Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генов MFN2, GDAP1 и NEFL у больных наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ генов MFN2, GDAP1 и NEFL у больных наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан"

На правах рукописи

СКАЧКОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

АНАЛИЗ ГЕНОВ МШ2, СВАРІ И ШП У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫМИ МОТОРНО-СЕНСОРНЫМИ НЕЙРОПАТИЯМИ ИЗ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

03.02.07. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Уфа-2013

005540517

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Хидиятова Ирина Михайловна Доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:

Мустафина Ольга Евгеньевна Доктор биологических наук, профессор

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Зав. лабораторией физиологической генетики

Доктор медицинских наук ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России

профессор кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Защита диссертации состоится « /А> (¡¿¿ММ 2013 г. в « /6 » часов на заседании диссертационного советаД 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦРАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru Автореферат разослан «

» ¿jOdi^Juf 2013г.

Бахтиярова Клара Закиевна

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН), или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) - это.клинически и генетически гетерогенная группа наследственных заболеваний периферической нервной системы, проявляющихся прогрессирующей слабостью и атрофией дистальных мышц нижних, и, на более поздних стадиях, - верхних конечностей, деформацией стоп и кистей, расстройством чувствительности. В основе заболевапия лежат дегенеративные изменения миелиновой оболочки или аксонов двигательных и чувствительных волокон периферических нервов и спинномозговых корешков, ведущие к снижению скорости передачи нервных импульсов. На основании электронейромиографических исследований (ЭНМГ), позволяющих идентифицировать характер поражения нейронов, НМСН подразделяются на два основных типа - демиелинизирующий (НМСН I типа), характеризующийся низкой скоростью проведения возбуждения по периферическим нервам (менее 38 м/сек), и аксональный (НМСН II типа) - с нормальной или незначительно сниженной скоростью проведения нервного импульса (более 38 м/сек). Наряду с двумя основными типами НМСН, выделяют еще несколько редких типов заболевания, сопровождающихся некоторыми дополнительными клиническими признаками (Оуск е1 а1., 1994). В свою очередь, каждый из этих типов заболевания включает в себя целый ряд отдельных генетических форм НМСН, различающихся по типу наследования, характеру клинических проявлений, электронейромиографическим и морфогистохимическим особенностям. На сегодняшний день, картировано более 50 ДНК-локусов, идентифицировано более 35 генов, мутации в которых обусловливают развитие различных форм НМСН (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html). Однако, следует отметить, что четкие клинические различия между отдельными формами заболевания отсутствуют, и установление его точного генетического варианта возможно только на основе молекулярно-генетического исследования. При этом, идентификация генетической причины НМСН имеет важное значение, поскольку связана с возможностью проведения пренатальной и пресимптоматической диагностики в каждой конкретной семье, проведения эффективного медико-генетического консультирования и мониторинга заболевания в отдельных регионах. ■

Распространенность всех форм НМСН в среднем в мире составляет 10 на 100000 населения, варьируя от 0,1 до 40 на 100000 в различных популяциях (вкте, 1974). Кроме того, существует значительное популяционное разнообразие по распространенности генетических форм НМСН, а также мутаций в соответствующих

генах, что обусловливает необходимость анализа эпидемиологии и молекулярно-генетических основ данной группы заболеваний в различных регионах и этнических группах.

В последние годы изучение распространенности и генетических причин НМСН проводится в Республике Башкортостан (РБ) - одном из многонациональных регионов России. Установлена территориальная и этническая неравномерность распространенности заболевания, в целом составляющей 10,3 на 100000 населения; преобладание по частоте НМСН I типа. В результате анализа у больных НМСН из РБ четырех генов (РМР22, MPZ, GJB1 и EGR2), мутации в которых, как считается, являются наиболее частой причиной развития заболевания, было обнаружено значительное региональное и этническое своеобразие по спектру и частоте выявленных в этих генах мутаций (Крупина и др., 2006; Багаутдинова, 2007; Хидиятова и др., 2008). В то же время, примерно в половине случаев НМСН мутации в исследованных генах не были обнаружены. Это определяет актуальность продолжения исследования, включающего анализ других ответственных генов, прежде всего, генов MFN2 (mitofusin 2), GDAP1 (Ganglioside-induced differentiation-associated protein 1) и NEFL (neurofilament, light polypeptide), каждый из которых, в зависимости от характера возникающих в них мутаций, может быть задействован в развитии различных генетических форм НМСН - демиелинизирующих и аксональных, доминантных и рецессивных.

Согласно опубликованным данным, генетические варианты НМСН, обусловленные мутациями в указанных генах, составляют существенную долю в структуре данной группы заболеваний, прежде всего, наследственных аксонопатий (Azzedine et al., 2012). Так, например, НМСН 2А типа, обусловленная мутациями в гене MFN2, является одной из наиболее частых форм аксонопатий. Их доля в этой группе заболевания, по данным разных авторов, составляет от 3 - 8% (Engelfried et al., 2006; Braathen et al., 2010) до 19 - 23% (http://neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn. html, neuromuscular disease center).

Ген MFN2 (1р36.22) кодирует белок митофузин 2-го типа, содержащийся в наружных мембранах митохондрий, участвующий в образовании и функционировании митохондриальных сетей, в обеспечении аксонального транспорта митохондрий (Misko et al., 2010), а также в регуляции апоптоза клетки за счет колокализации клетки с проапоптотическим белком Вах (Bach et al., 2003). К настоящему времени в гене MFN2 обнаружено 74 различных мутаций (http://www.hgmd.org). В популяциях Европы, в том числе и в Центральном регионе

России у больных НМСН 2А типа наиболее частой мутацией этого гена является миссенс-мутация p.Arg94Gln (Щагина и др., 2006; Zuchner et al., 2004; Verhoeven et al., 2006).

Ген GDAP1 (8q21.11) кодирует ганглиозид-индуцированный, ассоциированный с дифференцировкой белок, локализующийся в паружной мембране митохондрий. Основной функцией этого белка является регуляция процесса расщепления мембран (Niemann et al., 2005; Pedrola et al., 2005). На сегодняшний день описано более 40 мутаций этого гена, обусловливающих развитие как демиелинизирующей (4А), так и аксональных (2К/2Н) форм НМСН, наследуемых чаще по аутосомно-рецессивному, реже - по аутосомно-доминантному типу (http://www.molgen.ua.ac.Be / СМТ Mutations).

Ген NEFL (8р21) кодирует легкую цепь (63 кДа) структурного белка нейрофиламентов — основного компонента цитоскелета нейронов, играющего важную роль в структуре аксонов, включая протяженные фиброзные сети в цитоплазме нейронов. Нейрофиламенты определяют аксональный радиальный рост и их диаметр и, соответственно, скорость проведения импульсов по периферическим нервам (Yum et al., 2009). Мутации в гене NEFL обусловливают аутосомно-доминантпуга форму НМСН 2Е, впервые идентифицированную в российской семье (Mersiyanova et al., 2000). В настоящее время в гене NEFL обнаружено 23 различные мутации, ответственные за формирование 1F и 2Е фенотипов НМСН (http://www.molgen.ua.ac.be / СМТ Mutations).

Исходя из этих предпосылок, были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цель работы - определение вклада генетических форм моторно-сенсорных нейропатий, связанных с мутациями в генах MFN2 (mitofusin 2), GDAP1 (ganglioside-induced differentiation-associated protein 1) и NEFL (neurofilament, light polypeptide), в общую структуру данного заболевания в Республике Башкортостан и оптимизация подходов его ДНК-диагностики для населения исследуемого региона.

Задачи исследования:

1. У больных наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан провести скрининг мутации p.Arg94Gln в гене MFN2, наиболее распространенной среди больных НМСН 2А типа в популяциях Европы.

2. Определить спектр и частоту мутаций в генах MFN2, GDAPI и NEFL у больных НМСН из Республики Башкортостан.

3. Установить характер наследования и клинические признаки заболевания в семьях больных с выявленными мутациями в исследованных генах.

4. Определить вклад типов НМСН, связанных с мутациями в исследованных генах, в структуру заболевания в Республике Башкортостан.

5. Оптимизировать подходы ДНК-диагностики НМСН в Республике Башкортостан.

Научная новизна исследования. Впервые в Республике Башкортостан у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями изучены спектр и частота мутаций в генах MFN2, GDAP1 и NEFL. В гене MFN2 выявлено 4 мутации: p.Val705Ile, p.Arg259His, p.Arg259Cys и p.Leu724Pro, последние три из которых описаны нами впервые; обнаружено 7 полиморфных вариантов гена, два из которых -С.175+280Т и с.2204+15Т>С - ранее не описаны. В гене GDAP1 идентифицированы 4 различные мутации, 2 из которых - p.Glu229Lys и p.Ala312Thr - ранее не описаны. В гене NEFL выявлена новая мутация p.Glul63Val. У больных с выявленными мутациями в исследованных генах описаны клинико-генеалогические особенности НМСН.

Научно - практическая значимость. Полученные сведения о новых мутациях в генах MFN2, GDAP1 и NEFL, а также о клинических особенностях вызываемых ими форм заболевания вносят вклад в познание механизмов патогенеза наследственных моторно-сенсорных нейропатий. Определение спектра и частоты мутаций в этих генах у больных из Республики Башкортостан способствует расширению представлений о молекулярно-генетических основах развития НМСН в этом регионе в целом и в отдельных этнических группах, в частности. Разработанный с учетом полученных данных алгоритм ДНК-диагностики НМСН, оптимальный для жителей Республики Башкортостан, необходим для повышения эффективности медико-генетического консультирования в семьях больных.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов лекций по медицинской генетике на биологических факультетах университетов, в медицинских вузах и на курсах повышения квалификации медицинских работников. Материалы диссертации также могут быть использованы в работе медико-генетической консультации при ГБУЗ «Республиканский перинатальный центр» Республики Башкортостан.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях Европейского общества генетики человека «European Human Genetics Conference» (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012; Париж, 2013); Международной конференции «International Society for Applied Biological

Sciences Conference» (Сплит, 2011); Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных и микроорганизмов (Уфа, 2012); II и III Всероссийской школе - конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011; 2012); Санкт-Петербургском научном форуме «Наука и общество. Физиология и медицина XXI века» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Уфа, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из которых 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Структура II объем диссертации. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 279 источников. Диссертация содержит 7 таблиц и 61 рисунок.

***

Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета д.м.н„ профессору Магжанову Риму Валеевичу и к.м.н., доценту Сайфуллипой Елене Владимировне за консультативную помощь и организацию забора материала для исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы образцы геномной ДНК больных с клиническим диагнозом наследственная моторно-сенсорная нейропатия, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в РБ. Все больные состоят на диспансерном учете в Медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра (МГК РПЦ) г. Уфы. Забор крови и клинический осмотр больных проводился сотрудниками кафедры неврологии Башкирского государственного медицинского университета. В настоящее время наша выборка для молекулярно-генетического исследования НМСН представлена 329 больными из 170 неродственных семей, что составляет более половины из всех проживающих в республике больных. По этнической принадлежности исследуемые семьи распределяются следующим образом: 64 русских, 50 татарских, 27 башкирских, 3 украинских и по одной семье - чувашской, марийской и азербайджанской этнической принадлежности. В 23 семьях пробанды имеют метисное происхождение. Критерием включения в исследование был диагноз НМСН, поставленный на основании данных клинико-неврологического и ЭНМГ -методов обследования, соответствующих критериям диагностики наследственных моторно-сенсорных нейропатий, принятых и изложенных в материалах Европейского консорциума по изучению нервно-мышечных заболеваний.

На основании электронейромиографического исследования тип НМСН был установлен у больных из 78 семей, тогда как у остальных пациентов такие данные отсутствовали. В связи с этим исследование генов MFN2, GDAP1 и NEFL было проведено нами у всех 102 неродственных больных, у которых ранее были исключены мутации в генах РМР22, MPZ, GJB1 и EGR2, а также у членов их семей. Расчет частоты мутаций проводили для всей обследованной выборки неродственных больных НМСН (170 человек), без дифференцировки на типы заболевания. Выборка здоровых доноров (185 человек) представлена жителями Республики Башкортостан различной этнической принадлежности: русской (60 человек), татарской (65 человек) и башкирской (60 человек). У всех обследуемых лиц кровь для ДНК-анализа была получена с их информационного согласия.

Молекулярно-генетические исследования проведены с использованием стандартных методов: выделение ДНК - методом фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови (Mathew et al., 1984); поиск мутаций в генах -методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК; полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ); конформационного полиморфизма

однонитевой ДНК (SSCP); секвенирования на автоматическом секвенаторе АВТ Prism, модель 3130 XL (Applied Biosystems).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ гена MFN2 у больных НМСН из Республики Башкортостан

В результате анализа семнадцати кодирующих экзонов гена MFN2 у 102-х неродственных больных НМСН были выявлены 4 мутации - с.2113G>A (p.Val705Ile), c.776G>A (p.Arg259His), c.775C>T (p.Arg259Cys), c.2171T>C (p.Leu724Pro), три последние из которых ранее не описаны, и 7 полиморфных вариантов: c.892G>A (p.Glu298Arg), С.9570Т (Gly319Gly), с.1547С>Т (p.Ser523Ser), c.2256+58A>G и с.1039-22Т>С - известные полиморфные варианты, с.175+28С>Т и с.2204+15Т>С -ранее неописанные нуклеотидные замены в интронных областях гена.

В восьмом экзоне гена MFN2 были идентифицированы две ранее неописанные нуклеотидные замены, затрагивающие 259-й кодон. Одна из них - с.775С>Т (p.Arg259Cys) (Рисунок 1), - идентифицирована в одной татарской семье у двух больных, другая - c.776G>A (p.Arg259His) (Рисунок 2), - обнаружена у одного больного русской этнической принадлежности. У клинически здоровых членов семей пациентов, а также в контрольных выборках здоровых лиц данные нуклеотидные замены не выявлены.

А Б В

Рисунок 1. Идентификация мутации с.775С>Т(р.А^259Су8) в 8-ом экзоне гена \4FN2 методом вБСР-анализа (А) с последующим секвенированием (Б) и ПДРФ -анализом (В)

Рисунок 2. Идентификация мутации с.7760>А (р.А^259№8) в 8-ом экзоне гена МРШ методом ввСР-анализа (А) с последующим секвенированием (Б) и ПДРФ -анализом (В)

Аргинин относится к основным алифатическим аминокислотам, несущим положительный заряд, а цистеин - аминокислота с полярным незаряженным радикалом, и, кроме того, имеющим в своем составе вН-группу. Такая аминокислотная замена может быть причиной изменения трехмерной структуры белка и приводить к нарушению его функций. Гистидин - гетероциклическая а-аминокислота со слабыми основными свойствами, обусловленными присутствием в молекуле остатка имидазола. Поэтому замена аргинина на гистидин также может вносить изменения в заряд пептида, приводя к нарушениям в пространственной организации белковой молекулы и в ее взаимодействиях с другими белками. 259-й кодон входит в состав высококонсервативной области гена МРЫ2, кодирующей ГТФазный домен белка, обеспечивающий связывание и гидролиз молекулы АТФ. На этот домен белка митофузина 2 приходится наибольшее число мутаций, выявленных у больных НМСН II типа (http://www.hgmd.org). На основании этих сведений мы предполагаем функциональную значимость мутаций р.А^259Су8 и р.А^259Н1« в развитии заболевания.

Мутации с.775С>Т и с.776й>А могут быть подтверждены рестрикционным анализом с использованием эндонуклеазы АсП; дифференцировать эти две мутации друг от друга можно с помощью одной из эндонуклеаз - М$Л, ТярШ или ВзЛ. Этот метод весьма удобен для их идентификации при проведении ДНК-диагностики.

В восемнадцатом экзоне гена МРШ выявлены две различные мутации. У двух неродственных пациенток, одна из которых - татарка, другая — украинка, идентифицирована миссенс - мутация с.2ПЗО>А (р.Уа1705Пе) (Рисунок 3). В общей выборке больных НМСН из РБ частота ее носительства составила 1,2%, среди татар -2%. Эта мутация ранее была обнаружена как среди российских больных (Щагина и др., 2006), так и в других популяциях Европы, в частности, Германии и Норвегии (ЕгщеИпес! е1 а1„ 2006; ВгааШеп е! а!., 2010).

Рисунок 3. Идентификация мутации с.2ПЗО>А (р.Уа170511е) в 18-ом экзоне гена МРИ2 методом ввСР-анализа (А) с последующим секвенированием (Б)

В двух неродственных башкирских семьях (у трех больных из одной семьи и у одного больного из другой) - выявлена новая, ранее неописанная, нуклеотидная замена с.2171Т>С (р.Ьеи724Рго) (Рисунок 4), которая, очевидно, является функционально значимой мутацией, так как обнаружена только у больных НМСН и не выявлена ни у здоровых членов семьи, ни в контрольной группе здоровых индивидов. д б

Рисунок 4. Идентификация мутации с.2171Т>С (p.Leu724Pro) в 18-ом экзоне гена MFN2 методом SSCP-анализа (А) с последующим секвенированием (Б). В - Фрагмент родословной семьи К. с НМСН из РБ. Г - Фотография деформации стоп у пациентки III7 из семьи К.

724-й кодон входит в состав высококонсервативного региона гена MFN2, кодирующего СС2 концевой домен белковой молекулы, чрезвычайно важный для правильной мембранной топологии митофузина 2 (Kijma et al., 2005). Несмотря на то, что и лейцин и пролин относятся к группе аминокислот с незаряженными неполярными радикалами, они могут иметь различное значение для белковой молекулы, поскольку лейцин является алифатической аминокислотой, а пролин -гетероциклической, содержащей в своем составе атом азота, который способствует резкому изгибанию пептидной цепи. Очевидно, что эти сведения также могут служить косвенным подтверждением функциональной значимости выявленной нами нуклеотидной замены. Частота ее носительства в общей выборке неродственных больных НМСН из РБ составила 1,2%, а среди 27 неродственных башкирских семей -7,4%. Мутацию с.2171Т>С можно выявить, используя эндонуклеазу NIaYV.

Отдельно, методом рестрикционного анализа с использованием эндонуклеазы Эс1еI, нами был проведен скрининг всех обследуемых пациентов с НМСН на наличие распространенной среди европейских больных мутации р.Аг094О1п, однако в выборке больных из Башкортостана данная мутация не была обнаружена.

В общей группе неродственных больных НМСН (170 человек) частота носительства мутаций в гене МРЫ2 составляет 3%. Среди больных НМСН II типа (в РБ менее 40% от общей выборки больных (Крупина и др., 2006), частота мутаций в гене МРЫ2 и, соответственно, формы НМСН 2А в исследованном регионе может составлять, около, 7%.

У большинства обследованных больных с выявленными мутациями в гене \iFN2 клинические и электронейромиографические данные соответствовали НМСН II типа и характеризовались отчетливым межсемейным полиморфизмом по возрасту манифестации, степени выраженности и спектру клинических проявлений. Одним из объяснений этому может быть различный тип мутационного повреждения.

Анализ гена СОА Р1 у больных НМСН из Республики Башкортостан

В результате исследования всех шести экзонов гена вОАР 1 у 102-х больных было выявлено 6 нуклеотидных замен: четыре мутации, две из которых новые -с.6850А (р.01и229Ьу8), с.934С>А (р.А1а312ТЬг), и две известные - с.715С>Т (р.Ьеи239Р11е), с.7190>А (р.Суз240Туг), а также 2 известных полиморфных варианта - с.1020С (р.8ег348ег) и с.507Т>С (р.8ег1698ег).

Ранее неописанная миссенс-мутация с.685С>А (р.С1и229Ьуз) (Рисунок 5) в пятом экзоне гена ОВАР1 была выявлена в пяти неродственных семьях больных НМСН различной этнической принадлежности (двух русских, одной башкирской, одной татарской и одной азербайджанской).

А Б В

Рисунок 5. Идентификация мутации с.685С>А (р.01и229Ьуз) в 5-ом экзоне гена ОйАР1 методом 88СР - анализа (А) с последующим секвенированием (Б) и ПДРФ -анализом (В)

Во всех пяти семьях данная нуклеотидная замена обнаружена в гетерозиготном состоянии, при этом какой-либо другой мутации в гене GDAP1 методом прямого секвенирования всех других кодирующих последовательностей гена у этих больных не обнаружено, хотя в данных семьях наблюдается рецессивный тип наследования заболевания, и поэтому у больных следует ожидать наличие второй функционально значимой мутации. В двух семьях данная мутация в гетерозиготном состоянии была обнаружена и у одного из фенотипически здоровых родителей пробандов. В контрольной выборке здоровых лиц данная мутация не обнаружена. Интересным оказался факт, что, при отсутствии второй функционально значимой мутации в исследуемом гене, во всех данных пяти семьях мутация c.685G>A (p.Glu229Lys) сегрегирована с синонимичной заменой c.102G>C (p.Ser34Ser), присутствующей у них в гомозиготном состоянии, описанной ранее как полиморфный вариант rs788201. В белковой молекуле миссенс-мутация p.Glu229Lys затрагивает высоко консервативный GST-C домен, играющий ключевую роль в детоксикации и уменьшении числа активных форм кислорода (Chung et al., 2008). Мутация c.685G>A может быть идентифицирована методом рестрикционного анализа с использованием эндонуклеазы Mboll.

В шестом экзоне гена GDAP1 были выявлены три различные нуклеотидные замены. Миссенс-мутация c.934G>A (p.Ala312Thr) (Рисунок 6) идентифицирована у трех больных из одной русской семьи с доминантным типом наследования НМСН.

А Б В

Рисунок 6. Идентификация мутации с.934С>А (р.А1а312ТЬг) в б-ом экзоне гена ййАР! методом ЭЗСР-анализа (В) с последующим секвенированием (Б) и ПДРФ -анализом (А)

В контрольной выборке здоровых лиц данная мутация не обнаружена. В общей выборке больных НМСН из РБ (170 человек) частота гетерозиготного носительства мутации р.А1а312ТЬг составила 0,6%, а среди русских больных - 1,6%. Аутосомно-доминантная форма НМСН 2К, обусловленная мутациями в гене ййАР!, встречается достаточно редко (примерно 1% из СйАР! связанных НМСН), но, тем не менее, уже

известен целый ряд различных мутаций этого гена, детерминирующих такую форму (С1агатшй е1 а1., 2005; СптеИа е1 а1., 2010; 81уега е1 а1„ 2010; г\топ е1 а1„ 2011). Подтвердить мутацию р.А1а312ТЬг возможно при помощи эндонуклеазы НаеIII.

Б шестом экзоне гена СЭАР1 у больных НМСН из РБ мы обнаружили еще две известные мутации, затрагивающие два соседних ко дона: с.715С>Т (р.Ьеи239РЬе) и с.7190>А (р.Су5240Туг). Аминокислоты в положении 239 и 240 входят в состав высококонсервативного участка БвТ-С домена белка йОАР 1.

Мутация с.715С>Т (р.Ьеи239РЬе) выявлена у двух больных русской этнической принадлежности: у одной больной с доминантным типом наследования НМСН она обнаружена в компаунд гетерозиготном состоянии с мутацией с.719С>А (р.Сув240Туг) (Рисунок 7 А).

А 1 2 3

Рисунок 7. А - Идентификация мутаций с.715С>Т (p.Leu239Phe) и c.719G>A (p.Cys240Tyr) в гене GDAP1 в 6-ом экзоне гена GDAP1 методом SSCP-анализа (1) с последующим секвенированием (2) и ПДРФ - анализом (3)

Б - Идентификация мутации с.715С>Т (p.Leu239Phe) в гене GDAP1 в 6-ом экзоне гена GDAP1 методом SSCP-анализа (1) с последующим секвенированием (2) и ПДРФ -анализом (3)

У другого пациента, единственного больного в семье, - мутация с.715С>Т (p.Leu239Phe) идентифицирована в гетерозиготном состоянии, но вторая мутация в гене GDAP1, а также в других исследованных нами ранее генах, не обнаружена (Рисунок 7 Б). В последнем случае было установлено, что мутация с.715С>Т (p.Leu239Phe) возникла de novo. У этого больного мутация p.Leu239Phe сегрегировала

с полиморфным вариантом с.507Т>С (р.8ег1693ег), находящимся в гомозиготном состоянии. Эта нуклеотидная замена в четвертом экзоне гена ООЛР1 была обнаружена нами у четырех неродственных больных, также в гомозиготном состоянии. Ранее в различных исследованиях полиморфный вариант р.5сг1695ег гена йОАР! был обнаружен как в гомо -, так и в гетерозиготном состоянии у больных с аутосомно-рецессивным характером наследования, а также было показано, что он с высокой частотой встречается в общей популяции (8еш1егек е1 а1., 2003).

Мутации р.Ьеи239РЬе и р.Суз240Туг ранее были описаны и другими авторами. Мутация С.7150Т (р.Ьеи239РЬе) считается наиболее частой причиной 4А формы НМСН в популяциях Центральной и Восточной Европы (Вагапкоуа ^ а1., 2007). Мутация с.719в>А (р.Суэ240Туг) впервые была описана во французской семье с аутосомно-доминантной формой НМСН 2К (Савзегеаи е1 а1., 2009).

Таким образом, в целом, распространенность НМСН, связанных с мутациями в гене йОАР1, в общую структуру заболевания в РБ составляет около 5%.

В результате анализа данных клинического и генеалогического исследований, у больных НМСН с мутациями в гене ййАР! были выявлены две клинические формы -рецессивная, соответствующая промежуточному типу 4А, характеризующемуся дебютом заболевания в раннем детстве, его тяжелым течением и быстрым прогрессированием, слабостью мышц в дистальных отделах конечностей и их дальнейшей атрофией, и доминантная - с более поздним возрастом манифестации (11 - 50 лет), медленным прогрессированием и более мягким течением заболевания, что соответствует известной аксональной форме НМСН 2К.

Анализ гена Л'ЕГЬ >> больных НМСН из Республики Башкортостан

В результате исследования всех четырех экзонов гена ЫЕРЬ у 102-х неродственных больных НМСН из РБ была выявлена одна мутация с.488А>Т (р.01и163Уа1) и 5 полиморфных вариантов: с.639С>0 (р.11е213Ме1; к35575466); 1168-11Т>С (гв76347846); с.1402С>А (р.А8р468Азп; гз57153321)\ с.1355Т>С (р.11е452ТЬг; гз1065089) и с.1356С>Т (р.11е45211е), последний из которых ранее не описан.

Ранее неописанная миссенс-мутация с.488А>Т (р.С1и163Уа1) (Рисунок 8) выявлена нами в гетерозиготном состоянии у одной больной русской этнической принадлежности. Данная нуклеотидная замена была обнаружена только у пациентки с НМСН, но не выявлена в контрольной выборке здоровых индивидов. Другие родственники пробанда, к сожалению, не были доступны для анализа. Глутаминовая кислота относится к группе аминокислот с полярными отрицательно заряженными

радикалами, тогда как валин - неполярная алифатическая альфа-аминокислота, поэтому можно допустить, что подобная замена может быть причиной изменения вторичной структуры белка и приводить к нарушению его функций. Данная мутация находится в головном домене белка, ответственном непосредственно за сборку филаментов (Jordanova et al., 2003). Исходя из этих соображений, можно предположить, что данная нуклеотидная замена может являться функционально значимой мутацией, приводящей к развитию НМСН. В общей группе неродственных больных НМСН (170 человек) частота генетической формы НМСН, связанной с мутациями в гене NEFL, оказалась низкой, составляющей 0,6%. В европейской выборке больных НМСН частота встречаемости мутаций в гене NEFL также невысока, составляет в среднем 2% (Mersiyanova et al., 2000).

А Б

---_—-

с * о а аса до с оса

А/ллААлалАЛа/УУ

Рисунок 8. Идентификация мутации с.488А>Т (p.Glul63Val) в гене GDAP1 в 1-ом экзоне гена NEFL методом SSCP-анализа (А) с последующим секвенированием (Б)

Клиническую картину у выявленной нами больной НМСН с мутацией p.Glul63Val в гене NEFL можно отнести к аутосомно-доминантной демиелинизирующей форме НМСН 1F.

Оптимизация подходов ДНК-диагностики наследственных моторно-сенсорных нейропатий у больных из Республики Башкортостан

Проведенный анализ трех генов - MFN2, GDAP1 и NEFL - у больных НМСН из Республики Башкортостан явился продолжением комплексного эпидемиологического и клинико-генетического исследования этой группы заболеваний, проводимого в регионе в последние 10 лет. В настоящий момент, обобщая данные этого исследования, включающего анализ общей распространенности НМСН в РБ, частоты отдельных генетических форм НМСН как в общей выборке больных, так и в отдельных этнических группах, а также спектр и частоту мутаций в семи генах -РМР22. MPZ, GJB1, EGR2 (Крупина и др., 2006; Багаутдинова, 2007), MFN2, GDAP1 и NEFL, - можно констатировать, что: 1) генетическая причина развития НМСН у

больных из РБ установлена, примерно, в 52% неродственных семей 2) наиболее частыми причинами заболевания являются дупликация гена РМР22 (27%) и мутации в гене коннексина 32 (GJB1) (14%), обусловливающие развитие НМСН I типа; вклад НМСН 2А, связанной с мутациями в гене МЕЫ2, составляет 3%; вклад генетических форм НМСН 4А и НМСН 2К, связанных с мутациями в гене йОАР!, составляет 5%; мутации в гене МР1, связанные с формой НМСН 1В, обусловливают, приблизительно, 2% случаев НМСН; мутации в гене ^ГЬ, связанные с формой НМСН 1Б, - около 1%; а мутации в гене ЕОК2 у больных НМСН из РБ не обнаружены 3) спектр и частота мутаций в исследованных генах имеют этнические особенности (Рисунок 9).

Татары

Башкиры

Русские

І I

іРМР22сіир т?де\

ЩВ1:Рго87Д1а

Є)В1:Т1іг86ІІе

ЫВ1:Агв2261п

Є0АР1:Су5240Туг

ЄОАР1:АІа312"Піе

60АР1:ЄІи2291у5

вОДРІ: [_еи239РЬе

МЖ2:Аг5259НІ5

МРМ2:1.еи724Рго

МРІЧ2: УаІ705ІІе

!УТО:Аг|259Су5

МЕРІгСІиІбЗУзІ

Неизвестные мутации

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

Рисунок 9. Спектр и частота мутаций в генах РМР22, йЗВІ, МР2, МРЫ2, ЄОАРІ и ИЕП у больных НМСН из РБ в отдельных этнических группах

На основании проведенного исследования был разработан алгоритм ДНК-диагностики НМСН, оптимальный для исследованного региона (Рисунок 10). Безусловно, что при проведении ДНК-диагностики необходимо учитывать данные ЭНМГ - исследования, позволяющие определить характер нервного поражения, и, соответственно, основной тип НМСН; характер наследования заболевания, возраст манифестации и важнейшие клинические показатели, которые также могут способствовать предварительному выбору гена или группы генов для их дальнейшего анализа. Согласно разработанному алгоритму, при предварительном установлении диагноза - НМСН I типа, - обследование следует начинать с определения дупликации

гена РМР22, детерминирующей развитие формы НМСН 1А. При отсутствии дупликации гена РМР22 проводится поиск мутаций в гене ОЛИ, в первую очередь мутации р.Рго87А1а. являющейся наиболее частой у больных НМСН IX из РБ, особенно среди башкир. Здесь необходимо обратить внимание на характер наследования заболевания и на выраженность клинических проявлений у мужчин и женщин в исследуемой семье, поскольку мутации в гене <5.757 наследуются по X-сцепленному доминантному типу, но у женщин клинические признаки проявляются в более мягкой форме, чем у мужчин. Далее, если у больных с предварительным диагнозом НМСН Т мутации в этих двух генах не выявляются, то проводится поиск мутаций в генах МР2 (в первую очередь, определение мутации р.8сг88Ьсц) и ЫЕРЬ. В случае идентификации мутаций в этих генах устанавливается диагноз НМСН 1В или НМСН 1Б, соответственно. При предварительном установлении диагноза НМСН П типа, в случае доминантного наследования заболевания, ДНК-анализ необходимо начинать с исследования гена МРИ2, в первую очередь, с поиска мутаций, выявленных у больных из РБ, учитывая при этом этническую принадлежность и место происхождения обследуемой семьи. В случае идентификации мутации в гене МРЫ2, устанавливается диагноз НМСН 2А. Если мутации в гене МРЫ2 не обнаружены, то при доминантной аксональной форме НМСН можно провести анализ на наличие мутации р.Су8240Туг в гене СОАР1 При НМСН II типа, а также промежуточного (по данным ЭНМГ) типа с рецессивным характером наследования, рекомендуется начинать поиск мутаций с гена СгТМР/, в первую очередь, с мутаций р.О]и2291_у5 и р.Ьеи239РЬе. В случае отсутствия мутаций в указанных выше генах, поиск их может быть продолжен в других известных и неизвестных в отношении НМСН генах. Этому могут способствовать, в частности, появившиеся в настоящее время методы полногеномного секвенирования экзома, которые позволяют идентифицировать мутации и полиморфные варианты одновременно во всех кодирующих участках генома человека.

Рисунок 10. Алгоритм ДНК - диагностики НМСН в Республике Башкортостан

ВЫВОДЫ

1. В гене МРЫ2 у больных НМСН из Республики Башкортостан идентифицированы 4 мутации в гетерозиготном состоянии, три из которых являются новыми и описаны нами впервые: с.775С>Т (р.А^259Сув) — обнаружена в одной татарской семье, с.77бО>А (р.Агд259НІ5) - в русской семье, с.2171Т>С (рХеи724Рго) - в башкирской семье, и одна известная мутация - с.2113й>А (р.Уа170511е) - выявлена в татарской и украинской семьях. Мутация р.А^94С1п, наиболее распространенная среди больных НМСН 2А типа в популяциях Европы, у больных из РБ не обнаружена. Семь выявленных нуклеотидных замен являются полиморфными вариантами гена: с.8920>А (р.С1у298А^), с.957С>Т (р.01у319С1у), с.1547С>Т (р.8ег5238ег), с.2256+58А>С, с.1039-22Т>С, с.175+28С>Т и с.2204+15Т>С, два последние из которых ранее не описаны. Вклад

НМСН, обусловленных мутациями в гене \iFN2, в общую структуру заболевания среди больных из РБ составляет около 3%.

2. В гене О ПАР! у больных НМСН из Республики Башкортостан выявлены 4 мутации: с.6850>А (р.СкШЭЬув) - обнаружена в гетерозиготном состоянии в пяти семьях различной этнической принадлежности, в сочетании с гомозиготным генотипом *С*С по полиморфному варианту с.102С>С (г.?788201); с.715С>Т (р.Ьеи239РЬе) - идентифицирована в двух русских семьях, в одной из которых - в сочетании с мутацией с.7190>А (р.Суб240Туг), в другой - в сочетании с гомозиготным генотипом *0*0 по полиморфному варианту с.507Т>0 (п11554166); и с.934С>А (р.А1а312Пгг) - выявлена в одной русской семье в гетерозиготном состоянии. Мутации р.С1и229Ьуз и р.А1аЗ 12ТЪг ранее не описаны. Вклад НМСН, связанных с мутациями в гене СОАР1, в общую структуру заболевания в РБ составляет около 5%.

3. В гене МЕРЬ у больных НМСН из Республики Башкортостан обнаружено 6 изменений нуклеотидной последовательности: одна новая мутация - с.488А>Т (р.01и163\'а1), выявленная в гетерозиготном состоянии в русской семье, и 5 полиморфных вариантов: с.бЗЭОв (р.11е213Ме1; г.ч35575466); 1168-11Т>С (гаг76347846); с.1402С>А (р.АврДбвАвп; п57153321); с.1355Т>С (р.11е452ТЪг; г$1065089) и С.13560Т (р.11е45211е), последний из которых ранее не описан. Вклад НМСН, связанных с мутациями в гене МЕРЬ, в общую структуру заболевания в исследуемом регионе составляет около 1%.

4. Охарактеризованы клинические особенности НМСН у больных с выявленными мутациями в исследованных генах. Клиническая картина больных с выявленными мутациями в гене МЙ\Г2, в целом, соответствует таковой при аксональной форме НМСН 2А. У больных с мутациями в гене СйАР! наблюдались две различные формы заболевания: при наличии мутаций р.С1и229Ьуз и р.Ьеи239РЬе установлена рецессивная форма НМСН, соответствующая промежуточному типу 4А, при наличии мутаций р.Суз240Туг и р.А1а312ТЬг - доминантная форма НМСН, соответствующая аксональной форме НМСН 2К. У больной с мутацией р.01и163Уа1 в гене МЕРЬ клиническая картина заболевания соответствовала таковой при доминантной демислинизирующей форме НМСН №.

5. На основе полученных данных разработан оптимальный алгоритм молекулярно-гснетической диагностики у больных с НМСН из РБ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Хидиятова, И.М. Популяционное исследование структурных особенностей генов моногенных заболеваний в Республике Башкортостан і И.М. Хидиятова, B.JI. Ахметова, Р.И. Хусаинова, А.С. Карунас, Л.У. Джемилева, И.А. Скачкова, Д.Д. Надырпшна, А.А. Рахимкулова, А.К. Марданова, С.Ш. Мурзабаева, Р.В. Магжанов, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская тенетика. - 2011. - Т. 10. - №6. -С.13- 23.

2. Сайфуллина, Е.В. Клинико-генетическая характеристика пациентов с наследственными моторно-сенсорными невропатиями из Республики Башкортостан с мутациями в гене MFN2 / Е.В. Сайфуллина, Р.В. Магжанов, И.М. Хидиятова, И.А. Скачкова, Э.К. Хуснутдинова II Неврологический журнал. -2013. - Т. 18. - №1. - С. 30-34.

3. Хидиятова, И.М. Анализ гена MFN2 у больных с наследственными моторно -сенсориыми нейропатиями из Республики Башкортостан / И.М. Хидиятова, И.А. Скачкова, Е.В. Сайфуллина, Р.В. Магжанов, О.А. Щагина, Р.А. Зинченко, А.Н. Петрин, Э.К. Хуснутдинова // Генетика. - 2013. - Т.49. - №7. - С. 884-890

4. Скачкова, И.А. Анализ спектра мутаций гена MFN2 у пациентов с моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан / И.А. Скачкова, А.Ф. Ахметгалеева, И.М. Хидиятова, Р.В. Магжанов, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской школы - конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» - Уфа. - 2011. -Т.1. - №2. -С. 114-115.

5. Скачкова, И.А., Анализ гена MFN2 у пациентов с моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан / И.А Скачкова, А.Ф Ахметгалеева, И.М. Хидиятова, Д.В. Галиева, Р.В.Магжанов, Э.К. Хуснутдинова // Наука и общество. Физиология и медицина 21 века: тезисы секционных и стендовых докладов Санкт-Петербургского научного форума. - Санкт-Петербург. - 2011. - С. 101-102.

6. Skachkova, I. Mutational analysis of MFN2 in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan Republic (Russia) / I.A. Skachkova, I.M. Khidiyatova, R.V. Magzhanov, A. Ahmetgaleeva, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - Amsterdam. - 2011. - C. 451.

7. Skachkova, I. Spectrum and frequency of MFN2 in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan Republic (Russia) / I.A. Skachkova, I.M. Khidiyatova, R.V. Magzhanov, A. Ahmetgaleeva, E.K. Khusnutdinova // 7th International Society for Applied Biological Sciences Conference. - Croatia - 2011. -V.19 (2). - P. 356

8. Skachkova, I. The mutational spectrum of GDAPl gene in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan Republic (Russia) / I.A. Skachkova,

I.M. Khidiyatova, E.V. Saifullina, D. Baizigitov, R.V. Magzhanov, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. Nürnberg. - 2012. - V.20. - P.311.

9. Скачкова, И.А. Спектр мутаций в генах MFN2 и GDAP1 у пациентов с моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан / И.А. Скачкова, Д. Байзигитов, И.М. Хидиятова, Е.В. Сайфуллина, Р.В.Магжанов, Э.К. Хуснугдинова // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием "Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» - Санкт-Петербург. - 2012. -С. 102.

10. Galiyeva, D.V. Clinical and genetical study of patients from Republic Bashkortostan with novel mutation in GJBl gene / D.V. Galiyeva, E.V. Saifullina, I.A. Skachkova, R.V. Magzhanov, I.M. Khidiyatova, E.K. Khusnutdinova II European Human Genetics Conference. - Nürnberg. - 2012. - C.393

И. Скачкова, И.А. Анализ генов MFN2 и GDAP1 у пациентов с моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан / И.А. Скачкова, И.М. Хидиятова, Р.В. Магжанов, Э.К. Хуснутдинова // Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов» - Уфа. - 2012 - С.147.

12. Скачкова, И.А. Исследование спектра мутаций гена GDAP1 у пациентов с моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан / И.А. Скачкова, И.М. Хидиятова, Е.В. Сайфуллина, Р.В. Магжанов, Э.К Хуснутдинова // Материалы III Всероссийской школы - конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» -Уфа.-2012.-№3.-С.94.

13. Скачкова, И.А. Мутации в генах MFN2 и GDAP1 при моторно-сенсорных нейропатиях в Башкортостане // И.А. Скачкова, И.М. Хидиятова, Е.В. Сайфуллина, Р.В. Магжанов, Э.К. Хуснугдинова // Материалы V Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» тезисы секционных и стендовых докладов. - Звенигород,- 2012,- С. 60

14. Skachkova, I. Mutation alanalysis of NEFL gene in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan Republic (Russia) / I.A. Skachkova, I.M. Khidiyatova, E.V. Saifullina, R.V. Magzhanov, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - Paris. - 2013. - C. 505-506.

15. Saifullina, E.V. Clinical and genetic study of hereditary motor-sensory neuropathy patients from Republic Bashkortostan with novel mutations in MFN2 gene / E.V. Saifullina, R.V. Magzhanov, I.A. Skachkova, I.M. Khidiyatova, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - Paris. - 2013. - C. 208.

16. Скачкова, И.А. Анализ генов GDAP1 и NEFL у больных моторно-сенсорными нейропатиями в Республике Башкортостан / И.А. Скачкова // Всероссийская молодежная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы наука и образования» тезисы секционных и стендовых докладов. - Уфа; - 2013 - С. 174-176.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АД - Аутосомно-доминантное наследование

АР - Аутосомпо-рецессивное наследование

НМСН - Наследственная моторно-сенсорная нейропатия

ШМТ - Шарко-Мари-Тута болезнь

СПИ - Скорость проведения импульса

ЭНМГ - Электронейромиография

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

SSCP Single strand conformation polymorphism

(конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК)

ПДРФ - Полиморфизм длины рестрикциониых фрагментов

п.н. - пар нуклеотидов

РБ - Республика Башкортостан

MFN2 - Mitofusin 2, митофузин 2

Ganglioside-induced differentiation - associated protein 1, GDAP1 - ганпшозид-индуцированный, ассоциированный с дифференцировкой протеин 1

NEFL - Neurofilament light chain polypeptide gene, нейрофиламент легкой цепи

Подписано в печать 14.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60X84/16. Гарнитура Times. Усл.печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ 746.

Типография ИИЯЛ УНЦ РАН г.Уфа, пр. Октября, 71. тел. (347)235-60-50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скачкова, Ирина Алексеевна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

АНАЛИЗ ГЕНОВ МГ№, вОЛР! И ЬЕП У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫМИ МОТОРНО - СЕНСОРНЫМИ НЕЙРОПАТИЯМИ ИЗ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

На правах рукописи

04201452829

Скачкова Ирина Алексеевна

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Хидиятова И.М.

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 11

1.1. Клиническая характеристика, эпидемиология и классификация наследственных моторно - сенсорных нейропатий......................... 11

1.2. Молекулярно - генетические основы наследственных моторно -сенсорных нейропатий.......................................................... 16

1.2.1. Генетические основы наследственных моторно - сенсорных нейропатий I типа (миелинопатий).......................................... 23

1.2.1.1. Миелинопатии, связанные с генами структурных

белков миелиновой оболочки..................................... 25

1.2.1.2. Миелинопатии, связанные с генами белков -регуляторов транскрипции............................................... 30

1.2.1.3. Миелипатии, связанные с генами внутриклеточных белков шванновских клеток..................................... 31

1.2.2. Промежуточная форма наследственных моторно - сенсорных нейропатий................................................................ 36

1.2.3. Генетические основы наследственных моторно - сенсорных нейропатий II типа (аксонопатий).................................... 37

1.2.3.1. Аксонопатии, связанные с генами белков, участвующих

в формировании хондриома..................................... 39

1.2.3.2. Нейропатии, связанные с генами белков аксонального

цитоскелета....................................................................................................................................46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................54

2.1. Материал для исследования....................................................................................................54

2.2. Методы исследования..................................................................................................................55

2.2.1. Молекулярно - генетические методы исследования............................................55

2.2.1.1. Выделение геномной ДНК из периферической

крови............................................................... 55

_

2.2.1.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК..................... 56

2.2.1.3. Метод электофореза......................................................................................................^

2.2.1.4. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP - анализ)..............................................................................................................................62

2.2.1.5. Секвенирование................................................................................................................62

2.2.1.6. Рестрикционный анализ............................................. 63

2.2.2. Статистическая обработка результатов.................................... 64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ............ 65

3.1. Анализ гена MFN2 у больных НМСН из Республики

Башкортостан................................................................... 65

3.1.1. Клиническая характеристика больных НМСН с мутациями в

гене MFN2............................................................... 80

3.2. Анализ гена GDAP1 у больных НМСН из Республики

Башкортостан..................................................................... 86

3.2.1. Клиническая характеристика больных НМСН с мутациями в

гене GDAP1.............................................................. 99

3.3. Анализ гена NEFL у больных НМСН из Республики

- Башкортостан................................................................... 105

3.4. Оптимизация подходов ДНК - диагностики наследственных моторно - сенсорных нейропатий у больных из Республики Башкортостан................................................................... 113

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................................118

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................128

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................130

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН), или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) - это клинически и генетически гетерогенная группа наследственных заболеваний периферической нервной системы, проявляющихся прогрессирующей слабостью и атрофией дистальных мышц нижних, и, на более поздних стадиях, - верхних конечностей, деформацией стоп и кистей, расстройством чувствительности. В основе заболевания лежат дегенеративные изменения миелиновой оболочки или аксонов двигательных и чувствительных волокон периферических нервов и спинномозговых корешков, ведущие к снижению скорости передачи нервных импульсов. На основании электронейромиографических исследований (ЭНМГ), позволяющих идентифицировать характер поражения нейронов, НМСН подразделяются на два основных типа - демиелинизирующий (НМСН I типа), характеризующийся низкой скоростью проведения возбуждения по периферическим нервам (менее 38 м/сек), и аксональный (НМСН II типа) - с нормальной или незначительно сниженной скоростью проведения нервного импульса (более 38 м/сек). Наряду с двумя основными типами НМСН, выделяют еще несколько редких типов заболевания, сопровождающихся некоторыми дополнительными клиническими признаками [Dyck et al., 1994]. В свою очередь, каждый из этих типов заболевания включает в себя целый ряд отдельных генетических форм НМСН, различающихся по типу наследования, характеру клинических проявлений,

электронейромиографическим и морфогистохимическим особенностям. На сегодняшний день, картировано более 50 ДНК-локусов, идентифицировано более 35 генов, мутации в которых обусловливают развитие различных форм НМСН [http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html]. Однако, следует отметить, что четкие клинические различия между отдельными формами заболевания отсутствуют, и установление его точного генетического варианта возможно только на основе молекулярно -генетического исследования. При этом, идентификация генетической причины НМСН имеет важное значение, поскольку связана с возможностью

проведения пренатальной и пресимптоматической диагностики в каждой конкретной семье, проведения эффективного медико - генетического консультирования и мониторинга заболевания в отдельных регионах.

Распространенность всех форм НМСН в среднем в мире составляет 10 на 100000 населения, варьируя от ОД до 40 на 100000 в различных популяциях [Skre, 1974]. Кроме того, существует значительное популяционное разнообразие по распространенности генетических форм НМСН, а также мутаций в соответствующих генах, что обусловливает необходимость анализа эпидемиологии и молекулярно - генетических основ данной группы заболеваний в различных регионах и этнических группах.

В последние годы изучение распространенности и генетических причин НМСН проводится в Республике Башкортостан (РБ) - одном из многонациональных регионов России. Установлена территориальная и этническая неравномерность распространенности заболевания, в целом составляющей 10,3 на 100000 населения; преобладание по частоте НМСН I типа. В результате анализа у больных НМСН из РБ четырех генов (РМР22, MPZ, GJB1 и EGR2), мутации в которых, как считается, являются наиболее частой причиной развития заболевания, было обнаружено значительное региональное и этническое своеобразие по спектру и частоте выявленных в этих генах мутаций [Крупина и др., 2006; Багаутдинова, 2007; Хидиятова и др., 2008]. В то же время, примерно в половине случаев НМСН мутации в исследованных генах не были обнаружены. Это определяет актуальность продолжения исследования, включающего анализ других ответственных генов, прежде всего, генов MFN2 (mitofusin 2), GDAP1 (Ganglioside - induced differentiation - associated protein 1) и NEFL (neurofilament, light polypeptide), каждый из которых, в зависимости от характера возникающих в них мутаций, может быть задействован в развитии различных генетических форм НМСН - демиелинизирующих и аксональных, доминантных и рецессивных.

Согласно опубликованным данным, генетические варианты НМСН, обусловленные мутациями в указанных генах, составляют существенную долю в структуре данной группы заболеваний, прежде всего, наследственных аксонопатий [Azzedine et al., 2012]. Так, например, НМСН 2А типа,

обусловленная мутациями в гене MFN2, является одной из наиболее частых форм аксонопатий. Их доля в этой группе заболевания, по данным разных авторов, составляет от 3 - 8% [Engelfried et al., 2006; Braathen et al., 2010] до 19 - 23% [http://neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn. html, neuromuscular disease center].

Ген MFN2 (1р36.22) кодирует белок митофузин 2-го типа, содержащийся в наружных мембранах митохондрий, участвующий в образовании и функционировании митохондриальных сетей, в обеспечении аксонального транспорта митохондрий [Misko et al., 2010], а также в регуляции апоптоза клетки за счет колокализации клетки с проапоптотическим белком Вах [Bach et al., 2003]. К настоящему времени в гене MFN2 обнаружено 74 различных мутаций [http://www.hgmd.org]. В популяциях Европы, в том числе и в Центральном регионе России у больных НМСН 2А типа наиболее частой мутацией этого гена является миссенс -мутация p.Arg94Gln [ЕЦагина и др., 2006; Zuchner et al., 2004; Verhoeven et al., 2006].

Ген GDAP1 (8q21.11) кодирует ганглиозид-индуцированный, ассоциированный с дифференцировкой белок, локализующийся в наружной мембране митохондрий. Основной функцией этого белка является регуляция процесса расщепления мембран [Niemann et al., 2005; Pedrola et al., 2005]. Ha сегодняшний день описано более 40 мутаций этого гена, обусловливающих развитие как демиелинизирующей (4А), так и аксональных (2К/2Н) форм НМСН, наследуемых чаще по аутосомно - рецессивному, реже - по аутосомно - доминантному типу [http://www.molgen.ua.ac.Be/CMT Mutations].

Ген NEFL (8р21) кодирует легкую цепь (63 кДа) структурного белка нейрофиламентов - основного компонента цитоскелета нейронов, играющего важную роль в структуре аксонов, включая протяженные фиброзные сети в цитоплазме нейронов. Нейрофиламенты определяют аксональный радиальный рост и их диаметр и, соответственно, скорость проведения импульсов по периферическим нервам [Yum et al., 2009]. Мутации в гене NEFL обусловливают аутосомно - доминантную форму НМСН 2Е, впервые идентифицированную в российской семье [Mersiyanova et al., 2000]. В

настоящее время в гене NEFL обнаружено 23 различные мутации, ответственные за формирование 1F и 2Е фенотипов НМСН [http://www.molgen.ua.ac.be / СМТ Mutations].

Исходя из этих предпосылок, были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цель работы - определение вклада генетических форм моторно -сенсорных нейропатий, связанных с мутациями в генах MFN2 (mitofusin 2), GDAP1 (ganglioside - induced differentiation - associated protein 1) и NEFL (neurofilament, light polypeptide), в общую структуру данного заболевания в Республике Башкортостан и оптимизация подходов его ДНК - диагностики для населения исследуемого региона.

Задачи исследования:

1. У больных наследственными моторно - сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан провести скрининг мутации p.Arg94Gln в гене MFN2, наиболее распространенной среди больных НМСН 2А типа в популяциях Европы.

2. Определить спектр и частоту мутаций в генах MFN2, GDAP1 и NEFL у больных НМСН из Республики Башкортостан.

3. Установить характер наследования и клинические признаки заболевания в семьях больных с выявленными мутациями в исследованных генах.

4. Определить вклад типов НМСН, связанных с мутациями в исследованных генах, в структуру заболевания в Республике Башкортостан.

5. Оптимизировать подходы ДНК-диагностики НМСН в Республике

Башкортостан.

Научная новизна исследования. Впервые в Республике Башкортостан у больных наследственными моторно - сенсорными нейропатиями изучены спектр и частота мутаций в генах MFN2, GDAP1 и NEFL. В гене MFN2 выявлено 4 мутации: p.Val705Ile, p.Arg259His, p.Arg259Cys и p.Leu724Pro, последние три из которых описаны нами впервые; обнаружено 7

полиморфных вариантов гена, два из которых - с.175+28С>Т и с.2204+15Т>С - ранее не описаны. В гене ОИАР1 идентифицированы 4 различные мутации, 2 из которых - р.01и229Ьу8 и р.А1а312ТЬг - ранее не описаны. В гене А1ЕРЬ выявлена новая мутация р.01и163Уа1. У больных с выявленными мутациями в исследованных генах описаны клинико - генеалогические особенности НМСН.

Научно - практическая значимость. Полученные сведения о новых мутациях в генах МРИ2, ОИАР1 и ИЕРЬ, а также о клинических особенностях вызываемых ими форм заболевания вносят вклад в познание механизмов патогенеза наследственных моторно - сенсорных нейропатий. Определение спектра и частоты мутаций в этих генах у больных из Республики Башкортостан способствует расширению представлений о молекулярно - генетических основах развития НМСН в этом регионе в целом и в отдельных этнических группах, в частности. Разработанный с учетом полученных данных алгоритм ДНК - диагностики НМСН, оптимальный для жителей Республики Башкортостан, необходим для повышения эффективности медико - генетического консультирования в семьях больных.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов лекций по медицинской генетике на биологических факультетах университетов, в медицинских вузах и на курсах повышения квалификации медицинских работников. Материалы диссертации также могут быть использованы в работе медико - генетической консультации при ГБУЗ «Республиканский перинатальный центр» Республики Башкортостан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности спектра и частоты мутаций в генах МРИ2, СОАР1 и ИЕРЬ у больных НМСН из РБ. Новые мутации р.Аг§259Суз, р.Ал^259Н18, р.Ьеи724Рго в гене МРМ2; р.С1и229Ьуз и р.А1а312ТЬг - в гене вИАР!; р.С1и163Уа1 - в гене ИЕРЬ.

2. Вклад генетических форм НМСН, связанных с мутациями в генах МРИ2, СИАР! и ИЕРЬ, в общую структуру данного заболевания в

Республике Башкортостан составляет, приблизительно, 3%, 5% и 1%, соответственно.

3. Клинико-генеалогическая характеристика НМСН у больных с выявленными мутациями в генах MFN2, GDAP1 и NEFL.

4. Оптимальный для жителей РБ алгоритм молекулярно - генетического обследования больных НМСН, основанный на анализе генов РМР22, GJB1, MPZ, MFN2, GDAP1 и NEFL.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из которых 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях Европейского общества генетики человека «European Human Genetics Conference» (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012; Париж, 2013); Международной конференции «International Society for Applied Biological Sciences Conference» (Сплит, 2011); Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе - конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных и микроорганизмов (Уфа, 2012); II и III Всероссийской школе - конференции молодых ученых по физико - химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011; 2012); Санкт-Петербургском научном форуме «Наука и общество. Физиология и медицина XXI века» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной научно - практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Уфа, 2013).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 279 источников.

Диссертация содержит 7 таблиц и 61 рисунок.

***

Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета д.м.н., профессору Магжанову Риму Валеевичу и к.м.н., доценту Сайфуллиной Елене Владимировне за консультативную помощь и организацию забора материала для исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1Л. Клиническая характеристика, эпидемиология и классификация наследственных моторно - сенсорных нейропатий

Наследственные моторно - сенсорные нейропатии (НМСН) или болезнь Шарко - Мари - Тута (ШМТ) - это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической системы, связанных с нарушением функционирования различных структур периферических нервных волокон [Berger et al., 2002; Barisic et al., 2008; Szigeti et al., 2009]. В основе заболевания лежат дегенеративные изменения миелиновой оболочки или аксонов двигательных и чувствительных волокон периферических нервов и спинномозговых корешков. Клинические проявления у всех больных типичны для наследственных моторно - сенсорных невропатий и характеризуются сочетанием комплекса моторных, сенсорных и координаторных расстройств [Harding, 1995]. Основными клиническими признаками НМСН, сходными для всех форм заболевания, являются симметричные дистальные парезы с преимущественным вовлечением в процесс перонеальной группы мышц [Вельтищев и др., 1998]. Первыми симптомами заболевания являются слабость в дистальных отделах н�