M., O'Connell P., Martin G.A., et al. Loss of the normal NF1 allele from the bone marrow of children with type 1 neurofibromatosis and malignant myeloid disorders. -N Engl J Med. 1994. - 330:597-601.

144. Sharma S.V., Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes Dev. - 2007. - 21:3214-3231.

145. Shimkin M.B., Mettier S.R., Bierman H.R. Myelocytic leukemia: An analysis of incidence distribution and fatality // Ann Intern Med. 1951. -Vol. 35.-P.194.

146. Side L., Taylor B., Cayouette M., Conner E., Thompson P., Luce M.,

147. Shannon K. Homozygous inactivation of the NF1 gene in bone marrow cells160from children with neurofibromatosis type 1 and malignant myeloid disorders // N Engl J Med. 1997. - 336:1713-1720.

148. Sokal J.E., Leong S.S., Gomez G.A. Preferential inhibition by cytarabine of CFU-GM from patients with chronic granulocytic leukemia // Cancer. 1987. -99.- 197.

149. Song L., Liu H., Gao S., Jiang W., Huang W. Cellular microRNAs inhibit replication of the H1N1 influenza A virus in infected cells // J Virol. 2010. -84(17):8849-8860.

150. Soverini S., Martinelli G., Amabile M., et al. Denaturing-HPLC-based assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to Imatinib // Clin Chem. 2004. - 50:1205-1213.

151. Srikantan V., et al. PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer // Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. - 97:12216-12221.

152. Stanglmaier M., Warmuth M., Kleinlein I., et al. The interaction of the Bcr-Abl tyrosine kinase with the Src kinase Hck is mediated by multiple binding domains // Leukemia. 2003. - Vol.17, №2. - P.283-289.

153. Talpaz M., Silver R.T., Druker B.J, et al. Imatinib induces durable hematologic and cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: Results of a phase 2 study // Blood. 2002. - 99. -1928.

154. Tang C., Schafranek L., Watkins D.B., Parker W.T., Moore S., Prime J.A., White D.L., Hughes T.P. Tyrosine kinase inhibitor resistance in chronic myeloid leukemia cell lines: investigating resistance pathways // Leuk Lymphoma. 2011. - 52(11):2139-47.

155. Tanzer A., Amemiya C.T., Kim C.B., et al. Evolution of microRNAs located within Hox gene clusters // J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2005. - 304: 75-85.

156. Thomas J., Wang L., Clark R.E., et al. Active transport of imatinib into and out of cells: implications for drug resistance // Blood. 2004. - Vol.104, №12. -P.3739-3745.

157. Uhm K., Lee E.S., Lee Y.M., et al. Differential Methylation Pattern of ID4, SFRP1, and SHP1 between Acute Myeloid Leukemia and Chronic Myeloid Leukemia // J Korean Med Sci. 2009. - Vol.24. - P.493-497.

158. Upadhyaya M. et al. NF1 gene structure and NF1 genotype/phenotype correlations // Neurofibromatoses. Edited by D Kaufmann. Basel, Karger. -2008.-P. 46-62.

159. Van Etten R.A. Cycling, stressed-out and nervous: cellular functions of c-Abl // Trends Cell Biol. 1999. - 9:179.

160. Venturini L., Battmer K., Castoldi M., Schultheis B., Hochhaus A., Muckenthaler M.U., Ganser A., Eder M., Scherr M. Expression of the miR-17-92 polycistron in chronic myeloid leukemia (CML) CD34+ cells // Blood 2007.- 109:4399-405.

161. Wang Y.X., Zhang X.Y., Zhang B.F., et al. Initial study of microRNA expression profiles of colonic cancer without lymph node metastasis // J Dig Dis.-2010.- 11:50-54.

162. Wendel H.G., de Stanchina E., Cepero E., et al. Loss of p53 impedes the antileukemic response to BCR-ABL inhibition // Proc Natl Acad Sci U S A. -2006. Vol.103, №19. - P.7444-7449.

163. White, D.L. et al. OCT-1-mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib (AMN107): reduced OCT-1 activity is the cause of low in vitro sensitivity to imatinib // Blood. 2006. -108:697-704.

164. Wilda M., Fuchs U., Wossmann W., Borkhardt A. Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi) // Oncogene. -2002. Vol.21. - P.5716 - 5724.

165. Witts L.J., et al. Report of the Medical Research Council's Working Party for Therapeutic Trials in Leukemia: Comparison of radiotherapy and busulphan therapy // Br Med J. 1968. - Vol. 1. - P. 201.

166. Woltering J.M., Durston A.J. MiR-10 represses HoxBla and HoxB3a in zebrafish // PLoS ONE. 2008. - 3:el396.

167. Woodford-Thomas T.A., Rhodes J.D., Dixon J.E. Expression of a protein tyrosine phosphatase in normal and v-src-transformed mouse 3T3 fibroblasts // J. Cell Biol. 1992.- 117:401-414.

168. Wu J., Meng F., Lu H., et al. Lyn regulates BCR-ABL and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-Cbl protein stability in imatinib-resistant chronic myelogenous leukemia cells // Blood. 2008. - Vol.111, №7. - P.3821-3829.

169. Yekta S., Shih I.H., Bartel D.P. MicroRNAdirected cleavage of HOXB8 mRNA // Science. 2004. - 304: 594-596.

170. Yi R., Fuchs E. MicroRNA-mediated control in the skin // Cell Death Differ. -2010.-17:229-235.

171. Yi R., Poy M.N., Stoffel M. et al. A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'sternness'//Nature. 2008. - 452:225-229.

172. Zhang B.H. et al. Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact // Dev.Biol. 2006. - 289:3-16.

Информация о работе

Минниахметов, Илдар Рамилевич
кандидата биологических наук
Уфа, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетическое исследование хронического миелолейкоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы