Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-генетический анализ наследственных аксонопатий, обусловленных нарушением формирования хондриома

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико-генетический анализ наследственных аксонопатий, обусловленных нарушением формирования хондриома"

На правах рукописи

00305818Б

Щагина Ольга Анатольевна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕННЫХ АКСОНОПАТИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ НАРУШЕНИЕМ ФОРМИРОВАНИЯ

ХОНДРИОМА

03 00 15 - «Генетика» 03 00 26 «Молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 2007

003058186

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор ЕЛ. Дадали доктор биологических наук, профессор A.B. Поляков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор медицинских наук

П.А. Сломннский Г.Е. Руденская

Ведущая организация: ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава»

Защита диссертации состоится » ..¿-¿^сУ* 2007 г в .;/_/ часов на заседании Диссертационного совета Д 001 016 01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу Москва, 115478, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

Актуальность исследования

Исследованиями последних лет показано, что нарушение структуры и функций митохондрий лежит в основе патотенеза ряда распространенных наследственных нейродегенеративных заболеваний, что связано с повышенной чувствительностью нервной ткани к дисбалансу энергетических процессов Мутации в генах, белковые продукты которых участвуют в обеспечении биохимических процессов в митохондриях, являются причиной возникновения заболеваний из группы наследственных спастических параплегий, прогрессирующих мышечных дистрофий, атаксий экстрапирамидных заболеваний [Schon & Manfredi, 2003, Santel, 2005] Установление значительной роли нарушений функционирования митохондрий в патогенезе тех или иных наследственных заболеваний имеет существенное значение, так как позволяет повысить эффективность их лечения, посредством назначения специфической метаболической терапии

В последние годы идентифицировано три генетических варианта наследственных моторно-сенсорных нейропатий (НМСН), обусловленных м)тациями в генах, белковые продукты которых вносят существенный вклад в формирование структуры и функционирования хондриома (разветвтенных митохондриальных сетей) аксонов периферических нервов Один из этих генов -MFN2 (1р35-3б) - приводит к возникновению НМСН IIA2 тииа [Zuchner et al, 2004], второй - GDAP1 (8q21 1), обуславливает возникновение НМСН IVA типа [Baxter et al, 2002] и третий, DNM2 (19p 12), приводит к возникновению редкого промежуточного варианта аксонопатии - НМСН ДП 1В [Zuchner et al, 2005] Белковые продукты этих генов регулируют слияние и разделение митохондрий в процессе формирования хондриома [Mo?dy et al, 2003]

НМСН - одна из наиболее распространенных групп наследственных заболеваний человека, частота которых в различных популяциях варьирует от 10 до 40 на 100000 населения [Федотов, 2002, Skre, 1974] НМСН делят на две большие группы миелинопатии (НМСН I типа) и аксонопатии (НМСН II гипа) Идентификация I и II типа НМСН на клиническом уровне возможна только на основе элеятромиографического исследования с определением скоростей проведения импульса (СПИ) по срединному нерву Показана выраженная генетическая гетерогенность этой группы заболеваний, которая к настоящему времени включает около 30 генетических вариантов, для 22 из которых идентифицированы гены, ответственные за развитие заболевания [http.//www neuro wustl edu/neuromuscular/time/hmsn html] Клинические

проявления отдельных генетических вариантов имеют значительное сходство Все это затрудняв диапюстический этап медико-генетического консультирования и обуславливает необходимость проведения анализа частот встречаемости и особенностей клинических проявлений различных генетических вариантов НМСН [Дадали и др , 2003] Результаты таких исследований должны явиться основой для создания алгоритма молекулярно-генетической диагностики, позволяющего определить очередность исследования мутаций в тех ичи иных генах, ответственных за развитие наследственных аксонопатий, что позволяет снизить временные и экономические затраты В последние несколько лет в ряде популяций проведены исследования, направленные на изучение частоты и спектра мутаций в генах белков, обеспечивающих формирование митохондриальных сетей Показано, что эти генетические варианты составляют существенную долю в структуре наследственных аксонопатий в группах больных ряда европейских стран [Кщта й а1, 2005, Ьачуэоп й а1, 2005, №Ьз е! а1, 2002], однако в выборке больных проживающих на территории РФ такого рода исследования не проводились

Целью рабош явилось проведение клинико-генетического анализа аксонопатий, обусловленных нарушением структуры и функции хондриома и разработка алгоритмов их молекулярно-генетической диагностики на материале выборки больных, проживающих на территории РФ

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи

1 Определить доли и спектр мутаций трех генов — МГМ2, ОИМ2 и ОПАР], -ответственных за формирование хондриома, в выборке российских бочьных наследственными аксонопатиями

2 Выявить наиболее часто встречающиеся мутации, установить причины их распросграненности и разработать эффективные системы их регистрации

3 Оценить спектр основных клинических симптомов и частоту их встречаемости при различных вариантах аксонопатий, обусловленных мутациями в генах М¥Ы2, и ОБАР!

4 На основании полученных результатов и анализа литературных данных разрабо1ааь алюритм молекулярно-генетического обследования больных наел едственными аксонопатиями

Научная новизна

Впервые в выборке больных, проживающих на территории РФ оценены частоты встречаемости НМСН ПА, НМСН 1УА и НМСН промежуточного 1В типов, обусловленных мутациями генов МЛУ2, СОАР1 и /ЖМ2, белковые

продукты которых обеспечивают динамические процессы в хондриоме аксонов Определен спектр мутаций в генах MFN2 и GDAP1 Установлен вклад мутации этих генов в структуру заболеваемости НМСН Описаны две ранее не известные мутации гена MFN2 и одна гена GDAP1

В гене MFN2 выявлена «горячая» точка мутаций - кодон 94, а в гене GDÄP1 - частая мутация Leu239Phe Установлено, что причинои распространенности мутации Leu239Phe является эффект основателя и определен «возраст» мутации

Практическая значимость

Разработаны протоколы ДНК-диагностики для выявления мутаций в генах MFN2 и GDAP1 и алгоритмы молекулярно-генетического обследования больных Определены диагностические критерии, позволяющие проводить дифференциальную диаиюсгику НМСН IIA и IIMCH IVA при клиническом осмотре болыю1 о

Результаты проведенного исследования могут быть использованы в работе диагностических лабораторий и практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервной системы

Положения, выносимые на защиту

1 Мутации iena MFN2 являются причиной наследственной аксонопатии у 17% семей, у 8% семей причиной заболевания являются мутации гена GDAP1

2 В гене MFN2 выявлена частая мутация - Arg94Gln, - на долю которой приходится 42% случаев НМСН НА у неродственных пробандов В гене MFN2 имеется «горячая» точка - кодон 94

3 Выявлена частая мутация гена GDAP1 (НМСН IVA) у больных, проживающих на территории РФ - Leu239Phe

4 Причиной высокой частоты мутации Leu239Phe гена GDAP1 является эффект основателя «Возраст» мутации оценен в 1000±600 лет

5 Существуют статистически достоверные отличия по частотам основных неврологических симптомов в группах больных с НМСН IIA и HMCHIVA типов, позволяющие диагностировать их при клиническом осмотре

6 Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными аксонопатиями и разработаны эффективные системы диагностики частых мутаций генов MFN2 и GDAP1

Апробация работы

По материалам исследования опубликованы 14 научных работ, включая 7 статей Материалы диссертации доложены на конференциях European Human Genetics Conference 2005 и 2006, на V съезде Российского общества медицинских генетиков 2005, на Международной Школе Молодых Ученых по Молекулярной генетике Геномика и Биотехнология 2006 и на IX всероссийском съезде неврологов 2006

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 133 станицах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственного исследования и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы Библиография содержит 17 отечественных и 85 зарубежных источников Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 24 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для исследования являлись образцы ДНК, выделенные из периферической крови 110 больных в возрасте от 4 до 60 лет (52 мужчины и 48 женщин), из 72 неродственных семей с наследственной аксонопатией и 36 их клинически здоровых родственников В качестве группы сравнения использовались образцы ДНК, выделенные из крови 300 здоровых доноров, проживающих на территории различных областей РФ

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов для выделения DIA torn™ DNA PreplOQ (Isogene Lab ltd, Россия) по протоколу производителя

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПФ «Литех» или НПО "SYNTOL "

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности генов MFN2, GDAP1 и DNM2 использовался метод SSCP-анализа (single strand conformation

pohmorphism) со щелочной денатурацией и автоматическое секвенирование, которое проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США) В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР Анализ результатов секвенирования осуществится с помощью программ Chromas и BLAST (http //www nebí nlm nih gov/blast)

Исследование микросатгелитных и SNP маркеров проводилось методами ПДАФ (полиморфизм длины амплификационных фрагментов) - и ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) - анализа, соответственно Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении В работе использовали эгщонуклеазы производства фирмы «СибЭнзим», (Россия) и «Fermentas», (Литва)

При сравнении частот аллелей в хромосомах с мутациями Arg94Gln гена MFN2 и Leu239Phe гена GDAP1 с частотой этих аллелей в популяции испотьзовали точный критерий Фишера

Для оценки неравновесности по сцеплению для полиморфных маркеров в группе больных испотьзовали оценку 5 = (PD - Pn)/(1 - Pn). где 5 - мера неравновесности сцепления, PD - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, Рц - частота этого же аллеля среди нормальных хромосом

Для определения возраста мутации Leu239Phe гена GDAP1 применяли подход, основанный на понятии «генетических часов» и оценивающий количество поколений g с момента появления мутации в популяции до настоящего времени

log ô„ (0 - рекомбинационная фракция,

g= --— ,

log (1-6) S - мера неравновесности сцепления )

Результаты исследования и их обсуждение Молекулярно-генетический анализ

В результате поведенного исстедования выборки больных с наследственной аксонопатией оценена доля генетических вариантов, обусловленных мутациями генов, белки которых обеспечивают поддержание структуры хондриома Показано, что на долю мутаций гена МРИ 2, ответственного за возникновение НМСН НА

типа приходится 17% случаев заболевания, мутации гена ООАР! являются причиной наследственных ахсонопатий в 8% семей. Доля мутаций этих генов была существенно выше в семьях с подтвержденным АД или ЛР типом наследования заболевания и составила 25% и 40% соответственно. Мутаций гена ВЫМ2 в исследованной выборке не выявлено (Рисунок 1).

Рисунок 1. Доли мутаций генов МРШ, ОЫМ2, СВАР 1« выборке Российских больных.

_____ 17«

обнаружено

Полученные результаты соответствуют литературным данным о частотах встречаемости данных генетических вариантов.

Молекулярно-генетический анализ НМСН НА

В гене ¡\4FN2, мутации которого ответственны за НМСН НА нами обнаружено шесть различных миссе нс-мутаций в 12 семьях, четыре из которых -ТЪг206Пе (С.6170Т), Аг?94Тгр (с.280С>Т), Уа1705Пе (с.2ШОА) и Arg94G!n (с.28!0>А) - были описаны ранее, а две мутации - 8ег249Суэ (с.745С>0) и Ьеи724Рго (с.2171С>Т) идентифицированы впервые. Одна из мутаций - Аг^94Тгр -выявлена в двух неродственных семьях, другая - А^94С!п - в пяти, мутация ТЬгЗОбИе - в двух семьях, остальные мутации обнаружены у единичных больных нашей выборки. Полученные результаты суммированы в таблице 1.

Таблица I, Спектр выявленных мутации гена \-tFN2

Экзон Нуклсотид-ная замена АК замела Клинический фенотип Тип наследова кия Число семей

ЕХ4 с,280С>Т Arg94Trp имен II АД, de-novo 2

ЕХ4 c.281G>A Arg94Gln НМСН II, НМСН 11с глухотой АД 5

ЕХ7 с.617С>Т Thr2061Ie НМСИ II с ранним началом de-novo 2

ЕХ8 c,74SC>G Ser249Cys НМСН II АД | 1

ЕХ18 c.2U3G>A Val7051le НМСН II АД | 1

ЕХ! 8 c.2065G>A Leu724Pro НМСН II АД 1

Чтобы установить природу высокой частоты мутации Аг§94С1п, мы провели анализ гаплотипов хромосом с данной мутацией, используя как микросаттелитные маркеры, лежащие вблизи гена Л/УЖ2, так и внутригенные однонуклеотидные полиморфизмы (БЫР)

По четырем чикросагтелитныч маркерам неравновесия по сцеплению с каким-либо из аллелей выявлено не было По маркеру 0182740 на всех хромосомах с мутацией был выявлен общий аллель «1», что связано с высокой частотой этого аллеля в популяции

По внутригенным однонуклеотидным полиморфизмам, на хромосомах несущих мутацию Аг§9401п в 4 семьях был обнаружен общий гаплогап ге2236055-гэ3766744-1з873457-гз2236058 О-О-С-О (Таблица 2)

Таблица 2 Гаплотипы хромосом с мутацией А^9401п гена МРЫ2

Маркер Координата Пробанд

т п и 45 1 48 1 180 1 261 1 385 1

Б182667 11 422 5 3 6 6 5

СА2120 11 572 5 1 5 5 4

01Б2740 11 855 1 1 1 1 -

АЬ096840/22 11 939 1 6 1 2 -

ГБ3753579 11973 С С/Т С Т Т

ге2236055 11977 в С/А в в й

ГЭ3766744 11978 С С/С в в О

«873457 11981 С с/с С С/С О

Я940 11987 м м м м м

гэ2236058 11997 в с/с в с/с с

гэ755053б 12001 Т - в Т т

ге730123 12005 в - А АЮ в

ШБ434 12 267 4 4 5 4 5

018228 13 732 4 4 4 3 6

При сравнении частот гаплотипа «2236055- гч3766744-гз873457-ге2236058

О-в-С-в на хромосомах с мутацией Ащ9401п и хромосомах здоровых людей достоверных отличий выявлено не было (р=0,36) Действитечьно данный гаплотип является наиболее частым, и по нашим оценкам его частота в популяции составила 49% (Таблица 3)

Таблица 3 Частоты гаплотипа «в-й-С-О» па хромосомах с мутацией и в

контрольной выборке

Группа Число Чисто хромосом Частота

исследованных с гапютипом гапютипа

хромосом «в-С-С-С» (р=0,05)

Хромосомы с 5 4 0,8

мутацией (ДИ 0 46-0,94)

Аг§94С1п

Контрарная 82 40 0,49

выборка (ДИ 0,47-0,50)

Таким образом, высокая частота данного гаплотипа на хромосомах с мутацией является не следствием эффекта основателя, а отражает ассоциации, существующие между аллелями изученных SNP в популяции.

Исходя из полученных данных по анализу гаплотипов, имеющихся в литературе описаниях случаев возникновения мутации Arg94Gln dc novo [Vcrhoeveri et al., 2006], и того, что еще в двух семьях нашей выборки причиной ■заболевания явилась мутация Arg94Tip того же кодона, мы сделали вывод, что в гене MFN2 имеется «горячая точка» в кодоне 94, мутации в котором являются причиной НМСН ПА у 58% больных, проживающих на территории РФ.

Такая высокая частота мутаций кодона 94 представляет уникальную возможность для оптимизации прямой ДНК-диагностики. Нами была создана система регистрации всех возможных миссенс/нонсенс мутаций этого кодона. Для чего был выбран праймер, во вторую букву с 3' конца которого была введена замена A>G, являющаяся мягким мисс-метчем, таким образом, чтобы в нормальной последовательности появился сайт узнавания для рестриктюы EcoS&J, в который входят обе первые буквы кодона 94 {Рисунок 2).

Рисунок 2. Система идентификации мутаций кодона 94 гена MFN2

a. GCTGGCTCGG GGCACATGAAAGTGGCTTTTTTTGGCC

GCTGGC'TCGG ЕсоШ

GGCACATGAAAGTGGCTTTTTTTGGCC

MFN44 RN ~~

б.

imv.,>

170 и.о.

143 и.о.

а. Нормальная последовательность эгаона 4 гена Мга2 н последовательность с введенной в пра(1мер эамекой. Подчеркнута последовательность прайм ера Сайт узнавания эндонуклеаэы ЕсоШ выделен рамкоП, кодон 94 выделен жирным шрифтом.

б. Результаты ПДРФ анализа фрагмента, соответствующего экзону 4 гена Л/^А'З

Мол екулярно-генетический анализ НМСН промежуточного ¡В типа Нами проведено исследование всех зкзонов гена йИМ2 у всех больных нашей выборки.

Кроме описанных ранее полиморфизмов, было обнаружено два изменения нуклеотидной последовательности, В митр он е 16 у трех пробандов нашей выборки была выявлена вставка одного нуклеотида с. 1881+3 ШзС, не описанная как полиморфизм, в гетерозиготном состоянии. Исследование нормальной и

измененной последовательностей гена с помощью программы предсказания сайтов сплайсинга NetGene2 (http //www cbs dtu dk/services/NetGene2) показало, чю msC не влияет на сайты сплайсинга Исследование методом SSCP-анализа 50 (100 хромосом) здоровых неродственных доноров из различных регионов РФ выявило трех гетерозиготных и одного гомозиготного носителя инсерции Таким образом, вставка нуклеогида с 1881+31insC является полиморфным вариантом, аллечьная частота которого составляет 5%

В экзоне 8 у одного пробанда была выявлена замена с 10770Т (Gly359Gly), не приводящая к замене аминокислоты Была подобрана эндонуклеаза рестрикции Hm6I, режущая нормальную последовательность и проведено исследование 200 (400 хромосом) неродственных доноров, из различных регионов России Ни у одного из контролей данной замены выявлено не было Мы исследовали нормальную и измененную последовательность экзона 8 с помощью программ предсказания сайтов сплайсинга NetGene2 (http //www cbs dtu dk/services/NetGene2') и BDGP (http //www fruitfly org/seq_tools/sphce html) Замена с 1077C>T не изменяет вероятность сайтов сплайсинга Из полученных данных нельзя сделать однозначного вывода о том, является ли эта замена очень редким полиморфизмом или причиной заболевания в данной семье

Молекулярно-гепетический анализ HMCHIVA

В результате исследования всей кодирующей последовательности гена GDAP1, нами были выявлены мутации у 9 больных из 6 неродственных семей (Таблица 4)

Таблица 4 Мутации гена GDAP1

Экзон гена GDAPI Семья Мутацня1 Мутация 2 Клинический фенотип Тип наследования

ЕХЗ 149 Prol53Leu (с 4580Т) nd имени de novo9

ЕХ6 294 Leu239Phe (с 7150Т) Leu239Phe (с 7150Т) имени с атрофией зрите1ьного нерва АР

ЕХб 552 Leu239Phe (с 715С>Т) Leu239Phe (с 715С>Т) HMCHII АР

ЕХ6 374 Leu239Phe (с 7150Т) Leu239Phe (с 7150Т) HMCHII изолированный случай

ЕХб 312 Leu239Phe (с 715С>1) Arg257Stop (с 7690Т) HMCHII изолированный случай

ЕХ6 558 Leu239Phe (с 7150Т) п d HMCHII АР

В трех семьях у пробандов была выявлена, ранее описанная рядом авторов, мутация Ьеи239РЬе (с 7150Т) экзона 6 в гомозиготном состоянии, еще у двух больных эта мутация была выявлена в гетерозиготном состоянии Данная мутация была описана ранее, как причина аксонопатии в семьях из Чехии и Польши Кроме того, нами были выявлены две ранее не описанные мутации Рго153Ьеи и А^257Б1ор

Для установления природы высокой частоты мутации Ьеи239РЬе, нами было выбрано 8 микросаттелитных маркеров с высокой гегерозиготностыо, расположенных в интервале 8 м п н вокруг гена СОАР! Мы проанализировали частоты аллелей на хромосомах с мутацией и без мутации Полное неравновесие по сцеплению было обнаружено по маркеру 088286 По остальным маркерам также наблюдалось неравновесие по сцеплению (Таблица 5)

Таблица 5 Аллелъчые частоты маркеров (%), сцепленных с локусом НМСН1УА

Маркер озэг 79 08Э1 775 08 3288 □85551 085543 08 81 805 0801705 ОЗЭ1 7Б7

«от М 601 «а «о* М &ОЛ и во ч> » 4* вол АД ООП

С ^ 9 62 2 01 1 9 3 4 -

1 - 4 11 1 26 1 // / 01 1 33 - 32 6 06 > в ^ 3 1 21 1

1 10 3 32 6 44 4 С со 00 0 02 2 11 1 13 1 22 2 6 3 1~

3 5 9 11 1 1 33 3 01 1 011 3$ 9 9 2> 0 11 1 20 8 11 1 20 3

4 13 2 13 0 04 3 ео о 03 4 1~ 4 22 2 14 6 6 3

21 2 22 2 0 ос 0> 4 0~ 6 01 1 12 0 12 » 33,3 10 9

« 19 г 11 1 0 01 11 1 01 1 22 9 02 2 19 5 29 22 2 1-2

7 13 2 22 2 611 06 > 63 3 </> 4 2 1 22 2 ~ 3 33 3

8 - 4 13 а 100 0 01 1 0* 6 01 1 4 - 44 -

9 1 > 2> о 62 2 О* 4 3 I

10 13 0 СО 0 1 0

II 1> 2 60 0 1 а и 1

12 08 ' 01 1 111

1 ' 09 £ оз з

14 01 1 00 0

1* 04 3

1« 06 >

1- 0~ 6

Алтельные частоты маркеров, для которых обнаружено наибольшее неравновесие по сцеплению подчеркнуты

Мы определили значения неравновесия по сцеплению (5) для каждого аллеля всех исследованных маркеров, используя точный критерий Фишера для оценки достоверности ассоциации данного аллеля маркера с локусом НМСШУА

Таблица б Ассоциация и неравновесие по сцеплению аллелей маркеров с

локусоч НМСНIVА

аллель Р 8 ± 95% ДИ

085279 9 0,035 0,21+0,28

0831776 2 0,480 0,! 8+0,51

085286 8 <0,001 1

085551 13 <0,001 0,89±0,22

вОАР1 с 715Т

085548 3 0,003 0,83±0,33

0851805 1 0,005 0,41+0,36

0831705 5 0,041 0,37±0,39

0851757 8 0,003 0,42±0,35

р - вероятность ошибки для одностороннего варианта точного критерия Фишера 5 - мера неравновесности сцепления аллелей почиморфных маркеров с чокусоч заболевания, ДИ -доверительный интервал

При построении гаплотипа основателя мы выбирали аллели характеризующиеся максимальной неравновесностью сцепления с локусом заболевания по сравнению с другими аллетями маркеров и имеющие большее накопление в хромосомах с мутацией по сравнению с другими аллелями (Таблица 6) Поэтому, при определении предкового аллеля, учитывали наиботьшее положительное значение 5 и наименьшее р среди всех аллелей данного маркера Гаплотипы хромосом с мутацией Ьеи239РЬе представлены в таблице 7

Таблииа 7 Гаплотипы хромосом с мутацией Ьеи239Рке

Ларкер 083279 0851776 08Б286 088551 с 715С>Т 08Э548 08Э1805 0801705 0881757

0,88 0 65 0,82 0 66 0,74 0 75 0,84 0 79

тпн 73 151 73 667 75 244 75 371 75 439 75 821 78 257 80 408 81 202

сМ 91,45 92,58 94,61 95 15 95,15 96 21 97,28

5521 5 3 8 13 Т 3 4 7 8

294' 5 3 8 13 т 3 1 5 8

558 7 6 8 13 т 3 4 5 12

5522 7 1 8 12(1) т 3 1 6 7

3741 1 2 8 13 т 3 2 6 7

3742 9 2 8 13 т 3 1 3 1

2942 9 2 8 13 т 3 1 5 8

312 3 2 8 13 т 2 И 1 5 8

жирным шрифтом вы клена сохраненная часть гаплотипа основателя (') обозначены чутантные аллели

Таким образом, наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя 088279-0881776-088286-088551-088548-0881805-08817050881757 9-2-8-13-3-1-5-8 Интересно, что в данном случае неравновесие по сцеплению определенных аллелей исследованных маркеров, как и достоверная ассоциация этих алпелей с локусом НМСШУА, наблюдается на довольно

продолжительном расстоянии от мутации 3,54 сМ и 2,28 сМ соответственно в сторону центро- и теломеры Это может быть связано с относительно небольшим возрастом эффекта основателя в популяции

При расчете «возраста» мутации мы использовали значения неравновесия по сцеплению для маркеров Б88279, 0831805, Б881705 и Б881757 дня алтелей которых наблюдалась достоверная ассоциация с локусом НМСШУА и мера неравновесности сцепления аллеля данного маркера 5 с заболеванием лежала в пределах 0,20-0,50 (Таблица 8)

Таблиг^а 8 Число поколений, прошедших с момента распространения мутации Ьеи239Р1ге

маркер Я

08527И 6695

0831805 31,77

08Б1705 20 06

0851757 14 63

Среднее значение 33 35±2036

g- чисто покотений

Среднюю продолжительность одного поколения мы принимали равной 30 годам, соответственно время, за которое была накоплена мутация, составляет около 1000±610 лет Учитывая, что средний год рождения больных 1990, период начала распространения мутации 1Х-Х1 века, что соответствует историческим сведениям о заселении славянскими народами территории центральной России

Клиническая характеристика больных

Клиническая характеристика больных с мутациями в гене МРИ2

Нами проанализированы клинические проявления у 23 больных из 10 неродственных семей 18 больных были членами трех больших семей, с сегрегацией заболевания в двух и ботее поколениях Это позволило нам определить не только размах клинического полиморфизма НМСНПА типа, но и оценить внутри и межсемейную вариабельность клинических признаков, а также проследить динамику формирования клинического фенотипа по мере прогрессирования заболевания (возраст больных на момент осмотра варьировал от 6 до 60 лет)

Клинические проявления были типичными дта наследственных аксонопатий и характеризовались сочетанием блока моторных, сенсорных и координагорных расстройств Возраст манифестации заболевания варьировал от 2 до 27 лет и в

среднем составил 9,3±5,7 лет Первыми в процесс вовлекались мышцы перонеальной группы, голени и стоп, что клинически появлялось вялым парезом, снижением мышечной силы в сгибателях голени, выпадением ахилловых рефлексов и появлением специфической степпажной походки Поражение дистальных мышц ног достаточно быстро приводило к формированию полой стопы (реэ сауиэ) У 16 из 22 больных в патологический процесс вовтекались мышцы кистей (межкостные, а также мышцы тенара и гипотенара) Деформация кистей по типу «когтистой лапы» наблюдалась у 15 больных Характерным симптомом заболевания был тремор пальцев вытянутых рук постурально кинетического характера, который выявлялся у 18 больных и отсутствовал только у 5 больных в возрасте от 6 до 14 лет У большинства больных отмечено также выпадение карпо-радиального рефлекса, он оставался сохранным лишь у двух больных в возрасте 14 и 27, не имеющих деформации и слабости мышц кисти Снижение или отсутствие коленного рефлекса отмечено лишь у 14 из 24 больных (58%) У большинства пораженных детей и лиц молодого возраста коленный рефлекс оставался сохранным Еще более длительное время сохранялся рефлекс с двуглавых мышц, угнетение которого выявлено только у 9 больных (38%) с дтительностью течения заболевания от 17 до 54 лет Интересно отметить, что расстройства глубокой чувствительности зарегистрировано лишь у 8 больных, в то время как координаторные нарушения отмечены у 17 бочьных По мере про!рессирования заболевания у 7 больных отмечалась более выраженная генерализация процесса с распространением поражения на мышцы бедер У двух ботьных в возрасте 54 и 60 лет с длительностью заболевания от 44 до 54 лет отмечалось также снижение глоточного и небного рефлекса и двухсторонняя нейросенсорная тугоухость

При проведении электромиографического обследования у всех бочьных отмечались признаки аксонального поражения, в виде снижения амплитуд сенсорных потенциачов и М-ответов в сочетании с нормальными или несколько сниженными показателями скоростей проведения импульса (СПИ) по моторным волокнам периферических нервов и потенциалами фибрилчяции Показатели СПИ по срединному нерву варьировали от 41,6 м/с до 66,8м/с и в среднем составляли 53,6±8,2 м/с

Суммируя результаты клинико-электромиографического обследования больных нашей выборки и литературных данных можно выделить стедующие критерии диагноешки этого генетического варианта на клиническои стадии обследования больного, дающие основание для направления его на исследование мутаций в гене ЛÍF/V2

• АД наследование, единственный больной в семье,

• возраст манифестации от 2 до 27 лет,

• преобладание двигательных нарушений над чувствительными,

• значительные координаторные нарушения и отсутствие выраженных расстройств чувствительности,

• постурально-кинетический тремор пальцев рук,

• аксональный уровень поражения, регистрируемый при проведении электромиографического исследования СПИ по срединному нерву соответствует контрольным значениям или имеет промежуточные значения

Клиническая характеристика больных с мутациями в гене GDAP1 Нами проанализированы особенности клинических проявтений и электромиографических параметров у 9 больных (4 мужского и 5 женского пола) в возрасте от 9 до 34 лет с НМСН IVA, обусловленной мутацией в гене GDAP1

Возраст появления первых симптомов варьировал от 1 года до 5 лет и в среднем составлял 2,6±1,6 года Первые признаки заболевания, на которые обращали внимание родители больных, была деформация стоп по типу полых, а также слабость перонеальных групп мышц, приводящая к появлению степпажной походки В течение нескольких лет в патологический процесс распространялся в восходящем направлении с вовлечением сгибательных и разгибательных групп мышц голеней, а также межкостных мышцы кистей и мышц тенара и гипотенара Нарастание вялого тетрапареза приводило к выраженной эквино-варусной деформации стоп, а спустя 2-3 года от момента манифестации заботевания возникала деформация кистей по типу «когтистой лапы» или «обезьяньей лапы»

Характерной особенностью НМСН IVA типа было раннее выпадение сухожильных рефлексов с нижних и верхних конечностей, что свидетельствовало о быстром вовлечении в патологический процесс крупных миелинизированных нервных волокон У всех обследованных больных обнаруживались гакже выраженные расстройства глубокой чувствительности, что также свидетельствовало о тяжести поражения крупных нервных волокон аксонов, так как известно, что появление значимых сенсорных нарушений возникает при нарушении функционирования не менее 60% аксонов У 6 обследованных больных в возрасте от 17 до 29 лет, наряду с выпадением глубокой чувствительности, отмечалась поверхностная гипостезия, что свидетельствовало в пользу значительной генерализации процесса по мере прогрессирования заболевания

Наряду с этим у всех больных отмечались симптомы спино-церебеллярной атаксии, значительно усиливающиеся при отсутствии контроля зрения Ни у

одного наблюдаемого нами больного не отмечено нарушения функции черепно-мозговых нервов, а также вовлечения в процесс лицевой мускулатуры Интересно, ыкже, oiweniiь отсутствие у больных с НМСН IVA типа тремора пальцев кистей и фасцикулярных подергиваний различных мышечных групп, которые нередко наблюдаются при других генетических вариантах наследственных аксонопатий Наряду с этим, в обследованной нами выборке больных, не выявлено двух описанных ранее симптомов, которые с разной частотой отмечались у больных НМСН с мутациями в гене GDAP1 из других популяций - огрубление голоса, которые авторы связывают с парезом голосовых связок, и пирамидной симптоматики в нижних конечностях [Claramunt et all, 2005]

При проведении электромиографического обследования отмечены характерные признаки аксонопатий, причем наиболее выраженным оказывалось поражение сенсорных волокон периферических нервов В пользу этого свидетельствовало значимое снижение амплитуды потенциала действия и СПИ преимущественно чувствительных волокон, в то время как этот показатель, измеренный в отдельных сегментах моторных волокон зачастую находился в пределах контрольных значений

Суммируя результаты клинико-электромиографического обследования больных нашей выборки и титсрагурных данных можно выделить следующие критерии диагностики этого генетического варианта на клинической стадии обследования больного, дающие основание для направления его на исследование мутаций в гене GDAP 1

• начало заболевания в возрасте до 5 лет,

• грубые деформации стоп по типу эквино-варусных,

• быстрое прогрессировать заболевания с распространением паюлогического процесса на передние и задние группы мышц голеней и мышцы кисти,

• раннее выпадение сухожильных рефлексов с мышц верхних и нижних конечностей,

• выраженные расстройства всех видов чувствительности, с первоочередным выпадением глубокой чувствительности,

• аксоналышй уровень поражения, регистрируемый при проведении электромиографического исследования СПИ по срединному нерву в большинстве случаев соответствует контрольным значениям или имеет промежуточные значения

Сравнительный анализ клинических проявлений у больных НМСН НА и НМСН1УА

При сравнении анализируемых групп больных с выявленными мутациями генов МРИ2 и СйЛР1, выявлены клинические признаки, достоверно чаще встречающиеся в одной из двух групп больных (Таблица 9)

Таблица 9 Сравнительные данные о частотах встречаемости клинических признаков в группах бочьных с мутациями в генах МР¥!2 и СИАР!

признак — ген

МГ.\'2 вОЛП Р

Число исследованных больных 24 9

Возраст манифестации (лет) 9,3± 5,7 (2-27) 2,9±1,6 (1-5)

Снижение/отсутствие ахшпова рефлекса 100% 100% 1

Снижение/отсутствие коленного рефчекса* 58% 100% 0,032

Снижение/отсутствие карпо-радиально] о рефлекса 92% 100% 1

Снижение/отсутствие рефлекса с двуглавой мышцы* 38% 100% <0,001

Тремор пальцев кистей* 75% 0% <0,001

Координаторные расстройства 71% 100% 0,15

Деформация стоп 100% 100% 1

Деформация кистей* 63% 100% 0,039

Поверхностная гипосстезия в руках 50% 67% 0,46

Поверхностная гипоестезия в ногах 50% 67% 0,46

Расстройства глубокой чувствительности* 25% 100% <0,001

СПИ п ггеЛалиэ (м/с) 53,б±8,2 (41,6-66,8) 44,7±7,4 (32,0-54,0)

р - вероятность ошибки дтя одностороннего варианта точного критерия Фишера

*К.'|И||Ические признаки для которых выявлены статистически достоверные различия в двух группах больных

Как видно из таблицы 9, в двух анализируемых группах больных выявлены достоверные различия частот встречаемости пяти из 13 анализируемых признаков

Такие признаки, как снижение/отсутствие коленного рефлекса, рефлекса с двуглавой мышцы, отсутствие тремора пальцев, деформация кисти, расстройство

глубокой чувствительности встречаются достоверно чаще среди больных с мутациями в гене БОАР! Для этой же группы больных характерен ранний (1-5 лет) возраст манифестации заболевания, хотя и у нескольких больных с НМСН ИА заболевание манифестировало до 5 лет

По этектронейромиографическому критерию - СПИ по срединному нерву группы больных не различаются, и в той и другой группе наблюдается аксональный уровень поражения СПИ по срединному нерву в большинстве счучаев соответствовала нормальным значениям или имела промежуточные значения

Алгоритм молекулярно-генетического обследования больных с аксонопатиями

11а. основании результатов собственных исследований, и обобщения литературных данных о частоте встречаемости и особенностях клинических проявлений наследственных аксонопатий с АД и АР типами наследования нами разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования семейных и изолированных случаев этой группы заболеваний Предложенный алгоритм представлен на рисунках 3, 4

Анализ читературных данных показал, что классическая клиническая картина периферической полинейропатии характерна для трех генетических вариантов наследственных аксонопатий с АД типом наследования - НМСН ПА, НМСН НЕ и НМСН Поэтому очередность их молекулярно-генетического исследования может диктоваться частотой встречаемости этих вариантов в группе наследственных аксонопатий и возрастом их манифестации Два других генетических варианта с АД типом наследования, для которых идентифицированы гены - НМСН НВ и НМСН 1Ш имеют ряд характерных особенностей, отличающих их от «классического» варианта этой группы заболеваний

Самой частой причиной аксонопатий являются мутации гена МРИ2, в семейном счучае с АД типом наследования рекомендуется первоочередное исследование «горячей» точки гена МР№ - кодона 94, и в случае отсутствия в ней мутаций дальнейшее исследование всей последовательности гена МРШ, и лишь после исключения его, как причины заболевания - исследование других генов, мутации которых приводят к клиническому фенотипу аксонопатии, исходя из размеров гена, так как для каждого из них существуют лишь единичные описания мутаций

В случае АР типа наследования заболевания или подозрении на него (кровно-родственный брак), рекомендуется поиск мутаций в гене СОАР1, с

первоочередным анализом мутации Leu239Phe, которая в соответствии с результатами нашего исследования является причиной не менее 40% IIMCH с АР типом наследования

Анализ литературных данных показал, что к настоящему времени идентифицированы гены лишь двух вариантов наследственных аксонопатий с АР типом наследования, следовательно, молекулярно-генетическая диагностика АР форм аксонопатий может ограничиться поиском мутации в генах GDAP1 и Lamm А/С (Рисунок 3)

Рисунок 3 Алгоритм молекулярно-генетической диагностики семейных случаев наследственных аксонопатий

«+» - мутация найдена «-» - мутация не обнаружена

Наибольшую сложность представляет создание алгоритма молекулярно-генетическои диагностики в семьях с единственным больным В этих случаях ориентиром могут служить возраст манифестации и тяжесть клинического течения (Рисунок 4)

Рисунок 4 Алгоритм мопекулярно-генетической диагностики изолированных случаев наследственных аксонопатир

«+» - мутация найдена «-» - мутация не обнаружена

Так, в случае манифестации заболевания до 5 лет и быстрого прогрессировать заболевания целесообразно начинать диагностический поиск с исследования гена СИАР], при отсутствии мутаций в этом гене идентификация генетического варианта может быть продолжена и направлена на анализ мутаций в гепе МРШ, так как у небольшой части больных нашей выборки со НА типом отмечалось раннее начало и злокачественное течение заболевания

В случае более поздней манифестации заболевания целесообразно проводить исследование трех генов МРШ, МР1, МЕРЬ, НБРВ!, последовательность исследования которых диктуется частотой встречаемости НМСН ПА, 11МСН Ш, НМСН НЕ и НМСН №

Таким образом, разработанные нами алгоритмы будут способствовать оптимизации диагностики, позволяя снизить сроки проведения и стоимость ДНК-диагностики

выводы

1 Установлен вктад мутаций трех генов - MFN2, DNM2, GDAP1, участвующих в формировании хондриома, в развитие наследственных аксонопатий в выборке больных проживающих на территории РФ Среди 72 неродственных семей мутации гена MFN2 явились причиной заболевания в 12 семьях (17%) В шести семьях (8%) выявлены мутации гена GDAP1 Мутаций гена DNM2 в исследованной выборке не выявлено

2 Обнаружена частая мутация Arg94Gln гена MFN2, на долю которой приходится 42% случаев НМСН IIA Анализ гаплотипов хромосом с данной мутациеи показал ее независимое происхождение во всех семьях В том же кодоне у двух неродственных пробандов выявлена мутация Arg94Trp (у одного из пробандов de novo) Таким образом, в гене MFN2 имеется «горячая» точка мутаций - кодон 94, на дочю которой приходится 58% подтвержденных случаев HMCHI1A Разработана эффективная система диагностики этих мутаций

3 Устапов юно, чго основной причиной НМСН IVA в российской выборке больных является мутация Leu239Phe (с 715С>Т) гена GDAP1, выявтенная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии в пяти из шести семей (80% хромосом с выявленной мутацией) Разработана система эффективной диагностики этой мутации

4 Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель Leu239Phe, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя Время распространения мутации составляет 1000±610 лет

5 На основании анализа основных неврологических симптомов в группах больных НМСН IIA и НМСН IVA выявлены 5 признаков достоверно чаще встречающиеся у больных с НМСН IVA Для этой же группы больных характерен ранний (1-5 лет) возраст манифестации заболевания

6 Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных изолированными формами наследственных аксонопатий, и преде шищий not ¡едовагельность анализа генов, ответственных за НМСН II и промежуточного типа в семьях с АД и АР типами наследования и в изолированных случаях заболевания

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1 Evgrafov OV, Mersiyanova I, Irobi J, Van Den Bosch L, Dierick I, Leung CL, Schagina O, Verpoorten N, Van Impe K, Fedotov V, Dadali E, Auer-Grumbach M, Windpassmger C, Wagner K, Mitrovic Z, Hilton-Jones D, Talbot K, Martin JJ, Vasserman N, Tverskaya S, Polyakov A, Liera RK, Gettemans J, Robberecht W, De Jonghe P, Timmerman V Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Mane-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy// Nat Genet 2004 Jun,36(6) 602-6

2 О Sh'agina, S Tverskaya, H Dadali, H Osipova, R Zmchenko, E Ginter, A Polyakov Linkage study of a large CMT family from Udmurtia, Russian Federation - European Journal of Human Genetics V 12 -SI- June 2004 -P0722 -p 240

3 Щагина О. A , Мерсиянова И В , Дадали Е Л , Федотов В П , Потяков А В Картирование и идентификация генов болезни Шарко-Мари-Тута второго типа Медицинская генетика, 2005, т 4, №8, с 378-382

4 О. Schagina, Е Dadali, S Tverskaya, A Polyakov Mutation screening in the GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Mane-Tooth neuropathy type 2A - European Journal of Human Genetics V 13 - S 1 - May 2005 P0896 -p 274,

5 Щагина O.A, Тверская CM, Поляков А В Мутации в гене MFN2 -причина развития болезни Шарко-Мари-Тута 2А типа // Медицинская генетика, 2005, т 4, № 6, с 292

6 Поляков А В , Мерсиянова И В , ЕвграфовО В , Щагина О А Картирование и идентификация генов НМСН второго типа // Медицинская генетика, 2005, т 4, № 6, с 253

7 Гинтер Е К , Зинченко Р А , Осипова Е В , Ельчинова Г И , Галкина В А, Дадали Е Л , Хлебникова О В , Щагина О.А, Близнец Е А, Поляков А В , Петрова Н В , Козлова С И //Медико-генетическое изучение населения Республики Удмуртии Сообщение IV Спектр наследственных болезней в Республике Удмуртии // Медицинская генетика, 2005, т 4 , № 10, с 454-465

8 Федотов В П , Мерсиянова И В , Исмаилов Ш , Щагина О , Тверская С М, Никоноркин П О Популяционный молекулярно-генетический анализ наследственных мото-сенсорных нейропатий в Воронежской области // Медицинская генетика, 2005, т 4, № 6, с 281

9 О. A. Schagina, Е L Dadali, V Р Fedotov, А V Polyakov Arg94Gln nutation in the MFN2 gene is most frequent m the patient with Charcot-Marie-Tooth type 2

disease from Russia//(Control No 2006-A-1112-ESHG) European Journal of Human Genetics,V 14 Supp 1 May 6-9, 2006 Амстердам, P 007l,p 115

10 Федотов В П, Дадали Е JI, Мерсиянова И В , Щагина О.А , Поляков А В Клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность наследственных моторно-сенсорных нейропатий // тезисы IX всероссийского съезда общества неврологов, 2006, 29 мая-2 июня, с 100

11 Щагина О.А , Мерсиянова И В , Дадали Е JI, Федотов В П, Тверская С М, Поляков А В ДНК-диагностика настедственной моторно-сенсорной нейропатии в России// тезисы IX всероссийского съезда общества неврологов, 2006,29 мая-2 июня, с 102

12 Щагина О А , Дадали Е JI, Поляков А В Нарушение структуры и функций хондриома, как причина возникновения наследственной моторно-сенсорной нейропатии 2А типа (обзор литературы)//Медицинская генетика, 2006, т 5 ,№6 , с 5-10

13 Щагина О А , Дадали Е JI, Федотов В П , Поляков А В Спектр мутаций в гене MFN2 у больных настедственной моторно-сенсорной нейропатиеч II А типа //Медицинская генетика, 2006, т 5, № 9(51), с 21-26

14 Щагина О А , Дадали Е JI, Федотов В П , Осипова Е В , Зинченко Р А, Гинтер Е К, Поляков А В Новый аллельный вариант наследственной моторно-сенсорной нейропатии 2А типа в Удмуртской сечье//Медицинская г 7, т 6, №3, с 23-26

Заказ № 636 Объем In л Тираж ЮОэкз Отпечатано в ООО «Петрор>гц» г Москва,ул Палиха 2а тел 250-92-06 www postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щагина, Ольга Анатольевна

Оглавление.

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клинико-генетический анализ наследственных аксонопатий, обусловленных нарушением формирования хондриома"

Научная новизна.9

Практическая значимость.9

Положения, выносимые на защиту.10

Апробация работы.10

Глава 1.11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.11

1.1.Клинико-генетические характеристики НМСН.11

1.1.1 Классификация НМСН.11

1.1.2 Гистоморфологическая основа различных типов НМСН.13

1.1.3 Гены, мутации которых могут приводить к НМСН.15

1.2. Наследственные аксонопатии.18

1.2.1 Молекулярно-генетическая характеристика наследственных периферических аксонопатий.18

1.2.2 Гены белков, обеспечивающих формирование и функционирование хондриома, вовлеченные в патогенез НМСН.22

1.2.3 Роль нарушения структуры и функций хондриома в патогенезе наследственных аксонопатий.31

1.2.4 Клиническая характеристика аксонопатий, вызванных мутациями в генах белков, обеспечивающих формирование и функционирование хондриома.42

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Щагина, Ольга Анатольевна

Выводы

1. Установлен вклад мутаций трех генов - MFN2, DNM2, GDAP1, участвующих в формировании хондриома, в развитие наследственных аксонопатий в выборке больных проживающих на территории РФ. Среди 72 неродственных семей мутации гена MFN2 явились причиной заболевания в 12 семьях (17%). В шести семьях (8%) выявлены мутации гена GDAP1. Мутаций гена DNM2 в исследованной выборке не выявлено.

2. Обнаружена частая мутация Arg94Gln гена MFN2, на долю которой приходится 42% случаев НМСН IIA. Анализ гаплотипов хромосом с данной мутацией показал её независимое происхождение во всех семьях. В том же кодоне у двух неродственных пробандов выявлена мутация Arg94Trp (у одного из пробандов de novo). Таким образом, в гене MFN2 имеется «горячая» точка мутаций - кодон 94, на долю которой приходится 58% подтвержденных случаев HMCHIIA. Разработана эффективная система диагностики этих мутаций.

3. Установлено, что основной причиной НМСН IVA в российской выборке больных является мутация Leu239Phe (с.715С>Т) гена GDAP1, выявленная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии в пяти из шести семей (80% хромосом с выявленной мутацией). Разработана система эффективной диагностики этой мутации.

4. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель Leu239Phe, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя. Время распространения мутации составляет 1000±610 лет.

5. На основании анализа основных неврологических симптомов в группах больных НМСН IIA и НМСН IVA выявлены 5 признаков достоверно чаще встречающиеся у больных с НМСН IVА. Для этой же группы больных характерен ранний (1-5 лет) возраст манифестации заболевания.

6. Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных изолированными формами наследственных аксонопатий, определяющий последовательность анализа генов, ответственных за НМСН II и промежуточного типа в семьях с АД и АР типами наследования и в изолированных случаях заболевания.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Evgrafov OV, Mersiyanova I, Irobi J, Van Den Bosch L, Dierick I, Leung CL, Schagina O, Verpoorten N, Van Impe K, Fedotov V, Dadali E, Auer-Grumbach M, Windpassinger C, Wagner K, Mitrovic Z, Hilton-Jones D, Talbot K, Martin JJ, Vasserman N, Tverskaya S, Polyakov A, Liem RK, Gettemans J, Robberecht W, De Jonghe P, Timmerman V. Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy// Nat Genet. 2004 Jun;36(6):602-6.

2. O. Sh'agina, S. Tverskaya, H. Dadali, H. Osipova, R. Zinchenko, E. Ginter, A. Polyakov. Linkage study of a large CMT family from Udmurtia, Russian Federation. - European Journal of Human Genetics. V.12. - S.l - June 2004. - P0722. - p. 240.

3. Щагина O.A., Мерсиянова И.В., Дадали E.Jl., Федотов В.П., Поляков

A.В. Картирование и идентификация генов болезни Шарко-Мари-Тута второго типа. Медицинская генетика, 2005, т.4, №8, стр.378-382.

4. О. Schagina, Е. Dadali, S. Tverskaya, A. Polyakov. Mutation screening in the GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A -European Journal of Human Genetics. V.13 - S.l - May 2005. P0896. - p. 274;

5. Щагина O.A., Тверская C.M., Поляков А.В. Мутации в гене MFN2 -причина развития болезни Шарко-Мари-Тута 2А типа. // Медицинская генетика, 2005, т.4, № 6, с.292

6. Поляков А.В., Мерсиянова И.В., ЕвграфовО.В., Щагина О.А Картирование и идентификация генов НМСН второго типа. // Медицинская генетика, 2005, т.4, № 6, С.253

7. Гинтер Е.К., Зинченко Р.А., Осипова Е.В., Ельчинова Г.И., Галкина

B.А., Дадали E.JL, Хлебникова О.В., Щагина О.А., Близнец Е.А., Поляков А.В., Петрова Н.В., Козлова С.И.//Медико-генетическое изучение населения Республики Удмуртии. Сообщение IV. Спектр наследственных болезней в Республике Удмуртии.// Медицинская генетика, 2005, т.4., № 10, стр.454-465.

8. Федотов В.П., Мерсиянова И.В., Исмаилов Ш., Щагина О., Тверская С.М., Никоноркин П.О. Популяционный молекулярно-генетический анализ наследственных мото-сенсорных нейропатий в Воронежской области.// Медицинская генетика, 2005, т.4, № 6, с.281

9. О. A. Schagina, Е. L. Dadali, V. P. Fedotov, А. V. Polyakov. Arg94Gln mutation in the MFN2 gene is most frequent in the patient with Charcot-Marie-Tooth type 2 disease from Russia.//(Control No. 2006-A-1112-ESHG).European Journal of Human Genetics,V.l4.Supp.l.May 6-9, 2006. Амстердам, P 0071,p. 115

10. Федотов В.П., Дадали E.JI., Мерсиянова И.В., Щагина О.А., Поляков А.В. Клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность наследственных моторно-сенсорных нейропатий.// тезисы IX всероссийского съезда общества неврологов, 2006, 29 мая-2 июня, с. 100

11. Щагина О.А., Мерсиянова И.В., Дадали Е.Л., Федотов В.П., Тверская С.М., Поляков А.В. ДНК-диагностика наследственной моторно-сенсорной нейропатии в России// тезисы IX всероссийского съезда общества неврологов, 2006, 29 мая-2 июня, с. 102

12. Щагина О.А., Дадали Е.Л., Поляков А.В. Нарушение структуры и функций хондриома, как причина возникновения наследственной моторно-сенсорной нейропатии 2А типа (обзор литературы)//Медицинская генетика, 2006, т.5.,№6

13. Щагина О.А., Дадали Е.Л., Федотов В.П., Поляков А.В. Спектр мутаций в гене MFN2 у больных наследственной моторно-сенсорной нейропатией II А типа. // Медицинская генетика, 2006, т.5, № 9(51), с.21-26

Щагина О.А., Дадали E.JL, Федотов В.П., Осипова Е.В., Зинченко Р.А., Гинтер Е.К., Поляков А.В. Новый аллельный вариант наследственной моторно-сенсорной нейропатии 2А типа в Удмуртской семье//Медицинская генетика, 2007, т.6, №3

Заключение

В результате молекулярно-генетического исследования трех генов, участвующих в формирование хондриома на материалах выборки больных наследственными аксонопатиями проживающих на территории РФ, были выявлены частоты и спектр мутаций генов MFN2 и GDAP1.

Установлено, что мутации гена MFN2, как и предполагалось, являются наиболее частой причиной НМСН IIA, как при семейных, так и в изолированных случаях заболевания. Мутации выявлены в 12 семьях из 72, что составляет 17% всех случаев и согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена MFN2 в структуру заболеваемости НМСН II оценивается в 15-22%.

В гене MFN2 выявлена частая мутация Arg94Gln, явившаяся причиной заболевания в 5 из 12 семей (42%) и при анализе гаплотипов хромосом с мутацией по микросаттелитным маркерам и внутригенным однонуклеотидным полиморфизмам установлено, что высокая частота этой мутации у больных, проживающих на территории РФ обусловлена не эффектом основателя, а тем, что в гене MFN2 существует горячая точка -кодон 94, в котором локализуется еще одна мутация Arg94Trp, выявленная нами у двух неродственных пробандов. На долю этих двух мутаций кодона 94 приходится 58% случаев НМСН IIА, что является уникальной ситуацией для такого генетически гетерогенного заболевания. Для оптимизации ДНК-диагностики была разработана система регистрации всех мутаций кодона 94 гена MFN2, приводящих к аминокислотной замене, основанная на ПДРФ анализе фрагмента, соответствующего части экзона 4, полученного в результате амплификации с праймером с созданием сайта рестрикции для эндонуклеазы Есо881, узнающей нормальную последовательность.

В гене DNM2 мутаций не выявлено, что свидетельствует о том, что его вклад в заболеваемость наследственными аксонопатиями несущественен.

Мутации гена GDAP1 явились причиной заболевания в трех семьях с АР типом наследования и в трех изолированных случаях НМСН II. В пяти из этих шести семей причиной заболевания явилась одна и та же миссенс мутация экзона 6 Leu239Phe (с.715С>Т) в гомозиготном или компаунд гетерозиготном состоянии. Для установления природы высокой частоты данной мутации были проанализированы гаплотипы хромосом с данной заменой с использованием восьми микросаттелитных маркеров. Мы обнаружили неравновесие по сцеплению для 7 из 8 этих маркеров, из чего сделали вывод, что причиной столь высокой частоты этой мутации является эффект основателя. На основе проведенного анализа неравновесия по сцеплению аллелей полиморфных маркеров с заболеванием нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация. Наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя D8S279-D8S1776-D8S286-D8S551-D8S548-D8S1805-D8S1705-D8S1757: 9-2-8-13-3-1-58. Мы оценили период времени за который произошло размывание вследствии рекомбинаций гаплотипа предковой хромосомы . Для этого мы использовали подход, предложенный Risch с соавторами [75]. Полученная нами оценка времени, за которое произошло распространение мутации -около 1 ООО лет, что не противоречит историческим данным.

Нами проведен клинический анализ основных неврологических симптомов в группах больных с мутациями генов MFN2 и GDAP1, обнаруженные статистически достоверные отличия по частотам таких признаков, как снижение/отсутствие коленного рефлекса и рефлекса с двуглавой мышцы, тремор пальцев, деформация кисти, расстройство глубокой чувствительности и возрасту манифестации, позволяют оптимизировать дифференциальную диагностику этих форм заболевания на уровне клинического обследования пациентов при отсутствии семейного анамнеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щагина, Ольга Анатольевна, Москва

1. Бадалян, JI.O., Скворцов, И.А., Клиническая электро-нейромиография//. 1986, Москва: Медицина. 368.

2. Гехт, Б.М., Ильина Н.А., Нервно-мышечные болезни//, ed. "Медицина". 1982, Москва.

3. Гехт, Б.М., Меркулова, Д.М., Практические аспекты клиники и лечения полиневропатий.//Неврологический журнал,- 1997-. 2-(4-9.

4. Гехт, Б.М., Меркулова, Д.М., Касаткина Л.Ф., Клиника, диагностика и лечение демиелинизирующих полиневропатий.// Неврологический журнал,- 1996-. 1-(12-17.

5. Горбунова, В.Н., Савельева-Васильева, Красильникова В.В., Молекулярная неврология//. 2000, Санкт-Петербург: Интермедика.

6. Гринберг, Д.А., Аминофф, М.Д., Саймон, Р.П., Клиническая неврология//. 2004, Москва: Медпресс-информ. 520.

7. Дадали, Е.Л., Наследственные нервно-мышечные заболевания: диагностика и медико-генетическое консультирование. 1999: Москва.

8. Дадали, Е.Л., Угаров И.В., Шаркова И.В., Кириленко Н.Б., Проблемы классификации наследственных нейропатий.// Медицинская генетика,-2003-. 5-(194-200.

9. Левин, О.С., Полиневропатии//. 2005, Москва: Медицинское информационное агенство. 496.

10. Ю.Петрунин, А.С., Неврология детского возраста//. 2004, Москва: Медицина. 645.

11. И.Поляков, В.Ю., Сухомлинова, М.Ю., Файс, Д., Как сливаются, фрагментируются и делятся митохондрии.// Биохимия,- 2003-. том 68, вып.8-(1026-1039.

12. Скулачев, В.П., Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии.//. Биохимия мембран. 1989, Москва: Высшая школа. 199-208.

13. З.Федотов, В.П., Клинико-генетический анализ наследственных моторно-сенсорных нейропатий в Воронежской области. 2002: Москва.

14. Н.Ченцов, Ю.С., Введение в клеточную биологию//. 2004, Москва: Академкнига. 340-355.

15. Штульман, О.С., Левин, О.С., Неврология. Справочник практического врача//. 2004, Москва: Медпресс-информ. 860.

16. Эсбери, А.К., Джиллиатт, Р.У., Заболевания периферической нервной системы//. 1987, Москва: Медицина. 352.

17. Яхно, Н.Н., Штульман Д.Р., Болезни нервной системы//. 2 ed. 2001, Москва: Медицина. 569.

18. Antonellis, A., R.E. Ellsworth, N. Sambuughin, et al., Glycyl tRNA synthetase mutations in Charcot-Marie-Tooth disease type 2D and distal spinal muscular atrophy type V.// Am J Hum Genet,- 2003-. 72-(5)-: p. 1293-1299.

19. Baloh, R.H., R.E. Schmidt, A. Pestronk, et al., Altered axonal mitochondrial transport in the pathogenesis of Charcot-Marie-Tooth disease from mitofiisin 2 mutations.//J Neurosci,- 2007-. 27-(2)-: p. 422-430.

20. Bengtsson, B.O. and G. Thomson, Measuring the strength of associations between HLA antigens and diseases.//Tissue Antigens,- 1981-. 18-(5)-: p. 356-363.

21. Bergoffen, J., S.S. Scherer, S. Wang, et al., Connexin mutations in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease.//Science,- 1993-. 262-(5142)-: p. 2039-2042.

22. Birouk, N., H. Azzedine, O. Dubourg, et al., Phenotypical features of a Moroccan family with autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease associated with the S194X mutation in the GDAP1 gene.// Arch Neurol,-2003-. 60-(4)-: p. 598-604.

23. Bolino, A., M. Muglia, F.L. Conforti, et al., Charcot-Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding myotubularin-related protein-2.// Nat Genet,- 2000-. 25-(l)-: p. 17-19.

24. Chen, H., S.A. Detmer, A.J. Ewald, et al., Mitofusins Mfnl and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development.//J Cell Biol,- 2003-. 160-(2)-: p. 189-200.

25. Cho, H.J., D. Sung, B. Kim, et al., Mitochondrial GTPase mitofusin 2 mutations in Korean patients with Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2.// Clin Genet,- 2007-. 71-(3)-: p. 267-272.

26. Chung, K.W., S.B. Kim, K.D. Park, et al., Early onset severe and late-onset mild Charcot-Marie-Tooth disease with mitofusin 2 (MFN2) mutations.// Brain,- 2006-. 129-(Pt 8)-: p. 2103-2118.

27. Cipolat, S., O. Martins de Brito, B. Dal Zilio, et al., OPA1 requires mitofusin 1 to promote mitochondrial fusion.// Proc Natl Acad Sci U S А,-2004-. 101-(45)-:p. 15927-15932.

28. Claramunt, R., L. Pedrola, T. Sevilla, et al., Genetics of Charcot-Marie-Tooth disease type 4A: mutations, inheritance, phenotypic variability, and founder effect.//J Med Genet,- 2005-. 42-(4)-: p. 358-365.

29. Cuesta, A., L. Pedrola, T. Sevilla, et al., The gene encoding ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 is mutated in axonal Charcot-Marie-Tooth type 4A disease.//Nat Genet,- 2002-. 30-(l)-: p. 22-25.

30. De Jonghe, P., I. Mersivanova, E. Nelis, et al., Further evidence that neurofilament light chain gene mutations can cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2E.//Ann Neurol,- 2001-. 49-(2)-: p. 245-249.

31. De Jonghe, P., V. Timmerman, E. Nelis, et al., Charcot-Marie-Tooth disease and related peripheral neuropathies.//J Peripher Nerv Syst,- 1997-. 2-(4)-: p. 370-387.

32. De Sandre-Giovannoli, A., M. Chaouch, I. Boccaccio, et al., Phenotypic and genetic exploration of severe demyelinating and secondary axonal neuropathies resulting from GDAP1 nonsense and splicing mutations.// J Med Genet,- 2003-. 40-(7)-: p. e87.

33. Devlin, B. and N. Risch, A comparison of linkage disequilibrium measures for fine-scale mapping.//Genomics,- 1995-. 29-(2)-: p. 311-322.

34. Dyck, P.J. and E.H. Lambert, Lower motor and primary sensory neuron diseases with peroneal muscular atrophy. II. Neurologic, genetic, and electrophysiologic findings in various neuronal degenerations.// Arch Neurol,- 1968-. 18-(6)-: p. 619-625.

35. Engelfried, К., M. Vorgerd, M. Hagedorn, et al., Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A: novel mutations in the mitofusin 2 gene (MFN2).// BMC Med Genet,- 2006-. 7-(53.

36. Eura, Y., N. Ishihara, S. Yokota, et al., Two mitofusin proteins, mammalian homologues of FZO, with distinct functions are both required for mitochondrial fusion.//J Biochem (Tokyo),- 2003-. 134-(3)-: p. 333-344.

37. Evgrafov, O.V., I. Mersiyanova, J. Irobi, et al., Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy.//Nat Genet,- 2004-. 36-(6)-: p. 602-606.

38. Fabrizi, G.M., T. Cavallaro, C. Angiari, et al., Charcot-Marie-Tooth disease type 2E, a disorder of the cytoskeleton.//Brain,- 2007-. 130-(Pt 2)-: p. 394403.

39. Fischer, D., M. Herasse, M. Bitoun, et al., Characterization of the muscle involvement in dynamin 2-related centronuclear myopathy.// Brain,- 2006-. 129-(Pt 6)-: p. 1463-1469.

40. Georgiou, D.M., J. Zidar, M. Korosec, et al., A novel NF-L mutation Pro22Ser is associated with CMT2 in a large Slovenian family.// Neurogenetics,- 2002-. 4-(2)-: p. 93-96.

41. Gross, A., J.M. McDonnel, and S.J. Korsmeyer, BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis.// Genes & Development,- 1999-. 13-(1899-1911.

42. Harding, A.E. and P.K. Thomas, Genetic aspects of hereditary motor and sensory neuropathy (types I and II).//J Med Genet,- 1980-. 17-(5)-: p. 329336.

43. Helgason, A., G. Nicholson, K. Stefansson, et al., A reassessment of genetic diversity in Icelanders: strong evidence from multiple loci for relative homogeneity caused by genetic drift.// Ann Hum Genet,- 2003-. 67-(Pt 4)-: p. 281-297.

44. Ismailov, S.M., V.P. Fedotov, E.L. Dadali, et al., A new locus for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 (CMT2F) maps to chromosome 7q 11-q21.//Eur J Hum Genet,- 2001-. 9-(8)-: p. 646-650.

45. Jordanova, A., J. Irobi, F.P. Thomas, et al., Disrupted function and axonal distribution of mutant tyrosyl-tRNA synthetase in dominant intermediate Charcot-Marie-Tooth neuropathy.//Nat Genet,- 2006-. 38-(2)-: p. 197-202.

46. Kabzinska, D., H. Drac, K. Rowinska-Marcinska, et al., Early onset Charcot-Marie-Tooth disease caused by a homozygous Leu239Phe mutation in the GDAP1 gene.//Acta Myol,- 2006-. 25-(l)-: p. 34-37.

47. Kijima, К., С. Numakura, Н. Izumino, et al., Mitochondrial GTPase mitofusin 2 mutation in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A.// Hum Genet,- 2005-. 116-(l-2)-: p. 23-27.

48. Kijima, К., C. Numakura, E. Shirahata, et al., Periaxin mutation causes early-onset but slow-progressive Charcot-Marie-Tooth disease.// J Hum Genet,- 2004-. 49-(7)-: p. 376-379.

49. Koshiba, Т., S.A. Detmer, J.T. Kaiser, et al., Structural basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes.// Science,- 2004-. 305-(5685)-: p. 858-862.

50. Labuda, D., E. Zietkiewicz, and M. Labuda, The genetic clock and the age of the founder effect in growing populations: a lesson from French Canadians and Ashkenazim.//Am J Hum Genet,- 1997-. 61-(3>: p. 768-771.

51. Lawson, V.H., B.V. Graham, and K.M. Flanigan, Clinical and electrophysiologic features of CMT2A with mutations in the mitofusin 2 gene.//Neurology,- 2005-. 65-(2)-: p. 197-204.

52. Lee, Y.J., S.Y. Jeong, M. Karbowski, et al., Roles of the mammalian mitochonrial fission and fusion mediators Fisl, Drpl, and Opal in apoptosis//Mol Biol Cell,- 2004-.

53. Levin, M.L. and R. Bertell, RE: "simple estimation of population attributable risk from case-control studies".// Am J Epidemiol,- 1978-. 108-(l)-:p. 78-79.

54. Lupski, J.R., Axonal Charcot-Marie-Tooth disease and the neurofilament light gene (NF-L).//Am J Hum Genet,- 2000-. 67-(l)-: p. 8-10.

55. Marco, A., A. Cuesta, L. Pedrola, et al., Evolutionary and structural analyses of GDAP1, involved in Charcot-Marie-Tooth disease, characterize a novel class of glutathione transferase-related genes.//Mol Biol Evol,- 2004-. 21-(1)-: p. 176-187.

56. Matise, T.C., A. Chakravarti, P.l. Patel, et al., Detection of tandem duplications and implications for linkage analysis.// Am J Hum Genet,-1994-. 54-(6)-:p. 1110-1121.

57. Mersiyanova, I.V., A.V. Perepelov, A.V. Polyakov, et al., A new variant of Charcot-Marie-Tooth disease type 2 is probably the result of a mutation in the neurofilament-light gene.// Am J Hum Genet,- 2000-. 67-(l)-: p. 37-46.

58. Mozdy, A.D., J.M. McCaffery, and J.M. Shaw, Dnmlp GTPase-mediated mitochondrial fission is a multi-step process requiring the novel integral membrane component Fislp.//J Cell Biol,- 2000-. 151-(2)-: p. 367-380.

59. Mozdy, A.D. and J.M. Shaw, A fuzzy mitochondrial fusion apparatus comes into focus.//Nat Rev Mol Cell Biol,- 2003-. 4-(6)-: p. 468-478.

60. Nelis, E., S. Erdem, P.Y. Van Den Bergh, et al., Mutations in GDAP1: autosomal recessive CMT with demyelination and axonopathy.// Neurology,- 2002-. 59-(12)-: p. 1865-1872.

61. Nelis, E., K. Verhoeven, K. Claeys, et al. Mitofusin 2 mutations in Chrcot-Marie-Tooth type 2A neuropathy//. Mutation detection VIII International symposium on mutation in the genome. 2005. Santorini, Greece.

62. Nicholson, G. and S. Myers, Intermediate forms of Charcot-Marie-Tooth neuropathy: a review.//Neuromolecular Med,- 2006-. 8-(l-2)-: p. 123-130.

63. Parman, Y., E. Battaloglu, I. Baris, et al., Clinicopathological and genetic study of early-onset demyelinating neuropathy.// Brain,- 2004-. 127-(Pt 11)-: p. 2540-2550.

64. Pedrola, L., A. Espert, X. Wu, et al., GDAP1, the protein causing Charcot-Marie-Tooth disease type 4A, is expressed in neurons and is associated with mitochondria//Hum Mol Genet,- 2005-. 14-(8)-:p. 1087-1094.

65. Reilly, M.M. and M.G. Hanna, Genetic neuromuscular disease.// J Neurol Neurosurg Psychiatry,- 2002-. 73 Suppl 2-(II 12-21.

66. Risch, N., D. de Leon, L. Ozelius, et al., Genetic analysis of idiopathic torsion dystonia in Ashkenazi Jews and their recent descent from a small founder population.//Nat Genet,- 1995-. 9-(2)-: p. 152-159.

67. Roa, B.B., L.E. Warner, C.A. Garcia, et al., Myelin protein zero (MPZ) gene mutations in nonduplication type 1 Charcot-Marie-Tooth disease.// Hum Mutat,- 1996-. 7-(l)-: p. 36-45.

68. Saito, M., Y. Hayashi, T. Suzuki, et al., Linkage mapping of the gene for Charcot-Marie-Tooth disease type 2 to chromosome lp (CMT2A) and the clinical features of CMT2A.//Neurology,- 1997-. 49-(6)-: p. 1630-1635.

69. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.// Proc Natl Acad Sci U S А,- 1977-. 74-(12)-: p. 5463-5467.

70. Santel, A., Get the balance right: mitofusins roles in health and disease.// Biochim Biophys Acta,- 2006-. 1763-(5-6)-: p. 490-499.

71. Santel, A. and M.T. Fuller, Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin.//J Cell Sci,- 2001-. 114-(Pt 5)-: p. 867-874.

72. Schessl, J., L. Medne, Y. Hu, et al., MRI in DNM2-related centronuclear myopathy: evidence for highly selective muscle involvement.//Neuromuscul Disord,- 2007-. 17-(1)-: p. 28-32.

73. Schon, E.A. and G. Manfredi, Neuronal degeneration and mitochondrial dysfunction.//J Clin Invest,- 2003-. 111-(3)-: p. 303-312.

74. Senderek, J., C. Bergmann, S. Weber, et al., Mutation of the SBF2 gene, encoding a novel member of the myotubularin family, in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/llpl5.// Hum Mol Genet,- 2003-. 12-(3)-: p. 349-356.

75. Shield, A.J., T.P. Murray, and P.G. Board, Functional characterisation of ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 as a glutathione transferase.//Biochem Biophys Res Commun,- 2006-. 347-(4)-: p. 859-866.

76. Skre, H., Genetic and clinical aspects of Charcot-Marie-Tooth's disease.// Clin Genet,- 1974-. 6-(2)-: p. 98-118.

77. Street, V.A., C.L. Bennett, J.D. Goldy, et al., Mutation of a putative protein degradation gene LITAF/SIMPLE in Charcot-Marie-Tooth disease 1С.// Neurology,- 2003-. 60-(l)-: p. 22-26.

78. Sugioca, R., S. Shimizu, and Y. Tsujimoto, Fzol, a protein involved in mitochondrial fusion, inhibits apoptosis.// J. Biol. Chem.,- 2004-. 279-(50)-:1. P

79. Sun, X., J.M. Fontaine, J.S. Rest, et al., Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins.// J Biol Chem,- 2004-. 279-(4)-: p. 2394-2402.

80. Vallat, J.M., D. Grid, C. Magdelaine, et al., Autosomal recessive forms of Charcot-Marie-Tooth disease.// Curr Neurol Neurosci Rep,- 2004-. 4-(5)-: p. 413-419.

81. Vander Heiden, M.J. and G.B. Thompson, BCL-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis?//Naure Cell Biology,- 1999-. 1-(

82. Verhoeven, K. and e. al., Mutations in the small GTF-ase lete endosomal protein RAB7 cause Charcot-Marie-Tooth Type 2B neuropathy.// Am J Hum Genet,- 2003-. 72(3)-(722-727.

83. Verhoeven, K., K.G. Claeys, S. Zuchner, et al., MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in Charcot-Marie-Tooth type 2.// Brain,- 2006-. 129-(Pt 8)-: p. 2093-2102.

84. Warner, L.E., P. Mancias, I.J. Butler, et al., Mutations in the early growth response 2 (EGR2) gene are associated with hereditary myelinopathies.//Nat Genet,- 1998-. 18-(4)-: p. 382-384.

85. Zhao, C., J. Takita, Y. Tanaka, et al., Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIFlBbetaA Cell,- 2001-. 105-(5)-: p. 587-597.

86. Zuchner, S., P. De Jonghe, A. Jordanova, et al., Axonal neuropathy with optic atrophy is caused by mutations in mitofusin 2.// Ann Neurol,- 2006-. 59-(2)-:p. 276-281.

87. Zuchner, S., I.V. Mersiyanova, M. Muglia, et al., Mutations in the mitochondrial GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A.//Nat Genet,- 2004-. 36-(5)-: p. 449-451.

88. Zuchner, S., M. Noureddine, K. M.L., et al., Mutations in the pleckstrin homology domain of dynamin 2 cause dominant intermediate Charcot-Marie-Tooth disease//Nat Genet,- 2005-. 37:3-(289-294.