Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом

Зворыгин, Игорь Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом"

На правах рукописи

РГБ ОД 1 9 ФЕВ 2004

Зворыгин Игорь Анатольевич

Показатели обмена гликолротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом.

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ижевск - 2003

Работа выполнена в Ижевской государственной медицинской академии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Шараев Петр Низамиевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Галимов Шамиль Нариманович доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич

Ведущая организация:

Тюменская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится « -3 » /Чс~/ь го 2004г. в / -Ь> часов на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Башкирском государственном медицинском университете (450 000, г. Уфа - центр, ул. Ленина,3)

Автореферат разослан « 7 » г/^^-^***-, 200 г/г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Г.Х. Мирсаева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

Гликопротеины - группа сложных соединений, содержащих олигосаха-ридные цепи, ковалентно связанные с белковой основой. К числу таких соединений относится большая часть белков плазмы крови, секретов, а также многие белки внешней стороны клеточных мембран (Е. Koiw, A. Gronwall, 1952; Р. Хьюз, 1985; J. Koolman, К.-Н. Rohm, 1997).

Количество и состав олигосахаридных цепей оказывают влияние на кон-формацию белковой части гликопротеинов и определяют их антигенную специфичность. Одним из наиболее значимых компонентов гликопротеинов являются сиаловые кислоты - N-ацетилнейраминовая кислота и ее производные (L. Warren, 1959; R. Muirey et al., 1993). CK занимают концевые участки цепей и могут составлять до 20% молекулярного веса гликогтротеина, придавая молекуле гидрофильные свойства и общий отрицательный заряд (А. Gottschalk, 1969; Г.Я. Видершайн, 1980). Терминальное положение также может занимать L-фукоза, создавая в молекуле, в отличие от CK, гидрофобные участки (Z. Dische, L. Shettles, 1948; А.Ц. Анасашвшш, 1968; Р. Хьюз, 1985).

Тем не менее, такой важный компонент биохимического фенотипа, как количественный и качественный состав гликопротеинов сыворотки крови мало изучен у больных с опухолями кроветворной ткани. В связи с этим, было принято решение исследовать возможность использования показателей обмена гликопротеинов в диагностике и мониторинге заболеваний системы крови.

В качестве модели этой группы заболеваний был выбран хронический миелоидный лейкоз (XMJI) - широко распространенное злокачественное заболевание системы крови, характеризующееся четкой стадийностью течения (М.А. Волкова, 2001; А.Г. Туркина, 2002). В течении ХМЛ в настоящее время принято выделять три фазы: хроническую (или развернутую), бластный криз и, занимающую промежуточное положение, прогрессирующую фазу (или фазу

акселерации) (Н. Kantarjian, 1988; J.Reffers, J. Goldman, 1994). При этом, несмотря на изученность заболевания, сохраняются проблемы в определении фазы процесса и дифференциальной диагностики с рядом других нозологических форм, в частности - с сублейкемическим миелозом (СМ), что делает оправданным поиск дополнительных диагностических критериев (K.M. Абдулкадыров и др., 1998). В связи с этим, представляется важным использование доступных практическому здравоохранению методов исследования содержания гликопро-теинов в сыворотке крови больных миелолролиферативными заболеваниями.

Цель исследования: изучить показатели обмена сиало- и фукозосодер-жащих гликопротеинов и серомукоидов в сыворотке крови больных XMJI в различные фазы заболевания и сопоставить с клиническими и общепринятыми лабораторными данными.

Задачи исследования:

1. Исследовать показатели обмена сиалогликопротеинов (свободные, олигос-вязанные и белоксвязанные сиаловые кислоты, активность сиалидазы) в сыворотке крови больных XMJ1 и СМ.

2. Исследовать показатели обмена фукозогликопротеинов (белоксвязанная и олигомерсвязанная фукоза, активность a-L-фукозидазы) и серомукоидов (по содержанию белков, тирозина и гексозаминов) в сыворотке крови больных ХМЛ.

3. Сравнить результаты различных методов количественного анализа сиалогликопротеинов и серомукоидов, модифицировать известные методы анализа показателей обмена сиало- и фукозосодержащих соединений для применения в клинической практике.

4. Провести корреляционный анализ результатов исследования показателей обмена гликопротеинов и общепринятых для миелопролиферативных заболеваний лабораторных тестов, сравнить их информативность.

Научная новизна: Впервые проведено комплексное исследование показателей обмена сиало- и фукозгликопротеинов в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ с определением содержания ССК, ОССК, БССК, БСФ, ОСФ, а также активности сиалидазы и фукозидазы. Доказана фазовость изменений этих показателей в соответствии с развитием патологического процесса и возможность их использования в качестве маркера обострения заболевания.

Впервые выявлены различия в отклонениях отдельных показателей обмена гликопротеинов и их соотношений при прогрессировали заболевания. Показано, что, после периода повышенного биосинтеза гликопротеинов в хроническую фазу ХМЛ, в поздние периоды заболевания отмечается рост содержания продуктов распада указанных соединений (ССК, ОССК, ОСФ), что можно объяснить низкой устойчивостью к повреждающим факторам атипичных белков и нарастающей активностью глйкозидаз. Установлена тенденция к преобладанию в обмене указанных полимеров катаболических процессов с нарастанием концентрации продуктов гидролиза при переходе заболевания из моно-клоновой (доброкачественной) в поликлоновую (злокачественную) фазу ХМЛ.

Представлены результаты корреляционного анализа полученных данных с важнейшими гематологическими и биохимическими тестами, используемыми при лейкозах, установлено самостоятельное диагностическое и прогностическое значение показателей обмена сиало- и фукозосодержащих соединений. Показана целесообразность включения этих тестов в стандартные схемы диагностики и мониторинга заболеваний системы крови.

Практическая значимость:

Результаты исследования расширяют имеющиеся представления о пато-химии сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов при ХМЛ и СМ и возможностях их использования в диагностике и мониторинге указанных заболеваний. Установлено, что показатели обмена гликопротеинов являются маркерами активизации патологического процесса при трансформации в злокачественную поликлоновую стадию. В связи с этим показатели фракционного состава сиало-вых кислот, фукозы и серомукоидов могут быть рекомендованы для включения в протоколы регулярного планового обследования больных ХМЛ и СМ в качестве дополнительного биохимического критерия для диагностики фазы заболевания и своевременной коррекции схемы медикаментозного лечения.

В ходе исследований ряд методов анализа показателей обмена гликопротеинов были модифицированы в целях экономии времени на исследования и уменьшения расхода реактивов. Модификации методов изложены в информационном письме Минздрава Удмуртской Республики «Методы исследования показателей обмена сиаловых кислот в биологических жидкостях» для внедрения в лабораторную практику лечебно-профилактических учреждений. Показана возможность использования наборов реактивов «Сиалотест» («Реахим», Ижевск) и «Мукопротеины» (Hospitex diagnostics, Швейцария) в качестве скрининга с последующим применением развернутых методов исследования.

Положения, выносимые на защиту:

1. В сыворотке крови больных ХМЛ обнаруживаются изменения в обмене сиа-ло- и фукозосодержащих гликопрогеинов, что проявляется изменением содержания и (или) соотношения отдельных компонентов этих соединений с преимущественным ростом содержания продуктов катаболизма, а также повышением активности ферментов нейраминидазы и а-Ь-фукозидазы.

2. Несмотря на выявленную умеренную положительную корреляцию с отдельными гематологическими показателями (количество лейкоцитов, % бласт-ных клеток, СОЭ) и содержанием острофазовых белков крови (фибриноген, альфа-глобулины) показатели обмена гликопротеинов обладают собственной диагностической и прогностической значимостью.

3. Содержание отдельных компонентов обмена сиало- и фукозогликопротеи-нов и серомукоидов закономерно изменяется в соответствии с фазами заболевания, что может быть использовано в качестве дополнительного биохимического критерия при лабораторном мониторинге ХМЛ.

Внедрение в практику.

В лечебно-профилактических учреждениях Удмуртской Республики внедрено информационное письмо «Методы исследования показателей обмена сиаловых кислот в биологических жидкостях». Модифицированные лабораторные методы исследования сиалогликопротеинов используются в качестве дополнительного теста в оценке состояния больных, а также в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Ижевской государственной медицинской академии.

Разработанная и собранная в ходе работы компьютерная система визуализации и анализа микроизображений крови и костного мозга успешно используется в практической деятельности Республиканского гематологического центра и Республиканского латологоанатомического бюро МЗ УР, кафедры патологической анатомии Ижевской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века» (Москва, 1999), научно-практической конференции «Молодые ученые на рубеже веков» (Ижевск, 2000), П(У1) конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000), конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Ижевск, 2001), научно-практическом симпозиуме «Принципы лабораторного обеспечения внебольничной помощи» (Москва, 2001).

Диссертация обсуждена на объединенном заседании кафедр биохимического профиля ИГМА (2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 176 отечественных и 172 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 24 рисунками и 11 фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленными задачами были проведены исследования комплекса лабораторных показателей у 56 больных ХМЛ, находившихся на стационарном лечении в Республиканском гематологическом центре МЗ УР с 1998 по 2001 гг. (всего 98 случаев госпитализации). Доля лиц мужского пола составила 55%. Возраст пациентов находился в диапазоне от 15 до 77 лет с максимумом в возрастные периоды 41-50 и 61-70 лет. Средний возраст больных ХМЛ составил 54,2 ± 2,0 года (51,6 ± 2,6 для мужчин и 57,5 ±2,9 для женщин). За время наблюдения 11 пациентов умерли. В рамках дифференциальной диагностики, исследования проводились также у 42 больных СМ. Контрольную группу составили 24 практически здоровых посетителя поликлиники, проходящих плановый медицинский осмотр.

С учетом современной классификации ХМЛ все наблюдения (98 случаев госпитализации 56 больных) были разделены на три группы по фазам заболевания. При формировании групп принимались во внимание как клинический диагноз, так и объективные данные, в том числе основные лабораторные показатели. В группу с хронической фазой заболевания включено 34 случая госпитализации 25 больных с классическими клинико-гематологическими признаками неосложненной развернутой стадии ХМЛ (А.И. Воробьев, М.Д. Бриллиант, 1985). Группа больных ХМЛ в фазу акселерации (31 случай госпитализации 23 больных) сформирована на основании критериев, используемых международным регистром трансплантации костного мозга (ГОМТЛ) (ХКе^ИГеге, 1.0о1с1шап, 1994). Последнюю группу составили 33 случая госпитализации 18 пациентов с клиническим диагнозом бластного криза ХМЛ, подтвержденного лаборатор-

ными данными (Н. Kantaijian et al., 1987). Больные CM составили две группы, соответствующих хронической и терминальной фазам заболевания.

Оценка состава гликопротеинов проводилась по содержанию входящих в их состав углеводных компонентов. Для исследования использовалась венозная кровь, взятие крови производилось в утренние часы в течение 1-2 суток с момента поступления на стационарное лечение.

В работе были детально исследованы CK с использованием наиболее чувствительного и специфичного тиобарбитурового метода (L. Warren, 1959; А.А.Титаев, 1964). Современная модификация метода (П.Н. Шараев и соавг., 1993) позволяет получить не только суммарное содержание сиаловых кислот, но и их фракционный состав. Активность сиалидазы (КФ 3.2.1.18) оценивали по приросту в пробе CK после добавления в качестве субстрата нейраминлакто-зы (И.В.Цветкова, А.Б.Козина, 1968; П.Н. Шараев, 1993).

При определении фукозы использовался метод, основанный на реакции образовании хромогена при взаимодействии с солянокислым цистеином (L. Dische, L. Shetties, 1948; А.Ц. Анасашвили, 1968), также модифицированный для раздельного анализа фукозы, связанной с белками и олигомерами (П.Н. . Шараев и соавт., 1997). Активность a-L-фукозидазы (КФ 3.2.1.63) оценивалась по образованию n-нитрофенола при ферментативном расщеплении п-нитро-фенил-а-Ь-фукозы (Л.Г.Колибаба и соавт., 1975).

Серомукоиды определяли по содержанию белков (О.Н. Lowry, 1951) и ■ гексозаминов (А.Ц.Анасашвили, 1960; П.Н.Шараев, 1977) после удаления из пробы компонентов, осаждаемых хлорной кислотой (F.A.Charlwood, 1976). С целью сравнения информативности методов дополнительно проведена серия определений CK с реактивом Эрлиха (R.Starnberger, 1984) и серомукоидов по тирозину (R.J. Winzler, 1955; R.J.Henry, 1974) с использованием готовых наборов реактивов «Сиалотест» (НЛП «Реахим», г.Ижевск) и «Мукопротеины» («Hospitex diagnostics», Швейцария).

Функциональное состояние внутренних органов оценивалось с помощью комплекса биохимических показателей, определяемых в сыворотке крови с использованием реагентов «Human» (Германия), по методикам, рекомендованным Международной Федерацией по клинической химии (IFCC) на многоканальном программируемом фотометром FP-901 (Labsystems, Финляндия). Характеристика белкового обмена проведена с применением компьютеризованной системы для электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках «Астра» (Уфа). Фибриноген определяли унифицированным гравиметрическим методом.

Клеточный состав периферической крови исследовался импедансным методом на автоанализаторе К-1000 (TOA Sysmex, Япония). Использование венозной крови и К2ЭДТА в качестве антикоагулянта позволило получить более точные результаты (особенно для тромбоцитов) в сравнении с широко применяемым анализом капиллярной крови. Скорость оседания эритроцитов определялась унифицированным методом Панченкова (1972).

Для подсчета лейкоцитарной формулы и миелограммы применялись унифицированные методы исследования (В.В. Меньшиков, 1987) с окраской препаратов крови и костного мозга по Романовскому. Ввиду значимости этих методов для диагностики и мониторинга ХМЛ нами была разработана и реализована система визуализации микропрепаратов, позволившая получить качественные изображения с отечественного микроскопа «Биолам». При сборке системы использовалась настольная видеокамера серии «VideoLabs» (CIIIA), которая с помощью адаптера устанавливалась на окуляр микроскопа, а также персональный компьютер после незначительной модификации - установки дополнительной платы («видеокарта» с видеовходом S-Video в системе PAL). Для обработки изображений применялся пакет стандартных программных средств, поддерживающих работу с графикой и текстовый редактор Microsoft Word.

Расчет параметров описательной статистики и оценка статистической значимости различий между отдельными группами больных проводились с использованием статистического пакета электронной таблицы MS Excel 2000. Для оценки разностей средних применяется двусторонний критерий Стьюдента ( t ), позволяющий проверить значимость различий между двумя исследуемыми группами. В связи с тем, что схема наблюдения предполагала несколько групп больных, для преодоления эффекта множественных сравнений применялись поправка Бонферрони к критерию Стьюдента и критерий Ньюмена-Кейлса (С.Гланц, 1999). Регрессионный анализ с расчетом уравнения регрессии по методу наименьших квадратов и корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции Пирсона проводился с использованием профессионального англоязычного пакета «STATISTICA».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Значения СК в сыворотке крови больных ХМЛ определялись в широком диапазоне от 525 до 1400 мг/л. Гистограммы распределения значений (Рис.1) отразили близкое соответствие концентрации СК закономерностям нормально-

го распределения случайных величии (закону Гаусса) и позволили сделать вывод о применимости параметрических методов статистического анализа.

Рис. 1 Гистограммы распределения концентрации сиаловых кислот в соответствии с фазами ХМЛ

400 800 1200 1600

400 600 1200 1600

Примечание: На гистограммах можно наблюдать некоторое нарастание правосторонней асимметрии при прогрессировании патологического процесса. Светлыми столбиками отмечен своеобразный «всплеск» уровня СК в прогрессирующую и бластную фазу заболевания. Кроме того, постепенно уменьшается значение эксцесса распределения - кривая начинает принимать «плосковершинный» характер.

Таблица 1. Основные показатели обмена сиалогликопротеинов в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ в различные фазы заболевания

Группа, п БССК,мг/л ОССК, мг/л ССК, мг/л

Контр., п = 24 512,4 ±17,8 62,8 + 2,8 25,7 ± 1,8

ХМЛр, п = 31 703,1 ±23,5 Р,< 0,001 80,6 ±3,2 Р! <0,001 29,4 ± 2,0 Р, > 0,05

ХМЛа, п = 35 823,4 ±22,8 Р,< 0,001 Р2<0,01 109,8 ± 3,9 Р,< 0,001 Р2< 0,001 40,8 ± 2,3 Р, < 0,001 Р2 < 0,001

ХМЛт, п = 32 898,2 ±27,6 Рз > 0,05 119,9 ± 3,9 Рз > 0,05 52,8 ± 2,9 Рз < 0,01

СМр, п = 36 627,9 ±22,1 Р,< 0,001 76,1+3,8 Р| <0,05* 33,8 ±2,1 Р, <0,01*

СМт, п = 22 793,4 ±28,1 Р4< 0,001 103,1 ±4,8 Р4<0,01 44,0 ± 2,5 Р4<0,01

Р - оценка достоверности разности средних с использованием критерия Стьюдента для выборок произвольного объема: Р| - с конгр.группой; Р2 - для лары ХМЛр - ХМЛа; Р3 -для пары ХМЛа - ХМЛт; - для пары СМр - СМт

* — разность средних теряет достоверность в случае применения методов множественного сравнения (поправка Бонферрони и критерий Ньюмена-Кейлса).

Среднее содержание СК в сыворотке крови больных ХМЛ составило 954 + 18 мг/л. Приблизительно 85% от этой величины приходилось на БССК, остальные 15% были представлены продуктами их катаболизма, образованными в результате расщепления гликозидных связей. Обнаружено, что средние значения БССК и ОССК были достоверно повышены (Р < 0,001) в сравнении с контрольной группой уже в хроническую фазу ХМЛ и СМ (рис. 2). Достоверных различий с контролем в уровнях ССК в эту фазу ХМЛ и СМ не выявлено (Р > 0,05). И, напротив, между группами с прогрессирующей и бластной фазой ХМЛ можно считать достоверной разность средних уровней ССК (Р < 0,01), при этом изменения концентрации БССК и ОССК были менее значительны (Р > 0,05).

Рис. 2 Средние значения концентрации ССК, ОССК и БССК в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ в различные фазы заболевания

250 200 150 100 50 0

мг/л , 823,4* . 898,0*

, 703,1 * . I 627,9* 793

1 512,4 I 1109,8* ' 1 119,9* г ПОЗ,

1б2,8 I 80,6 * I с I I 76,1

I I I дп я • 52,8* • * 25,7 ^ 29,4 -1-40'8 33,8

1000

иг/л 800

600 о ССК □ ОССК ф-ИВ-ЦЧОО л БССК

200

Контр. ХМЛр ХМЛа ХМЛт (СМр ССМт

Примечания: 1) вертикальными отрезками отмечено I стандартное отклонение;

2) * - разница средних с контрольной группой достоверна.

На следующей диаграмме (рис. 3) отражено отношение средних значений фракций СК к контрольной группе. Обращает на себя внимание, что в хроническую фазу рост концентрации ССК и ОССК относительно небольшой, тогда как в фазу акселерации отношения ССК и БССК к контролю выравниваются, а относительная концентрация ОССК становится наибольшей. В бластную фазу отмечается максимально высокий относительный уровень ССК и ОССК, при этом концентрация БССК существенно не увеличивается. Вероятно, рост концентрации БССК в поликлоновую стадию ХМЛ ограничивается нарастающими нарушениями белоксинтетической функции печени, связанными с лейкозной

инфильтрацией и фиброзированием паренхимы органа, а также длительным приемом цитостатических препаратов. Динамика ССК и ОССК отражает истощение механизмов компенсации и нарастание процессов катаболизма.

Уровни ССК и ОССК в хроническую фазу СМ также характеризуются минимальными отличиями от контрольной группы, что связано с длительным доброкачественным течением заболевания. Тем не менее, у части больных обнаруживаются более высокие уровни этих компонентов в сравнении с хронической фазой ХМЛ. Причиной может быть характерный для остеомиелофиброза распад клеток в экстрамедуллярных очагах кроветворения.

Рис. 3 Отношение ( % ) ССК, ОССК и БССК к контрольной группе у больных ХМЛ и ОМФ в различные фазы заболевания

220 200 180 160 140 120 100

205,4

174,8

158,8

137,2

128,3

114,4

100%

160,7

I &

190,9

175,3

171,2

131,5

122,5

1 >1,2

164,2

1 >4

□ ССК

о осск

8 □ БССК

Контр. ХМЛр ХМЛа ХМЛт ОМФр ОМФг

Лейкемизация процесса в терминальную фазу СМ приводит к повышению ССК и ОССК, хотя их концентрации все-таки редко достигают величин бластной фазы ХМЛ. Можно предположить, что глубокие фиброзные изменения органов кроветворения, развившиеся за весьма продолжительное время с начала заболевания, приводят к снижению интенсивности воспалительных реакций в завершающую стадию болезни. К сожалению, по результатам применения методов множественного сравнения, не выявлено статистически значимых отличий концентрации СК в терминальную фазу СМ от фазы акселерации и бластной фазы ХМЛ (Р > 0,05).

Изменения фракционного состава СК согласуются с активностью сиали-дазы (КФ 3.2.1.18). Заметим, что у лиц сыворотка крови не обладает сиалидаз-ной активностью (Рис. 4). В хроническую фазу ХМЛ отмечалось лишь небольшое повышение активности фермента (среднее значение - 1,34 ± 0,28

мкг/мл/час), а у 19% больных определялись только следы активности фермента. У больных СМ в фазу развернутых проявлений среднее значение несколько выше (2,12 ± 0,36 мкг/мл/час) у 14%, только следы активности, но разности средних недостоверны (Р > 0,05). Значительное повышение активности отмечается в прогрессирующую фазу - 3,06 ± 0,37 мкг/мл/час и, в большей степени, в бластную фазу - 4,92 ± 0,46 мкг/мл/час (разности средних в бластную фазу и фазу акселерации достоверны: Р < 0,01). Таким образом, тенденция к повышению активности фермента и параллельный рост ССК предполагают высокую вероятность прогрессирования патологического процесса.

Рис. 4 Динамика роста ССК, ОССК и БССК относительно активности сиалидазы в различные фазы ХМЛ

СПЗСиалидаза -Ж-ССК

-в-осск

—в—БССК

Контр. ХМЛр ХМЛа ХМЛт

Определение суммарной концентрации СК с применением набора реактивов «Сиалотест» было проведено у 10 здоровых лиц и 22 больных ХМЛ. Параллельно в тех же образцах сыворотки крови СК определялись тиобарбитуро-вым методом. Для значений двух полученных вариационных рядов проведен регрессионный анализ с расчетом уравнения регрессии по методу наименьших квадратов и коэффициента корреляции (Рис. 5).

Из графика регрессии следует, что зависимость значений, полученных альтернативными методами, носит линейный характер в широком диапазоне значений (от нормы до выраженной патологии). В соответствии с уравнением регрессии, влияние коэффициентов сдвига (а = 33,3) и наклона (Ь = 0,92) на изменение значений концентрации СК при пересчете с одного метода на другой очень незначительно. Коэффициент корреляции Пирсона указывает на высокую тесноту связи между двумя переменными при оценке по шкале Чеддока, выяв-

ленная корреляция статистически значима (г = 0,76; Р < 0,001). Таким образом, можно сделать вывод о высокой степени соответствия значений концентрации СК, полученных двумя различными методами и рекомендовать наборы реактивов «Сиалотест» для использования в клинико-диагностических лабораториях.

Рис. 5 График линейной зависимости результатов определения СК с использованием набора реактивов «Сиалотест» и тиобарбитуровым методом

СК = 33,339 + ,91689 * СТ Корреляция: г = ,76250

Сиалотест, мг/л

При раздельном определении содержания фукозы, связанной с белками и олигомерами, обнаружилось, что их динамика, в общих чертах, повторяет закономерности, выявленные ранее соответственно для БССК и продуктов гидролиза сиалогликопротеинов, хотя отличаются меньшей степенью роста в сравнении с контрольной группой (Таблица 2). Разности средних с контролем статистически значимы начиная с хронической фазы ХМЛ. При этом, отличия уровней БСФ между фазами заболевания не являются достоверными. В случае применения методов множественного сравнения нельзя считать достоверной и разность средних в хроническую фазу ХМЛ с контрольной группой, для остальных различий достоверность сохраняется.

Оценка результатов для ОСФ не позволяет считать достоверными различия между хронической фазой и контрольной группой, а также между группами больных в прогрессирующую и бластную фазу ХМЛ. Напротив, обращает на себя внимание значительное повышение ОСФ в фазу акселерации ХМЛ {Рис. 6 - среднее значение достоверно отличается не только от среднего контрольной группы, но и хронической фазы заболевания). Отмечается также повышение в

поздние стадии ХМЛ активности фукозидазы, но достоверных изменений в соответствии с фазами не выявлено (Р > 0,05).

Таблица 2. Концентрация БСФ и ОСФ (М ± т) в различные фазы ХМЛ

Группа, п БСФ, мг/л ОСФ, мг/л

Контроль, п= 12 72,2 ±3,6 10,8 ±0,28

ХМЛр, п= 16 83,5 ± 3,9 Р, = 0,05 11,5+0,29 Р, > 0,05

ХМЛа, п = 21 89,9 ±4,1* Р, < 0,01 13,6 ±0,35* Р,< 0,001 Р2< 0,001

ХМЛт, п= 19 93,2 ±3,9* Р, = 0,001 14,4 ± 0,34* Р, < 0,001

Р| - оценка достоверностиразяосги средних с контрольной группой (критерий Стьюдента для выборок произвольного объема); Рг - то же для пары ХМ11р - ХМЛа

* - разность средних с контрольной группой достоверна в случае применения методов множественного сравнения (поправка Бонферрони и критерий Ньюмена-Кейлса)

Из таблицы следует, что в хроническую фазу ХМЛ отмечается незначительное (+ 16%) повышение концентрации БСФ в сравнении с контрольной группой, содержание ОСФ в это время практически не изменяется. В группе больных в фазу акселерации, напротив, отмечено заметное изменение содержания ОСФ (+ 25,9%), что приблизительно соответствует степени изменения БСФ (+ 24,5%) для этой фазы ХМЛ. При переходе в бластную фазу заболевания существенного роста концентрации БСФ и ОСФ не происходит, пределы роста составляют соответственно +29,1% и +33,3%.

Рис. 6 Динамика относительного изменения концентрации БСФ и ОСФ в различные фазы ХМЛ (с масштабированием осей «У»)

15 14 13 12 11 10

ОСФ , _ мг/л ..О

о-"

конг ХМЛ р ХМЛа ХМЛт

110 100

90 80 70 60

БСФ мг/л

—О-- НБФ

—е— сбф

Таблица 3. Результаты определения серомукоидов по белкам и гексозаминам в сыворотке крови больных в различные фазы ХМЛ

Группа, п Серомукоиды, в т.ч.

белки, мг/л гексозамины, мг/л

Контроль, п = 12 948 ±28,1 112,3 ±2,9

ХМЛр, п = 12 1088 ±32,3 Р, < 0,05 121,5 ±3,4 Р1 = 0,05*

ХМЛа, п = 15 1384 ±38,1 Р, < 0,001 Р2 < 0,001 139,4 + 4,1 Р,< 0,001 Р2<0,01

ХМЛт, п= 11 1275 ±35,9 Р1 <0,001 Р3 = 0,001 132,7 ±3,8 Р, <0,001 Р3 < 0,05*

р1 - оценка достоверности разности средних с контрольной группой (критерий Стьюдента для выборок произвольного объема); Р2 - то же для пары ХМЛр - ХМЛа; Рз - то же для пары ХМЛр - ХМЛт;

* - разность средних с контрольной группой теряет достоверность в случае применения поправки Бонферроии

Количество серомукоидов (таблица 3) по белкам увеличивается в хроническую фазу на 14,8% (Р < 0,05), далее значительный рост на 46,0% к контролю в фазу акселерации, в бластную фазу наблюдаются несколько меньшие значения (только на 34,5% выше контроля). Для гексозаминов средние значения повышены на 8,2% в хроническую фазу (разность средних с контролем нельзя считать достоверной по результатам поправки Бонферроии), 24,1 и 18,2 % в прогрессирующую и бластную фазу соответственно. Разности средних между прогрессирующей и бластной фазами недостоверны как для белков, так и гексозаминов (Р > 0,05).

Рис. 7 Динамика относительного изменения белков и гексозаминов в составе серомукоидов (с масштабированием осей «У»)

190

700

контр ХМЛр ХМЛа ХМЛт

гексозамины мг/л

170

150 ...0.. 6елки

130 —^—гексозамины

110

Соотношение белки/гексозамины составило 8,44 в группе здоровых лиц, у больных ХМЛ этот показатель равен 8,95 в хроническую фазу, и, соответственно, 9,93 и 9,61 в прогрессирующую и бластную фазу заболевания. Как было показано ранее, повышение содержания ОССК говорит о повышенном распаде гликопротеинов, по этой же причине, вероятно, в молекулах серомукоидов наблюдается устойчивое относительное снижение содержания гексозаминов. Причины более низких значений серомукоидов в бластную фазу в сравнении с фазой акселерации (Рис. 7) не вполне ясны. Не исключено, что имели значение нарастающие нарушения белоксинтетической функции печени, вызванные лей-козной инфильтрацией и фиброзированием паренхимы органа.

Проведены также сравнительные исследования количества серомукоидов по содержанию тирозина. Результаты регрессионного анализа дают основание утверждать, что обнаружена высокая теснота связи между двумя переменными (концентрация серомукоидов, полученная альтернативными методами), и данная связь может быть выражена в форме линейной зависимости. Коэффициент корреляции составил т = 0,78. Выявленная корреляция статистически значима (Р < 0,001), и по шкале Чеддока такая теснота связи расценивается как высокая.

Рис. 8 График линейной зависимости результатов определения серомукоидов по содержанию белка и тирозина у больных ХМЛ (п = 22)

Регрессия: СМ(б) = 753,56 + 2,3399 * МП Корреляция: г = ,77999

1800

1600

1400

1200

юоо

о.

воо

)

а-"

о .--'о^

■ ' ь

20 80 140 200

Муколротеины, мг/дл

260

320

Линия регрессии доверит.область 95%

Корреляционный анализ проведен также между показателями обмена СК и общепринятыми лабораторными показателями. Сильных связей результатов стандартных гематологических тестов с уровнем суммарных СК и их фракций выявлено не было. Слабая прямая связь отмечается с уровнем лейкоцитов (Р < 0,05), бластов (Р < 0,05) и базофилов (Р < 0,05) периферической крови, слабая обратная связь - с уровнем эритроцитов (Р < 0,05). Практически отсутствовала связь концентрации СК с уровнями тромбоцитов и эозинофилов. Умеренная прямая связь выявлена для СОЭ (Р < 0,01), как интегрального неспецифического показателя активности воспалительного процесса, зависящего преимущественно от белкового состава плазмы крови.

Рис. 9 Коэффициенты корреляции концентрации СК с основными гематологическими показателями у больных ХМЛ

Лейкоциты (ПК)

КМ - костный мозг

Корреляционный анализ с белковыми фракциями (Рис. 10) выявил заметную обратную связь с общим белком (г = -0,54; Р < 0,001) и умеренную обратную связь с альбуминами сыворотки крови (г = -0,42; Р < 0,001). Наибольшие положительные значения коэффициента корреляции (умеренная прямая связь) отмечены для аг и Р-глобулинов (соответственно г = 0,41 и 0,30; Р < 0,001). Для а2-глобулинов характерна слабая прямая связь (г = 0,19; Р < 0,05), для у-глобулинов такая связь вообще отсутствует.

При расчете коэффициентов корреляции для СК с абсолютными (г/л), а не относительными (%) значениями белковых фракций, прямые связи с глобу-линовыми фракциями уфачиваются, что свидетельствует о минимальной зависимости содержания СК от абсолютного значения концентрации глобулиновых фракций. Такая особенность пагохимии СК приобретает важное значение в условиях терминальной стадии гематологических заболеваний, сопровождающихся выраженными нарушениями белоксинтетической функции печени, когда затруднена интерпретация других показателей активности процесса.

Рис. 10 Коэффициенты корреляции концентрации СК и фибриногена с общим белком и белковыми фракциями у больных ХМЛ

Характерно, что для классического маркера острой фазы - фибриногена плазмы, в отличие от СК, характерна умеренная прямая связь с общим белком (г = 0,32; Р < 0,05), а также значительно сильнее выраженная прямая связь с аг, (12- и р-глобулинами (соответственно г = 0,54; 0,59 и 0,49; Р < 0,001). Корреляция между фибриногеном и СК практически отсутствует (г = 0,10). Таким образом, если концентрация фибриногена вполне укладывается в рамки понятий об этом соединении, как классическом белке острой фазы, то динамика изменения сиаловых соединений требует дополнительного обсуждения.

Относительно невысокие, хотя и положительные, коэффициенты корреляции с аг, а2- и р-глобулиновыми фракциями, «ответственными» за острофазовую реакцию, позволяют говорить о более сложных патохимических механизмах изменения концентрации сиалосодержащих соединений в ходе патоло-

гического процесса и, следовательно, возможности оценки с помощью этого параметра активности заболевания вне «острой фазы». Тот факт, что изменения концентрации СК не повторяют динамику других белков острой фазы, позволяет говорить о самостоятельном диагностическом и прогностическом значении этого показателя при миелопролиферативных заболеваниях.

ВЫВОДЫ

1. Среднее содержание сиаловых кислот у больных хроническим миелоид-ным лейкозом составило 954,5 ± 18,2 мг/л, разность средних с контролем достоверна (Р < 0,001), распределение значений соответствует закономерностям нормального распределения случайных величин. Регрессионный анализ подтверждает удовлетворительное соответствие результатов, полученных с использованием реактива Эрлиха, тиобарбитуровому методу.

2. В сыворотке крови больных хроническим миелолейкозом достоверное повышение белок- и олигосвязанных сиаловых кислот (Р < 0,001) отмечается уже в хроническую фазу заболевания, выраженный рост уровня свободных сиаловых кислот наблюдается только в фазу акселерации. Максимальные уровни продуктов гидролиза сиалогликопротеинов зафиксированы в бластную фазу, что свидетельствует о преобладании катаболических процессов в обмене сиалогликопротеинов в позднюю поликлоновую стадию заболевания.

3. Активность сиалидазы сыворотки крови у больных хроническим миелолейкозом сохраняется на низких уровнях (1,34 ± 0,28 мкг/мл/час) в хроническую фазу заболевания, у 19% больных определялись только следы сиалидаз-ной активности. Значительное повышение активности отмечается в прогрессирующую и бластную фазы (3,06 ± 0,37 и 4,92 ± 0,46 мкг/мл/час), что является важным прогностическим признаком. Повышение активности фермента и параллельный рост свободных сиаловых кислот предполагают высокую вероятность прогрессирования патологического процесса и трансформации заболевания в злокачественную поликлоновую стадию.

4. Уровни сиаловых кислот в сыворотке крови у больных сублейкемиче-ским миелозом в развернутую фазу характеризуются минимальными отличиями от контрольной группы, что связано с длительным доброкачественным течением заболевания. Лейкемизация процесса в терминальную фазу приводит к повышению свободных и олигосвязанных сиаловых кислот, но, по результатам

применения методов множественного сравнения, статистически значимых отличий с фазой акселерации и бластной фазой ХМЛ не выявлено (Р > 0,05).

5. В хроническую фазу ХМЛ среднее значение белоксвязанной фукозы на 16% выше (Р = 0,05) среднего контрольной группы, содержание олигосвязан-ной фукозы при этом практически не изменяется. В фазу акселерации, напротив, отмечен статистически значимый рост содержания олигосвязанной фукозы, в бластную фазу существенного роста концентрации обоих компонентов не происходит. В поздние стадии ХМЛ отмечается повышение активности фуко-зидазы, но достоверных изменений в соответствии с фазами не выявлено.

6. В фазу акселерации хронического миелоидного лейкоза отмечается достоверное повышение содержания серомукоидов (Р < 0,001) и отношения бел-ки/гексозамины до 9,93 (8,44 в группе здоровых лиц, 8,95 в хроническую фазу), что свидетельствует об устойчивом снижении содержания гексозаминов в составе серомукоидов. Регрессионный анализ показал высокое соответствие результатов определения серомукоидов по содержанию белков и тирозина.

7. Корреляционный анализ обнаружил умеренную прямую связь уровня сиаловых кислот с а)- и р-глобулинами и СОЭ, слабую прямую связь - с количеством лейкоцитов, бластов, базофилов периферической крови и <*2- глобулинами, умеренную обратную связь - с общим белком и альбуминами (все результаты достоверны). Сильных связей ни с одним из показателей не выявлено, что подчеркивает самостоятельное значение сиаловых кислот в диагностике и мониторинге миелопролиферативных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изменения фракционного состава СК, фукозы и серомукоидов могут быть рекомендованы для использования в качестве дополнительного биохимического маркера активизации патологического процесса и перехода заболевания в фазу акселерации. Тенденция к повышению активности сиалидазы и параллельный рост содержания ССК предполагают высокую вероятность про-грессирования патологического процесса и позволяют ставить вопрос о корректировке схемы цитостатической терапии.

В связи с этим, можно считать целесообразным включение этих исследований в схемы лабораторного мониторинга ХМЛ и СМ. В качестве скрининга могут быть широко рекомендованы для использования наборы реактивов «Сиа-лотест» и «Мукопротеины» с последующим (при необходимости) применением развернутых методов исследования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Метод определения фукозы, не связанной с белками / ГШ.Шараев, Н.С.Стрелков, Р.Р.Кильдиярова, Е.П.Сахабутдинова, И.А.Зворыгин// Клин. лаб. диагн. - 1997. - № 4. - С. 17-18.

2. Шараев П.Н. Диагностическое значение анализа показателей обмена сиа-логликопротеинов при хроническом миелоидном лейкозе / П.Н.Шараев, И.А.Зворыгин// Клин. лаб. диагн. - 1999. -№11.- С.45.

3. Показатели обмена коллагена и гликопротеинов при эндогенных интоксикациях / П.Н.Шараев, Н.С.Стрелков, И.А.Зворыгин, П.Н.Максимов, А.Я.Маль-чиков, Е.П.Сахабутдинова, Н.Н.Меньшикова // Материалы конф. «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Челябинск, 1999. - С. 121122.

4. Зворыгин И.А. Диагностическое значение исследования показателей обмена фукозогликопротеинов при хроническом миелоидном лейкозе и гломерулонеф-рите/ И.А.Зворыгин, Н.К.Габдрахманова // Материаты трудов науч.-прак. конференции «Молодые ученые на рубеже веков», т. 25. - Ижевск: Ижевская государственная медицинская академия. - 2000. - С. 47.

5. Зворыгин И.А. Исследование гликопроиенов сыворотки крови при хроническом миелоидном лейкозе с использованием лектинов/ И.А.Зворыгин// Труды Ижевской государственной медицинской академии, т. 38. - Ижевск: ИГМА. -2000. - С. 25.

6. О диагностическом значении показателей обмета коллагена и гликопротеинов при эндогенных интоксикациях / П.Н.Шараев, Н.С.Стрелков, И.А.Зво-рыгин, А.Я.Мальчиков, Е.П.Сахабутдинова, Н.Н.Меньшикова, М.Н.Осипова, Т.О.Толстолуцкая// Клин. лаб. диагн. - 2000. - № 9. - С. 9-10.

7. О диагностическом значении исследования гликопротеинов и оксипролин-содержащих белков сыворотки крови и мочи с использованием лективов/ Т.О.Толстолуцкая, И.А.Зворыгин, Я.В.Васильева, Н.К.Габдрахманова, М.Н.Осипова, Н.Г.Чернышева// Материалы конф. Биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Ижевск: Экспертиза. - 2001. - С. 130-131.

8. Изменения компонентов гликопротеинов сыворотки крови в острую фазу заболеваний/ П.Н.Шараев, Н.С.Стрелков, И.А.Зворыгин, П.М.Максимов, Н.Г.Чернышева, М.Н.Осипова// Труды Ижевской государственной медицинской академии, т. 39. - Ижевск: Экспертиза. - 2001. - С. 37.

9. Исследование гликопротеинов сыворотки крови в острую фазу развития заболеваний/ П.Н.Шараев, Н.С.Стрелков, И.А.Зворыгин, П.Н.Максимов, Н.Г.Чернышева, М.Н.Осипова, Б.Г.Князева//Клин.лаб.диагн. - 2001,- №11.- С.13 -14.

10. Исследование показателей обмена фукозосодержащих гликопротеинов в сыворотке крови/ П.Н. Шараев, Н.С. Стрелков, И.А. Зворыгин, Н.К. Габдрах-манова, М.Н. Осипова, Г.И. Ермаков, Л.В. Кочурова, С.Н. Найденкина// Труды Ижевской государственной медицинской академии, т. 40. - Ижевск: Экспертиза. - 2002. - С.28-30.

Список сокращений

ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз СМ - сублейкемический миелоз СК - сиаловые кислоты БССК - белоксвязанные сиаловые кислоты ОССК - олигосвязанные сиаловые кислоты ССК - свободные сиаловые кислоты БСФ - связанная с белком фукоза ОСФ - связанная с олигомерами фукоза

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Зворыгин, Игорь Анатольевич

Список принятых сокращений.

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Основные сведения о хроническом миелоидном лейкозе.

1.1 Современные представления о заболевании.

1.2 Характеристика фазовых изменений при XMJI.

1.3 Вопросы дифференциальной диагностики.

Глава 2. Углеводсодержащие соединения и их компоненты

2.1 Основные сведения о структуре, свойствах и функциях 29 гликопротеинов и других углеводсодержащих соединениях.

2.2 Строение, свойства и роль сиаловых кислот.

2.3 Вопросы обмена гликопротеинов и сиаловых кислот.

2.4 Изменения показателей обмена сиалосодержащих соединений при различных заболеваниях.

Собственные исследования

Глава 3. Материал и методы исследования.

3.1 Общая характеристика наблюдаемых больных.

3.2 Объективные методы оценки изменений в системе кроветворения и обмена веществ в соответствии с фазами заболевания.

3.3 Специальные методы исследования.

3.4 Методы статистического анализа.

Глава 4. Результаты объективных методов исследования системы гемопоэза в соответствии с фазами патологического процесса

Глава 5. Состояние обмена сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов в соответствии с фазами хронического миелолейкоза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом"

Актуальность проблемы:

Количество и состав олигосахаридных цепей оказывают влияние на кон-формацию белковой части гликопротеинов и определяют их антигенную специфичность. Одним из наиболее значимых компонентов гликопротеинов являются сиаловые кислоты - N-ацетилнейраминовая кислота и ее производные (L. Warren, 1959; R. Murrey et al., 1993). CK занимают концевые участки цепей и могут составлять до 20% молекулярного веса гликопротеина, придавая молекуле гидрофильные свойства и общий отрицательный заряд (A. Gottschalk, 1969; Г.Я. Видершайн, 1980). Терминальное положение также может занимать L-фукоза, создавая в молекуле, в отличие от СК, гидрофобные участки (Z. Dische, L. Shettles, 1948; А.Ц. Анасашвили, 1968; Р. Хьюз, 1985).

Неопластическая трансформация при заболеваниях системы крови сопровождается нарушениями дифференцировки клеток гемопоэза, их функций и межклеточных взаимодействий (А.И. Воробьев 1976, 2002; Ф.Д. Шиффман, 2000). Во всех этих процессах важную роль играют гликопротеины (J.T. Gallagher, I.N. Hampson, 1984). Известно, что профиль состава поверхностных гликопротеинов при различных формах лейкозов соответствует происхождению и степени зрелости бластной клетки (L.C. Anderson, C.D. Gahmberg, 1982; Г.И. Козинец, В.А. Макаров, 1998). Тем не менее, такой важный компонент биохимического фенотипа, как количественный и качественный состав гликопротеинов сыворотки крови к настоящему времени мало изучен у больных с опухолями кроветворной ткани, что приводит к необходимости исследовать возможность использования показателей обмена гликопротеинов в онкогематологии.

В качестве модели этой группы заболеваний был выбран хронический миелоидный лейкоз (XMJI) - широко распространенный вариант лейкоза, развивающийся из клеток - предшественников миелопоэза, которые сохраняют способность дифференцироваться до зрелых форм. (А.И. Воробьев, М.Д. Бриллиант, 1985). По современным представлениям XMJI является злокачественным клональным заболеванием системы крови, характеризующимся гепатос-пленомегалией, нейтрофильным лейкоцитозом со сдвигом влево в лейкоцитарной формуле, наличием характерных изменений клеточного ядра, а также стадийностью течения. (К.М. Абдулкадыров и соавт., 1998; М.А. Волкова, 2002). Заболеваемость XMJI приблизительно одинакова во всем мире - 1-1,5 на 100 ООО человек в год, что составляет 7 - 15 % среди всех лейкозов взрослых и 1,5 - 3% всех детских лейкозов. (А.Г. Туркина, 2001).

Неопластическая трансформация при XMJI связана с поражением поли-потентной стволовой клетки (R. Kurzrock et al., 1994). В системе гемопоэза у больных XMJI происходит чрезмерное неконтролируемое нарастание количества миелоидных клеток - предшественников, протекающее с вовлечением клеток миелоидного, эритроидного, мегакариоцитарного и В-лимфоидного рядов (R. Silver, 1990). Клональная природа XMJI доказана путем проведения цитоге-нетических (обнаружение Ph-хромосомы), молекулярно-генетических (детекция химерного гена bcr-abl) и биохимических (выявление моноклонального типа экспрессии глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы) исследований (P. Fialkow et al., 1977; Е. Canaani et al., 1984; J. Rowley, 1988). Заболевание в своем развитии последовательно проходит три фазы: хроническую, прогрессирующую (accelerated) и бластную или бластный криз (Н. Kantarjian, 1988; J. Goldman, 1996).

Типичными клинико-лабораторными признаками хронической фазы XMJI являются гепатоспленомегалия и нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом в лейкоцитарной формуле влево до миелоцитов и промиелоцитов, реже - единичных бластных клеток (А.И. Воробьев, М.Д. Бриллиант, 1976; М.А. Волкова, 1993; А.Г. Туркина, 1998). По мере прогрессирования лейкозного процесса наблюдаются изменения как со стороны клеточного ядра (появление дополнительных злокачественных клонов), так и клинико-гематологических признаков: усиливается и становится рефрактерной к монотерапии цитостатиками гепа-тоспленомегалия, быстро нарастает лейкоцитоз, в лейкоцитарной формуле появляется большое количество бластных клеток, а также эозинофильных и ба-зофильных гранулоцитов (P. Canellos, 1990; G. Bergamaschi, V. Rosti, 1994).

Несмотря на изученность заболевания, сохраняются проблемы в определении фазы процесса и дифференциальной диагностики с рядом других нозологических форм, в частности - с сублейкемическим миелозом (СМ). Гистологическое исследование костного мозга имеет важное значение в дифференциальной диагностике XMJI и СМ, основным морфологическим проявлением которого является остеомиелофиброз (ОМФ), хотя критерии распознавания двух рассматриваемых нозологических форм также являются недостаточно разработанными. (О.А. Рукавицын, 1997; А.В. Давыдова, 2001).

Диагностика прогрессирующей и бластной фаз XMJI в настоящее время проводится с использованием конкретных клинико-лабораторных критериев (J.Reiffers, J. Goldman, 1996), но прогрессирование XMJI не у всех больных сопровождается увеличением количества определенных типов клеток периферической крови или костного мозга (бласты, промиелоциты, эозинофилы, базо-филы) (К.М. Абдулкадыров и соавт., 1998). Нередки ситуации, когда в случае нерезко выраженных клинико-лабораторных признаков заболевания возникают сложности в дифференциальной диагностике и принятии решения о назначении адекватной схемы лечения (О.А. Рукавицын, 1997).

Не всегда существует возможность провести цитогенетическое и моле-кулярно-генетическое исследования костного мозга для завершения диагностического процесса у большинства пациентов, хотя даже в этом случае необходимо иметь ввиду наличие вариантов течения заболевания без филадельфийской хромосомы, что встречается у 5-15% больных (Р.Н. Fitsgerald, М.Е. Beard, et al., 1987; JI.И. Яворковский, 1989).

Таким образом, можно считать очевидным фактом недостаточность использования только классических клинико-гематологических критериев при постановке диагноза, дифференциальной диагностике и определении фазы заболевания. С научной и практической точек зрения оправданным является поиск дополнительных диагностических критериев фазы XMJI. В связи с этим, вызывает определенный интерес использование доступных практическому здравоохранению методов исследования показателей обмена гликопротеинов.

Исследования гликопротеинов при различных формах лейкозов показали, что профиль их состава находится в прямой зависимости от происхождения и степени зрелости лейкозной клетки. Лейкозная трансформация сопровождается изменением экспрессии или утратой тех или иных гликопротеинов (L.C. Anderson, C.D. Gahmberg, 1982). Прогрессия патологического процесса при XMJI - переход от хронической фазы в прогрессирующую и в бластный криз -сопровождается углублением нарушений программ клеточной дифференци-ровки, становлением блока дифференциации на более ранней стадии, усилением базофильной пролиферации. Следствием вышеперечисленного должны быть биохимические сдвиги, отражающие изменения в популяции гемопоэти-ческих клеток и появление особенностей, характерных для незрелых опухолевых клеток (Н. Kantarjian, 1988; Т. Ikeda, 1990).

Представленные литературные данные позволяют утверждать, что биохимический фенотип лейкозной клетки, важной составляющей которого являются углеводсодержащие соединения, отражает процессы неопластической трансформации, происходящие в клеточном ядре. При этом прогрессирование лейкозного процесса должно сопровождаться закономерными сдвигами в содержании и составе сиалогликопротеинов. В связи с этим можно считать обоснованными исследования обмена сиало- и фукозогликопротеинов в организме больных с опухолями кроветворной ткани для определения возможности их использования в качестве маркера фаз опухолевого процесса.

Следует отметить, что исследование обмена гликопротеинов у больных XMJI представляет особенный интерес. Клональный характер и достаточно четкая стадийность патологического процесса позволяют рассматривать это заболевание в качестве своеобразной модели опухолей гемопоэтической ткани.

Комплексная оценка содержания и состава гликопротеинов у больных XMJI может быть полезна для понимания патогенетических особенностей заболевания, а также использоваться при разработке практических вопросов мониторинга и прогнозирования в онкогематологии.

Задачи исследования:

1. Исследовать показатели обмена сиалогликопротеинов (свободные, оли-госвязанные и белоксвязанные сиаловые кислоты, активность сиалидазы) в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ.

3. Сравнить результаты различных методов количественного анализа сиа-ло-гликопротеинов и серомукоидов, модифицировать известные методы анализа показателей обмена сиало- и фукозосодержащих соединений для применения в клинической практике.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование показателей обмена сиало- и фукозгликопротеинов в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ с определением содержания ССК, ОССК, БССК, БСФ, ОСФ, а также активности сиалидазы и фукозидазы. Доказана фазовость изменений этих показателей в соответствии с развитием патологического процесса и возможность их использования в качестве маркера обострения заболевания.

Впервые выявлены различия в отклонениях отдельных показателей обмена гликопротеинов и их соотношений при прогрессировании заболевания. Показано, что, после периода повышенного биосинтеза гликопротеинов в хроническую фазу XMJI, в поздние периоды заболевания отмечается рост содержания продуктов распада указанных соединений (ССК, ОССК, ОСФ), что объясняется низкой устойчивостью к повреждающим факторам атипичных белков и нарастающей активностью гликозидаз. Установлена тенденция к преобладанию в обмене указанных полимеров катаболических процессов с нарастанием концентрации продуктов гидролиза при переходе заболевания из моноклоно-вой (доброкачественной) в поликлоновую (злокачественную) фазу XMJI.

Практическая значимость.

Результаты исследования расширяют имеющиеся представления о пато-химии сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов при XMJI и СМ и возможностях их использования в диагностике и мониторинге указанных заболеваний. Установлено, что показатели обмена гликопротеинов являются маркерами активизации патологического процесса при трансформации в злокачественную поликлоновую стадию. В связи с этим показатели фракционного состава сиаловых кислот, фукозы и серомукоидов могут быть рекомендованы для включения в протоколы регулярного планового обследования больных XMJI и СМ в качестве дополнительного биохимического критерия для диагностики фазы заболевания и своевременной коррекции схемы медикаментозного лечения.

В ходе исследований ряд методов анализа показателей обмена гликопротеинов были модифицированы в целях экономии времени на исследования и уменьшения расхода реактивов. Модификации методов изложены в информационном письме Минздрава Удмуртской Республики для внедрения в лабораторную практику лечебно-профилактических учреждений. Показана возможность использования наборов реактивов «Сиалотест» («Реахим», Ижевск) и «Мукопротеины» (Hospitex diagnostics, Швейцария) в качестве скрининга с последующим применением развернутых методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В сыворотке крови больных XMJI обнаруживаются изменения в обмене сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов, что проявляется изменением содержания и (или) соотношения отдельных компонентов этих соединений с преимущественным ростом содержания продуктов катаболизма, а также повышением активности ферментов нейраминидазы и a-L-фукозидазы.

3. Содержание отдельных компонентов обмена сиало- и фукозогликопро-теинов и серомукоидов закономерно изменяется в соответствии с фазами заболевания, что может быть использовано в качестве дополнительного биохимического критерия при лабораторном мониторинге XMJI.

Внедрение в практику.

В лечебно-профилактических учреждениях Удмуртской Республики внедрено информационное письмо «Методы исследования показателей обмена сиаловых кислот в биологических жидкостях». Модифицированные лабораторные методы исследования сиалогликопротеинов используются в качестве дополнительного теста в оценке состояния больных, а также в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПК и ГШ Ижевской государственной медицинской академии.

Разработанная и собранная в ходе работы компьютерная система визуализации и анализа микроизображений крови и костного мозга успешно используется в практической деятельности Республиканского гематологического центра и Республиканского патологоанатомического бюро МЗ УР, кафедры патологической анатомии Ижевской государственной медицинской академии.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены на симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века» (Москва, 1999), научно-практической конференции «Молодые ученые на рубеже веков» (Ижевск, 2000), II(VI) конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000), конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Ижевск, 2001), научно-практическом симпозиуме «Принципы лабораторного обеспечения внебольничной помощи» (Москва, 2001).

Окончательный вариант работы обсужден на межкафедральном заседании ИГМА (Ижевск, 2003).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 139 отечественных и 129 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 24 рисунками и 10 фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зворыгин, Игорь Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Среднее содержание сиаловых кислот у больных XMJI составило 954,5 ± 18,2 мг/л, разность средних с контролем достоверна (Р < 0,001), распределение значений соответствует закономерностям нормального распределения случайных величин. Регрессионный анализ подтверждает удовлетворительное соответствие результатов, полученных с использованием реактива Эр-лиха, тиобарбитуровому методу.

2. В хроническую фазу XMJI отмечается достоверное повышение БССК и ОССК (Р < 0,001), уровень ССК изменяется незначительно. В фазу акселерации наряду с повышением БССК наблюдается выраженный рост ССК, а относительная концентрация ОССК становится наибольшей. Максимальные уровни ССК и ОССК отмечены в бластную фазу, БССК при этом изменяются незначительно (Р > 0,05), что говорит о преобладании в обмене сиалогликопро-теинов катаболических процессов.

3. Активность сиалидазы в хроническую фазу XMJI сохраняется на низких уровнях (1,34 ± 0,28 мкг/мл/час), у 19% больных определялись только следы сиалидазной активности. Значительное повышение активности отмечается в прогрессирующую и бластную фазы (3,06 ± 0,37 и 4,92 ± 0,46 мкг/мл/час), что является важным прогностическим признаком. Повышение активности фермента и параллельный рост ССК предполагают высокую вероятность прогрессирования XMJI.

4. Уровни сиаловых кислот у больных СМ в развернутую фазу характеризуются минимальными отличиями от контрольной группы, что связано с длительным доброкачественным течением заболевания. Лейкемизация процесса в терминальную фазу СМ приводит к повышению ССК и ОССК, но, по результатам применения методов множественного сравнения, статистически значимых отличий с фазой акселерации и бластной фазой ХМЛ не выявлено.

5. В хроническую фазу ХМЛ среднее значение БСФ на 16% выше (Р = 0,05) среднего контрольной группы, содержание ОСФ в эту фазу практически не изменяется. В фазу акселерации, напротив, отмечен статистически значимый рост содержания ОСФ, в бластную фазу существенного роста концентрации обоих компонентов не происходит. Отмечается также повышение в поздние стадии ХМЛ активности фукозидазы, но достоверных изменений в соответствии с фазами не выявлено.

6. В фазу акселерации отмечается достоверное повышение содержания серомукоидов (Р < 0,001) и отношения белки/гексозамины до 9,93 (8,44 в группе здоровых лиц, 8,95 в хроническую фазу), что свидетельствует об устойчивом снижении содержания гексозаминов в составе серомукоидов. Регрессионный анализ показал хорошее соответствие результатов определения серомукоидов по содержанию тирозина.

7. Корреляционный анализ обнаружил умеренную прямую связь уровня СК с а г и (3-глобулинами и СОЭ, слабую прямую связь - с количеством лейкоцитов, бластов, базофилов периферической крови и а2-глобулинами, умеренную обратную связь - с общим белком и альбуминами (все результаты достоверны). Сильных связей с ни с одним из показателей не выявлено, что подчеркивает самостоятельное значение сиаловых кислот в диагностике и мониторинге заболеваний системы крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Можно считать целесообразным включение этих исследований в схемы лабораторного мониторинга ХМЛ и СМ. В качестве скрининга могут быть использованы наборы реактивов «Сиалотест» и «Мукопротеины» с последующим (при необходимости) применением развернутых методов исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Зворыгин, Игорь Анатольевич, Уфа

1. Абдулкадыров К.М. Всегда ли обязательна цитогенетическая верификация хронического миелолейкоза?/ К.М. Абдулкадыров, О.А. Рукавицын, С.С. Бессмельцев// Тер. арх,- 1996.- №7. - С. 27-31.

2. Абдулкадыров К.М. Хронический миелолейкоз./ К.М. Абдулкадыров, О.А. Рукавицын, С.С. Бессмельцев// СПб: «Специальная литература», 1998. -464 с.

3. Аврова Н.Ф. Выделение и очистка ганглиозидов мозга./ Н.Ф. Аврова, Е.Л. Обухова //Вопр.мед.химии.- 1973, Т.19, N 3, С.259-260.

4. Алексеев Н.А. Лейкозы у детей./ Н.А. Алексеев, И.М. Воронцов Л.: «Медицина», 1988. - 248 с.

5. Анасашвили А.Ц. Гликопротеиды сыворотки крови и мочи./ А.Ц. Анаса-швили// М., «Медицина», 1968, - 228 с.

6. Афанасьев Б.В. Родоначальные кроветворные клетки человека./ Б.В. Афанасьев, В.А. Алмазов// Л.: «Наука», 1985.- 204 с.

7. Балаба Т.Я. Нарушение обмена нейраминовой кислоты при острой травме/ Т.Я. Балаба, И.В. Каплан //Хирургия 1977, N 1. - С.79-85.

8. Барштейн Ю.И. Значение сиаловых кислот и изменений неклеточных структур сосудистых стенок в развитии отека мозга при менингоэнцефа-лите./ Ю.И. Барштейн, О.А. Ярош, Ш.В. Персидский //Врач, дело 1989, N 10. С.118-122.

9. Барышников А.Ю. Иммунологический фенотип бластных клеток у больных хроническим миелоидным лейкозом и его клиническое значение.// А.Ю. Барышников, Л.Ф. Морозова, И.В. Фриновская// Тер. арх.- 1984.- N 6. С. 50-53.

10. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны. Факты и гипотезы./ Л.Д. Бергельсон//- М.: Наука, 1975, 183 с.

11. Болезни системы крови./Ф.Э. Файнштейн, Г.И. Козинец, С.М. Бахрамова, М.П. Хохлова// Ташкент: «Медицина», - 1987, - 670 с.

12. Бычков С.М. Новые данные о гликозаминогликанах и протеогликанах./ С.М. Бычков, М.М. Захарова//- Вопр. мед. химии 1979, Т.25, N 3, С.227-237.

13. Варазашвили Л.М. Сиалосодержащие гликоконъюгаты при раке яичников: Автореферат дис. . .канд.биол.наук/ Л.М. Варазашвили, Тбилиси, 1991.

14. Вейнберг А.Я. Функция ганглиозидов и родственных соединений на по15

Информация о работе

Зворыгин, Игорь Анатольевич
кандидата медицинских наук
Уфа, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы