Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка программы дифференциальной диагностики болезней дыхательной цепи митохондрий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка программы дифференциальной диагностики болезней дыхательной цепи митохондрий"

РГ® од

р и ЯНЯ ПОЗ

Российская академия медицинских наук ^

Меднко-генетическнй научный цгнтр

На правах рукописи УДК 616.056.7+577.121

ЗАХАРОВА

ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ПРОГРАММЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНЕЙ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ.

03.00.15- Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2000

Работа выполнена в лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного Центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор |К.Д.Краснопольская| Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.И. Маевский доктор медицинских наук, профессор С.И. Козлова

Ведущее учреждение: Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится «.<?*?>>..2000 года в «.//..>. часов на заседании Диссертационного совета Д.001.16.01. при Медико-генетическом научном центре (МГНЦ) РАМН. По адресу: г.Москва, 115478, ул. Москворечье д 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН

02 V!

Автореферат разослан «><?..»......-п/..................2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

■) • )

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Болезни дыхательной цепи митохондрий (БДЦМ)-сравнительно недавно открытая группа наследственных болезней обмена веществ (НБО), входящая в класс митохондриальных болезней (МБ) (DiMauro, S., Bonilla, Е 1987). Популяционная частота БДЦМ точно не определена не только в стране, но и за рубежом, хотя по литературным данным эти заболевания имеют существенный удельный вес в наследственной патологии человека (Robinson В.Н, 1993). Пять комплексов дыхательной цепи митохондрий (КДЦ), выполняют важнейшую функцию -обеспечение энергией в виде молекул АТФ биохимических процессов, осуществляемых на клеточном уровне. 13 полипептидов КДЦ кодируются митохондриальной ДНК (мтДНК), и около 70 полипептидов - ядерными генами. Мутационное изменение пептидов, входящих в состав КДЦ, сопровождается снижением продукции энергии во всех клетках организма, что приводит к нарушению их функции. БДЦМ во многом отличаются от других групп НБО благодаря двойному генетическому контролю над КДЦ и особенностям генетики митохондрий. Двойной генетический контроль определяет уникальную генетическую гетерогенность этих заболеваний, наличие множества копий мтДНК в цитоплазме одной клетки создает феномен гетероплазмии, а различие в энергетической потребности различных органов и тканей определяет феномен пороговой экспрессии фенотипа (De Vivo, D. С., 1992). Все эти факторы создают серьезные трудности диагностики этой группы заболеваний. Кроме обычных для НБО проблем медико-генетического консультирования (МГК), связанных с выраженным клиническим и биохимическим полиморфизмом и наличием гено - и фенокопий, при БДЦМ прибавляются проблемы исключительного внутрисемейного полиморфизма, наличия неполных и перекрывающихся фенотипов,

что затрудняет даже формирование идеи о принадлежности к БДЦМ и ограничивает диагностическую значимость существующих методов. При этом БДЦМ относятся к числу инвалидизирующих, прогрессирующих НБО, проблемы МГК которых, необходимо решать в практике здравоохранения любой страны. В практике отечественного МГК к началу данного исследования не существовало программы диагностики этих заболеваний на клиническом, биохимическом и молекулярно-генетическом уровне. Все эти факторы определяют актуальность данного исследования.

Цель работы. Разработка программы диагностики и дифференциальной диагностики обширной группы БДЦМ, обусловленных мутациями мтДНК, и оценка эффективности диагностических методов. Задачи исследования.

1. Разработка клинических показаний для формирования групп риска с БДЦМ в целом и выявления набора симптомов и признаков, характерных для определенных синдромов.

2. Исследование диагностически значимых биохимических маркеров в биологических жидкостях больных с различными формами БДЦМ.

3. Исследование активности КДЦ в мышечном биоптате больных.

4. Разработка подходов :•: ДНК-диагностике и анализ спектра мутаций при БДЦМ у российских больных.

5. Анализ гено-фенотипических корреляций у больных с БДЦМ.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые на репрезентативной выборке больных разработана и апробирована программа диагностики БДЦМ. С помощью этой программы выявлены спектры характерных для БДЦМ в целом и "уникальных" для различных типов БДЦМ симптомов и признаков, разработана карта описания клинических фенотипов для больных с БДЦМ и схемы проведения биохимического обследования больных. В ходе выполнения работы решены следующие задачи, имеющие принципиальное значение для практики МГК: охарактеризован спектр симптомов и признаков, характерных для БДЦМ, разработана схема диагностики и окончательного установления диагноза,

впервые проведено исследование спектра мутаций мтДНК у российских больных с различными формами БДЦМ.

В совокупности результаты данного исследования создают базу для диагностики БДЦМ, что имеет принципиальное значение для МГК отягощенных семей и использования метаболической терапии, которая разработана для этой группы НБО. Положения, выносимые на защиту.

1.Ha основании комплексного клинико-генеалогического, биохимического и молекулярно-генетического обследования 61 пациента с БДЦМ разработана программа верификации этой группы заболеваний и проведена оценка эффективности диагностических процедур.

2. Разработаны клинические критерии диагностики БДЦМ в целом и охарактеризованы уникальные симптомы и признаки для наиболее распространенных форм БДЦМ (синдрома MELAS, синдрома KSS, болезни Лея).

3. Показано, что диагностическая ценность повышения концентрации лактата, пирувата, 3-гидроксибутирата и соотношений лактат/пируват, 3-гидроксибутират/ ацетоацетат в крови неравнозначна для исследуемых групп БДЦМ. Наибольшее диагностическое значение (приближающееся к 100%), имеет измерение концентрации лактата на фоне глюкозной кривой.

4. На основании измерения активностей ферментов, входящих в состав (I-IV) комплексов дыхательной цепи митохондрий у 18 больных установлен точный биохимический дефект.

5. Идентифицировано 22 мутации мтДНК (из них 7 точковых и 15 делеций варьирующих размеров). Точковые мутации были обнаружены у больных с клиническими синдромами MELAS, KSS, MERRF, а делеции - у больных с клиническими синдромами K.SS, СРЕО, MELAS, MERRF.

6. Показано отсутствие четких гено-фенотипических корреляций у больных с идентифицированными мутациями мтДНК.

Зублнкацни.

lo основным положениям диссертации опубликовано 10 научных работ. Апробация работы.

'езультаты исследования были представлены на 2 (4) съезде медицинских генетиков 2000г) и межлабораторном семинаре Института клинической генетики МГНЦ РАМН 2000г).

Объем и структура диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложений и списка литературы. Диссертация изложена на // è страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунком и лг таблицами.

Библиографический указатель содержит 136 источников, из них 129 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Характеристика выборки больных.

Клиническое и параклиническое обследование больных детского возраста (1-15лет) проводилось на базе Республиканской детской клинической больницы (РДКБ) е отделениях психоневрологии, (зав.отделением ПНО-1 Пилия C.B., зав.отделена ПНО-2 Ильина Е.С.). Клиническое и параклиничекое обследование взрослогс контингента больных (15-35лет) проводилось в Клинике нервных болезней ММА им Сеченова (завкафедрой нервных болезней академик РАМН, проф. Яхно Ц.Н.) Институте неврологии РАМН (зав.отдел.нейрогенетики проф.Иванова-Смоленская И. А зав.отд.медленных нейроинфекций проф.Завалишин И.А.)

Морфологическое исследование мышечных биоптатов проводилось в МНИ! педиатрии и детской хирургии (д.м.н Сухорукое B.C.) и в Институте теоретической экспериментальной биофизики РАН г. Пущино (к.б.н. Погорелов Г.Н.). Биохимические методы. Материлом для биохимических исследований являлась кров; и мышечные биоптаты пациентов и здоровых доноров. Концентрацию лактата пирувата и 3-гидроксибутрата в крови определяли энзиматическим методом и использованием ВЭЖХ (Daish P. et all, 1985; Frits А., 1991). Активность КДЩ\ измеряли в образцах мышечной ткани полученных при проведении открыто; мышечной биопсии m.quadriceps femori, стандартными меодами (Fischer J. et all 1985).

Молекулярно-генетические методы. Для молекулярно-генетических исследовани использовали ДНК, выделенную из клеток периферической крови и мышечны биоптатов. Для обнаружения точковых мутаций мтДНК использовались стандартнь методы ПЦР-анализа с последующим рестрикционным анализом. Нами бьи проведено исследование на следующие мутации мтДНК : A3443G, A3260G, Т327И A8344G, A8356G, Т8993С, T8993G. (Goto, Y.,et all, 1990,1991; Silvestri, G. et all,199

Zeviani, M. et all, 1991 ). Для обнаружения делеций мтДНК нами был использован метод Long-PCR.( Ferlin, T., Guironnet, С , et all, 1997).

Результаты проведенных исследований н обсуждение.

Разработка программы диагностики БДЦМ базировалась на общих принципах, применяемых для НБО. НБО являются уникальным классом заболеваний у человека, в диагностике которых не клиническим, а биохимическим и молекулярно-генетическим методам принадлежит главенствующая роль. Общая структура разработанной программы представлена на рис. 1.

Приступая к разработке этой программы, мы создали унифицированную карту регистрации клинического фенотипа, которая включала 110 симптомов и признаков, которые по литературным данным наиболее часто встречаются при БДЦМ, результаты параклинических и генеалогических обследований, что в совокупности обеспечивало предположительное выявление отягощенных семей.

Этап подтверждения диагноза включал анализ концентрации метаболитов и измерение активности ферментов. С помощью молекулярно-генетических методов нами выявлялись мутации мтДНК, однозначно этиологически связанные с клиническим фенотипом Диагноз БДЦМ был подтвержден у 61 пациента. Клинически у больных диагностированы: "синдром MELAS" (п= 18), "синдром MERRF" (п=11), "синдром KSS"(n=17), "синдром СРЕО"(п= 7), "Болезнь Лея" (п= 8).

Характеристика клинического полиморфизма и критерии клинической диагностики БДЦМ. С целью выявления клинических показаний, для исключения БДЦМ в целом нами была проведена статистическая обработка унифицированных карт клинического фенотипа пациентов с точно установленным диагнозом БДЦМ, что позволило очертить типичный симптомокомплекс БДЦМ. Эти симптомы и признаки встретились более чем в 50% случаев (таблица1). Вычленение этих симптомов и признаков имеет существенную практическую значимость, поскольку факт перекрывания клинических фенотипов друг с другом является объективной реальностью

Для отдельных синдромов нами были выделены «уникальные» симптомы и признаки.

Рис 1. Структура программы диагностики БДЦМ.

Подтверждение диагноза

Таблица 1. Типичные симптомы и признаки.

Клинические симптомы и признака Частота (%)

мышечная гипотония 89

мышечная слабость 79

офтальмоплегия 69

мышечная гипотрофия/атрофия 65

миопатия лицевой мускулатуры 65

полуптоз/птоз 65

атаксия 59

задержка/регресс моторного развития 56

нарушения сердечного ритма 55

изменение толерантности к глюкозе 55

снижение остроты зрения 54

К числу "уникальных" относились те симптомы и признаки, вероятность появления которых для каждого определенного синдрома существенно превышала (более, чем в 5 раз) вероятность их появления среди всех других синдромов рис.2. Клиническое разнообразие, наличие неполных клинических фенотипов, а также малочисленность выборки по каждой из нозологических форм позволили сформулировать перечень "уникальных" симптомов и признаков только для групп синдромов MELAS (n=3), KSS (п-4), Болезнь Лея (п=8).

РИС 2. "УНИКАЛЬНЫЕ СИМПТОМЫ В ПРИЗНАКИ1* БДЦМ.

БОЛЕЗНИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ (БДЦМ)

т

УНИКАЛЬНЫЕ СИМПТОМЫ И ПРИЗНАКИ'

I

¡L

MELAS Болезнь ЛЕЯ KS£

-инсульго- - пирамидная - пигментная

подобное симптоматика дегенерация

состояние - задержка/регресс сетчатки

- тремор психоречевого - задержка роста

- расстройства развития - гипотрофия

сознания - нарушения

- кровоизлияние сердечного

в мозг (МРТ) ритма

- изменение толерантности к

глюкозе

- миопатия скелет-

ных мышц

- синдром "вялого"

ребенка

-отек вещества

мозга (КТ/МРТ)

-некротизирующая

энцефалопатия

(МРТ)

Исследование метаболитов (лактата, пирувата, 3-гндроксибутирата н ацетоацетата) и оценка их диагностической значимости.

Повышение концентрации лактата, з-гидроксибутирата, а также соотношения лакгат/пируват, 3-гидроксибутират/ацетоацетат являются важными биохимическими маркерами нарушения окислительного фосфорилирования. При обследовании нами выявлено

-диагностическое значение повышения концентрации этих метаболитов не является абсолютной;

- диагностическая ценность этих показателей после пищевой нагрузки выше, чем натощак;

-диагностическая значимость неравнозначна для исследуемых групп, (рис. 3,4,5) В качестве дополнительного теста, увеличивающего нагрузку на ДЦМ, нами проводились нагрузка глюкозой и измерение концентрации лактата на фоне глюкозной кривой. Выявлено, что концентрация лактата, измеренная на фоне глюкозной кривой, статистически достоверно отличалась у больных от нормы (рис. 6). Этот тест, провоцирующий несостоятельность ДЦМ У потенциальных больных, может быть использован в тех случаях, когда концентрация лактата, измеренная до и после пищевой нагрузки, приближается к нормальной, что затрудняет интерпретацию этого показателя.

При оценке уровней среднего значения этих метаболитов в отдельных группах БДЦМ )ыявлено, что средний уровень концентраций лактата убывает в ряду "синдром \ЯЕЬА8"-"болезнь Лея"-("синдром МЕИЦ^синдром КБ8)-"синдром СРЕО", хотя ггатистически достоверные различия (при уровне доверительной вероятности 0,95) тблюдаются не между всеми изучаемыми группами, (рис. 7,8).

} случае 3-ОН-бутирата наиболее высокие значения уровня этого метаболита выявлены | группе "болезнь Лея", которые статистически достоверно отличаются от других рупп БДЦМ до пищевой нагрузки. (рис. 9,10)

100' 908070-

MELAS Leigh MERRF KSS CPEO

¡□лактат ИЗ-ОН-бугират

Рис 3. Распределение больных с повышенным уровнем ластата и 3-ОН-бутирата до пищевой нагрузки

MELAS Leigh MERRF KSS CPEO

□ лактат ЕЗЗ-ОН-бутират

Рис 4. Распределение больных с повышенным уровнем ластата и З-ОН-бутирап после пищевой нагрузки.

МЕШв 1.в)д>1 МЕЮТ КЭЭ СРЕО

□ лактат/пируват до пищевой нагрузки !олактат/пируват после пищевой нагрузки ¡п 3-ОН-бутират/ацетоацетат до пищевой нагрузки ; □ 3-ОН-бутират/ацетоацетат после пищевой нагрузки

Рис 5. Распределение больных с повышенным соотношением лактат/пируват н 3-ОН-бутират/ацетоацетат

Концентрация (мМ)

пациентов с БДЦМ П- Область изменения концентрации лактата в норме

Рис 6. Концентрация лактата в крови на фоне глюкозной кривой.

38 3«

3

S"

CL | 18

Рис.7 Концентрация лактата в крови (до пищевой нагрузки) у больных с различными типами БДЦМ.

MELAS LECH МЕИ* KSS

Рис.8 Концентрация лактата в крови (после пищевой нагрузки) у больных с различными типами БДЦМ.

Рис.9 Концентрация 3-ОН-бутирата в крови (до пищевой нагрузки) у больных с различными типами БДЦМ.

МЕГИР

Рис. 10 Концентрация 3-ОН-бутнрата в крови (после пищевой нагрузки) у больных с различными типами БДЦМ.

Установление биохимического дефекта. С целью установления точного биохимического дефекта проводилось измерение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий в мышечном биоптате больных с различными формами БДЦМ. на этом этапе исследовали образцы мышечных биоптатов 31 пациента. Активность ферментов выражали в общепринятых единицах и в относительных единицах (в пересчете на цитрат - синтазу). В нашей выборке снижение активности ферментов КДЦМ (1-4) обнаружено у 61% обследуемых больных (п=18). Наиболее частым дефектом, встретившимся в нашей выборке, являлась недостаточность 4 КДЦМ и 1+3 КДЦ Резкое снижение активности одного из КДЦМ (менее 10% от нормы) выявлено только в группе "болезнь Лея". Сочетанное поражение нескольких КДЦМ выявлено у 4 больных, относящихся к разным синдромам.

Выявлено, что не существует четко выраженной корреляции между биохимическим дефектом определенного КДЦМ и клиническим фенотипом, поэтому вне зависимости от клинического фенотипа для подтверждения диагноза БДЦМ необходимо проводить измерение активности всех КДЦ И если снижение активности фермента найдено, это, безусловно, говорит в пользу диагноза БДЦМ. Установление молекулярно-генетического дефекта.

Широкий спектр мутаций мтДНК не позволяет исключить все известные мутации у больного, поэтому в нашей программе мы использовали только анализ наиболее частых мутаций. В клетках крови у 57 пациентов и мышечных биоптатах у 30 больных вне зависимости от клинического фенотипа, мы проводили анализ следующих мутаций мтДНК

- точковые мутации (А32430, А83440, Т3271С, Т8993С, Т&9930, А32600, Т8356С)

- делении мтДНК (в области митохондриального генома -5700-16000 п.н ).

Так как нарушения при БДЦМ могут носить органоспецифичный характер, адекватный выбор анализируемой ткани играет существенную роль в подтверждении диагноза БДЦМ. Так, традиционное использование образцов крови для верификации диагноза в ряде случаев может привести к ложноотрицательным результатам из-за отсутствия или малого процента мутантной ДНК в клетках крови. Поскольку по литературным данным многие мутации ассоциированы с определенным клиническим фенотипом, исследование начиналось со скрининга на мутации, которые наиболее характерны для данного синдрома, и затем дополнялось анализом на другие мутации в зависимости от клинических признаков.

В нашей выборке у 23 пациентов были обнаружены мутации мтДНК. 7 из них были точковыми. Замена А —»G в положении 3243 обнаружена у 6 больных из 5 семей. Замена A —*G выявлена в положении 8344 у одного пациента в клетках крови. Дру! ие точковые мутации нами обнаружены не были.

Делеции мтДНК варьирующих размеров были обнаружены у 16 больных. 10 мутаций (из них 6 точковых) были обнаружены в клетках крови. Таким образом, диагностическая информативность клеток крови при проведении ДНК-диагностики, в особенности точковых форм, достаточно высока. Поэтому использование этого метода в диагностике БДЦМ может существенно ускорить и упростить процесс окончательной постановки диагноза и избежать проведения мышечной биопсии. Анализ гено-феиотнпических корреляций. При анализе гено-фенотипических корреляций нами установлено в 15 случаях соответствие клинического синдрома молекулярно-генетическим данным И в 8 случаях - несоответствие (Таблица 2). Это несоответствие связано с неполным развитием клинического фенотипа у пациента на момент обследования и перекрыванием клинических симптомов между клиническими формами БДЦМ, поэтому больные с перекрывающимися или неполными синдромами должны быть скриннрованы на все возможные мутации, начиная с наиболее частых. Мутация A3243G была обнаружена нами у 6 пациентов из 5 семей. Несмотря на описанную в литературе ассоциацию между синдромом MELAS и мутацией A3243G, некоторые из наших пациентов, у которых была обнаружена данная мутация, не имели полного клинического фенотипа синдрома MELAS, и один пациент по совокупности клинических признаков был отнесен к синдрому K.SS. Так, клинические признаки, характеризующие синдром MELAS, были выявлены у четырех больных (таблица 3). Но даже среди этой группы больных один или несколько симптомов являлись атипичными: эндокринные нарушения (гипотиреоз и сахарный диабет), увеличение печени. Пигментная дегенерация сетчатки (п=3), птоз (п=4) и прогрессирующая наружная офтальмоплегия (п=3), встретившиеся в нашей выборке, по литературным данным характерны для синдрома KSS, который в большинстве случаев ассоциирован с крупными перестройками мтДНК. Поэтому эти пациенты, скорее, могут быть отнесены к "смешанной" группе. Более того, инсультоподобные состояния - ключевой признак клинической манифестации синдрома MELAS - у 2 больных на момент обследования не выявлялся, а у 1 - присоединился по мере прогрессировать заболевания. Один пациент из нашей выборки (Т.Д.) по совокупности клинических признаков был отнесен к синдрому KSS. В отличие от других пациентов из нашей выборки у этого пациента

мутация /\3243G была обнаружена в гетероплазмическом состоянии только в мышечной ткани.

Таблица 2. Соответствие клинического фенотипа результатам молекулярно-генетического исследования.

Пациент Клинический синдром Мутация мтДНК Синдром, соответствующий мутации

Ю.М. MELAS A3243G MELAS

П.Ю. MELAS A3243G MELAS

т.д.* KSS A3243G MELAS

C.B. MELAS A3243G MELAS

С.Ю.* KSS A3243G MELAS

А.Ю. MELAS A3243G MELAS

К.С.* MELAS Del-7100 KSS/CPEO

С.Ж. MERRF A8344G MERRF

П.Д.* MELAS Del-5000 KSS/CPEO

Б.О.* MELAS Del-5000 KSS/CPEO

C.B.* MERRF Del -5000 KSS/CPEO

Б. Л.* MERRF Del -6400 KSS/CPEO

А.А.* MERRF Del-5000 KSS/CPEO

Р.О. CPEO Del-7700 KSS/CPEO

Х.С. KSS Del -5000 KSS/CPEO

з.д. CPEO Del-6200 KSS/CPEO

К.М. KSS Del -9500 KSS/CPEO

Б.Т. CPEO Del -5000 KSS/CPEO

Г.Ю. KSS Del -7300 KSS/CPEO

С.С. KSS Del -5000 KSS/CPEO

К.Д KSS Del -9300 KSS/CPEO

К.О. KSS Del -5000 KSS/CPEO

•-несоответствие клинического фенотипа результатам молекулярно-генетического исследования.

Особый интерес представляет семейный случай заболевания (пациенты С.Ю. и C.B.). У обоих сибсов отмечается наличие типичных для БДЦМ симптомов и признаков, спеюр которых более выражен у младшей сестры (C.B.). Кроме того, у девочки имеелся ряд "уникальных" для MELAS симптомов; инсультоподобные эпизоды в анамнезе, кальцификация в области подкорковых узлов симметрично с обеих сторон, (по данным КТ). У сибса больной С.Ю., 21 года, с 16-летнего возраста отмечались жалобы на общую слабость, снижение массы тела, отставание роста, частые простудные заболевания и желудочно-кишечные расстройства.

Таблица 3. Клинический фенотип бальных с мутацией MELAS A3243G.

Пациент СВ.* С.Ю.* А. Т. ю.м. ПС. Т.Д.

Клинические признаки, характерные для синдрома MELAS

Энцефалопатия (деменция) + - + • - -

Мышечная гипотония + + + + + +

Лактат-ацидоз + + + + + +

Инсультоподобные состояния + + + + •

Судороги + - + + + -

Мигренеподобные головные боли + • + •

Часто встречающиеся при синдроме MELAS клинические признаки.

Задержка роста + + - + - +

Геми-/тетра парез + - + - - -

Снижение слуха - - - - + -

Атаксия + - + - + -

Гемианопсия - - - - + -

Редкие и нехарактерные для синдрома MELAS признаки.

Нарушение сердечной проводимости + • + ■ +

Сахарный диабет - - - - + -

Наружная/внутренняя офтальмоплегия + + ■ т +

Пигментная дегенерация сетчатки + • +

Гипотиреоз - - + - - -

Птоз/полуптоз + + + - + +

Гепатомегапия + - + - - -

Заболевание манифестировало правосторонним полуптозом, выявленным после рождения, который расценивался как индивидуальная фенотипическая особенность. Идентификация у пациентов C.B. и С.Ю. одной и той же мутации мтДНК характеризует два специфических свойства болезней дыхательной цепи митохондрий: материнский тип наследования и выраженный внутрисемейный клинический полиморфизм.

Наиболее частым биохимическим дефектом при мутации A3243G является поражение 1 и 4 КДЦ. Анализ активностей КДЦ проводили в мышечном биоптаге 4 больных с установленной мутацией. В нашей выборке больных у 3 пациентов выявлена недостаточность 1+3 и 4 КДЦМ, что хорошо согласуется с литературными данными. Интересно, что у пациента Т.Д. активность ферментов была в пределах нормы, а у пациента С.Ю., несмотря на более мягкое течение заболевания, остаточная активность ферментов КДЦМ была ниже, чем у более тяжело пораженной сестры (C.B.). Такое клиническое разнообразие проявлений данной мутации не может быть полностью объяснено процентным соотношением между мутантными и нормальными молекулами мтДНК, и молекулярные механизмы патогенеза заболевания, обусловленные мутацией A3243G, остаются не до конца понятными. Вероятно, в реализации клинического фенотипа существенную роль играет взаимодействие между двумя геномами - ядерным и митохондриальным.

Заключение.

Основным содержанием данного исследования являлась разработка программы диагностики БДЦМ и апробация ее на представительной выборке больных. Такая задача впервые ставилась в практике отечественной медицины. Следует подчеркнуть, что данная программа диагностики распространяется не на все БДЦМ, а только на те из них, которые обусловлены мутациями митохондриального генома. Однако патогенетичеекие механизмы при мутациях ядерных и митохондриальных генов могут или совпадать, когда речь идет о полипептидах КДЦ, либо существенно перекрываться, когда речь идет о мутационном повреждении неизвестных еще белков, обеспечивающих функционирование КДЦ, как это имеет место при атаксии Фридрейха. Поэтому наша программа диагностики БДЦМ применима и для БДЦМ,

обусловленных мутациями ядерных геноз при анализе метаболитов и мутантных ферментов. Потребуется только дополнить ее общепринятыми методами ДНК-анализа ядерных генов, когда они будут картированы и секвенированы. Особенностями данного исследования, осложнявшими решение поставленных задач, являются следующие: - отсутствие клинической практики и методической базы для верификации БДЦМ, что вынудило нас при методической направленности данного исследования решать такие проблемы, как выявление предположительных больных и оценку значимости клинических и параклинических методов диагностики;

-значительная вариабельность больных с различными формами БДЦМ (при статистической значимости общего размера совокупной выборки), отражающая не только различия в их частоте, но и, к сожалению, в эффективности диагностики; -необходимость использования большого числа разноплановых методических подходов для обеспечения максимальной точности диагноза;

-отсутствие абсолютно-значимых диагностических подходов, что потребовало широкого привлечения статистического анализа к обработке данных; -выраженный прогрессирующий характер БДЦМ, что при однократном исследовании (выборка состояла преимущественно из педиатрического контингента) обуславливает "молчание" биохимических параметров.

Однако, хотя в силу объективных трудностей, исследование носило действительно многоплановый характер, все же для решения поставленной проблемы оно не может завершиться набором строгих инструкций, обеспечивающих 100% верификацию шагноза, сохраняя определенную потребность во врачебной интуиции на этапе тредположительного выявления больных. Но максимальное расширение методических юдходов к диагностике этой группы НБО позволяет сделать постановку диагноза юлее вероятной. Поскольку содержание данного исследования адресовано практике >течественного МГК, которое практически еще не имеет опыта работы с БДЦМ, нами »ценена значимость использованных для их диагностики методов и разработана госледовательность проведения этапов их реализации (рис. 11).

Аномальное количественное выражение патогномоничных для- БДЦМ метаболитов и IX соотношение принципиально повысит вероятность постановки диагноза БДЦМ у [редполагаемого больного.

анализ мутаций мтДНК обладает безусловной диагностической значимостью, если он вляется положительным и выявляет распространенные мутации, однозначно вязанные с клиническим фенотипом БДЦМ.

Ограниченность методов энзимодиагностики уже неоднократно обсуждалась, однако выявление снижения активности фермента, составляющего менее 10% от нормы при предположительных мутациях ядерного генома или неполного (относительного) снижения активности при мутациях мтДНК выявляется далеко не у всех больных. Тем не менее, если снижение активности фермента найдено, это, безусловно, говорит в пользу диагноза БДЦМ.

Данное исследование создает базу для грамотного формирования выборки больных с БДЦМ в местах проживания больных, для исключения грубых диагностических ошибок, которые имеют место в практике отечественного здравоохранения, для налаживания всех необходимых этапов в рамках отечественного здравоохранения для грамотного медико-генетического консультирования отягощенных семей и использования метаболической терапии для частичного или полного купирования клинических проявлений.

Рис 11. Алгоритм проведения биохимического н молекулярно-генетического

обследования

Измерение концентрации метаболитов в крови (до и после пшцевой нагрузки)

гочнение данных 1инического обследования

Нет

Проведение молекулярно-генетических исследований (мышечный биоптат)

т

Мутации обнаружены

Пет

Измерение аетивности

ферментов КДЦМ (мышечный биогтпгг)

Активность снижена

Да

Подтверждение диагноза БДЦМ

Проведение молекулярно-генетическнх исследований (клетки крови)

-> Да Г

Окончательный диагноз БДЦМ

А

ВЫВОДЫ

1. На основании комплексного клинико-генеалогического, биохимического и молекулярно-генетического обследования 61 пациента с БДЦМ разработана программа верификации этой группы заболеваний и прозедена оценка эффективности диагностических процедур.

2. Разработаны клинические критерии диагностики БДЦМ в целом и охарактеризованы уникальные симптомы и признаки для наиболее распространенных форм БДЦМ (синдром MELAS, синдром KSS, болезнь Лея )

3. Анализ концентрации лактата, пирувата, 3-гидроксибутирата и соотношений лактат/пируват, 3-гидроксибутират/ацетоацетат в крови больных показал, что диагностическая значимость измеренных метаболитов неравнозначна для исследуемых групп. Наибольшее диагностическое значение (приближающееся к 100%), имеет измерение лактата на фоне глюкозной кривой.

4. На основании измерения активностей ферментов, входящих в состав (I-IV) комплексов дыхательной цепи митохондрий у 18 больных установлен точный биохимический дефект.

5. Идентифицировано 22 мутации мтДНК (из них 7 точковых и 15 делеций варьирующих размеров). Точковые мутации ассоциированы с синдромами MELAS (n=5), KSS (n=l), MERRF (n=l), а делении - с синдромами KSS (n=6), MELAS (п=3), СРЕО"(п= 3), MERRF (п=3).

6.Анализ гено-фенотипческих корреляций у больных с идентифицированными мутациями мтДНК выявил несоответствие клинического диагноза у 8 больных и выраженный внутрисемейный полиморфизм у 2 пациентов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. К.Д.Краснопольская, Е.А.Мытникова, Е.Ю.Захарова, А.Я. Покровская, А.С.Петрухин. Клинический полиморфизм митохондриальных болезней при недостаточности цитохром С оксидазы. Неврологический журнал 1999, №1, стр. 11-16

2. Захарова Е.Ю., Миренбург Т.В., Ахунов B.C., Тишканина C.B., Евдокименков В Н. "Проблемы медико-генетического консультирования при наследственных болезнях обмена клеточных органелл". Тезисы доклада, Российская научно-практическая конференция, Москва, 1997 г., стр.34.

3. Краснопольская К.Д., Миренбург Т.В., Ахунов B.C., Покровская А.Я, Шехтер О.В., Захарова Е Ю., Воскобоева Е.Ю., Букина Т.М. Программа диагностики и профилактики наследственных болезней обмена клеточных органелл у российских больных. "Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей". Тезисы докладов. 1998, стр. 33-34

4. Захарова Е Ю., Покровская А.Я., Поаалко Н.Е., Ломоносова Е.З., Мытникова Е.А., Помытко Н.П., Нечкина Н.П., Усачева Е.Л., Яхно H H. Клинический и биохимический полиморфизм мутации MELAS A3243G митохондриального генома у российских больных. "Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей". Тезисы докладов. 1998, стр. 26

5. Краснопольская К.Д., Захарова ЕЮ. Современные достижения в диагностике и профилактике митохондриальных болезней. Ж-л невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова, 1998, Л»8, стр. 49-56

6. Краснопольская К.Д., Букина Т.М., Ахунов B.C., Евдокименков В.Н., Захарова 5.Ю., Покровская А.Я., Воскобоева Е Ю., Шехтер О.В., Тишканина C.B., Мытникова S.A., Погорелов А.Г. Программа диагностики и профилактики наследственных 5олезней обмена клеточных органелл. Вестник РАМН, 1999, №11, стр. 16 - 22.

Яхно H.H., Нечкина Н.П., Помытко Н.П., Захарова Е.Ю., Воскобоева Е.Ю., Токровская А.Я. Случай синдрома MELAS. Неврологический журнал, 8. Мальберг С.А, Маслова О.И., Шередярова Т.Ч., Захарова Е.Ю., Метященко Е.П., Сурсолова П. А.Синдром Кернс-Сейра., 1997, №8, стр. 53-57

E.Yu. Zakharova, X.D.Krasnopolskaya, Е.А. Mitnikova, A.Ya. Pokrovskaya. Clinical olymorphism og A3243G mtDNA mutation. J. Inher. Metab. Dis., 1998, v 21, Suppl 2, 80. 0. X.D.Krasnopolskaya, E.Yu.Zakharova, V.N.Evdokimenkov, A.Ya.Pokrovskaya, ■ G.Pogorelov. Diagnostic programme for respiratory chain diseases in Russia. J. Inher. letab. Dis., 1998, v.21, Suppl 2,85.

Участок множительной техники ОНЦ им. H. H. Блохина РАМК 4¿Ml2.000 Заказ 1+cj Тираж 100 экз.