Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфометрический анализ митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфометрический анализ митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани"

На правах рукописи

Внноградская Ирина Сергеевна

Морфометрнческнй анализ митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 1 НОЯ 2014

Москва-2014

005555767

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Научно-исследовательском клиническом институте педиатрии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Глиикина Валерия Владимировна

доктор медицинских наук, профессор Сухорукое Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Валнуллнн Виктор Владимирович

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии.

доктор медицинских наук, профессор Михалева Людмила Михайловна

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией клинической морфологии.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская Государственная медицинская академия» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 23 декабря 2014 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.072.04 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте: http://rsmu.ru. ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. I.

Автореферат разослан _2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета у

доктор медицинских наук, профессор Леонова Людмила Васильевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одной из центральных проблем в любой области знаний, является выбор инструментов исследований. Особенно это актуально в области медицины и здравоохранения, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и тактики лечения, а впоследствии и определяет его успешность.

Нервно-мышечные заболевания, в особенности, обусловленные генетическими дефектами миопатии, составляют большую группу наследственных заболеваний человека, приводящих к инвалидности и фатальному исходу у детей и взрослых. Дифференциальная диагностика этих заболеваний остается трудной в силу недостаточно специфичных проявлений и большого клинического сходства состояний, обусловленных разными генетическими дефектами.

Большой интерес в исследованиях патогенетических механизмов миопатий вызывает изучение морфологии митохондрий в скелетной мышечной ткани. Свидетельством универсальной роли митохондрий в патогенезе различных заболеваний мышц является исследование, проведенное J. Muller-Hocker и соавт. [Muller-Hocker J. et al., 1986], в котором было показано, что ослабление-сопряжение окислительного фосфорилирования тесно, но не обязательно связано с пролиферацией митохондрий. В ряде исследований [Sukhorukov V.S., 1998, 2006, 2011] было высказано предположение, что при определенных формах заболеваний увеличение числа и размеров митохондрий в мышцах может влиять на клиническую картину заболевания. Но до сих пор остается открытым вопрос о компенсаторной роли увеличения числа митохондрий и о возможности этих органелл влиять на снижение степени тяжести заболевания [Jouberi F. et.al., 2008, Piquereau J. et.al., 2012]. Именно, поэтому по-прежнему остается неясным вопрос: какова роль изменения числа митохондрий в скелетной мышечной ткани при врожденной миопатии? Врожденные миопатии являются редкими, клинически и генетически гетерогенными заболеваниями, лечение которых на сегодняшний день составляет большую сложность. Среди них первое место по частоте занимает врожденная миопатия центрального стержня, относящаяся к так называемым «немитохондриальным» заболеваниям [Сухорукое B.C., Харламов Д.А., 2010]. В свою очередь митохондриальные болезни составляют большую группу патологических состояний, связанных с генетически детерминированными нарушениями клеточной биоэнергетики. Их частота встречаемости варьиру-

з

ет от 1:5000 до 1:10000 населения [Schaefer A.M. et al., 2008; Chinnery P.F. et al., 2012; Bannwarth S. et al., 2013].

Связь с развитием миопатий различной степени тяжести определяет особый интерес к структурной реорганизации митохондрий в мышцах. На сегодняшний день организация митохондриона в зрелых мышечных волокнах человека практически не изучена, а глубокое понимание энергетических процессов клетки, несомненно, требует комплексного подхода, сочетающего исследования биоэнергетики и митохондриальной биохимии с анализом морфологии митохондрий, что было бы полезно для лечения таких тяжёлых наследственных заболеваний.

Точная морфологическая оценка параметров митохондрий в скелетной мышечной ткани при адаптационных процессах особенно актуальна на современном этапе развития клинической миологии, когда ещё отсутствуют генетические методы лечения подавляющего большинства нервно-мышечных заболеваний.

Анализ морфометрических параметров митохондрий при патологических состояниях скелетной мышечной ткани в сопоставлении с другими клинико-лабораторными показателями больных может помочь при разработке неспецифических терапевтических подходов в лечении различных заболеваний мышц.

Цель исследования: изучить морфометрические параметры митохондрий скелетных мышц при врожденной миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии и определить возможности их использования для диагностики заболеваний мышц.

Задачи исследования:

1. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня и оценить наличие корреляционных связей между полученными показателями.

2. При миопатии центрального стержня определить корреляционные связи между выявленными морфометрическими показателями митохондрий скелетной мышечной ткани с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания, а также напряженностью энергетического метаболизма.

3. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальиых участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани у больных митохондриальной миопатией и оценить наличие корреляционных связей между полученными показателями.

4. При митохондриальной миопатии определить корреляционные связи между выявленными морфометрическими показателями митохондрий скелетной мышечной ткани с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания, а также напряженностью энергетического метаболизма.

5. Сопоставить полученные морфометрические показатели состояния митохондрий скелетной мышечной ткани при миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии, а также оценить интенсивность адаптационных и патологических процессов при изменении указанных показателей.

6. Выявить диагностические значимые морфометрические критерии состояния митохондрий, позволяющие эффективно использовать их для оценки компенсаторных и патологических процессов в скелетной мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые проведена полноценная морфометрическая характеристика параметров митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальиых участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.

Впервые выявлены информативные морфометрические параметры митохондрий и изложены доказательства компенсаторной роли изменения числа и размеров митохондрий при наследственно обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани. Новизной обладают сведения о различных компенсаторных механизмах энергетического аппарата мышц при митохондриальной и немитохондриальной миопа-тиях. В частности, оценена эффективность увеличения числа митохондрий в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани при названных заболеваниях.

Приоритетным являются предложенные в работе механизмы поддержания удельного объёма митохондриальной популяции в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.

С помощью корреляционного анализа впервые была выявлена взаимосвязь между морфометрическими параметрами митохондрий и клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания и активности энергетического метаболизма при данных заболеваниях.

Впервые проведена сравнительная оценка между морфометрическими показателями состояния митохондрий в скелетной мышечной ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.

Впервые предложены дополнительные маркеры для дифференциальной диагностики и расшифровки патогенеза миопатии центрального стержня и митохондриальной миопатии.

Впервые предложен показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна, выражающий соотношение удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл, который может быть применён для оценки компенсаторных митохондри-альных изменений в скелетной мышечной ткани при нервно - мышечных заболеваниях.

Практическая значимость работы. Разработанные критерии морфометрической оценки параметров митохондрий при наследственно обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани, с использованием компьютерной электронно-микроскопической морфометрической обработки полученных данных, позволяют существенно повысить качество результатов патоморфологического исследования биопсий-ного материала и уровень эффективности диагностики у больных нервно-мышечными заболеваниями. Указанные критерии внедрены в практическую деятельность психоневрологического отделения №2 НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Материалы исследования включены в лекционные курсы для студентов, учащихся в ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Субсарколеммальные и межмиофибриллярные популяции митохондрий при врожденной миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии существенно различаются между собой по ряду морфометрических параметров: относительному количеству, размеру и удельному объёму митохондрий, в то время как форма и электронная плотность их одинаковы.

2. При врожденной миопатии центрального стержня относительное количество и размер митохондрий в субсарколеммалыюм участке обуславливают компенсацию нарушения энергообмена и коррелирует со снижением степени тяжести заболевания; между количеством митохондрий и их размерами наблюдается отрицательная корреляция.

3. При митохондриалыюй миопатии увеличение удельного объёма митохондрий достигается за счёт увеличения количества и размеров митохондрий при этом данные показатели не коррелируют друг с другом; удельный объём митохондрий не связан достоверным соотношением с лабораторными показателями митохондриальных функций при указанной патологии.

4. Показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна может быть применён для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в скелетной мышечной ткани больных нервно-мышечными заболеваниями.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России и научно-исследовательской лаборатории, общей патологии Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Основные положения диссертации доложены на XI Российском Конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2012), на XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), на XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2014), на XIII Международном конгрессе по нервно-мышечным заболеваниям (Ницца, Франция 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них три - статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из глав введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. Общий объём диссертации составил 146 страниц машинописного текста. Работа содержит список литературы из 204 ссылок (27 отечественных и 177 иностранных авторов), 55 рисунков, 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Работа основана на комплексном морфологическом изучении архивного материала диагностических биоптатов четырехглавой мышцы бедра больных, находившихся в отделениях психоневрологии, а также врожденных и наследственных заболеваний НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. В работе было обследовано 39 пациентов, из них: 21 пациент с диагнозом врожденная миопатия центрального стержня в возрасте от 4 до 27 лет и 18 пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия в возрасте от 4 месяцев до 16 лет.

Морфологическое исследование биоптатов мышечной ткани осуществлялось с помощью специального метода окраски гистоферментохимического выявления активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. Материал подвергался замораживанию, для этого его погружали в среду для заливки в жидкий азот фирмы Sigma. Для получения срезов свежей ткани толщиной 10-12 мкм использовали микротом-криостат Microm HM 505 N. Анализ и фотосъемка светомикроскопических препаратов производились на световом микроскопе Nikon eclipse 80i.

Для электронио-мнкроскопического исследования мышц проводили префиксацию ткани, взятой всегда в строго определенном месте (четырехглавая мышца бедра) размером не более 1мм3 в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7.4) при 0°С. После отмывки ткани фосфатным буфером (рН=7.4) проводили фиксацию 1%-ным раствором четырехокиси осмия в течение часа при 2-4°С. Затем ткань обезвоживали в спиртах восходящей концентрации. Заливку ткани производили в эпоновую смолу после трехкратной обработки ацетоном по методике Лафта [Luft, 1961]. Срезы получали на ультратоме фирмы REICHERT Nr. 321850/Е и контрастировали цитратом свинца по методике Рейнольдса [Reynolds, 1963]. Исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-100В.

Морфометрический анализ проводился путем подсчета митохондрий, разделенных на две популяции в зависимости от их места расположения в мышечном волокне: под сарколеммой (субсарколеммальная) и между миофибриллами (межмиофибриллярная) с помощью компьютерной программы для микрофотометрии

«Image J» при увеличении x 10 ООО. Для каждого пациента было изготовлено 5 блоков. С каждого блока проанализировано не менее 20 полей зрения.

Определяли относительное количество митохондрий их размерные характеристики, такие как: площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметр Фере; показатели формы - фактор формы «эллипс», «округлость»; среднюю электронно-оптическую плотность и удельный объём митохондрий. Параллельно определяли удельный объём миофибрилл.

В процессе работы нами был предложен показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна, равный отношению удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл.

Биохимические исследования были проведены в Научно-исследовательском клиническом институте педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. Из результатов проведенных биохимических исследований были проанализированы следующие показатели: концентрация креатинина (Ммоль/л), уровень молочной и пировиноградной кислот (Ммоль/л), уровень активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ Ед/л) и концентрация общего кальция (Ммоль/л) в крови. Биохимический анализ крови был проведен натощак. Определение уровня молочной и пировиноградной кислот в крови проводили с помощью энзиматического метода Rollinghoff (1967) натощак и после стандартной нагрузки глюкозой (из расчета 1,75 г/кг массы тела, но не более 50 г) на 60 и 180 минутах.

Степень тяжести заболевания у больных детей оценивалась совместно с клиницистами Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России при помощи различных тестов мышечной активности.

Статистическая обработка данных. Определяли средние значения и стандартные ошибки среднего для абсолютных показателей. Абсолютные показатели при условии нормального распределения сравнивали с помощью t-критерия Стыодента для независимых выборок. При распределении, отличном от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми признаками и продолжительностью воздействия возмущающих факторов был проведен ранговый корреляционный анализ Спирмена. Различия считались статистически достоверными

при р<0,05. Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ "STATISTICA 6.0".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гнстоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы в скелетной мышечной ткани пациентов

В скелетной мышечной ткани больных врожденной мионатией центрального стержня активность сукцинатдегидрогеназы была выявлена в периферических участках мышечных волокон, тогда как в центральных участках наблюдалось значительное снижение активности этого фермента или его отсутствие. Это может указывать на то, что периферические участки энзиматически активны в отличие от центральных участков мышечных волокон.

Анализ полученных препаратов показал, что при гистоферментохимической оценке активности сукцинатдегидрогеназы у 16 из 18 пациентов с диагнозом митохон-дриальная миопатия, обнаруживатись участки мышечных волокон с повышенной активностью фермента, главным образом в периферических участках, а у некоторых больных и в центральных участках мышечных волокон.

Электронно-микроскопическое исследование изменении митохондрий в скелетной мышечной ткани пациентов

При ультраструктурном анализе скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатиен центрального стержня в центральных участках мышечных волокон были выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление (рис.1.А). Такие деструктивные участки, как правило, сопровождались вакуолизацией и деструкцией митохондрий, а также деструкцией т-трубочек, сар-коплазматических цистерн (триад). У некоторых пациентов была обнаружена грубая дезориентация миофиламентов с расширением центральных пространств между ними, заполненных мелкогранулярным материалом на фоне вакуолизации и деструкции митохондрий. В центральных участках со слабо выраженными вышеописанными ультраструктурными изменениями или с полным их отсутствием, были выявлены митохондрии с электронно-плотным матриксом (рис.1.Б).

Ю

В периферических (субсарколеммальных) участках часто, хотя и не всегда, выявлялись многочисленные скопления митохондрий с электронно-плотным матриксом (рис.1.В), в отличие от центральных (межмиофибриллярных) участков мышечных волокон. При этом признаков изменения миофиламентов и других ультраструктур в субсарколеммальных участках не обнаружено (рис.1.Г).

Рис. 1. Ультраструктурные изменения при врожденной миопатии центрального стержня: (А) возраст 14 лет. Увл. х 15 ООО; (Б) возраст 12 лет Увл. х 8 ООО; (В) возраст 10 лет. Увл. х 6 ООО; (Г) возраст 10 лет. Увл. х 6 ООО.

При митохондриальной миопатии в отличие от миопатии центрального стержня ультраструктурные изменения затрагивают главным образом митохондрии.

Так под сарколеммой мышечных волокон были выявлены участки с массовым набуханием митохондрий, с признаками деструкций крист и с наличием липидных включений (рис.2.А).

Между миофибриллами были обнаружены крупные, удлиненные митохондрии рис 2.Б), группы митохондрий с частым расположением в виде цепочек или других своеобразных комплексов (рис.2.В), гипертрофированные митохондрии с деструкцией наружной мембраны и плотности матрикса. Матрикс большинства межмиофибриллярных митохондрий просветлен и увеличен в объёме, видны электронно-прозрачные зоны,

11

лишенные крист, межмембранное пространство сжато (рис.2.Г, Д). Такую ультраструктуру митохондрий связывают с нарушениями сопряжения процессов окисления и фос-фолирования. Также под сарколеммой мышечных волокон могут в небольшом количестве встречаться увеличенные митохондрии с электронно-прозрачным матриксом, лишенным крист (рис.2.Е).

Рис.2. Ультраструктурные изменения митохондрий в скелетной мышечной ткани больных ми-тохондриальной миопатией: (А) возраст 9 лет. Увл. х 15 ООО; (Б) возраст 13 лет. увл. х 50 ООО; (В) возраст 17 лет Увл. х 20 ООО; (Г) возраст 6 лет. Увл. х 30 ООО; (Д) возраст 7 лет увл. х 40 ООО; (Е) возраст б лет. Увл. х 20 000.

Отметим, что у некоторых пациентов в центральных участках мышечных волокон были выявлены незначительные разрастания соединительной ткани. В таких участках на фоне истончения, атрофии миофибрилл, обнаружены измельченные митохондрии с нечеткими контурами и с участками лизиса крист. В центральных участках мышечных волокон были так же, как и при миопатии центрального стержня выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление.

Морфометрпческое исследование митохондрий в скелетной мышечной ткани пациентов

В нашей работе была проведена комплексная морфометрическая оценка электронно-микроскопических изображений поперечнополосатых скелетных мышечных волокон у 21 больного с врожденной миопатией центрального стержня.

Анализ полученных параметров показал, что митохондрии представляют собой относительно округлые структуры (среднее значение округлости митохондрий 0,8± 0,008 в относительных единицах), со средней площадью 0,13±0,009 мкм2, средним максимальным диаметром Фере 0,5± 0,02 мкм и минимальным диаметром Фере 0,29±0,01. Введенный нами показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна, составил в среднем 0,187 ± 0,03.

Количество и размер митохондрий различались в зависимости от их локализации в мышечном волокне. Относительное количество митохондрий в субсарколеммапьных участках, более, чем в двое превышало соответствующее значение межмиофибрилляр-ных участков мышечных волокон (рис.3). По размерам межмиофибриллярные митохондрии были достоверно меньше, чем субсарколеммальные (рис.3). В связи с этим определяется существенное различие в значениях удельного объёма митохондрий в этих участках (рис.3).

Было выявлено, что показатель удельного объёма миофибрилл, также существенно различается в зависимости от их расположения в мышечном волокне. Так, в субсар-колеммальном участке среднее значение удельного объёма миофибрилл составило 49,39±5,40 %, а в межмиофибриллярном участке 93,32±0.64 %.

Так как, под сарколеммой мышечных волокон локализуется больше по количеству и объёму митохондрий, чем между миофибриллами, то очевидно, что и энергетическая мощность в этих участках будет больше, чем в центральных участках мышечных волокон. Среднее значение показателя энергетической обеспеченности мышечного волокна в субсарколеммальном участке 0,34±0,05, а в межмиофибриллярном участке 0,04± 0,02 (рис.3).

Удельный объём митохондрий (%)

0,2

ОД 5 г

¡В! ми!11

0,05 ■ив Що^ш

¡1

су €>сарко/1 еллгилльная межлииофибриллярийя популяции митохондрий популяции митохондрий

Показатель ЭОМВ

мсжу.иофибрил лирная популяция митохондрий

суосарколе» сма льньо I уч

аюфнбрнллярныйучас

Рис.З. Сравнение средних морфометрических показателей митохондрий в различных участках мышечных волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня.

ЭОМВ - энергетическая обеспеченность мышечного волокна.

Также была проведена комплексная морфометрическая оценка электронно-микроскопических изображений поперечнополосатых мышечных волокон у 18 пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия. В результате морфометрического анализа было выявлено, что митохондрии представляют собой относительно округлые структуры (среднее значение округлости митохондрий 0,78±0,008 в относительных единицах). Были установлены размерные параметры митохондрий: средняя площадь 0,1± 0,008 мкм 2, средний максимальный диаметр Фере 0,49±0,018 мкм и средний минимальный диметр Фере 0,29±0,09 мкм. Введенный нами показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна в среднем составил 0,27±0,122.

Следует отметить, что две популяции: субсарколеммальная и межмиофибрилляр-ная, различались ещё в большей степени, чем при миопатии центрального стержня.

Например, количество органелл под сарколеммой, почти втрое больше, чем между миофибриллами мышечных волокон (рис.4).

Размерные характеристики межмиофибриллярных митохондрий меньше, чем у субсарколеммальных (рис.4). Соответственно в субсарколеммальном участке удельный

объём митохондрий и показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна значительно больше, чем в межмиофибрилляном (рис.4).

Среднее значение удельного объёма миофибрилл в межмиофибриллярном участке 81,94 ±5,96 %. а в субсарколеммальном 38+75 ±6+65%.

Данные рангового корреляционного анализа

Вполне объяснимо, что удельный объём митохондрий в скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня, положительно коррелирует с их размерами (с площадью 11=0,61; достоверность р<0,05, с периметром Я=0,60; достоверность р<0,05).

Относительное количество митохондрий

субсарколеммальная межмиофибриллярная популяция митохондрий популяция митохондрий

Удельный объём митохондрий (%)

Площадь митохондрий (мкм2)

субсэрколеммальная межмиофибриллярная популяция митохондрий популяция митохондрий

Показатель ЭОМВ

субгарш>ле1>пмлЕ.каи мгжмнофиПриллнрная

нилу;ыШВ1 митучонлрий популяция ми гохикД|Жи

1

0,8

Об

0,4 щшм ШШ1 ш

0,2 .53 Л

П

субсарнолеммальная межмиофибриллярная популяция митохондрий популяция митохондрий

Рис.4. Сравнение средних морфометрических показателей митохондрий в различных участках мышечного волокна больных митохондриальной миопатией. ЭОМВ - энергетическая обеспеченность мышечного волокна.

Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами митохондрий и их формой фактор «эллипс» в обеих популяциях митохондрий:

- с площадью митохондрий в субсарколеммальной и межмиофибриллярной популяциях (11=0,98; достоверность р<0,05 и Я=0,95; достоверность р<0,05, соответственно);

- с периметром митохондрий (в обеих популяциях коэффициент корреляции составил 11=0,97: достоверность р<0,05).

Следовательно, увеличение размеров этих органелл сопровождается их удлинением. Более крупные митохондрии имеют вытянутую, эллипсоидную форму. Об этом также свидетельствует положительная корреляция между фактором «эллипс» и удельным объёмом митохондрий в субсарколеммальной популяции (Я=0,66; достоверность р<0,05) и в межмиофибриллярной популяции (11=0,48; достоверность р<0,05).

Таким образом, можно предположить, что в качестве ведущего компенсаторного механизма используется гипертрофия с формированием вытянутых форм митохондрий.

В то же время, следует обратить внимание на умеренную отрицательную корреляцию между относительным количеством митохондрий и их размерами, обнаруженную для обеих популяций митохондрий:

- с площадью митохондрий в субсарколеммальной популяции (Я=-0,43; достоверность р<0,05), а в межмиофибриллярной популяции (Я=-0,46; достоверность р<0,05);

- с периметром митохондрий в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной популяциях митохондрий (Я= -0,40 и -0,51; достоверность р<0,05, соответственно).

Таким образом, при уменьшении размеров митохондрий происходит увеличение их числа. Мы предполагаем, что это происходит вследствие пролиферации митохондрий.

Положительная корреляция между «эллипсоидностью» субсарколеммальных митохондрий и уровнем лактата до нагрузки глюкозой (11=0,90; достоверность р<0,05) и после нагрузки (Я=0,46; достоверность р<0,05), указывает на то, что более вытянутые органеллы в большей степени, обеспечивают реакцию ткани в ответ на повышение уровня молочной кислоты. Субсарколеммальные митохондрии эллипсоидной формы, представляют собой эффективный в функциональном отношении пул и их число связано положительной корреляцией с коэффициентом «лактат/пируват» после нагрузки глюкозой (11=0,42; достоверность р<0,05) и с концентрацией креатинина крови (11=0,50; достоверность р<0,05). Полученные результаты в целом свидетельствуют о том, что увеличение количества эллипсоидных органелл в субсарколеммальных участках мышечных волокон является важным компенсаторным механизмом при заболеваниях мышц «немитохондриального» генеза.

Количество и удельный объём межмиофибриллярных митохондрий отрицательно коррелируют с показателем концентрации лактата, как до нагрузки (с относительным

количеством Я—О,77; достоверность р<0,05; с удельным объёмом Я=-0,62; достоверность р<0,05), так и после нагрузки глюкозой (Я= -0,60; достоверность р<0,05; -0,66; достоверность р<0,05, соответственно). Это может объясняться относительной недостаточностью митохондриальной активности в условиях пониженного количества этих ор-ганелл, и соответствующим повышением концентрации молочной кислоты, как биохимическим проявлением этой недостаточности.

Наиболее значимым представляются выявленные отрицательные корреляции:

- между относительным количеством субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести этого заболевания (Я= -0,80; достоверность р<0,05) (рис.5);

- удельным объёмом субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (Я= -0,76; достоверность р<0,05);

- размерными показателями субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (Я= -0,72; достоверность р<0.05);

- эллипсоидностью субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (Я= -0,86; достоверность р<0,05) (рис.5).

Мы считаем, что это свидетельствует о том, что увеличение количества эллипсоидных митохондрий, их размеров и удельного объёма в субсарколеммальных участках мышечных волокон скелетной мышечной ткани имеет очевидный компенсаторный эффект и напрямую связано с более легким течением заболевания.

фактор «эллипс»

Рис.5. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров митохондрий с показателем степени тяжести заболевания у больных врожденной миопатией центрального стержня.

Наиболее яркие отличия в межмиофибриллярных и субсарколеммальных популяциях выявлены между взаимосвязями коэффициента лактат/пируват с показателем энергетического обеспеченности мышечного волокна (Я=-0,48; достоверность р<0,05, 11=0,46; достоверность р<0,05. соответственно). Показатель энергетической обеспеченности субсарколеммального участка мышечного волокна отрицательно коррелирует со степенью тяжести заболевания (Я=-0,43; достоверность р<0,05) (рис.6.А) и положительно коррелирует с биохимическими параметрами (а именно содержанием креатинина 11=0,63; достоверность р<0,05) (рис.б.Б) и общего кальция Я=0,42; достоверность р<0,05 в крови).

В связи, с чем указанный показатель может эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани.

У: степень тяжести заболевания (баллы); У: показатель креатинин крови (ммоль/л) X; показатель (ЭОМВ) X: показатель ЭОМВ (субсарколеммапьный)

Рис.6. Корреляционная взаимосвязь между показателями: (А) энергетической обеспеченности мышечного волокна (ЭОМВ) и степени тяжести заболевания; (Б) энергетической обеспеченности мышечного волокна и креатинина крови у больных врожденной миопатией центрального стержня.

В субсарколеммальном участке показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна отрицательно коррелирует с объёмом миофибрилл (И= -0,71; достоверность р<0,05). Таким образом, чем больше энергетическая мощность мышечного волокна, тем меньше удельный объём миофибрилл.

Следовательно, энергетическая мощность мышечного волокна больше зависит от удельного объёма митохондрий, а не от объёма миофибрилл в этом участке. Об этом

свидетельствует выявленная положительная корреляция между данным показателем и удельным объёмом митохондрий (К=0,53; достоверность р<0,05).

При митохондриалыюй миопатии обнаружена достоверная положительная корреляция между показателем энергетической обеспеченности мышечного волокна и удельным объёмом митохондрий (Я=0,83; достоверность р<0,05), которая свидетельствует, о том, что увеличение энергетической мощности мышечного волокна сопровождается пропорциональным увеличением объёма митохондрий во всех участках мышечного волокна. В субсарколеммапыюм участке выявлена отрицательная корреляция между показателем энергетической обеспеченности мышечного волокна и удельным объёмом миофибрилл (Я=-0,62; достоверность р<0,05), а в межмиофибриллярном (К= -0,82; достоверность р<0,05).

Однако, в отличие от миопатии центрального стержня, при митохондриальной миопатии увеличение объёма митохондрий в субсарколеммальном и межмиофибриллярном участке достигается только за счёт увеличения размеров митохондрий (т.е. гипертрофии). Это подтверждает выявленная положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и их размерами в обеих популяциях:

- с площадью митохондрий (в субсарколеммалыюй популяции 11=0,45; достоверность р<0,05, а в межмиофибриллярной 11=0,52; достоверность р<0,05);

- с периметром митохондрий (в субсарколеммальной популяции 11=0,48; достоверность р<0,05, а в межмиофибриллярной 11=0,62; достоверность р<0,05);

- с максимальным диаметром Фере митохондрий (в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной 11=0,45,11=0,63; достоверность р<0,05).

- с минимальным диаметром Фере митохондрий (в межмиофибриллярной популяции 11=0,47; достоверность р<0,05).

Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами и формой фактор «эллипс» этих органелл. Так, в субсарколеммальной популяции (с площадью 11=0,55; достоверность р<0,05, с периметром 11=0,80; достоверность р<0,05, с максимальным и минимальным диаметром Фере 11=0,98, Я=0,89; достоверность р<0,05), а в межмиофибриллярной популяции (с площадью 11=0,93; достоверность р<0,05, с периметром 11=0,97; достоверность р<0,05, а с максимальным и минимальным диаметром Фере 11=0,99, 11=0,90; достоверность р<0,05). Таким образом, также как и при миопатии

центрального стержня, чем больше удельный объём митохондрий, тем они становятся крупнее и принимают эллипсоидную форму.

Однако установленная отрицательная корреляция между относительным количеством межмиофибриллярных митохондрий и относительной электронной плотностью этих органелл (Я=-0,52; достоверность р<0,05) указывает на то, что в межмиофибриллярных участках мышечных волокон мало функционально активных митохондрий.

Также в межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электронно-оптической плотностью (Я= -0,45; достоверность р<0,05). Это, очевидно, позволяют сделать вывод о том, что эллипсоидность характерна для менее функционально активных органелл в этом участке. Таким образом, с увеличением размеров митохондрий форма этих органелл меняется от округлой к эллипсоидной форме с более светлым матриксом и с менее развитыми кристами. Следовательно, можно предположить, что мышечное волокно может обслуживаться малым количеством мелких округлых митохондрий.

Выявленная отрицательная корреляция между числом субсарколеммальных митохондрий и концентрациями лактата (Я=-0,40; достоверность р<0,05) в периферической крови, очевидно, свидетельствуют о том, что число органелл именно в этом участке может варьировать и играть, таким образом, существенную роль в реализации обмена глюкозой.

Отмеченное различие между субсарколеммальными и межмиофибриллярными митохондриями, выявляется в том, что только у первых из них отмечается выраженная положительная взаимосвязь между числом, удельным объёмом митохондрий и уровнем креатинина в крови (1<=0.67; 11=0,64; достоверность р<0,05, соответственно). Это подтверждает наши предположения о том, что количество субсарколеммальных митохондрий влияет на интенсивность энергообмена в мышце.

Важно отметить, что количество митохондрий во всех участках мышечного волокна не связано достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания. Считаем, это принципиальной особенностью митохондриальной миопатии, адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом.

Была выявлена положительная корреляции между размерными показателями (площадью, периметром) митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки глюкозой (в субсарколеммальной популяции с площадью 11=0,52; достоверность р<0,05 а с периметром 11=0,50; достоверность р<0,05, а в межмиофибрилярной популяции Я=0,46; 11=0,51; достоверность р<0,05, соответственно), через час после нагрузки глюкозой в субсарколеммальной популяции (11=0,40, 11=0,40; достоверность р<0,05, соответственно), а через три часа после нагрузки только в субсарколеммальной популяции была установлена отрицательная корреляция (Я=-0,53, Я=-0,47; достоверность р<0,05, соответственно). Мы предположили, что более крупные и светлые органеллы менее эффективно справляются с метаболизмом глюкозы. Установленный факт является доказательством значительного истощения митохондрий в условиях митохондриального заболевания.

Предположения о компенсаторной роли увеличения числа субсарколеммальных митохондрий в мышцах больных митохондриальной миопатией также находят свое подтверждение при анализе взаимоотношения введенными нами показателя энергетического обеспечения мышечного волокна с концентрациями креатинина крови (11=0,68; достоверность р<0,05).

ВЫВОДЫ

1. При врожденной миопатии центрального стержня количество и размеры митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках мышечных волокон существенно различаются между собой, в то время как форма и электронная плотность этих органелл в вышеуказанных участках одинаковы; выявлена достоверная отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их количеством, при этом удельный объём митохондриальной популяции в большей степени зависит от размеров отдельных органелл, а не от их количества.

2. Относительное количество митохондрий в мышечном волокне при врожденной миопатии центрального стержня связано положительными корреляциями с метаболической активностью мышечной ткани; при этом увеличение числа митохондрий в большей степени характерно для относительно эффективной компенсации тканевого энергообмена, а повышение размеров органелл происходит на фоне его декомпенсации.

3. Относительное количество митохондрий в периферических участках мышечных

21

волокон у больных миопатией центрального стержня положительно коррелирует с базовыми биохимическими показателями энергообмена; в то же время степень функциональной активности митохондрий, выражающаяся в их относительной эллипсоидности, больше обусловливает адаптационный потенциал тканевых биоэнергетических реакций и эффективность тканевого ответа на повышение концентрации глюкозы в организме.

4. При врожденной миопатии центрального стержня увеличенные субсарколем-мальные скопления митохондрий имеют компенсаторную природу; повышение размеров этих органелл под сарколеммой и в меньшей степени увеличение их количества в этих участках достоверно коррелирует со снижением степени тяжести заболевания.

5. При митохондриальной миопатии морфометрические характеристики митохондрий во многом изменены за счет набухания и деструкции, наиболее сохранными очевидно являются относительно мелкие и округлые органеллы; при этом отрицательная корреляция между размерами и количеством митохондрий в мышечном волокне не выявляется, что свидетельствует о нарушении механизма поддержания объёма митохондриальной популяции за счёт координации процессов пролиферации и роста этих органелл.

6. Корреляционный анализ морфометрических характеристик митохондрий и кли-нико-лабораторных показателей при митохондриальной миопатии показывает, что увеличение удельного объёма субсарколеммальных митохондрий в условиях полисистемной митохондриальной недостаточности имеет адаптационное значение для всего организма; в то же время в отличие от миопатии центрального стержня удельный объём митохондрий в мышечном волокне при митохондриальной миопатии не связан достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания, то есть адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом.

7. Предложенный нами показатель энергетического обеспечения мышечного волокна, выражающий соотношение удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл и отрицательно коррелирующий со степенью тяжести заболевания, может эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях.

Практические рекомендации

1. При дифференциальной диагностике биопсийного материала поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией следует учитывать полученные в работе взаимосвязи между морфометрическими параметрами митохондрий и клинико-лабораторными показателями, позволяющие значительно уменьшить число проводимых биопсий.

2. Предложенный в работе показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна может быть эффективно применен для оценки компенсаторных митохондриаль-ных изменений в скелетной мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях.

3. Полученные результаты морфометрического анализа митохондрий при наследственно обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани могут быть использованы в качестве диагностических маркеров в неврологической практике при оценке характера течения нервно-мышечных заболеваний.

Синеок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Виноградская И.С. Адаптационные возможности мышечной ткани при болезни центрального стержня. / B.C. Сухорукое, Д.А. Харламов, И.С. Виноградская и др. // Материалы Третьего Балтийского конгресса по детской неврологии. С-Пб. - 2011,- с.94-95.

2. Виноградская И.С. Диагностическая эффективность биопсии мышечной ткани при болезни центрального стержня. / B.C. Сухоруков, Д.А. Харламов, И.С. Виноградская и др. // Материалы Всероссийской научно-практической «Приоритетные направления охраны здоровья ребенка в неврологии и психиатрии (диагностика, терапия, реабилитация и профилактика)». Тула - 2011.- с. 110-111.

3. Виноградская И.С. Компенсаторный эффект митохондриальных изменений при врожденной миопатии «центрального стержня». / B.C. Сухоруков, П.А. Шаталов, И.С. Виноградская и др. // Материалы Научно-практической конференции с международным участием «Фармакотерапия и диетология в педиатрии» и VIII Конференция «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе». Казань - 2011. - с. 177.

4. Виноградская И.С. Значение митохондриальных изменений при врожденной миопатии «центрального стержня». // Материалы VII Международной Пироговской научной

медицинской конференции студентов и молодых ученых. Москва Вестник РГМУ. Москва - 2012 . Специальный выпуск №1. - с. 240.

5. Виноградская И.С. Ультраструктурные изменения скелетномышечной ткани при нарушениях рианодиновых рецепторов. / П.А. Шаталов, И.С. Виноградская // Материалы XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва - 2012. - С.146-147.

6. Виноградская И.С. Применение электронной микроскопии в дифференциальной диагностике врождённой миопатии «центрального стержня». // B.C. Сухорукое, П.А. Шаталов, И.С. Виноградская и др. // Сб. материалов XI Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва - 2012. - с.145.

7. Виноградская И.С. Морфометрические особенности митохондрий поперечнополосатых мышечных волокон при врожденной миопатии «центрального стержня». // B.C. Сухорукое, И.С. Виноградская, П.А. Шаталов и др. // Сб. материалов XI Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва - 2012. -с. 270-271.

8. Виноградская И.С. Электронно-микроскопические критерии дифференциальной диагностики врожденной миопатии «центрального стержня» у человека. / П.А. Шаталов, B.C. Сухоруков, И.С. Виноградская и др. // Вестник Российского государственного медицинского университета. -2012. № 5. - с. 66-70.

9. Виноградская И.С. Морфометрический анализ изменений митохондрий в мышечном волокне при митохондриальной миопатии. / И.С. Виноградская, П.А. Шаталов. // Материалы XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва -2013. - с. 146.

10. Виноградская И.С. Морфометрическое подтверждение компенсаторной роли митохондрий при врожденной миопатии «центрального стержня». / И.С. Виноградская, B.C. Сухоруков, Д.А. Харламов. // Сб. материалов XII Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва -2013. - с. 154.

11. Виноградская И.С. Морфометрический анализ характеристик митохондрий в скелетной мышечной ткани больных детей врожденной миопатией центрального стержня. / И.С. Виноградская. // Материалы XXI международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва - 2014.- с. 157.

12. Виноградская И.С. Новые доказательства адаптационной роли митохондриальных изменений при врожденной миопатии центрального стержня. / И.С. Виноградская, B.C. Сухорукое, Д.А. Харламов и др. // Российский вестник перннатологни н педиатрии. -2014. Том 59.- № 2. - с. 80-82.

13. Виноградская И.С. Митохондриальная сеть скелетных мышечных волокон. / И.С. Виноградская, Т.Г. Кузнецова, Е.А. Супруненко. // Вестник Московского Университета. Серия 16. Биология. -2014. № 2. с.16-26.

14. Vinogradskaya I.S. Adaptive role of mitochondrial changes in congenital central core myopathy. / Vinogradskaya I.S., Sukhorukov V.S., Kharlamov D.A., et al. // 13lh International congress on Neuromuscular Diseases. - 2014. - P.172.

Список сокращений

СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

ЭОМВ - энергетическая обеспеченность мышечного волокна.

Подписано в печать: 17.10.2014 Объем: 1,2 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 325 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru