Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа"

На правах рукописи

Миловидова Татьяна Борисовна

КЛ1ШИКО-МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕ1ШОЙ МОТОРНО-СЕНСОРНОЙ НЕЙРОПАТИИI ТИПА

03.02.07 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 СЕН 2011

МОСКВА, 2011

4853299

Работа выполнена в Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН и на кафедре медицинской и общей генетики Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российского Государственного Медицинского Университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель - Д0КТ0Р медицинских наук, профессор

Дадали Елена Леонидовна

Научный консультант - Д0КТ0Р биологических наук, профессор

Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты - Д0,СГ0Р медицинских наук, профессор

Петрин Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Иллариошкин Сергей Николаевич

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение

дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится « 2011г. в Я часов на заседании Диссерта-

ционного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан «М» СХХЙу^^2011:

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор у?

Р.А. Зинченко

Актуальность темы

Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) - обширная группа генетически гетерогенных заболеваний периферических нервов, характеризующихся симптомами прогрессирующей полинейропатии с преимущественным поражением мышц дистальных отделов конечностей. НМСН являются не только самым частым среди наследственных заболеваний периферической нервной системы, но и одним из самых частых наследственных заболеваний человека. Частота всех форм НМСН варьирует от 10 до 40:100000 в различных популяциях.

К настоящему времени картировано более 40 локусов, отвечающих за наследственные моторно-сенсорные нейропатии, идентифицировано 30 генов, для большинства из которых выявлены кодируемые ими белки и установлены их функции. Безусловно, количество обнаруженных генетических вариантов не является конечным и их поиск продолжается. Описаны все типы наследования НМСН.

Клинические проявления НМСН обусловлены поражением различных структур периферических нервов. Большое значение для понимания природы НМСН имело использование электропейромиографического метода обследования, в частности определение скорости проведения импульса (СПИ) по срединному нерву. Все моторно-сенсорные нейропатии в настоящее время по электронейромиографическим и морфологическим признакам принято разделять на три основных типа: 1) демиелинизирующий (НМСН1), характеризующийся снижением скорости проведения импульса (СПИ) по срединному нерву менее 38 м/с, 2) аксональный вариант (НМСШ1), характеризующийся нормальной или несколько сниженной СПИ по срединному нерву, 3) промежуточный, СПИ при котором находится в пределах от 25 до 38 м/с. На долю НМСН I типа приходится 70% всех случаев НМСН.

Таким образом, проведение медико-генетического консультирования семей, отягощенных НМСШ, является затруднительным вследствие клинико-генетического полиморфизма наследственных демиелинизирующих полинейропатий. На данный момент в этой группе картировано 19 локусов, и идентифицировано 15 генов, мутации в шести из которых являются доминантными: РМР22, РО, ЫТАР, £012, ИЕРЬ, ОЛЯ, и в девяти -рецессивными: ООЛР1, МТММ, 5^2, 5НЗТС2, ДЩЛОЛ Репахт, , РЮ4 и РДШ. В России существует проблема диагностики НМСШ, что обусловлено недостаточной информированностью врачей о клинических критериях НМСШ. Важным аспектом, делающим необходимым проведение молекулярно-генетических исследований НМСШ в России является то, что в ряде случаев невозможно клинически различить наследственные и ненаследственные полинейропатии, возникающие в результате течения целого ряда других заболеваний. Важным этапом медико-генетического консультирования семей, отягощенных НМСШ, является выявление генетического варианта с использованием молекулярно-генетических методов. Идентификация генетического варианта необходима для решения ряда проблем, основными из которых являются: определение генетического статуса родственников пробанда, определение риска рождения у них больного ребенка и планирование способов дородовой диагностики. Однако существование генетической гетерогенности и значительного сходства клинических проявлений НМСН создают значи-

тельные трудности при проведении такой диагностики с использованием дорогостоящих методов ДНК анализа. Это обусловливает необходимость создания алгоритма идентификации генетического варианта НМСН, который позволит сократить временные и материальные затраты на проведение диагностического этапа и повысит его эффективность. В основу такого алгоритма должны быть положены различия в частоте встречаемости различных вариантов НМСН, возрасте начала, типах наследования, показателях СПИ по срединному нерву и особенностях клинических проявлений и течения заболевания.

Цель исследования

В соответствии со всем выше изложенным была поставлена следующая цель работы: совершенствование способов диагностики и профилактики наследственной мотор-но-сенсорной нейропатии I типа (НМСН1) на основе анализа частот встречаемости и клинических особенностей отдельных генетических вариантов.

Задачи исследования

1. В выборке пациентов с наследственными миелинопатиями провести поиск мутаций в генах, ответственных за НМСН1 с АД типом наследования. Изучить частоты встречаемости различных генетических форм НМСН1.

2. Провести поиск мутаций в гене ООЛР1, ответственном за 25% случаев миелинопа-тий с АР типом наследования. Разработать систему детекции наиболее частых мутаций генов РС04, РЮ4, N01101 и БНЗТС2 при миелинопатиях с АР типом наследования.

3. Для больших семей с неустановленным генетическим вариантом НМСН1 провести анализ сцепления с известными АД локусами. Оценить генетическую гетерогенность НМСН1 в РФ.

4. Изучить особенности клинических проявлений выявленных генетических вариантов НМСН1. Выявить значимые для дифференциальной диагностики клинические признаки каждого из вариантов НМСН1.

5. Разработать эффективный алгоритм клинико-молекулярно-генетической диагностики и профилактики семей с НМСН1.

Научная новизна

Впервые в России собрана уникальная по количеству семей и проведенному клиническому обследованию выборка семей, отягощенных НМСН1.

До проведения настоящей работы в России была определена частота встречаемости и спектр мутаций только трех из шести возможных генетических форм НМСН1 с доминантным типом наследования (НМСН1А, НМСН1В и НМСШХ) и до настоящего момента не было уделено внимание НМСН 1 типа с аутосомно-рецессивным наследованием.

В ходе данной работы впервые в России разработаны протоколы молекулярно-генетического анализа генов ИТ АР, ЕОк2 и МУ7!. В связи с появлением новых мето-

дов ДНК-диагностики впервые разработана система для определения числа копий гена РМР22, детекции частичных делеций и дупликаций, основанная на количественной мультиплексной пробозависимой лигазной реакции (MLPА).

Впервые разработан быстрый, простой и недорогой способ для определения наиболее частых мутаций генов FGD4, FIG4, NDRG1 и SH3TC2, ответственных за НМСН с аутосомно-рецессивным типом наследования, методом MLP А.

Впервые в России проведен анализ причин высокой доли отдельных мутаций в исследуемой выборке. Показано наличие «горячих» точек мутаций гена GJB1.

Разработан эффективный алгоритм клинико-молекулярно-генетической диагностики и профилактики семей с HMCHI.

Показана дальнейшая генетическая гетерогенность НМСН 1 типа.

Практическая значимость

Разработанная методика проведения молекулярно-генетического анализа HMCHI может быть использована для подтверждающей, дифференциальной, пресимптоматиче-ской и пренатальной диагностики.

Использование разработанного алгоритма молекулярно-генетического обследования российских больных и внедрение новых методов и протоколов поможет сделать проведение диагностики HMCHI более эффективным, быстрым и менее дорогостоящим.

Положения, выносимые на защиту

1. На долю HMCHIA, обусловленной мутациями в гене РМР22, приходится 60% всех случаев HMCHI. 9% всех случаев HMCHI составляет HMCHIB (мутации в гене РО), 20% - HMCHIX (мутации в гене GJB1). Определен спектр мутаций генов РМР22, GJB1, РО и распределение мутаций по доменам белка. Показана необходимость исследования не только кодирующей, но и некодирующей последовательности гена GJB1. Мутаций генов EGR2, NEFL и LITAF в выборке российских больных с НМСШ не обнаружено.

2. На долю HMCHI с аутосомно-рецессивным типом наследования приходится 1,8% всех случаев с HMCHI, в том числе 0,9%, обусловленных частой мутацией гена GDAP1, и 0,9%, обусловленных частыми мутациями генов SH3TC2 и FIG4. Разработана эффективная система диагностики методом MLPA частых мутаций генов FGD4, FIG4, NDRG1 и SH3TC2, ответственных за НМСН с аутосомно-рецессивным типом наследования.

3. В группах больных с HMCHI и мутациями генов РМР22, GJBI и гена РО при анализе частот встречаемости основных неврологических симптомов выявлены статистически достоверные различия.

4. Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных НМСН 1 типа, определяющий последовательность анализа генов РМР22, GJB1, MPZ, GDAP1 и часто встречающихся мутаций генов, ответственных за АР миели-нопатии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференции European Human Genetics Conference 2010, на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009, на конференциях European Human Genetics Conference 2007,2008, 2009.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично выполнил всю экспериментальную работу, участвовал в консультировании пациентов с НМСН I типа. Автором разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования пациентов с НМСН I типа. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по клинико-молекулярно-генетическому анализу наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа были внедрены в практику медико-генетического консультирования при МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 125 источников, из них 6 отечественных и 119 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 225 пробандов из неродственных семей с НМСН 1(101 семейный и 124 изолированных случаев), проживающих на территории РФ. Рассматриваемая выборка больных на 95% представлена русскими. Диагноз "НМСН I" всем больным был поставлен на основании диагностических критериев, утвержденных на 53-ем Международном Семинаре Европейского Нейромышеч-ного Центра (DeJonghe el al. 1998), основными из которых были следующие: 1) медлен-

но прогрессирующая симметричная мышечная слабость и атрофия дистальной части преимущественно нижних конечностей; 2) деформации стоп по типу полых; 3) снижение или утрата сухожильных рефлексов; 4) поверхностные гипостезии в дистальных отделах конечностей; 5) сниженные значения СПИ по двигательным и чувствительным нервам (значения для двигательных волокон срединного нерва < 38 м/с). Все пациенты были обследованы в МГНЦ РАМН или МГК г. Воронежа.

Для статистического анализа сходства клинической манифестации групп пациентов с различными типами НМСН дополнительно были использованы клинические и электронейромиографические данные 26 семей с HMCHIX и 18 семей с HMCHIB, не вошедших в исследование.

Контрольная выборка была взята из банка лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. Ее составили 120 здоровых неродственных человек, проживающих на территории различных регионов РФ.

Во всех случаях у пациентов получено письменное информированное согласие о проведении исследований.

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom ™ из образцов периферической крови.

Исследование генов РМР22, GJB1, MPZ (PO), LITAF, EGR2, NEFL и G DA PI проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификацию необходимых фрагментов геномной ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоцикле-ре МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) Все фрагменты были секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130x1 (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы Chromas.

При исследовании количества копий гена РМР22 использовали метод количественной мультиплексной лигазной реакции (MLPА). Последовательность проб для реакции выбиралась на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов ДНК, имеющихся в базе данных GeneBank. Математический обсчет результатов количественной ПЦР проводился с помощью программы CoffalyserV8, представленной в свободном доступе на сайте MRC-Holland (www.mlpa.com).

Для детекции частых мутаций в генах FIG4 и SH3TC2, а также двух частых мутаций, встречающихся у цыган, в генах NDRG1 и SH3TC2 при демиелинизирующих ней-ропатиях с аутосомно-рецессивным типом наследования был использован метод MLPA. Этот метод значительно дешевле, проще и быстрее, чем прямое автоматическое секве-нирование.

Оценку сцепления локуса заболевания с геномными маркерами проводили на основании статистического анализа сегрегации заболевания в семье с аллелями полиморфных маркеров, используя метод максимального правдоподобия (Oit, 1991). Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью

документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении. Двухлокусный анализ сцепления осуществлялся с помощью программы MLINK, входящей в пакет программ "LINKAGE", версия 5.1 (RockfellerUniversity,

URL=http://linkage.rockefeller.edu).

Статистический анализ сходства клинической манифестации групп пациентов с различными типами НМСН осуществлялся с помощью методики, основу которой составляет построение для каждой из групп в пространстве клинических симптомов и признаков доверительных шаров, позволяющих количественно выразить степень вариабельности клинического фенотипа у пациентов с различными типами НМСН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетический анализ НМСН 1 типа с доминантным типом наследования

При исследовании гена РМР22 мутации были выявлены в 135 семьях, что составляет 60% всех случаев HMCHI в РФ (табл.1):

4- наиболее частая при HMCHI мутации - дупликации в области короткого плеча хромосомы 17 (17pll.2-p.12) - была выявлена в 130 семьях, что составило 57,8%;

•i- в результате секвенирования последовательности гена РМР22 в одной семье выявлена мутация c.440T>G (Leul47Arg) в гетерозиготном состоянии, что составляет 0,4% всех случаев HMCHI.

Ян, на долю частичных делеций/дупликаций гена РМР22 пришлось 1,8% (4 семьи).

Таблица 1. Спектр мутаций гена РМР22 у российских больных.

Тип мутации Количество больных Частота среди всех случаев HMCHI в РФ

Дупликация в области 17pll.2-p.12 130 57,8%

Частичные дупликации.делеции 4 1,8%

Точковые мутации 1 0,4%

Всего 135 60%

В 90 семьях, у которых не было выявлено мутаций в гене РМР22, и данные анализа родословных не противоречили Х-сцепленному типу наследования, был проведен поиск мутаций в гене йЛ31. В результате исследования были выявлены 33 различные мутации, включая 13 ранее не описанных, гена ОЛ!1 в 46 семьях. Это составило 20% всех семей с НМСН 1 типа. Проведен анализ спектра и частот встречаемости различных типов мутаций в гене йЛИ (табл.2).

Показано, что мутации гена йЛН являются второй по частоте (после дупликации гена РМР22) причиной развития НМСН1 и обнаруживаются у 20% больных.

Показано наличие в гене GJB/ «горячих» точек мутаций (табл.3).

Таблица 2. Спектр мутаций гена GJB1 у российских больных.

№ экзон/ интрон нуклеотидная замена аминокислотная замена домен белка Колич. семей авторы

1 интрон lb с.-371Т>С мутация в промоторе - 1 Данные исследования

2 интрон lb е.-17 G>A мутация сайта сплайсинга - 1 Данные исследования

3 2 c.59T>A+61G>A He20G]y21>AsnSer TMI 1 Mersiyanova et al, 2000

4 2 c.62Gdel frame shift TMI 1 Данные исследования

5 2 c.62G>T Gly21Val TMI 1 Данные исследования

6 2 C.640T Arg22Stop TMI 1 Ressol et al, 1996

7 2 c.65G>A Arg22Gln TMI 1 Bone et al, 1997

8 2 c.68T>C Val23Ala TMI 1 lonasescu et al, 1996

9 2 c.70T>C Trp24Arg TMI 1 Данные исследования

10 2 с.101Т>А Met34Lys TMI 1 Mersiyanova et al, 2000

И 2 c,124A>T Ser42Cys ECI 1 Данные исследования

12 2 c.l32G>C Trp44Cys ECI 1 Данные исследования

13 2 c,158G>A Cys53Tyr ECI 1 Данные исследования

14 2 c.224G>A Arg75Gln TM2 1 Nicholson et al, 1996

15 2 С.2330Т Ser78Phe TM2 1 Данные исследования

16 2 c.248T>G Leu83Arg TM2 1 Dyck et al, 1993

17 2 c.251T>G Val84Gly TM2 1 Данные исследования

18 2 c.271G>A Val91Met TM2 1 Dubourg et al, 2001

19 2 c.277A>G Met93Val TM2 1 Mersiyanova et al, 2000

20 2 c.283G>A Val95Met 1С 1 Bone et al, 1997

21 2 c.286G>C Ala96Pro 1С 1 Данные исследования

22 2 c.319C>T Argl07Trp 1С 3 Ressot et al, 1996; Bone et al, 1997

23 2 C.4240T Argl42Trp TM3 4 Mersiyanova et al, 2000

24 2 c.425G>A Argl42Gln TM3 2 Bone et al, 1997; Dubourg et al, 2001

25 2 C.4900T Argl64Trp EC2 1 Bort et al, 1997; Dubourg et al, 2001

26 2 c.491G>A Argl64Gln EC2 5 Bone et al, 1997; Dubourg et al, 2001

27 2 c.541G>A Vall81Met EC2 3 Bone et al, 1997

28 2 c.548G>A Argl83His EC2 2 Bone et al, 1997; Bortetal, 1997

29 2 C.5790G Phel93Leu TM4 1 Mersiyanova et al, 2000

30 2 c.622G>A Glu208Lys С 1 Mersiyanova et al, 2000

31 2 c.643C>T Arg215Trp С I Ressot et al, 1996; Dubourg et al, 2001

32 2 c.784A785Tdel frame shift с 1 Данные исследования

33 2 c.849C>A Cys283Stop с 1 Данные исследования

Таблица 3. «Горячие» точки мутаций гена GJB1.

кодон Известные мутации Число семей

142 Argl42Trp/Argl42Gln 4/2

164 Argl64Trp / Argl64Gln 1/5

Всего из 46 семей (%) 12 (26%)

В 44 семьях, причину болезни в которых не удалось установить после исследования генов РМР22 и был проведен поиск мутаций в гене МР2. В ходе проведенного исследования в 21 семье выявлен 21 аллельный вариант, в т.ч. 6 ранее не описанных, НМСН 1В типа, что составило 9% всех семей с НМСН 1 типа (табл.4).

Таблица 4. Спектр мутаций гена MPZ у российских больных.

№ экзон нуклеотидная аминокис- домен бел- количест- авторы

замена лотная замена ка во семей

1 1 c.94G>T Val32Phe эц 1 Yoshihara étal., 2000

2 1 c.128G>T Glu43Val эц 1 Данное исследование

3 2 c.142C>G Leu48Val эц 1 Данное исследование

4 2 c.150C>G Cys50Trp эц 1 Данное исследование

5 2 с.160Т>С Ser51Pro эц 1 Bissar-Tadmourietal, 1999

6 2 с.188С>Т Ser63Phe эц 1 Blanquet-Grossard et ai, 1995

7 2 с.233С>Т Ser78Leu ЭЦ 1 Nelisetal., 1994

8 2 с.292С>Т Arg98Cys ЭЦ 1 Warneretal., 1996

9 2 c.293G>A Arg98His ЭЦ 1 Mersiyanova et al., 2000

10 3 с.3160Т Argl06Cys эц 1 Rautenstrauss etal., 2007

11 3 c.382G>A Aspl28Asn эц 1 Marques Jr et al., 1999

12 3 c.389A>G Lysl30Arg эц 1 Warner et al., 1996

13 3 с.397С>Т Prol33Ser эц 1 Данное исследование

14 3 с.402С>А Aspl34Glu эц 1 Mersiyanova et al., 2000

15 3 с.404Т>С llel35Thr эц 1 Mersiyanova et al., 2000

16 3 c.414G>C Lysl38Asn эц 1 Mersiyanova et al, 2000

17 3 с.1390А Thrl39Asn эц 1 Mersiyanova et al, 2000

18 3 c.419C>G Serl40Cys эц 1 Данное исследование

19 3 c.499G>A Glyl67Arg ТМ 1 Nelisetal, 1996

20 5 c.664delA Ala221fs иц 1 Rautenstrauss et al., 1994

21 6 с.742А>Т Lys248X иц 1 Данное исследование

Показано, что мутации гена МР2 являются третьей по частоте (после дупликации гена РМР22 и мутаций гена причиной развития НМСН и обнаруживаются у 9% больных.

В 44 семьях, причину болезни в которых не удалось установить, был проведен поиск мутаций в генах ЫТАР, ЕйЯ2 и А¡ЕРЬ, ответственных за НМСН1С, НМСНШ, и НМСН1Р типа соответственно. Исследование мутации в этих генах полностью исчерпывает весь список известных на сегодняшний день генетических вариантов АД мие-линопатий. Ни в одной семье мутаций в данных генах выявлено не было. При сравнении данных о частотах встречаемости различных генетических вариантов НМСН1, полученных нами, с мировыми (табл. 5) видно, что значимых различий не наблюдается.

Таблица 5. Суммарные молекулярно-генетические данные по HMCHI с доминантным типом наследования_

Подтип HMCHI Ген Доля мутаций от общего числа случаев НМСН1 в мире Доля мутаций от общего числа случаев НМСН1 в РФ

HMCH1A PMP22 70%-80% 60%

НМСН IX GJB1 15-20% 20%

HMCH1B MPZ 5%-10% 9%

Подтип НМСН1 Ген Доля мутаций от общего числа случаев НМСН1 в мире Доля мутаций от общего числа случаев НМСН1 в РФ

НМСН 1С иТАР 1%-2% -

нмент ЕйЯ2 <2% -

НМСН 1 г ЫЕРЬ <5% -

Частоты НМСН1Х и НМСН1В соответствуют верхним границам таковых в различных популяциях, в связи с чем, частота НМСН 1А типа несколько ниже, чем в большинстве европейских популяциях.

Молекулярно-генетический анализ миелинопатий с АР типом наследования

После исследования выборки на все описанные на данный момент АД гены, мутации в которых приводят к фенотипу НМСН1, причина заболевания установлена в 202 семьях (95 семейных случаев и 107 изолированных), что составляет 89%. В 23 семьях (7 семейных случаев и 16 изолированных) мутаций обнаружено не было. Предполагается, что среди изолированных случаев, мутаций в которых выявлено не было, могут быть АР случаи. Поэтому следующим этапом настоящего исследования был поиск мутаций в гене ййЛР!, ответственном за НМСН4А. Показано, что на долю мутаций в этом гене приходится около 25% всех случаев миелинопатий с аутосомно-рецессивным типом наследования.

В результате исследования кодирующей последовательности гена йОАР! мутация Ьси239РЬе выявлена в двух изолированных случаях на трех хромасомах: у одного больного в гомозиготном состоянии, у второго - гетерозиготном состоянии, что соответствует 0,9% всех проанализированных случаев миелинопатий.

Диагностика АР состояний до настоящего времени была затруднена вследствие отсутствия коммерческих тест-систем для всех форм АР миелинопатий и вследствие отсутствия достаточного количества материала для исследования. Поэтому были разработаны две МЬРА-системы для детекции мутаций, часто встречающихся по данным литературы в различных популяциях.

Система 1 включала две частые мутации генов БНЗТС2 (А^1109Х) и МО!Ю! (А^148Х), описанные у болгарских цыган (Рис.1 А). Система 2 включала две мутации гена 8НЗТС2 (Аг§658Суз и А^954Х) и мутацию 11е41ТЬг гена И64 (Рис. 1Б).

Кроме того, в кодоне 298 гена описано две различные замены, поэтому было принято решение о секвенировании экзона 7 у российских больных с миелинопатиями с неустановленной причиной заболевания.

В результате исследования 14 семей, в которых не была установлена причина болезни и исключен АД тип наследования, выявлено по одной мутации в гетерозиготном состоянии в двух семьях: мутация 11е41ТЬг гена РЮ4 и мутация А^658Суэ гена 5НЗТС2, что соответствует 0,9% всех случаев НМСН1.

Таким образом, в результате проведенного исследования причина НМСН 1 типа выявлена в 91,5% случаев. Около 90% всех случаев составляют 1А и 1В с АД типом наследования и IX тип с Х-сцепленным доминантным типом, обусловленные мутациями

в генах РМР22, МР2 и СЛИ, соответственно, на долю миелинопатий с АР типом наследования приходится 1,8%.

1 2 3 4 5

5НЗТС2 (Аг§ 1109Х) ЫОНС1 (А^148Х)

А:

дорожка 2 - положительный контроль: №Э1Ю1 Аг§148Х/Аг§148Х

дорожки 1,3-5- норма

Б:

дорожка I - положительный контроль: ЖМ1е41Ш/Ы дорожка 3 - положительный контроль:

$НЗТС2 Аг§658Суз/Ы дорожки 2, 4 - норма

РЮ4 (Ие41ТЬг) 8НЗТС2 (Аг§658Суз)

ЗНЗТС2 (Аг§954Х)

Рис. 1. Системы для детекции повторяющихся мутаций в генах, ответственных за развитие НМСН1 с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Анализ сцепления в двух больших семьях с НМСН1

В результате исследования всех известных генов, приводящих к НМСН1 с доминантным типом наследования, гена йОАР! и частых мутаций генов 8НЗТС2, ГЮ4, РСИ4 и ИИКа, ответственных за миелинопатии с АР типом наследования, без выявленной причины заболевания остались 19 семей: 7 с АД типом и 12 изолированных.

Среди семей с АД типом наследования в нашей выборке без определенной причины заболевания есть две большие семьи из Самары (семья 194) и Владимира (семья 985). Х-сцепленный тип наследования в данных семьях исключен генеалогически.

Для анализа сцепления с известными аутосомно-доминантными локусами НМСН использованы высокополиморфные микросателлитные маркеры, тесно сцепленные с локусами НМСН 1 А, НМСН1В, НМСН1С, НМСНШ и НМСН1Е. За область исключения принята прилежащая к исследуемому маркеру область, внутри которой значение Ьоё-балла было меньше или равно -2.

Для локусов НМСНШ, НМСН 1С и НМСН 1Б в семье 194 получены результаты, не исключающие сцепление заболевания с ними (табл. 6).

Для всех известных АД локусов НМСН в семье 985 получены результаты, исключающие сцепление заболевания с любым из них (табл. 7). Это позволило сделать вывод, что заболевание в данной семье не сцеплено с известными АД локусами НМСН 1 типа, и, таким образом, представляет собой новый генетический вариант демиелинизу-рующей формы наследственной моторно-сенсорной нейропатии. Данная семья пригодна для дальнейшего полногеномного картирования, что, вероятно, позволит обнаружить новый локус заболевания.

Таблица 6. Исключение сцепления локуса НМСН1 в семье 194 с известными АД локу-сами НМСНI

Локус Исследованные маркеры в Область исключения

0.00 0.01 0.05 0.10 0.20

РМР22 БиР5 -00 -1,87 -1,02 -0,62 -0,25 (0.009 х 2) сМ

мрг 0182844 0,9 0,88 0,79 0,68 0,46 -

ШРЬ 088136 0,12 0,15 0,26 0,23 0,23 -

1ЛТАР 0168497 -0,21 -0,17 -0,05 0,03 0,07 -

ЕС1*2 01051225 -00 -1,34 -0,66 -0,40 -0,17 (0.008 х 2) сМ

Таблица 7. Исключение сцепления локуса НМСН1 в семье 985 с известными АД локу-сами НМСН I

Локус Исследованные маркеры 0 Область исключения

0.00 0.01 0.05 0.10 0.20

РМР22 ОиР5 -00 -1,5 -0,77 -0,46 -0,20 (0.009 х 2) сМ

мрг 0182844 -00 -2,7 -1,36 -0,83 -0,36 (0.04 х 2) сМ

ЫЕИ- 088136 -00 -1,3 -0,65 -0,39 -0,15 (0.009 х 2) сМ

ЫТАР 0168497 -00 -1,5 -0,80 -0,5 -0,22 (0.009 х 2) сМ

ЕОЯ2 01081225 -00 -2,3 -1,00 -0,5 -0,1 (0.02 х 2) сМ

Статистический анализ сходства клинической картины групп пациентов с различными типами НМСН1

С целью выявления особенностей клинических характеристик отдельных генетических вариантов НМСН 1 типа, нами проведен статистический анализ, направленный на выявление различий в частотах встречаемости основных клинических признаков в четырех группах больных, состоящих из пациентов, как вошедших в исследуемую выборку, так и обследованных ранее.

4. Группа НМСН1А - 68 больных с дупликацией 17р11,2-р12 гена РМР22

4 Группа НМСН1В - 39 больных с мутациями в гене МР2

4 Группа НМСН IX - 69 больных с мутациями в гене С/В/

•4» Группа НМСНО - 14 больных с НМСН 1 типа без выявленных мутаций.

Для наглядного представления близости клинической манифестации исследуемых групп НМСН использовалась методика построение для каждой из групп в пространстве клинических симптомов и признаков доверительных шаров, позволяющих количественно выразить степень вариабельности клинического фенотипа у пациентов с различными типами НМСН (рис. 2).

Как следует из рис. 2, рассматриваемые типы НМСН демонстрируют достаточно значительное перекрывание областей, характеризующих вариабельность клинического фенотипа образующих их пациентов. Это обстоятельство указывает на близость клинической манифестации исследуемых типов НМСН, если сопоставлять их по комплексу клинических симптомов и признаков. Однако, для каждого из типов НМСН можно выделить фрагменты областей, не перекрываемых областями, соответствующими другим типам НМСН. Это обстоятельство указывает на наличие отдельных симптомов и признаков, обладающих некоторыми дифференцирующими свойствами.

С целью выделения этих наиболее информативных симптомов и признаков было проведено попарное сопоставление частот встречаемости признаков в отдельных группах. В табл. 8 проведено попарное сравнение пациентов с НМСНО, НМСН1А, НМСН1В и НМСН1Х между собой. Результаты сопоставления представлены величинами значимостей (р). Жирным шрифтом с подчеркиванием в таблицах выделены признаки, достоверно разичающиеся в сравниваемых группах.

Таблица 8. Сопоставление частот (%) встречаемости признаков среди пациентов с НМСНО, НМСН1А, НМСН1В и НМСН1Х

Наименование признака Частота Частота (знач.р) при сравнении

НМСНО НМСН1А (зна ч.р) нмсшв (знач .р) НМСН1Х (знач. р)

Возраст дебюта до 5 лет 21.43 44.12(0.12) 66.67(<0.001) 43.48 (0.13)

Возраст дебюта от 6 до 10 лет 21.43 20.59 (0.97) 12.82 (0.47) 20.29 (0.95)

Возраст дебюта 11-20 лет 21.43 4.41 (0.03) 12.82 (0.47) 4.35 (0.03)

Возраст дебюта старше 20 лет 7.14 4.41 (0.62) 2.56 (0.44) 4.35 (0.66)

Деформация стоп по типу Фридрейховых 35.71 60.29 (0.09) 15.38(0.11) 59.42(0.11)

Деформация стоп по типу полых 14.29 14.71 (0.97) 5.13 (0.27) 14.49 (0.98)

Деформация стоп по типу эквино-варусных 28.57 11.76(0.11) 2.56 (<0.001) 11.59(0.10)

Другие деформации стоп 7.14 5.88 (0.86) 10.26 (0.73) 5.80 (0.85)

Гипостезия стоп поверхностная 28.57 51.47 (0.11) 84.62(<О.ООП 50.72 (0.13)

Гипостезия кистей поверхностная 21.43 33.82 (0.37) 79.49fc0.001) 33.33 (0.38)

Гиперстезия стоп 14.29 16.18 (0.86) 2.56(0.11) 15.94 (0.88)

Гиперстезия кистей 7.14 7.35 (0.98) <0.001 (0.10) 7.25 (0.99)

Нарушение проприоцептивной чувствительности в ногах 7.14 14.71 (0.44) 7I.79fc0.001") 14.49 (0.45)

Нарушение проприоцептивной чувствительности в руках <0.001 4.41 (0.43) 71.79Г<О.ООП 4.35 (0.43)

Отсутствие/снижение ахилловых рефлексов 92.86 69.12 (0.07) 92.31 (0.95) 68.12(0.06)

Отсутствие/снижение коленных рефлексов 85.71 70.59 (0.25) 92.31 (0.50) 69.57 (0.22)

Отсутствие/снижение рефлекса двуглавой мышцы 21.43 41.18(0.17) 51.28(0.06) 40.58(0.18)

Отсутствие/снижение рефлекса карпо-радиального 35.71 42.65 (0.63) 76.92 Г0.0П 42.03 (0.66)

Деформация кистей 35.71 14.71 (0.07) 74.36 №.01) 14.49 (0.06)

Гипотрофия мышц кистей 57.14 41.18 (0.22) 2.56 (<0.0011 40.58 (0.26)

Гипотрофия мышц голеней 64.29 30.88(0.02) 66.67 (0.87) 30.43 (0.02)

Степпаж 57.14 73.53 (0.23) 71.79 (0.32) 72.46 (0.26)

Сколиоз 21.43 13.24 (0.14) 7.69 (0.17) 13.04(0.15)

Кардиопатия <0.001 1.47(0.65) <0.001 (-) 1.45 (0.65)

Интенционный тремор кистей 21.43 42.65 (0.14) 87.Щ<0.001) 42.03 (0.14)

Фасцикулярный тремор кистей 7.14 7.35 (0.98) <0.001 (0,10) 7.25 (0.99)

Фасцикуляция мышц <0.001 2.94 (0.52) <0.001 (-) 2.90 (0.52)

Спинно-мозжечковая атаксия 57.14 58.82 (0.91) 94.87(<0.001) 57.97 (0.95)

Нарушение черепно-мозговой иннервации 7.14 2.94 (0.45) <0.001 (0,10) 2.90(0.44)

Присоединение поражения рук спустя 1-5 л. 21.43 (<0.001) <0.001(<0.001) <0.001(<0.001)

Присоединение поражения рук спустя 6-10 л <0.001 8.82 (0.25) 2.56 (0.55) 8.70 (0.26)

Присоединение поражения рук спустя 11-15 л <0.001 2.94 (0.52) <0.001 (-) 2.90 (0.52)

Трофические расстройства <0.001 1.47(0.65) <0.001 (-) 1.45 (0.65)

Асимметрия поражения 7.14 1.47(0.21) 17.95(0.34) 1.45(0.21)

Таким образом, в результате проведенных исследований значимых отличий в клинических проявлениях между НМСН1А, НМСН1Х и НМСНО не выявлено. Однако при

сопоставлении клинических симптомов НМСН1В выявлен ряд существенных отличий в тяжести клинического течения по сравнению с НМСН1А/НМСН1Х/НМСН0.

Показано, что для НМСН 1В типа более характерен ранний дебют заболевания (до 5 летнего возраста), а также большая выраженность и генерализация процесса. Это проявляется в повышении частоты встречаемости таких признаков как гипотрофия мышц голеней, мозжечковая атаксия, нарушение проприоцептивной чувствительности в ногах и руках, интенционный тремор кистей. Достоверно чаще у больных этой группы обнаруживалась поверхностная гипостезия стоп и кистей. Это связано с тем, что у больных с НМСН 1А, IX типа и НМСНО отмечалась выраженная вариабельность расстройств чувствительности. Так у 16% больных с НМСН 1А, IX типов и НМСНО отмечалась гиперестезия стоп, а у 7% гиперестезия кистей, которые были характерны на начальных стадиях патологического процесса, и свидетельствовали о раздражении задних рогов спинного мозга. Гиперестезия стоп отмечена нами только у 2,5.% больных с НМСН 1В типа. Кроме того, у больных с НМСН1А, IX типами и НМСНО достоверно чаще отмечалась деформация стоп по типу стопы Фридрейха, в то время как у больных с НМСН 1В типа отмечались другие типы деформации стоп или их не было вовсе. Наряду с этим, показаны значимые различия в частоте встречаемости асимметрии поражения у больных с НМСН 1В типа и у больных с НМСН 1 А, IX типов и НМСНО. Этот признак обнаружен более чем у 17% больных с НМСН 1В типа и только у 1,5% больных с НМСН 1А и IX типами. Известно, что асимметрия поражения не характерна для наследственных нервно-мышечных заболеваний, в связи с чем, требовалось проведение дифференциальной диагностики между наследственным характером поражения и ней-ропатиями экзогенной и эндогенной природы. В целом можно отметить, что проведенный анализ показал наличие более тяжелой степени тяжести заболевания у больных с НМСН 1В типа.

Анализ различий между исследуемыми группами по значениям СПИ был использован непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. Таким образом, рис. 3 отражает соотношение средних значений СПИ в исследуемых группах.

38

36

34

32

30

28

26

о

1

24

20

22

18

16

_ - 95% доверительный интервал

среднее

12

НМСНО

НМСК1А

нмснхт

Рис. 3. Средние значения СПИ для различных типов НМСН

Таким образом, видим, что: 4 НМСНО и НМСН1А не обнаруживают существенных различий по значениям

СПИ (соответствующие доверительные интервалы перекрываются). Л для НМСН1Х характерно существенное превышение средних значений СПИ по сравнению со всеми другими типами.

НМСН1В характеризуется наименьшими средними значениями СПИ по сравнению с другими типами НМСН. Достоверность этого вывода подтверждается оценкой различий между исследуемыми группами НМСН на основе Критерия Краскела-Уоллиса. Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9. Анализ различий между исследуемыми группами пациентов по средним значениям СПИ _ _

Средние значения СПИ, м/с Статистика Краскела-Уоллиса Уровень значимости

НМСНО НМСН 1А НМСН1В НМСН IX

25.8 ±4.7 20.9 ± 1.5 15.9 ± 2.9 33.8 ± 1.9 84.27 <0.001

Алгоритмы диагностики различных типов НМСН1

На основании результатов клинико-молекулярно-генетического анализа, проведенного нами в группе российских больных с НМСН1, разработан алгоритм их диагностики с использованием молекулярно-генетических методов. Важным этапом медико-генетического консультирования семей, отягощенных НМСН, является выявление генетического варианта с использованием молекулярно-генетических методов. Идентификация генетического варианта необходима для решения ряда проблем, основными из которых являются: определение генетического статуса родственников пробанда, определение риска рождения у них больного ребенка и планирование способов дородовой диагностики. Однако существование генетической гетерогенности и значительного сходства клинических проявлений НМСН создают значительные трудности при проведении такой диагностики с использованием дорогостоящих методов ДНК анализа. Это обусловливает необходимость создания алгоритма идентификации генетического варианта НМСН, который позволит сократить временные и материальные затраты на проведение диагностического этапа и повысит его эффективность. В основу такого алгоритма могут быть положены различия в частоте встречаемости различных вариантов НМСН, возрасте начала, типах наследования, показателях СПИ по срединному нерву и особенностях клинических проявлений и течения заболевания

Таким образом, для планирования алгоритма ДНК диагностики с целью выявления генетического варианта врачу-генетику необходимо: 1) провести генеалогический анализ; 2) определить возраст манифестации заболевания; 3) получить показатели СПИ по срединному нерву; 4) получить результаты неврологического осмотра. Диагностический алгоритм для определения типа НМСН1, адаптированный для российских пациентов, представлен на рис. 4.

НМСН1 -миелинопзгия

> ДА/мутация

Рис. 4. Диагностический алгоритм НМСН1 у российских больных

При выявлении у пробанда скоростей проведения импульса ниже 38 м/с необходимо в первую очередь исследовать мутации генов, продуктами которых являются белки миелиновой оболочки нерва.

В семьях с аутосомно-доминантным типом наследования и при наличии единственного больного в семье, важным признаком, позволяющим спланировать последовательность исследования мутаций, является СПИ по срединному нерву. При её резком снижении (<15м/с) и наличии характерных клинических признаков: 4ь Возраст дебюта до 5 лет 4* Гипостезия стоп и кистей

4» Нарушение проприоцептивной чувствительности в ногах и руках ■1. Снижение/отсутствие карпо-радиального рефлекса -1» Интенционный тремор кистей 4» Мозжечковая атаксия 4» Гипотрофия мышц голеней •Ii Асимметричность поражения имеет смысл начинать поиск мутаций с гена MPZ(PO) (рис. 4). При СПИ, колеблющихся в промежутке от 10 до 30 м/с наиболее частой причиной заболевания является дупликация на хромосоме 17р11.2-р12 в области гена РМР22, а второй по частоте причиной болезни являются наследумые Х-сцепленно доминантные мутации гена GJB1. В семьях с аутосомно-рецессивным наследованием заболевания последовательность молекулярно-генетического исследования генов построена в зависимости от частот встречаемости мутаций в различных генах при аутосомно-рецессивных формах миелинопатий: GDAP1-SH3TC2-F1G4-NDRG1.

Таким образом, нами предложен алгоритм молекулярно-генетической диагностики больных с HMCHI, в основу которого положены как результаты исследования частот встречаемости различных типов HMCHI и их клинических особенностей, так и результаты анализа спектра мутаций в генах, обусловливающих клинику данных заболеваний. Предложенный алгоритм позволяет значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики НМСН 1 типа в РФ.

ВЫВОДЫ

1. В результате поиска мутаций в генах, ответственных за возникновение доминантных вариантов НМСН 1 типа установлен вклад мутаций генов РМР22, GJB1, Р0, который составил 89% всех случаев HMCHI в РФ. В выборке из 225 больных мутации гена РМР22 явились причиной заболевания у 135 пациентов (60%). У 46 пациентов (20%) выявлены мутации гена GJB1. У 21 пациента (9%) выявлены мутации гена Р0. Мутаций генов EGR2, NEFL и LITAF не обнаружено.

2. Определен спектр мутаций гена GJB1 и распределение мутаций по доменам белка. Показана необходимость исследования не только кодирующей, но и некоди-рующей последовательности гена GJBI. Установлено, что большинство мутаций приводят к изменению трансмембранных доменов белка, ответственных за формирование стенок канала, и экстрацеллюлярной петли 2, обеспечивающей со-

хранность структуры канала. Показано, что реже всего поражаются высоко консервативные N- и С-домены белка коннексина 32.

3. Определен вклад миелинопатий с АР типом наследования в общее число случаев HMCHI в РФ, который составляет 1,8%. Показано, что половина всех миелинопатий с АР типом наследования приходится на мутации в гене GDAP1. Разработаны системы детекции наиболее частых мутаций генов FGD4, FIG4, NDRG1 и SH3TC2 при демиелинизирующих нейропатиях с аутосомно-рецессивным типом наследования.

4. В результате исключения сцепления с известными АД локусами в большой семье, где не была выявлена причина заболевания, показана дальнейшая генетическая гетерогенность демиелинизурующей формы наследственной моторно-сенсорной нейропатии.

5. В результате анализа 34 клинических симптомов в четырех группах больных: с НМСН1А, НМСН1В, НМСН1Х типов и неустановленной формой заболевания показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию между НМСН1А, НМСН1Х и неустановленной формой заболевания. Выделен специфический симптомокомплекс, характерный для НМСН1В типа.

6. Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных НМСН 1 типа, определяющий последовательность анализа генов РМР22, GJB1, MPZ, GDAP1 и часто встречающихся мутаций генов, ответственных за АР миелинопатии. Предложенный алгоритм позволяет значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики НМСН 1 типа в РФ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Тибуркова Т.Б., Щагина О.А., Федотов В.П., Поляков А.В., "Исследование причин распространенности часто встречающихся мутаций гена Сх32"// Генетика человека и патология. Томск. - 2007. - С.193-194. Tiburkova Т.В., Schagina О.А., Dadaly E.L., Fedotov V.P., Polyakov A.V. , "Founder effect in CMT-families with mutations in GJB1 gene from différent régions of Russia"// Europ. J. Hum. Genet. - 2007. - V.15. - S.l. - P.240 Хидиятова И.М., Багаутдинова Э.Г., Галиева Д.В., Крупина Н.Б., Щагина О.А., Тибуркова Т.Б., Магжанов Р.В., Поляков А.В., Хуснутдинова Э.К., "Спектр и частота мутаций в гене коннексина 32 (GJB1) у больных с наследственной моторно-сенсорной нейропатией IX типа в республике башкортостан"// Генетика. -2008. -Т.44. - №¡10. -С.1385-1391. Т.В. Tiburkova, О.А. Schagina, E.L. Dadaly, V.P. Fedotov, A.V. Polyakov , "Hereditary motor and sensory neuropathy type I in Russia"// Europ. J. Hum. Genet.-2008. - V.16. - S.2. - P.319.

Тибуркова Т.Б., Щагина O.A., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Бабушкина Н.П., Поляков А.В. "Исследование гена GJB1 в выборке россий-

ских больных с наследственной моторно-сенсорной нейропатией типа I" // Медицинская генетнка. - 2009. - №7. - С.30-38

6. Щагина О.А., Дадали Е.Л., Федотов В.П., Тибуркова Т.Б., Поляков А.В. "Наследственная моторно-сенсорная полинейропатия типа 4А'У/ Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. -2010. - №5. - С.13-16.

7. Тибуркова Т.Е., Щагина О.А., Дадали E.JL, Поляков А.В. "Классификация и алгоритмы диагностики различных генетических вариантов наследственных моторно-сенсорных полинейропатий'7/ Медицинская генетика. -2011. -№4. - С.21-30.

8. Тибуркова Т.Е., Щагина, О.А., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Поляков А.В. "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии 1-го типа"// Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков// Медицинская генетика. - 2010. -Т., прил. к№5. -С.178.

9. Тибуркова Т.Б., Щагина О.А., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Поляков А.В. "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии 1 типа" // Медицинская генетика. - 2009. - №17. -С.34-35

10. Dadaly E.L., Tiburkova Т.В., Schagina О.А., Fedotov V.P. "Genotype-phenotype correlation in families with myelin protein zero (MPZ) gene mutations"// Europ. J. Hum. Genet. - 2010. - V.18. - S.l. - P.325.

11. Tiburkova T.B., Schagina O.A., Fedotov V.P., Dadaly E.L. "Molecular investigation of PMP22 gene in Russia CMT1 patients: comparison of different methods"// Europ. J. Hum. Genet. - 2010. - V.18. - S.l. - P.340.

СОКРАЩЕНИЯ

АД - Аутосомно-доминантный

АР - Аутосомно-рецессивный

ДНК - Дезоксирибопуклеиновая кислота

НМСН - Наследственная Моторно-Сенсорная Нейропатия

ПЦР - Полимеразная Цепная Реакция

СПИ - Скорость Проведения Импульса по срединному нерву FIG4 - SAC1 lipid phosphatase domain containing EGR2 - Early Growth Response 2 (раннееразвитиеответа 2) FGD4 - PH domain containing 4

GDAP1 - Ganglioside-induced Differentiation-Associated Protein 1

GJB1 - Gap Junction protein, Beta 1 (белокщелевогоконтакта)

KIAA1985 (SH3TC2) - SH3 domain and TetratriCopeptide repeats 2

LITAF - Lipopolysaccharide-Induced TNF factor (липополисахарид-индуцирующий TNF

фактор )

NDRG1 - N-myc Downstream Regulated Gene 1 P0 - Mielin Protein Zero (Нулевойбелокмиелина)

PMP22 - Peripheral Myelin Protein 22 (Периферический миелиновый протеин 22)

Подписано в печать:

31.08.2011

Заказ № 5833 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Миловидова, Татьяна Борисовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа"

Цель и задачи исследования.7

Научная новизна.8

Практическая значимость.9

Положения, выносимые на защиту.9

Апробация работы.10

ГЛАВАІ: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.11

1.1 Общая характеристика наследственных моторно-сенсорных нейропатий.11

1.1.1 Классификация наследственных моторно-сенсорных нейропатий.11

1.1.2 Клинические признаки наследственных моторно-сенсорных нейропатий.16

1.1.3 Морфологическая основа НМСН.19

1.2 Молекулярно-генетическая характеристика НМСН 1 типа.23

1.2.1 НМСН1А (СМТ1А, М1МЧ18220) и ННПС (ШРР, М1М*162500).25

1.2.2 НМСН1В (СМТ1В, М1М*118200). 29

1.2.3 НМСН1С (СМТ1С, М1М*601098).32

1.2.4 НМСНЮ (СМТШ, МІМП29010). 34

1.2.5 НМСН1Р (СМТ1Р, М1М*162280).35

1.3 Молекулярно-генетическая характеристика Х-сцеиленных форм НМСН 1 тина.38

1.3.1 НМСН1Х (СМТ1Х, М1М*304040).38

1.3.2 НМСНХ5 (СМТХ5, М1М*311850).44

1.4 Молекулярно-генетическая характеристика миелинопатий с рецессивным типом наследования.45

1.4.1 НМСН4А (СМТ4А, МІМЧ06598).46

1.4.2 НМСН4В1 (СМТ4В1, МІМЧ03557).47

1.4.3 НМСН4В2 (СМТ4В2, М1М*607597).48

1.4.4 НМСН4С (СМТ4С, МІМЧ08206).49

1.4.5. НМСНЬот (СМТ40, М1М*601455).49

1.4.6. НМСН4Е (СМТ4Е, М1МЧ05253).49

1.4.7НМСІІ4Р (СМТ4Р, М1М*605725).49

1.4.8 НМСН4С (СМТ4в, М1М%605285).50

1.4.9 НМСН4Н (СМТ4Н, МІМЧ11104).50

1.4.10 HMCH4J (CMT4J, MIM*609390).51

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Миловидова, Татьяна Борисовна

выводы

1. В результате поиска мутаций в генах, ответственных за возникновение доминантных вариантов НМСН 1 типа установлен вклад мутаций генов РМР22, GJB1, РО, который составил 89% всех случаев HMCHI в РФ. В выборке из 225 больных мутации гена РМР22 явились причиной заболевания у 135 пациентов (60%). У 46 пациентов (20%) выявлены мутации гена GJB1. У 21 пациента (9%) выявлены мутации гена РО. Мутаций генов EGR2, NEFL и LITAF не обнаружено.

2. Определен спектр мутаций гена GJBI и распределение мутаций по доменам белка. Показана необходимость исследования не только кодирующей, но и некодирующей последовательности гена GJB1. Установлено, что большинство мутаций приводят к изменению трансмембранных доменов белка, ответственных за формирование стенок канала, и экстрацеллюлярной петли 2, обеспечивающей сохранность структуры канала. Показано, что реже всего поражаются высоко консервативные N- и С-домены белка коннексина 32.

3. Определен вклад миелинопатий с АР типом наследования в общее число случаев HMCHI в РФ, который составляет 1,8%. Показано, что половина всех миелинопатий с АР типом наследования приходится на мутации в гене GDAP1. Разработаны системы детекции наиболее частых мутаций генов FGD4, F1G4, NDRG1 и SH3TC2 при демиелинизирующих нейропатиях с аугосомно-рецессивным типом наследования.

4. В результате исключения сцепления с известными АД локусами в большой семье, где не была выявлена причина заболевания, показана дальнейшая генетическая гетерогенность демиелинизурующей формы наследственной моторно-сенсорной нейропатии.

5. В результате анализа 34 клинических симптомов в четырех группах больных: с НМСН1А, НМСН1В, НМСН1Х типов и неустановленной формой заболевания показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию между НМСН 1 А, НМСН IX и неустановленной формой заболевания. Выделен специфический симптомокомплекс, характерный для НМСН 1В типа.

6. Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных НМСН 1 типа, определяющий последовательность анализа генов РМР22, СЗВ1, МР2, ОЭАР! и часто встречающихся мутаций генов, ответственных за АР миелинопатии. Предложенный алгоритм позволяет значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики НМСН 1 типа в РФ.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Тибуркова Т.Б., Щагина О.А., Федотов В.П., Поляков А.В., "Исследование причин распространенности часто встречающихся мутаций гена Сх327/ Генетика человека и патология. Томск. - 2007. - С.193-194.

2. Tiburkova Т.В., Schagina О.А., Dadaly E.L., Fedotov V.P., Polyakov A.V. , "Founder effect in CMT-families with mutations in GJB1 gene from différent régions of Russia'///Europ. J. Hum. Genet. -2007. - V. 15. - S. 1. - P.240

3. Хидиятова И.М., Багаутдинова Э.Г., Галиева Д.В., Крупина Н.Б., Щагина О.А., Тибуркова Т.Б., Магжанов Р.В., Поляков А.В., Хуснутдинова Э.К., "Спектр и частота мутаций в гене коннексина 32 (GJB1) у больных с наследственной» моторно-сенсорной< нейропатией IX типа в республике башкортостан'7/ Генетика. - 2008. - Т.44. - №10. - С. 1385-1391.

4. Т.В. Tiburkova, О.А. Schagina, E.L. Dadaly, V.P. Fedotov, A.V. Polyakov , "Hereditary motor and sensory neuropathy type I in Russia"// Europ. J. Hum. Genet. - 2008. - V.16. - S.2. - P.319.

5. Тибуркова Т.Б., Щагина O.A., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Бабушкина Н.П., Поляков А.В. "Исследование гена GJB1 в, выборке российских больных с наследственной моторно-сенсорной нейропатией типа I" // Медицинская генетика. - 2009. - №7. - С.30-38

6. Щагина О.А., Дадали Е.Л., Федотов В.П., Тибуркова Т.Б., Поляков А.В. "Наследственная моторно-сенсорная полинейропатия типа 4А'7/ Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. -2010. - №5. - С. 13-16.

7. Тибуркова Т.Б., Щагина О.А., Дадали E.JL, Поляков А.В. "Классификация и алгоритмы диагностики различных генетических вариантов наследственных моторно-сенсорных полинейропатий'7/ Медицинская генетика. - 2011. - №4. - С.21-30.

8. Тибуркова Т.Б., Щагина, О.А., Дадали E.JL, Руденская Г.Е., Федотов В.П., Поляков А.В. "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии 1-го типа'7/ Материалы VI-го съезда

118

Российского общества медицинских генетиков// Медицинская генетика. -2010. - Т., прил. к №5. - С. 178.

9. Тибуркова Т.Б., Щагина О.А., Дадали E.JL, Руденская Г.Е., Поляков А.В. "Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии 1 типа" // Медицинская генетика. - 2009. - №17. -С.34-35

10.Dadaly E.L., Tiburkova Т.В., Schagina О.А., Fedotov V.P. "Genotype-phenotype correlation in families with myelin protein zero (MPZ) gene mutations"// Europ. J. Hum. Genet. -2010. - V.18. - S.l. - P.325.

11.Tiburkova T.B., Schagina O.A., Fedotov V.P., Dadaly E.L. "Molecular investigation of PMP22 gene in Russia CMT1 patients: comparison of different methods"// Europ. J. Hum. Genet. -2010. - V.18. - S.l. - P.340.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы собрана значительная по количеству обследованных больных с наследственными миелинопатиями выборка. В результате молекулярно-генетического исследования всех на данный момент известных доминантных генов, приводящих к НМСН 1 типа, были выявлены частоты и спектр мутаций генов РМР22, ОЛ31 и МР2 (РО), так же было показано отсутствие мутаций генов ЕОЯ2, ИЕРЬяЫТАР у российских больных с НМСН 1 типа.

Установлено, что мутации гена РМР22 обусловливают 60% НМСН 1 типа в РФ, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена РМР22 в структуру заболеваемости НМСН 1 типа оценивается в Европе в 53,6-80%. Наиболее частая мутация - дупликация 17р11.2-р 12 - выявлена в 130 семьях; точковая мутация гена РМР22 выявлена в 1 семье, частичные дупликации/делеции гена РМР22 выявлены в 4 семьях.

Мутации гена СЛВ1 являются второй по частоте причиной НМСН 1 типа в РФ и составляют 20%, что также согласуется с литературными данными, по которым вклад гена СЗЫ в структуру заболеваемости НМСН 1 типа оценивается в Европе в 15-20%. Показана необходимость исследования не только кодирующего второго экзона гена ОЗВ1, но и его промоторной области и интрона. Поведено исследование распределения мутаций по доменам белка коннексина 32. В обследованной нами выборке больных отмечено преобладание мутаций, нарушающих аминокислотную последовательность второго ЕС домена, что связано с локализацией в ней повторяющихся мутаций.

В гене С/ВУ были выявлены повторяющиеся мутации, причиной распространенности которых являются локальные эффекты основателя. Также в

114 гене выявлены «горячие» точки, на долю мутаций в которых приходится

26% всех случаев НМСН IX типа.

На долю мутаций гена МР2 приходится 9% всех случаев НМСН 1 типа, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена МР2 в структуру заболеваемости НМСН 1 типа оценивается'в Европе в 5-10%. Определен спектр мутаций гена МР2 и распределение мутаций по доменам белка.

Проведено молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности гена ОИАР! и часто встречающихся по литературным данным мутаций генов БНЗТС2, ЫВЯа, РЮ4 и ГОИ4, ответственных за АР тип демиелинизирующих НМСН. Показано, что на долю АР миелинопатий приходится 1,8% всех случаев НМСН1, причем половина приходится на мутации гена СЭАР1.

В двух больших семьях, где не была выявлена причина заболевания, был проведен анализ сцепления со всеми известными АД локусами. Показана дальнейшая генетическая гетерогенность демиелинизурующей формы наследственной моторно-сенсорной нейропатии.

Нами проведен клинический анализ 34 признаков НМСН 1 типа в группах больных с мутациями генов РМР22, СЗВ1 и МРХ и больных, у которых мутаций в данных генах выявлено не было. В данном исследовании мы попытались выделить ядро клинических признаков, характерных для этих групп.

В результате, мы определили статистически достоверное отличие по нескольким признакам - резкое снижение СПИ (< 15м/с), возраст дебюта до 5 лег, гипостезия стоп и кистей, нарушение проприоцептивной чувствительности в ногах и руках, снижение/отсутствие карпо-радиального рефлекса, интенционный тремор кистей, мозжечковая атаксия, гипотрофия мышц голеней, асимметричность поражения - для группы больных с мутациями в гене МР2. Для других трех исследуемых групп не выявлено уникального набора симптомов и признаков.

Создан клинико-молекулярно-генетический алгоритм диагностики НМСН 1 типа у больных из РФ, в основу которого легли результаты проведенного исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Миловидова, Татьяна Борисовна, Москва

1. Дадали Е.Л. Наследственные нервно-мышечные заболевания: диагностика и медико-генетическое консультирование. Автореф. докг. дисс., М. 1999.

2. Мерсиянова И.В. Картирование и идентификация нового локуса аксональной формы наследственной мото-сенсорной нейропатии: Болезни Шарко-Мари-Тута II типа. Автореф. Канд. Дисс., М. 2001.

3. Миловидова Т.Б., Щагина O.A., Дадали E.JL, Поляков A.B. Классификация и алгоритмы диагностики различных генетических вариантов наследственных моторно-сенсорных полинейропатий. Мед. Ген. 4: 21-30, 2011

4. Тибуркова Т.Б., Щагина O.A., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Бабушкина Н.П., Поляков A.B. Исследование гена GJB1 в выборке российских больных с наследственной моторно-сенсорной нейропатией типа I. Мед. Ген. 7: 30-38, 2009

5. Шаркова И.В. Клинико-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии 1 X типа. Автореф. Канд. Дисс., М. 2004.

6. Щагина O.A., Дадали E.JL, Федотов В.П., Тибуркова Т.Б., Поляков A.B. Наследственная моторно-сенсорная полинейропатия типа 4А. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 5: 13-16, 2010

7. Anita SD, Saporta MD. Charcot-marie-tooth disease subtypes and genetic testing strategies. Ann Neurol. 69: 22-33, 2011

8. Basri R, Yabe I, Soma H, Matsushima M, Tsuji S, Sasaki H. X-linked Charcot-Marie-Tooth Disease (CMTX) in a Severely Affected Female Patient with Scattered Lesions in Cerebral White Matter. Internal Medicine. 46: 1023-1027, 2007

9. Bissar-Tadmouri N, Gulsen-Parman Y. Two novel mutations in the MPZ gene coding region in Charcot-Marie-Tooth type 1 patients of Turkish origin: S54P, I30del; GVYI29ins. Hum. Mutat. 14:449, 1999

10. Blanquet-Grossard F, Pham-Dinh D, Dautigny A. Charcot-Marie-Tooth type IB neuropathy: third mutation of serine 63 codon in the major peripheral myelin glycoprotein PO gene. Clin. Genet. 48:281-283, 1995

11. Boercoel CF, Takashima H, Garcia CA. Charcot-Marie- Tooth disease and related neuropathies: mutation distribution and genotype- phenotype correlation. Ann neurol. 51:190-201, 2002

12. Bone LJ, Deschenes SM, Balice-Gordon RJ, Fischbeck KH, Scherer SS. Connexin32 and X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis. 4:221230, 1997

13. Carpenter DA, Ip W. Neurofilament triplet protein interactions: evidence for the preferred formation of NF-L-containing dimers and a putative function for the end domains. J Cell Sci 109: 2493-2498, 1996

14. Casasnovas C, Banchs I, Corral J, Martínez-Matos JA, Volpini V. Clinical and molecular analysis of X-linked Charcot-Marie-Tooth disease type 1 in Spanish population. Clin. Genet. 70: 516-523, 2006

15. Chance PF, Abbas N, Lensch MW, Pentao L, Roa BB, Patel PI, Lupski JR. Two autosomal dominant neuropathies result from reciprocal DNA duplication/deletion of a region on chromosome 17. Hum. Mol. Genet. 3:223228, 1994

16. Chance PF, Bird TD, O'Connell P, Lipe H, Lalouel JM, Leppert M. Genetic linkage and heterogeneity in type I Charcot-Marie-Tooth disease (hereditary motor and sensory neuropathy type I). Am. J. Hum. Genet. 47: 915-925, 1990.

17. Chance P, Dracopoli N, Bird T, Housman DE, Summar M, Ketting R. Linkage relationships of Charcot-Marie-Tooth neuropathy (HMSNIb) to chromosome 1 markers. Cytogenet. Cell Genet. 46: 592, 1987.

18. Chow CY, Zhang Y, Dowling JJ, Jin N, Adamska M, Shiga K, Szigeti K, Shy ME, Li J, Zhang X, Lupski JR, Weisman LS, Meisler MH. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448:68-72, 2007

19. Claramunt R, L. Pedrola T. Sevilla. Genetics of Charcot-Marie-Tooth disease type 4A: mutations, inheritance, phenotypic variability, and founder effect. J Med Genet. 42:358-365, 2005

20. Claramunt R. Sevilla T, Lupo V, Cuesta A, Millan JM, Vilchez JJ, Palau F,

21. Espinos C. The p.R1109X mutation in SH3TC2 gene is predominant in Spanish Gypsies with Charcot-Marie-Tooth disease type 4. Clin. Genet. 71: 343-349, 2007

22. Cuesta AL, Pedrola T. Sevilla. The gene encoding ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 is mutated in axonal Charcot-Marie-Tooth type 4A disease. Nat Genet. 30:22-25, 2002

23. De Sandre-Giovannoli A, Chaoueh M, Boccaccio I. Phenotypic and genetic exploration of severe demyelinating and secondary axonal neuropathies resulting from GDAPI-nonsense and splicing mutations. J Med Genet. 40:87, 2003

24. Dubourg O, Tardieu S, Birouk N, Gouider R, Léger JM, Maisonobe T, Brice A, Bouche P, LeGuern E. Clinical, electrophysiological and molecular genetic characteristics of 93 patients with X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Brain 124: 1958-1967,2001

25. Dyck PJ, Lambert EH. Lower motor and primary sensory neuron disease with peroneal muscular atrophy. Arch. Neurol. 18: 603-618, 1968

26. Dyck PJ, Chance P, Lebo R, Carney JA. Hereditary motor and sensory neuropathies. In: Peripheral Neuropathy (eds: Dyck PJ, Thomas PK, Griffin JW, Low PA, Poduslo JF) Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1094-1136, 1993

27. Emery AE. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases a world survey. Neuromuscul Disord. 1:19-29, 1991

28. England A C, Denny-Brown D. Sensory changes, and trophic disorder, in peroneal muscular atrophy (Charcot-Marie-Tooth type). Arch. Neurol.1. Psychiat. 67: 1-22, 1952.

29. Fishman GI, Eddy RL, Shows TB, Rosenthal L, Leinwand LA. The human connexin gene family of gap junction proteins: distinct chromosomal locations but similar structure. Genomics 10: 250-256, 1991.

30. Gaboreanu FM, Hrstka R, Xu . Myelin protein zero/Po phosphorilation and function^ require an adaptor protein Jinking it to RACK and PKCa. J. Cell Biol. 177:707-716, 2007

31. Gerding WM, Koetting J, Epplen JT, Neusch C. Hereditary motor and4 sensory neuropathy caused by a novel' mutation in LITAF. Neuromuscul Disord. 19:701-703, 2009

32. Hahn AF, Brown WF, Koopman WJ, Feasby TE. X-linked dominant hereditary motor and sensory neuropathy. Brain 113: 1511-1525, 1990

33. Hayasaka K, Himoro M, Sato W, Takada G, Uyemura K, Shimizu N, Bird TD, Conneally PM, Chance PF. Charcot-Marie-Tooth neuropathy type IB is associated with mutations of the myelin P(0) gene. Nature Genet. 5: 31-34, 1993

34. Herringham WP. Muscular atrophy of the peroneal type affecting many members of a family. Brain. 11: 230-236, 1889

35. Hoffman PN, Lasek RJ. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. J Cell Biol. 66: 351-366, 1975

36. Houlden H. Mutations in, the 5' region of the myotubularin-related protein 2 (MTMR2) gene in autosomal recessive hereditary neuropathy with focally folded myelin. Brain. 124:907-915, 2001

37. Hu X, Ma M, Dahl G. Conductance of connexin hemichannels segregates with the first transmembrane segment. Biophys J. 90(1): 140-150, 2006

38. Huang Y, Sirkowski EE, Stickney JT, Scherer SS. Prenylation-defective humanconnexin32 mutants are normally localized and function equivalently to wild-type connexin32 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 25: 7111-7120, 2005

39. Hurst J, Flavell D, Julien JP, Meijer D, Mushynski W, Grosveld F. The human neurofilament gene (NEFL) is located on the short arm of chromosome 8. Cytogenet. Cell Genet. 45:30-32, 1987

40. Ionasescu W, Searby C, Ionasescu R, Neuhaus IM, Werner R. Mutations of the noncoding region of the connexin32 gene in X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Neurology 47: 541-544, 1996

41. Ionasescu W. X-linked Charcot-Marie-Tooth disease and connexin32. Cell Biol Int. 22: 807-813, 1998

42. Jeffery M Vance Hereditary motor and sensory neuropathies. J Med Genet. 28:1-5, 1991

43. Julien JP, Mushynski WE. Neurofilaments in health and disease. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 61:1-23, 1998

44. Kalaydjieva L, Gresham D, Gooding R, Heather L, Baas F, de Jonge R, Blechschmidt K, et al. () N-myc downstream-regulated gene 1 is mutated in hereditary motor and sensory neuropathy-Lom. Am J Hum Genet. 67:47-58, 2000

45. Kamholz J, Menichella D, Jani A, Garbern J, Lewis RA, Krajevvski KM, Lilien J, Scherer SS, Shy ME. Charkot-Marie-Tooth disease type 1: molecular pathogenesis to gene teraphy. Brain. 123:222-33, 2000

46. Kochanski A, Kabzinska D. Molecular genetic analysis of the GJB1 gene: a study of six mutations. J Appl Genet. 45:95-100, 2004

47. Kumar NM, Gilula NB. Cloning and characterization of human and rat liver eDNAs coding for a gap junction protein. J. Cell Biol. 103: 767-776, 1986

48. Laird DW. The life cycle of a connexin: gap junction formation, removal, and degradation. J Bioenerg Biomembr. 28: 311-318, 1996

49. Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol 122: 1337-1350, 1993

50. Lupski R, Chance PF, Garcia CA. Inherited primari peripheral neuropathies: molecular genetics and clinical implications of CMT1A and HNPP. JAMA 270: 2326, 1993

51. Lupski JR, Wise CA, Kuwano A, Pentao L, Parker J, Glaze D, Ledbetter D, Greenberg F, Patel PI. Gene dosage is a mechanism for Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Nature Genet. 1: 29-33, 1992

52. Marques W Jr, Hanna MG. Phenotypic variation of a new P0 mutation in genetically identical twins. Neurology. 246: 596-599, 1999

53. Matejas V, Huehne K, Thiel C, Sommer C, Jakubiczka S, Rautenstrauss B. Identification of Alu elements mediating a partial PMP22 deletion. Neurogenetics 7(2): 119-26, 2006.

54. McMillan J.C., Harper P.A. Clinical genetics in neurological disease. J. neurol. neurosurg. psychiatr. 57(1): 7-15, 1994

55. Menichella DM, Goodenough DA, Sirkowski E, Scherer SS, Paul DL. Connexins are critical for normal myelination in the CNS. J Neurosci. 23: 5963-73, 2003

56. Middleton-Price HR, Harding AE, Monteiro CJ, Berciano J, Malcolm S. Linkage of- hereditary motor and sensory neuropathy type I (HMSNI) to the pericentromeric region of chromosome 17. Cytogenet. Cell Genet. 51:1044, 1989.

57. Nakagawa T, Chen J, Zhang Z, Kanai Y, Hirokawa N. Two distinct functions of the carboxyl-terminal tail domain of NF-M upon neurofilament assembly: cross-bridge formation and longitudinal elongation of filaments. J Cell Biol 129:411-29, 1995

58. Nelis E, Haites N and Van Broeckhoven C. Mutations in the peripheral myelin genes and associated genes in inherited peripheral neuropathies. Hum Mutat .13:11-28, 1999

59. Nelis E, Timmerman V, De Jonghe P. Rapid screening of myelin genes in CMT1 patients by SSCP analysis: identification of new mutations and polymorphisms in the P0 gene. Hum Genet. 94:653-657, 1994

60. Nelis E, Van Broeckhoven C. Estimation of the mutation frequencies in Charcot-Marie-Tooth disease type 1 and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies: a European collaborative study. Eur. J. Hum. Genet. 4: 2533, 1996.

61. Nelis ES, Erdem PY, Van Den Bergh. Mutations in GDAP1: autosomal recessive CMT with demyelination and axonopathy. Neurology. 59: 18651872, 2002

62. Nicholson GA, Dawkins JL, Blair IP, Kennerson ML, Gordon MJ, Cherryson AK. Nash J, Bananis T. The gene for hereditary sensory neuropa-thy type I (HSN-1) maps to chromosome 9q22.1-q22.3. Nature Genet. 13: 101-104, 1996

63. Pareyson D, Taroni F, Botti S, Morbin M, Baratta S, Lauria G, Ciano C, Sghirlanzoni A. Cranial nerve involvement in CMT disease type 1 due to early growth response 2 gene mutation. Neurology 54: 1696-1698, 2000

64. Park HK, Kim BJ, Sung DH, Ki CS, Kim JW. Mutation analysis of the PMP22, MPZ, EGR2, LITAF, and GJB1 genes in Korean patients with Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1. Clin Genet. 70: 253-256, 2006

65. Parman Y, Battaloglu E, Baris I, Bilir B, Poyraz M, Bissar-Tadmouri N, Williams A, Ammar N, Nelis E, Timmerman V, De Jonghe P, Necefov A, Deymeer F.

66. Serdaroglu P, Brophy PJ, Said G. Clinicopathological and genetic study of early-onset demyelinating neuropathy. Brain. 127:2540-2550, 2004

67. Priest JM, Fischbeck KH, Nouri N, Keats BJ. A locus for axonal motor-sensory neuropathy with deafness and mental retardation maps to Xq24-q26. Genomics. 29: 409-412, 1995

68. Rautenstrauss B, Nelis E. Identification, of a de novo insertional mutation in P0 in a'patient with a Dejerine-Sottas syndrome (DSS) phenotype.- Hum. Mol. Genet. 1701-1702, 1994

69. Ressot C, Gomes D, Dautigny A, Pham-Dinh D, Bruzzone R. Connexin32 mutations associated with X-linked Charcot-Marie-Tooth disease: show two distinct behaviors: loss of function and altered gating properties. J Neurosci. 18:4063-75, 1998

70. Silander K, Meretoja P, Pihko. Screening for connexin 32 mutations in Charcot-Marie-Tooth disease families with possible X-linked inheritance. Hum Genet. 100: 391-397, 1997

71. Skre H. Genetic and clinical aspects of Charcot-Marie-Tooth's disease. Clin Genet. 6: 98-118, 1974

72. Somerville MJ, McLachlan DR, Percy ME. Localization of the 68000-Da human neurofilament gene (NF68) using a murine cDNA probe. Genome 30: 499-500, 1988

73. Song S, Zhang Y, Chen B, Zhang Y, Wang M, Wang Y, Yan M, Zou J, Huang Y, Zhong N. Mutation frequency for Charcot-Marie-Tooth disease type 1 in the Chinese population is similar to that in the global ethnic patients. Genet Med. 8: 532-535, 2006

74. Street VA, Bennett CL, Goldy JD, Shirk AJ, Kleopa KA, Tempel BL, Lipe HP, Scherer SS, Bird TD, Chance PF. Mutation of a putative protein degradation gene LITAF/SIMPLE in Charcot-Marie-Tooth disease 1C. Neurology 60: 22-26, 2003

75. Street VA, Goldy JD, Golden AS, Tempel BL, Bird TD, Chance PF. Mapping of Charcot-Marie-Tooth disease type 1C to chromosome 16p identifies a novel locus for demyelinating neuropathies. Am. J. Hum. Genet. 70: 244-250, 2002.

76. Suter U, Snipes GJ, Schoener-Scott R, Welcher AA, Pareek S, Lupski JR,

77. Murphy RA, Shooter EM, Patel PI. Regulation of tissue-specific expression of alternative peripheral myelin protein-22 (PMP22) gene transcripts by two promoters. J Biol Chem. 269: 25795-25808, 1994

78. Suter U, Welcher AA, Ozcelik T, Snipes GJ, Kosaras B, Francke U, Billings-Gagliardi S, Sidman RL, Shooter EM. Trembler mouse carries a point mutation in a myelin gene. Nature 356: 241-244, 1992a

79. Thomas PK, Calne DB, Stewart G. Hereditary motor and sensory polyneuropathy (peroneal muscular atrophy). Ann. Hum. Genet. 38: 111-153, 1974

80. Uemyra K, Kitamyra K, Miura M. Structure and molecular biology of Po protein. In: Martenson RE, editor. Myelin: biology and chemistry. Boca Raton (FL) : CRC Press. 481-508, 1992

81. Uemura K, Kitamura K, Miura M. Structure and molecular biology of Po protein. In: Martenson RE, editor. Myelin: biology and chemistry. Boca Raton (FL) : CRC Press; 1992. p.481-508

82. Valentijn LJ, Baas F, Wolterman RA, Hoogendijk JE, van den Bosch NH, Zorn I, Gabreels-Festen AW, de Visser M, Bolhuis PA. Identical pointmutations of PMP-22 in Trembler-J mouse and Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Nat Genet. 2:288-291, 1992

83. Vance JM. Hereditary motor and sensory neuropathies. J. Med. Genel. 28: 1-5, 1991

84. Vance JM, Barker D, Yamaoka LH, Stajich JM, Loprest L, Hung WY, Fischbeck K, Roses AD, Pericak-Vance MA. Localization of Charcot-Marie-Tooth disease type la (CMT1A) to chromosome 17pll.2. Genomics 9: 623628, 1991

85. Vance JM, Nicholson G, Yamaoka LH, Stajich J, Stewart CS, Speer C, Hung WY, Roses AD, Barker D, Gaskell PC, Pericak-Vance MA. Linkage of Charcot-Marie-Tooth neuropathy type la to chromosome 17. Cytogenet. Cell Genet. 51: 1097-1098* 1989.

86. Warner LE, Mancias P, Butler IJ. Clinical phenotype of different MPZ (Po) mutations may include Charcot-Marie-Tooth type IB, Dejerin-Sottas and congenital hypomyelination. Neuron. 17: 451-460, 1996

87. Willecke K, Jungbluth S, Dahl E, Hennemann H, Heynkes R, Grzeschik KH. Six genes of the human connexin gene family coding for gap junctional proteins are assigned to four different human chromosomes. Europ. J. Cell Biol. 53: 275-280, 1990