Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль аномалий гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль аномалий гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом"

На праеаі рукописи

и

Морданов Сергей Викторович

РОЛЬ АНОМАЛИЙ ГЕНА ВСЯ-АВЬ В РАЗВИТИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 МАЙ 2013

Москва-2013

005058568

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Куцев Сергей Иванович

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Шатохин Юрий Васильевич

Официальные оппоненты:

Писарев Владимир Митрофаиович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского" Российской Академии медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов критических состояний

Челышева Екатерина Юрьевна, кандидат медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение

"Гематологический научный центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации, старший научный сотрудник научно-клинического отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный медицинский университет имени Н.И.Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 2013г. в часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « >> ¿£¿//¿¿'/¿9 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ^

ученой степени доктора наук, - /

доктор медицинских наук, профессор ^^^^ХКнченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В терапии хронического миелоидного лейкоза (XMJI) препаратами группы ингибиторов тирозинкиназ достигнуты впечатляющие успехи, оказавшие существенное влияние на развитие целенаправленной терапии онкологических заболеваний. Исследования молекулярной биологии ХМЛ, разработка таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназ, развитие системы мониторинга эффективности терапии, молекулярно-биологический анализ механизмов резистентности по сути явились моделью для разработки современных принципов лечения лейкозов и солидных опухолей.

Первым препаратом таргетной терапии XMJI стал иматиниб. Наиболее известным клиническим исследованием безопасности и эффективности иматиниба по сравнению с интерфероном в лечении ХМЛ является Международное рандомизированное исследование IRIS, результаты которого показали беспрецедентное превосходство иматиниба (Druker B.J. et al., 2006). После 6 лет терапии иматинибом пациентов в хронической фазе ХМЛ их общая выживаемость составила 88%, бессобытийная выживаемость - 83%, выживаемость без прогрессии в фазу акселерации и бластный криз - 93% (Hochhaus A. et al., 2007).

Однако, несмотря на доказанную безопасность и безусловную эффективность иматиниба в качестве терапии ХМЛ первой линии после 5 лет терапии лишь около 2/3 общего числа пациентов достигают и удерживают полный цитогенетический ответ (O'Brien S.G. et al., 2008; de Lavallade H. et al., 2008). Таким образом, клиническая резистентность к терапии иматинибом развиваются у меньшинства пациентов с ХМЛ, но все же в достаточно высоком проценте случаев. В связи с этим исследования молекулярных причин резистентности и поиск путей возможного контроля над механизмами резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с ХМЛ остается актуальной проблемой.

Одной из основных причин резистентности ХМЛ к терапии таргетными препаратами рассматриваются аномалии гена BCR-ABL: мутации киназного домена гена BCR-ABL (Roche-Lestienne С. et al., 2002; Shah N.P. et al., 2002), приводящие к конформационным изменениям BCR-ABL тирозинкиназы и неэффективности ингибиторов, а также появление дополнительных копий (амплификации) гена BCR-ABL (de Lavallade H.et al., 2008), обусловливающих увеличение синтеза аномальной тирозинкиназы.

Однако, если о роли мутаций в развитии приобретенной резистентностии накопилось довольно много данных за последние несколько лет (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002), то частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности остаются малоизученными. Также ограниченны и противоречивы данные литературы о роли амплификации гена BCR-ABL в развитии вторичной резистентности к

иматинибу, не изучены влияния количества копий гена ВСН-ЛВЬ и величины клона с амплификацией ВСЯ-АВЬ на развитие резистентности к терапии ИТК.

Цель исследования - оценить роль ВСЯ-АВЬ зависимых механизмов, обусловленных мутациями гена ВСЯ-АВЬ и его амплификацией в формировании резистентности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом.

Задачи исследования

1. Определить частоту и спектр мутаций участка гена ВСЯ-АВЬ, кодирующего киназный домен 5СЛ-Л51-тирозинкиназы (Р-петля, га-домен, С-домен, А-петля), у больных ХМЛ с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом.

2. Оценить влияние мутаций гена ВСЯ-АВЬ на развитие рефрактерности и приобретенной резистентности к иматинибу.

3. Выявить частоту амплификации гена ВСЯ-АВЬ в опухолевых клетках у больных ХМЛ с резистентностью к терапии иматинибом.

4. Оценить значимость амплификации гена ВСЯ-АВЬ на формирование первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

Новизна результатов исследования

Впервые проведена комплексная оценка значения амплификации и мутаций гена ВСЯ-АВЬ в формировании резистентности к терапии иматинибом на большой выборке пациентов. Определен спектр мутаций (27 миссенс мутаций), являющихся причиной рефрактерности терапии иматинибом, 70,4% из которых находятся в локусе, кодирующем Р-петлю. Оценена роль амплификации гена ВСЯ-АВЬ в развитии первичной резистентности к терапии иматинибом. Впервые определено влияние величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ, на развитие резистентности к терапии иматинибом. Впервые оценено значение количества копий амплфицированного гена ВСЯ-АВЬ в развитии резистентности к терапии ХМЛ иматинибом.

Практическая значимость

Результаты исследования показали необходимость проведения не только анализа мутаций, но и амплификации гена ВСЯ-АВЬ в случаях выявления резистентности к терапии иматинибом, поскольку амплификация гена ВСЯ-АВЬ является одной из причин неудач терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Наличие клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ является фактором неблагоприятного прогноза ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ в хронической фазе и фазе акселерации вне зависимости от величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ. Показано, что наличие мутаций гена ВСЯ-АВЬ и их локализация влияют на эффективность терапии иматинибом. Выявление аномалий гена ВСЯ-АВЬ (мутаций и амплификации) обусловливает необходимость изменения подходов к терапии ХМЛ

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аномалии гена BCR-ABL являются одними из основных механизмов развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с XMJI и суммарно обнаруживаются более, чем в 50% случаев.

2. Мутации гена BCR-ABL являются основной причиной стойкой резистентности на длительных сроках наблюдения, в отличие от резистентности, обусловленной BCR-ABL независимыми причинами.

3. Вклад амплификации гена BCR-ABL в развитие резистентности к терапии XMJI иматинибом сопоставим с ролью мутаций гена BCR-ABL.

4. Влияние аномалий гена BCR-ABL на эффективность терапии иматинибом у больных XMJI не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL.

5. Длительность периода времени от постановки диагноза XMJI до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификации гена BCR-ABL).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 научно-практических форумах: Основные положения диссертации доложены на Научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг" (Кисловодск, 2009), IV съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), 15th, 16th, 17th Congress of European Hematologists Association (Barcelona 2010, London 2011, Amsterdam, 2012), 7th Scientific Symposium "Improving Research for a Common Future" (Cologne, 2012), I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012).

Публикации

Всего по теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из которых -3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Внедрение результатов в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведении семинаров на кафедре гематологии и трансфузиологии с курсами клинической лабораторной диагностики, генетики и лабораторной генетики ФПК и ППС ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России.

Результаты исследования проведенного Мордановым C.B. внедрены в практическую работу лаборатории медицинской генетики, отделения гематологии клиники ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России, отделений гематологии республиканских, краевых и областных онкологических диспансеров Южного Федерального и Северо-Кавказского Федерального округов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов, сборе первичных данных, проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи. Математическая обработка данных проведена лично соискателем. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнено автором самостоятельно.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики исследования, трех глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (18 источников на русском и 177 на иностранном языках). Работа содержит 27 рисунков и 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Материалом для данного исследования явились клинико-лабораторные данные 368 пациентов (соотношение мужчины/женщины - 167/201) с цитогенетически подтвержденным (РЬ-позитивным) ХМЛ. Критериями включения в исследование пациентов с диагнозом ХМЛ явились: наличие хронической фазы или фазы акселерации заболевания, терапия иматинибом в дозе 400-800 мг/сут., длительность терапии иматинибом более 18 месяцев (без учёта предлеченности и длительности заболевания до назначения иматиниба). Критериями исключения - терапия ингибиторами тирозинкиназ II поколения. Медиана длительности терапии составила 30 месяцев (18-120 месяцев).

В течение первых трех лет терапии иматинибом мониторинговые цитогенетические и молекулярно-генетические исследования выполнялись каждые 6 месяцев после начала приема иматиниба. В дальнейшем исследования выполнялись 1 раз в 12 месяцев.

В работе использовались критерии цитогенетического и молекулярного ответов (табл.1), а также критерии оптимального, субоптимального и неудовлетворительного ответов (табл. 2) на терапию ХМЛ ингибиторами тирозиникназ, предложенные Европейским обществом по лечению лейкозов -ЕЬИ (М. Вассагаш е1 а!., 2009).

Таблица 1. Критерии цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом

Ответ на терапшо | Критерии определения

Цитогенетический ответ

Полный цитогенетический ответ (ПЦО) 0% Ph+клеток КМ

Частичный цитогенетический ответ (ЧЦО) <35% Ph+ клеток КМ

Малый цитогенетический ответ (МЦО) 36-65 % Ph+ клеток КМ

Минимальный цитогенетический ответ (МинЦО) 66-95 % Ph+ клеток КМ

Отсутствие цитогенетического ответа (ОЦО) >95% Ph+ клеток КМ

Молекулярный ответ

Полный молекулярный ответ (ПМО) Транскрипт BCR-ABL не определяется

Большой молекулярный ответ (БМО) Низкий уровень экспресии: отношение уровня транскрипта BCR-ABL к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) менее 0,1% (IS)

Отсутствие большого молекулярного ответа (ОБМО) Умеренная экспрессия гена BCR-ABL: значение уровня транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) от 0,1 % до 1,0% Высокий уровень экспрессии: уровень транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) > 1%

Таблица 2. Критерии отсутствия ответа, субоптимального и оптимального ответов на терапию ХМЛ иматинибом

Время терапии Отсутствие ответа Субоптимальный ответ Оптимальный ответ

3 мес. Отсутствие ГО — МЦО (Ph+ 36-65 %)

6 мес. Отсутствие ЦО (РЫ- 96-100%) Отсутствие ЧЦО (Ph+ >35%) ЧЦО (Ph+ <35%)

12 мес. Отсутствие ЧЦО (РЫ- >35%) Отсутствие ПЦО (Ph+0%) ПЦО (Ph+ 0%)

18 мес. Отсутствие ПЦО (РЬ+ 0%) Отсутствие БМО БМО

Обследованные пациенты разделены на 3 группы в зависимости от эффективности лечения иматинибом в соответствии с критериями Е1ЛЧ (табл.3). Первую группу составили пациенты (п=118) с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Вторую группу (п=35) - пациенты с субоптимальным ответом. Третью - пациенты (п=215) с отсутствием ответа на проводимую терапию. В свою очередь в последней группе выделены пациенты с первичной резистентностью к проводимой терапии ХМЛ иматинибом, и пациенты с вторичной резистентностью. В качестве критерия вторичной резистентности (рецидива) рассматривались утрата достигнутого цитогенетического и/или молекулярного ответа, как при оптимальном, так и субоптимальном ответах на терапию иматинибом.

Таблица 3. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование

Группы пациентов Ответ на терапию Число пациентов (муж./жен.) медиана возраста

1 Оптимальный ответ 118 (60/58) 52,7 года

2 Субоптимальный ответ 35 (12/23) 51,6 года

3 Резистентность Первичная 215(95/120) 47,9 года 145 (69/74) 47,5 года

Вторичная 70 (26/44) 49,4 года

Общее количество 368(167/201) 49,6 года

Для выявления мутаций гена BCR-ABL исследовали нуклеотидную последовательности кДНК киназного домена гена BCR-ABL по оригинальной методике с одноэтапной амплификацией. РНК выделяли из образцов крови гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RT-Dx Kit («IPSOGEN»). Амплификация интересующего фрагмента кДНК гена BCR-ABL производилась в один этап. Для амплификации использовались: 5'BCR праймер — F -gaagtgtttcagaagcttctc и 3'ABL праймер - R - tccatgcggtagtccttctc. Амплифицировали участок длиной 1407 пн (в случае варианта Ь2а2 гена BCR-ABL) или 1482 пн (при варианте Ь3а2). Реакция выполнена в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 8 мкл очищенной воды («Sigma»), 5 мкл полученной кДНК, 4 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (12,5мМ MgC12), 0,3 мкл TaqF ДНК-полимераза («АмплиСенс»), 2 мкл смеси dNTP и по 0,5 мкл каждого праймера. Реакцию амплификации проводили по схеме: 94 °С, 10 мин; 45 циклов:94°С - 30 сек, 64°С - 30 сек, 70°С - 120 сек; 70°С - 5 мин.

Результаты оценивались путем проведения горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. Ампликоны кДНК BCR-ABL выделяли из геля и очищали методом сорбции на борсилнкатной мембране с помощью колонок AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit («Axygen»), Реакцию секвенирования проводили с помощью наборов Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter») и праймеров собственного дизайна. После проведения реакции, продукты ее очищались и подвергались капиллярному электрофорезу с использованием генетического анализатора Beckman Coulter CEQ-8000. Анализ нуклеотидной последовательности и поиск мутаций проводился при помощи программного обеспечении CEQ-8000 Genetic Analysis System v.6.0.75 («Beckman Coulter»). Референтная последовательность ДНК, мРНК гена ABL, а также аминокислотная последовательность ABL-тирозинкиназы получена из баз данных «The National Center for Biotechnology Information» (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (U.S.Department of Health and Human Services, http://vvvvw.nih.gov/).

Для определения дополнительных копий гена BCR-ABL проводили молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH). Для определения слитного гена BCR-ABL использовались гнбридизационные пробы к локусам 9q34 (ABL) и 22ql 1 (BCR) Vysis® LSI® BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe («Abbott»). Пробоподготовка и исследование проводилось согласно протоколу производителя. Анализу подвергались не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. При необходимости, в случае обнаружения менее 2-х ядер с искомой аномалией на 200 проанализированных, число анализируемых ядер увеличивали в 3-5 раз (до 600-1000 интерфазных ядер), с целью подтверждения наличия аберрации и уточнения величины [amp(BCR-ABL)+] клона.

Процедура статистической обработки полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и электронных таблиц MS Excel 2007 - 2010. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине. Анализ включал определение медианы возраста, длительности терапии иматинибом, длительности предшествующей иматинибу терапии, выживаемости (общей и безрецидивной) для каждой группы наблюдения, определение частоты мутаций и амплификации гена BCR-ABL, в зависимости от фазы заболевания и вида резистентности, а также изменение указанной частоты от длительности рефрактерного течения. Методом множительных оценок Каплана-Мейра проведен анализ вероятности достижения большого, полного цитогенетического и большого молекулярного ответов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций киназного домена гена BCR-ABL, а также в зависимости от появления дополнительных копий BCR-ABL в исследованных группах. Проведен дискриминантный анализ позволяющий выделить признаки, в наибольшей степени ответственные за различия между группами исследованных пациентов. Проверка соответствия изучаемых данных нормальному распределению проведена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерий Фишера и у\ Для изучения связи изучаемых показателей использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона (г), а также непараметрические методы корреляционного анализа Спирмена (г).

Исследования проводились в течение 5 лет (2007 - 2012гг.) на базе лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние мутаций киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с ХМЛ к терапии иматинибом.

Для выяснения роли мутаций гена BCR-ABL в развитии невосприимчивости к терапии ХМЛ иматинибом проведено определение нуклеотидной последовательности киназного домена гена BCR-ABL у 104 больных ХМЛ (56 мужчин и 48 женщин) с первичной и вторичной резистентностью, из которых в хронической фазе заболевания находилось 80 человек, в фазе акселерации - 24 человека. Мутации гена BCR-ABL обнаружены у 42 больных (21 - муж., 21 - жен.) из 104, что составило 40,4% от всех изученных резистентных случаев. При этом в группе пациентов находящихся в хронической фазе ХМЛ мутации киназного домена обнаружены у 28 (соотношение мужчин/женщин - 15/13) человек из 80, что составило 35,0% (рис.1).____

ХРОНИЧЕСКАЯ ФАЗА ФАЗА АКСЕЛЕРАЦИИ

мутации не обнаружены мутации не обнаружены

65,0% \ / : ; '' / ■■■ . - ;.!fik

С.." J ^шмимши;т-п;" Ы^? ШШш

35,0% 58 3%

мутации BCR-ABL мутации BCR-ABL

Рис. 1. Частота обнаружения мутаций у пациентов резистентных к терапии иматинибом в зависимости от фазы заболевания.

В группе пациентов находящихся в фазе акселерации мутации обнаружены у 14 (соотношение мужчин/женщин - 6/8) из 24 человек - 58,3%. Выявленные различия в частоте обнаружения мутаций в разных фазах заболевания статистически достоверны (р=0.0221). Различия по полу достоверными не являются (р=0.2585) (рис.1).

Среди 68 пациентов (38 мужчин и 30 женщин), не достигших к 18 месяцам полного цитогенетического ответа, что соответствует понятию первичной резистентности или рефрактерное™, мутации обнаружены у 23 (13 мужчин и 10 женщин), что составляет 33,8% (рис.2).

Из 36 пациентов (18 мужчин и 18 женщин) с вторичной резистентностью, которым проведено аналогичное исследование, мутации выявлены у 19 (10 мужчин и 9 женщин) (52,8%). Выявленная разница в частоте встречаемости мутаций внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически достоверна (р=0.0317). Различия по тендерному признаку не достоверны (р=0.4276).

РЕФРАКТЕРНОСТЬ

мутации не обнаружены

66,2%

23 33,8%

мутации BCR-A8L

ВТОРИЧНАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ

мутации не обнаружены

мутации BCR-ABL

Рис.2. Частота обнаружения мутаций киназного домена BCR-ABL в зависимости от типа резистентности к терапии иматинибом.

Среди пациентов с первичной резистентностью обнаружены 27 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене АВЬтирозинкиназы, которые являются причиной неэффективности терапии иматинибом согласно данным литературы (O'Hare Т. et al., 2005): M244V/I (5), L248V (5), G250E (3), Q252E/L(2), Y253H(2), G255E/V (2), F31 IL (1), ТЗ151 (1), M351T(2), F359I (1), H396R (1), F401L (1), Y435C(1) (рис.3). В 6 случаях в опухолевых клетках обнаружены по 2 мутации гена BCR-ABL.

Проведенный анализ показал, что большая часть мутаций находятся в локусе, кодирующем Р-петлю. Так, в этом участке обнаружено 19 (70,4%) мутаций из 27 (рис.3).

0 1Л , " " S ^ х >..........................................5............................................... u N m «л ■и m Н г?? £2 — ее . cj 1 N N N !> ^ ¿Б Н ш 1 о >- ш.......................zi... ~..... ^ in äs ri й

II ; ........... : E 5 г?

III L.. Ii iii

р IB C . A ICZZ

Рис.3. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена ВСЯ-АВЬ, кодирующих Р-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (1В), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена ВСЯ-АВЬ тирозинкиназы у пациентов с первичной резистентностью.

В структуре АВЬ-тирозинкиназы имеются 2 гибкие петлевые структуры -АТФ-связывающая петля (Р-петля) и активационная петля (А-петля). Данные

регионы характеризуются специфичным, стабилизирующим структуру белка, пространственным расположением при неактивной конформации BCR-ABL. Иматиниб действует как конкурирующий ингибитор АТФ-связывающего домена, при этом взаимодействует с киназным доменом BCR-ABL киназы, образуя контакты минимум с 21 аминокислотой. Мутации в участке гена BCR-ABL, кодирующем Р- и А- петли, дестабилизируют их расположение так, что домен киназы не может перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом.

Среди пациентов с вторичной резистентностью обнаружены 23 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABL-тирозинкиназы, и 2 мутации сплайсинга, приводящие к делеции экзонов 4 и 7 ABL домена (рис. 4): G250E(6), Q252L (1), Y253H(2), E255V/K(2), L273M (1), F311L (1), T315I (2), М351Т (1), F359V/I (5), H396R (2), delL184-K274 (1), delR362-A424 (1). Данные мутации согласно литературным данным являются причиной неэффективности терапии иматинибом O'Hare Т., Walters D.K., Stoffregen Е.Р. et al., 2005). Анализ мутаций гена BCR-ABL у пациентов с XMJ1, утративших большой или полный цитогенетический ответ, показал, что только 11 (47,8%) из 23 мутаций локализуются в локусе, кодирующем Р-петлю (рис.4)

о

.................ее....................... 10 о

ш 5 !л 3

ГМ UJ м Д 1Л X

ст| 1 1 1

[ Р № ] I С 1 : А

delL184-K274 delR362-A424

Рис.4. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих Р-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (1В), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с вторичной резистентностью к иматинибу.

При исследовании динамики выявления мутаций у резистентных к терапии иматинибом пациентов с ХМЛ обнаружено увеличение доли пациентов с мутациями от 10% на 12 месяцев терапии до 32% после 6 лет терапии иматинибом (рис.5)

Для определения зависимости цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом от наличия обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL рассчитаны показатели кумулятивной вероятности цитогенетического (БЦгО и ПЦгО) и молекулярного (БМО) ответов на терапию иматинибом.

18 24 36 48

Время (мес.)

Рис.5. Изменение частоты встречаемости мутаций гена ВСЯ-АВЬ с течением времени при отсутствии эффекта в лечении ХМЛ иматинибом.

В группе больных ХМЛ без мутаций (п=62) кумулятивная вероятность достижения на 60 месяцев терапии БЦгО составила 88,6%, ПЦгО - 81,6%, БМО - 67,9% (рис. 6).

Рис. 6. Кумулятивная вероятность достижения а. БЦгО, ПЦгО и БМО в общей группе пациентов, б. БЦгО в группе пациентов с мутациями гена ВСЯ-АВЬ. в. ПЦгО в группе пациентов с мутациями гена ВСЯ-АВЬ. г. БМО в группе пациентов с мутациями гена ВСЯ-АВЬ (п=42). Случаи без мутаций - синяя линия Пациенты с мутациями ВСЯ-АВЬ - красная линия.

В группе пациентов, у которых при проведении молекулярно-генетических исследований обнаружены мутации киназного домена гена ВСЯ-

ABL, вероятность достижения БЦгО, ПЦгО и ПМО достоверно снижается: БЦгО на 60 месяцев терапии иматинибом составила 62,4% (р<0,0001) (рис.66), ПЦгО - 22,6% (р<0,000001) (рис.бв), БМО - 5,9% (р<0,000001) (рис.бг). Интересно, что в группе больных XMJI с мутациями только у одного пациента достигнут БМО после 5 лет терапии иматинибом. У данного больного XMJI обнаружена мутация F311L после 24 месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Доза была повышена до бООмг/сут, а затем до 800мг/сут. В конечном итоге повышение дозы иматиниба позволило преодолеть резистентность и достичь БМО. У остальных пациентов (41 человек) снижения уровня экспрессии BCR-ABL ниже 0,1% (IS) не достигнуто.

Еще более убедительные данные о неблагоприятном влиянии мутаций киназного домена гена BCR-ABL получены при сравнении вероятности достижения ПЦгО и БМО в группах резистентных пациентов с мутациями и без мутаций. Оценка влияния мутаций на цитогенетический ответ в группе резистентных больных производилась на основе анализа вероятности достижения полного цитогенетического ответа, так как ПЦгО по нашему убеждению является более строгим критерием оценки эффективности терапии, чем большой цитогенетический ответ (БЦгО).

Анализ вероятности достижения ПЦгО в диапазоне от начала терапии до 24 месяцев лечения показал, что динамика достижения ПЦгО в группе резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL достоверно не различается с динамикой ответа группы пациентов без мутаций (рис. 7а). При этом в обеих группах резистентных больных вероятность достижения ПЦгО достоверно ниже, нежели в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Далее, в период от 24 до 60 месяцев в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL вероятность достижения ПЦгО повышается и начинает достоверно отличаться от аналогичного показателя группы резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL. При этом вероятность достижения ПЦгО не достигает таковой у пациентов контрольной группы (различие достоверно). И наконец после 5 лет терапии вероятность достижения полного цитогенетического ответа в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL приближается к таковой в группе больных XMJI с оптимальным ответом (различие становится статистически недостоверно). При этом вероятность достижения ПЦгО в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL остается стабильно низкой.

Аналогичные особенности динамики наблюдались и в достижении большого молекулярного ответа. В течение первых 36 месяцев терапии иматинибом вероятность достижения БМО в группах резистентных пациентов без мутаций и с мутациями киназного домена гена BCR-ABL практически не различается, тогда как к 5 годам различие также становится значительным и статистически достоверным (рис. 76). В данной ситуации особенно интересно, что резистентные пациенты без мутаций могут достигать БМО в более чем 50% случаев. Вероятность достижения БМО у пациентов с мутациями гена BCR-ABL в течение всего периода наблюдения остается минимальной.

Рис.7. Кумулятивная вероятность достижения ПЦгО (а) и БМО (б) у резистентных больных XMJI с мутациями гена BCR-ABL (красная линия), резистентных больных XMJI без мутаций гена BCR-ABL (красная пунктирная линия) и у больных с оптимальным ответом (синяя линия).

Таким образом, наличие мутаций гена BCR-ABL достоверно снижает вероятность достижения большого и полного цитогенетического ответов, а также делает практически невозможным достижение большого молекулярного ответа. При этом обнаружены различия в вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов не только между пациентами общей группы и группы с мутациями гена BCR-ABL, но и внутри группы резистентных пациентов: с одной стороны тех, у кого выявлены мутации гена BCR-ABL, с другой - без изменений нуклеотидной последовательности онкогена. Данное обстоятельство указывает на то, что резистентность, развивающаяся вследствие мутаций гена BCR-ABL, приводит к стойкому снижению вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов, в отличие от резистентности, обусловленной другими причинами. Особенно важным моментом является достоверное снижение вероятности достижения большого молекулярного ответа в случае возникновения мутаций киназного домена гена BCR-ABL, так как в настоящее время доказано, что быстрое и своевременное достижение большого молекулярного ответа -основной критерий успешного подавления опухолевого клона, и как можно более быстрое достижение БМО и ПМО является основной целью терапии XMJI ингибиторами тирозинкиназ. Следовательно, появление мутаций гена BCR-ABL является крайне неблагоприятным прогностическим фактором.

Влияние амплификации киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с XMJI к терапии иматннибом.

Для определения роли амплификации гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных XMJI проведено FISH исследование с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL у 175 больных ХМЛ (80 мужчин, 95 женщин). Из них в хронической фазе находились 130 пациентов, в

фазе акселерации — 45 пациентов. По результатам стандартного цитогенетического исследования клеток костного мозга, критериям оптимального ответа (Вассагаш М. Е1 а1, 2009) соответствовали 36 человек (21%), критериям субоптимального ответа - 15 человек (9%), критериям характеризующим отсутствие ответа — 124 (70%).

В результате проведенного исследования в группах пациентов с оптимальным и субоптимальным ответами на терапию иматинибом дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ не были обнаружены ни в одном случае. Напротив, в группе резистентных пациентов амплификация гена ВСЯ-АВЬ выявлена у 45 из 124 человек (36,3%).

Сопоставление групп пациентов с обнаруженными дополнительными копиями гена ВСЯ-АВЬ и без амплификации гена ВСЯ-АВЬ показало, что они достоверно не различаются по возрасту, полу, длительности наблюдения, предшествующей назначению иматиниба терапии, медиане длительности терапии иматинибом, медиане назначенной дозы иматиниба. Однако, обнаружены достоверные различия по продолжительности периода от постановки диагноза до назначения терапии иматинибом у больных ХМЛ с обнаруженной амплификацией ВСЯ-АВЬ и без таковой. Так, в первой из указанных групп медиана длительности составила 13,2 (0-128) мес., тогда как во второй группе - 4,6 (0-110) мес. (р=0,007572). Таким образом, раннее назначение терапии иматинибом достоверно снижает вероятность развития амплификации гена ВСЯ-АВЬ.

В группе резистентных больных ХМЛ (124 человека), у находящихся в хронической фазе заболевания, дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ обнаружены в 21 случае из 70 (30%), у больных ХМЛ в фазе акселерации - в 24 случаях из 54 (36,4%). Выявленные различия статистически достоверны (р=0,0246) (рис.16). Таким образом, как и в случае с мутациями киназного домена ВСЯ-АВЬ, прогрессия заболевания сопровождается в увеличением частоты амплификации гена ВСЯ-АВЬ.

ХРОНИЧЕСКАЯ атр(ВС(!-АВи

ФАЗА не обнаружена

атр(ВСИ-АВ1.)

ФАЗА

АКСЕЛЕРАЦИИ ™Р(ВС*АВЦ

не обнаружена

атр(ВСК-АВ1)

Рис. 8. Частота амплификации гена ВСЯ-АВЬ в клетках костного мозга зависимости от фазы ХМЛ (N=124, р=0,0246).

Из 124 резистентных пациентов рефрактерных к терапии иматинибом оказалось 87 больных ХМЛ, вторично резистентных - 37. Среди 87 пациентов с первичной резистентностью (рефрактерностью) амплификация гена ВСЯ-АВЬ обнаружена у 32 больных (36,8%). Из 37 пациентов с вторичной резистентностью, дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ выявлены у 13 (35,18%). Выявленное различие по частоте встречаемости амплификации внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически недостоверно (р=0,8471). Интересно, что в отличие от мутаций гена ВСЯ-АВЬ, зависимость частоты обнаружения амплификации гена ВСЯ-АВЬ от типа резистентности не обнаружена_(таб.8) __

amp(BCR-ABL) не обнаружена

amp(BCR-ABl) не обнаружена

Рис. 9. Частота обнаружения амплификаций гена ВСЯ-АВЬ в зависимости от типа резистентности (N=124, р=0,8471)

amp(BCR-ABL)

3Z 36,8% amp(BCR-ABL)

Количество дополнительных слитных сигналов в опухолевых клетках костного мозга в изученных случаях ХМЛ колебалось от 1 до 7 (рис.9). В некоторых случаях амплификация гена ВСЯ-АВЬ сочеталась с дополнительными хромосомными аберрациями затрагивающими локусы генов АВЬ1 и ВСЯ.

Рис. 10. FISH с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL. Вариации количества дополнительных копи BCR-ABL a. nue ish(ABLlx4),(BCRx4), (ABLlconBCR хЗ). б. nue ish(ABLlxl0),(BCRxl0),(ABLlconBCRx8). в. nue ish (ABL 1x4), (BCRx4) (ABLlconBCRx2)[68/200],

В каждом изученном случае ХМЛ с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ, резистентного к терапии иматинибом, доля опухолевых клеток, несущих дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ, варьировала от 1% до 78% среди всех клеток костного мозга. Среднее значение величины клона клеток с амплификацией в группе рефрактерных пациентов составило 14,06%, у вторично резистентных больных - 16,75% (р=0.3994).

Анализ размера опухолевого клона с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ в динамике терапии иматинибом показал, что размер клона клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ находится в обратной зависимости от частоты его встречаемости (случаи ХМЛ с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ в небольшом количестве клеток костного мозга встречались гораздо чаще, чем случаи ХМЛ с большим количеством клеток костного мозга с амплификацией) (рис. 10).

У ряда пациентов (6 человек) при проведении первого контрольного исследования (6 мес.) обнаружены ядра, содержащие дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ. При этом отмечена значительная величина клона с амплификацией (среднее значение 24,3%, минимум 10%, максимум - 67%), обнаруженная у данных пациентов. Все пациенты в дальнейшем оказались абсолютно рефрактерны к проводимой терапии ХМЛ иматинибом.

клеток содержащих дополнительные копии гена ВСЯ-АВЬ

Подобной картины не наблюдалось у других пациентов, проанализированных методом FISH в другие мониторинговые сроки (12, 18, 24 мес. и т.д.). В случае обнаружения дополнительных копий гена ВСЯ-АВЬ при проведении последующих контрольных исследований (на 12, 18, 24 мес.) отмечена значительно меньшая презентированнось этих клонов. Однако с каждым последующим контролем средний размер его увеличивался (рис. 11).

Для оценки влияния появления клонов клеток с дополнительными копиями гена ВСЯ-АВЬ проведен расчет кумулятивной вероятности

достижения БЦгО, ПЦгО и БМО в зависимости от наличия амплификации. В группе больных XMJI с амплификацией вероятность достижения большого цитогенетического ответа (БЦгО) на 60 месяцев терапии иматинибом составила 58,6%, тогда как в группе больных без амплификации - 89,0% (р<0,00001).

J 25 й

I 20

Текущ. эффект: F{6. 297)=53,888, р=0,00000 Вертик. столбцы равны 0.95 доверительных интервалов

Рис. 12. Динамика изменения среднего значения величины клона клеток, содержащего дополнительные копии гена BCR-ABL в зависимости от срока мониторингового наблюдения.

Также наличие амплификации гена BCR-ABL достоверно снижает вероятность достижения полного цитогенетического ответа (ПЦгО) до 31,6% (в группе пациентов без амплификации вероятность ПЦгО на 60 месяцев терапии равна 63,8%, р<0.00001) и большого молекулярного ответа (БМО) до 16,9% (в группе больных без амплификации - 67,0%, р<0.00001) (рис. 12).

Рис.13. Вероятность (кумулятивная) достижения ПЦгО и БМО при наличии амплификации гена BCR-ABL на бОмес. наблюдения. Зеленая линия - пациенты с амплификацией гена BCR-ABL.

Таким образом, в группе пациентов, у которых при проведении молекулярно-цитогенетического (FISH) исследования в ядрах клеток костного мозга обнаружены дополнительные копии гена BCR-ABL (амплификация BCR-ABL) достоверно снижена вероятность достижения большого и полного цитогенетического, а также большого молекулярного ответов.

Для поиска связи между значениями величины опухолевого клона с амплификацией гена BCR-ABL и вероятностью достижения полного цитогенетического и большого молекулярного ответов на терапию ХМЛ иматинибом все пациенты с амплификацией распределены на 4 квартиля. Первый квартиль (Q1) включал 25% пациентов с наименьшими значениями величины клона опухолевых клеток с амплификацией; квартили Q2 и Q3 включали по 25% пациентов со значениями меньше и больше медианы соответственно; четвертый квартиль (Q4) включал 25% пациентов с наибольшими значениями величины клона опухолевых клеток с амплификацией. Данные, касающиеся 50% пациентов Q1-Q2 и 50% пациентов Q3-Q4 объединены в две группы. Для стратификации данных использованы группы Q1-Q2 (группа пациентов с размером опухолевого клона с амплификацией 1-6%), и Q3-Q4 (группа пациентов с размером опухолевого клона с амплификацией 7-72%).

Метод Каплан-Мейер не выявил статистически значимые различия между группами Q1-Q2 и Q3-Q4 по вероятности достижения ПЦгО (р=0.86454) и БМО (р=0.66071) (рис. 13).

о Замрл. > Цензур*. 0 змеял. '

Рис. 14. Вероятность (кумулятивная) достижения ПЦгО и БМО в зависимости от величины клона с амплификацией гена BCR-ABL.

Таким образом, размер клона с amp(BCR-ABL) не влияет на вероятность достижения полного цитогенетического и большого молекулярного ответов. Выявление даже единичных опухолевых клеток с амплификацией гена BCR-АВЬ обладает неблагоприятным прогностическим значением и требует модификации терапии ХМЛ.

Оценка значения аномалий гена ВСЛ-АВЬ в комплексе демографических и клинико-лабораторных данных в развитии резистентности к терапии иматинибом методом дискриминантного анализа.

С целью оценки уровня влияния некоторых клинико-лабораторных факторов, включая мутации гена ВСЯ-АВЬ и его амплификацию, на вероятность возникновения неудач терапии ХМЛ иматинибом и выделения признаков, в той или иной степени ответственных за различия между группами пациентов, проведен дискриминантный анализ ряда статистических данных. Определены и выделены группы пациентов а) не достигших ответа (рефраткерность) на терапию иматинибом, б) утративших ответ (вторичная резистентность), а также в) достигших цитогенетического ответа на конец наблюдения. Оценивалось влияние таких факторов как: пол, возраст, регион проживания, скорость достижения цитогенетического ответа при терапии ХМЛ иматинибом (для этого определялась глубина цитогенетического ответа на 6 месяцев терапии иматинибом), наличие перерывов в приеме иматиниба, фаза ХМЛ на момент начала терапии иматинибом, наличие мутаций гена ВСЯ-АВЬ, наличие амплификаций гена ВСЯ-АВЬ, величина опухолевого клона имеющего атр(ВСЯ-АВЬ)

Кор.1 от Корня 2

6 • - Баз »тает« (р«фрактвр*асть|: л - Вгоричная резистентность ! ■ - ПЦгО достигнут

5 ............ * ■ \

■ А 3.......................»...... А ' А *

2 ......: • : :

* • ■ 1...... л • • . л •..... «1 . V I. •• П: ч

-Л 1

2 ....... ........ { % Ч : • 3 ............. • ...... .....

-5-4-3-2-10123 Кор 1

Рис. 15. Дискриминантный анализ: определение признаков в наибольшей степени ответственных за различие между группами пациентов: а) не достигших ПЦгО (рефрактерность); б) потерявших БЦгО (вторичная резистентность); в) достигших ПЦгО

Дискриминантный анализ показал (рис. 14), что разделение неполное и группы перекрываются, это может свидетельствовать о том, что перечислены и учтены далеко не все факторы, приводящие к неудачам терапии. Более четко разделены группы а) пациентов достигших ПЦгО и б) рефрактерных к

проводимой терапии. Хуже отображена группа рецидивировавших пациентов, т.е. вторично резистентных. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что группа пациентов достигших, но утративших ответ, более разнородна по признакам и причинам, вызвавшим рецидив заболевания, и выбранных факторов не достаточно для четкой дискриминации группы. С другой стороны, для данной группы, в определенной мере, все же характерны те же признаки, что свойственны и другим группам пациентов: как достигшим ПЦгО, так и пациентам с рефрактерностью к проводимой терапии. И указанные причины все же в определенной мере оказывают влияние на формирование группы вторично резистентных пациентов.

Результаты проведенного дискриминантного анализа дискриминантного анализа показали, что на достижение ответа при терапии ХМЛ иматинибом, а также на возникновение вторичной резистентности наибольшее влияние оказывают такие факторы как (табл. 4): глубина цитогенетического ответа на 6 месяцев терапии иматинибом (р=0.000000), наличие мутаций гена ВСЯ-АВЬ (р=0.000000), наличие амплификаций ВСЯ-АВЬ (р=0.000025), перерывы в терапии иматинибом (р=0.009103) и фаза ХМЛ на начало терапии иматинибом (р=0.041970).

Такие факторы как пол, возраст, предлеченность не влияют на вероятность получения оптимального ответа на терапию иматинибом. Также определено, что величина клона с атр(ВСЯ-АВЬ) не оказывает влияния на распределение пациентов между группами пациентов с оптимальным ответом, рефрактерных и вторично резистентных.

Таблица 4. Результаты анализа дискриминантных функций (р<0.00001)

р-уров. кор.1

Пол 0,326307 0,043545

Возраст 0,222070 -0,010653

Регион проживания 0,410515 -0,084058

Ответ на 6 мес. терапии 0,000000 -0,752438

Наличие мутаций BCR-ABL 0,000000 -0,386263

Наличие amp (ВСЯ-АВЬ) 0,000025 -0,378137

Величина клона с amp (BCR-ABL) 0,515810 -0,018700

Перерывы в терапии иматинибом 0,009103 0,101230

Фаза ХМЛ на начало терапии иматинибом 0,041970 -0,188465

Для комплексного анализа подтверждения роли мутаций и амплификаций ВСЯ-АВЬ оценена вероятность достижения ПЦгО в группах пациентов резистентных к терапии иматинибом а) с мутациями киназного домена гена ВСЯ-АВЬ, б) дополнительными копиями гена ВСЯ-АВЬ, в) резистентных пациентов без аномалий ВСЯ-АВЬ, г) пациенты с оптимальным ответом на терапию иматинибом (на 6 месяцев).

Через 12-18 месяцев после начала терапии иматинибом в группе пациентов резистентных к терапии ХМЛ без аномалий гена ВСЯ-АВЬ

вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов достоверно превышает аналогичный показатель в группах резистентных пациентов с мутациями и амплификацией ВСЯ-АВЬ. После 5 лет терапии данный показатель приближается к таковому у группы пациентов с оптимальным ответом, становясь в случае полного цитогенетического ответа статистически неразличимым (рис. 15).

Рис. 16. Вероятность достижения ПЦгО (а) и БМО (б) в зависимости от наличия мутаций и амплификации гена ВСЯ-АВЬ

ВЫВОДЫ

1. Аномалии гена ВСЯ-ABL (мутации и амплификация) являются важными механизмами развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с XMJI. Мутации гена BCR-ABL обнаружены в 40,4% случаев резистентности (первичная резистентность - 33,8%; вторичная резистентность - 52,8%). Амплификация гена BCR-ABL выявлена в 36,3% случаев (первичная резистентность - 36,8%; вторичная резистентность - 35,1%).

2. Большая часть мутаций гена BCR-ABL у первично резистентных больных (70%) локализована в кодирующем Р-петлю участке киназного домена ABL тирозинкиназы, обусловливая высокий уровень резистентности. У вторично резистентных больных мутации в участке, кодирующем Р-петлю, обнаружены в 48% случаев.

3. Мутации и амплификация гена BCR-ABL приводят к стойкому снижению частоты достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом.

4. Развитие резистентности на терапию иматинибом у больных ХМЛ не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL

5. Длительность периода времени от постановки диагноза ХМЛ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификация гена BCR-ABL).

Практические рекомендации:

1. Анализ случаев неэффективности терапии XMJI иматинибом должен включать в себя комплекс исследований, включающих изучение аномалий гена BCR-ABL методами FISH-анализа с ДНК зондом к гену BCR-ABL, и определение нуклеотидной последовательности гена BCR-ABL

2. Появление низкопроцентных клонов с амплификацией гена BCR-ABL является неблагоприятным прогностическим фактором и требует коррекции терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. C.B. Морданов Амплификация гена BCR-ABL у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, рефрактерных к иматинибу / С.И. Куцев, C.B. Морданов // Онкогематология. - 2009. -№3. - С. 23-26.

2. C.B. Морданов Прогностическое значение дополнительных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в терапии иматинибом хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, C.B. Морданов, А.Н. Зельцер // Медицинская генетика. - 2009. - № 10. - С. 27-33.

3. C.B. Морданов Механизмы резистентности к терапии хронического миелолейкоза ингибитором тирозинкиназ иматинибом. / Куцев С.И., Зельцер А.Н., Оксенюк О.С., Устаева O.A., Кунгурова Т.И., Бурнашева Е.В., Гранкина Е.А., Шатохин Ю.В. // Медицинский вестник Юга России. - 2010. - №2. - С. 10-17

Публикации в других изданиях:

4. S.V. Mordanov Cytogenetic and FISH analysis for diagnosis and evaluation of minimal residual disease (MRD) in CML patients / S.I. Kutsev, S.V. Mordanov, A.N. Zeltzer, Y.V. Shatokhin, E.V. Burnasheva // "Developing Research for a Common Feature", Abstracts of 4th Scientific Symposium. -Rostov-on-Don, 2006. - P. 51-52.

5. C.B. Морданов Мутации гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом / М.В. Вельченко, С.И. Куцев // Материалы III Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". - Ростов-на-Дону, 2009.-С. 157-158.

6. C.B. Морданов Цнтогенетический мониторинг терапии ХМЛ в ЮФО / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, C.B. Морданов // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". - Кисловодск, 2009. - С. 3-8.

7. C.B. Морданов BCR-ABL зависимые механизмы резистентности к иматинибу: амплификация и мутации гена BCR-ABL / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, C.B. Морданов // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". - Кисловодск, 2009. - С. 19-30.

8. С.В. Морданов Молекулярный мониторинг терапии хронического миелолейкоза (ХМЛ) иматинибом у пациентов, не достигших полного цитогенетического ответа. / Вельченко М.В., Зельцер А.Н., Устаева О.А., Гранкина Е.А., Шатохин Ю.В., Куцев С.И. // Материалы VI съезда РОМГ. - Ростов-на-Дону. - 2010. - С.36

9. С.В. Морданов Мутации в гене BCR-ABL у пациентов с первичной резистентностью к терапии иматинибом / Вельченко М.В., Устаева О.А., Шатохин Ю.В., Шамрай B.C., Сердюк О.Д., Напсо Л.И., Новоспасская Н.В., Куцев С.И. // Материалы VI съезда РОМГ. - Ростов-на-Дону. -2010.-С.119

10. С.В. Морданов Значение амплификации гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом / О.А. Устаева, С.В. Морданов, А.Н. Зельцер, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашева, И.В. Снежко, С.И. Куцев // Материалы I Всероссийского конгресса «Генетика опухолей кроветворной системы». -г.Ростов-на-Дону. - С. 182.

ll.S. Mordanov The mechanisms of resistance to TKI therapy of CML patients in routine practice / S. Kutsev, S. Mordanov, O. Oxenjuk, A. Zeltzer, M. Velchenko, O. Ustaeva, Yu Shatokhin, E. Burnasheva // Russian-German Scientific Symposium «Modern investigations from fundamental and clinical medicine» - Rostov- on-Don, 2010. P. 14-15

12. С.В. Морданов Мутации гена BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозом с первичной резистентностью к терапии иматинибом. / С.И. Куцев // Вестник гематологии. - 2010, - том VI, №2, - С.67-68

13. S.Mordanov The Role of Imatinib Plasma Level in the Achievment of Complete Cytogenetic Response (CCyR) in Chronic Myeloid Leukemia (CML) Therapy / S.Kutsev, O.Oxenjuk, S.Mordanov, Yu.Shatokhin, T.Pospelova, N.Khoroshko, A.Turkina. // Blood. - 2011. - V.118. N21. -P.1619.

14. S. Mordanov The low level clones of BM cells with BCR-ABL fusion gene amplification have unfavorable influence on CML imatinib therapy outcome / S. Mordanov, A. Zeltzer, E. Grankina, O. Ustaeva, T. Kungurova, Y. Shatokhin, S. Kutsev // European Journal of Human Genetics. - 2012. -Vol.20, Sup.l. -P.207

15. Mordanov S. Small Clones Of Bone Marrow Cells With BCR-ABL Gene Amplification Predict Unfavorable Outcome Of Imatinib CML Treatment / Kutsev S., Mordanov S„ Ustaeva O., Grankina E., Shatokhin Y., Serdjuk O., Polevichenko E., Turkina A. // Haematologica. - 2012. - Vol. 97, Sup.l. -P.359

16. Mordanov S. Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) Therapy of Patients with CML: mechanisms and monitoring / Kutsev S., Mordanov S., Oxenjuk O, Zeltser A., Kungurova Т., Ustaeva O., Sokolova A., Shatokhin Yu, Burnasheva E., Polevichenko E„ Serdjuk O., Zaklyakova L. // 7th Scientific Symposium "Improving Research for a Common Future". - Cologne, 2012. -P. 37-38.

Используемые в автореферате сокращения

ELN - European leukemia net

FISH - флуоресцентная in situ гибридизация

IS - International scale (международная шкала оценки уровня экспрессии В CR-ABL)

IRIS - international randomized study of interferon and sti57

Ph-хромосома - филадельфийская хромосома

БМО - большой молекулярный ответ

БЦгО — большой цитогенетический ответ

ГО — гематологический ответ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КМ - костный мозг

МинЦгО - минимальный цитогенетический ответ

МЦгО — малый цитогенетический ответ

ОБМО - отсутствие большого молекулярного ответа

ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции с последующей полимеразной

цепной реакцией

ОЦгО - отсутствие цитогенетического ответа

ПЦгО — полный цитогенетический ответ

ПМО - полный молекулярный ответ

РНК - рибонуклеиновая кислота

XMJI - хронический миелолейкоз

ЧЦгО — частичный цитогенетический ответ

ЦгО - цитогенетический ответ

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л Заказ № 3002. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Морданов, Сергей Викторович, Москва

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

на правах рукописи

РЧХ0/2>5~6/2}

Морданов Сергей Викторович

Роль аномалий гена ВСЯ-АВЬ в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, Куцей Сергей Иванович

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Шатохин Юрий Васильевич

Ростов-на-Дону 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА I. СОВРЕМННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О BCR-ABL 12

ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА ИМАТИНИБОМ

1.1. Цитогенетические и молекулярные основы патогенеза 12

хмл

1.2. Биологические основы целенаправленной терапии ХМЛ 16 ингибиторами тирозинкиназ

1.3. Механизмы резистентности ХМЛ к терапии ингибиторами 18 тирозинкиназ ,

1.4. BCR-ABL-зависимые механизмы резистентности ХМЛ к 21 терапии иматинибом

1.5.1. Амплификация гена BCR-ABL 21

1.5.2. Мутации гена BCR-ABL 24 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44

2.1. Характеристика пациентов 44

2.2. Методы исследования 49

2.2.1. Стандартное цитогенетическое исследование клеток 49 костного мозга

2.2.2. Молекулярно-цитогенетические исследования 50 2.2.3 Молекулярно-генетические исследования 55 2.2.4. Статистическая обработка данных 58

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ КИНАЗНОГО ДОМЕНА ГЕНА 60 BCR-ABL НА РАЗВИТИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ПАЦИЕНТОВ С ХМЛ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ

3.1. Мутации киназного домена гена BCR/ABL в 61

зависимости от типа резистентности

3.2. Влияние мутаций гена ВСЯ-АВЬ на динамику 67

цитогенетического и молекулярного ответов у пациентов, получающих терапию иматинибом. ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ ГЕНА ВСТАВЬ НА 76 РАЗВИТИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ПАЦИЕНТОВ С ХМЛ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ

4.1. Амплификация гена ВС11/АВЬ в зависимости от типа 81 резистентности

4.2. Характеристика клонов опухолевых клеток с 83 амплификацией гена ВСЯ-АВЬ

4. 3. Динамика цитогенетического и молекулярного ответов у 86 пациентов, получающих терапию иматинибом, в зависимости от наличия дополнительных копий гена ВСЫ-АВЬ 4.4. Влияние величины опухолевого клона с амплификацией 89 гена ВСЫ-АВЬ на вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов ГЛАВА 5. Оценка значения аномалий гена ВСЯ-АВЬ в комплексе 92 демографических и клинико-лабораторных данных в развитии резистентности к терапии иматинибом методом дискриминантного анализа.

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96

ВЫВОДЫ 104

Практические реко мендации: 104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ELN - European LeukemiaNet

FISH - флуоресцентная in situ гибридизация

IS - International scale (международная шкала оценки уровня

транскрипта В CR/ ABL)

IRIS - international randomized study of interferon and sti57

Ph-хромосома - филадельфийская хромосома

БМО — большой молекулярный ответ

БЦО - большой цитогенетический ответ

ГО — гематологический ответ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КМ — костный мозг

МинЦО — минимальный цитогенетический ответ

МЦО — малый цитогенетический ответ

ОБМО — отсутствие большого молекулярного ответа

ОТ-ПЦР — реакция обратной транскрипции - полимеразная цепная реакция

ОЦО — отсутствие цитогенетического ответа

ПЦО — полный цитогенетический ответ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПМО — полный молекулярный ответ

РНК - рибонуклеиновая кислота

XMJI — хронический миелолейкоз

ЧЦО — частичный цитогенетический ответ

ЦО - цитогенетический ответ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

В лечении хронического миелолейкоза (XMJI) ингибиторами тирозинкиназ достигнуты впечатляющие результаты, оказавшие существенное влияние на развитие таргетной терапии различных онкологических заболеваний. (Deininger М., O'Brien SG., Guilhot F., 2009) Следующим уроком, который необходимо извлечь из результатов таргетной терапии XMJ1 для использования в других областях онкологии, является установление контроля над механизмами резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с XMJI (Mughal T.I., Goldman J.M., 2007).

Наиболее известным клиническим исследованием безопасности и эффективности иматиниба по сравнению с интерфероном в лечении XMJI является Международное рандомизированное исследование IRIS, результаты которого показали беспрецедентное превосходство иматиниба (Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al., 2006). После 6 лет монотерапии иматинибом пациентов в хронической фазе XMJI их общая выживаемость составила 88%, бессобытийная выживаемость - 83%, выживаемость без прогрессии в фазу акселерации и бластный криз — 93% (Hochhaus А., Druker В J., Larson R.A. et al., 2007 ).

Однако, у части пациентов с XMJI, получающих монотерапию иматинибом, наблюдается первичная резистентность (рефрактерность) или вторичная (приобретенная) резистентность к проводимой терапии. О значении рефрактерности к терапии иматинибом для клинической практики свидетельствуют некоторые результаты исследования IRIS: в 4% вновь диагностированных случаев XMJI не удалось достичь полной гематологической ремиссии после 3 месяцев терапии иматинибом, в 16% случаев не удалось достичь большого цитогенетического ответа после 12 месяцев терапии и у 23% пациентов не был достигнут полный

цитогенетический ответ после 18 месяцев терапии (Druker В.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al., 2006).

Различные исходы лечения резистентных к иматинибу пациентов обусловлены, вероятно, разными механизмами развития резистентности. Изучение этих механизмов имеет огромное клиническое значение, поскольку может привести к выявлению прогностических факторов, позволяющих предвидеть благоприятный исход или прогрессию заболевания. Более того, выяснение причин рефрактерности может помочь оптимизировать терапию XMJ1 — повысить дозу иматиниба, перейти на терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) второго поколения (нилотиниб, дазатиниб), принять решение о трансплантации костного мозга.

Среди механизмов развития резистентностии к терапии иматинибом главная роль отводится мутациям киназного домена гена BCR-ABL (Cortes J., Jabbour Е., Kantarjian Н., 2007). Различные миссенс-мутации химерного гена BCR-ABL приводят к замене одной из аминокислот в белке Всг-АЫ, что обусловливает нарушение связывания иматиниба с Всг-АЫ тирозинкиназой (Jabbour Е., Kantaijian Н., Jones D. et al., 2006). Однако, если о роли мутаций в развитии приобретенной резистентностии накопилось довольно много данных за последние несколько лет (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002), то частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности остаются малоизученными. Ряд авторов обнаружили связь между появлением мутаций гена BCR-ABL и возрастом пациентов, наличием ранней или поздней хронической фазы на момент начала терапии иматинибом, предлеченностью, продолжительностью периода от установления диагноза до начала терапии иматинибом, длительностью терапии иматинибом (O'Hare Т., Eide С.А., Deininger М., 2008). Однако, в этих исследованиях анализировались преимущественно мутации, обусловливающие развитие вторичной резистентности.

Роль амплификации гена BCR-ABL в формировании резистентности к иматинибу отражена в единичных публикациях. Впервые амплификация гена BCR-ABL, приводящая к гиперэкспрессии BCR-ABL транскрипта, была обнаружена в экспериментах с BCR-ABL-позитивными клеточными линиями (Le Coutre Р., Tassi Е., Varella-Garcia М. et al., 2000). В клинической практике M.E.Gorre с соавт. (2001) методом FISH впервые показали амплификацию гена BCR-ABL в 3 из 9 случаев XMJI, резистентного к иматинибу. Затем А. Hochhaus (2003) также показал методом FISH увеличение количества копий гена BCR-ABL у 2 из 7 больных XMJI с первичной резистентностью. Интересно, что он не обнаружил амплификацию гена BCR-ABL ни в одном из 25 случаев вторичной резистентности ХМЛ. Однако, до сих пор не изучено влияние количества копий амплифицированного гена BCR-ABL, величины клонов с амплификацией гена BCR-ABL на развитие резистентности к терапии ИТК, четко не определена роль амплификации гена BCR-ABL в развитии первичной и вторичной резистентности.

Цель исследования - оценить роль BCR-ABL зависимых механизмов, обусловленных мутациями гена BCR-ABL и его амплификацией, в формировании резистентности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом.

Задачи исследования

1. Определить частоту и спектр мутаций участка гена BCR-ABL, кодирующего киназный домен 5С7?-^(Я£-тирозинкиназы (Р-петля, IB-домен, С-домен, А-петля), у больных XMJI с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом.

2. Оценить влияние мутаций гена BCR-ABL на развитие рефрактерности и приобретенной резистентности к иматинибу.

3. Выявить частоту амплификации гена ВСЯ-АВЬ в опухолевых клетках у больных ХМЛ с резистентностью к терапии иматинибом.

4. Оценить значимость амплификации гена ВСЯ-АВЬ н формировании первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

Новизна результатов исследования

Впервые проведена комплексная оценка значения амплификации и мутаций гена ВСЯ-АВЬ в формировании резистентности к терапии иматинибом на большой выборке пациентов. Оценена роль амплификации гена ВСЯ-АВЬ в развитии первичной резистентности к терапии иматинибом. Впервые определено влияние величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ, на развитие резистентности к терапии иматинибом. Впервые оценено значение количества копий амплфицированного гена ВСЯ-АВЬ в развитии резистентности к терапии ХМЛ иматинибом.

Практическая значимость

Результаты исследования показали необходимость проведения не только анализа мутаций, но и амплификации гена ВСЯ-АВЬ в случаях выявления резистентности к терапии иматинибом, поскольку амплификация гена ВСЯ-АВЬ является одной из причин неудач терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Наличие клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ является фактором неблагоприятного прогноза ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ в хронической фазе и фазе акселерации вне зависимости от величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ. Показано, что наличие мутаций гена ВСЯ-АВЬ и их локализация влияют на эффективность терапии иматинибом. Выявление аномалий гена ВСЯ-АВЬ (мутаций и амплификации) обусловливает необходимость изменения подходов к терапии ХМЛ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аномалии гена BCR-ABL являются одними из основных механизмов развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с XMJ1 и суммарно обнаруживаются более, чем в 50% случаев.

2. Мутации гена BCR-ABL являются основной причиной стойкой резистентности на длительных сроках наблюдения, в отличие от резистентности, обусловленной i?СУ?-/^¿-независимыми причинами.

3. Вклад амплификации гена BCR-ABL в развитие резистентности к терапии XMJI иматинибом сопоставим с ролью мутаций гена BCR-ABL.

4. Влияние аномалий гена BCR-ABL на эффективность терапии иматинибом у больных XMJI не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL.

5. Длительность периода времени от постановки диагноза XMJÏ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификации гена BCR-ABL).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 научно-практических форумах: Научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг" (Кисловодск, 2009), IV съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), 15th, 16th, 17th Congress of European Hematologists Association (Barcelona 2010, London 2011, Amsterdam, 2012), 7th Scientific Symposium "Improving Research for a Common Future" (Cologne, 2012), I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012).

Публикации

Всего по теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из которых - 3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Внедрение результатов в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведении семинаров на кафедре гематологии и трансфузиологии с курсами клинической лабораторной диагностики, генетики и лабораторной генетики ФПК и ППС ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России.

Результаты исследования проведенного Мордановым C.B. внедрены в практическую работу лаборатории медицинской генетики, отделения гематологии клиники ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России, отделений гематологии республиканских, краевых и областных онкологических диспансеров Южного Федерального и Северо-Кавказского Федерального округов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов, сборе первичных данных, проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи. Математическая обработка данных проведена лично соискателем. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнены автором самостоятельно.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики исследования, трех глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (18 источников на русском и 177 на иностранном языках). Работа содержит 27 рисунков и 15 таблиц.

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О BCR-ABL-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА ИМАТИНИБОМ

1.1. Цитогенетические и молекулярные основы патогенеза ХМЛ

Хронический миелоидный лейкоз является одним из клональных онкогематологических заболеваний. Повреждение кроветворной стволовой клетки приводит к увеличению числа клеток миелоидного ряда, которые сохраняют способность к созреванию. На долю ХМЛ приходится до 20% от общего количества опухолевых заболеваний системы крови у взрослых (Хорошко Н.Д., Туркина А.Г.2001; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., 2005;).

В течении хронического миелоидного лейкоза можно выделить три стадии. Заболевание начинается с хронической фазы, протекающей вначале практически бессимптомно, а затем характеризующейся выраженным лейкоцитозом и спленомегалией. Через 2-4 года при отсутствии лечения заболевание переходит в фазу акселерации, что сопровождается утратой опухолевыми клетками способности к дифференцировке. В дальнейшем развитие ХМЛ характеризуется терминальной фазой бластного криза. Таким образом, заболевание прогрессирует в течение 3-5 лет и заканчивается летальным исходом (Perrotti D., Jamieson С. et al, 2010).

В основе патогенеза ХМЛ лежит возникновение реципрокной транслокации - t(9;22)(q34;ql 1) в стволовой кроветворной клетке. В результате этой транслокации образуется дериватная хромосома 22 -der(22)t(9;22)(q34;ql 1), которую принято называть «Филадельфийской» (Ph-хромосома), поскольку она впервые была обнаружена в городе Филадельфия (США) (Nowell P.C., Hungerford D.A., 1960). Ph-хромосома обнаруживается цитогенетическим методом в опухолевых клетках практически во всех случаях ХМЛ (в 95% ). В связи с этим, обнаружение Ph-хромосомы в клетках костного мозга используется в качестве «маркирующего» признака этого заболевания (Kawasaki E.S., Clark S.S.,

Coyne N.Y. et al., 1988; Faderl S., Talpaz M., EstrovZ. 1999). Данный факт является важным моментом, использующимся в диагностике и мониторинге хронического миелоидного лейкоза. Обнаружение Ph-позитивных клеток при цитогенетическом исследовании клеток костного мозга является «золотым стандартом» в диагностике хронического миелолейкоза, а цитогенетический ответ используется как один из наиболее важных критериев оценки эффективности терапии XMJI (De Klein A., van Kessel A.G., Grosveld G., 1982; Туркина А.Г., Челышева Е.Ю., 2004; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2005; Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин A.B., 2007).

Критическим молекулярным следствием реципрокной транслокации t(9;22) является образование химерного гена BCR/ABL1, локализованного на дериватной хромосоме 22 (Ph-хромосоме) (Lion T., Izraeli S., Henn T. et al., 1992; Lion T., Henn T., Gaiger A. et al., 1993; Lin F., van Rhee F., Goldman J.M. et al., 1996).

Протоонкоген c-ABL (ABL1) впервые был идентифицирован как нормальный клеточный гомолог вирусного онкогена v-ABL (вируса лейкоза мышей Абельсона Ab-MuLV). В норме ген ABL1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), (MIM ID * 189980) локализован в длинном плече хромосомы 9 (09q34.1) и экспрессирует протеин р 145ABL (Van Etten R.A., 1999), который выполняет роль нерецепторной тирозинкиназы и играет важную роль в регуляции нормального клеточного цикла. В структуре р 145ABL выделен ряд доменов, отвечающих как за ферментативную составляющую его функции (домен SH1 обладает функцией тирозинкиназы), так и за регуляторные взаимодействия (домены SH2, SH3 участвуют во взаимодействия�