Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелолейкоза

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелолейкоза"

2278

На правах рукописи

Куцев Сергей Иванович

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА

03.00.15 - генетика

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Домрачева Елена Васильевна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович

доктор медицинских наук Румянцев Сергей Александрович

доктор медицинских наук, профессор Хорошко Нина Дмитриевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

« JÜ »

2009 г. в

часов на

Защита состоится ___________________________________

заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу; 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_»_2009 т.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко P.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) - клональное миелопролиферативное заболевание, составляющее около 20% вновь диагностированных случаев лейкозов у взрослых. Ежегодная заболеваемость ХМЛ - не более 1-2 случаев на 100 ООО взрослого населения. ХМЛ развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql 1.2). Образующуюся при этом дериватную хромосому der(22)t(9;22) с укороченным длинным плечом называют филадельфийской (Ph-хромосома). В результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql 1.2) происходит слияние гена ÄBL, расположенного на длинном плече хромосомы 9, с геном BCR, расположенным на длинном плече хромосомы 22, с образованием слитного гена BCR-ABL. Белок BCR-ABL является тирозинкиназой с повышенной активностью и играет ключевую роль в патогенезе ХМЛ. Механизмы, контролирующие в норме активность ABL тирозинкиназы, не способны регулировать активность химерной BCR-ABL тирозинкиназы, что приводит к увеличению пролиферативной активности клеток и ингибированию апоптоза, уменьшает зависимость клеток от цитокинов и снижает клеточную адгезию. При установлении диагноза ХМЛ 90-100% клеток костного мозга характеризуются наличием Ph-хромосомы, выявляемой цитогенетическим или FISH методами.

Исследования молекулярного патогенеза ХМЛ подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, заключающейся в применении специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы. Создание первого из них - иматиниба (STI571) стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии. Впервые вместо уничтожения всех миелоидных клеток с помощью неспецифического цитостатического воздействия стала применяться терапия, которая действует избирательно, блокируя повышенную пролиферативную активность и стимулируя апоптоз только опухолевых клеток.

Иматиниб селективно ингибирует BCR-ABL тирозинкиназу, встраиваясь в АТФ-связывающий карман киназного домена белка BCR-ABL. Благодаря этому АТФ не может встроиться в АТФ-связывающий карман, BCR-ABL тирозинкиназа остается в неактивном состоянии и тем самым блокируется сигнальный путь пролиферации опухолевых клеток. Клинические испытания иматиниба показали необыкновенно высокую эффективность этого препарата в терапии ХМЛ (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и соавт., 2003; Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова 0,Ю. и соавт., 2007). Так, к пяти годам терапии иматинибом полный гематологический ответ (нормализация клинико-лабораторных показателей) на лечение был достигнут у 98% больных ХМЛ; большой цитогенетический ответ (количество Ph-позитивных миелокариоцитов при цитогенетическом исследовании менее 35%) - у 92% больных; полный цитогенетический ответ

(Ph-позитивные клетки в костном мозге не обнаруживаются) - у 87% пациентов; 5-летняя выживаемость без прогрессии заболевания составила 93% (Druker В .J. с соавт., 2006).

Несмотря на столь впечатляющие результаты, существует проблема первичной резистентности (рефрактерности) и вторичной (приобретенной) резистентности. Например, по данным международного исследования IRIS к концу 7 года наблюдения 17% пациентов утратили полный цитогенетический ответ (O'Brien S.G. с соавт., 2008).

Успех терапии ингибиторами тирозинкиназ во многом зависит от внедрения эффективной системы мониторинга результатов лечения, позволяющей своевременно изменять тактику терапии ХМЛ в каждом конкретном случае. В связи с относительной новизной клинического применения ингибиторов тирозинкиназ многие аспекты мониторинга терапии этими препаратами далеки от своего окончательного разрешения. Поэтому развитие системы мониторинга эффективности терапии ХМЛ препаратами ингибиторов тирозинкиназ с помощью генетических технологий для последующей оптимизации терапевтической тактики ведения пациентов с ХМЛ представляется весьма актуальным. К настоящему времени противоречивы данные о прогностическом значении дополнительных хромосомных аномалий, выявляемых при диагностическом цитогенетическом исследовании и в процессе цитогенетического мониторинга эффективности терапии, не вполне определено место молекулярно-генетического мониторинга, не ясна роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к проводимой терапии, не оценена роль фармакокинетического мониторинга в терапии ХМЛ.

Цель исследования - оценить значимость цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований в оценке прогноза и мониторинге эффективности терапии ХМЛ.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ цитогенетическим и молекулярно-генетическим методами исследования.

2. Сопоставить информативность цитогенетического, молекулярно-цитогенетического и молекулярно-генетического методов в диагностике и мониторинге терапии ХМЛ.

3. Определить частоту выявления и дать цитогенетическую характеристику клонов лейкозных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями, а также оценить их роль в прогнозе эффективности терапии ХМЛ.

4. Оценить эффективность молекулярно-генетического мониторинга в терапии ХМЛ.

5. Исследовать частоту и спектр мутаций гена BCR-ABL и определить значение клонов лейкозных клеток с мутациями гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом.

6. Определить роль цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований для прогноза эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Новизна результатов исследования

В настоящем исследовании впервые:

- проведена комплексная оценка результатов цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических исследований на этапе диагностики и в процессе мониторинга эффективности терапии ХМЛ инг ибиторами тирозинкиназ.

- показана необходимость проведения молекулярно-цитогенетических исследований у резистентных к терапии иматинибом пациентов с целью поиска дополнительных хромосомных аберраций в небольших клонах опухолевых клеток.

- выявлена частота и спектр мутаций химерного гена ВСК-АВЬ, а также оценена их роль в развитии рефрактерности к иматинибу в когорте первично резистентных больных ХМЛ.

- установлено влияние перерывов в терапии иматинибом на развитие первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

- выявлено значение измерения концентрации иматиниба в плазме крови для оптимизации терапии ХМЛ.

Практическая значимость.

Разработан алгоритм диагностики и мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических факторов, позволяющий оптимизировать тактику терапии заболевания. Создана математическая модель прогнозирования цитогенетического ответа на основании анализа корреляционных взаимосвязей различных показателей генетического мониторинга терапии ХМЛ. Разработаны рекомендации по использованию молекулярно-цитогенетического метода для выявления амплификации гена ВСЯ-АВЬ в случаях резистентности к проводимой терапии. Предложено использование молекулярно-генетического мониторинга методом ПЦР в реальном времени терапии ХМЛ только после достижения полного цитогенетического ответа. Определена роль клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями и мутациями гена ВСК-АВЬ в развитии первичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Показана роль фармакокинетических исследований в мониторинге терапии ХМЛ иматинибом.

Основные положения, выносимые на защиту:

- мониторинг терапии ХМЛ должен включать в себя комплекс цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований факторов резистентности при лечении ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

результаты стандартного цитогенетического исследования коррелируют с результатами молекулярно-генетических исследований, однако наиболее целесообразно использовать молекулярно-генетический метод для мониторинга эффективности терапии XMJI ингибиторами тирозинкиназ после достижения полного цитогенетического ответа.

- к факторам, потенцирующим развитие первичной резистентности к ингибиторам тирозинкиназ, относятся: появление на фоне терапии иматинибом клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-положительных клетках, амплификация гена BCR-ABL и мутации гена BCR-ABL.

Апробация работы

Основные результаты работы, составившие содержание диссертации, доложены и обсуждены на 2 European Cytogenetics Conference (Vienna, 1999); I Съезде терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2000); II и VI Всероссийском симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний" (Москва, 2001; 2009); I и IV Всероссийском конгрессе "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" (Москва, 2002; 2005); IV международном научном симпозиуме "Developing Research for a Common Feature" (Ростов-на-Дону, 2006); Второй научной конференции "Актуальные проблемы генетики", посвященной 115-летию Н.И.Вавилова (Москва, 2003); II и IV научно-практической конференции Южного Федерального округа с международным участием "Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты" (Ростов-на-Дону, 2004, Кисловодск, 2006); IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2004); Общероссийской открытой конференция "Вопросы организации диагностики и лечения больных, страдающих хроническим миелоидным лейкозом" (Москва, 2005); I, II и III Научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг" (Сочи, 2006; Росгов-на-Дону, 2007; Кисловодск, 2008); Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону, 2006); Всероссийской школе-семинаре "Актуальные проблемы цитогенетики" (Москва, 2007); XXXV и XXXVI Всероссийских гематологических декадниках "Новое в гематологии и клинической трансфузиологии" (Москва, 2008, 2009); Республиканской конференции "Актуальные вопросы гематологии" (Махачкала, 2008); XX International Congress of Genetics (Berlin, 2008); European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008): II Сибирской конференции по гематологии "Баркагановские чтения" (Барнаул, 2009). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 9 сентября 2009 года.

Внедрение в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на курсе медицинской генетики ФПК и ППС, кафедре гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС и кафедре внутренних болезней №2 ГОУ ВПО "Ростовский государственный медицинский университет Росздрава", кафедре внутренних болезней ГОУ ВПО "Астраханская государственная медицинская академия Росздрава". Результаты работы внедрены в работу лаборатории медицинской генетики и отделения гематологии клиники ГО'У ВПО РостГМУ Росздрава. Полученные результаты исследования легли в основу изданных 2 методических рекомендаций для врачей гематологов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 34 научные работы, из них 8 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Издано 2 методических рекомендаций для врачей.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, 6 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии (24 источника на русском и 181 на иностранном языках). Работа содержит 48 рисунков и 14 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Проведено обследование 298 пациентов с клинически манифестированным хроническим миелолейкозом в хронической фазе или фазе акселерации. У всех 298 пациентов диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим методом (обнаружение транслокации 1(9;22)(я34;ц11.2) в клетках костного мозга) и/или молекулярно-цитогенетическим методом (обнаружение слитного гена ВСК-АВЬ в клетках костного мозга). Все включенные в исследование пациенты с ХМЛ получали 6 или более месяцев терапию препаратом класса ингибиторов тирозинкиназ - иматинибом в дозе 400,600 или 800 мг/сутки согласно рекомендациям Европейского общества по лечению лейкозов Е1Л\[ (Вассагаш М. с соавт., 2006). Обязательным условием включения больных ХМЛ в исследование являлось наличие

информированного согласия пациентов на анонимное использование результатов выполненных анализов в научном исследовании.

У пациентов, включенных в исследование (п=298), медиана возраста на момент постановки диагноза составила 46,6 лет (минимальный возраст - 12,9 лет, максимальный - 77,4 года). Отношение мужчины/женщины - 137/161. В исследование включены пациенты, впервые начавшие получать терапию иматинибом как в хронической фазе (0=215; 72,1%), так и в фазе акселерации (п=83; 27,9%). Медиана длительности периода от момента постановки клинического диагноза до цитогенетического подтверждения диагноза XMJI составила 6 месяцев (минимальная длительность - 0,5 месяцев, максимальная - 60).

В обследованной группе больных XMJI до начала терапии иматинибом не получали какую-либо специфическую терапию 18 (6,0%) пациентов, 280 (94,0%) пациентов получали цитостатическую терапию гидроксикарбомидом, бусульфаном или интерфероном-a в сочетании с малыми дозами цитозара. Большая часть пациентов с ХМЛ получали терапию только гидроксикарбомидом (п=225, 75,5%). Медиана длительности терапии гидроксикарбомидом составила 7 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц и максимальная - 108 месяцев. У 16 (5,4%) пациентов с XMJI помимо терапии гидроксикарбомидом были периоды терапии бусульфаном. Медиана длительности терапии бусульфаном у этих больных составила 37,5 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц, максимальная - 108 месяцев. У 33 (11,1) пациентов с ХМЛ помимо терапии гидроксикарбомидом имела место терапия интерфероном-a с медианой длительности 13,5 месяцев (минимальное значение - 3 месяца, максимальное - 76). В 6 (2%) случаях пациенты получали терапию интерфероном-a в сочетании с малыми дозами цитозара. Медиана длительности терапии - 54 месяца (минимальное значение - 7 месяцев, максимальное - 108). Распределение пациентов по видам и длительности предшествующей иматинибу терапии представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение пациентов по видам и длительности предшествующей терапии

Терапия Количество (%) пациентов Медиана (месяцы) Минимум (месяцы) Максимум (месяцы)

Нет терапии 18 (6,0%) - - -

Гидроксикарбомид 225 (75,5%) 7 1 108

Гидроксикарбомид + бусульфан 16 (5,4%) 37,5 1 108

гидроксикарбомид + Интерферон 33 (11,1%) 13,5 3 76

Интерферон + цитозар 6 (2,0%) 54 7 108

Всего 298 (100%) 7 1 : 108

Стандартные цитогенетические исследования клеток костного мозга.

С целью цитогенетической диагностики и мониторинга эффективности терапии пациентов с XMJI исследовали стернальный пунктат костного мозга. Общее количество диагностических и мониторинговых исследований для 298 пациентов составило 1190 анализов. Образцы костного мозга в объеме 1 мл помещали в пробирки с гепарином лития. Культивирование клеток костного мозга проводили в среде, содержащей 7 мл RPMI 1640 («Sigma») и 2 мл телячьей эмбриональной сыворотки («Sigma»). Колцемид (концентрация подбиралась эмпирически) добавляли за 2 часа до остановки культивирования. Культивирование осуществлялось в термостате в течение 2 и 24 часов при температуре 37°С. После гипотонизации и фиксации культуры клеток полученную клеточная суспензию раскапывали на подготовленные предметные стекла. Цитогенетические препараты окрашивали GTG дифференциальным методом. Кариотипирование проводили с помощью микроскопа Аксиоплан-2-мот («Carl Zeiss») и программного обеспечения ikaros («Metasystems»), В каждом случае ХМЛ проанализировано не менее 20 метафазных пластинок клеток костного мозга. Результаты цитогенетических исследований приведены в работе в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой (Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J., 2009).

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток костного

мозга

Флуоресцентную in situ гибридизацию хромосом (FISH) с ДНК зондом к слитному гену ВСЯ- ABL проводили в случаях отсутствия метафазных пластинок при стандартном цитогенетическом исследовании, а также в случае резистентности к терапии иматинибом. Всего выполнено 172 FISH анализа. В работе использован двухцветный ДНК зонд 22ql 1.2 LSI ВСЯ SpectruGreen / 9q34 LSI ABL SpectrumOrange dual fusion DNA probe (Vysis, Abbott). FISH анализ проводили согласно протоколу производителя на цитогенетических препаратах содержащих как метафазные хромосомы, так и интерфазные ядра.

Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioplan-2-mot» с фильтром DAPI/Orange/Green (Vysis, Abbott). В каждом случае ХМЛ проанализировано не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. Результаты FISH исследований приведены в работе в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой (Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J., 2009).

Молекулярно-генетические исследования методом ПЦР в реальном

времени.

С целью количественной оценки экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210 на этапе постановки диагноза и в процессе мониторинга терапии ХМЛ проводили исследования методом ПЦР в режиме реального времени. Всего выполнено 1015 исследований. Забор периферической крови осуществляли в объеме не менее 5 мл в вакуумные пробирки («Vacuette») с этилендиаминтетрауксусной кислотой. Выделение РНК проводили не позже 24 часов с момента забора материала гуанидин-тиоционат хлороформ-

фенольным методом по Chomczynski P., Sacchi N. (1987). Для реакции обратной транскрипции использовали от 1 до 3 мкг выделенной тотальной РНК, случайные гексамерные праймеры и M-MLV обратную транскриптазу. ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили в термоциклере Rotor-Gene 6000 версии 1.7 («Corbett Life Science», Австралия). Для выделения РНК, постановки реакции обратной транскрипции и проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени использовали наборы реагентов ОНКОСКРИН 1-1-Q (ООО «ГеноТехнология»), разработанные с учетом рекомендаций протокола стандартизации «Европейской программы против рака» (Gabert J. с соавт., 2003; Мисюрин A.B. с соавт.,2007).

Определение интенсивности экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210 и контрольного гена ABL проводили согласно протоколу производителя. Для построения калибровочной кривой использовали трехкратные повторы десятикратных разведений положительных контрольных образцов, концентрации которых составляли 102, 103, 104, 105, 106 копий в 5 мкл раствора.

Относительную экспрессию химерного гена BCR-ABL определяли как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 10б, как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженной на 100%, а также в виде десятичного логарифма снижения (Alog) относительной экспрессии гена BCR-ABL по отношению к базовому уровню, рассчитанному как медиана экспрессии гена BCR-ABL у 30 больных с впервые выявленным хроническим миелоидным лейкозом до начала терапии иматинибом.

Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена BCR-ABL.

С целью поиска мутаций гена BCR-ABL было проведено определение нуклеотидной последовательности методом секвенирования кДНК гена BCR-ABL. Анализ мутаций гена BCR-ABL был выполнен у 64 больных, входящих в группу резистентных к иматинибу пациентов. Амплификацию интересующего фрагмента гена BCR-ABL, кодирующего Р-петлю, С-домен, IB-домен, А-петлю, производили в два этапа в соответствии с рекомендациями Branford S. и Hughes Т. (2006). На первом этапе амплифицировали участок гена BCR-ABL с помощью праймеров BCR F - 5tga сса act cgt gtg tga aac tc -3' и ABL R -5 - tcc act teg tct gag ata ctg gat t -3'. На втором этапе из полученного фрагмента BCR-ABL амлифицировали участок только киназного домена гена ABL с помощью праймеров к гену ABL: ABL F - 5'- ege aac aag ccc act gtc t -3' и ABL R -5'- tcc act teg tct gag ata ctg gat t -3'. Реакцию амплификации проводили при следующих условиях: 95°С - 10 мин; 45 циклов: 95°С - 15 сек, 60°С - 20 сек, 72°С - 120 сек; 72°С - 5 мин.

Реакцию секвенирования полученного фрагмента гена ABL проводили с помощью набора GenomeLab™Methods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing ("Beckman Coulter", США) согласно протоколу производителя.

Определение нуклеотидной последовательности проводили с помощью автоматического анализатора CEQ8000 ("Beckman Coulter1',США).

Измерение концентрации иматиниба в плазме крови и межклеточной жидкости костного мозга

С целью изучения влияния некоторых фармакокинетических параметров на достижение цитогенетического и молекулярного ответов при терапии иматинибом проводили определение концентрации иматиниба в плазме крови и межклеточной ■ жидкости костного мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией методом тандемной масс-спектрометрии. В работе определяли Ctr0ugh иматиниба -остаточную концентрацию препарата через 24 часа после последнего приема. Для измерения концентрации иматиниба использовали не более 200 мкл сыворотки крови и 100 мкл межклеточной жидкости костного мозга. Внутренний стандарт d8-STI 571 использовали в концентрации 1300 нг/мл. Для построения калибровочных графиков для каждой анализруемой партии использовали растворы иматиниба в плазме крови с концентрацией 10, 25, 100, 200, 500, 1000, 3000 и 5000 нг/мл. Для валидации метода готовились растворы иматиниба в плазме крови с концентрацией 500, 1000,3000 нг/мл.

После депротеинизации образцы подвергались высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью хроматографа Agilent 1200 (Agilent Technologies) с колонкой XTerra RP18 100x2.1 мм (Waters). Мобильная фаза: ацетонитрил/водный буфер формиата аммония (70/30 об.%). Содержание аммония формиата 4 ммоль/л, pH = 3,2. Объем вводимой пробы для исследования - 5 мкл с последующей электроспрейной ионизацией.

Масс-спектометрия осуществлялась с помощью детектора Agilent 6140 Triple Quad LC/MS (Agilent Technologies) в режиме MRM 494,2 —> 394,2 для иматиниба и 502,5 —>■ 394,1 для внутреннего стандарта при следующих условиях: температура осушающего газа - 300°С, скорость потока газа - 6 л/мин, небулайзер - 18 psi, напряжение на капилляре - 3200 V, напряжение на фрагментаторе - 125 V, энергия соударения для иматиниба 30 V и 32 V для внутреннего стандарта, время удерживания (сканирования) - 500 миллисекунд для иматиниба и 200 миллисекунд для внутреннего стандарта.

Статистическая обработка данных

Процедура статистической обработки полученных данных проводилась на персональном компьютере типа IBM PC/AT с использованием пакета прикладных программ Statistics 6,0 и электронных таблиц Excel 2003. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине.

Исследования проводились в период с 1999 по 2009 год в лаборатории медицинской генетики клиники Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Цитогенегический мониторинг терапии хронического миелолейкоза

В нашем исследовании выявлена высокая эффективность стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) кариотипа костного мозга на этапе цитогенетической диагностики ХМЛ: при выполнении диагностического СЦИ Ph-хромосома была обнаружена у 274 (91.9%) пациентов. У 24 больных ХМЛ (8Д%) в случаях неудовлетворительного качества метафазных пластинок или в случаях отсутствия митотически делящихся клеток в костном мозге диагноз ХМЛ был подтвержден методом FISH с двухцветным ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL. Поскольку предшествующая терапия может оказывать влияние на пролиферативную активность клеток костного мозга, было проанализировано возможное влияние предшествующей иматинибу терапии на отсутствие митотически делящихся миелокариоцитов в 24 выявленных случаях ХМЛ. Среди 24 больных ХМЛ этой группы пациентов 20 (83,3%) получали предшествующую иматинибу терапию гидроксикарбомидом, 1 (4,2%) - интерфероном-а, 3 (12,5%) - не получали предшествующей терапии вообще. Таким образом, наиболее часто пациенты получали предшествующую терапию гидроксикарбомидом. В нашем исследовании не обнаружено статистически значимой корреляционной связи между фактом предшествующей иматинибу терапии и отсутствием митотически делящихся миелокариоцитов при СЦИ (г=0Д31). Также не было выявлено корреляционной связи между длительностью периода от установления клинического диагноза до проведения цитогенетического исследования с одной стороны и эффективностью цитогенетического исследования с другой стороны (г=0,0321). Таким образом, в нашем исследовании не обнаружено статистически значимой связи между фактом предшествующей иматинибу терапии, а также длительностью заболевания и эффективностью цитогенетического исследования.

При цитогенетическом и FISH исследованиях количество Ph- или BCR-ЛЖ,-позитивных клеток в костном мозге варьировало от 0 до 100%, поскольку в результате предшествующей иматинибу терапии интерфероном-а некоторые пациенты достигали частичного, большого и даже полного цитогенетического ответа. У 33 (11,1%) пациентов, получавших терапию интерфероном-а, количество Ph-положительных клеток варьировало от 0 до 100% при цитогенетическом исследовании, а BCR-ABL-по'Ш-твных клеток - от 3% до 90% при FISH исследовании. У пациентов, получавших другие виды терапии или не получавших ее вообще (п=265 , 88,9%), количество Ph-положительных клеток варьировало от 85% до 100% при цитогенетическом исследовании, а ¿?СЯ-Л.0£-позитивных клеток - от 76% до 100% при FISH исследовании.

Цитогенетические исследования на этапе диагностики позволили выявить клоны опухолевых клеток с вариантными транслокациями t(V;9;22), формирующимися при участии трех хромосом, в 2 (0,7%) случаях и дополнительные хромосомные аберрации (ДХА) в Ph-позитивных клетках у 8 (2,7%) пациентов до начала терапии иматинибом (таблица 2).

Таблица 2.

Кариотипы костного мозга у впервые выявленных больных ХМЛ с вариантными транслокациями 1(У,9,22) и дополнительными хромосомными аномалиями в РЬ-позитивных клетках до начала терапии иматинибом. _

№ Пациент Кариотип

1 С.Б.А. 46,ХУД7,9;22)(р10;ч34д 11.2)[ 18]/46,ХУГ2]

2 М.М.З. 46,ХУ,1(9;22)(я34;я 11.2)[13]/46,ХУ,1(?,9;22)(?;я34;Ч11.2)Г5]/4б,ХУ[21

3 П.Н.В. 46,ХХ,1(9;22)(ч34^11.2)[13]/47,ХХ,1(9;22)(ч34;я11.2),+с!ег(22)«:(9;22) [7]

4 Н.В.Л. 46,ХУД9;22)(Ч34;Ч11.2)[7]/ 47,ХУ,г(9;22)(Ч34;я11,2),+22[3]/ 46,ХУ[10]

5 В.А.А. 46,ХУД9;22)(я34;я11.2)[6]/ 46,ХУ,1(9;22)(я34;я11.2),+21[3]/ 46ДУ112]

6 У.С. В. 46,ХХ,1(9;22)(ч34;я11,2)[11]/46,ХХ,1(9;22)(я34;Ч11.2),-5,+таг[2]/ 4б,ХХ[1]

7 И.Ю.Н. 46,ХУД9;22)(ц34;я 11.2)[181/47,ХУД(9;22)(ч34;ч11.2),+13Г2]

8 Ц.М.Р. 46,ХУД9;22)(Ч34;Ч 11,2)[ 11 ]/48,ХУД9;22)(я34;я 11.2),+19,+с1ег(22) Ц9;22) [4]/47,ХУД(9;22)(я34;я11.2),+22[51

Предшествующая иматинибу терапия гидроксикарбомидом, бусульфаном и интерфероном-а, а также длительность периода от клинической диагностики до цитогенетического подтверждения ХМЛ по нашим данным не влияют на формирование вариантных форм транслокаций 1(У;9;22) и ДХА в РЬ-позитивных клетках.

Появление клонов опухолевых клеток с вариантными формами транслокации 1.(У;9;22) и дополнительными хромосомными аномалиями в РЬ-позитивных клетках, выявляемых на этапе диагностического цитогенетического исследования, по некоторым данным литературы могут являться причиной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Проведенное нами исследование показало, что в группе пациентов с такими хромосомными аномалиями, выявленными до начала терапии иматинибом, вероятность достижения большого ЦГО на терапию иматинибом практически не отличается от таковой в группе пациентов без цитогенетических особенностей на этапе диагностики (р=0,71179). Также не обнаружено влияния вариантных транслокаций и ДХА в РЬ-позитивных клетках, выявленных до начала терапии иматинибом, на достижение полного ЦГО на терапию иматинибом (р=0,25646).

Таким образом, достижение большого и полного ЦГО не зависит от наличия клонов клеток с вариантными транслокациями и дополнительными хромосомными аномалиями в РЬ-позитивных клетках костного мозга, выявленных до начала терапии иматинибом. Наиболее вероятно, что до начала терапии иматинибом повышенная активность ВСЯ-АВЬ тирозинкиназы приводит к генетической нестабильности, в результате которой возможно образование клонов с дополнительными хромосомными аномалиями. Однако, под действием иматиниба РЬ-позитивные клетки с

дополнительными хромосомными аномалиями элиминируются так же, как и клоны клеток, имеющие только РЬ-хромосому.

Исследование стандартным цитогенетическим и молекулярно-цитогенетическим методами клеток костного мозга в процессе терапии иматинибом позволяют в полной мере оценить редукцию опухолевого клона клеток, преимущественно - в течение первых 12 месяцев терапии. В нашем исследовании при медиане длительности терапии иматинибом 24 месяца (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 84) среди 298 обследованных пациентов с ХМЛ, получавших терапию иматинибом 6 или более месяцев, у 197 (66,1%) больных был достигнут большой ЦГО, когда при цитогенетическом исследовании костного мозга РЬ-положительные клетки составляют менее 35% миелокариоцитов (рис.1). Из них в срок после 6 месяцев терапии иматинибом большой ЦГО был достигнут у 135 (45,3 %) пациентов. У остальных 62 (20,8%) больных БЦГО был достигнут в сроки 12 - 72 месяца. Однако, у 101 больного ХМЛ (33,9%) большой ЦГО не был достигнут на терапии иматинибом вообще.

Полный ЦГО на терапию иматинибом, когда РЬ-положительные клетки в костном мозге не обнаруживаются цитогенетическим методом, был достигнут у 157 (59,7%) больных ХМЛ из 263 пациентов, получавших терапию иматинибом 12 или более месяцев (рис.1). Из них в срок после 12 месяцев терапии иматнибом полный ЦГО был достигнут у 119 больных (45,2%). У остальных 38 больных (14,5 %) полный ЦГО был достигнут в сроки 18 - 72 месяца и у 106 (40,3 %) пациентов полный ЦГО на терапию иматинибом не был достигнут вообще.

Рис. 1. Структура цитогенетического ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ, находившихся на терапии 6 и более месяцев (А), 12 и более месяцев (Б).

Редукция клона РЬ-позитивных опухолевых клеток в ответ на терапию иматинибом является, несомненно, мультифакториальным процессом, зависящим от многих факторов. Особенный интерес вызывает рефрактерность к иматинибу пациентов, которая обусловлена, вероятно, разными механизмами развития первичной резистентности, в частности генетическими. Изучение этих механизмов имеет огромное клиническое значение, поскольку может привести к выявлению прогностических факторов,

позволяющих предвидеть благоприятный исход или прогрессию заболевания. Более того, выяснение причин рефрактерности может помочь оптимизировать терапию ХМЛ - повысить дозу иматиниба, перейти на терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) второго поколения, принять решение о трансплантации костного мозга.

Однако, отсутствие цитогенетического ответа может быть ассоциировано с различными факторами. В нашем исследовании проведен поиск возможных корреляционных связей некоторых демографических показателей (возраст, пол пациентов), продолжительности периода С'Т установления диагноза до начала терапии иматинибом, режима терапии ХМЛ (предшествующей иматинибу цитостатической терапии, перерывов в терапии иматинибом) с достижением цитогенетического ответа на терапию иматинибом.

Хронический миелолейкоз развивается преимущественно у людей среднего возраста. В нашем исследовании медиана возраста также составила 46,6 лет. Тем не менее, отмечены возрастные колебания на момент установления диагноза ХМЛ от минимального 12,9 лет до максимального 77,4 года, которые возможно влияют на достижения большого и полного ЦГО при терапии иматинибом. Однако, проведенный корреляционный анализ не выявил связи между возрастом пациентов и достижением БЦГО (г=0.027, р=0.74) и ПЦГО (г=-0.056 р=0.49).

В группе обследованных пациентов отмечены заметные тендерные различия - среди впервые выявленных пациентов с ХМЛ было 137 мужчин и 161 женщина. Однако, проведенный корреляционный анализ также ые обнаружил связи между достижением БЦГО и ПЦГО с одной стороны и полом пациента с другой стороны (для БЦГО - р.=0,66223 и для ПЦГО -р=0,63613).

По некоторым данным литературы, редукция опухолевых клеток, выявляемая цитогенетическим методом, зависит от длительности периода до начала терапии иматинибом. В связи с этим нами проведен корреляционный анализ зависимости времени достижения БЦГО и ПЦГО от длительности периода между постановкой клинического диагноза ХМЛ и началом терапии иматинибом. Из обследованной когорты пациентов с ХМЛ (п=298) только 2 (0,7%) пациента получили терапию ингибитором тирозинкиназ - иматинибом в течение 1 месяца после установления диагноза. У 296 (99,3 %) больных медиана длительности периода до начала терапии иматинибом составила 8 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц и максимальная - 120 месяцев. Однако, корреляционный анализ не обнаружил зависимости достижения БЦГО (г=0,1376, р= 0,0931) и ПЦГО (г=0,0507, р=0,5376) от длительности периода до начала терапии иматинибом.

Поскольку пациенты получали различную предшествующую иматинибу терапию, также была исследована возможная корреляционная связь между временем достижения БЦГО, ПЦГО на фоне терапии иматинибом и предшествующей терапией гидроксикарбомидом, бусульфаном и интерферона-а. В результате статистического анализа связи достижения

БЦГО и предшествующей терапией гидроксикарбомидом выявлена слабая корреляционная связь (г=0,2149, р=0,0083). Однако, между достижением ПЦГО и предшествующей терапией гидроксикарбомидом корреляционной связи не выявлено (г=0,0918, р=0,2637). Данный факт легко объясняется тем обстоятельством, что достижение БЦГО является наименее "жестким" показателем эффективности терапии иматинибом с позиций статистического анализа. Также не обнаружено корреляционной связи между временем достижения БЦГО, ПЦГО и предшествующей иматикибу терапией бусульфаном (г=0,0992, р=0,2269 для БЦГО; г=0,1182, р=0,1496 для ПЦГО) и интерфероном-а (г=-0Л057, р=0,1981 для БЦГО; г=-0,1147, р=0,1621 для ПЦГО).

В нашем исследовании было изучено влияние на вероятность достижения БЦГО и ПЦГО перерывов в терапии иматинибом, вызванных токсичностью препарата и необоснованным нарушением режима приема препарата. При медиане длительности терапии иматинибом в изученной когорте пациентов с ХМЛ 24 месяца у 95 (31,9%) пациентов выявлены от 1 до б эпизодов перерывов в терапии иматинибом. Медиана длительности перерывов в терапии составила 60 дней (минимальное значение - 5 дней, максимальное - 427 дней). С целью проверки гипотезы о влиянии перерывов были изучены различия вероятности достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с перерывами более 30 дней (половина медианы) и без перерывов. В результате проведенного исследования было обнаружено статистически достоверное снижение вероятности достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с перерывами в терапии иматинибом (БЦГО - р = 0,00246 и ПЦГО - р = 0,00013) (рис. 2). Особенно заметно влияние перерывов в течение первого года терапии. Так, у пациентов с перерывами в терапии более 30 дней вероятность достижения БЦГО и ПЦГО после 6 и 12 месяцев терапии в 2 раза меньше, чем у пациентов без перерывов.

Таким образом, проведенный корреляционный анализ не выявил статистически достоверной связи между возрастом, полом пациентов, длительностью периода от момента постановки клинического диагноза до начала терапии иматинибом, предшествующей терапии препаратами гидроксикарбомида, бусульфана и интерферона, длительностью терапии иматинибом с одной стороны и достижением цитогенетического ответа с другой стороны. Однако, была обнаружена статистически достоверная зависимость достижения цитогенетического ответа от непрерывности терапии иматинибом. Перерывы терапии иматинибом более 30 дней при медиане длительности терапии 24 месяца приводят к снижению в 2 раза вероятности редукции опухолевого клона до полного цитогенетического ответа.

о Complete * Censored

1.0 j

0,9

0.8

0,7

Я 0.6 С

* г, с

5 0> ' S

§ о/ =t

0,3 0,2

Нет перерывов в терапии

Перерывы в терапии

5 10 15 20 25 30 35 40 46 50 55 Время (мес.)

Рис. 2. Вероятность достижения полного ЦГО у больных ХМЛ в зависимости от перерывов терапии иматинибом.

Исследование стандартным цитогенетическим методом клеток костного мозга в процессе терапии иматинибом позволяет оценить не только редукцию опухолевого клона клеток, но и выявить признаки клональной цитогенетической эволюции - дополнительные хромосомные аномалии (ДХА) в РЬ-позитивных клетках. Появление ДХА в РЬ-позитивных клетках на фоне терапии иматинибом означает появление новых клонов опухолевых клеток с дополнительными, помимо 1:(9;22)(я34^11.2), хромосомными аберрациями.

В результате проведенного исследования клоны опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аномалиями в РЬ-позитивных клетках костного мозга были обнаружены у 33 пациентов с ХМЛ (11%) из 298 больных, включенных в исследование. Медиана возраста в группе больных ХМЛ с ДХА составила 48,8 лет (минимальный возраст - 18,9 лет, максимальный - 72,1 года). Отношение мужчины/женщины — 12/6. К началу терапии иматинибом 18 пациентов (54,5%) были в хронической фазе ХМЛ, 15 пациентов (45,5%) - в фазе акселерации. Медиана длительности терапии иматинибом составила 18 месяцев (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 60). В группе пациентов с ХМЛ без ДХА (п=265, 89,0%) медиана возраста составила 46,3 года (минимальный возраст - 12,9 лет, максимальный - 77,4 года). Отношение мужчины/женщины - 119/146. К началу терапии иматинибом в хронической фазе были 197 пациентов (74,3%) и в фазе акселерации 67 пациентов (25,7%). Медиана длительности терапии иматинибом составила 24 месяца (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 84).

У 15 пациентов ДХА были обнаружены при стандартном цитогенетическом исследовании (таблица 3). Наиболее частой хромосомной аберрацией, выявляемой в Ph-положительных клетках костного мозга, явилась дополнительная Ph-хромосома +der(22)(9;22). Еще у 18 больных ДХА -дупликация Ph-хромосомы определялась только методом интерфазной флуоресцентной гибридизации хромосом in situ (FISH) в виде амплификации (удвоения) гена BCR-ABL (таблица 4). Таким образом, дупликация Ph-хромосомы цитогенетическим или FISH методом была выявлена в 27 случаях (81,8%) из 33. Количество клеток с дополнительной Ph-хромосомой при цитогенетическом исследовании варьировало от 10% до 50%. Количество клеток с амплификацией гена BCR-ABL среди 5С7?-ДЖ-позитивных клеток при FISH исследовании варьировало от 3 % до 72%.

Таблица 3.

Кариотипы костного мозга больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аномалиями в РЬ-позитивных клетках._

№ Ф.И. Кариотип

1 A.B. 46,XY,t(9;22)(q34;qll.2)[7]/48,XY,t(9;22)(q34;qll.2),+14,+der(22)t(9;22)[2]/46,XY[l 1]

2 БА. 46,XX,t(9;22)(q34;qll.2)[14]/46,XX,t(9;22)(q34;qll.2),i(17)(ql0)[6]

3 Б.В. 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2)[18]/ 47,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2),+der(22)t(9;22)[2]

4 Д.А. 46,XY,t(9;22)(q34;qll.2)tl6]/47,XY,t(9;22)(q34;qll.2),+der(22)t(9;22)[4]

5 И.А. 45,X,-Y, t(9;22)(q34;qll.2)[20]

6 К.А. 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2)[9]/47,XY,t(9;22)(q34;q 11.2),+der(22)t(9;22)[ 10]/46,XY[l ]

7 М.Л. 46,XX,t(9;22)(q34;qll.2)[18]/46,XX,t(2;20)(pl2;ql3),t(9;22)(q34;qll.2)[2]

8 Н.Е. 46JXX,t(9;22Xq34;qll.2)[13}/47JXX,t(9;22)(q34;qll.2)5+der(22)t(9;22)[l]/ 47,XX,t(9;22)(q34;ql 1.2), i(17)(ql0),+der(22)t(9;22)[l], 46,XX[5]

9 Н.В. 46,XX,t(9;22)(q34;q 11.2)[7]/46,XX,t(9;22)(q34;q 11,2),+22[3 ]/46,XX[ 10]

10 П.Н. 46,XX3t(9;22)(q34;q 11.2)[18]/47,XX,t(9;22)(q34;ql 1,2),+der(22)t(9;22)[2]

11 С.Г. 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2) 18]/48,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2),+22,+der(22)t(9;22)[2]

12 С.Н. 46,XX,t(9;22)(q34;q 11.2)[17]/47,XX,t(9;22)(q34;q 11.2),+der(22)t(9;22)[2]/46,XX[ l ]

13 Т.Н. 46,XY,t(9;22)(q34;qll.2)[3]/475XY,t(9;22)(q34;ql 1.2),+8[3]/46,XY[14]

14 У.С. 46,XX,t(9;22)(q3 4;q 11.2)[13]/46,XX,t(9;22)(q34;ql 1.2),-5,+mar[2]/46,XX[4]

15 Ч.А.В. 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2)[13]/47,XY,t(9;22)(q34;ql 1.2),+dcr(22)t(9;22)[2]/46,XY[5]

Таблица 4.

Результаты FISH исследований костного мозга больных XMJI с дупликацией

гена BCR-ABL.

№ Ф.И. Результат FISH

1 Щ.Л. nue ish (ABLlx3),(BCRx3),(ABLlconBCRx2)[161/200]/(ABLlx4),(BCRx4), (ABL1 conBCRx3)[ 10/200]/(ABLlx8-12), (BCRx9-12), (ABL 1 conBCRx9-l2) [3/200] /(ABL1 ,BCR)x2[26/200]

2 х.к. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[l 11/200]/(ABLlx4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[71 /200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[ 18/200]

3 т.з. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLIconBCRx2)[87/200]/(ABLlx2), (BCRx2), (ABL 1 conBCRxl)[62/200]/ (ABLlx5-6), (BCRx5-6), (AB LlconBCRx4)f6/200]/ (ABL 1x2), (BCRx2) [45/200]

4 со. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[106/140]/(ABLlx2), (BCRx2), (ABL 1 conBCRx 1 )[ 14/140]/ (ABLx4), (BCRx4), (AB LI conBCRx3) [4/140]/ (ABLlx2), (BCRx2)[76/t40]

5 Р.Л. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABL lconBCRx2)[ 140/200]/(ABL 1x4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[44/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[l6/200]

6 П.А. nue ish (ABL 1x4), (BCRx4), (ABLlconBCRx3)[ 144/200]/ (ABLlx3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[46/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)f 10/200]

7 П.Л. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[47/200]/(ABLlx4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)r6/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[ 147/200]

8 к.с. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABL lconBCRx2)[ 169/200]/(ABL 1x4-5), (BCRx4-5), (ABL 1 conBCRx3-4)[6/200]/(ABL 1 x2),(BCRx2) [25/200]

9 к.в. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[132/200]/ (ABLlx2), (BCRx2), (ABL 1 conBCRx 1 )[35/200]/ (ABL 1x4), (BCRx4), (ABLlconBCRx3) [15/200]/(ABLlx3), (BCRx2), ABL 1 conBCRx 1)[ 14/200]/ (ABL 1x2), (BCRx2)[4/200]

10 Б.С. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLleonBCRx2)[28/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[8/200]/ (ABL 1x2), (BCRx2)[ 164/200]

11 Б.О. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABL lconBCRx2)[169/200]/(ABL 1x4-5), (BCRx4-5), (ABLlconBCRx3-4)[l 1/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[20/200]

12 Б.А. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[136/200]/(ABLlx4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[41/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[23/200]

13 М.М. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLleonBCRx2)[ 102/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABLlconBCRx3)[65/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[33/200]

14 Л.Г. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[26/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[23/200]/ (ABLIx2), (BCRx2)[ 151/200]

15 Д.Л. nue ish (ABLlx3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[47/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABLlconBCRx3)[6/200]/ (ABL 1x2), (BCRx2)[ 147/200]

16 Г.Л. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLleonBCRx2)[154/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABL1 conBCRx3)[ 16/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[30/200]

17 С.Р. nue ish (ABLlx3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[120/200]/ (ABL 1x4), (BCRx4), (ABL 1 conBCRx3)[6/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[74/200]

18 к.в. nue ish (ABL 1x3), (BCRx3), (ABLlconBCRx2)[154/200]/ (ABLlx4), (BCRx4), (ABLlconBCRx3)[26/200]/ (ABLlx2), (BCRx2)[20/200]

Среди 33 больных XMJI, у которых контрольные мониторинговые СЦИ или FISH анализ выявили в костном мозге клоны Ph-позитивных опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аномалиями и амплификацией гена BCR-ABL, появившимися на фоне терапии иматинибом, большой ЦГО

был достигнут только у 11 пациентов (33,3%) и не достигнут у 22 пациентов (66,7%). В соответствии с критериями Европейского общества по лечению лейкозов (ЕЬ1М) к 6 месяцу терапии БЦГО был достигнут у 21% пациентов с ДХА, а к 12-му месяцу - только у 28%, что более чем в 2 раза меньше по сравнению с группой пациентов без ДХА. Среди 265 пациентов с ХМЛ, в РЬ-позитивных клетках костного мозга которых ДХА не определялись, большой цитогенетический ответ (БЦГО - РЪ-положительных клеток в костном мозге менее 35%) на терапии иматинибом был достигнут у 186 больных (70,2%) и не достигнут у 79 пациентов (29,8%). В этой группе больных ХМЛ к 6 месяцу терапии иматинибом БЦГО был достигнут у 48% пациентов, а к 12 месяцу - у 60% больных. Анализ вероятности достижения БЦГО на терапию иматинибом показал, что у пациентов, не имеющих ДХА, она составляет 83%, тогда как у пациентов с ДХА - всего лишь 40% (р=0,00001) (рис.3).

Рис. 3. Вероятность достижения большого цитогенетического ответа (БЦГО) у больных ХМЛ в зависимости от наличия клонов РЬ-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями (ДХА)(п=33).

Также было выявлено, что среди 33 пациентов с ДХА полный ЦГО был достигнут только у 6 больных (18,2%) и не достигнут у 27 (81,8%) пациентов. К 12 месяцу терапии ПЦГО наблюдался всего лишь у 13% пациентов, а к 18 месяцу у 18% больных. Для сравнения, полный цитогенетический ответ на терапию иматинибом был достигнут у больных ХМЛ без ДХА в РЬ-позитивных клетках костного мозга в 151 случае (57,0%) и не достигнут в у 114 больных (43,0%). К 12 месяцу терапии ПЦГО был достигнут в 45% случаев, а к 18 месяцу - 52% больных ХМЛ в этой группе. Вероятность достижения ПЦГО у пациентов без ДХА составила 70%, а у пациентов с ДХА - 27% (рис.4). Выявленные различия статистически высоко значимы (р=0,00002).

Рис.4. Вероятность достижения ПЦГО у больных ХМЛ в зависимости от наличия клонов РЬ-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями (ДХА)(п=33).

Вероятность пятилетней общей выживаемости по Каплану-Майеру среди пациентов, у которых не обнаружены ДХА в РЬ-позитивных клетках костного мозга, составила 97%. У пациентов с ДХА расчетная пятилетняя общая выживаемость выявлена на уровне 74% (рис. 5). Различия расчетной выживаемости в этих двух группах пациентов статистически достоверны и высоко значимы (р=0,00002).

о Сотр1е& * Сепвогей 1,06 -;-------1-

I 0,90.........

I ?

| 0.85 • I

а

0,80 -0,75

0,70-_----.------—------

О 10 20 30 40 - 60 60 70

Время (мес.)

Рис.5. Вероятность 5-летней общей выживаемости по Каплану-Майеру у 298 пациентов с ХМЛ в зависимости от появления ДХА в РЬ-позитивных клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом. Сплошная линия - пациенты без ДХА (п=265), пунктирная линия - пациенты с ДХА (п=33).

Таким образом, в результате проведенного исследования Ph-позитивные клоны клеток с ДХА в костном мозге были обнаружены у 33 пациентов с ХМЛ (11%) из 298 больных, включенных в исследование. Наиболее частой ДХА явилась дополнительная Ph-хромосома +der(22)(9;22), выявленная как стандартным цитогенетическим методом исследования, так и методом FISH в виде амплификации гена BCR-ABL. Анализ вероятности достижения БЦГО на терапию иматинибом показал, что у пациентов с ДХА вероятность достижения БЦГО в 2,1 раза меньше, чем у пациентов без ДХА, а вероятность достижения ПЦГО - в 2,6 раза меньше, чем у пациентов без ДХА. Более того, вероятность 5-летней общей выживаемости по Каплану-Майеру у пациентов с ДХА, появившимися на фоне терапии иматинибом, достоверно ниже, чем у пациентов без ДХА. Наиболее вероятно, что Ph-позитивные клетки с ДХА, обнаруженные на фоне терапии иматинибом, появляются в результате повышенной активности BCR-ABL тирозинкиназы. Эти клетки могли существовать до начала терапии иматинибом в виде низкоуровневых клонов, не выявлявшихся цитогенетическим методом. При терапии иматинибом низкоуровневые клоны с ДХА, обладающие резистентностью к иматинибу, могут получать преимущества в выживании и количество Ph-клеток с ДХА увеличивается. Также клоны Ph-позитивных опухолевых клеток с ДХА могут появляться и de novo в процессе терапии иматинибом в связи с недостаточным подавлением активности BCR-ABL тирозинкиназы.

Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза.

Молекулярно-генегическое исследование методом ПЦР в режиме реального времени было выполнено от 1 до 5 раз у 287 пациентов с ХМЛ из 298 включенных в исследование.

Наибольший интерес представляет оценка минимальной остаточной болезни методом количественной ПЦР в реальном времени в группе пациентов с ПЦГО (п^Ш). Среди пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 0 копий BCR-Л5£х106/копий ABL. Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в этой группе пациентов составил от 0 до 9753 копий гена BCR-ABL х106/копий ABL.

Среди этой группы больных ХМЛ, достигших ПЦГО, в 75 (54,3%) случаях выявлен полный молекулярный ответ (0 копий гена BCR-ABL х10б/копий ABL). У 63 (45,7%) больных ХМЛ с ПЦГО был обнаружен остаточный опухолевый клон клеток. В группе пациентов с признаками минимальной остаточной болезни медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL, минимальное и максимальное значение экспрессии та же, что и в общей группе пациентов с ПЦГО.

В группе пациентов с частичным цитогенетическим ответом (ЧЦГО, п=44), у которых Ph-хромосома выявлялась в 1%-35% клеток костного мозга, медиана экспрессии гена BCR-ABL была уже выше и составила 8266 копий гена ВС/?-ЛШ,х106/копий ABL, максимальное значение - 67299 копий BCR-Л51х10б/копий ABL, минимальное - 1006 копий 5СЯ-ЛД£х10б/копий ABL.

У пациентов с малым (п=17) и минимальным (п=35) цито генетическим и ответами (36-65% и 66-95% Ph-позигивных клеток в костном мозге соотвественно) медиана экспрессии гена BCR-ABL практически не отличалась (36833 и 39215 копий BCR-ABLx 106/копий ABL). Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с малым цитогенетическим ответом колебался от 9208 до 297222, у больных XMJI с минимальным цитогенетическим ответом -от 2224 до 537923 копий £СЯ-Л££х106/копий ABL.

У пациентов с ХМЛ (п=53) без цитогенетического ответа на терапию иматинибом (Ph-хромосома обнаружена в >95% клеток костного мозга) медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 74457 копий BCR-ABLxlQ /копий ABL, максимальное значение - 797101 копий BCR-ЛЖхЮ6/копий ABL, а минимальное - 2943 копий BCR-ABLx 106/копий ABL (табл. 5).

Таблица 5.

Уровень экспрессии гена BCR-ABL в группах больных ХМЛ с различными

вариантами цитогенетического ответа на терапию иматинибом

Молекулярный ответ Цитогенетический ответ

Экспрессия BCR-ABL Значение ПЦГО (п»138) чцго (п=44) МЦГО (п~17) МинЦГО (п=35) Нет ЦГО (п=53)

копии гена BCR-ABL хЮ(' /копии гена ABL Медиана 0 8266 36833 39215 74457

Максимальное значение 9753 67299 297222 537923 797101

Минимальное значение 0 1006 9208 2224 2943

копии гена BCR-ABL х 100% /копии гена ABL (%) Медиана % 0 0,83 3,5 3,9 7,4

Максимальное значение % 0,97 6,7 29 53 79

Минимальное значение % 0 0,1 0,9 0,2 0,3

Alog экспрессии Гена BCR-ABL Медиана (Д1о§) 4,97 1,03 0,49 0,38 0,10

Максимальное снижение (Д^) 4,97 1,97 1,34 1,62 2,24

Минимальное снижение (Д^) од 0,14 -0,5 -0,76 -0,93

С целью стандартизации и сопоставимости результатов исследования экспрессии гена BCR-ABL, полученных методом количественной ПЦР в реальном времени, экспрессия гена BCR-ABL оценивалась также как отношение экспрессии гена BCR-ABL к экспрессии контрольного гена (в нашем случае это ген ABL), умноженной на 100%, Обнаружение гена BCR-ABL на уровне 1% и более свидетельствует о выраженной экспрессии, оценить которую еще возможно с помощью стандартного цитогенетического исследования. Уровень экспрессии гена BCR-ABL 0,1-1% свидетельствует об умеренном уровне экспрессии, который уже невозможно оценить с помощью стандартного цитогенетического исследования. Определение экспрессии гена

BCR-ABL на уровне 0,1% и менее говорит о наличии у пациента большого молекулярного ответа.

В группе пациентов с ПЦГО медиана экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови составила 0%, максимальное значение экспрессии гена - 0,97%, а минимальное значение составило 0%. В группе пациентов, достигших ЧЦГО, медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 6,7%, максимальное значение экспрессии - 6,7%, а минимальное - 0,1%. У больных с малым и минимальными цитогенетическими ответами медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 3,5% и 3,9%, максимальное значение -29% и 53%, а минимальное значение- 0,9% и 0,2%, соответственно (табл. 5).

Таким образом, у всех пациентов с ПЦГО (п=138), когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом, экспрессия гена BCR-ABL не превышала 1%. Поэтому использование в рутинной практике результатов количественной ПЦР для мониторинга терапии ХМЛ у пациентов с ПЦГО бесспорно. Однако, в случаях ЧЦГО уровень экспрессии гена BCR-ABL колебался от 0,1% до 6,7%, что затрудняет использование результатов молекулярно-генетического исследования для оценки ответа на проводимую терапию у пациентов с ЧЦГО. У пациентов с малым и минимальным цитогентическими ответами уровень экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови практически не различался. Важно, что в некоторых случаях минимального цитогенетического ответа, когда Ph-хромосома обнаруживается в костном мозге в 66-95% клеток, уровень экспрессии гена BCR-ABL был на уровне от 0,2% до 53%. В случаях отсутствия цитогенетического ответа отмечена максимальная экспрессия, но колебания ее значений очень высоки (0,3 - 79%).

Исследование динамики изменений экспрессии гена BCR-ABL в процессе терапии ХМЛ позволяет оценить редукцию клона лейкозных клеток. В связи с те' % что оценить изначальную экспрессию гена BCR-ABL у каждого больного не представлялось возможным, в исследовании использован методический подход, основанный на определении медианы базового уровня (БУ) экспрессии у 30 впревые выявленных больных ХМЛ до начала терапии иматинибом. Дальнейшая оценка динамики изменений экспрессии гена BCR-ABL, а следовательно и редукции количества опухолевых клеток, у каждого пациента ХМЛ, получавшего терапию иматинибом, основывалась на сравнении с БУ. При этом результаты исследований выражали в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (Alog) по отношению к базовому уровню. Снижение экспрессии на 1 log по отношению к базовому уровню означало снижение уровня экспрессии BCR-ABL транскрипта в 10 раз, на 2 log-в 100 раз, наЗ log - в 1000 раз, на 4 log - в 10000 раз.

Экспрессия гена BCR-ABL была определена у 30 больных с впервые диагностированным хроническим миелоидным лейкозом до начала терапии. Диапазон значений экспрессии у этих больных составил от 9118 до 501189 копий BCR-ABLx 106/копий ABL. Медиана экспрессии гена BCR-ABL у этих больных с впервые выявленным ХМЛ составила 94211 копий BCR-

Л51х106/копий ABL или 4,97 log. Это значение было принято за величину базового уровня (БУ).

Медиана снижения уровня экспрессии гена BCR-ABL (Alog) относительно БУ экспрессии в случае полного цитогенетического ответа составила 4,97 log. Максимальное снижение составило, естественно, 4,97 log, а минимальное - 0,1 log. В случаях достижения БЦГО медиана снижения экспрессии была на уровне 1,03 log. При этом диапазон значений колебался в пределах 0,14-1,97 log. Медианы снижения экспрессии при малом и минимальном цитогенетическом ответах составили 0,49 и 0,38 соответственно, максимальный Alog: 1,34 и 1,62 соответственно, минимальный Alog: -0,5 и -0,76 соответственно. В случаях выявления Ph-хромосомы в 95-100 % клеток костного мозга (отсутствие цитогенетического ответа на проводимую терапию) медиана снижения относительно БУ составила всего лишь 0,1 log, минимальное значение - -0,93, максимальное - 2,24.

Несомненно, изменение уровня экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, отражающее динамику редукции опухолевого клона, имеет клиническое значение. При сопоставлении процента Ph-положительных клеток в костном мозге и уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови обнаружен широкий диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в различных группах.

В связи с этим был проведен корреляционный анализ достигнутого пациентами цитогенетического ответа и результатов молекулярно-генетического исследования, выраженного в количестве копий гена BCR-ABL)с106/копий ABL, в процентах относительно уровня экспрессии контрольного гена ABL (%) и в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (Alog) по отношению к базовому уровню.

Проведенный анализ показал, что все показатели коррелируют между собой. Естественно, что абсолютно коррелируют между собой результаты исследования методом ПЦР в режиме реального времени, выраженные в количестве копий гена BCR-ABLx 106 по отношению к количеству копий гена ABL и в процентном отношении к гену ABL (г=1,000). Преимущества последнего способа выражения обусловлены возможностью четкого определения большого молекулярного ответа, при котором экспрессия гена BCR-ABL определяется на уровне 0,1% и меньше. Связь же этих показателей с результатами ПЦР, выраженными как десятичный логарифм снижения экспрессии (Alog) по отношению к базовому уровню умеренной силы (г=-0,474 и г=-0,475).

В нашем исследовании установлена умеренная корреляционная связь между результатами цитогенетического исследования (% Ph-положительных клеток в костном мозге) и уровнем экспрессии гена BCR-ABL в клетках крови, что позволяет использовать молекулярно-генетический метод для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Корреляционная связь между цитогенетическим ответом и уровнем экспрессии гена BCR-ABL, выраженным в процентах и количестве копий гена BCR-ABLx 10б по отношению к гену ABL, умеренной силы и г составляет

0,5000. Максимальная сила корреляционной связи установлена между результатом цитогенетического анализа и количественных ПЦР исследований, когда результаты последних оценивались в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (Alog) по отношению к БУ (г=-0,687). Корреляционная связь отрицательная, поскольку чем больше экспрессия гена BCR-ABL в клетках крови (а следовательно, больше Ph-позитивных опухолевых клеток), тем меньше Alog снижения экспрессии гена BCR-ABL относительно БУ.

Сравнение анализируемых групп с различными вариантами цитогенетического ответа в зависимости от определенной медианы уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови, выраженное в копиях BCR-ABLx 106 /ABL, процентном отношении к контрольному гену ABL и Alog снижения экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, статистически достоверны только при сравнении группы пациентов с ПЦГО и группы больных XMJI, не ответивших на терапию иматинибом (р>0,05).

Таким образом, полученные результаты исследования экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови свидетельствуют о целесообразности использования метода количественной ПЦР для диагностики и мониторинга эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ пациентов с ХМЛ. Наиболее информативна оценка минимальной остаточной болезни (количества BCR-ABL позитивных клеток крови) в виде десятичного логарифма снижения экспрессии гена BCR-ABL (Alog) по отношению к базовому уровню его экспрессии. Наиболее целесообразно проводить молекулярно-генетические исследования после достижения ПЦГО, когда стандартное цитогенетическое исследование оказывается неинформативным и только молекулярно-генетическое исследование позволяет оценить степень редукции опухолевого клона. Достижение большого молекулярного ответа, определяемого как экспрессия гена BCR-ABL на уровне менее 0,1% или редукция экспрессии более чем на 3 log, является наиболее важным критерием молекулярного ответа на терапию ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

В связи с тем, что наиболее информативны и клинически значимы данные о снижении экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, структура молекулярного ответа в анализируемых цитогенетических группах исследована в соответствии с уровнем Alog снижения экспрессии гена BCR-ABL. При анализе структуры молекулярного ответа (рис.6) было установлено, что в группе пациентов с полным ЦГО (п=138) у 84 (60,9%) больных выявлено снижение экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log по сравнению с базовым уровнем, в 15 (10,9%) случаях - на 2-2,99 log, в 36(26,10%) случаях - на 1-1,99 log. У 3 (2,1%) больных ХМЛ с полным ЦГО снижение экспрессии гена BCR-ABL оказалось на уровне менее чем 1 log. Таким образом, большой молекулярный ответ (БМО) выявлен более чем у половины больных ХМЛ с полным ЦГО, получавших терапию иматинибом. У большинства больных с полным ЦГО (71,8%) было отмечено снижение экспрессии BCR-ABL более чем на 2 log по сравнению с базовым уровнем.

<1 f 2-2.9Э f 4,97 1-1.99 >3 (ПМО)

ПЦГО (0%)

(БМО)

Молекулярный ответ (Alog)

Рис. 6. Структура молекулярного ответа у пациентов с полным цитогенетическим ответом (ПЦГО), частичным цитогенетическим ответом (ЧЦГО), малым цитогенетическим ответом (МЦГО), минимальным цитогенетическим ответом (МинЦГО) и отсутствием цитогенетического ответа (95-100% Ph-позитивных клеток))

В группе обследованных с помощью метода количественной ПЦР пациентов с XMJI (п=44) с частичным ЦГО редукция экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log не отмечена. В 3 (6,8%) случаях отмечено снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови на 2-2,99 log по сравнению с БУ, в 19 (43,2%) случаях - на 1-1,99 log, в 22 случаях (50,0%) случаев - менее чем на 1 log.

В группе больных XMJI с малым и минимальным цитогенетическим ответом, а также в группе не ответивших на терапию иматинибом (Ph-хромосома обнаруживалась более чем в 95% клеток костного мозга) в большинстве случаев выявлено снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови менее чем на 1 log по сравнению с базовым уровнем. Только у 4 пациентов, не ответивших на терапию иматинибом, отмечена заметная редукция экспрессии гена BCR-ABL на 1-1,99 log.

Несмотря на значительный диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL клетках периферической крови, были отмечены достоверные различия в значениях снижения экспрессии гена BCR-ABL между группами пациентов с отсутствием ответа на терапию иматинибом, малым, минимальным и частичным цитогенетическими ответами с одной стороны и группой с полным цитогенетическим ответом (р=0,0357) с другой стороны. Между группами с ЧЦГО, МЦГО, МинЦГО и отсутствием цитогенетического ответа статистически достоверных различий уровня снижения экспрессии гена BCR-ABL не обнаружено.

В нашем исследовании у 70 пациентов с хроническим миелоидным лейкозом было проведено динамическое наблюдение за минимальной остаточной болезнью методом количественной ПЦР в реальном времени. Повторное молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови проводилось в среднем через 6 месяцев (минимальный интервал повторного исследования 3 месяца, максимальный 12 месяцев). У 38 пациентов наблюдалось снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови: медиана снижения экспрессии гена относительно предыдущего результата составила 2,2 log, максимальное снижение составило - 5,8 log, а минимальное - 0,2 log.

В группе пациентов, у которых наблюдалось снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в 42% случаев редукция экспрессии гена составила более чем 3 log относительно предыдущего результата, в 19% случаев - на 22,99 log, в 13% случаев - на 1-1,99 log, в 26% случаев - менее чем на 1 log. Таким образом, у большинства пациентов с положительной динамикой ответа при терапии иматинибом (61%) было отмечено снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 2 log относительно предыдущего результата.

У 10 пациентов наблюдалось повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL: медиана повышения экспрессии гена BCR-ABL относительно предыдущего результата составила —1,38 log, максимальное повышение --3,1 log, а минимальное —0,42 log. В этой группе пациентов повышение экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log относительно предыдущего результата наблюдалось в 18% случаев, в 9% случаев - на 2-2,99 log, в 45% случаев - на 1-1,99 log, в 18% случаев - менее чем на 1 log. Таким образом, у большинства пациентов (82%) с отрицательной динамикой ответа на терапию иматинибом было отмечено повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 1 log относительно предыдущего результата.

Достижение большого молекулярного ответа (БМО) у пациентов с полным ЦГО, характеризующегося уровнем экспрессии гена BCR-ABL менее 0,1% или редукцией экспрессии на 3 log или более относительно БУ, является важнейшим критерием эффективности терапии XMJI. В соответствии с рекомендациями Европейского общества по лечению лейкозов (ELN) БМО должен быть достигнут при терапии иматинибом после 18 месяцев лечения. В нашем исследовании БМО достигли 84 (53,2%) пациента с XMJ1 из 158, достигших ПЦГО. Медиана времени достижения БМО составила 18 месяцев, а диапазон времени достижения БМО колебался от 6 до 72 месяцев.

В нашем исследовании было проверено влияние на вероятность достижения БМО различных факторов, в частности тех. которые оказывают влияние на достижение цитогенетического ответа: дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) в Ph-позитивных клетках костного мозга, мутаций гена BCR-ABL и перерывов в терапии иматинибом.

Анализ вероятности достижения БМО на терапию иматинибом показал, что у пациентов, не имеющих клонов Ph-позитивных клеток с ДХА на фоне терапии иматинибом, она составляет 50% при 5-летнем периоде наблюдения,

тогда как у пациентов с ДХА вероятность достижения БМО 0% (р=0,00404) (рис.7). _______________

и Сотр1е1е - Саплдой

О 10 20 30 40 50 60 70 60 СО 100 _Время (м«с) _

Рис. 7. Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных хроническим миелолейкозом (п=84) в зависимости от наличия клонов РЬ-позитивных клеткок с ДХА.

Достижение большого молекулярного ответа возможно только у пациентов, достигших полного цитогенетического ответа. При этом РЬ-хромосома не выявляется в клетках костного мозга. Однако, на фоне терапии иматинибом у некоторых больных появляются клоны РЬ-негативных клеток с хромосомными аберрациями. В нашем исследовании у 10 пациентов с полным ЦГО обнаружены клоны РЬ-негативных клеток с хромосомными аномалиями: у 4 пациентов +8, у 2 пациентов —7, у 2 пациентов +22, у 1 пациента ёе1(2)(я32), у 1 пациента 1(17)^10). Анализ вероятности достижения БМО при терапии иматинибом показал, что появление клонов РЬ-негативных клеток с ДХА на фоне терапии иматинибом не влияет на вероятность достижения БМО (р=0,74921) (рис.8).

Рис. 8 . Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных ХМЛ, достигших ПЦГО (п=84), в зависимости от наличия РЬ-негативных клонов клеток с хромосомными аномалиями (ДХА).

Перерывы в терапии иматинибом очевидно могут замедлить достижение БЦГО, ПЦГО и БМО. В результате проведенного исследования было обнаружено статистически достоверное снижение вероятности достижения БМО (рис.9) у пациентов с перерывами в терапии иматинибом более 30 дней за весь период лечения (р=0,04572).

о Complete * Censored

1,0 """ " ............ "" -------- --------------- "" ------------- ■— ' ...

0,9

0,8 0.7 Отсутствие перерывов в терапии

£ °,в 14) £ 0,5

i г-»-^ I

Ь о.д а 0,3 Гг ...............- I

0.2 I а - Перерывы в терапии |

0.1 j ^ Г"

0.0 о •

0 10 20 30 40 50 60 ТО 80 00 100

Время (мес.)

Рис.9. Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных XMJ1 в зависимости от перерывов терапии иматинибом.

Таким образом, эффективность молекулярно-генетического мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ бесспорна. Наиболее оправдано применение молекулярного мониторинга у пациентов с полным ЦГО, когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом. В достаточно репрезентативной когорте пациентов с ХМЛ, достигших полного ЦГО, экспрессия гена BCR-ABL не превышала 1%, а снижение экспрессии относительно базового уровня не менее чем на 1 log было выявлено у 98% пациентов с полным ЦГО. Значительные колебания экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с частичным ЦГО при лечении иматинибом не позволяют сделать однозначный вывод о необходимости молекулярных исследований у пациентов, еще сохраняющих Ph-позитивный клон клеток в костном мозге, доступный цитогенетическому анализу. У пациентов с малым и минимальным цитогенетическими ответами уровень экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови практически не различался, так же как и мало он отличался от уровня экспрессии гена BCR-ABL у рефрактерных к иматинибу пациентов, не ответивших на терапию ХМЛ.

При сопоставлении процента Ph-положительных клеток в костном мозге и уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови обнаружен широкий диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в различных группах. Полученные результаты свидетельствуют о наибольшей информативности оценки минимальной остаточной болезни (количества BCR-ABL позитивных клеток крови) по снижению десятичного логарифма

экспрессии гена ВСЯ-АВЬ (Л1с^) относительно базового уровня его экспрессии. Несомненно, изменение уровня экспрессии гена ВСК-АВЬ относительно БУ, отражающее динамику редукции опухолевого клона клеток, имеет наибольшее клиническое значение.

По нашему мнению, наиболее целесообразно проводить молекулярно-генетические исследования после достижения полного ЦГО, когда стандартное цитогенетическое исследование оказывается неинформативным и только молекулярно-генетическое исследование позволяет оценить степень редукции опухолевого клона. Исследование динамики экспрессии гена ВСЯ-АВЬ на фоне продолжающейся терапии иматинибом показало высокую чувствительность и лабильность этого показателя, что предполагает необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга после достижения полного ЦГО не менее 1 раза в 3 месяца.

Достижение большого молекулярного ответа, определяемого как экспрессия гена ВСК-АВЬ менее 0,1% или снижение экспрессии более чем на 3 1о§, является наиболее важным критерием молекулярного ответа на терапию ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Вероятность достижения большого МО достоверно снижается при наличии ДХА в РЬ-позитивных клетках, мутаций гена ВСК-АВЬ, а также перерывов в терапии иматинибом и не зависит от появления ДХА в РЬ-негативных клетках костного мозга.

Мутационный мониторинг терапии хронического миелолейкоза

В настоящая время роль мутаций гена ВСК-АВЬ в развитии вторичной резистентности определена. Данные о роли мутаций гена ВСК-АВЬ в формировании первичной резистентности единичны. Для проведения мутационного анализа в исследование включены 64 пациента с ХМЛ, рефрактерных к терапии иматинибом. В качестве критериев рефрактерности в нашем исследовании рассматривались отсутствие цитогенетического ответа после шести месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки, частичного цитогенетического ответа - после 12 месяцев терапии, полного цитогенетического ответа - после 18 месяцев терапии. Вторую группу составили пациенты с ХМЛ (п=30), достигшие цитогенетического ответа на терапию иматинибом (400 мг/ сутки) в течение 6-18 месяцев лечения в соответствии с критериями ЕЬИ.

В результате проведенного исследования в группе рефрактерных к иматинибу пациентов (п=64) были обнаружены миссенс-мутации у 16 (25,0%) пациентов (таблица 6). Среди этих пациентов 1 мутация выявлена у 10 (62,5%) пациентов и компаунд мутации (2 или 3) выявлены у 6 (37,5%) больных ХМЛ. Всего выявлено 23 мутации.

Таблица 6.

Мутации гена BCR-ABL, выявленные у рефрактерных к иматинибу пациентов с XMJI __

№ Пациент Мутация Соотношение клонов %N/%M

1 A.C. L248V 80/20

2 K.M. L248V 0/100

3 И.А. M244V + М351Т 0/100/10

4 K.M. L248V + F359C 0-20/70/80

5 И.З. T315I 0/100

6 Б.А. Q252E 40/60

7 Ш.В. M244I 80/20

8 М.Л. F311L 0/100

9 о.т. M244I 50/50

10 в.н. M244I + G255E 0-80/20/20

11 с.х. H396R 0/100

12 Х.С. L248V + T315S + Q346H 0/100/50/50

13 Д.Е. F401L 75/25

14 K.M. L248V + Y253H 0-20/80/15

15 о.т. М 2441 70/30

16 сл. Y253H + Y435C 0-50/50/50

Анализ локализации выявленных мутаций показал, что 15 (65,3%) из 23 выявленных мутаций локализованы в участке гена BCR-ABL, кодирующем Р-петлю (рис.12). Мутации Р-петли критичны, поскольку именно в ней расположен АТФ-связывающий карман, являющийся мишенью для иматиниба. Основным последствием мутаций, затрагивающих Р-петлю, являются нарушение связывания иматиниба с белком BCR-ABL тирозинкиназой. Выявленные мутации Р-петли по литературным данным приводят к значительному снижению чувствительности BCR-ABL позитивных клеток к иматинибу в тестах in vitro.

Рис.10. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих Р-петлю (Р), Ш-домен (1В), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы.

Среди рефрактерных к иматинибу пациентов с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL было 9 мужчин и 7 женщин. Медиана возраста у рефрактерных пациентов с обнаруженными мутациями составила 43 года (от 32 лет до 54 лет). У 6 (37,5%) рефрактерных к иматинибу пациентов с мутациями гена BCR-ABL на момент начала терапии иматинибом диагностирована хроническая фаза, у 10 (62,5%) - фаза акселерации. Медиана продолжительности периода от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом в группе рефрактерных пациентов с обнаруженными мутациями составила 19 месяцев (от 1 до 108 месяцев), что сопоставимо с медианой продолжительности всех обследованных паицентов (24 месяца). Все пациенты с обнаруженными мутациями с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом получали лечение препаратами гидроксикарбомида и медиана длительности этой терапии составила 18,5 месяцев (минимум - 1 месяц, максимум - 108 месяцев). Из них 1 пациент получал одновременно с гидроксикарбомида терапию бусульфаном. Еще один пациент после 5 месяцев терапии гедреа безуспешно получал терапию интерфероном-a в течение 7 месяцев. Медиана суточной дозы иматиниба за время наблюдения в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL составила 483,5 мг/сутки. В случаях обнаружения мутаций медиана длительности заболевания с момента установления диагноза до момента проведения мутационного анализа составила 22 месяца в группе пациентов с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL. Медиана длительности терапии иматинибом на момент проведения мутационного анализа в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL составила 21 месяц (минимум -6, максимум - 48 месяцев).

При сравнении двух групп пациентов с мутациями гена BCR-ABL и без мутаций с помощью двустороннего критерия Фишера по полу, возрасту, продолжительности периода от момента диагностики до начала терапии иматинибом, предшествующей иматинибу цитостатической терапии, средней суточной дозе иматиниба, длительности заболевания статистически значимых различий не обнаружено. Однако, мутации достоверно чаще обнаруживались у пациентов, начавших терапию иматинибом в фазе акселерации.

Проведенное исследование влияние мутаций гена BCR-ABL на вероятность достижения БЦГО, ПЦГО и БМО показало, что достижение цитогенетического и молекулярного ответов зависит от наличия мутаций в гене BCR-ABL: вероятность достижения БЦГО, ПЦГО и БМО статистически достоверно ниже у пациентов с мутациями гена BCR-ABL (БЦГО - р= 0,00028, ПЦГО - р=0,00699 и БМО - р=0,04572)(рис.11).

Рис.11. Вероятность достижения полного цитогенетического ответа (ПЦГО) у больных XMJ1 в зависимости от появления мутаций в гене BCR-ABL.

Таким образом, в нашем исследовании мутации гена BCR-ABL обнаружены у 16 (25,0%) из 64 пациентов, рефрактерных к иматинибу. Большая часть мутаций (65,3%) локализованы в области, кодирующей Р-петлю киназного домена BCR-ABL тирозикиназы, являющейся локусом связывания с иматинибом. В нашем исследовании не обнаружено статистически достоверных различий между группами рефрактерных пациентов с мутациями и без мутаций гена BCR-ABL по возрасту, полу, продолжительности периода от установления диагноза до начала терапии иматинибом, предшествующей иматинибу цитостатической терапии, средней суточной дозе иматиниба и длительности терапии иматинибом. По нашим данным, исследованные факторы не влияют на появление мутаций гена BCR-ABL у рефрактерных к иматинибу пациентов.

Различные мутации гена BCR-ABL сообщают BCR-ABL позитивным клеткам разный уровень резистентности к иматинибу в тестах in vitro. Тем не менее, анализ вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом показал, что при групповом анализе всех пациентов с выявленными мутациями у них значительно ниже вероятность достижения большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО, чем у пациентов без мутаций.

Фармакокинетический мониторинг терапии ХМЛ

В связи с тем, что терапевтический уровень концентрации иматиниба может оказывать влияние на достижение цитогенетического и молекулярного ответа, было предпринято исследование концентрации иматиниба у 188 пациентов с XMJI из 298. Концентрация препарата в плазме крови измерялась у всех пациентов, давших информированное согласие на проведение этого исследования. Из исследования были исключены 9 (4,8%) пациентов с XMJI, у

которых выявлено нарушение режима приема препарата. У этих больных ХМЛ концентрация иматиниба в плазме составила 0-197 нг/мл, что в соответствии с данными I фазы клинических испытаний свидетельствует о нарушении режима приема препарата по меньшей мере в течение нескольких дней. В исследовании определялась остаточная концентрация иматиниба в плазме через 24±3 часа после последнего приема (С1гои8н ), то есть перед очередным приемом иматиниба. В связи с этим из исследования исключены пациенты, принявшие иматиниб менее чем за 21 час и более чем за 27 часов до забора образцов крови. В результате анализировались фармакокинетические данные, полученные для 76 пациентов с ХМЛ.

Результаты измерения концентрации иматиниба в плазме крови были разбиты на квартили. Вероятность достижения БЦГО и ПЦГО оценивалась в зависимости от отношения пациента к 1 квартилю (25% пациентов с минимальной концентрацией иматиниба) или 4 квартилю(25% пациентов с максимальной концентрацией иматиниба). Анализ вероятности достижения БЦГО и ПЦГО не выявил статистически достоверных различий между уровнем достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с низкой (1 квартиль) и высокой (4 квартиль) концентрацией иматиниба в плазме (р=0,43719 и р-0,71240).

В исследование влияния концентрации иматиниба в плазме на достижение БМО были включены 49 пациентов. Все пациенты находились в хронической фазе заболевания и получали терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки в течение 18-36 месяцев.

Среди 49 пациентов, получавших терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки в течение 18-36 месяцев и включенных в наше исследование, 18 больных ХМЛ (36,7%) достигли большого молекулярного ответа (Д ^ ВСК-АВЬ > 3) и 31 пациент с ХМЛ (63,3%) не достиг большого молекулярного ответа (А ^ ВСЯ-АВЬ < 3).

В группе пациентов с ХМЛ (п=18), достигших большого молекулярного ответа, средний возраст составил 54 года, соотношение мужчин и женщин 8/10, средняя длительность терапии иматинибом - 29 месяцев. Среднее значение Стш иматиниба в плазме крови в этой группе пациентов составило 1729,2 ± 215,0 нг/мл, медиана - 1558,5 нг/мл, минимальное значение - 447,0 нг/мл, максимальное значение - 3394,0 нг/мл. Отмечена значительная вариабельность данного показателя, поскольку стандартное отклонение (б) в этой группе пациентов составило 916,2.

В группе пациентов с ХМЛ (п=31), не достигших большого молекулярно ответа, средний возраст составил 51 год, соотношение мужчин и женщин -16/15, средняя длительность терапии иматинибом - 24 месяца. Среднее значение Стш в плазме крови в этой группе пациентов составило 962Д ± 77,2 нг/мл, медиана - 922,0 нг/мл, минимальное значение - 263,0 нг/мл, максимальное значение - 2472,0 нг/мл. В этой группе пациентов также выявлена значительная вариабельность Ст;п - стандартное отклонение (б) составило 430,1.

Проведенный статистический анализ с использованием критерия Манна-Уитни (и - тест) показал, что между группами пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа и не достигших его, средние значения Стт иматиниба в плазме различаются статистически достоверно (р=0,0007). Использование критерия Спирмена показало, что уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ, а следовательно и объем опухолевого клона клеток, коррелирует с уровнем иматиниба (выявлена отрицательная корреляционная связь г=-0,4) с достоверностью р=0,006.

Распределение этих же групп пациентов по квартилям в зависимости от С(гоицЬ иматиниба показало, что 75% больных ХМЛ с молекулярной ремиссией имели концентрацию иматиниба выше 992 нг/мл (рис.12).

БМО нет БМО

Рис.12. Дисперсия медианы значения С1гоий1, иматиниба у больных ХМЛ с большим молекулярным ответом (БМО) и без большого молекулярного ответа (нет БМО). По оси ординат - С1гои8н иматиниба в нг/мл. Горизонтальные линии внутри прямоугольников соответствуют медиане Сц-о^и иматиниба в каждой группе. Верхняя и нижняя границы прямоугольников соответствуют третьему и первому квартилям Сггоиеь иматиниба, а горизонтальные линии на концах пунктирных линий - минимальное и максимальное значения С^^ иматиниба в каждой группе.

В нашей работе впервые было выполнено исследование концентрации иматиниба в межклеточной жидкости костного мозга, полученного в результате стернальной пункции у пациентов с ХМЛ. Измерение концентрации иматиниба в костном мозге с одновременным определением концентрации препарата в плазме крови выполнено у 144 пациентов с ХМЛ. Концентрация препарата в костном мозге была выше в среднем в 1, 4 раза, чем в плазме. Медиана отношения концентрации иматиниба в костном мозге к концентрации иматиниба в плазме составила 1,4 (минимум - 0,5, максимум -3,6). Корреляционный анализ выявил связь умеренной силы (г=0,6464, р=0,0000) между концентрацией препарата в плазме и костном мозге (рис.13)

Рис. 13. Корреляционная связь концентрации иматиниба в плазме и межклеточной жидкости костного мозга.

Так же, как и в случае с анализом влияния концентрации иматиниба в плазме, нами не обнаружено статистически достоверной разницы вероятности достижения БЦГО и ПЦГО в зависимости от концентрации иматиниба в костном мозге (р=0,67321 и р=0,76678 соответственно).

Таким образом, достижение терапевтической концентрации иматиниба в плазме крови является вариабельным показателем. Однако у пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа, концентрация иматиниба в плазме значительно выше, чем у больных ХМЛ, не достигших большого молекулярного ответа на терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Для пациентов с ХМЛ с низким уровнем иматиниба в плазме крови, получавших иматиниб в дозе 400 мг/сутки и не достигших в рекомендованные ЕЬК сроки большого молекулярного ответа, может быть рекомендовано повышение суточной дозы иматиниба до 600-800 мг.

Концентрация иматиниба в плазме коррелирует с концентрацией препарата в межклеточной жидкости костного мозга. Концентрация иматиниба в костном мозге незначительно зависит от "разбавленности" костного мозга периферической кровью и может быть в дальнейшем использована для анализа эффективности терапии иматинибом.

Алгоритм мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

Анализ впечатляющих результатов терапии иматинибом с одной стороны, как и понимание механизмов резистентности к иматинибу и путей ее преодоления с другой стороны, являются основой для разработки принципов эффективного применения ингибиторов тирозинкиназ второго поколения и других таргетных препаратов в гематологии и онкологии. В связи с этим, актуальна разработка четких методических подходов к мониторингу терапии ХМЛ и, как следствие, изменения тактики терапии ХМЛ.

В нашем исследовании выявлена высокая эффективность стандартного цитогенетического исследования, молекулярно-цитогенетического и молекулярного исследований для генетической диагностики ХМЛ. Однако, алгоритм мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозикиназ (рис.14) до достижения полного ЦГО непременно должен включать СЦИ. Использование молекулярно-генетического мониторинга до достижения полного цитогенетического ответа сомнительно, поскольку динамика снижения экспрессии гена ВСЯ-АВЬ не всегда отражает в полной мере редукцию клона опухолевых клеток. Напротив, после достижения полного ЦГО молекулярно-генетический метод является единственно возможным и довольно чувствительным подходом для оценки минимальной остаточной болезни.

Мониторинг

до достижения полного ЦГО I

Цитогенетический мониторинг

Оптимальный ответ на терапию

Субоптимальный

ответ или отсутствие ответа на терапию

Цитогенетический мониторинг

Фармакокинетический мониторинг

Мутационный мониторинг

Мониторинг после достижения полного ЦГО

Молекулярный мониторинг

Увеличение Снижение

экспрессии гена экспрессии гена

ВСЯ-АВ1 ВСИ-АВ1

ДХА в РЬ-позитивных клетках

Концентрация иматиниба < 1000 нг/мл

Мутации гена ВСК-АВ£

Рис.14. Алгоритм генетического мониторинга терапии ХМЛ

При отсутствии ответа на проводимую терапию или утрате достигнутого ответа необходимо проведение цитогенетического мониторинга с целью поиска клонов РЬ-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями. Появление таких клонов является неблагоприятным фактором, достоверно снижающим вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов на проводимую терапию.

Проведение фармакокинетического мониторинга необходимо прежде всего для исследования соблюдения пациентом режима приема препарата.

Низкая концентрация иматиниба или его отсутствие в плазме и костном мозге свидетельствуют о перерывах в терапии, значительно снижающих вероятность достижения ответа на лечение. Кроме того, концентрация иматиниба в плазме более 1000 нг/мл необходима для достижения большого молекулярного ответа.

Также в случаях резистентности к ингибиторам тирозинкиназ показано исследование мутационного статуса в гене BCR.-A.BL, поскольку мутации в нем приводят как к первичной, так и вторичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Выявленные изменения являются основанием для изменения тактики терапии пациентов с ХМЛ: повышение дозы препарата первой линии -иматиниба, переход на терапию ингибиторами тирозинкиназ второй линии, перевод пациента на программу трансплантации костного мозга.

В нашем исследовании проанализировано несколько генетических факторов, обусловливающих эффективность терапии иматинибом. На основании известных на момент обследования клинико-генетических параметров нами была предпринята попытка прогнозирования важнейшего критерия эффективности терапии иматинибом и другими ингибиторами тирозинкиназ - цитогенетического ответа методом множественной линейной регрессии. Из массива данных были выделены сведения о пациентах, результаты лечения которых были прослежены не менее 24 месяцев. Эта когорта больных была разделена на 2 группы: обучающую и контрольную. Имеющийся массив данных позволил провести корреляционный и регрессионный анализы, на основе которых сделана попытка прогнозирования цитогенетического ответа через заданный (с интервалом 6 месяцев.) промежуток времени. Анализ выявленных корреляций позволил выделить показатели, связанные хотя бы умеренной силы связью.

Таким образом, линейное регрессионное уравнение, позволяющее прогнозировать вариант цитогенетического ответа через 24 месяца терапии иматинибом имеет вид:

У = - 0,52 +0,198 х А + 0,640 х В + 0,855 х С - 0,176 х В

Где У - прогнозируемый вариант через 24 месяца терапии иматинибом (0-ПЦГО, 1- БЦГО, 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 - нет ЦГО)

А - цитогенетический ответ после 6 месяцев терапии (0- ПЦГО, 1- БЦГО. 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 ~ нет ЦГО)

В - цитогенетический ответ после 12 месяцев терапии (0- ПЦГО, 1- БЦГО, 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 - нет ЦГО)

С - наличие дополнительных хромосомных аномалий (1- нет ДХА, 2 — есть ДХА)

О - наличие мутаций гена ВСК-АВЬ{\-нет мутаций, 2-есть мутации)

Проверка регрессионного уравнения показала 80% вероятность совпадения результатов. Графическое представление соответствия прогнозируемых и фактических данных в обучающей группе приведено ниже

Очевидно, что линейная модель не является идеальной, однако она дает возможность выделить группу пациентов, требующих мониторирования и, возможно, изменения тактики терапии. Регрессионное уравнение в виде удобного для использования интерфейса размещено в сети Интернег на сайте http://www.ortho-dove.com/cytgen/.

ВЫВОДЫ

1. Цитогенетические и FISH исследования показали высокую эффективность терапии иматинибом в изученной когорте пациентов с ХМ Л: при медиане терапии 24 месяца 66,1% пациентов, получавших терапию иматинибом 6 и более месяцев, достигли большого ЦГО, 59,7% больных ХМЛ, находившихся на терапии иматинибом 12 и более месяцев, достигли полного ЦГО.

2. Эффективность стандартного цитогенетического исследования кариотипа костного мозга на этапе цитогенетической диагностики ХМЛ составила 91,9%. Дополнительные хромосомные аномалии, выявляемые в Ph-позитивных клетках костного мозга при диагностическом цитогенетическом исследовании, не влияют на вероятность достижения большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

3. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-позитивных клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом, обладают статистически достоверным неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-негативных клетках, не обладают аналогичным прогностическим значением

4. Наиболее частой дополнительной хромосомной аномалией в Ph-позитивных клетках является дополнительная Ph-хромосома. В случае отсутствия дополнительной Ph-хромоеомы при стандартном цитогенетическом исследовании у пациентов с резистентностью к иматинибу необходимо проведение FISH исследований с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL для выявления малопроцентных клонов опухолевых клеток с дупликацией Ph-хромосомы.

5. Результаты молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени, выполняемых в процессе мониторинга терапии ХМЛ, достоверно коррелируют с результатами стандартных цитогенетических исследований. Проведение молекулярно-генетического мониторинга уровня экспрессии гена BCR-ABL наиболее оправдано у пациентов с полным ЦГО, когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом.

6. Наибольшей информативностью обладает оценка минимальной остаточной болезни, определяемая как снижение десятичного логарифма экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня экспрессии.

рассчитанного для 30 впервые диагностированных пациентов с XMJI. Наличие данных об уровне экспрессии гена BCR-ABL до начала терапии иматинибом не является необходимым для оценки редукции опухолевого клона.

7. Мутации гена BCR-ABL, обусловливающие резистентность к проводимой терапии иматинибом, обнаружены в 25,0% случаев рефрактерное™ к проводимой терапии. Появление мутаций в гене BCR-ABL обладает неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

8. Концентрация иматиниба в межклеточной жидкости костного мозга коррелирует с концентрацией препарата в плазме крови - соотношение этих двух показателей в среднем 1,5:1.

9. Уровень концентрации иматиниба прямо коррелирует с вероятностью достижения большого МО и не коррелирует с вероятностью достижения большого и полного ЦГО.

Практические рекомендации

1. Для оптимизации терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ предложен алгоритм мониторинга эффективности терапии в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических факторов.

2. Проведение молекулярно-генетического мониторинга терапии ХМЛ методом ПЦР в реальном времени целесообразно после достижения полного цитогенетического ответа.

3. Исследование рефрактерности к терапии ингибиторами тирозинкиназ должно включать молекулярно-цитогенетический анализ для выявления низкоуровневых клонов клеток с амплификацией гена BCR-ABL

4. Выявление клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями и мутациями гена BCR-ABL является фактором неблагоприятным прогноза цитогенетического и молекулярного ответов на лечение и предполагает изменения тактики терапии ХМЛ.

5. Фармакокинетический мониторинг необходимо проводить у резистентных к иматинибу больных ХМЛ для оценки соблюдения пациентом режима приема препарата и коррекции дозы иматиниба при отсутствии большого молекулярного ответа.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kutsev, S.I. Our experience with FISH and conventional cytogenetics in oncohematology/ S.I. Kutsev, Y.A.Boumber, L.I. Petrenko, N.M. Moussonova// Cytogenetics and Cell Genetics. - 1999. - V.85, № 1-2. - P. 77.

2. Бурнашева, Е.В.Особенности нарушения функции тромбоцитов у больных с хроническими лейкозами / Е.В.Бурнашева, С.И. Куцев, Н.П.Плескачева,

B.С.Отливщикова, Ю.В. Шатохин // Материалы I съезда терапевтов Юга России. - Ростов-на-Дону, 2000. - С. 49-50.

3. Шатохин, Ю.В. Цитохимическая характеристика клеток грануляторного ряда костного мозга у пациентов, страдающих миелопролиферативными заболеваниями / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, B.C. Отливщикова // III Научная сессия Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2000. - С. 265-266.

4. Куцев, С.И. Мультиплексная флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (mFISH) в анализе хромосомных аберраций при онкогематологических заболеваниях /С.И.Куцев, В.Н.Чернышов, Н.М.Мусонова, Ю.В. Шатохин, Л.И. Петренко // Детская онкология. - 2001, №1,-С.112-113.

5. Koutsev, S.I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the diagnosis and follow up of chronic myeloid leukaemia / S.I. Koutsev, Y.V. Shatokhin, N.M.Moussonova// The Hematology Journal. - 2001. - V.l, Suppl.l. - P. 230.

6. Куцев, С.И. Флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (FISH) в диагностике и определении эффективности терапии альфа-интерфероном хронического миелолейкоза / С.И.Куцев, Ю.В.Шатохин // Материалы симпозиума "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний". - Москва, 2001. - С.15-16.

7. Бурнашева, Е.В. Роль гливека в лечении хронического миелолейкоза, влияние на функциональные показатели мегакариоцитов костного мозга и тромбоцитов периферической крови / Е.В. Бурнашева, Ю.В. Шатохин, Г.Ю.Нагорная, С.И, Куцев, В.С.Отливщикова, Н.П. Плескачева // Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета. -Ростов-на-Дону, 2004. - С. 243-245.

8. Шатохин, Ю.В. Современные медицинские технологии в диагностике, прогнозировании и оптимизации терапии опухолевых заболеваний кроветворной системы / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, Л.П. Высоковская, Е.В. Полевиченко, Л.П. Сизякина // Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 19-20.

9. Шатохин, Ю.В. Хронический миелолейкоз / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, Е.В. Бурнашева, B.C. Отливщикова, О.Н. Шатохина // Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты: Сб. научных трудов под ред. Чернышова В.Н., Куцева С.И., Вып.2. - Ростов-на-Дону, 2004.-С. 175-180.

10. Kutsev, S.I. Quantitative Fluorescent in Situ Hybridization of Chromosomes / S.I. Kutsev, S.V. Mordanov // Medizinische Genetik. - 2004. - V.l6, №1. ~ p. Ю6.

11. Ворсанова, С.Г. Онкоцитогенетика / С.Г. Ворсанова, Ю.Б. Юров, В.Н. Чернышов, И.Ю. Юров, С.И. Куцев //Глава из учебного пособия Ворсанова

C.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. "Медицинская цитогенетика" - М., Медпрактика-М, 2006. - С. 148-159.

12. Куцев, С.И. Количественная флуоресцентная гибридизация хромосом / С.И. Куцев, С.В.Морданов // Мат. Конференции "Научно-технологическая

платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)". - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 85-86.

13. Kutsev, S.I. Cytogenetic and FISH analysis for diagnosis and evaluation of minimal residual disease (MRD) in CML patients / S.I.Kutsev, S.V.Mordanov, A.A. Zeltzer, Y.V. Shatokhin, E.V.Burnasheva // "Developing Research for a Common Feature", Abstracts of 4th Scientific Symposium. - Rostov-on-Don, 2006. - P. 5152.

14. Куцев, С.И. Предварительные результаты терапии гливеком хронического миелолейкоза на юге России / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, М.В.Вельченко, Ю.В.Шатохин, Е.В. Бурнашева // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. -2006.- Т.5, №4.-С. 12.

15. Куцев, С.И. Анализ мутаций BCR-ABL киназного домена у иматиниб резистентных пациентов с хроническим миелоидным лейкозом / С.И. Куцев, М.В.Вельченко, А.Н. Зельцер, С.В. Морданов, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашева // Кардиология СНГ. - 2007. - Т.5, №2. - С. 269-270.

16. Куцев, С.И. Результаты цитогенетической диагностики хронического миелолейкоза в ЮФО в 2005-2007 гг. / С.И.Куцсв / Материалы II научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". - Ростов-на-Дону3 2007. - С.3-6.

17. Kutsev, S. Mutation profile of BCR-ABL kinase domain in imatinib primary and secondary resistant chronic myeloid leukemia cases / S. Kutsev, M.Velchenko, S. Mordanov // European Journal of Human Genetics. - 2008. - V. 16, Suppl.2. - P. 212.

18. Куцев, С.И. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, М.В.Вельченко// Клиническая онкогематология. - 2008. - Т. 1,№3.-С. 190-199.

19. Kutsev, S.I. Mutation analysis of BCR-ABL kinase domain in imatinib resistant chronic myeloid leukemia causes / S.L Kutsev, M.V.Velchenko // Abstracts of XX International Congress of Genetics. - Berlin, 2008. - P. 218.

20. Куцев, С.И. Роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом / С.И. Куцев, М.В. Вельченко, С.В. Морданов // Клиническая онкогематология. - 2008 - Т.1, №4. - С. 303-309.

21.Куцев, С.И. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ / С.И. Куцев, М.В.Вельченко, А.Н. Зельцер // Онкогематология. - 2008, №4. - С. 17-25.

22. Куцев, С.И. Анализ мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, М.В. Вельченко, С.В. Морданов // Уч.-метод. рекоменд. - Ростов-на-Дону, изд. РостГМУ, 2008. -44с.

23.Куцев, С.И. Влияние концентрации иматиниба в плазме на достижение молекулярной ремиссии у больных хроническим миелолейкозом / С.И. Куцев, О.С. Оксенюк, М.В. Вельченко // Казанский медицинский журнал. - 2009. -том 90, №3.~ С. 339-343.

24.Куцев, С.И. Эволюция мониторинга лечения хронического миелоидного лейкоза / С.И. Куцев. // Гематология и трансфузиология. - 2009г. - №4. -С .36-44.

25.0ксенюк, О.С. Концентрация иматиниба в плазме крови у пациентов с хроническим миелолейкозом / О.С. Оксенюк, Е.Г. Овсянникова, С.И. Куцев // Артериальная гипертензия. - 2009. - Т. 15,№1. - С.62-63.

26. Куцев, С.И. Зависимость цитогенетического ответа на терапию хронического миелолейкоза от концентрации иматиниба в плазме крови / С.И. Куцев, О.С. Оксенюк, А.Н. Зельцер, Ю.В. Шатохин // Материалы III Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 165-166.

27. Куцев, С.И. Амплификация гена BCR-ABL у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, рефрактерных к иматинибу/ С.И. Куцев, С.В.Морданов И Онкогематология. - 2009, №3. - С. 57-61.

28. Вельченко, М.В. Мутации гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом / М.В. Вельченко, C.B. Морданов, С.И. Куцев // Материалы III Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". - Ростов-на-Дону, 2009.-С. 157-158.

29. Куцев, С.И. Прогностическое значение дополнительных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в терапии иматинибом хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, C.B. Морданов, А.Н. Зельцер // Медицинская генетика. -2009.- № 10.-С. 27-33.

30. Куцев, С.И. Лекарственный мониторинг в терапии хронического миелолейкоза иматинибом / С.И. Куцев, О.С. Оксенюк // Клиническая онкогематология. - 2009. - том 2, № 3. - С. 256-261.

31. Куцев, С.И. Влияние перерывов терапии иматинибом на достижение цитогенетического и молекулярного ответов у больных хроническим миелолейкозом / С.И. Куцев, Ю.В.Шатохин // Казанский медицинский журнал. - 2009. - том 90, №6. - С. 827-831.

32. Куцев, С.И. Цитогенетический мониторинг терапии ХМЛ в ЮФО / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, C.B. Морданов / Материалы IV научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". - Кисловодск, 2009. - С.3-8.

33. Морданов, C.B. BCR-ABL зависимые механизмы резистентности к иматинибу: амплификация и мутации гена BCR-ABL / C.B. Морданов, С.И. Куцев / Материалы IV научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". -Кисловодск, 2009. - С. 19-30.

34. Оксенюк, О.С. Значение исследования концентрации иматиниба в плазме крови и костном мозге у пациентов с хроническим миелолейкозом / О.С. Оксенюк, С.И. Куцев // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг". - Кисловодск, 2009. - С.42-50.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЦГО - большой цитогенетический ответ БМО - большой молекулярный ответ БУ - базовый уровень

ДХА - дополнительные хромосомные аномалии

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая

МО - молекулярный ответ

ПГО - полный гематологический ответ

ПМО - полный молекулярный ответ

ПЦГО - полный цитогенетический ответ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФА - фаза акселерации

ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз

ХФ - хроническая фаза

ЦГО - цитогенетический ответ

Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» Заказ № 2953/9 Тиране 100 экз.

I

Печать на ризографе Формат 90x60/16. Усл. печ. л. 2,88 125171, г.Москва, Ленинградское шоссе, д.18 тел. 8 (495) 786-22-31

В- 2

2008152002

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Куцев, Сергей Иванович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клинико-генетическая характеристика хронического миелолейкоза.

1.2. Генетическая диагностика хронического миелолейкоза.

1.2.1 Цитогенетическая диагностика хронического миелолейкоза.

1.2.2. Молекулярно-генетическая диагностика хронического миелолейкоза.

1.3. Генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ.

1.3.1.Молекулярно-биологические основы терапии хронического миелолейкоза иматинибом и другими ингибиторами тирозинкиназ.

1.3.2 Цитогенетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза.

2.3.3. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза.

1.4. Генетический мониторинг резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных ХМЛ.

1.4.1. Исследования амплификации гена BCR-ABL.

1.4.2. Исследование мутаций гена BCR-ABL.

1.4.3. Фармакокинетический мониторинг терапии ХМЛ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы. Характеристика пациентов.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга.

2.2.2. Флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (FISH).

2.2.3. Количественная оценка экспрессии химерного онкогена BCR-ABL.

2.2.4. Определение первичной последовательности гена BCR-ABL.

2.2.5. Измерение концентрации иматиниба в плазме крови и межклеточной жидкости костного мозга.

2.2.6. Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА.

3.1. Цитогенетическая диагностика хронического миелолейкоза.

3.2. Цитогенетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза

3.3. Дополнительные хромосомные аномалии в Ph-позитивных и

Ph- негативных клетках костного мозга.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ

ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА.

ГЛАВА 5. МУТАЦИОННЫЙ МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ

ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА.

ГЛАВА 6. ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ

ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелолейкоза"

Актуальность исследования.

Хронический миелоидный лейкоз (XMJI) - клональное миелопролиферативное заболевание, составляющее около 20% вновь диагностированных случаев лейкозов у взрослых. Ежегодная заболеваемость XMJI - не более 1-2 случаев на 100 ООО взрослого населения (Faderl S., Talpaz М., Estrov Z., Kantarjian H.M., 1999; Sawyers C.L. , 1999). XMJI развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22)(q34;qll.2). Образующуюся при этом дериватную хромосому der(22)t(9;22) с укороченным длинным плечом называют филадельфийской (Ph-хромосома) по названию города, в котором она была впервые описана. В результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;qll.2) происходит слияние гена ABL (Abelson gene), расположенного на длинном плече хромосомы 9, с геном BCR (the breakpoint cluster region gene), расположенном на длинном плече хромосомы 22, с образованием слитного гена BCR-ABL. Белок BCR-ABL является тирозинкиназой с повышенной активностью и играет ключевую роль в патогенезе XMJI (Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D., 1990; Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J. et al., 1990). Механизмы, контролирующие в норме активность ABL тирозинкиназы, не способны регулировать активность химерной BCR-ABL тирозинкиназы, что приводит к злокачественной трансформации стволовой кроветворной клетки. Активность BCR-ABL тирозинкиназы обусловливает увеличение пролиферативной активности клеток и ингибирование апоптоза, уменьшает зависимость кроветворных клеток от цитокинов и снижает клеточную адгезию (Gotoh A., Miyazawa К., Ohyashiki К. et al., 1995; Cheng К., Kurzrock R., Qiu X. et al., 2002). При установлении диагноза XMJI 90100% клеток костного мозга характеризуются наличием Ph-хромосомы, выявляемой цитогенетическим или FISH методами.

Исследования патогенеза XMJ1 на молекулярном уровне подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, в основе которой лежат специфические ингибиторы BCR-ABL тирозинкиназы. Создание первого из них - иматиниба (STI571) стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии (Хорошко Н.Д., Туркина А.Г., 2001; Туркина А.Г., 2001; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2002). Впервые концепция тотального неспецифического уничтожения активно пролиферирующих клеток с помощью цитостатических препаратов заменена парадигмой целенаправленной элиминации опухолевых клеток, имеющих идентичную клональную природу.

Иматиниб селективно ингибирует BCR-ABL тирозинкиназу, встраиваясь в АТФ-связывающий карман киназного домена белка BCR-ABL и удерживая его таким образом в неактивном состоянии (Schindler Т. , Bornmann W., Pellicena P. et al., 2000). Преклинические исследования показали, что иматиниб эффективно ингибирует не только BCR-ABL тирозинкиназу, но и тирозинкиназы c-Kit , (3 рецепторы тромбоцитарного фактора роста (Joensuu Н., Roberts P.J., Sarlomo-Rikala М. et al., 2001; Heinrich M.C., Blanke C.D., Druker B.J., Corless C.L., 2002).

Клинические испытания иматиниба показали необыкновенно высокую эффективность этого препарата в терапии XMJI (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2003; Туркина А.Г., Виноградова О.Ю., Хорошко Н.Д., Воробьев А.И., 2008). Так в исследовании IRIS к пяти годам терапии иматинибом полный гематологический ответ на терапию иматинибом достигли 98% больных XMJI, большой цитогенетический ответ - 92%, полный цитогенетический ответ - 87%; 5-летняя выживаемость без прогрессии заболевания составила 93% (Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al., 2006).

Несмотря на столь впечатляющие результаты, существует проблема резистентности к терапии иматинибом. Понятие резистентности к иматинибу включает по меньшей мере две дефиниции. Первичная резистентность (или рефрактерность) - это отсутствие или недостаточный ответ на лечение: отсутствие гематологического ответа после 3 месяцев терапии, малого цитогенетического ответа (Ph-хромосома определяется в 35 - 65% клеток костного мозга) после 6 месяцев терапии, большого цитогенетического ответа (Ph-хромосома определяется менее, чем в 35% клеток костного мозга) после 12 месяцев терапии. Вторичная, или приобретенная, резистентность определяется как потеря гематологического, цитогенетического или молекулярного ответов или прогрессирование заболевания до фазы акселерации или бластного криза (Baccarani М., Saglio G., Goldman J. et al., 2006).

В основе развития резистентности к терапии ХМЛ иматинибом могут лежать несколько механизмов, включая мутации гена BCR-ABL, амплификацию гена BCR-ABL, активацию BCR-ABL независимых путей, например, членов семейства Src киназ, избыточное связывание иматиниба с сывороточным а-1 кислым гликопротеином, дисбаланс между клеточными белками-переносчиками препарата (Kantarjian Н., Talpaz М., Giles F. et al., 2006). Одним из основных механизмов резистентности и, одновременно, прогрессии XMJI является "клональная эволюция" - появление дополнительных хромосомных аберраций (ДХА) в Ph-позитивных лейкозных клетках.

Успех терапии ингибиторами тирозинкиназ во многом зависит от внедрения эффективной системы мониторинга результатов лечения, позволяющей своевременно изменять тактику терапии ХМЛ в каждом конкретном случае. В связи с относительной новизной клинического примеиения ингибиторов тирозинкиназ многие аспекты мониторинга терапии этими препаратами далеки от своего окончательного разрешения. Поэтому развитие системы мониторинга эффективности терапии ХМЛ препаратами ингибиторов тирозинкиназ с помощью генетических технологий для последующей оптимизации терапевтической тактики ведения пациентов с XMJT представляется весьма актуальным. К настоящему времени противоречивы данные о прогностическом значении дополнительных хромосомных аномалий, выявляемых при диагностическом цитогенетическом исследовании и в процессе цитогенетического мониторинга эффективности терапии, не вполне определено место молекулярно-генетического мониторинга, не ясна роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к проводимой терапии, не оценена роль фармакокинетического мониторинга в терапии ХМЛ.

Цель исследования - оценить значимость цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований в оценке прогноза и мониторинге эффективности терапии ХМЛ.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ цитогенетическим и молекулярно-генетическим методами исследования.

2. Сопоставить информативность цитогенетического, молекулярно-цитогенетического и молекулярно-генетического методов в диагностике и мониторинге терапии ХМЛ.

3. Определить частоту выявления и дать цитогенетическую характеристику клонов лейкозных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями, а также оценить их роль в прогнозе эффективности терапии ХМЛ.

4. Оценить эффективность молекулярно-генетического мониторинга в терапии ХМЛ.

5. Исследовать частоту и спектр мутаций гена BCR-ABL и определить значение клонов лейкозных клеток с мутациями гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом.

6. Определить роль цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетичееких исследований для прогноза эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Новизна результатов исследования

В настоящем исследовании впервые:

- проведена комплексная оценка результатов цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических исследований на этапе диагностики и в процессе мониторинга эффективности терапии XMJT ингибиторами тирозинкиназ.

- показана необходимость проведения молекулярно-цитогенетических исследований у резистентных к терапии иматинибом пациентов с целью поиска дополнительных хромосомных аберраций в небольших клонах опухолевых клеток.

- выявлена частота и спектр мутаций химерного гена BCR-ABL, а также оценена их роль в развитии рефрактерности к иматинибу в когорте первично резистентных больных XMJI.

- установлено влияние перерывов в терапии иматинибом на развитие первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

- выявлено значение измерения концентрации иматиниба в плазме крови для оптимизации терапии XMJT.

Практическая значимость.

Разработан алгоритм диагностики и мониторинга терапии XMJT ингибиторами тирозинкиназ в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетичееких факторов, позволяющий оптимизировать тактику терапии заболевания. Создана математическая модель прогнозирования цитогенетического ответа на основании анализа корреляционных взаимосвязей различных показателей генетического мониторинга терапии XMJ1. Разработаны рекомендации по использованию молекулярно-цитогенетического метода для выявления амплификации гена BCR-ABL в случаях резистентности к проводимой терапии. Предложено использование молекулярно-генетического мониторинга методом ПЦР в реальном времени терапии ХМЛ только после достижения полного цитогенетического ответа. Определена роль клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями и мутациями гена BCR-ABL в развитии первичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Показана роль фармакокинетических исследований в мониторинге терапии ХМЛ иматинибом.

Основные положения, выносимые на защиту:

- мониторинг терапии ХМЛ должен включать в себя комплекс цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований факторов резистентности при лечении ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. результаты стандартного цитогенетического исследования коррелируют с результатами молекулярно-генетических исследований, однако наиболее целесообразно использовать молекулярно-генетический метод для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ после достижения полного цитогенетического ответа.

- к факторам, потенцирующим развитие первичной резистентности к ингибиторам тирозинкиназ, относятся: появление на фоне терапии иматинибом клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-положительных клетках, амплификация гена BCR-ABL и мутации гена BCR-ABL.

Апробация работы

Основные результаты работы, составившие содержание диссертации, доложены и обсуждены на 2nd European Cytogenetics Conference (Vienna, 1999); I Съезде терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2000); II и VI

Всероссийском симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний" (Москва, 2001; 2009); I и IV Всероссийском конгрессе "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" (Москва, 2002; 2005); IV международном научном симпозиуме "Developing Research for a Common Feature" (Ростов-на-Дону, 2006); Второй научной конференции "Актуальные проблемы генетики", посвященной 115-летию Н.И.Вавилова (Москва, 2003); II и IV научно-практической конференции Южного Федерального округа с международным участием "Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты" (Ростов-на-Дону, 2004, Кисловодск, 2006); IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2004); Общероссийской открытой конференция "Вопросы организации диагностики и лечения больных, страдающих хроническим миелоидным лейкозом" (Москва, 2005); I, II и III Научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг" (Сочи, 2006; Ростов-на-Дону, 2007; Кисловодск, 2008); Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону, 2006); Всероссийской школе-семинаре "Актуальные проблемы цитогенетики" (Москва, 2007); XXXV и XXXVI Всероссийских гематологических декадниках "Новое в гематологии и клинической трансфузиологии" (Москва, 2008, 2009); Республиканской конференции "Актуальные вопросы гематологии" (Махачкала, 2008); XX International Congress of Genetics (Berlin, 2008); European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008); II Сибирской конференции по гематологии "Баркагановские чтения" (Барнаул, 2009). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 9 сентября 2009 года.

Внедрение в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на курсе медицинской генетики ФПК и ППС, кафедре гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС и кафедре внутренних болезней №2 ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава, кафедре внутренних болезней ГОУ ВПО "Астраханская государственная медицинская академия Росздрава". Результаты работы внедрены в работу лаборатории медицинской генетики и отделения гематологии клиники ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава. Полученные результаты исследования легли в основу изданных 2 методических рекомендаций для врачей гематологов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 34 научные работы, из них 8 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Издано 2 методических рекомендаций для врачей.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики и 4 глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (24 источника на русском и 195 на иностранном языках). Работа содержит 48 рисунков и 14 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Куцев, Сергей Иванович

ВЫВОДЫ

1. Цитогенетические и FISH исследования показали высокую эффективность терапии иматинибом в изученной когорте пациентов с ХМЛ: при медиане терапии 24 месяца 66,1% пациентов, получавших терапию иматинибом 6 и более месяцев, достигли большого ЦГО, 59,7% больных ХМЛ, находившихся на терапии иматинибом 12 и более месяцев, достигли полного ЦГО.

2. Эффективность стандартного цитогенетического исследования кариотипа костного мозга на этапе цитогенетической диагностики ХМЛ составила 91,9%. Дополнительные хромосомные аномалии, выявляемые в Ph-позитивных клетках костного мозга при диагностическом цитогенетическом исследовании, не влияют на вероятность достижения большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

3. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-позитивных клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом, обладают статистически достоверным неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-негативных клетках, не обладают аналогичным прогностическим значением

4. Наиболее частой дополнительной хромосомной аномалией в Ph-позитивных клетках является дополнительная Ph-хромосома. В случае отсутствия дополнительной Ph-хромосомы при стандартном цитогенетическом исследовании у пациентов с резистентностью к иматинибу необходимо проведение FISH исследований с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL для выявления малопроцентных клонов опухолевых клеток с дупликацией Ph-хромосомы.

5. Результаты молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени, выполняемых в процессе мониторинга терапии ХМЛ, достоверно коррелируют с результатами стандартных цитогенетических исследований. Проведение молекулярно-генетического мониторинга уровня экспрессии гена BCR-ABL наиболее оправдано у пациентов с полным ЦГО, когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом.

6. Наибольшей информативностью обладает оценка минимальной остаточной болезни, определяемая как снижение десятичного логарифма экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня экспрессии, рассчитанного для 30 впервые диагностированных пациентов с ХМЛ. Наличие данных об уровне экспрессии гена BCR-ABL до начала терапии иматинибом не является необходимым для оценки редукции опухолевого клона.

7. Мутации гена BCR-ABL, обусловливающие резистентность к проводимой терапии иматинибом, обнаружены в 25,0% случаев рефрактерности к проводимой терапии. Появление мутаций в гене BCR-ABL обладает неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

8. Концентрация иматиниба в межклеточной жидкости костного мозга коррелирует с концентрацией препарата в плазме крови - соотношение этих двух показателей в среднем 1,5:1.

9. Уровень концентрации иматиниба прямо коррелирует с вероятностью достижения большого МО и не коррелирует с вероятностью достижения большого и полного ЦГО.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оптимизации терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ предложен алгоритм мониторинга эффективности терапии в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических факторов.

2. Проведение молекулярно-генетического мониторинга терапии ХМЛ методом ПЦР в реальном времени целесообразно после достижения полного цитогенетического ответа.

3. Исследование рефрактерности к терапии ингибиторами тирозинкиназ должно включать молекулярно-цитогенетический анализ для выявления низкоуровневых клонов клеток с амплификацией гена BCR-ABL

4. Выявление клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями и мутациями гена BCR-ABL является фактором неблагоприятным прогноза цитогенетического и молекулярного ответов на лечение и предполагает изменения тактики терапии ХМЛ.

5. Фармакокинетический мониторинг необходимо проводить у резистентных к иматинибу больных ХМЛ для оценки соблюдения пациентом режима приема препарата и коррекции дозы иматиниба при отсутствии большого молекулярного ответа.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Куцев, Сергей Иванович, Москва

1. Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Ахлынина Т.В. и др. Экспрессия онкогена BCR-ABL и р53-индуцированный апоптоз в суспензионных культурах гемопоэтических Ph+ клеток хронического миелолейкоза// Экспериментальная биотерапия. 2002. - Т.1, №4. - С. 29-38.

2. Домрачева ЕВ, Захарова А.Е., Асеева Е.А. Прогностическое значение дополнительных цитогенетических аномалий при хроническом миелолейкозе // Гематол. и трансфузиол. 2005. - Т. 50, №4. - С. 37-41.

3. Дьяченко Л.В., Захарова А.В., Асеева Е.А. и др. Молекулярно-цитогенетический мониторинг различных режимов терапии у больных хроническим миелолейкозом // Тер. Архив. 2004. - Т. 7, № 7. - С. 4144.

4. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г. Перспективы фармакотерапии ХМЛ // Эффективная фармакотерапия. 2006. - № 1. - С. 38-42.

5. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю. и др. Результаты многоцентрового исследования терапии гливеком больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе // Гематол. и трансфузиол. 2007. - Т.52, № 2. - С. 13-17.

6. Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. и др. Резистентность при терапии Гливеком у больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации // Гематол. и трансфузиол. 2007. - №2. - С. 17-24

7. Ломана Е.Г., Огородникова Ю.С., Мартынкевич И.С. и др. Прогностические факторы эффективности терапии Гливеком больных хроническим миелолейкозом // Вестник гематологии. 2005. - Т. 1., №1. - С. 14-21.

8. Ломаиа Э.Г., Зарицкий А.Ю. Нилотиниб новый этап успеха в терапии хронического миелолейкоза // Онкогематология. - 2007. - № 4. - С. 6772.

9. Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П. и др. Дополнительные хромосомные аберрации у больных хроническим миелолейкозом // Гематол. и трансфузиол. 2007. - Т. 52, №2. - С. 2835.

10. Мещеряков А.А. Гливек патогенетическая терапия злокачественных новообразований // Современная онкология. - 2002. - Т. 4, № 1. -С.123- 125.

11. П.Мисюрин А.В., Аксенова Е.В., Крутов А.А. и др. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематол. и трансфузиол. -2007. № 2. - С.35-40.

12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2002. - 305 с.

13. Семочкин С.В., Лория С.С., Курова Е.С. и др. Анализ качества жизни больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации на фоне терапии Гливеком // Современная онкология. 2002. - Т4, №2. - С.67-70.

14. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных путей STI571 (Signal Transductor Inhibitor) новое направление в лечении хронического миелолейкоза // Современная онкология. - 2001. - ТЗ, №2. - С.46- 48.

15. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии Гливеком (иматиниб мезилат, STI 571) в поздней хронической стадии миелолейкоза (ХМЛ) при неэффективности терапии интерфероном-альфа. // Проблемы гематологии. 2002. - № 1. - С. 8889.

16. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии иматиниба мезилатом (Гливеком) в хронической фазе хронического миелолейкоза // Тер. Архив. 2003. - Т. 75, № 8. - С. 6267.

17. Туркина А.Г., Челышева Е.Ю. Цитогенетический и молекулярный ответ ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+ хроническим миелолейкозом // Фарматека. - 2004. - №18 (95). - С. 48-53.

18. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др.//Практические рекомендации по лечению больных хроническим миелолейкозом: пособие для врачей. Москва. - Тверь : ООО "Издательство "Триада", 2005.-78 с.

19. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Цитогенетический ответ маркер эффективности терапии ингибитором тирозинкиназы (гливеком) у больных хроническим миелолейкозом // Тер. Архив. -2005. - Т77, N7. - С. 42-47.

20. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Практические рекомендации по лечению больных хроническим миелолейкозом. Москва. - ТверыООО "Издательство "Триада", 2008. - 36 с.

21. Туркина А.Г., Виноградова О.Ю., Хорошко Н.Д., Воробьев А.И. Достижения в диагностике и лечении больных хроническим миелолейкозом в Российской Федерации (2004 2008 гг)// Бюллетень Сибирской медицины. - 2008. - Приложение 3. - С.76-80.

22. Хорошко Н.Д., Туркина А.Г. Хронический миелолейкоз; успехи современного лечения и перспективы // Гематол. и трансфузиол. -2001,- Т46, №4. С. 3-8.

23. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическомисследовании уровня BCR-ABL транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематол. и трансфузиол. 2007. - №2. - С.50-51.

24. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В. и др. Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом: клиническое значение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Тер. Архив. 2007. - № 4. - С. 49-53

25. Ahuja Н., Bar-Eli М., Advani S.H. et al. Alterations in the p53 gene and the clonal evolution of the blast crisis of chronic myelocytic leukemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86, №17. - P. 6783-6787.

26. Azam M., Latek R.R., Daley G.Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571 imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL II Cell. 2003. - V. 112, №6. -P. 831-843.

27. Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. 2006. - V.108, №6.-P. 1809-1820.

28. Baccarani M., Pane F., Saglio G. Monotoring treatment of chronic myeloid leukemia // Haematologica. 2008. - V.93, №2. - P. 161-167.

29. Barbany G., Hagberg A., Olsson-Stromberg U. et al. Manifoldassisted reverse transcription-PCR with real-time detection for measurement of the BCR-ABL fusion transcript in chronic myeloid leukemia patients // Clin. Chem. 2000. - V.46, №7. - P. 913-920.

30. Barthe C., Cony-Makhoul P., Melo J.V. et al. Roots of clinical resistance to STI-571 cancer therapy// Science. 2001. - V.293, №5538. - P.2163.

31. Ben-Neriah Y., Daley G.Q., Mes-Masson A.M. et al. The chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the product of the bcr/abl hybrid gene // Science. 1986. - V.233, №4760. - P.212-214.

32. Blasdel C., Egorin M.J., Lagattuta T.F. et al. Therapeutic drug monitoring in CML patients on imatinib // Blood. 2007. - V.l 10, №5. - P.1699-1701.

33. Bolton A.E., Peng В., Hubert M. et al. Effect of rifampicin on the pharmacokinetics of imatinib mesylate (Gleevec, STI571) in healthy subjects// Cancer Chemother. Pharmacol. 2004. - V.53, № 2. - P. 102106.

34. Bonifazi F., de Vivo A., Rosti G. et al. Chronic myeloid leukemia and interferon-alpha: a study of complete cytogenetic responders // Blood. -2001. V.98, №10. - P. 3074-3081.

35. Branford S., Hughes T.P., Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics // Br. J. Haematol. 1999. - V.107, №3. -P.587-589.

36. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I. et al. Real-time quantitative PCR analysis can be used as a primary screen to identify patients with CML treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations // Blood. 2004. - V. 104, №9. - P.2926-2932.

37. Branford S., Hughes T.P. Detection of BCR-ABL mutations and resistance to imatinib mesylate // in: Myeloid Leukemia: Methods and Protocols, Eds by Iland H., Hertzberg M. and Marlton P. Totova, Human Press Inc., 2006. - P.69-92.

38. Branford S. Chronic myeloid leukemia: molecular monitoring in clinical practice // in: The education programm of the Am. Soc. Hematol. 2007. -P.376-383.

39. Braziel R.M., Launder T.M., Druker B.J. et al. Hematopathologic and cytogenetic findings in imatinib mesylate-treated chronic myelogenous leukemia patients: 14 months' experience // Blood. 2002. - V.100, №2. -p. 435-441.

40. Buchdunger E., Zimmermann J., Mett H. et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative // Cancer Res. 1996. - V.56, №.1. - P. 100-104.

41. Burgess M.R., Skaggs B.J., Shah N.P. et al. Comparative analysis of two clinically active BCR-ABL kinase inhibitors reveals the role of conformation-specific binding in resistance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005. V.102, № 9. - P. 3395-3400.

42. Carulli G., Petrini M., Marini A., Ambrogi F. P-glycoprotein in acute nonlymphoblastic leukemia and in the blastic crisis of myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 1988. - V.319, №2. - P.797-798.

43. Cheng K., Kurzrock R., Qiu X. et al. Reduced focal adhesion kinase and paxillin phosphorylation in BCR-ABL-transfected cells // Cancer. 2002. -V.95, № 2. - P.440-450.

44. Chu S., Xu H., Shah N.P. et al. Detection of BCR-ABL kinase mutations in CD34+ cells from chronic myelogenous leukemia patients in complete cytogenetic remission on imatinib mesylate treatment // Blood. 2004. -V.105, № 5. - P.2093 -2098.

45. Collins S.J. Breakpoints on chromosomes 9 and 22 in Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia (CML): amplification of rearranged c-Abl oncogenes in CML blast crisis // J. Clin. Invest. 1986. - V. 78, №5. -P. 1392-1396.

46. Collins S.J., Groudine M.T. Chronic myelogenous leukemia: amplification of a rearranged c-Abl oncogene in both chronic phase and blast crisis // Blood. 1987. - V. 69, № 3. - P.893-898.

47. Coquelle A., Toledo F., Stern S. et al. A new role for hypoxia in tumor progression: induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex DMs and HSRs // Mol. Cell. 1998. - V.2, №2. -P.259-265.

48. Corbin A.S., Buchdunger E., Pascal F. et al. Analysis of the structural basis of specificity of inhibition of the Abl kinase by STI571 // J. Biol. Chem. -2002. V.277, №35. - P. 32214-32219.

49. Corbin A.S., La Rosee P., Stoffregen E.P. et al. Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib // Blood. 2003. - V. 101, №11. - P. 4611-4614.

50. Cortes J.E., Talpaz M., Giles F. et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy// Blood. 2003. - V.101, №10. - P. 3794-3800.

51. Cortes J., Rousselot P., Kim D.W. et al. Dasatinib induces complete hematologic and cytogenetic responses in patients with imatinib-resistant or -intolerant chronic myeloid leukemia in blast crisis // Blood. 2007. -V.109, №8. - P. 3207-3213.

52. Cowan-Jacob S.W., Guez V., Fendrich G. et al. Imatinib (STI571) resistance in chronic myelogenous leukemia: molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V.4, №.3. - P.285-299.

53. Cross N.C., Feng L., Chase A. et al. Competitive polymerase chain reaction to estimate the number of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow transplantation // Blood. 1993. - V.82, №6.-P. 1929-1936.

54. Crossman L.C., Druker B.J., Deininger M.W. et al. hOCT 1 and resistance to imatinib//Blood. -2005.-V. 106, №3.-P. 1133-1134.

55. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome // Science. 1990. - V.247, №4944. - P. 824-830.

56. Deininger M.W., Goldman J.M., Lydon N., Melo J.V. The tyrosine kinase inhibitor STI571 selectively inhibits the growth of BCR-ABL positive cells // Blood. 1997. - V.90, №9. - P. 3691-3698.

57. Deininger M.W., McGreevey L., Willis S. et al. Detection of ABL kinase domain mutations with denaturing high-performance liquid chromatography // Leukemia. 2004. - V.18, №4. - P. 864-871.

58. De Klein A., van Kessel A.G., Grosveld G. et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukemia // Nature. 1982. - V.300, №5894. - P. 765-767.

59. Donato N.J., Wu J.Y., Stapley J. et al. BCR-ABL independence and LYN kinase overexpression in chronic myelogenous leukemia cells selected for resistance to STI571 // Blood. 2003. - V.101, №2. - P. 690-698.

60. Druker В .J., Tamura S., Buchdunger E. et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells // Nat. Med. 1996. - V.2, №5. - P. 561-566.

61. Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J. et al. Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 2001. - V.344, №14. - P. 1031-1037.

62. Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 2006. -V.355, №23. - P.2408-2417.

63. El-Zimaity M.M., Kantarjian H., Talpaz M. et al. Results of imatinib mesylate therapy in chronic myelogenous leukaemia with variant Philadelphia chromosome // Br. J. Haematol. 2004. - V.125, № 2. - P. 187-195.

64. Emig M., Saussele S., Wittor H. et al. Accurate and rapid analysis of residual disease in patients with CML using specific fluorescent hybridization probes for real time quantitative RT-PCR // Leukemia. 1999. - V.13,№ll.-P.1825-1832.

65. Ernst Т., Erben P., Miiller M.C. et al. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib // Haematologica. 2008. - V.93, №2. - P. 186-192.

66. Faderl S., Talpaz M., Estrov Z., Kantarjian H.M. Chronic myelogenous leukemia: biology and therapy // Ann. Intern. Med. 1999. - V.131, №3. -P. 207-219.

67. Feinstein E., Cimino G., Gale R.P. et al. P53 in chronic myelogenous leukemia in acute phase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88, №14. - P. 6293-6297.

68. Ferrao P.T., Frost M.J., Siah S.-P., Ashman L.K. Overexpression of P-glycoprotein in K562 cells does not confer resistance to the growth inhibitory effects of imatinib (STI571) in vitro // Blood. 2003. - V.102, № 13.-P. 4499-4503.

69. Fialkow P.J., Jacobson R.J., Papayannopoulou T. Chronic myelocytic leukemia: clonal origin in a stem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage // Am. J. Med. 1997. - V. 63, №1.-P. 125- 130.

70. Freeman W.M., Walker S.J., Vrana K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential // Biotechniques. 1999. - vol. 26, № 112. - P.2224-2225.

71. Gambacorti-Passerini С., LeCoutre P., Mologni L. et al. Inhibition of the ABL kinase activity blocks the proliferation of BCR/ABL1 leukemic cells and induces apoptosis // Blood Cells Mol. Dis. 1997. - V. 23, №3. -P.380-394.

72. Gambacorti-Passerini C.B., Gunby R.H., Piazza R. et al. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia chromosome-positive leukaemias // Lancet Oncol. 2003. - V.4, №2. - P.75-85.

73. Geary C.G. The story of chronic myeloid leukemia // Br. J. Haematol. -2000.-V. 110, №1.-P. 2-11.

74. Gishizky M.L., Johnson-White J., Witte O.N. Efficient transplantation of BCR—ABL-induced chronic myelogenous leukemia-like syndrome in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90, №8. - P. 3755-3759.

75. Goldman J.M., Melo J.V. Chronic myeloid leukemia-advances in biology and new approaches to treatment // N. Engl. J. Med. 2003. - V. 349, №15. -P. 1451-1464.

76. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia still a few questions // Exp. Hematol. - 2004. - Y.32, №1. - P. 2-10.

77. Gordon M.Y., Goldman J.M. Cellular and molecular mechanisms in chronic myeloid leukemia: biology and treatment // Brit. J. Haematol. 1996. -V.95, №1. - P. 10-20.

78. Gorre M.E., Mohammed M., Ellwood K. et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification // Science. 2001. -V.293, №5531. - P.876-880.

79. Gotoh A., Miyazawa K., Ohyashiki K. et al. Tyrosine phosphorylation and activation of focal adhesion kinase (pl25FAK) by BCR-ABL oncoprotein // Exp. Hematol. 1995. - V.23, №11. - P. 1153-1159.

80. Groffen J., Stephenson J.R., Heisterkamp N. et al. Philadelphia chromosome breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22// Cell.- 1984. V.36, №1. - P. 93-99.

81. Guilhot F., Chastang C., Michallet M. et al. Interferon alfa-2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia. French Chronic Myeloid Leukemia Study Group // N. Engl. J. Med. 1997.- V.337, № 4. P. 223-229.

82. Guilhot F., Apperley J., Kim D.W. et al. Dasatinib induces significant hematologic and cytogenetic responses in patients with imatinib-resistant or -intolerant chronic myeloid leukemia in accelerated phase // Blood. 2007.- V.109, №10. P. 4143-4150.

83. Hantschel О., Nagar В., Guettler S. et al. A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-Abl // Cell. 2003. - V. 112, №6. - P. 845-857.

84. Harris S.L., Levine A.J. The p53 pathway: positive and negative feedback loops // Oncogene. 2005. - V.24, №17. - P.2899-2908.

85. Heinrich M.C., Blanke C.D., Druker B.J., Corless C.L. Inhibition of KIT tyrosine kinase activity: a novel molecular approach to the treatment of KITpositive malignancies // J. Clin. Oncol. 2002. - V.20, № 6. - P. 16921703.

86. Heisterkamp N., Stam K., Groffen J. et al. Structural organization of the bcr gene and its role in the Ph' translocation // Nature. 1985. - V315., № 6022. -P. 758-761.

87. Hochhaus A., Lin F., Reiter A. et al. Variable numbers of BCR-ABL transcripts persist in CML patients who achieve complete cytogenetic remission with interferon-alpha // Br. J. Haematol. 1995. - V. 91, № 1. -P.126-131.

88. Hochhaus A., Lin F., Reiter A. et al. Quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia patients on interferon-alpha therapy by competitive polymerase chain reaction // Blood. 1996. - V.87, № 4. - P. 1549-1555.

89. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. Roots of Clinical Resistance to STI-571 Cancer Therapy // Science. 2001. - V. 293, №5531. - P. 2163.

90. Hochhaus A. Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia patients // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2002. - V.15, № 1. - P. 159178.

91. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia. 2002. - V.16, № 11.-P.2190-2196.

92. Hochhaus A. Cytogenetic and molecular mechanisms of resistance to imatinib // Semin. Hematol. 2003. - V.40, № 2, Suppl 2. - P.69-79.

93. Hochhaus A., La Rosee P. Imatinib therapy in chronic myelogenous leukemia: strategies to avoid and overcome resistance // Leukemia. 2004. -V. 18, № 8. - P.1321-1331.

94. Hochhaus A., Kantarjian H.M., Baccarani M. et al. Dasatinib induces notable hematologic and cytogenetic responses in chronic-phase chronicmyeloid leukemia after failure of imatinib therapy // Blood. 2007. - V. 109, № 6. - P.2303-2309.

95. Hughes T.P., Morgan G.J., Martiat P. et al. Detection of residual leukemia after bone marrow transplantation: role of PCR in predicting relapse // Blood. 1991 - V.77, № 4. - P. 874-878.

96. Hughes Т., Branford S. Molecular monitoring of chronic myeloid leukemia // Semin. Hematol. 2003. - V.40, №2, Suppl.2. - P. 62-68.

97. Hughes Т., Kaeda J., Branford S. et al. Frequency of major molecular response to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 2003. - V.349, № 15. - P. 1423-1432.

98. Hughes Т., Branford S. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia // Blood Reviews. -2006. V.20, № 1. - P. 29-41.

99. Huntly B.J., Guilhot F., Reid A.G. Imatinib improves but may not fully reverse the poor prognosis of patients with CML with derivative chromosome 9 deletions // Blood. 2003. - V.102, № 6. - P. 2205-2212.

100. Illmer Т., Schaich M., Platzbecker U. et al. P-glycoprotein-mediated drug efflux is a resistance mechanism of chronic myelogenous leukemia cells to treatment with imatinib mesylate // Leukemia. 2004. - V. 18, №3. -P.401-408.

101. Jaffe E., Harris N., Stein H., Vardiman J., editors. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Haematopoetics and Lymphoid Tissues. Lyon. - IARC Press, 2001. -345 p.

102. Joensuu H., Roberts P.J., Sarlomo-Rikala M. et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor // N. Engl. J. Med. 2001. - V. 344, № 14. - P. 1052-1056.

103. Kantarjian H.M., Smith T.L., McCredie K.B. et al. Chronic myelogenous leukemia: a multivariate analysis of the associations of patient characteristics and therapy with survival // Blood. 1985. - V.66, № 6. - P. 1326-1335.

104. Kantarjian H.M., Dixon D., Keating M.J. et al. Characteristics of accelerated disease in chronic myelogenous leukemia // Cancer. 1988. -V.61, № 7. - P. 1441-1446.

105. Kantarjian H.M., Cortes J.E., O'Brien S. et al. Imatinib mesylate (STI571) therapy for Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in blast phase // Blood. 2002. - V. 99, №10. - P.3547-3553.

106. Kantarjian H.M., O'Brien S., Cortes J.E. et al. Treatment of Philadelphia chromosome-positive, accelerated-phase chronic myelogenous leukemia with imatinib mesylate // Clin. Cancer Res. 2002. - V.8, №7 . - P.2167-2176.

107. Kantarjian H., Sawyers C., Hochhaus A. et al. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia // N. Engl. J. Med. 2002. - Y.346, № 9. - P.645-652.

108. Kantarjian H.M., Talpaz M., O'Brien S. et al. Imatinib mesylate for Philadelphia chromosome-positive, chronic-phase myeloid leukemia after failure of interferon-alpha: follow-up results // Clin. Cancer Res. 2002. -V.8, №7.- P. 2177-2187.

109. Kantarjian H., Giles F., Wunderle L. et al. Nilotinib in imatinib-resistant CML and Philadelphia chromosome-positive ALL // N. Engl. J. Med. -2006. V.354, № 24. - P.2542-2551.

110. Kantarjian H., Talpaz M., Giles F. et al. New Insights into the Pathophysiology of Chronic Myeloid Leukemia and Imatinib Resistance // Ann. Intern. Med. 2006. - V.145, №12. - P. 913-923.

111. Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne N.Y. et al. Diagnosis of chronic myelogenous and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemiaspecific mRNA sequences amplified in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1988. V.85, №15. - P. 5698-5702.

112. Kelman Z., Prokocimer M., Peller S. et al. Rearrangements in the p53 gene in Philadelphia chromosome positive chronic myelogenous leukemia // Blood. 1989. - V.74, №7. - P.2318-2324.

113. Khorashad J.S., Anand M., Marin D. et al. The presence of a BCR-ABL mutant allele in CML does not always explain clinical resistance to imatinib // Leukemia. 2006. - V.20, №4. - P. 658-663.

114. Kolomietz E., Al-Maghrabi J., Brennan S. et al. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis// Blood. 2001. - V.97, № 11. - P. 3581-3588.

115. Kovitz C., Kantarjian H., Garcia-Manero G. et al. Myelodysplastic syndromes and acute leukemia developing after imatinib mesylate therapy for chronic myeloid leukemia // Blood. 2006. - V.108, № 8. - P. 28112813.

116. Kreill S., Mueller M., Hanfstein B. et al. Management and clinical outcome of CML patients after imatinib resistance associated with ABL kinase domain mutations // Blood. 2003. - V.102, № 12. - P.71.

117. Kuwazuru Y., Yoshimura A., Hanada S. et al. Expression of the multidrug transporter, P-glycoprotein, in chronic myelogenous leukaemia cells in blast crisis // Br. J. Haematol. 1990. - V.74, №1. - P.24-29.

118. Lange Т., Gunther C., Kohler T. et al. High levels of BAX, low levels of MRP-1, and high platelets are independent predictors of response to imatinib in myeloid blast crisis of CML // Blood. 2003. - V.101, № 6. - P.2152-2155.

119. Larson R.A., Druker B.J., Guilhot F. et al. Imatinib pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study // Blood. 2008. - V.lll, №8. -P. 4022-4028.

120. LeCoutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al. Induction of resistance to the Abelson inhibitor STI571 in human leukemic cells through gene amplification // Blood. 2000. - V. 95, № 5. - P. 1758-1766.

121. Lee W.I., Kantarjian H., Glassman A. et al. Quantitative measurement of BCR/abl transcripts using real-time polymerase chain reaction // Ann. Oncol. 2002. - V.13, № 5. - P.781-788.

122. Lin F., van Rhee F., Goldman J.M. et al. Kinetics of increasing BCR-ABL transcript numbers in chronic myeloid leukemia patients who relapse after bone marrow transplantation // Blood. 1996. - V.87, № 10. - P.4473-4478.

123. Lion Т., Izraeli S., Henn T. et al. Monitoring of residual disease in chronic myelogenous leukemia by quantitative polymerase chain reaction // Leukemia. 1992. - V.6, № 6. - P.495-499.

124. Lion Т., Henn Т., Gaiger A. et al. Early detection of relapse after bone marrow transplantation in patients with chronic myelogenous leukaemia // Lancet. 1993. - V. 341, № 8840 . - P.275-276.

125. Lion Т., Gaiger A., Henn T. et al. Use of quantitative polymerase chain reaction to monitor residual disease in chronic myelogenous leukemia during treatment with interferon // Leukemia. 1995. - V. 9, № 8. - P. 1353-1360.

126. Lowe S.W., Cepero E., Evan G. Intrinsic tumour suppression // Nature. -2004. V.432, № 7015. - P.307-315.

127. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J. et al. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. 1990.- V.247, № 4946. P. 1079-1082.

128. Luzi D., Falchi L., Cambrin G.R. et al. Response to imatinib or imatinib containing regimens of secondary clones in chronic myeloid leukemia patients with additional chromosomal abnormalities // Blood. 2007. -V.110, №11. - P.215.

129. Mahon F.X., Delbrel X., Cony-Makhoul P. et al. Follow-up of complete cytogenetic remission in patients with chronic myeloid leukemia after cessation of interferon alfa // J. Clin. Oncol. 2002. - V.20, № 1. - P.214-220.

130. Mahon F.X., Belloc F., Lagarde V. et al. MDR1 gene overexpression confers resistance to imatinib mesylate in leukemia cell line models // Blood.- 2003. V. 101, № 6. - P. 2368-2373.

131. Malinge M.C., Mahon F.X., Delfau M.H. et al. Quantitative determination of the hybrid Bcr-Abl RNA in patients with chronic myelogenous leukaemia under interferon therapy // Br. J. Haematol. 1992. - V.82, №.4. - P.701-707.

132. Marktel S., Marin D., Foot N. et al. Chronic myeloid leukemia in chronic phase responding to imatinib: the occurrence of additional cytogenetic abnormalities predicts disease progression // Haematologica.- 2003.- V. 88, № 3. P. 260-267.

133. Mashal R., Shtalrid M., Talpaz M. et al. Rearrangement and Expression of p53 in the Chronic Phase and Blast Crisis of Chronic Myelogenous Leukemia//Blood. 1990. -V. 75, № 1. - P.180-189.

134. Melo J.V. The molecular biology of chronic myeloid leukaemia // Leukemia.- 1996. V.10, № 5. - P.751-756.

135. Melo J.V., Chuah C. Resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukaemia // Cancer Lett. 2007. - V. 249, № 2. - P.121-132.

136. Мегх K., Muller M.C., Kreil S. et al. Early reduction of BCR-ABL mRNA transcript levels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of interferon alpha // Leukemia. -2002. V.16, № 12. - P. 1579-1583.

137. Moravcova J., Lukasova M., Stary J. et al. Simple competitive two-step RT-PCR assay to monitor minimal residual disease in CML patients after bone marrow transplantation // Leukemia. 1998. - V.12, № 8. - P. 13031312.

138. Morgan G.J., Hughes Т., Janssen J.W. et al. Polymerase chain reaction for detection of residual leukaemia // Lancet. 1989. - V.l, № 8644. - P. 928929.

139. Muller M.C., Gattermann N. Lahaye T. et al. Dynamics of BCR-ABL mRNA expression in first-line therapy of chronic myelogenous leukemia patients with imatinib or interferon alpha/ara-C // Leukemia. 2003. - V.17, № 12. - P.2392-2400.

140. Nagar В., Bornmann W.G., Pellicena P. et al. Crystal structures of the kinase domain of c-Abl in complex with the small molecule inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571) // Cancer Res. 2002. - V.62, № 15. -P.4236^1243.

141. Nakai H., Misawa S. Chromosome 17 abnormalities and inactivation of the p53 gene in chronic myeloid leukemia and their prognostic significance // Leuk. Lymphoma. 1995. - V. 19, №3-4. - P.213-221.

142. Nardi V., Azam M., Daley G.Q. Mechanisms and implications of imatinib resistance mutations in BCR-ABL // Curr. Opin. Hematol. 2004. - V.ll, № l.-P. 35-43.

143. Nowell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocytes leukemia // Science. 1960. - V.132, № 3438. - P. 1497.

144. O'Brien S.G., Guilhot F., Larson R.A. et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 2003. - V.348, № 11. - P. 994-1004.

145. О'Наге Т., Walters D.K., Stoffregen E.P. et al. In vitro activity of Bcr-Abl inhibitors AMN107 and BMS-354825 against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants // Cancer Res. 2005. - V. 65, № 11.-P.4500-4205.

146. Ohmine K., Nagai Т., Tarumoto T. et al. Analysis of gene expression profiles in an imatinib-resistant cell line, KCL22/ SR // Stem Cells. 2003. - V.21, № 3. - P.315-321.

147. Peggs K., Mackinnon S. Imatinib mesylate the new gold standard for treatment of chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2003. - V.348, № 11.-P. 1048-1050.

148. Peng В., Hayes M., Resta D. et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of imatinib in a phase I trial with chronic myeloid leukemia patients // J. Clin. Oncol. 2004. - V.22, № 5. - P. 935-942.

149. Picard S., Titier K., Etienne G. et al. Trough imatinib plasma levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukemia // Blood. 2007. - V.109, № 8. - P. 3496-3499.

150. Radich J.P., Gooley Т., Bryant E. et al. The significance of bcrabl molecular detection in chronic myeloid leukemia patients late 18 months or more after transplantation // Blood. 2001. - V.98, № 6. - P. 1701-1707.

151. Ray A., Cowan-Jacob S.W., Manley P.W. et al. Identification of BCR-ABL point mutations conferring resistance to the Abl kinase inhibitor AMN107 (nilotinib) by a random mutagenesis study // Blood. 2007. -V.109, № 11. - P.5011-5015.

152. Roche-Lestienne С., Preudhomme С. Mutations in the ABL kinase domain pre-exist the onset of imatinib treatment // Semin. Hematol. 2003. - V.40, № 2, Suppl.2. - P.80-82.

153. Roumiantsev S., Shah N.P., Gorre M.E. et al. Clinical resistance to the kinase inhibitor STI-571 in chronic myeloid leukemia by mutation of Tyr-253 in the Abl kinase domain P-loop // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99, № 16. - P. 10700-10705.

154. Rowley J.D. A new consistent abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining// Nature. 1973. - V.243, № 5405. - P. 290-293.

155. Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al. The BCR/ABL tyrosine kinase induces production of reactive oxygen species in hematopoietic cells // J. Biol. Chem. 2000. - V.275, № 32. - P.24273-24278.

156. Saussele S., Weisser A., Muller M.C. et al. Frequent polymorphism in BCR exon b2 identified in BCR-ABL positive and negative individuals using fluorescent hybridization probes // Leukemia. 2000. - V.14, № 1. -P.2006-2010.

157. Sawyers C.L. Chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 1999. -V.340, № 17. - P. 1330-1340.

158. Sawyers C.L. Research on resistance to cancer drug Gleevec // Science. -2001. V.294, № 5548. - P. 1834.

159. Sawyers C.L, Hochhaus A., Feldman E. et al. Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study // Blood. 2002. - V. 99, № 10. - P.3530-3539.

160. Schindler T. , Bornmann W., Pellicena P. et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase // Science. 2000. - V.289, №5486.-P. 1938-1942.

161. Schmitt C.A., Fridman J.S., Yang M. et al. Dissecting p53 tumor suppressor functions in vivo // Cancer Cell. 2002. - V.l, № 3. - P. 289298.

162. Seigneurin D., Champelovier P., Mouchiroud G. et al. Human chronic myeloid leukemic cell line with Philadelphia chromosome exhibits megakaryocytic and erythrocytic characteristics // Exp. Hematol. 1987. -V.15, № 8. - P.822-832.

163. Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J. An International system for human cytogenetic nomenclature (2009). Karger, 2009. - p. 181.

164. Shah N.P., Sawyers C.L. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias // Oncogene. 2003. - V. 22, № 47. - P.7389-7395.

165. Shah N.P., Tran C., Lee F.Y. et al. Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor // Science. 2004. - V.305, № 5682. - P.399-401.

166. Shtivelman E., Lifshitz В., Gale R.P., Canaani E. Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia // Nature. 1985. - V. 315, № 6020. - P.550-554.

167. Sorel N., Bonnet M.L., Guillier M. et al. Evidence of ABLkinase domain mutations in highly purified primitive stem cell populations of patients with chronic myelogenous leukemia // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 323, № 3. - P.728-730.

168. Soverini S., Martinelli G., Amabile M. et al. Denaturing-HPLCbased assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to Imatinib // Clin. Chem. 2004. - V.50, № . p. 1205-1213.

169. Talpaz M., Silver R.T., Druker B.J. et al. Imatinib induces durable hematologic and cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: results of a phase 2 study // Blood. 2002. - V. 99, №6. -P. 1928-1937.

170. Talpaz M., Shah N.P., Kantarjian H. et al. Dasatinib in imatinib-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemias // N. Engl. J. Med. 2006. -V.354, №24. - P. 2531-2541.

171. Thomas J., Wang L., Clark R.E., Pirmohamed M. Active transport of imatinib into and out of cells: implications for drug resistance // Blood. -2004. V.104, №12. - P. 3739-3745.

172. Thompson J.D., Brodsky I., Yunis J.J. Molecular quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia after bone marrow transplantation // Blood. 1992. - V.79, № 6. - P. 1629-1635.

173. Tokarski J.S., Newitt J.A., Chang C.Y. et al. The structure of dasatinib (BMS-354825) bound to activated ABL kinase domain elucidates its inhibitory activity against imatinib-resistant ABL mutants // Cancer Res. -2006. V.66, № 11. - P. 5790-5797.

174. Van der Velden V.H., Hochhaus A., Cazzaniga G. et al. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects // Leukemia. 2003. - V.17, № 6. - P. 1013-1034.

175. Von Bubnoff N., Schneller F., Peschel C. et al. BCR-ABL gene mutations in relation to clinical resistance of Philadelphia chromosome-positive leukaemia to STI571: a prospective study // Lancet. 2002. - V.359, № 9305. - P.487-491.

176. Wang L., Pearson K., Ferguson J.E. et al. The early molecular response to imatinib predicts cytogenetic and clinical outcome in chronic myeloid leukaemia // Br. J. Haematol. 2003. - V. 120, № 6. - P.990-999.

177. Weisberg E., Griffin J.D. Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cell lines // Blood. 2000. - V.95, № 11. - P. 3498-3505.

178. Widmer N., Decosterd L.A., Csajka C. et al. Population pharmacokinetics of imatinib and the role of alpal-acid glycoprotein // Br. J. Clin. Pharmacol. 2006 - V. 62, №1 - P. 97-112.

179. Wilkinson G.R. Cytochrome P4503A (CYP3A) metabolism: prediction of in vivo activity in humans // J. Pharmacokinet. Biopharm. 1996. - V. 24, № 5. - P.475-490.

180. Wilkinson G.R. Drug metabolism and variability among patients in drug response // N. Engl. J. Med. 2005. - V.352, № 21. - P. 2211-2221.

181. Willis S.G., Lange Т., Demehri S. et al. High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy // Blood. 2005. -V. 106, №6.-P. 2128-2137.