Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан"

Багаутдинова Эльвира Газинуровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ МОТОРНО-СЕНСОРНЫХ НЕЙРОПАТИЙ I ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 16 1"7ЭЭ

УФА-2007

003161799

Багаутдмнова Эльвира Га шнуровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ МОТОРНО-СЕНСОРНЫХ НЕЙРОПАТИЙ 1 ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 2007

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Хидиятова Ирина Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич

доктор биологических наук профессор Мустафина Ольга Евгеньевна

Ведущая организация Институт общей генетики им Н Н Вавилова РАН

Регионального диссертационного совета КМ 002 133 01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу 450054, г Уфа, Просп Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Авторефера! разослан IО октября 2007 г

Ученый секретарь регионального

Защита диссертации состоится ноября 2007 г в

часов на заседании

диссертационного совета, к б н

Бикбулатова С М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) - это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической нервной системы, поражающих миелиновьге оболочки, аксоны двигательных и чувствительных волокон, а также спинно-мозговых корешков В среднем, в мире их распространенность составляет 10,0 на 100000 населения, варьируя от 0,1 до 41,0 на 100000 населения (Руденская , 1998, Emery et al, 1991, lonasescu et al, 1995) В Башкортостане распространенность всех типов НМСН составляет 10,3 на 100000 населения (Крупина и др , 2006)

В зависимости от характера поражения нервных волокон, НМСН подразделяются на два основных типа - димиелинезирующий (НМСН I) и аксональный (НМСН II), клиническая дифференциация которых возможна только на основе электронейромиогрфического исследования, выявляющего скорость проведения импульса (СПИ) по срединному нерву К каждому из этих типов заболевания относится целый ряд генетически различных форм заболевания В настоящее время картировано более 25 генов, ответственных за развитие НМСН, 22 из которых идентифицированы (http //www neuio wustl edu/neuiomuscular/time/hmsn html) Известные формы НМСН, несмотря на существование определенных особенностей, имеют много общих как кпинических, так и электронейромиографических признаков, что значительно затрудняет их диагностику, в том числе дифференциальную Поэтому самым точным методом диагностики НМСН, становящимся все более доступным в наше время, является ДНК-анализ, позволяющий проводить не только дифференциальную, но также пренагальную и пресимптоматическую диагностику в отягощенных НМСН семьях При этом, молекулярно-генетическое исследование НМСН является и основой изучения патогенеза данной группы заболеваний

Большинство из известных генов, мутации в которых приводят к развитию НМСН, кодируют белки, непосредственно участвующие в структурной и функциональной организации миелина периферических нервных волокон Согласно литературным данным, в странах Европы и США наиболее распространена НМСН I типа, среди которого наиболее частой является форма НМСН 1А (СМТ1А) Генетической причиной развития данной формы является дупликация 1,5 Mb в хромосомной области 17р11 2-12,

включающей ген белка периферического миелина (РМР22) (Timmerman et al, 1990, Patel et al , 1990, Lebo et al , 1992) Наряду с дупликацией/делецией, в гене РМР22 обнаружено более 60 точковых мутаций, приводящих к развитию НМСН Второй по nacioie считаегся Х-сцепленная форма НМСН IX, обусловленная мутациями в гене коннексина 32 (Сх32, GJB!) Другим важным геном, мутации в котором приводят к развитию целого ряда форм НМСН, является ген MPZ (myelin protein zero, Ро) Более редкой, но все же имеющей место причиной НМСН I типа, является нарушение структуры гена EGR2 (early growth response gene - 2) Следует отметить, что мутации в выше указанных генах могут приводить к различным формам НМСН, относящимся не только к НМСН 1 типа, но также к НМСН II и промежуточного типов Поэтому, при проведении молекулярно-генетического изучения данной группы заболеваний в определенном регионе, как правило, в первую очередь исследуются именно эти гены

В Республике Башкортостан (РЬ) эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование НМСН начато в последние годы установлена территориальная и этническая неравномерность распространения заболевания, преобладание по частоте НМСН I типа Однако, молекулярно-генетический анализ включал только определение дупликации/делеции 1ена РМР22, показавшее несколько более низкий уровень частоты данной мутации в РБ (45% среди НМСН I) (Крупина с соавт, 2006), по сравнению с другими регионами России В связи с этим, актуальным является продолжение исследования роли ряда известных генов в развитии НМСН у больных из РБ, являющееся основой для разработки наиболее оптимального для региона алгоритма ДНК-диагностики данной группы заболеваний

При проведении идентификации дупликации/делеции гена РМР22 методом регистрации дозы гена с помощью двух микросателлитных маркеров, в ряде случаев возникала необходимость анализа полиморфизма дополнительных ДНК-локусов Это определило актуальность подбора высокополиморфных маркеров, сцепленных с геном РМР22, удобных для ПЦР-анализа и характеризующихся высокой степенью гетерозиготности среди населения исследуемого региона

Целью исследования являлся анализ структурных особенностей генов РМР22, CJBI, MPZ, EGR2 у больных с наследственными моторно-сенсорными

нейропатиями из Республики Башкортостан и разработка оптимального для региона алгоритма ДНК - диагностики данной группы заболеваний В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1 Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов генов РМР22, йЗВ1(Сх32), МР2 и ЕСЯ2 у больных с НМСН из РБ и в контрольной выборке

2 У больных с выявленными мутациями определить гаплотипы по полиморфным локусам, маркирующие мутантные хромосомы

3 Охарактеризовать клинические особенности НМСН у больных с выявленными мутациями в исследованных генах

4 С целью оптимизации метода выявления дупликации/делеции гена РМР22 провести анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных ДНК - локусов в выборках здоровых жителей Республики Башкортостан, этнических русских, башкир и татар

5 Разработать на основе полученных данных оптимальный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики НМСН Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые в

Республике Башкортостан изучены спектр и частота мутаций в генах РМР22, СШ1 (С\32), МР2 и ЕСЯ2 при НМСН I типа Выявлено 4 различных мутации в гене С'./В1, одна из которых (Рю87А1а) является частой в РБ (19,40% среди НМСН 1 типа), сиспленном с общим гаплотипом, мутация Пг861!е, выявленная с частотой 1,49% среди НМСН I типа, ранее не описана С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 проведен анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных локусов среди жителей РБ, показавший высокие показатели гетерозиготности и возможности их использования для диагностики данной мутации

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических причинах развития НМСН в Башкортостане На основе данных по спектру и частоте генетических вариантов НМСН разработан оптимальный для нашего региона алгоритм поиска мутаций у больных с НМСН I типа Полученные результаты могут быть использованы для уточнения диагноза, а также позволяют проводить пренатальную ДНК-диагностику НМСН в семьях с идентифицированными мутациями Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в

5

медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников

Положения, выносимые на зашиту:

1 Высокая частота распространения формы НМСН IA среди больных НМСН из Республики Башкортостан

2 Высокий уровень гетерозиготности трех микросателлитных локусов, сцепленных с геном РМР22, у жителей РБ и возможность их использования для диагностики дупликации/делеции данного гена

3 Спектр и частоты мутаций в генах РМР22, GJB1, MPZ и EGR2 у больных НМСН I типа из РБ Впервые обнаружены мутации Thr86Ile (с 257С>Т) в гене GJB1 и полиморфизм Ser239Ser(c 714С>Т) в гене MPZ

4 Высокая частота мутации Рго87А1а в гене GJB1 среди больных НМСН I типа из РБ, связанная с эффектом основателя

5 Основные клинические характеристики больных НМСН I с выявленными мутациями в 1ене GJB1

6 Оптимальный для жителей РБ алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I типа, основанный на анализе генов РМР22 и GJB1

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Ежегодных конференциях Европейского общества генетиков человека (Амстердам 2006, Ницца 2007), 10-й Пущинской школе - конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Путинского научного центра РАН, девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006), Ежегодной Балканской конференции генетиков человека (Balkan Meeting on Human Genetics, Скопье, 2006), международной школе молодых ученых «Геномика и биотехнология» (Звенигород, 2006), 31-ом конгрессе федерального европейского биохимического общества (FEBS congress, Стамбул, 2006), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатовисследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 34 рисунка Список литературы включает 165 источников

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета д м н , профессору Магжанову Риму Валеевичу за консультативную помощь и организацию забора материала

Материал исследования В работе использованы образцы геномной ДНК больных с клиническим диагнозом наследственная моторно-сенсорная нейропатия, состоящих на диспансерном учете в Медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра (МГК РПЦ) г Уфы, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в Башкортостане Клинический осмотр и забор крови больных проводился сотрудниками кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета Исследуемая выборка представлена 173 больными НМСН из 131 семьи и 60 здоровыми членами семей Из 131 семьи на основании данных ЭНМГ диагноз НМСН I типа был установлен в 67 семьях, II типа - в 9 семьях, у больных из 55 семей данные ЭНМГ отсутствовали, в связи с чем в исследование были включены все больные с НМСН, без дифференциации на типы, а расчет частоты выявленных мутаций представлен как для 67 неродственных больных НМСН I типа, так и для всей выборки неродственных больных НМСН По этнической принадлежности семьи распределились следующим образом 42 русских, 37 татарских, 27 башкирских, 3 украинских, по одной семье чувашской, марийской и азербайджанской В 19-ти семьях пробанды происходили из межнациональных браков

Методы исследования Выделение ДНК проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной

крови (Mathew, 1984) Идентификацию дупликации гена РМР22 проводили методом мультиплексной ПЦР с помощью набора реактивов «CMT-dup», выпускаемого ООО «Центр Молекулярной Генетики» (г Москва), согласно прилагаемой инструкции Анализ полиморфизма трех микросателпитных ДНК - локусов, сцепленных с геном РМР22, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием праймеров, предложенных (Latour et al, 2001) Поиск мутаций в ienax РМР22 Сх32 MPZ и EGR2 осуществляли методом конформаиионного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP-анализ) Результаты SSCP-анализа оценивали в 10%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием азотнокислым серебром Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism, модель 310 (Applied Biosystems)

Статистическая обработка полученных результатов. Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа "Rows х Columns" [Roff, 1989], Statistica ver 6 0 (StatSoft, Inc, 2003) с использованием критерия «хи-квадрат», критерия Стьюдента (t)

Неравновесие по сцеплению между аллелями локусов Х-хромосомы рассчитывали по формуле S = Статистическую значимость

неравновесия по сцеплению оценивали с помощью точного критерия Фишера, используя пакет STATS системы R 2 5 1 для статистического анализа и программирования (R Development Core Team, 2007)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение частоты дупликации/делеции гена РМР22 в выборке больных НМСН из Башкортостана

В выборке больных с клиническим диагнозом болезнь «Шарко-Мари-Тута» был проведен анализ частоты дупликации гена РМР22 В исследовании приняло участие 173 больных из 131 семьи, в 67 из которых с помощью клинических методов исследования и ЭНМГ была установлена НМСН 1 типа

В результате скрининга дупликации гена РМР22 (рис 1) данная мутация обнаружена у 46 больных из 35 неродственных семей без дифференциации на типы НМСН В пересчете на неродственных больных, частота данной мутации

составила 2(1,72% из НМС11 всех типов и 52,24% - на I !МСН I типа, что оказалось несколько ниже по сравнению с аналогичными показателями по России и странам пиропы. В трех основных этнических группах больных, без дифференциации на типы 11МСН. наибольшая частота дупликации выявлена у лиц татарской этнической принадлежности - 37,14%, наименьшая - у башкир ■ 14,78%; для русских этот показатель составил 31,43%, для метисов - 17.14%. Все полученные значения можно считать достаточно высокими, у ¡«гл.тающими на необходимость первоочередного поиска данном мутации при проведении ДНК-диапюстики заболевания.

¡ d up 5

}dii¡)4

0 2 3 4 5 © 7 (¡) 9 10 (íj) 12 13

Рис 1. "Олсктрофореграмма 11Ц1'-аналила для идентификации дупликации гена РМР22: дорожки № 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13 - отсутствие дупликации, дорожки Л'а 6, R и 1 i - наличие дупликации; дорожка 1 — деления гена РМР22.

У двух пациентов (1,53%) выявлена деления гена РМР22. ведущая к развитию наследственной нейропатии со склонностью к параличам от сдавленна. В 3-х из 35 семей (8,57%) дупликация гена РМР22 являлась мутацией tie novo.

2. Анализ полиморфизма трех й'ГК-локусои, сцепленных с геном РМР22, в пеко гарых этнических группах Башкортостана.

На сегодняшний деш. наиболее дешевым, быстрым и простым й исполнении методом детекции дуплнкацин/дслеции гена [-'МР22 является регистрация дозы аллелей полиморфных микро- или минисателлитных ДНК-локусов, расположенных внутри ген но или рядом с геном. При этом, важной характеристикой используемых в этих целях полиморфных маркеров являегся их гстерозиготносп. в популяциях. Чем выше степень гетерозиготное™ полиморфного ДНК- локуса. чем меньше вероятность наличия гомозиготного состояния аллелей, затрудняющего интерпретацию результата.

С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 был проведен анализ полиморфизма трех микросателлитных локусов (4А, 9А 9В), описанных в работе Latour с соавторами (2001), в выборке здоровых доноров из Башкортостана, представляющих три этнические группы - русских, башкир и татар На рисунке 2 представлено схематическое расположение изученных авторами ДНК-локусов относительно гена РМР22 Они захватывают область размером в 0,55 Mb в центре дупликации

il

tппяя m«t»»

О 3

Рис. 2 Полиморфные ДНК-локусы, сцепленные с дуплицируемой областью гена РМР22 (Latour et al , 2001)

По локусу 4А в выборках доноров русской и татарской этнической принадлежности выявлено по 6 аллельных вариантов, в выборке башкир - 8 Во всех этнических группах наиболее часто встречаются 4 аллельных варианта, частота которых варьирует в пределах 16-32% (рис 3) Для данного ДНК-локуса установленные значения гетерозиготности варьировали от 57% у русских до 66% у татар (таблица 1) Такие показатели не считаются высокими, тк существует множество полиморфных локусов, гетерозиготность которых может достигать более 80% Однако, ввиду того, что 4 аллельных варианта распределены среди населения с частотой, не превышающей 40%, и аллели легко идентифицируются методом ПЦР и электрофореза, данный полиморфный локус можно считать пригодным для использования при диагностике дупликации/делеции гена РМР22

При анализе локуса 9А наиболее часто во всех трех обследованных выборках встречаются аллели №№ 2,3,4 и 5, их частота находится в пределах 18-26% среди русских, 7-32% среди татар и 14-30% среди башкир (рис 4) Гетерозиготность по данному локусу оказалась выше, чем по локусу 4А,

составив 75% во всех исследованных группах, что свидетельствует о возможности использования его для идентификации дупликации гена ГМГ22

. и рун ::ь 4 ГпТП рм Йа шИ'.'Рь

Рис. 3. Распределение Шетйг аллелей полиморфно]» ДНК-.Шкуса 4А в некоторых тгничееки.х группах ЬЪлкортййтна,: ГГо оси писцисс указаны номера аллелей (со бссиеннос обозначение аллелей: I - аллель с минимальным размером фрагмента, К - с максимальным) . по оси ординат - их частоты.

□ руссы'е ■ татары п озшкиры

Рис. 4, Распределение частот аллелей полиморфного ДНК-локуса О А в некоторых этнических группах Башкортостана.

По полиморфному локусу 9В выявлено 7 аллелей в выборке русских и по 6 аллелей в выборках татар и башкир. Наиболее частыми во всех группах являются аллели М)№ 2, 3. 4 и 5, их частота варьирует от 13 до 35% среди русских, от 14 до 37% среди татар и от 16 до 30% среди башкир (рис. 5). Показатели фактической гетерозиготное™ но данному локусу варьирую! от 68% среди русских до 83% V башкир (таблица Г). Таким образом, локус 9В является достаточно информативным полиморфным маркером, особенно для башкир.

з з л а а 7

Я тага ^ И

Рис. 5. Распределение частот аллелей полиморфного Л'¡К-локуеа Ш 1! некоторых 'VI ннческих группах Башкортостана.

Таблица 1. Индексы фактической и теоретической гет ерю зигот пост и

полиморфных л Оку сов 4А, 9А и 913

в этнических группах русских, татар и башкир.

■ Л о кус 1 етерознготносп. В цолом

Русские Татары 1>;»шк!фы

фактическая ■теоретическая фактическая теорети ческая фактическая теоретическая фак-1 тич. теор-тич.

4 А 0,57 0,77 0,66 0,70 0,60 0.80 0,61 0,76

9 А 0.75 0,79 0,75 0,77 0.75 0,77 0,75 0,76

9Й 0,68 0.76 0,70 0,73 | 0,83 0,80 0,74 0,76

3. Поиск мутации и полиморфизмов в генах РМР22, 0\1В1, МРХ н НО'Я2.

В семьях больных без дупликации гена РМР22 (127 больных из 94 семей) проведём 58бР'-анализ всех экзонов генов РМР22> (1./Н!. МРИ, и ЕСк2.

В гене РМР22 обнаружен одии тип изменения подвижности однонитевой Щ [К в участке, включающем часть третьего интроиа и четвертый экзон (рис 6). Последующее семченирование данного образца выявило замену гуанина на аденин в мнтрошюй области гена РМР22 влюжнкснии С..300-290>А (рис.6).

Пдск&рьку данное изменение ранее не описано в литературе, а в нашей выборке обнаружено в единичном случае, достаточно сложно предположить о его роли в развитии НМСН. В результате данной нуклеотидной замены не происходит изменения сайта рестрикции для каких-либо из изпестных эпдонуклеаз.

В результате 53СР-анализа единственного кодирующего экзона гена СЛИ было выявлено 4 различный типа изменения подвижности однонитевой ДНК. При последующем секвенироьании определены четыре мутаций: Рго87А1а. А1^22С1п, 'ПнВбПс и А?^15а1т

С наибольшей частотой (4,42% в общей выборке больных с НМСН и 19.40% среди больных с НМС11 1) среди пациентов НМСН из Башкортостана выявлена трансверсия С на С в 254 положении нуклеотидной последовательности, приводящая к замене пролина (ССС) па аланпн (ССС) в 87 положении аминокислотной последовательности белка (Рго87А1а) (рис. 7). С наибольшей частотой данная мутация выявлена среди больных - башкир по этнической принадлежности () 8,52% в выборке больных башкир, без дифференциации на типы НМСН), реже - среди русских (11.9%) и татар (5,40%). Согласно опубликованным данным, эта мутация встречается у пациентов из Бельгии (КеКк е! а!.. 1997) и не обнаружена ранее среди болы и,1« НМСН из России. Мутация локализована но втором трансмембранном домене белка и, согласно данным (АЬгат® е1 а!.. 2000), приводи':1 к уменьшению диаметра каналов щелевого соединения, что препятствует прохождению по

Рис; 7. 8ЙСР -- анализ и се кассирша пне первого типа изменения подвижности однонитевой ДНК 1-ена 0.1В 1 (2$9С С). Дорожка 5 - маркер молекулярного веса. 3,4 -образцы ДИК контрольных здоршш^ индивидов, 2. 6 - пдиоцецочечпые фрагменты ДНК больных НМС11 с измененной подвижностью первого тина.

Мутация была подтверждена с помошыо ПДРФ-анализЗ с использованием рестриктазы Acit в стандартных условиях,

Секвенциомный анализ образцов ДНК со II типом изменения подвижности однонитевой ДНК (рис. 8) выявил наличие замены гуанина на аденпн в 65 положении (65G>A), что приводит к замене аргинина (CGA) на 1'лутамин (САА) н 22 положении аминокислотной последовательности белка (Arg22Gln). Миссеис мутация Arg22Gln выявлена у трех больных из двух семей татарской этнической принадлежности, что составило 1,53% для общей выборки неродственных пациентов из РЬ, без дифференциации на типы заболевания и 2,93% лля йоЩшх НМСН I типа. Данная мутация ранее описана в семьях больных Японии (Matsuyama fit аЦ2£Ю1'). Германии (Scnderek et al., 1998), Финляндии (Si[antler et al, 1997), а также обнаружена в России (Фетодов. 2003).

Рис. 8. SSCP-анализ и ссквенирование II типа изменения п гене CJFU (650А),

При III типе |.ЗСР- изменения е одной семье татарской этнической принадлежности выявлена мутация - замена цптозина на тимии в 257 положении нуклеотидной гюследонательное™, приносящая к замене треонина на изолейцин и 86 положении аминокислотной последовательности белка Сх32 (11н'8611е) (рис. 9). Частота мутации составила 0,76% для общей выборки больных НМСН И 1,49%.для НМСН [ типа.

Рие* 9. Картину 5>)'СРг|налГОй и секяйЩговаиня 111 типа изменения а гене GJB1 (251С -Г),

Данная мутация ранее не описана и литература и не зафиксирован;! в оаж данных (www.molgen.Lia.ac.bt'/CMTMulations), Относительно функциональной значимости мутации ТЬгЯбПе можно сделать предположение на основании места ее расположения - во втором транс мембранном домене белка Сх32, в непосредственной близости с колоном Й7, где описана мутация Рш87А1а. Вероятно, что мутация TlirSólte, так же. как и Рго87А1а, Может приводить к нарушению межклеточного транспорта за счет изменения структуры молекул коннексина 32 в составе конпексонов и, соответственно, образуемых ими щелевых соединенно. Можно также отметить, что при данной мутации полярная аминокислота треонин, способная формировать сложные водородные связи в структуре молекулы белка, заменяется на мегюлярную аминокислоту изолейцнн, обладающую, благодаря наличию углеводородного радикала, гидрофобными свойствами. Вероятно, что такое замещение аминокислот в последовательности белка играет немаловажную роль в его структуре и функции.

При четвертом типе SSCP-измеиепия (рис. 10) в гене GJB! у двух неродственных больных идентифицирована замена гуанина на адепии в 44 положении нуклестщной последовательности (44G>A), что привело к замене аргинина на глутамип в 15 положении аминокислотной последовательности (Ai'glSGln); Частота мутации составила 1.53% для обшей кыборки больных НМСН и 2,08% для болын,IX с НМСН I типа. Мутаиия локализована в пптоплазматическом домене белка. Согласно литературным данным, эта мутация изменяет функцию белка, влияя на проведение возбуждающих импульсов «I а!.. 1904).

Рис, 1(1. 55СР-ипя'11Й и ееквениртвацгй IV типа изменения гена 0.1В1 (440 А).

Для всех выявленных мутаций в гене СиВ! были определены ген от и Л Й и гаплотины по 8 полиморфным микросателлитным ДМК-локусам, сцепленным с геном (таблица 2). Для 5 из этих 8 л о кусов было пршедено исследование полиморфизма в контрольной выборке здоровых мужчин из РЕ,

Таблица 2 Генотипы и гаплотипы по 8 полиморфным маркерам у больных НМСНI с мутациями в гене С№1

Больные НМСН

Маркер Координата Рго87А1а Аг£22С1П ТМбНе

тпн 80 27 0 29 0 32 0 43 0 58 0 64 0 70 0 72 0 73 0 80 0 88 0 89 0 25 0 65 0 69 0 66 0

М м ж ж м м м ж ж м м м м м м ж м

0X88040 68163 4 3 3/4 3/4 4 3 4 3/3 3/3 4 4 3 3 3 3 4/5 3

0X81216 68281 4 3 4/4 3/4 4 4 4 3/2 2/4 4 4 4 4 3 2 2/3 4

0X88111 68410 3 2 4/3 1/3 3 3 3 3/3 3/3 3 3 3 3 1 1 1/3 2

0X8983 69365 3 3 3/3 3/3 3 3 4 4/4 3/3 3 3 3 3 2 3 3/4 2

0X88107 69637 2 2 2/2 2/2 2 2 2 2/3 2/2 2 2 2 2 2 2 2/2 2

ОХБ8052 69730 6 6 6/7 6/5 6 6 6 7/6 6/7 6 6 6 2 7 7 7/9 7

аВ1 70361

0X86743 71281 3 3 3/3 1/3 3 3 3 1/3 1/3 3 3 3 3 1 1 1/1 1

0X88070 72572 2 2 1/1 2/2 2 2 2 2/2 2/2 2 2 2 2 1 1 1/2 1

что позволило рассчитать показатели неравновесия по сцеплению выявленных у больных аллелей с частой мутацией Рго87А1а (таблица 3) Таблица 3. Частоты аллелей полиморфных локусов гена у больных с

мутацией Рго87А1а и в контрольных выборках, и их неравновесие по сцеплению с данной мутацией

Маркер Аллель Частоты аллелей -> X Р 5

бопьные з юровые

йХБШО 3 0,50 0,53 0,05 <0,0001 -0,07

4 0,50 0,35 1,09 0,35 0 23

0X81216 4 0,86 - - - -

3 0,14 - - - -

ОХ88111 3 0,93 0,33 16,27 0,0001 0,89

2 0,07 0,43 6,42 0,62 -0,64

ОХ8983 3 0,86 0,43 8,16 0,007 0,75

4 0,14 0,30 1,42 0.33 -0,22

йХ88107 2 1,0 0,75 4,76 0,03 1

0X88052 6 1,0 0,15 38,29 0,0001 1

СЗВ1 Рго87А1а

ОХ86743 3 1,0 - - - -

0X88070 3 0,97 - - - -

1 0,07 - - - -

Примечание Для выборки здоровых доноров приведены только а плели, выявленные у больных

Как видно из таблицы 3, наибольшие значения показателя неравновесия по сцеплению установлены для аллелей локусов 0X58107 и 0X88052 (100% сцепление), достаточно высоки они и для локусов ОХ88111 (аллельЗ) и 0X8083 (аллель 3) По локусам ОХБ1216 DX.Se7-13 и 0X88070 анализ полиморфизма среди здоровых доноров не проведен что не позволило рассчитать показатели неравновесия по сцеплению однако по этим локусам у больных наблюдается высокая частота определенных ал тел ей. что, с большой вероятностью, может свидетельствовать о их сцеплении с мутацией Подтверждение этому может являться и тот факт, что по локусам ОХБ1216 и 0X88070 аллели, не совпадающие у разных больных, отличаются между собой на один динуклеотидный повтор, что может быть результатом мутации, характерной для микросателлитных ДНК-локусов (таблица 2)

Таким образом, у всех больных с НМСН I из РБ, имеющих мутацию Рго87А1а в гене СЛ?/, определяется общий гаплотип по локусам 0X51216-0X58111-0X5983-0X58107-0X58052-0X86743-0X58070 4-4-3-3-2-6-3-2, чго свидетельствует о распространении данной мутации на территории РБ в результате эффекта основателя

Всего в гене йЛИ мутации были выявлены у 26 больных НМСН I из 16 неродственных семей Мутация Рго87А1а обнаружена у 21 больного из 13 неродственных семей, А!£2201п - у 3 неродственных больных, ТЬг86Пе - у 1 больного и его тети, не имеющей клинических признаков НМСН, Аг§1501п- у 2 неродственных больных В контрольной группе здоровых доноров ни одна из этих мутаций не обнаружена

У большинства больных с выявленными мутациями в гене ОЛИ были проанализированы основные клинические признаки НМСН При мутации Рго87А1а были выявлены парезы в дистапьных отделах нижних конечностей у 20 (95,2%) человек, в большинстве случаев (57,1%) - тяжелой, реже умеренной (23,8%) и легкой (14,3%) степени Верхние дистальные парапарезы встречались у 16 (76,2%) больных, из них у 4 (19,0%) пациентов - тяжелой, у 7 (33,3%) -средней и у 5 (23,8%) - легкой степени тяжести У всех пациентов данной группы (100,0%) выявлено снижение или отсутствие глубоких рефлексов в нижних конечностях, гипорефелексия в верхних конечностях обнаружена у 16 человек (76,2%) Гипотрофии в дистальных отделах ног наблюдались у 20 (95,2%) пациентов, в дистальных отделах рук - у 19 (90,5%) Гипотрофии в проксимальных отделах конечностей отмечены лишь у 10 (47,6%) больных У 18 (85,7%) обследованных отмечалась деформация стоп У 14 (66,7%) больных наблюдались контрактуры в суставах У 10 (47,6%) больных выявлено снижение поверхностной, у 7 (33 3%) - глубокой чувствительности Постуральный тремор в пальцах кистей рук отмечен у 11 (52,4%) обследованных Выраженный тремор конечностей, головы наблюдался у 1 (4,8%) пациента Вегетативно-трофические расстройства были выявлены у 11 (52,4%) больных

У больных с мутацией Arg22Gln наблюдались нижние парапарезы легкой степени тяжести у 2 (66,7%) больных, тяжелый парапарез дистальных отделов нижних конечностей - у 1 (33,3%) больного В верхних конечностях у 2 пациентов выявлены парезы легкой и умеренной степени тяжести, составившие 33,3% для каждой степени, соответственно У всех 3 пациентов (100,0%) выявлена гипорефлексия в руках, снижение глубоких рефлексов в ногах отмечено лишь у 1 (33,3%) обследованного Гипотрофии в дистальных отделах ног выявлены у всех больных, в дистальных отделах рук — у 2 (66,7%) Ни у одного пациента не отмечено расстройств поверхностной чувствительности, лишь у 1 (33,3%) обнаружено снижение глубокой чувствительности Гипотрофии в проксимальных отделах конечностей, постуральный тремор у пациентов данной группы не встречались Вегетативно-трофические расстройства наблюдались у 1 (33,3%) больного

У одного больного с впервые выявленной мутацией Thr86Ile первые признаки заболевания (трудности при ходьбе, спотыкание) появились в возрасте 13 лет Со стороны черепных нервов отмечен горизонтальный билатеральный мелкоразмашистый нистагм Обнаружено нарушение осанки в виде сколиоза Стопы деформированы по типу pes cavus Отсутствовали парезы в мышцах дисчальных отделов нижних конечностей, выявлялось легкое снижение силы мышц дистальных отделов верхних конечностей В проксимальных отделах ног сила мышц была снижена до 4 баллов, в проксимальных отделах рук парезов не было Глубокие и периостальные рефлексы в конечностях отсутствовали У пациента наблюдалась умеренная гипотрофия мышц голеней и стоп, легкая - мышц кистей Клиническими особенностями, выявленными при обследовании, являлись спонтанные и вызванные фасцикуляции в мышцах бедер и плеч При обследовании сестры матери пробанда, являющейся носительницей мутантного гена, было выявлено, что она фенотипически здорова

В гене MPZ у больных НМСН с отсутствием дупликации гена РМР22 проведен SSCP-анализ всех шести экзонов и промоторной области, который выявил наличие одного типа изменения в структуре однонитевой ДНК в шестом экзоне гена Секвенц'ионный анализ данного образца идентифицировал замену цитозина на тимин в 714 положении нуклеотидной последовательности (714С>Т), что привело к синонимичной замене аминокислоты серина в 238 (AGOAGT) положении белка миелина (Ро - myelin protein zero) Данное изменение обнаружено в гетерозиготном состоянии у двух лиц татарской этнической принадлежности с диагнозом НМСН I типа Для подтверждения наличия данной нуклеотидной замены был проведен ПДРФ-анализ с использованием фермента Rsa I 714

Нормальная последовательность i

673 С AG ACG CCA GTG CTG TAT GCA ATG CTG GAC CAC AGC AGA AG C 225 Gin Thr Pro Val Leu Tyr Ala Met Leu Asp His Ser Arg Ser

238

Измененная последовательность

673 CAG ACG CCA GTG CTG TAT GCA ATG CTG GAC CAC AGC AGA AG Г 225 Gin Thr Pro Val Leu Tyr Ala Met Leu Asp His Ser Arg Sei

В гене EGR2 у больных НМСН из Башкортостана был проведен SSCP -анализ всех кодирующих последовательностей, который не выявил никаких изменений подвижности однонитевой ДНК

Таким образом, в результате анализа четырех генов методами SSCP-анализа и последующего секвенирования у больных с НМСН I типа из Республики Башкортостан было установлено, что наиболее частыми являются дупликация гена РМР22 и мутации в гене коннексина 32 (GJB1), являющиеся причиной забопевания в 79,1% семей На основании проведенного исследования был разработан алгоритм ДНК-диагностики НМСН, оптимальный для исследованного региона (рис 11)

Определение дупликации/делеции гена РМР22

НМСН I (СПИ<38 м/с)

Мутация обнаружена => НМСН 1А

/\

Мутация не обнаружена => поиск мутаций в гене С.УВ/, в первую очередь - Рю87А1а

/\

Мутация обнаружена НМСН IX

Мутация не обнаружена => поиск мутаций в генах РМР22 мрг

Мутация обнаружена => форма НМСН установлена

Мутация не обнаружена

Рис. 11. Схема алгоритма ДНК-диагностики НМСН I в РБ

ВЫВОДЫ

1 Показано, что в Республике Башкортостан среди наследственных моторно-сенсорных нейропатий преобладающей формой заболевания является НМСН1А, обусловленная дупликацией гена РМР22, частота которой составляет 52,24% среди НМСН 1 типа и 26% -среди всех форм НМСН В результате поиска других мутаций в гене РМР22 выявлен интронный полиморфизм 309-29 в>А у одного больного НМСН I, не обнаруженный в контрольной группе

2 В результате анализа полиморфизма трех ДНК-локусов, сцепленных с геном РМР22, определены частоты их аллелей и показатели гетерозиготности в выборках здоровых доноров русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан, свидетельствующие о возможности использования данных ДНК-маркеров для идентификации дупликации/делеции гена РМР22 у больных НМСН из РБ

3 В гене коннексина 32 (GJB1) у больных с НМСН из РБ выявлено 4 мутации Pro87 Ala (с 259C>G), с частотой 19,40% среди больных НМСН I типа, Arg22Gln (с 65G>A) (2,98%), Argl5Gln (с 44G>A) (2,98%) и Thr86Ile (с 257С>Т) (1,49%), последняя из которых ранее не описана

4 Мутации в генах MPZ и EGR2 являются редкой причиной развития НМСН у больных из РБ в гене MPZ у двух больных татарской этнической принадлежности обнаружен полиморфизм Ser239Ser (с 714 С>Т) в гетерозиготном состоянии (2,98%), не выявленный в группе контроля, ранее не описанный, в гене EGR2 изменений нуклеотидных последовательностей у больных с НМСН не выявлено

5 По 8-ми полиморфным микросагеллитным ДНК-локусам, сцепленным с геном GJBI, установлен обший для больных гаплотип, сцепленный с мутацией Рго87А1а, что свидетельствует о ее распространении в регионе в результате эффекта основателя

6 Определены основные клинические характеристики больных НМСН 1 с выявленными мутациями Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I, оптимальный для жителей Республики Башкортостан

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Latypova Е G (Bagautdinova), Krupina N, Magzhanov R , Khusnutdinova E, Khidiytova I Genes PMP22 duplication screening in patients with hereditary motor and sensory neuropathy from Bashkortostan // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference -Amsterdam, 2006 - V 14 - P 306

2 Латыпова Э Г (Багаутдинова), Крупина Н Б, Магжанов Р В, Хуснутдинова Э К , Хидиятова И М Скрининг дупликации гена РМР22

у больных наследственной моторно-сенсорной нейропатией из Башкортостана // Тезисы докладов 10 Путинской школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - наука XXI века» - Пу щино, 2006 - с 76

3 Латыпова Э Г (Багаутдинова), Крупина Н Б, Хидиятова И М Анализ дупликации гена РМР22 и поиск мутаций в гене Сх32 у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан // Тезисы докладов научно-практической конференции «Человек и его здоровье» - Санкт-петербург, 2006 -с 153

4 Latypova Е (Bagautdmova), Krupina N , Magzhanov R , Khusnutdinova E , I Khidiytova I Duplication fiequency analysis of PMP22 gene in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan //Balkan Journal of Medical Genetics - 7th Balkan Meeting on Human Genetics - Skopje, 2006 - V 9 - P 86

5 Крупина H Б, Латыпова Э Г (Багаутдинова), Магжанов Р В Эпидемиологическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий и анализ частоты дупликации гена РМР22 у больных в Республике Башкортостан // Тезисы IX Всероссийского съезда неврологов - Ярославль, 2006 - с 94

6. Крупина Н Б, Хидиятова И М, Латыпова Э Г (Багаутдинова), Магжанов Р В, Хуснутдинова Э К Клинико-эпидемиологическое исследование наследственных моторон-сенсорных нейропатий и скрининг дупликации гена РМР22 у больных в Республике Башкортостан //Медицинская генетика -2006 -№11 -с 126-128

7 Latypova Е G (Bagautdmova), Khidiytova I М , Krupina N В , Magzhanov R V , Khusnutdinova E К Analysis of connexin 32 gene (GJB1, Cx32) in the hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) patients from Bashkortostan // Abstracts of European Journal of Human Genetics Conference Nice 2007 European Human Genetics - V 15 - P 202

8 Латыпова Э Г (Багаутдинова), Крупина Н Б, Магжанов Р В, Хуснутдинова Э К , Хидиятова И М Анализ гена коннексина 32 (GJB1, Сх32) у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями (НМСН) из Башкортостана // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона -Уфа, 2007 - с 76

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

НМСН - наследственная моторно-сенсорная нейропатия

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБ - Республика Башкортостан

ЭНМГ - электронейромиография

Сх32 - connexin 32, коннексин 32

EGR2 — early growth response, фактор раннего роста 2

GJB1 - gap junction betta 1

MPZ- myelin protein zero, миелиновый гликопротеин P(0)

PMP 22 - peripheral myelin piotem 22, структурный белок периферического миелина

SSCP - single strand conformation polymorphism, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

Отпечатано на оборудовании типографии РНТИК «Башгехинформ» тираж 50 экз

450077 РБ г Уфа, ул Кирова, 15 теп (347)272-10-37 272-41-20

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Багаутдинова, Эльвира Газинуровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клиническая характеристика и эпидемиология наследственных моторно-сенсорных нейропатий.

1.2. Молекулярно-генетические основы НМСН.

1.2.1. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии первого типа (миелинопатии).

1.2.2. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии второго типа (аксонопатии).

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

11.1. Материал для исследования.

11.2. Методы исследования.

II.2.1. Выделение геномной ДНК.

И.2.2. Идентификация дупликации гена РМР22.

11.2.3. Исследование генов РМР22, GJB1 (Сх32), MPZn EGR

11.2.4. Анализ полиморфных ДНК-локусов, сцепленных с геном

GJB1 (Сх32).

11.2.5. SSCP-анализ.

11.2.6. Определение нуклеотидной последовательности.

11.3. Рестрикционный анализ.

11.4. Статистическая обработка результатов.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 III. 1. Определение частоты дупликации/делеции гена РМР22 в выборке больных НМСН из Башкортостана.

III. 1.2. Анализ полиморфизма ДНК-локусов 4А, 9А и 9В, сцепленных с геном РМР22, в некоторых этнических группах Башкортостана.

III.2. Поиск мутаций и полиморфизмов в генах РМР22, GJB1 (Сх32'),

MPZ и EGR

111.2.1. Анализ гена РМР22.

111.2.2. Анализ гена GJB1 (Сх32).

111.2.3. Анализ генов MPZ и EGR2.

111.3. Анализ ассоциаций мутаций в гене GJB1 (Сх32) с гаплотипами по полиморфным локусам.

111.4. Алгоритм ДНК-диагностики НМСНI типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан"

Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) - это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической нервной системы, поражающих миелиновые оболочки, аксоны двигательных и чувствительных волокон, а также спинномозговых корешков. НМСН являются одними из самых распространенных наследственных болезней нервной системы человека. В среднем, в мире их распространенность составляет 10,0 на 100000 населения, варьируя от 0,1 до 41,0 на 100000 населения, но большинство показателей находится в пределах 4,0-15,0 на 100000 [Руденская Г. Е., 1998; Emery А., 1991; Ionasescu V., 1995]. В последние десятилетия и в нашей стране активно ведутся работы по изучению распространенности НМСН. Согласно этим данным, чаще заболевание встречается в Воронежской области (12,5 на 100000), в Самарской (11,0 на 100000) и Амурской (10,7 на 100000) областях [Федотов В. П., 2002; Вяткина С. Я., 1991; Хоменко Е. И., 1982, 1983]. В Башкортостане распространенность всех типов НМСН составляет 10,3 на 100000 населения [Крупина Н. Б. с соавт., 2006].

В зависимости от характера поражения нервных волокон, НМСН подразделяются на два основных типа - димиелинезирующий (НМСН I) и аксональный (НМСН II), клиническая дифференциация которых возможна только на основе электронейромиогрфического исследования, выявляющего скорость проведения импульса (СПИ) по срединному нерву. К каждому из этих типов заболевания относится целый ряд генетически различных форм заболевания. В настоящее время картировано более 25 генов, ответственных за развитие НМСН, 22 из которых идентифицированы [http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html]. Известные формы НМСН, несмотря на существование определенных особенностей, имеют много общих как клинических, так и электронейромиографических признаков, что значительно затрудняет их диагностику, в том числе дифференциальную. Поэтому самым точным методом диагностики НМСН, становящимся все более доступным в наше время, является ДНК-анализ, позволяющий проводить не только дифференциальную, но также пренатальную и пресимптоматическую диагностику в отягощенных НМСН семьях. При этом, молекулярно-генетическое исследование НМСН является и основой изучения патогенеза данной группы заболеваний.

Большинство из известных генов, мутации в которых приводят к развитию НМСН, кодируют белки, непосредственно участвующие в структурной и функциональной организации миелина периферических нервных волокон. Согласно литературным данным, в странах Европы и США наиболее распространена НМСН I типа, среди которого наиболее частой является форма НМСН1А (СМТ1А). Генетической причиной развития данной формы является дупликация 1,5 Mb в хромосомной области 17р 11.2-12, включающей ген белка периферического миелина (РМР22) [Timmerman V. et al., 1990, Patel P. et al., 1990, Lebo Y. et al., 1992]. Наряду с дупликацией/делецией, в гене РМР22 обнаружено более 60 точковых мутаций, приводящих к развитию НМСН. Второй по частоте считается Х-сцепленная форма НМСН IX, обусловленная мутациями в гене коннексина 32 (Сх32, GJB1) - структурного белка межклеточных каналов, обеспечивающих факультативный транспорт ионов и небольших молекул между соседними слоями миелина. Нормальное функционирование щелевого соединения между соседними шванновскими клетками обеспечивает сальтаторный характер проведения возбуждения по миелиновой оболочке периферических нервов [Bruzzone R. et а1.,1996]. В настоящее время описано 296 различных мутаций гена GJB1, спектр и частота которых различны в разных популяциях [http://www.molgen.ua.ac.be/ CMTMutations]. Другим важным геном, мутации в котором приводят к развитию целого ряда форм НМСН, является ген MPZ (myelin protein zero, Ро), кодирующий основной белок миелина, составляющий 50% всех белков миелина периферической нервной системы. Основной функцией белка является сближение соседних пластин миелиновых структур, что обеспечивает их стабилизацию и компактизацию. В гене MPZ описано уже более 120 мутаций, обнаруженных в разных регионах мира. Более редкой, но все же имеющей место причиной НМСНI типа, является нарушение структуры гена EGR2 (early growth response gene - 2). Считается, что этот ген экспрессируется в раннем эмбриогенезе и является транскрипционным фактором для, так называемых, поздних миелиновых генов, таких как MPZ и МБР (myelin basic protein). В настоящее время в гене EGR2 описано только 9 мутаций и один полиморфизм. Следует отметить, что мутации в выше указанных генах могут приводить к различным формам НМСН, относящимся не только к НМСН I типа, но также к НМСН II и промежуточного типов. Поэтому, при проведении молекулярно-генетического изучения данной группы заболеваний в определенном регионе, как правило, в первую очередь исследуются именно эти гены.

В Республике Башкортостан (РБ) эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование НМСН начато в последние годы: установлена территориальная и этническая неравномерность распространения заболевания, преобладание по частоте НМСН I типа. Однако, молекулярно-генетический анализ включал только определение дупликации/делеции гена РМР22, показавшее несколько более низкий уровень частоты данной мутации в РБ (45% среди НМСН I) [Крупина Н. Б. с соавт., 2006], по сравнению с другими регионами России. В связи с этим, актуальным является продолжение исследования роли ряда известных генов в развитии НМСН у больных из РБ, являющееся основой для разработки наиболее оптимального для региона алгоритма ДНК-диагностики данной группы заболеваний.

В настоящее время банк ДНК больных НМСН из РБ расширен, что требует и продолжения определения дупликации/делеции гена РМР22. Кроме того, следует отметить, что при проведении идентификации данной мутации методом регистрации дозы гена с помощью двух микросателлитных маркеров, в ряде случаев возникала необходимость анализа полиморфизма дополнительных ДНК-локусов. Это определило актуальность подбора высокополиморфных маркеров, сцепленных с геном РМР22, удобных для ПЦР-анализа и характеризующихся высокой степенью гетерозиготности среди населения исследуемого региона.

Целью исследования явился анализ структурных особенностей генов РМР22, Сх32, MPZ, EGR2 у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Башкортостана и разработка оптимального для региона алгоритма ДНК - диагностики данной группы заболеваний.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов генов РМР22, Сх32, MPZ и EGR2 у больных с НМСН из РБ и в контрольной выборке.

2. У больных с выявленными мутациями определить гаплотипы по полиморфным локусам, маркирующие мутантные хромосомы.

3. Охарактеризовать клинические особенности НМСН у больных с выявленными мутациями в исследованных генах.

4. С целью оптимизации метода выявления дупликации/делеции гена РМР22 провести анализ полиморфизма трех сцепленных с геном минисателлитных ДНК - локусов в популяциях русских, башкир и татар - жителей Башкортостана.

5. Разработать на основе полученных данных оптимальный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики НМСН.

Научная новизна

В результате проведенного исследования впервые в Республике Башкортостан изучены спектр и частота мутаций в генах РМР22, GJBl(Cx32), MPZ и EGR2 при НМСН I типа. Выявлено 4 различных мутации в гене GJB1, одна из которых Рго87А1а является частой в РБ (19,40% среди НМСН I типа), сцепленной с общим гаплотипом; мутация Thr86Ile, выявленная с частотой 1,49% среди НМСН I типа, ранее не описана. С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 проведен анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных локусов среди жителей РБ, показавший высокие показатели гетерозиготности и возможности их использования для диагностики данной мутации.

Научно-практическая значимость

Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических причинах развития НМСН в Башкортостане. На основе данных по спектру и частоте генетических вариантов НМСН разработан оптимальный для нашего региона алгоритм поиска мутаций у больных с НМСН I типа. Полученные результаты могут быть использованы для уточнения диагноза, а также позволяют проводить пренатальную ДРЖ-диагностику НМСН в семьях с идентифицированными мутациями. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Высокая частота распространения формы НМСН IA среди больных НМСН из Республики Башкортостан.

2. Высокий уровень гетерозиготности трех микросателлитных локусов, сцепленных с геном РМР22, у жителей РБ и возможность их использования для диагностики дупликации/делеции данного гена.

3. Спектр и частоты мутаций в генах РМР22, GJB1, MPZ и EGR2 у больных НМСН I типа из РБ. Впервые обнаружены мутации Thr86Ile (с.257С>Т) в гене GJB1 и полиморфизм Ser238Ser (с.714С>Т) в гене MPZ.

4. Высокая частота мутации Рго87А1а в гене GJB1 среди больных НМСН I типа из РБ, связанная с эффектом основателя.

5. Основные клинические характеристики больных НМСН I с выявленными мутациями в гене GJB1.

6. Оптимальный для жителей РБ алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I типа, основанный на анализе генов РМР22 и GJB1.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Багаутдинова, Эльвира Газинуровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в Республике Башкортостан среди наследственных моторно-сенсорных нейропатий преобладающей формой заболевания является НМСН 1 А, обусловленная дупликацией гена РМР22, частота которой составляет 52,24% среди НМСН I типа и 26% - среди всех форм НМСН. В результате поиска других мутаций в гене РМР22 выявлен интронный полиморфизм 309-29 G>A у одного больного НМСН I, не обнаруженный в контрольной группе.

2. В результате анализа полиморфизма трех ДНК-локусов, сцепленных с геном РМР22, определены частоты их аллелей и показатели гетерозиготности в выборках здоровых доноров русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан, свидетельствующие о возможности использования данных ДНК-маркеров для идентификации дупликации/делеции гена РМР22 у больных НМСН из РБ.

3. В гене коннексина 32 (GJB1) у больных с НМСН из РБ выявлено 4 мутации: Pro87Ala (c.259C>G), с частотой 19,40% среди больных НМСН I типа; Arg22Gln (c.65G>A) (2,98%); Argl5Gln (c.44G>A) (2,98%) и Thr86Ile (c.257C>T) (1,49%), последняя из которых ранее не описана

4. Мутации в генах MPZ и EGR2 являются редкой причиной развития НМСН у больных из РБ: в гене MPZ у двух больных татарской этнической принадлежности обнаружен полиморфизм Ser239Ser (с.714 С>Т) в гетерозиготном состоянии (2,98%), ранее не описанный; в гене EGR2 изменений нуклеотидных последовательностей у больных с НМСН не выявлено.

5. По 8-ми полиморфным микросателлитным ДНК-локусам, сцепленным с геном GJB1, установлен общий для больных гаплотип, сцепленный с мутацией Рго87А1а, что свидетельствует о ее распространении в регионе в результате эффекта основателя.

6. Определены основные клинические характеристики больных НМСН I с выявленными мутациями. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I, оптимальный для жителей Республики Башкортостан.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) - это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической нервной системы, обусловленных нарушением структурно-функциональной организации миелиновой оболочки или аксонов периферических нервов. В зависимости отхарактера поражения нервных волокон, выделяют два основных типа заболевания - НМСН I типа - миелинопатии, и НМСН II типа -аксонопатии, клиническая дифференциация которых возможна только на основе электронейромиогрфического исследования, выявляющего скорость проведения импульса (СПИ) по срединному нерву. К каждому из этих типов заболевания относится целый ряд генетически различных форм заболевания. В настоящее время картировано более 25 генов, ответственных за развитие НМСН, 22 из которых идентифицированы. Известные формы НМСН, несмотря на существование определенных особенностей, имеют много общих как клинических, так и электронейромиографических признаков, что значительно затрудняет их диагностику, в том числе дифференциальную. Поэтому самым точным методом диагностики НМСН является ДНК-анализ, позволяющий проводить не только дифференциальную, но также пренатальную и пресимптоматическую диагностику в отягощенных НМСН семьях.

Среди наследственных заболеваний нервной системы НМСН являются наиболее частыми, их распространенность, в среднем в мире, составляет 10 на 100000 населения [Руденская Г. Е., 1998; Emery A. et al., 1991; Ionasescu V. et al., 1995]. При этом, как по частоте заболевания, так и по распространенности его отдельных форм наблюдаются выраженные межпопуляционные различия, что делает актуальным исследование региональных особенностей частоты заболевания и выявления генетических причин его развития. Определение спектра и частоты мутаций в генах, ответственных за развитие заболевания, у больных в конкрентном регионе, с учетом их этнической принадлежности является основой для разработки наиболее оптимальной для региона схемы

ДНК-диагностики, направленной, в свою очередь, на улучшение медико-генетического консультирования семей больных и профилактику наследственного заболевания в регионе, в целом. Ранее нами было показано, что в Республике Башкортостан распространенность НМСН всех типов составляет 10,3 на 100000 населения [Крупина Н. Б. с соавт., 2006], а наиболее частота среди них является НМСН 1А, обусловленная дупликацией гена РМР22. При этом, полученное значение частоты данной мутации среди больных НМСН I типа (45%) было значительно ниже, чем в некоторых других регионах России, где было проведено подобное исследование [Федотов В. П., 2002; Вяткина С. Я., 1991; Хоменко Е. И., 1982, 1983].

В ходе продолжающегося активного исследования больных с НМСН в РБ за период с 2006 по 2007 год банк ДНК пациентов и членов их семей был значительно расширен: в настоящее время он представлен 173 больными из 131 семьи и 60 здоровыми членами семей, что составляет, примерно, половину всех семей с НМСН, зарегистрированных в РБ. Это позволило нам продолжить молекулярно-генетический анализ на достаточно репрезентативной выборке больных. Следует отметить, что в РБ у многих больных НМСН ЭНМГ-исследование не проведено (возможно, из-за его дороговизны, или же проживания больных в отдаленных районах, где такая диагностика отсутствует). Кроме того, и ЭНМГ не является абсолютным диагностическим критерием НМСН. Поэтому для молекулярно-генетического исследования мы выбрали скрининговый подход, несмотря на его дороговизну. Нами был проведен поиск мутаций в 4-х генах, ответственных за развитие НМСН I типа у всех больных НМСН из РБ, без дифференциации на типы заболевания. Среди них диагноз НМСН I типа, поставленный на основании клинических и электронейромиографических данных, имели 67 неродственных больных. Такой подход оказался оправданным, он позволил как уточнить до конкретной генетической формы диагноз у больных с уже определенным типом заболевания, так и определить его форму у ряда больных с неизвестным типом НМСН. Частота выявленных мутаций была рассчитана как в общей выборке больных НМСН, так и в выборке НМСН I типа, что позволило детально охарактеризовать структуру НМСН I типа на фоне общей картины распространенности НМСН в РБ.

В результате поиска мутаций в генах РМР22, GJB1, MPZ и EGR2 методом SSCP-анализа и последующего автоматического секвенирования, было установлено, что основными причинами НМСН I типа в РБ являются дупликация гена РМР22, обусловливающая развитие формы НМСН IA, и мутации в гене коннексина 32 (GJB1), детерминирующие форму НМСН IX. Частота НМСН IA составляет 52,24% среди больных НМСН I типа и 26,70% -среди всех больных НМСН. Наиболее часто данна форма заболевания встречается среди лиц татарской и русской этнической принадлежности (соответственно, 37,14% и 31,43% в выборках больных, без дифференцииации на типы заболевания), значительно реже - среди башкир (14,78%). Для идентификации дупликации/делеции гена РМР22 нами был оптимизирован метод регистрации дозы аллелей на основе анализа полииморфизма трех микросателлитных ДНК-локусов, ранее описанных [Latour P. et al., 2001]. С этой целью полиморфизм этих локусов был исследован в трех этнических группах - русских, башкир и татар, наиболее представленных в РБ, - и, на основании установленных высоких показателей гетерозиготности, показана информативность данных ДНК-локусов в качестве маркеров при диагностике дупликации /делеции гена РМР22.

В гене GJB1 у больных с НМСН из РБ выявлено 4 мутации: Рго87А1а (c.259C>G), Arg22Gln (c.65G>A); Argl5Gln (c.44G>A) и Thr86Ile (c.257C>T), последняя из которых ранее не описана.

С наибольшей частотой (9,92% в общей выборке больных с НМСН и 19,40% среди больных с НМСН I) среди пациентов НМСН из Башкортостана выявлена миссенс-мутация Рго87А1а. С наибольшей частотой она обнаружена среди больных - башкир по этнической принадлежности (18,52% в выборке больных башкир, без дифференциации на типы НМСН), реже - среди русских (11,9%) и татар (5,40%). Согласно опубликованным данным, эта мутация встречается у пациентов из Бельгии [Nelis Е. et al., 1997] и не обнаружена ранее среди больных НМСН из России. Мутация локализована во втором трансмембранном домене белка и, согласно данным [Abrams et al., 2000], приводит к уменьшению диаметра каналов щелевого соединения, что препятствует прохождению по нему относительно крупных молекул. Мутация была подтверждена с помощью ПДРФ-анализа с использованием рестриктазы Acil.

Миссенс-мутация Arg22Gln выявлена у трех больных из двух семей татарской этнической принадлежности, что составило 1,53% для общей выборки неродственных пациентов из РБ, без дифференциации на типы заболевания и 2,98% для больных НМСН I типа. Данная мутация ранее описана в семьях больных Японии [Matsuyama W. et al.,2001], Германии [Senderek J. et al., 1998], Финляндии [Silander K. et al., 1997], а также обнаружена в России [Фетодов, 2003].

Миссенс-мутация Argl5Gln (c.44G>A) обнаружена у двух неродственных больных, метисов по происхождению. Частота ее составила 1,53% для общей выборки больных НМСН и 2,98% для больных с НМСН I типа. Мутация локализована в цитоплазматическом домене белка. Согласно литературным данным, эта мутация изменяет функцию белка, влияя на проведение возбуждающих импульсов [Fairweather N. et al., 1994].

Новая, ранее не описанная миссенс - мутация Thr86Ile выявлена в одной семье татарской этнической принадлежности у пробанда и его фенотипически здоровой тети. Частота ее составила 0,76% для общей выборки больных НМСН и 1,49% для НМСН I типа. Предположительно, данная мутация явлется функциональной, но приводит к рецессивному типу заболевания. Такое предположение мы делаем на основании места ее расположения - во втором трансмембранном домене белка Сх32, в непосредственной близости с кодоном 87, где описана мутация Рго87А1а, а также учитывая химическую неравноценность аминокислот: при данной мутации полярная аминокислота треонин, способная формировать сложные водородные связи в структуре молекулы белка, заменяется на неполярную аминокислоту изолейцин, обладающую, благодаря наличию углеводородного радикала, гидрофобными свойствами. Вероятно, что такое замещение аминокислот в последовательности белка может играть немаловажную роль в его структуре и функции.

Всего в гене GJBl мутации были выявлены у 26 больных НМСН I из 18 неродственных семей. В контрольной группе здоровых доноров ни одна из этих мутаций не обнаружена.

Для всех выявленных мутаций в гене GJBl были определены генотипы и гаплотипы по 8 полиморфным микросателлитным ДНК-локусам, сцепленным с геном. Для 5 из этих 8 локусов было проведено исследование полиморфизма в контрольной выборке здоровых мужчин из РБ, что позволило рассчитать показатели неравновесия по сцеплению выявленных у больных аллелей с частой мутацией Рго87А1а и установить общий гаплотип по локусам DXS1216-DXS8111-DXS983-DXS8107-DXS8052-DXS6743-DXS8070: 4-4-3-3-2-6-3-2, что свидетельствует о распространении данной мутации на территории РБ в результате эффекта основателя.

У большинства больных с выявленными мутациями в гене GJBl были проанализированы основные клинические признаки НМСН.

При сравнительном анализе частоты встречаемости отдельных признаков среди пациентов с дупликацией гена РМР22 с больными с мутацией Рго87А1а в гене GJBl и попытке выявить дифференциально-диагностические критерии, у последних обнаружено достоверно более частое вовлечение в патологический процесс проксимальных отделов конечностей, а также тяжелые формы нижнего пареза. В группе пациентов с НМСН IX типа, по сравнению с НМСН IA, реже встречались такие признаки, как постуральный тремор пальцев рук, деформации стоп. В целом, можно отметить более тяжелое течение заболевания у пациентов с НМСН IX по сравнению с НМСН IA, приводящее к более быстрой инвалидизации больных.

У больного с вновь обнаруженной мутацией Thr86Ile не наблюдались характерные для НМСН клинические признаки. Отсутствовали парезы в мышцах дистальных отделов нижних конечностей, выявлялось легкое снижение силы мышц дистальных отделов верхних конечностей, наблюдались умеренная гипотрофия мышц голеней и стоп, легкая - мышц кистей, в проксимальных отделах рук не было парезов. Клиническими особенностями, выявленными при обследовании, являлись спонтанные и вызванные фасцикуляции в мышцах бедер и плеч.

Таким образом, при сравнительном анализе клинических характеристик групп больных НМСН I типа с обнаруженными мутациями в генах РМР22 (дупликация гена) и GJB1 выявляются определенные различия, в большей степени проявляющиеся в распространенности патологическогот процесса и степени тяжести. Однако, учитывая что все выявленные клинические признаки не являются специфическими для какой-то отдельной из исследованных форм НМСН, а также наблюдается внутрисемейный клинический полиморфизм [Крупина Н. Б. с соавт., 2006], их нельзя считать дифференциально-диагностическими критериями для отдельных форм НМСН.

Мутации в генах MPZ и EGR2 являются редкой причиной развития НМСН у больных из РБ: в гене MPZ у двух больных татарской этнической принадлежности обнаружен полиморфизм Ser238Ser (с.714 С>Т) в гетерозиготном состоянии (2,98%), ранее не описанный; в гене EGR2 изменений нуклеотидных последовательностей у больных с НМСН не выявлено.

Таким образом, в результате молекулярно-генетического исследования НМСН в РБ, проведенного на основе детального анализа структуры 4-х генов, ответственных как за I тип, так и за ряд форм НМСН II типа, причина заболевания установлена в 79,1% семей, имеющих больных НМСН I типа. На основании выявленных спектра и частоты мутаций в исследованных генах разработан оптимальный для региона алгоритм ДНК-диагностики данной группы заболеваний, оптимизированы методы идентификации мутаций, что позволит значительно повысить эффективность медико-генетического консультирования семей, отягощенных НМСН, в РБ. В то же время, учитывая значительную гетерогенность заболевания, наличие в РБ больных с НМСН II типа, а также семей с неустановленным типом заболевания, актуальным является продолжение данного исследования, в первую очередь, предполагающего поиск мутаций в ряде генов, мутации в которых наиболее часто обусловливают развитие НМСН II типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Багаутдинова, Эльвира Газинуровна, Уфа

1. Аверьянов Ю. Н., Подчуфарова Е. В., Дубанова Е. А. Наследственная невропатия со склонностью к параличам от сдавления. // Неврол. журнал. -1999. №4. - С.32-37.

2. Вельтищев Ю. Е., Темин П. А. Наследственные болезни нервной системы. -М.: Медицина, 1998. 322 с.

3. Вяткина С. Я. Клинико-генеалогическая и популяционная характеристика наследственных нервно-мышечных заболеваний в Куйбышевской области: автореф. дисс на соискании уч. степени д.м.н. Л., 1991.

4. Горбунова В. Н., Баранов В. С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997.- С.239-240.

5. Горбунова В. Н., Савельева-Васильева Е. А. Молекулярная неврология: в 3 ч. СПб.: Интермедика, 2000. - Ч. I: Заболевания нервно-мышечной системы. -318 с.

6. Давиденков С. Н. Наследственные болезни нервной системы. М.: Государственное медицинское издательство. - 1932. - 375 с.

7. Дадали Е. Л. Наследственные нервно-мышечные заболевания: диагностика и медико-генетическое консультирование. // Автореф. дис. . д.м.н. М. 1999. -35 с.

8. Животовский Л. А. Популяционная биометрия. М.:Наука, 1991.- 271 с.

9. Зенков Л. Р., Ронкин М. А. Функциональная диагностика нервных болезней. // Элктронейромиография. М.: МЕДпресс-информ. - 2004. - 310 с.

10. Ю.Иллариошкин С. Н., Иванова-Смоленская И. А., Маркова Е. Д. ДНК-диагностика наследственных болезней нервной системы. М.: Мед. информ. агентство, 2002. - С. 173-191.

11. Левин О. С. Наследственные моторно-сенсрные невропатии Полинейропатии. М.: Мед. информ. агентство. - 2005. - 496 с.

12. Руденская Г. Е. Наследственные болезни нервной системы в российских и среднеазиатских популяциях: клинико-генетико-эпидемиологическое исследование: дис. д.м.н. М, 1998. - 312 с.

13. Руденская Г. Е., Шагина И. А., Вассерман Н.Н. и др. Наследственная моторно-сенсорная нейропатия с Х-сцепленным доминантным наследованием. // Журн. невропат, и псих. 2001. - т.Ю. - С.8 - 13.

14. Савченко Ю. Н. Невральная амиотрофия Шарко-Мари. // Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1984. - Т. 84. - С. 17181722.

15. Скупченко В. В., Романова Т. В. Клинико-генеалогический и электрофизиологический анализ наследственных моторно-сенсорных невропатий в Самарской области. // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2001. - № 8. - С.8-11.

16. Федотов В. П. Клинико-генетический анализ наследственных моторно-сенсорных нейропатий в Воронежской области: автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 2002.

17. Федотов В. П. Клинико-генетический анализ наследственных моторно-сенсорных нейропатий в Воронежской области. // Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.м.н. Воронеж, 2002. - 25 с.

18. Хоменко Е. И. Клинико-генетическое исследование полиморфизма невральной амиотрофии Шарко-Мари (в Амурской области): автореф. дис. . канд. мед. наук. Новосибирск, 1982.

19. Хоменко Е. И. Распространение и клинический полиморфизм невральной амиотрофии Шарко-Мари в Амурской области. // Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1982. -№11. - С.22-25.

20. Щагина О. А., Мерсиянова И. В., Дадали Е. Л., Федотов В. П., Поляков А. В. Картирование и идентификация генов болезни Шарко-Мари-Тута второго типа. // Мед.генетика. 2005. - Т.4. - №8. - С.378-382.

21. АЬе К. Т., Lino А. М., Hirata М. Т. A novel stop codon mutation in the PMP22 gene associated with a variable phenotype. // Neuromuscular disorders. 2004. -Vol.14.-№ 5.-P.313-20.

22. Abrams К. C., Oh S., Ri Y., Bargiello A. Thaddeus. Mutations in connexin 32: the molecular and biophysical bases for the X-linked form of charcot-marie-Tooth disease. // Brain. 2000. - Vol.32. - P.203-214.

23. Ainsworth P. J., Bolton C. F., Murthy В. C. et al. Genotype/phenotype correlationin affected individuals of a family with a deletion of the entire coding sequence of the connexin 32 gene. // Hum. Genet. 1998. - vol.103. - P.242-244.

24. Auer-Grumbach M., De Jonghe P., Wagner K., Verhoeven K., Hartung H.- P., Timmerman V. Phenotype-genotype correlations in a CMT2B family with refined 3ql3-q22 locus. //Neurology.-2000. Vol.55.- P. 1552-1557.

25. Auer-Grumbach M., Strasser-Fuchs S., Robl T. Late onset Charcot-Marie-Tooth 2 syndrome caused by two novel mutations in the MPZ gene. // Neurology. 2003. -Vol.61.- №10. -P.1435-7.

26. Bach D. et al. Mitofusin 2 determines mitochondrial network architecture and itochondrial metabolism. A novel regulatory mechanism altered in obesity. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol.278. - №19. - P.l7190-7.

27. Balice-Gordon R. J., Bone L. J., Scherer S. S. Functional gap junctions in the Schwann cell myelin shearth. // J. Cell Biol. 1998. - Vol.142. - P.1095-1104.

28. Beckett J., White B. N., Simpson N. E., Ebers G. C., Holden J, MacLeod P. M. A linkage study using DNA markers localizes the gene for X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease at Xql3-Xq22. // Cytogenet. Cell Genet. 1985. -vol.40.-P.579.

29. Barankova L., Vyhnalkova E., Zuchner S., Mazanec R. et al. GDAP1 mutations in Czech families with early-onset CMT. // Neuromuscular Disorders. 2007. -Vol.17.-P.482-489.

30. Ben Othmane K. et al. Localization of gene (CMT2A) for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 to chromosome lp and evidence of genetic heterogeneity. // Genomics. 1993. - Vol.17. - P.370-375.

31. Berger P., Niemann A., Suter U. Schwann cells and the pathogenesis of inherited motor and sensory neuropathies (Charcot-Marie-Tooth disease). // Glia. 2006. -Vol.54. -P.243-257.

32. Bergoffen J., Scherer S. S., Wang S., Scott M. 0., Bone L. J., Paul D. L., Chen K., Lensch M. W., Chance P. F., Fischbeck К. H. Connexin mutations in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. // Science. 1993. - Vol.24. - P.2039-42.

33. Bone L. J., Deschenes S. M., Balice-Gordon R. J., Fishbeck К. H., Scherer S. S. Connexin 32 and X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. // Neurobiology of disease. 1997. - Vol.4. -P.221-230.

34. Brewis M., Posnanker D., Rolland C., Miller H. Neurological diseases in an English city. // Acta. Neurol. Scand. 1966. - Vol.42. - Suppl.24. - P. 1-89.

35. Bruzzone R., White T. W., Paul D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling// Eur. J. Biochem. 1996. - Vol.238, №1 -P. 1-27.

36. Chance P.F., Fischbeck К. H. Molecular genetics of Charcot-Marie-Tooth disease and related neuropathies. // Hum. Mol. Genet. 1994. - Vol.3. - P.1503-1507.

37. Chapon F., Latour P., Diraison P. Axonal phenotype of Charcot-Marie-Tooth disease associated with a mutation in the myelin protein zero gene. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1999. - Vol.66. -P.779-782.

38. Cho H-J., Sung D. H., Kim B. J. and Ki C.-S. Mitochondrial GTPase mitofusin 2 in Korean patients with Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2. // Clin. Genet. -2007.-Vol.71.-P.267-272.

39. Choi B.-O., Lee M. S., Shin S. H., Hwang J. H., Choi K.-G., Kim W.-K., Sunwoo I. N., Kim N. K., Chung K. W. Mutational analysis of PMP22, MPZ, GJB1, EGR2 and NEFL in Korean Charcot-Marie-Tooth neuropathy patients. // Mutation in Brief. 2004. - Vol.732.

40. Dejerine J., Sottas J. Sur la nevrite interstitielle hypertrophique progressive de l'enfance. // Сотр. Rend. Soc. Biol. 1893. - Vol.45. -P.63-96.

41. De Jonghe P., Timmerman V., Nelis E., Martin J. J., Van Broeckhoven C. Charcot-Marie-Tooth disease and related peripheral neuropathies. // J. Peripher. Nerv.Syst. -1997. -vol.2. -P.2703-2716.

42. De Jonghe P., Timmerman V., Nelis E., De Vriendt E., Lofgren A., Ceuterick C., Martin J.-J., Van Broeckhoven C. A novel type of hereditary motor and sensory neuropathy characterized by a mild phenotype. // Arch. Neurol. 1999. - Vol.56. -P.1283-1288.

43. De Jonghe P., Timmerman V., Nelis E. Charcot-Marie-Tooth disease and related peripheral neuropathies. // J. Peripheral. Nerv. Syst. 1997. - Vol.2. - P.370-387.

44. Dyck P. J., Chance P., Lebo R., Carney J. A. Hereditary motor and sensory neuropathies. // Peripheral neuropathy. 1993. - Vol.2. - P. 1094 - 1136.

45. Dyck P. J. Inherited neuronal degeneration and atrophy affecting peripheral motor, sensory, and autonomic neurons. // Peripheral neuropathy. 1984. - Vol.2. -P. 1600-1655.

46. Dyck P. J., Lambert E. H. Lower motor and primary sensory nerve diseases with peroneal muscular atrophy I: neurologic, genetic and electrophysiological findings in hereditary polyneuropathies // Arch. Neurology. 1968. - Vol.18. -P.603-618.

47. Dyck P. J., Litchy W. J., Minnerath S. et al. Hereditary motor and sensory neuropathy with diaphragm and vocal cord paresis. // Ann. Neurol. 1994. -Vol.35. - № 5. - P.608-615.

48. Eggers S. D., Keswani S.C., Melli G., Cornblath D. R. Clinical and genetic description of a family with Charcot-Marie-Tooth disease type IB from a transmembrane MPZ mutation. // Muscle Nerve. 2004. - Vol.29. -№6. - P.867-869.

49. Emery A. Population frequency of inherited neuromuscular diseases a world survey. // Neuromusc. Disorder. - 1991. - Vol. 1. - P. 19-29.

50. Erwin W. G. A pedigree of sex-linked recessive peroneal atrophy. // J. Hered. -1944.- Vol.35 -P.24-26.

51. Falk M. M., Buehler L. K., Kumar N. M., Gilula N. B. Cell-free synthesis and assembly of connexins info functional gap junction membrane channels // EMBO J. 1997. - Vol.16- P.2703-2716.

52. Fedotov V. P., Ismailov S., Evgrafov О. V., Bezryadina E. E. Genetic studies of patients with HMSN-1 in a specific region of Russia (DNA analysis and EMG criteria). // Medizinische genetic. 1999. - Vol.11. - P. 142

53. Fischbeck К. H., ar-Rushdi N., Pericak-Vance M., Rozear A. D., Fryns J. P. X-linked neuropathy: gene localization with DNA probes. // Ann. Neurol. 1986. -Vol.20.-P.527-532.

54. Fischbeck К. H., Ritter A., Shi Y., Nussbaum R. W., Lesko J., Ionasescu V., Chance P., Harding A. Linkage studies of X-linked neuropathy and spinal muscular atrophy. // Cytogenet. Cell Genet. 1978. - Vol.46. - P.614.

55. Jordanova A., Thomas F. P., Guergueltcheva V. Dominant intermediate Charcot-Marie-Tooth type С maps to chromosome Ip34-p35. // Am. J. Hum. Genet. -2003.-Vol.73.-P.1423-1430.

56. Harding A. E. The clinical features of hereditary motor and sensory neuropathy types I and II. // Brain. 1980. - Vol.103. - P.259-280.

57. Harding A. E., Thomas P. K. Autosomal recessive forms of hereditary motor and sensory neuropathy. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 1980. - Vol.43. - P. 669678.

58. Harding A. E., Thomas P. K. Peroneal muscular atrophy with pyramidal features. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr. 1984. - Vol.47. - P. 168-172.

59. Hayasaki K., Himoro M., Wang Y., Takata M., Minoshima S., Shimizu N., Miura M., Uyemura K., Takada G. Structure and chromosomal localization of the gene encoding the human myelin protein zero (MPZ). // Genomics. 1993. - Vol.17. -P.755-758.

60. Hayasaki K., Ohnishi A., Takada G., Fukushima Y., Murai Y. Mutation of the myeline (sic) PO gene in the Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol.194. - P. 1317-1322.

61. Hayasaki K., Nanao K., Tahara M., Sato W., Takada G., Miura M., Uyemura K. Isolation and sequence determination of cDNA encoding the major structural protein of human peripheral myelin. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. -Vol.180.-P.515-518.

62. Ionasescu V. V., Trofatter J., Haines J. L., Summers A. M., Ionasescu R., Searby C. Heterogeneity in X-linked recessive Charcot-Marie-Tooth neuropathy. // Am. J. Hum. Genet. 1991. - Vol.48. - P. 1075-1083.

63. Ionasescu V. V., Trofatter J., Haines J. L., Summers A. M., Ionasescu R., Searby C. X-linked recessive Charcot-Marie-Tooth neuropathy: clinical and genetic study. // Muscle Nerve. 1992. - Vol.15. - P. 368-373.

64. Goudier R., LeGuern E., Gudenheim M. Clinical, electrophysiologic, and molecular correlations in 13 families with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies and a chromosome 17pl 1.2 deletion. // Neurology. 1995. -Vol.45.-P.2018-2023.

65. Karbowski M. et al Spatial and temporal association of Bax with mitochondrial fission sites, drpl, and Mfti2 during apoptosis. // J. Cell. Biol. 2002. - Vol.159. -№6. -P.931-938.

66. Kim S. M., Chung K. W., Choi B. 0. Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP) patients of Korean ancestry with chromosome 17pll.2-pl2 deletion. // Exp. Mol. Med. 2004. - Vol.36. - №1. - P.28-35.

67. Kim H.-J., Hong S. H., Ki C.-S., Kim B.-J., Shim J.-S., Cho S.-H., Park J.-H., Kim J.-W. A novel locus for X-linked recessive CMT with deafness and optic neuropathy maps to Xq21.32-q24. //Neurology. -2005. Vol.64. -P.1964-1967.

68. Kleopa K. A., Georgiou D. M., Nicolaou P. A novel PMP 22 mutation Ser22Phe in a family with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies and CMT IA phenotypes. //Neurogenetics. 2004. - Vol. 5. - № 3. - P.171-175.

69. Kwon J. M,, Elliott J. L., Yee W.-C., Ivanovich J., ScavardaN. Charcot-Marie-Tooth type II locus to chromosome 3q. // Am. J. Hum. Genet. 1995. - Vol.57. -P.853-858.

70. Kochanski A., Drac H., Kabzinska D., Hausmanowa-Petrusewicz I. A novel mutation, Thr65Ala, in the MPZ gene in a patient with Charcot-Marie-Toothtype IB disease with focally folded myelin. // Neuromusc. Disorder. 2004. -Vol. 14. - №3. -P.229-32.

71. Kochanski A., Kabzinska D., Nowakowski A. An axonal form of Charcot-Marie-Tooth disease with a novel missense mutation in the myelin protein zero gene. // J. Peripher. Nerv. Syst. 2004. - Vol.9. - №1. - P.l-2.

72. Kulkens Т., Bolhius P. A., Wolterman R. A. Deletion of the serine 34 codon from the major peripheral myelin P0 gene in Charcot-Marie-Tooth disease type IB. // Nature Genet. 1993. - Vol.5. - P.35-39.

73. Lebo R.V., Lynch E.D., Bird T.D. Multicolor in situ hibridization and linkage analysis order Charcot-Marie-Tooth type I (CMT IA) gene-region markers. // Am. J. Hum. Genet. 1992. - Vol.50. - P.42-55.

74. Lee Y. C., Soong B. W., Lin K. P. Myelin protein zero gene mutations in Taiwanese patients with Charcot-Marie-Tooth disease type 1. // J. Neurol. Sci. -2004. Vol.219. - №1-2. - P.95-100.

75. Lib J., Glass J., Shumas S. A unique mutation in connexin 32 associated with severe early onset CMTX in a heterozygous female. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1999.-Vol.14.-P.481-484.

76. Lupski J. R., Wise C. A., Kuwano A. Gene dosage is a mechanism for Charcot-Marie-Tooth disease type IA. // Nature Genet. 1992. - Vol.1. - P.29-33.

77. Lupski R. J. Charcot-Marie-Tooth disease: a gene-dosage effect. // Molecular genetics in clinical practice. 2001.

78. Mac Arthur M. W., Thornton J. M. // J. Mol. Biol. -1991. Vol.218. - P. 397412.

79. Martin P. E., Mambetisaeva E. Т., Archer D. A. et al. Analisis of gap junction assembly using mutated in Charcot-Marie-Tooth X-linked disease. // J.Neurochemistry. 2000. - vol.74. - P.711-727.

80. Mathew С. C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. // Methods in Molecular Biology / ed. J.M. Walker. N. Y.: Human Press, 1984. -Vol. 2.-P. 31-34.

81. Matsuyama W., Nakagawa M., Moritoyo Т., Takashima H., Umehara F., Hirata K., Suehara M., Osame M. Phenotypes of X-linked Charcot-Marie-Tooth disease and altered trafficking of mutant connexin 32 (GJBl).// J Hum Genet. -2001. Vol.46(6). -P.307-13.

82. Mostacciuolo M. L., Schiavon F., Angelini C. Frequency of duplication at 17pl 1.2 in families of northest Italy with Charcot-Marie-Tooth disease type I. // Neuroepidemiology. 1995. - Vol.14. - P.49-53.

83. Mozdy A. D., McCaffery J. M. and Shaw J. M. Dnm lp GTPase-mediated mitochondrial fission is a multi-step process requiring the novel integral membrane component Fis lp. // J. Cell. Biol. 2000. - Vol.151. - P.367-380.

84. Muller H. W., Suter U., Van Broeckhoven C. Advances in Charcot-Marie-Tooth disease research: cellular function of CMT-related proteins, transgenic animal models, and pathomechanisms. //Neurobiol. Disease. 1997. - Vol.4. - P.215-220.

85. Nagarajan R., Svaren J., Le N. EGR2 mutations in inherited neuropathies dominant-negatively inhibit myelin gene expression. // Neuron. 2001. -Vol.30.-P.355-368.

86. Nelis E., De Jonghe P., De Vriendt E., Patel P. I., Martin J.-J., Van Broeckhoven C. Mutation analysis of the nerve specific promoter of the peripheral myelin protein 22 gene in CMT1 disease and HNPP. // J. Med. Genet. 1998. - Vol.35. -P.590-593.

87. Nei M. Molecular Population Genetic and Evolution. Amsterdam: North-Holland, 1975.- P.278.

88. Nowakowski A., Kochanski A. Screening of the myelin protein zero gene in patients with Charcot-Matie-Tooth disease. // Acta Biochimica Polonica. -2004.-Vol.51.-P.273-280.

89. Oh S., Rivkin S., Tang Q., Verselis V. K., Bargiello T. A. Determinants of gating polarity of a connexin 32 hemichannel. // Biophysical Journal. 2004. -Vol.21.-P.234-245.

90. Orita M., Jwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. - V.86.- P.2766-2770.

91. Ouvrier R., Geevasingha N., Ryan M. Monique, Med M. Autosomal-recessive and X-linked forms of hereditary motor and sensory neuropathy in childhood. // Muscle and Nerve. 2007. - Vol.6. -P. 157-163.

92. Ouvrier R. A and Nicholson G. A. Advances in the genetics of hereditaty hypertrophic neuropathy in childhood. // Brain Dev. 1995. - Vol.17. - P.31-38.

93. Patel P. I., Franco В., Garcia C. Genetic mapping of autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease in a large French-Acadian kindred: identification of new linked markers on chromosome 17. // Am. J. Hum. Genet. 1990. -Vol.46.-P.801-809.

94. Pentao L., Wise S. A., Chinault A. C. Charcot-Marie-Tooth type IA duplication appears to arise from recombination at repear sequences flanking the 1.5 Mb monomer unit. // Nature Genet. 1992. - Vol.2. - P.292-300.

95. Priest J., Fischbeck K., Nouri N. A locus for axonal motor-sensory neuropathy with deafness and mental retardation maps to Xq24-q26. // Genomics. 1995. -Vol.29. -P.409-412.

96. Roa В. В., Garcia C. A., Suter U. Charcot-Marie-Tooth disease type IA: association with a spontaneous point mutation in the PMP 22 gene. // New Engl. J. Med. 1993. - Vol.329. -P.96-101.

97. Scott A., Detmer and David C. Chan. Complementation between mouse Mfh 1 and Mfh 2 protects mitochondrial fusion defects caised by CMT2A disease mutations. // The Journal of Cell Biology. 2007. - Vol.176. - P.405-414.

98. Senderek J., Hermans В., Lehmann U. Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2 and Po point mutations: two novel amino acid substitutions (Asp61Gly; Tyrll9Cys) and a possible «hotspot» on Thrl24Met. // Brain Path. 2000. -Vol.10.-P.235-248.

99. Shy M. E. et al. CMT1X phenotypes represent loss of GJB1 Gene function. // Neurology. 2006. - Vol.68. - P.849-855.

100. Silander K., Meretoja P., Pihko H., Juvonen V., Issakainen J., Aula P., Savontas M.-L. Screening for connexin 32 mutations in Charcot-Marie-Tooth disease families with possible X-linked inheritance. // Hum. Genet. 1997. - Vol.100. -P.391-397.

101. Silander K., Juvonen V., Ignatius J., Pihko H., Saarinen A., Wallden Т., Aula P., Savontaus M-L. Spectrum of mutations in Finnish patients with Charcot-Marie-Tooth disease and related neuropathies. // Hum. Mutat. 1998. - Vol.12. -P.59-68.

102. Skre H. Genetic and clinical aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. // Clin. Genet. 1974. - Vol.6. - P.98-118.

103. Sladky J. Т., Brown M. J. Infantile axonal polyneuropathy with X-linked inheritance. // Ann. Neurol. 1984. - Vol.16. - P.402.

104. Street V. A., Goldy J. D., Golden A. S., Tempel B. L., Bird T. D., Chance P. F. Mapping of Charcot-Marie-Tooth disease type 1С to chromosome 16p identifies a novel locus for demyelinating neuropathies. // Am. J. Hum. Genet. 2002. -Vol.70. - P.244-250.

105. Zuchner P., De Jonghe, Jordanova A. Axonal neuropathy with optic atrophy is caused by mutations in mitofiisin 2. // Ann. Neurol. 2006. - Vol.59. - P.276-281.

106. Suter U., Snipes G. J., Schoener-Scott R. Regulation of alternative peripheral myelin protein-22 (PMP22) gene transcripts by two promoters. // J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269. - P.25795-25808.

107. The inherited peripheral neuropathies mutation database: http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations.

108. Thomas P. K., Calne D. В., Stewart G. Hereditary motor and sensory polyneyropathy (peroneal muscular atrophy). // Ann. Hum. Genet. 1974. -Vol.38.-P.l 11-153.

109. Timmerman V., Raeymaekers P., De Jonghe P. Assignment of the Charcot-Marie-Tooth neuropathy type I (CMT IA) gene to 17pl 1.2-pl2. // Am. J. Hum. Genet. 1990. - Vol.47. - P.680-685.

110. Timmerman V. et al. Linkage and mutation analysis of Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2 families with chromosomes Ip35-p36 and Xql3. // Neurology.-1996.-Vol.46.-P.1311-1318.

111. VanSlyke J. K., Deschens S. M., Musil L. S. Intracellular transport, assembly, and degradation of wild-type and disease-linked mutant gap junction proteins. // Mol. Biol. Cell. 2000. - Vol. 11.- P. 1933-1946.

112. Vallat J-M., Sindou P., Preux P.M. Ultrastructural PMP 22 expression in inherited demyelinating neuropathies. // Ann. Neurol. 1996. - Vol.39. - P.813-817.

113. GTP-ase late endosomal protein RAB7 cause Charcot-Marie-Tooth type 2B neuropathy. H Am. J. Hum. Genet. 2003. - Vol.72. - P.'722-727.

114. Vizoli F. DeH'atrofia muscolare progressiva nevrotica. // Biol. Reserch. Accad. Med. Chir. 1889. - Vol.3. - P.67-69.

115. Warner L. E., Shohat M., Shorer Z., Lupski J. R. Multiple de novo MPZ (PO) point mutations in a sporadic Dejerine-Sottas case. // Hum. Mutat. 1997. -Vol.10.-P.21-24.

116. Warner L. E., Svaren J., Milbrandt J., and Lupski J. R. Functional consequences of mutations in the early growth response 2 (EGR2) gene correlate with the severity of human myelinopathies. // Human Molecular Genetics. 1999. -Vol.8. -P.1245-1251.

117. Welcher A. A., Suter U., De Leon M. A myelin protein is encoded by the homolog of a growth arrest specific gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. - Vol.88. - №16. - P.7195-7199.

118. Warner L. E., Svaren J., Milbrandt J., Lupski J. R. Functional consequences of mutations in the early growth response 2 gene (EGR2) correlate with severity of human myelinopathies. // Hum. Mol. Genet. 1999. - Vol.8. - P. 1245-1251.

119. Young P., Suter U. The causes of Charcot-Marie-Tooth disease. // Cell Mol. Life Sci. 2003. - Vol.60. - №12. - P.2547-2560.

120. Zhao С. et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF lBbeta. // Cell. 2001. - Vol.36. - P.587-597.

121. Zuchner S. et al. Mutations in the mitochondrial GTPase 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. // Nat. Gene. 2004. - Vol.36. - P.449-451.