Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии у детей

Соколова-Меркурьева, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии у детей
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии у детей"

На правах рукописи Соколова-Меркурьева Анна Владимировна

Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии у детей

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в Российском университете дружбы народов Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

академик РАЕН,

доктор медицинских наук,

профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Медведев Дмитрий Иванович Сухоруков Владимир Сергеевич

Боголепов Николай Николаевич

Автандилов Георгий Герасимович

Ведущая организация

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится ¿¿с-^-/ 2004 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.)

Автореферат разослан «/^» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Саврова Ольга Борисовна

Актуальность темы

Нарушения клеточного энергообмена, в основе которых, в первую очередь, лежит митохондриальная недостаточность, ведут к широкому спектру клинических проявлений (Schefiler I., 2001; Сухоруков B.C., 2002). Эти проявления зависят от степени вовлеченности в патологический процесс различных тканей и органов. Распространенность патологических состояний, связанных с митохондриальной недостаточностью не ограничивается наследственными синдромами, вызываемыми мутациями генов, непосредственно ответственных за синтез митохондриальных белков. Широчайший круг других заболеваний включает в себя те или иные нарушения клеточной энергетики как вторичные звенья патогенеза.

В настоящее время для определения характеристик митохондриальных функций используются клинические, биохимические и молекулярно-генетические методы. Вместе с тем, одно из ведущих мест в современной диагностике митохондриальных нарушений занимают морфологические методы (особенно морфологический анализ биоптатов скелетной мышцы). Необходимо учитывать, что, несмотря на большую диагностическую ценность данных, полученных с помощью этих методов, они не являются абсолютными показателями митохондриальной недостаточности. Количество и выраженность изучаемых параметров при этом может варьировать даже при одной и той же нозологической форме заболевания, а при некоторых митохондриальных болезнях чувствительность этих методов может быть недостаточной.

При морфологическом анализе биоптата скелетной мышцы у больных с подозрением на митохондриальное заболевание желательно использовать все возможные методы гистологического анализа, которые могут значительно повысить точность исследования (гистохимическая оценка активности митохондриальных ферментов и выявление таких субстратов как липиды, гликоген, соли кальция, электронная микроскопия с анализом ультраструктуры митохондрий). Однако в доступной нам научной литературе (Nardin R. A., Johns D. R., 2001; Materials of the 5 European Meeting on Mitochondrial Pathology Italy 2001. Mitochondrion 2001; 1: Suppl.l.) отсутствуют, к сожалению, достоверные критерии комплексной оценки митохондриальной недостаточности с помощью этих методов.

Одной из проблем патогенеза нарушений клеточного энергообмена и, как следствие, осуществления диагностики этих состояний является случайное («мозаичное») распределение патологически измененных митохондрий по тканям и органам. Отдельные данные литературы (Bercovic S. F. и др., 1989) свидетельствуют о возможности диагностического использования методов выявления дефектных митохондрий не только в биоптатах скелетной мышцы, но и в других тканевых элементах, в частности, в эпителиях различной локализации или клетках рыхлой волокнистой соединительной ткани.

Совершенно не изученной до сих пор является впервые предпринятое в настоящей работе изучение возможности использования кожного биоптата для диагностихи митохондриальной недостаточности. Это исследование проведено в связи с тем, что метод биопсии мышечной ткани весьма травмотичен для ребенка, тем более, что не всегда исследование биоптата

мышечной ткани приводит к достаточно достоверному выявлению нарушений клеточной биоэнергетики. Поэтому сочетание исследования биоптатов мышечной ткани и кожных биоптатов позволяет получить более объективную информацию о тех или иных нарушениях клеточного энергообмена.

Малая травматичность взятия и сравнительная простота обработки крови объясняет интерес к цитохимическому анализу активности митохондрий в клетках периферической крови для диагностики полисистемных митохондриальных нарушений (Тозлиян Е. В., 2003). В связи с этим у многих больных с полисистемной митохондриальной недостаточностью диагностическая биопсия мышц в последнее время часто заменяется цитохимическим анализом форменных элементов крови (в первую очередь, лимфоцитов).

В то же время, в научной литературе, к сожалению, до сих пор отсутствуют данные, позволяющие произвести полноценное сопоставление диагностических характеристик цитохимического и других морфологических методов.

Таким образом, все вышеперечисленное убедительно свидетельствует о теоретической и прикладной необходимости и актуальности проведения комплексного сравнительного гистологического анализа проявлений митохондриальной недостаточности в различных тканевых элементах у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемной митохондриальной недостаточности.

Цель работы

Провести комплексный гистологический анализ митохондрий различных тканевых элементов у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена.

Задачи исследования

1. Провести комплексный гистологический, гистохимический и электронно-микроскопический анализ биоптатов скелетной мышечной ткани, взятых с диагностической целью у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена.

2. Провести комплексный гистологический, гистохимический и электронно-микроскопический анализ биоптатов кожи, взятых с диагностической целью у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена.

3. Провести сравнительный анализ полученного материала с цитохимическими показателями активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови.

Научная новизна работы

В работе представлены данные о наличии полисистемных нарушений митохондрий у больных с различными наследственными заболеваниями. Проведена оценка морфо-функциональных особенностей реактивности

митохондриального пула в условиях недостаточности клеточной энергетики.

Впервые произведена комплексная оценка гистологических признаков митохондриальной недостаточности в тканевых элементах кожи у больных с полисистемными нарушениями клеточного энергообмена.

Впервые проведен комплексный сравнительный гистологический анализ митохондриальных нарушений в скелетных мышцах, в коже и в лимфоцитах периферической крови у больных с дисфункцией клеточного энергообмена. Подтверждены представления о мозаичном распределении митохондрий с нарушенными структурно-функциональными характеристиками в клетках и тканях организма.

Практическая значимость

Данные о морфофункциональных особенностях митохондрий в различных клетках организма при полисистемной энергетической недостаточности имеют большое значение для понимания адаптационных возможностей клеток при тканевой гипоксии, вызванной полисистемными нарушениями митохондрий.

Результаты исследования позволяют разработать подходы к комплексной диагностике больных с митохондриальными заболеваниями.

Полученные данные смогут помочь выделять группы больных, для которых требуется патогенетически обоснованная терапевтическая коррекция клеточного энергообмена.

Доказана диагностическая ценность морфологического анализа биоптата кожи для диагностики митохондриальных дисфункций.

Решение поставленных задач осуществлялось на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии (заведующий — доктор медицинских наук, профессор Д.И.Медведев) и в научно-исследовательской лаборатории общей патологии (руководитель - доктор медицинских наук, профессор В.С.Сухоруков) Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Минсоцздрава РФ.

Апробация и внедрение в практику

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Российского университета дружбы народов (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор Д. И. Медведев) и в научно-исследовательской лаборатории общей патологии Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Минсоцздрава РФ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор В. С. Сухоруков).

Результаты исследования используются в работе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии (заведующий — доктор медицинских наук, профессор Д.И.Медведев). Разработанные способы диагностики нарушений клеточного энергообмена апробированы и внедрены в практику работы Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Минсоцздрава РФ (директор - доктор медицинских наук, профессор А.Д.Царегородцев).

Материалы диссертации доложены: на 35-м международном симпозиуме неврологов (11 - 14 сентября 2003 года, Белград, Сербия); на всероссийской

научной конференция «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» (22 - 24 октября 2003 года, г. Москва).

По теме диссертации издано 5 публикаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, приложения и указателя литературы, в котором приводятся 92 источника, из них 19 отечественных и 73 иностранных авторов. Содержит 3 рисунка, 12 таблиц, 28 микрофотографий

Материал и методы исследования

Группы обследованных больных:

Среди детей с различными наследственными заболеваниями, направленных на диагностическую биопсию мышц и/или кожи отобраны 30 больных детей в возрасте от 5 до 12 лет с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемной митохондриальной недостаточности. В процессе обследования, в том числе с помощью использованных в настоящей работе методов, диагнозы были уточнены. Распределение окончательных диагнозов у обследованных больных см. в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение обследованных больных в зависимости от окончательного диагноза._

Распределение материала биопсий по группам больных

Группа Нозологическая форма Кол-во детей

А Митохондриальные Всего 17

синдромы

Синдром MERRF 1

Синдром MELAS 2

Синдром Кернса-Сейра 2

Недифференцированные энцефаломиопатии 7

Кардиомиопатии 5

Б Заболевания с Всего 10

сопутствующей

«вторичной» митохондри-

альной недостаточно-

стью

Туберозный склероз 3

Синдром Марфана 3

Синдром Элерса-Данло 4

В. Больные с неподтвержденной Структурная миопатия, спинальная амиотрофия, лейкоэнцефалит 3

митохондриальнои

недостаточностью

В качестве группы сравнения использованы материалы исследований лимфоцитов и мышц 10 детей с различными заболеваниями без клинико-лабораторных признаков полисистемной митохондриальной недостаточности. К сожалению, в связи с относительной редкостью проведения диагностических биопсий кожи, в группе сравнения соответствующих материал отсутствовал, и пришлось ограничиться сравнением показателей, изученных при биопсии кожи у детей первой и второй групп.

Клиническими критериями отбора служили: данные анамнеза, клинического осмотра в отделениях Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, данные лабораторных исследований (исследования сахарной кривой, концентраций пирувата и лактата в сыворотке крови, данные о состоянии системы перекисного окисления липидов, цитохимического анализа активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови с помощью визуальной методики). Окончательным определяющим фактором для включения больного в группу исследования служило внесение в историю болезни предварительного диагноза, предполагающего наличие у больного митохондриальной недостаточности, и направление с целью уточнения диагноза на диагностическую биопсию скелетной мышечной ткани.

Материал для исследования

Исследованы биоптаты скелетных (передних бедренных) мышц и кожи у детей, отобранных для исследования; проведен углубленный цитохимический анализ активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови.

Методы:

Морфологический анализ проведен с помощью следующих методов:

1) Для выявления общих гистологических изменений - окраска нефиксированных замороженных и парафиновых срезов гематоксилином и эозином; окраски по методам Гомори-Энгела, Маллори, Ван Гизон.

2) Для выявления активности отдельных ферментов и субстратов на световом уровне - выявление сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, гликогена, кальция, липидов. Визуально по интенсивности осадка реакции определялась активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др., цитохромоксидазы (ЦО) по методу Берстона; гистохимическое распределение гликогена исследовано по методу Шабадаша, микроконгломератов солей кальция - по Косса, липидов - окраской Суданом черным В по Лизону.

3) Для ультраструктурного анализа образцы ткани фиксированы в растворах глутарового альдегида и четырехокиси осмия, залиты в эпонаралдитовую смесь смол, контрастированы уранилацетатом и цитратом свинца и изучены в электронном микроскопе ЭМ 125 и ЕМ-109.

4) Цитохимическое выявление активности митохондриальных ферментов-сукцинатдегидрогеназы (СДГ), а -глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови

осуществлены наборами реактивов фирмы ООО МНПК "Химтехмаш", ГосНИИ "ИРЕА" (метод Пирса (1957) в модификации Нарциссова Р.П. (1986) с последующей визуальной и компьютерной морфометрией (пакет программ "Видеотест", методика Сухорукова B.C., Тозлиян Е.В.).

5) Морфометрия и статистическая обработка - анализ распределения типов мышечных волокон, определение количества и размеров клеток, гистохимических маркеров проведены методом компьютерной телефотометрии; обработка количественных данных проведена методами корреляционного и других сравнительных математических анализов с помощью пакетов прикладных программ «Видеотест» и «Excell».

При анализе препаратов были введены балльные оценки [Сухорукое, 1998] по следующим категориям: "степень патологического изменения соединительнотканных оболочек скелетной мышцы", "степень патологического изменения мышечных волокон", "выраженность патологии в распределении липидов", "выраженность патологии в распределении кальция", "выраженность патологии в распределении гликогена", "выраженность морфологических признаков

митохондриальной недостаточности (митохондриальный индекс)"; последний параметр включал в себя наличие "рваных красных волокон" (RRF), выраженность отдельных RRF, степень гистохимической недостаточности митохондриальных ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитохромоксидазы (ЦО).

Результаты и обсуждение

Морфологические признаки повреждения митохондрий у детей с митохондриальными болезнями

Обследовано 17 детей с клиническими и биохимическими признаками митохондриальных болезней: синдромы MERRF (миоклонус-эпилепсия, RRF) - 1, MELAS (митохондриальная энцефаломиопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды) - 2, Кернса-Сейра (пигментный ретинит, наружная офтальмоплегия, полная блокада сердца) - 2, недифференцированные митохондриальные энцефаломиопатии - 7, идиопатические митохондриальные кардиомиопатии - 5.

Митохондриальные изменения влимфоцитахпериферическойкрови

В лимфоцитах всех обследованных детей обнаружены выраженные нарушения цитохимической активности ферментов клеточного энергообмена. В таблице 2 отражены результаты цитохимического анализа с визуальным подсчетом активности ферментов у детей обследованных групп (в таблице не приведены больные 3-ей группы в связи с ее немногочисленностью и невозможностью получения достоверных средних).

Средняя активность СДГ у детей 1-ой группы достоверно снижена по сравнению со 2-ой группой (р<0,005) и нормативными показателями (р<0,001).

Таблица 2. Сравнительная характеристика активности ферментов энергетического обмена (усл.ед.) в разных группах обследованных детей в возрасте 5-12 лет (визуальная оценка) (п=37).

сдг ГФДГ гдг мдг лдг

I. Митохондриальные болезни (п=17): 15,8±1,1 * 6,1 ±0,5* 7,8± 0,3* 12,2±0,5 18,3 ±0,6*

II. Заболевания с сопутствующей митохондриальной недостаточностью (п=10): 18,8 ±2,4 7,14± 1,9* 10,1±0,8 10,1±0,6 17,9±0,5*

IV Контроль (п=10) 20,1 ±0,4 12,4±0,2 12,6±0,4 11,1 ±0,4 14,2± 0,6

* - достоверные отличия от IV группы (р<0,05);

СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ГФДГ - а -глицерофосфатдегидрогеназа;

ГДГ - глутаматдегидрогеназа; МДГ - малатдегидрогеназа;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа.

Активность сс-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) детей была также снижена и достоверно (р<0,005) отличалась от таковой у детей, не страдающих митохондриальной патологией. Активность

глутаматдегидрогеназы (ГДГ) у детей с митохондриальными болезнями была достоверно снижена по сравнению с больными 2-ой группы и с контролем (р<0,002). Достоверных отличий в активности

малатдегидрогеназы (МДГ) в исследуемых группах не отмечено. В первой группе обследованных отмечалось достоверное (р<0,005) повышение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

При компьютерной морфометрической оценке гранул наиболее значимые изменения обнаружены при оценке площади гранул, а также их средней оптической плотности. Вышеуказанные параметры были значительно изменены в 1-ой группе детей с митохондриальными заболеваниями и 2-ой группе, достоверно отличаясь от таковых у здоровых детей (р<0,0001).

Проводилась сравнительная оценка коэффициентов определяемых ферментов: К1 - ГФДГ/СДГ, К2 - ГДГ/СДГ, КЗ - ГФДГ/ГДГ (таблица 3).

Таблица 3. Сравнительная оценка соотношений активности определяемых ферментов в группах обследованных детей (визуальная оценка).

Группы детей ГФДГ/СДГ гдг/сдг ГФДГ/ГДГ

Группа 1 0,29 ± 0,03 * 0,47 ± 0,02* 0,73 ± 0,05*

Группа 2 0,57 ± 0,04 0,54 ±0,04 1,1 ±0,03

Контроль 0,6 ± 0,02 0,63 ±0,02 0,99±0,04

* - достоверные отличия от контроля (р<0,005)

Достоверное снижение всех исследованных коэффициентов отмечалось у детей 1-ой группы по сравнению с контролем (р<0,001).

Нарушенные морфометрические параметры цитохимического анализа указывают на изменения процессов клеточного энергетического метаболизма.

Наличие характерных изменений показателей активности митохондриальных ферментов послужило основанием для проведения следующего этапа запланированного комплексного обследования с применением дополнительных методов гистологического анализа для уточнения характера распределения диагностически и патогенетически важных признаков митохондриальных нарушений по разным тканям.

Достоверно (р< 0,05) были представлены следующие изменения: значительное снижение количества гранул; увеличение площади мелких гранул (соответствующих отдельным мелким митохондриям) и кластеров (скопления митохондрий); округление гранул; снижение оптической плотности гранул. Все это свидетельствовало о глубоком нарушении функций митохондрий. Полученные результаты подтверждают ранее полученные данные о высокой чувствительности цитохимической диагностики при митохондриальной недостаточности [Сухорукое и др., 2000; Тозлиян, 2003].

Митохондриальные изменения в скелетных мышцах

У большинства детей 1-ой группы выраженных изменений соединительнотканных оболочек не выявлено. Отмечено только наличие признаков умеренного расширения и склероза перимизия без выраженных изменений со стороны эндомизия. Исключение составили только дети с синдромом MELAS, у которых на фоне относительно более выраженных деструктивных изменений мышечных волокон отмечены расширение объема и склероз перимизия и эндомизия.

Большинство мышечных волокон одного размера и имеет нормальную морфологию, однако встречаются небольшие группы атрофированных волокон. Типы мышечных волокон распределены мозаично. Соотношение А и I дисков при окраске по Гомори-Энгелу - в норме. В то же время, отмечается небольшое количество региональных и целостных некрозов мышечных волокон. В части мышечных волокон отмечаются субсарколеммальные массы. В ряде волокон отмечаются участки сегментарного некроза с признаками активного фагоцитоза деструктивной ткани, однако большинство участков региональных некрозов и все целостно некротизированные волокна, как правило, представляют собой нефагоцитируемый гомогенный слабоокрашиваемый клеточный детрит. Электронно-микроскопический анализ выявляет множественные расщепления саркомеров, "размытость" Z-линий.

В части волокон субсарколеммально обнаруживаются скопления липидов. При ультраструктурном анализе видно, что липидные включения, как правило, находятся вблизи митохондрий субсарколеммально и между миофибриллами.

В субсарколеммальных участках многих волокон отмечаются также умеренные скопления гликогена и микроконгломератов солей кальция. Следует отметить, что наличие признаков митохондриальной недостаточности, в частности, RRF, как уже было показано в литературе [Сухорукое, 1998] часто сопровождается характерными изменениями в картине гистохимического распределения гликогена, кальция и липидов. Эти изменения заключаются в наличии субсарколеммальных отложений

указанных субстратов. Таким образом, эти изменения можно использовать в качестве косвенного доказательства наличия митохондриальной недостаточности, что особенно важно при изучении архивного материала, заключенного в парафин.

При светогистохимическом анализе скелетной мышцы ККР различной степени выраженности были выявлены у 15 из 17 детей. При этом у 13 из них ККР были СДГ-позитивными и ЦО-позитивными; у двух СДГ-позитивными и ЦО-негативными, что позволяет предположить наличие мутации митохондриальной ДНК в зоне расположения генов субъединиц цитохромоксидазы.

При электронно-микроскопическом анализе скелетных мышц детей, имеющих ККР, обнаружены типичные ультраструктурные изменения, сопровождающие этот светооптический феномен: аномально увеличенные субсарколеммальные и интермиофибриллярные скопления митохондрий, деструкция большинства из них (чаще по деэнергизованному типу, с истончением крист и вакуолизацией матрикса) при наличии отдельных сохранных митохондрий. Важно отметить, что ультраструктурные изменения митохондрий, иногда очень значительные, определялись не только в мышечных волокнах, но и в соединительнотканых элементах, в частности, в эндотелиоцитах и адвентициальных клетках капилляров. У одного из детей без КИР качественные митохондриальные изменения были значительно менее выражены, а аномальных скоплений этих органелл не наблюдалось; у другого — при малом количестве митохондрий отмечались их грубые ультраструктурные изменения.

Помимо этого была выявлена зависимость выраженности ЛЕР от цитохимической активности СДГ (обратная, г=-0,57, р<0,05) и а-ГФДГ (прямая, г=0,5, р<0,05) в лимфоцитах периферической крови (рис. 1).

О 1 1,25 1,5 1,75 2

вь ражен ность баллы

Рисунок 1. Зависимость активности СДГ и а-ГФДГ от выраженности ЯЯР в биоптатах мышц

Как представлено на графике, чем больше выраженность ЯЯР, тем ниже активность СДГ и выше активность ГФДГ.

Средние показатели морфофункционального состояния скелетной мышцы у больных 1-ой группы приведены в таблице 4.

Таблица 4

Параметр Средняя Ошибка Достоверность Ы Норма

Изменение 3,20 0,45 0,002 0

оболочек

Изменение 5,10 0,48 0,004 0

мышечных

волокон

Липиды 2,55 0,29 0,001 0

Гликоген 2,05 0,20 0,05 0

Кальций 2,80 0,4 0,001 0

Процент РРР 28,7% 3,5% 0,005 до 5%

Митохонд- 2,33 0,24 0,005 0

риальный

индекс

Таким образом, исследование скелетных мышц подтвердило наличие митохондриальной патологии у детей с митохондриальными болезнями. Однако метод биопсии мышечной ткани довольно травматичен для ребенка и не всегда исследование биоптата мышечной ткани выявляет нарушения клеточной биоэнергетики. В связи с этим актуальным является вопрос о максимально возможном использовании материала, взятого при биопсии. Так как биопсия скелетной мышцы позволяет одновременно брать для анализа и кожу ребенка, необходимо изучить возможность использования кожного биоптата для диагностики митохондриальной недостаточности.

Изменения митохондрий в коже В предыдущем разделе обоснована практическая значимость исследования кожи для выявления полисистемных нарушений клеточного энергообмена. Актуальность исследования обоснована мозаичностью распределения измененных митохондрий в онтогенезе и вероятностью присутствия аномальных форм этих органелл во всех тканях. Именно в таких ситуациях биопсия кожи может быть диагностически значимой.

При гистологическом анализе препаратов кожи с помощью обзорных светооптических методов существенных деструктивных изменений в характеристиках эпидермиса и дермы выявлено не было. Слои эпидермиса имели типичное расположение и строение. У двух из обследованных детей определялись слабо выраженные признаки дискератоза и акантолиза, еще у одного - слабо выраженный акантоз.

Так как основной задачей в данном исследовании было изучение характеристик митохондрий в клеточных элементах кожи, основное внимание было обращено на структуры, имеющие относительно большое

по сравнению с другими количество этих органелл — базальный слой эпидермиса, потовые железы. При обзорных окрасках значимых патологических изменений в этих структурах выявлено не было.

При гистохимическом выявлении активности митохондриальных ферментов обращало на себя внимание сравнительно меньшая по сравнению с мышцами окрашиваемость препаратов в целом. Наибольшее, хотя и малое в абсолютном выражении, специфическое окрашивание определялось именно в вышеупомянутых структурах - эпителиоцитах базального слоя и потовых желез, причем наиболее интенсивно и четко выявлялась активность СДГ, которая и была в дальнейшем наиболее подробно исследована.

При визуальной оценке этих препаратов существенных различий в гистохимической активности у детей обследованной группы выявить не удалось. Для более точного анализа была применена компьютерная фотоморфометрия клеток указанных эпителиальных структур. Наиболее удобный способ при этом, как нам представляется, это измерение средней оптической плотности, так как в этом случае не обязательно ни перерассчитывать полученные результаты на каждую клетку эпителиального ряда, ни придерживаться обязательного анализа гистохимической активности на строго одинаковой площади. Кроме того, была рассчитана гетерогенность окраски по параметру «интервал яркости».

Средние значения полученных параметров представлены в таблице 5.

Таблица 5. Характеристики эпителиоцитов кожи при гистохимическом выявлении активности СДГ (в усл. единицах).

Группы обследованных Средняя оптическая Интервал яркости

плотность

I. Митохондриальные 0,106 +/-0,018 62,1 +/-3,2

болезни (р < 0.005) (р < 0.005)

II. Заболевания с 0,135+/-0,007 55,4 +/-1,2

сопутствующей (р < 0.005) (р < 0.005)

митохондриальнои

недостаточностью

Из таблицы видно, что значения средней оптической плотности гранул формазана у детей первой группы было достоверно ниже, чем у детей второй группы. Таким образом, можно сделать вывод о снижении средних показателей активности митохондрий эпителиоцитов кожи у детей, с митохондриальными болезнями. Более высокое, чем у других детей, значение показателя интервала яркости гранул формазана свидетельствует в данном случае о повышенной гетерогенности функциональных характеристик митохондрий у этих детей. Такое изменение совпадает с наблюдаемыми изменениями митохондриальной активности в скелетных и гладких мышцах, а также в других органах (Сухоруков, 1998, 2002, 2003; Ростовская, 2002), когда при общем снижении активности в отдельных клеточных элементах функциональные характеристики митохондрий резко возрастают выше нормы. В целом это приводит к общей тканевой

гетерогенности по значениям гистохимических показателей митохондриальной активности.

При оценке вышеуказанных параметров обращало на себя внимание то, что у четырех больных 1-ой группы значения средней оптической плотности, характеризующие среднюю активность СДГ в эпителиоцитах, были снижены относительно этого же параметра у других детей (0,102 +/-0,009 и 0,115 +/- 0,006, соответственно). Значение интервала яркости было, наоборот, повышено (64,5 +/- 2,2 и 60,3 +/- 0,9). Крайне важным можно считать тот факт, что к этим четырем больным относились и те двое, у которых не было выявлено КИР в скелетных мышцах. Это наблюдение убедительно подтверждает гипотезу, положенную в основу настоящего исследования, о возможности диагностического выявления признаков митохондриальных нарушений в различных органах и тканях при их случайном мозаичном распределении в организме. Без учета этого у двух указанных детей морфологическое исследование могло бы быть проведено впустую, и неизвестно, как это отразилось бы в дальнейшем на постановке клинического диагноза.

Ультраструктурные признаки изменений митохондрий, в виде умеренного увеличения их количества и деструкции по деэнергизованному типу наблюдались в тканевых элементах кожи одиннадцати детей, в том числе у обоих детей, в скелетной мышце которых не было обнаружено ККР. Наиболее выражены эти изменения были в эпителиоцитах базального и шиповатого слоев эпидермиса. Кроме того, их можно было отметить в фибробластах и клетках капилляров сосочкового слоя дермы.

Полученные данные подтверждают теоретические представления о тканевой полисистемности поражения при митохондриальных заболеваниях [Лойда и др., 1983; Кнорре, Мызина,1992; Клембовский, Сухорукое, 1997; Краснопольская, 1997; Клембовский и др., 1999]. Можно предположить, что равномерное распределение пораженных органелл в тканях должно быть более характерно для заболеваний, связанных с ядерными мутациями [Клембовский и др., 1999]. В то же время полисистемность в сочетании с мозаичной выраженностью митохондриальных нарушений может быть объяснена случайным распространением пула митохондрий с мутантной ДНК в онтогенезе [Дадали, 1996; Краснопольская, 1997; Ленинджер, 1985]. Результаты работы позволяют рекомендовать исследовать у больных с подозрением на митохондриальную природу заболевания максимально возможное число тканевых элементов при диагностической биопсии.

Морфологические признаки повреждения митохондрий у детей с заболеваниями с сопутствующей митохондриальной недостаточностью

Обследовано 10 детей с диагнозами: туберозный склероз - 3, синдром Марфана - 3, синдром Элерса-Данло - 4. Эти заболевания не относятся к группе митохондриальных болезней, однако при всех из них доказано наличие вторичной митохондриальной недостаточности.

Митохондриальные изменения в лимфоцитах периферической крови Показатели цитохимической активности митохондриальных ферментов лимфоцитов у детей 2-ой группы представлены выше в таблице 7, а также в рисунках 1 и 2. В дополнение следует отметить, что у детей 2-ой группы по сравнению с 3-й группой и здоровыми активность ЛДГ была достоверно повышена (р<0,005).

В то же время, как явствует из данных, приведенных в таблице 4, у детей 2-ой группы не было отмечено признаков диспропорции в активности изученных митохондриальных ферментов лимфоцитов. Ни по одному из изученных коэффициентов соотношения энзимных активностей не было выявлено достоверной разницы с контрольными показателями.

Таким образом, для детей 1-ой и 2-ой групп были характерны изменения качественных характеристик гранул активности ферментов энергетического обмена в отличие от детей 3-й группы и контроля. Для детей 2-ой группы характерно достоверное снижение средней оптической плотности гранул определяемых ферментов по сравнению 3-й группой и контролем (р<0,05) без изменения площади гранул. В 1-ой группе изменения были более выраженными. В этой группе детей отмечалось значительное (достоверное по сравнению с контролем и 2-ой группой детей, р<0,001) увеличение площади гранул при резком снижении их оптической плотности (достоверные отличия с контролем р<0,0001).

В целом, согласно полученным данным цитохимического анализа изменения морфометрических параметров активности митохондриальных ферментов у больных 1-ой и 2-ой групп выражались в виде значительного снижения количества гранул и изменения их качественных параметров (увеличения площади мелких гранул и кластеров, округления гранул, снижения оптической плотности), что свидетельствовало о глубоком нарушении функции митохондрий и декомпенсации энергетического обмена. Повышение всех параметров или нормальное количество гранул при изменении лишь параметров, регистрируемых компьютером, наблюдалось у детей 2-ой группы. Эти изменения, по-видимому, отражали компенсаторное напряжение энергетического метаболизма при изученных заболеваниях.

Митохондриальные изменения в скелетныхмышцах У большинства детей изменения соединительнотканных оболочек мышцы выражены незначительно, причем больше в перимизии, чем в эндомизии. Изменения оболочек чаще выражались в их расширении, иногда в повышении клеточности, реже (у двух детей) определялись признаки склероза. У двух детей с туберозным склерозом на ультраструктурном уровне отмечены набухание и пролиферация эндотелия, очаги пролиферирующих гладких миоцитов, дистрофия базальных мембран, наличие тромбов.

Размеры и форма большинства мышечных волокон, характер поперечно-полосатой исчерченности и распределение мышечных ядер не были выраженно изменены. Типы волокон были распределены мозаично. У трех детей (2-е туберозным склерозом и 1 с синдромом Марфана) в части мышечных волокон обнаруживались участки гетерогенной базофилии,

региональные некрозы. В зоне некрозов отмечались единичные макрофаги. При окраске по методу Гомори-Энгела и гематоксилином-эозином замороженных срезов патологических включений не выявлено.

При гистохимических окрасках у детей 2-ой группы обнаружены изменения более умеренные, чем в предыдущей группе. В отдельных группах волокон обнаружены мелкозернистые субсарколеммальные липидные включения, а также конгломераты кальция, диффузно и субсарколеммально распределенные в мышечных волокнах. У восьми детей обнаружено относительно небольшое количество мелкозернистых скоплений гликогена, также расположенных субсарколеммально.

У девяти детей (за исключением одного ребенка с синдромом Элерса-Данло) обнаружено небольшое количество слабовыраженных ИКР. У всех детей КИР были позитивны в отношении окраски как на СДГ, так и на ЦО. Общая активность СДГ и ЦО была не изменена.

При электронно-микроскопическом анализе обнаружены митохондриальные скопления, типичные для ККР. Митохондрии были полиморфны, преобладали формы небольших размеров. Имелись скопления дистопированных органелл с просветленным матриксом и дезорганизованными, частично лизированными кристами, участки субсарколеммальной деструкции с образованием саркоплазматических масс. Среди митохондрий часто обнаруживались липидные включения.

Таким образом, морфологическое исследование подтвердило наличие митохондриальной патологии у детей 1-ой и 2-ой групп. У больных 1-ой группы морфологические признаки митохондриальной недостаточности отличались большей степенью выраженности по сравнению со 2-ой группой.

Изменения митохондрий в коже

Морфологические параметры структурных элементов кожи при обзорных методах исследования у всех больных 2-ой группы в основном соответствовали нормальным показателям. Небольшие нарушения отмечались лишь у больных синдромами Марфана и Элерса-Данло и касались изменения распределения н относительного количества соединительно-тканых волокон в дерме, что характерно для данных заболеваний. Следует отметить, что во всех случаях, в том числе и при туберозном склерозе, биопсия кожи была проведена из участков, не затронутых макроскопически выявляемыми патологическими изменениями типа «кофейных пятен» и др.

Отсутствие возможности получить достоверные параметры такой активности у совершенно здоровых детей из-за недопустимости проведения у них биопсии с научно-исследовательскими целями, мы не можем делать вывод о достоверном отклонении представленных средних значений от референтных показателей. Однако полученные результаты свидетельствуют о достоверном отличии этих показателей от таковых у детей первой группы.

Средняя оптическая плотность гранул, свидетельствующая о среднем уровне активности этого митохондриального фермента, была выше, а показатель интервала яркости, представляющий собой морфометрическое

выражение гетерогенности митохондрий по уровню

сукцинатдегидрогеназной активности, был ниже, чем у детей с «первичными» митохондриальными болезнями. Это свидетельствует об относительно более сохранном состоянии митохондрий эдителиоцитов кожи обследованных больных 2-ой группы.

В то же время при проведении электронно-микроскопического исследования было отмечено, что у шести из десяти детей второй группы (у двух детей с туберозным склерозом, трех — с синдромом Марфана и одного с синдромом Элерса-Данло) имелись ультраструктурные признаки умеренных изменений митохондрий в виде тенденции к их деструкции по деэнергизованному типу в эпителиоцитах базального и шиповатого слоев эпидермиса, а также в фибробластах и клетках капилляров сосочкового слоя дермы.

Таким образом, можно сделать вывод, что у больных второй группы с митохондриальной недостаточностью, сопутствующей течению основного заболевания, умеренно выраженные признаки митохондриальных изменений можно выявить в различных тканевых элементах, в том числе и в тех, что доступны для ультраструктурного анализа при проведении биопсии кожи. Последняя процедура часто проводится в диагностических целях без последующего исследования морфофункциональных характеристик митохондрий эпителиоцитов. В результате важная для последующей разработки терапевтической тактики информация бывает упущена и не реализуются эффективные возможности современной энерготропной терапии.

Кроме того, при дальнейшем накоплении данных о светооптических параметрах нормальной гистохимической активности митохондриальных ферментов в эпителиоцитах кожи для выявления сведений о нарушении митохондриальной активности можно будет пользоваться и значительно более дешевыми по сравнению с электронной микроскопией свето-гистохимическими методами.

Больные с неподтвержденной митохондриальной недостаточностью

В данную группу вошли трое больных, у которых первоначально по клиническим критериям нельзя было исключить наличие митохондриальной недостаточности (повышенная слабость, утомляемость, комплексность поражения нервной и мышечной систем, сердца и ряда других органов, а также ряд других клинических признаков). При дальнейшем исследовании больным были выставлены следующие клинические диагнозы: больной А - структурная миопатия (болезнь «центрального стержня»); больной Б - лейкоэнцефалит; больной В -спинальная амиотрофия Верднига-Гофмана.

При проведении цитохимического исследования митохондриальной активности в лимфоцитах периферической крови были обнаружены умеренные изменения.

У двух из них имело место слабое повышение активности СДГ в лимфоцитах, причем у первого это было единственным цитохимическим изменением, а у второго одновременно отмечалось умеренное снижение ГФДГ и ЛДГ, что

свидетельствовало о снижении гликолитической активности. У третьего больного активность СДГ, наоборот, была слабо снижена, а активность ГФДГ и ЛДГ -повышена.

Выявленные у этих больных слабые цитохимические изменения активности ферментов внутриклеточного энергообмена при сопоставлении с общими тенденциями подобных изменений, более выраженных в других обследованных нами группах, а также описанных в литературе [Тозлиян, 2003], свидетельствуют о том, что при функциональных напряжениях метаболизма процессы, непосредственно связанные с аэробным окислением в митохондриях, и гликолитическая активность гиалоплазмы изменяются обратно пропорционально. Причем, видимо, более умеренные изменения характеризуются повышением активности аэробного катаболизма; в этих случаях единственным или наиболее выраженным изменением при цитохимическом анализе является повышение активности СДГ. При нарастании относительной декомпенсации активность СДГ может снижаться за пределы нижних значений референтных показателей, а активность ферментов, связанных с анаэробными процессами (ГФДГ, ЛДГ) - нарастать.

Выявленные цитохимические параметры оказались единственными измененными лабораторными показателями клеточного энергообмена у всех трех больных. При гистологическом исследовании скелетных мышц и кожи морфофункциональные характеристики митохондрий оказались не изменены.

С учетом вышесказанного цитохимические показатели, полученные у больных А и Б, позволяют считать, что определяемые у них изменения носят умеренно компенсаторный характер. Такая компенсация может быть вызвана самыми разнообразными причинами. Отсутствие других признаков полисистемных митохондриальных изменений позволяет предположить, что эти причины связаны скорее всего с парциальным функциональным напряжением лимфоцитов. В то же время у больного В (спинальная амиотрофия) можно предполагать наличие декомпенсированного энергообмена в лимфоцитах. Однако, при отсутствии других лабораторных признаков полисистемной митохондриальной недостаточности, неясно - является ли это проявлением скрытых полисистемных нарушений энергообмена, не выявляемых использованными методами, или свидетельством относительно более серьезных, чем у других больных, нарушений клеток лимфоцитарного ряда.

При морфологическом анализе материала, полученного при биопсии скелетной мышцы у больных А и В, были обнаружены изменения, типичные для поставленных диагнозов. У больного спинальной амиотрофией — признаки выраженной пучковой атрофии мышечных волокон с сопутствующими характерными гистохимическими и ультраструктурными изменениями. У больного со структурной миопатией были обнаружены типичные, хотя и умеренно выраженные, признаки болезни «центрального стержня» - снижение гистохимической ферментативной активности и ультраструктурные нарушения в центральной части многих мионов. В то же время никаких

морфологических признаков, принятых за диагностически значимые для выявления митохондриальной недостаточности (наличие RRF, общее снижение гистохимической активности митохондриальных ферментов, ультраструктурные изменения митохондрий в сохранных мионах) выявлены не были.

Также не было обнаружено и признаков митохондриальных изменений в клеточных элементах кожи больных данной группы. В связи с малым количеством больных этой группы средние морфометрические показатели состояния мышц и кожи, изученные у больных первых двух групп, не рассчитаны.

Таким образом, в рамках настоящего исследования у всех обследованных детей с клиническими и биохимическими признаками митохондриальных болезней (синдромы MERRF, MELAS, Кернса-Сейра, другие митохондриальные энцефаломиопатии, митохондриальные кардиомиопатии) в лимфоцитах как визуально, так и при компьютерной морфометрической оценке обнаружены выраженные нарушения цитохимической активности ферментов клеточного энергообмена. Эти параметры были изменены очень значительно и достоверно отличались от таковых у здоровых детей. Выявленные нарушения указывают на изменения процессов клеточного энергетического метаболизма.

У детей с заболеваниями (синдромы Марфана и Элерса-Данло, туберозный склероз), при которых доказано наличие вторичной митохондриальной недостаточности, показатели цитохимической активности митохондриальных ферментов лимфоцитов также были изменены по сравнению с нормой, однако не так грубо, как в первой группе. Кроме того, не было отмечено признаков диспропорции в активности изученных митохондриальных ферментов лимфоцитов. Ни по одному из изученных коэффициентов соотношения энзимных активностей не было выявлено достоверной разницы с контрольными показателями.

В целом, согласно полученным данным цитохимического анализа, изменения морфометрических параметров активности митохондриальных ферментов у больных 1-ой и 2-ой групп выражались в виде значительного снижения количества гранул и изменения их качественных параметров (увеличения площади мелких гранул и кластеров, округления гранул, снижения оптической плотности), что свидетельствовало о глубоком нарушении функции митохондрий и декомпенсации энергетического обмена. Повышение всех параметров или нормальное количество гранул при изменении лишь параметров, регистрируемых компьютером, наблюдалось у детей 2-ой группы. Эти изменения, по-видимому, отражали компенсаторное напряжение энергетического метаболизма при изученных заболеваниях.

У большинства детей 1-ой группы выявлены прямые и косвенные признаки митохондриальной недостаточности - ККР, нарушения активности митохондриальных ферментов, нарушения

светогистохимического распределения кальция, гликогена и липидов, ультраструктурные изменения митохондрий. Последние включали в себя аномально увеличенные субсарколеммальные . и интермиофибриллярные скопления митохондрий, деструкцию большинства из них (чаще по деэнергизованному типу, с истончением крист и вакуолизацией матрикса) при наличии отдельных сохранных митохондрий. Важно отметить, что ультраструктурные изменения митохондрий, иногда очень значительные, определялись не только в мышечных волокнах, но и в соединительнотканных элементах, в частности, в эндотелиоцитах и адвентициальных клетках капилляров. Таким образом, исследование скелетных мышц подтвердило наличие митохондриальной патологии у детей с митохондриальными болезнями.

У большинства детей 2-ой группы обнаружено небольшое количество слабовыраженных ККР. У всех детей ККР были позитивны в отношении окраски как на СДГ, так и на ЦО. Общая активность СДГ и ЦО была не изменена. При электронно-микроскопическом анализе обнаружены умеренные изменения митохондрий. Таким образом, морфологическое исследование подтвердило наличие митохондриальной патологии у детей 1-ой и 2-ой групп. У больных 1-ой группы морфологические признаки митохондриальной недостаточности отличались большей степенью выраженности по сравнению со 2-ой группой.

Метод биопсии мышечной ткани довольно травматичен для ребенка и не всегда исследование биоптата мышечной ткани выявляет нарушения клеточной биоэнергетики. В связи с этим для анализа при биопсии мышц была взята и кожа детей. Актуальность такого исследования обоснована тем, что патологически измененные митохондрии могут распределяться по организму мозаично и, хотя вероятность их обнаружения в скелетной мышце значительно выше, чем в коже (в связи с разницей в абсолютном количестве), теоретически возможны варианты, когда патологические митохондрии присутствуют в коже и отсутствуют в мышцах.

При гистохимическом выявлении активности митохондриальных ферментов в коже обращало на себя внимание сравнительно меньшая по сравнению с мышцами окрашиваемость препаратов в целом. При этом наиболее интенсивное специфическое окрашивание определялось в эпителиоцитах базального слоя и потовых желез, причем наиболее интенсивно и четко выявлялась активность СДГ, которая и была в дальнейшем наиболее подробно исследована.

гранул формазана свидетельствовало о повышенной гетерогенности митохондрий у этих детей. Такое изменение совпадает с наблюдаемыми изменениями митохондриальной активности в скелетных и гладких мышцах, а также в других органах, когда при общем снижении активности в ткани функциональные характеристики митохондрий в отдельных клеточных элементах резко возрастают выше нормы. В целом это приводит к общей тканевой гетерогенности по значениям гистохимических показателей митохондриальной активности.

К больным с такими изменениями относились и те двое, у которых не было выявлено КИР в скелетных мышцах. Это наблюдение убедительно подтверждает гипотезу о возможности диагностического выявления признаков митохондриальных нарушений в различных органах и тканях при их случайном мозаичном распределении в организме. Ультраструктурные признаки изменений митохондрий в виде умеренного увеличения их количества и деструкции по деэнергизованному типу наблюдались в тканевых элементах кожи одиннадцати детей первой группы, в том числе у обоих детей, в скелетной мышце которых не было обнаружено ККР. Наиболее выражены эти изменения были в эпителиоцитах базального и шиповатого слоев эпидермиса. Кроме того, их можно было отметить в фибробластах и клетках капилляров сосочкового слоя дермы.

Морфологические параметры структурных элементов кожи при обзорных методах исследования у всех больных 2-ой группы в основном соответствовали нормальным показателям.

Морфометрические характеристики распределения гистохимической активности сукцинатдегидрогеназы в коже больных 2-ой группы свидетельствовали о достоверном отличии этих показателей от таковых у детей 1-ой группы.

Средняя оптическая плотность гранул, свидетельствующая о среднем уровне активности этого митохондриального фермента, была выше, а гетерогенность митохондрий по уровню сукцинатдегидрогеназной активности была ниже, чем у детей с «первичными» митохондриальными болезнями. Это свидетельствует об относительно более сохранном состоянии митохондрий эпителиоцитов кожи обследованных больных 2-ой группы. В то же время при проведении электронно-микроскопического исследования было отмечено, что у шести из десяти детей 2-ой группы имелись ультраструктурные признаки умеренных изменений митохондрий.

Эти изменения свидетельствовали о том, что при функциональных напряжениях метаболизма процессы, непосредственно связанные с аэробным окислением в митохондриях, и гликолитическая активность гиалоплазмы изменяются обратно пропорционально. Причем, видимо, более умеренные изменения характеризуются повышением активности аэробного катаболизма; в этих случаях единственным или наиболее выраженным изменением при цитохимическом анализе является повышение активности СДГ. При нарастании относительной декомпенсации активность СДГ может снижаться за пределы нижних значений референтных показателей, а активность ферментов, связанных с анаэробными процессами (ГФДГ, ЛДГ), - нарастать. Можно считать, то определяемые у больных 3-й группы изменения носят умеренно компенсаторный характер и связаны, скорее всего, с парциальным функциональным напряжением лимфоцитов.

В целом, полученные данные подтверждают теоретические представления о тканевой полисистемности поражения при митохондриальных заболеваниях. Результаты работы позволяют рекомендовать исследовать у больных с подозрением на митохондриальную природу заболевания максимально возможное число тканевых элементов при диагностической биопсии.

Выводы

1. Результаты исследования свидетельствуют о тканевой полисистемности митохондриальных нарушений у больных с различными по природе нарушениями клеточного энергообмена.

2. Наиболее выраженные гистологические изменения при митохондриальных болезнях проявляются в скелетных мышцах в виде прямых и косвенных признаков митохондриальной недостаточности - «рваных» красных волокон (КИР), нарушений активности митохондриальных ферментов, нарушений светогистохимического распределения кальция, гликогена и липидов, а также ультраструктурных изменений митохондрий.

3. Морфологические признаки полисистемных митохондриальных нарушений в клеточных элементах кожи выражены в эпителиоцитах базального слоя эпидермиса. Они могут быть обнаружены с помощью компьютерной морфометрии препаратов с гистохимическим выявлением активности митохондриальных ферментов, а также с помощью электронной микроскопии.

4. Признаки митохондриальных изменений в лимфоцитах периферической крови выявляются с высокой диагностической чувствительностью в отношении полисистемных нарушений клеточного энергообмена. Однако в силу относительно более низкой специфичности они нуждаются в подтверждении данными, полученными при изучении эпидермоцитов или скелетной мышечной ткани.

5. Выраженность митохондриальных изменений не всегда коррелирует в разных изученных объектах, что является свидетельством случайного мозаичного распределения измененных митохондрий в процессе онтогенеза.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Морфологическое выявление признаков полисистемной митохондриалбной недостаточности.//Материалы Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы». М., 2003, С.172 - 173-Соавт. В.С.Сухоруков, АВ.Смирнов, Д.И.Медведев.

2. Нарушения клеточного энергообмена при туберозном склерозе у детей.//Российский вестник перинатологии и педиатрии. М., 2003, №5(48), С.19 - 23. Соавт. АМ.Пивоварова, B.C. Сухоруков, ЕДБелоусова, САСелина, М.Ю.Дорофеева.

3. Screening mitochondrial insufficiency test in neurological patients.//Materials of the 35 th International danube symposium for neurological sciences & continuing education. Belgrade, Serbia & Montenegro, 2003, P. 140 - 141. Co-authors V.S. Sukhorukov, E.V.Tozliyan, M.V.Ershova, E.V.Polevaya, EAShabeinicova, EA.Nikolaeva, S.N.Illarioshkin, DAChamchad.

4. Early evaluation of mitochondrial disturbances in children with non-differentiated forms of development retardation.// Materials of the 35th International danube symposium for neurological sciences & continuing education. Belgrade, Serbia & Montenegro, 2003, P. 141 - 142. Co-authors V.S. Sukhorukov, E.V.Tozliyan, EAShabelnicova, EANikolaeva, DAChamchad.

5. Комплексная гистологическая диагностика полисистемной митохондриальной недостаточности.//Вестник Российского университета дружбы народов, серия «Медицина». М.; 2003, №5 (24), С. 50 - 53. Соавт. В. С. Сухоруков, А. В. Смирнов, Д. И. Медведев.

Соколова-Меркурьева Анна Владимировна (Россия) «Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии

у детей»

В работе изучен биопсийный материал скелетных мышц и кожи, а также кровь 30 детей с признаками митохондриальной недостаточности различного генеза. В качестве группы сравнения использован аналогичный материал 10 детей без таких нарушений. Проведен анализ гистологических, электронномикроскопических, гистохимических и цитохимических препаратов с исследованием активности сукцинатдегидрогеназы,

глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, а также распределения гликогена, кальция и липидов. Проведена морфометрия и статистическая обработка данных. Результаты позволили охарактеризовать полисистемные нарушения митохондрий у больных с различными наследственными заболеваниями. Впервые произведена комплексная оценка таких нарушений в коже. Подтверждены представления о мозаичном распределении измененных митохондрий в клетках и тканях организма. Полученные данные помогут выделять группы больных, нуждающихся в лечебной коррекции клеточного энергообмена

Anna V. Sokolova-Merkurjeva (Russia) «Comparative histological analysis ofepidermocytes, skeletal muscle fibres and blood lymphocytes in children with mitochondrial disorders»

Biopsy material of skeletal muscles, derma and blood of 30 children with signs of heterogeneous mitohondrial disturbance has been studied. As comparison group analogous material from 10 children without such disturbances has been used. It has been carried out histological, ultrastructural, histochemical and cytochemical analysis which included evaluation of activity of succinate dehydrogenase, a-glycerophosphate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase as such as estimation of glycogen, calcium and lipids distribution. Morphometry and statistical analysis of received data has been accomplished. The results allowed to describe polysystemic mitochondrial disorders in patient with different hereditary diseases. For the first time complex evaluation of such disoders in skin has been carried out Conception about changed mitochondria mosaic distribution in cells and tissues has been confirmed. These data will help to reveal groups ofpatients required in medicinal correction of cell energy metabolism.

Подписано в печать 18.11.2004 г. Отпечатано 19.11.2004 г. Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 169.

Отпечатано в типографии РЭА им. Г. В. Плеханова. 115054, Москва, ул. Зацепа, 41/4.

«2373»

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Соколова-Меркурьева, Анна Владимировна

2. Наиболее выраженные гистологические изменения при митохондриальных болезнях проявляются в скелетных мышцах в виде прямых и косвенных признаков митохондриальной недостаточности — «рваных» красных волокон (ЛИР), нарушений активности митохондриальных ферментов, нарушений светогистохимического распределения кальция, гликогена и липидов, а также ультраструктурных изменений митохондрий.

Однако в силу относительно более низкой специфичности они нуждаются в подтверждении данными, полученными при изучении эпидермоцитов или скелетной мышечной ткани.

Заключение

Проведенный в работе анализ литературных данных показал, что нарушения клеточного энергообмена, в основе которых, в первую очередь, лежит митохондриальная недостаточность, имеют самые различные тканевые представительства. Клинически это проявляется наиболее часто поражением нервной системы и органов чувств, скелетных мышц, сердца, а также ряда внутренних органов, причем случайное мозаичное распределение поврежденных митохондрий приводит к самым разнообразным сочетаниям симптоматики у больных. К болезням, причиной которых являются мутации митохондриальных генов, относятся слудующие синдромы: Кернса-Сейра (нарушения со стороны глаз, атаксия, мышечная слабость, нарушения сердечной проводимости и другие симптомы), Пирсона (вялость, нарушения со стороны крови, кишечника, поджелудочной железы), MELAS (энцефаломиопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды), оптическая нейропатия Лебера и многие другие. Митохондриальные изменения выявлены при синдроме хронического утомления, мигренях, синдроме Экбома, болезни Мак-Ардля, проксимальной тубулопатии, витамин-независимом рахите, панцитопении, анемии, карликовости, диабете, гипопаратиреозе, кардиомиопатии, печеночной недостаточности, диарее, атрофии ворсинок кишечника, гиперпигментации и поражениях кожи.

Большинство изученных в этом отношении заболеваний характеризуются наличием мутаций митохондриальной ДНК. Однако, так как 98% наследственной информации о митохондриальных белках заложено в ядре, число наследственных митохондриальных нарушений, связанных с ядерными мутациями, должно быть несоизмеримо выше, чем вызванных внутримитохондриальными мутациями. Число таких состояний можно предсказать сейчас только гипотетически, а значит, большинство из них скрываются под масками различных заболеваний.

Распространенность состояний, связанных с митохондриальной недостаточностью, не ограничивается наследственными синдромами, вызываемыми мутациями генов, непосредственно ответственных за митохондриальные белки. Широкий круг других заболеваний включает в себя те или иные нарушения клеточной энергетики как вторичные звенья патогенеза. Изучение этих патологических состояний и распространение информации о важности анализа энергетических дисфункций тем более актуально, что в настоящее время существуют действенные методы коррекции митохондриальной недостаточности, которые помогают в лечении перечисленных выше, не всегда истинно «митохондриальных» заболеваний. Нарушения клеточной энергетики могут не проявляться в виде самостоятельного заболевания, однако сказываются на характере течения других болезней.

Все вышесказанное диктует актуальность разработки методов диагностики нарушений клеточной энергетики. Несмотря на важность клинических, биохимических и молекулярно-генетических методов такой диагностики, одну из ведущих ролей в лабораторном анализе митохондриальных нарушений играют морфологические методы. Скелетная мышечная ткань является идеальным объектом для этого. Она способна подавать сигналы "митохондриального дистресса" посредством выраженной пролиферации митохондрий и образования ИШ7, снижением гистохимической активности митохондриальных ферментов и другими гистохимическими, а также ультраструктурными изменениями.

Митохондриальные нарушения могут быть выявлены при морфологическом анализе других тканей (различных эпителиев, гладких миоцитов, лейкоцитов и др.). К сожалению, данные об информативности таких исследований в отношении выявления митохондриальных изменений единичны, хотя в целом и подтверждают наличие патологических признаков в митохондриях этих клеточных объектов при митохондриальных болезнях.

Все это и определило цель настоящего исследования: провести комплексный гистологический анализ митохондрий различных тканевых элементов у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена.

Для осуществления этой цели в рамках исследования были поставлены и решены следующие задачи:

1) провести комплексный гистологический, гистохимический и электронно-микроскопический анализ биоптатов скелетной мышечной ткани, взятых с диагностической целью у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена;

2) провести комплексный гистологический, гистохимический и электронно-микроскопический анализ биоптатов кожи, взятых с диагностической целью у больных с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемного нарушения клеточного энергообмена;

3) провести сравнительный анализ полученного материала с цитохимическими показателями активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови.

В рамках запланированной тематики было обследовано 30 больных детей в возрасте от 5 до 12 лет с клинико-биохимическими и цитохимическими признаками полисистемной митохондриальной недостаточности. Распределение детей по диагнозам было следующим: 17 детей с первичными митохондриальными заболеваниями (синдромы MERRF, MELAS, Кернса-Сейра, митохондриальные энцефаломиопатии и кардиомиопатии); 10 детей с заболеваниями, которым сопутствовала вторичная» митохондриальная недостаточность (туберозный склероз, синдромы Марфана и Элерса-Данло). У трех больных со структурной миопатией, спинальной амиотрофией и лейкоэнцефалитом митохондриальной недостаточности не было выявлено.

Кроме того,в качестве группы сравнения использованы материалы исследований лимфоцитов и мышц 10 детей с различными заболеваниями без клинико-лабораторных признаков полисистемной митохондриальной недостаточности.

Исследованы биоптаты скелетных (передних бедренных) мышц, и кожи у детей, отобранных для исследования; проведен углубленный цитохимический анализ активности митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови.

У всех 17 детей с клиническими и биохимическими признаками митохондриальных болезней (синдромы MERRF, MELAS, Кернса-Сейра, другие митохондриальные энцефаломиопатии, митохондриальные кардиомиопатии) в лимфоцитах как визуально, так и при компьютерной морфометрической оценке обнаружены выраженные нарушения цитохимической активности ферментов клеточного энергообмена. Эти параметры были изменены очень значительно и достоверно отличались от таковых у здоровых детей. Выявленные нарушения указывают на изменения процессов клеточного энергетического метаболизма.

Обследовано также 10 детей с заболеваниями (синдромы Марфана и Элерса-Данло, туберозный склероз), при которых доказано наличие вторичной митохондриальной недостаточности. Показатели цитохимической активности митохондриальных ферментов лимфоцитов у детей 2-ой группы также были изменены по сравнению с нормой, однако не так грубо, как в первой группе. Кроме того, не было отмечено признаков диспропорции в активности изученных митохондриальных ферментов лимфоцитов. Ни по одному из изученных коэффициентов соотношения энзимных активностей не было выявлено достоверной разницы с контрольными показателями.

У большинства детей 1-ой группы выявлены прямые и косвенные признаки митохондриальной недостаточности — ШЗР, нарушения активности митохондриальных ферментов, нарушения светогистохимического распределения кальция, гликогена и липидов, ультраструктурные изменения митохондрий. Последние включали в себя аномально увеличенные субсарколеммальные и интермиофибриллярные скопления митохондрий, деструкцию большинства из них (чаще по деэнергизованному типу, с истончением крист и вакуолизацией матрикса) при наличии отдельных сохранных митохондрий. Важно отметить, что ультраструктурные изменения митохондрий, иногда очень значительные, определялись не только в мышечных волокнах, но и в соединительно-тканых элементах, в частности, в эндотелиоцитах и адвентициальных клетках капилляров.

Таким образом, исследование скелетных мышц подтвердило наличие митохондриальной патологии у детей с митохондриальными болезнями.

У большинства детей второй группы обнаружено небольшое количество слабовыраженных ВШ7. У всех детей Ш^Р были позитивны в отношении окраски как на СДГ, так и на ЦО. Общая активность СДГ и ЦО была не изменена. При электронно-микроскопическом анализе обнаружены умеренные изменения митохондрий.

Метод биопсии мышечной ткани довольно травматичен для ребенка, и не всегда исследование биоптата мышечной ткани выявляет нарушения клеточной биоэнергетики. В связи с этим для анализа при биопсии мышц была взята и кожа детей. Актуальность такого исследования обоснована тем, что патологически измененные митохондрии могут распределяться по организму мозаично, и, хотя вероятность их обнаружения в скелетной мышце значительно выше, чем в коже (в связи с разницей в абсолютном количестве), теоретически возможны варианты, когда патологические митохондрии присутствуют в коже и отсутствуют в мышцах.

При гистохимическом выявлении активности митохондриальных ферментов в коже обращало на себя внимание сравнительно меньшая, по сравнению с мышцами, окрашиваемость препаратов в целом. При этом наиболее интенсивное специфическое окрашивание определялось в эпителиоцитах базального слоя и потовых желез, причем наиболее интенсивно и четко выявлялась активность СДГ, которая и была в дальнейшем наиболее подробно исследована.

При визуальной оценке этих препаратов существенных различий в гистохимической активности у детей обследованных групп выявить не удалось. При компьютерной морфометрии было показано, что значения средней оптической плотности гранул формазана у детей первой группы было достоверно ниже, чем у детей второй группы. Таким образом, можно сделать вывод о снижении средних показателей активности митохондрий эпителиоцитов кожи у детей с митохондриальными болезнями. Более высокое, чем у других детей, значение показателя интервала яркости гранул формазана свидетельствовало о повышенной гетерогенности митохондрий у этих детей. Такое изменение совпадает с наблюдаемыми изменениями митохондриальной активности в скелетных и гладких мышцах, а также в других органах, когда при общем снижении активности в ткани функциональные характеристики митохондрий в отдельных клеточных элементах резко возрастают выше нормы. В целом это приводит к общей тканевой гетерогенности по значениям гистохимических показателей митохондриальной активности.

К больным с такими изменениями относились и те двое, у которых не было выявлено ЛМ7 в скелетных мышцах. Это наблюдение убедительно подтверждает гипотезу о возможности диагностического выявления признаков митохондриальных нарушений в различных органах и тканях при их случайном мозаичном распределении в организме. Ультраструктурные признаки изменений митохондрий, в виде умеренного увеличения их количества и деструкции по деэнергизованному типу наблюдались в тканевых элементах кожи одиннадцати детей первой группы, в том числе у обоих детей, в скелетной мышце которых не было обнаружено КЮ7. Наиболее выражены эти изменения были в эпителиоцитах базального и шиповатого слоев эпидермиса. Кроме того, их можно было отметить в фибробластах и клетках капилляров сосочкового слоя дермы.

Морфометрические характеристики распределения гистохимической активности сукцинатдегидрогеназы в коже больных второй группы свидетельствовали о достоверном отличии этих показателей от таковых у детей первой группы.

Средняя оптическая плотность гранул, свидетельствующая о среднем уровне активности этого митохондриального фермента, была выше, а гетерогенность митохондрий по уровню сукцинатдегидрогеназной активности, был ниже, чем у детей с «первичными» митохондриальными болезнями. Это свидетельствует об относительно более сохранном состоянии митохондрий эпителиоцитов кожи обследованных больных второй группы. В то же время при проведении электронно-микроскопического исследования было отмечено, что у шести из десяти детей второй группы имелись ультраструктурные признаки умеренных изменений митохондрий.

У больных с неподтвержденной митохондриальной недостаточностью (болезнь «центрального стержня», лейкоэнцефалит, спинальная амиотрофия Верднига-Гофмана) в лимфоцитах периферической крови были обнаружены умеренные изменения. Однако они не сопровождались признаками митохондриальных изменений в других тканях. Эти изменения свидетельствовали о том, что при функциональных напряжениях метаболизма процессы, непосредственно связанные с аэробным окислением в митохондриях, и гликолитическая активность гиалоплазмы изменяются обратно пропорционально. Причем, видимо, более умеренные изменения характеризуются повышением активности аэробного катаболизма; в этих случаях единственным или наиболее выраженным изменением при цитохимическом анализе является повышение активности СДГ. При нарастании относительной декомпенсации активность СДГ может снижаться за пределы нижних значений референтных показателей, а активность ферментов, связанных с анаэробными процессами (ГФДГ, ЛДГ), нарастать. Можно считать, что определяемые у больных третьей группы изменения носят умеренно компенсаторный характер и связаны скорее всего с парциальным функциональным напряжением лимфоцитов.

Таким образом, полученные данные подтверждают теоретические представления о тканевой полисистемности поражения при митохондриальных заболеваниях. Результаты работы позволяют рекомендовать исследовать у больных с подозрением на митохондриальную природу заболевания максимально возможное число тканевых элементов при диагностической биопсии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Соколова-Меркурьева, Анна Владимировна, Москва

1. Дадали JL Митохондриальные болезни. Российский медицинский журнал, 1996г., N5, с.19-21.

2. Казанцева JI. 3. , Юрьева Э.А., Клембовский А. И. и соавт. Критерии дифференциальной диагностики наследственных нарушений нервно-психического развития, обусловленных патологией митохондрий. Пособие для врачей. М 1999:16.

3. Клембовский А.И., Сухоруков B.C. Митохондриальная недостаточность у детей. Архив патологии 1997; 59: 5: 3-7.

4. Клембовский А.И., Сухоруков В. С., Казанцева Л.З. Определение группы риска развития митохондриальной недостаточности среди детей с врожденными и наследственными метаболическими болезнями. Пособие для врачей. М. 1999. — с. 15

5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Москва "Высшая школа" 1992г.

6. Краснопольская К.Д. Информационное письмо. Наследственные митохондриальные болезни: методические подходы к диагностике и лечению. Бюллетень межрегионального общества медицинских генетиков. М 1997, N 1(5), с.9-18.

7. Ленинджер А. Основы биохимии. Под редакц. В.А. Энгельгардта Москва "Мир" 1985г.

8. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов, лабораторные методы.

9. Наследственные болезни нервной системы. Под ред. Ю.Е.Вельтищева, П.А.Темина. М: Медицина 1998: 496.

10. Наследственные нарушения нервно-психического развития детей. Под ред. П.А.Темина, Л.З.Казанцевой. М: Медицина 2001: 432.

11. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия. М: Медицина 2000; 164с.

12. Сухоруков B.C. Общие вопросы патологии клеточной энергетики. В сб. «Актуальные вопросы современной педиатрии», МЗ РФ, М:2002а, 11-15

13. Сухоруков B.C. Гетерогенность и клинико-морфологическаяIнеоднородность митохондриальной патологии у детей. Автореф. дисс. д.м.н., Москва, 1998.

14. Сухоруков B.C. Нарушения клеточного энергообмена у детей. Российский вестник перинатологии и педиатрии 20026, т.47, №5, 4450

15. В.С.Сухоруков Гистологический анализ митохондриальных нарушений у человека. Сборник трудов Всерос.научн.конф. «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», Москва, 2003, Изд-во РУДН, 177-181.

16. Сухоруков B.C., Клембовский А.И., Невструева B.B. и др. Митохондриальная природа кардиомиопатий у детей. Архив патологии 1997а; 59: 12-18.

17. Сухоруков B.C., Клембовский А.И., Невструева В.В. и др. Характеристика морфологических изменений скелетной мышечной ткани при митохондриальных миопатиях у детей и их матерей. Архив патологии 19976; 59: 18-21.

18. Сухоруков B.C., Нарциссов Р.П., Петричук С.В. Сравнительная диагностическая ценность анализа скелетной мышцы и лимфоцитов при митохондриальных болезнях. Архив патологии 2000; 62: 2: 19-21.

19. Тозлиян Е.В. Раннее выявление митохондриальных нарушений у детей с недифференцированными формами задержки нервно-психического развития. Автореф. дисс. к.м.н., Москва, 2003.

20. Adisa А. О., Odutuga A.A. Changes in the activities of three diagnostic enzymes in the heart of rats following the consumption of diets deficient in zinc and essential fatty acids. Biochem-Mol-Biol-Int. 1998 Oct; 46(3): 5716.

21. Attardi G. Role of mitochondrial DNA in human aging. Mitochondrion 2001; 1: Suppl.l: SI.

22. Ballinger S.W., Shoffner J.M., Hedaya E.V., et al. Maternally transmitted diabetes and deafness associated with a 10.4 kb mitochondrial DNA deletion. Nature Genet 1992; 1: 11-15.

23. Barrientos A., Casademont J., Saiz A. et al. Autosomal recessive Wolfram syndrome associated with an 8.5-kb mtDNA single deletion. Am J Hum Genet 1996; 58: 963-970.

24. Baysal BE, Ferrell RE, Willett-Broziek JE, Lawrence EC, Myssiorek D, Bosch A, van der Mey A, Taschner PE. Mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in hereditary paraganglioma. Science 2000 Feb 4;287(5454):848-51.

25. Behan W.M.H., Gow J.W., Simpson K., More I.A.R., Downie I., Holt I., Behan P.O. Mitochondrial findings in the chronic fatigue syndrome. / J.Pathol., 1994, v. 173, Suppl., p. 153.

26. Bindoff L. Mitochondria and the heart. European Heart Journal (2003) 24, 221-224

27. Chen Q Mitochondrial encephalomyopathy. Report of a case. /Chung-Hua-Shen-Ching-Ching-Shen-Ko-Tsa-Chih; 1990 Feb; 23(1); P 38-40, 63.

28. Chinnery P.F. Searching for nuclear-mitochondrial genes. Trends in Genetics Vol.19 No.2 February 2003 60

29. Chitkara D. K., Nurko S., Shoffner J. M., Buie T., Flores A. Abnormalities in gastrointestinal motility are associated with diseases of oxidative phosphorylation in children. The American journal of gastroenterology Vol. 98, No. 4, 2003

30. Chretien D., Benit P., Chol M., Lebon S., Rotig A., Munnich A., Rustin P. Assay of mitochondrial respiratory chain complex I in human lymphocytes and cultured skin fibroblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications 301 (2003) 222-224

31. Cohen B.H. Mitochondrial cytopathy in adults: What we know so far. Cleveland clinic journal of medicine, volume 68, number 7, July 2001, 625642

32. De-Stefano-N; Argov-Z; Matthews-PM; Karpati-G; Arnold-DL -Impairment of muscle mitochondrial oxidative metabolism in McArdles's disease./Muscle-Nerve. 1996 Jun; 19(6): 764-9

33. De Vivo D. The expanding spectrum of mitochondrial diseases. Brain & Development 1993; 15: 1-22.

34. Di Mauro S., Schon E. A. Mitochondrial Respiratory-Chain Diseases. N Engl J Med 2003;348:2656-68.

35. DiMauro S., Moraes C. Mitochondrial encephalomyopathies. Arch Neurol 1993; 50: 1197-1208.

36. Fliss M.S., Usadel H., Caballero O.L., et al. Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids. Science 2000; 287: 2017-2019.

37. Gietl C., Seidel C., Svendsen I. Plant glyoxysomal but not mitochondrial malat dehydrogenase can fold without chaperone assistense. Biochim.-Biophys.-Acta. 1996 May 20; 1274(1-2): 48-58.

38. Goncalves A., Oliveira C., Ferro M.A., Dinis M., Cunha L. Glutamate dehydrogenase deficiency in MachadoJoseph disease. Can J Neurol Sei 1993 May; 20(2): 14750.

39. Hipolite I. Migraine: la piste des mitochondries. / J.IntMed., 1994, v.321, p.17.

40. Holmgren D., Wahlander H., Eriksson B.O., Oldfors A., Holme E., Tulinius M. Cardiomyopathy in children with mitochondrial disease: Clinical course and cardiological findings. European Heart Journal (2003) 24, 280-288

41. Holt I.J., Harding A.E., Morgan-Hughes J.A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature 1988; 331:717-719.

42. Holt I.J., Harding A.E., Petty R.K.H., Morgan-Hughes J.A. A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy. / Am. J. Hum. Genet., 1990, v.46, p.428-433.

43. Jane F.G., Kenna P.F., Humphries P. (2002); On the genetics of retinitis pigmentosa and on mutation-independent approaches to terapeutic intervention. The EMBO J., 857 864.

44. Karppa M., Syrajala P., Tolonen U., Majamaa K. Peripheral neuropathy in patients with the 3243A>G mutation in mitochondrial DNA. J Neurol (2003) 250 :216-221

45. Kocaefe Y C, Erdem S, Ozguc M, Tan E. Four novel thymidine

46. Phosphorylase gene mutations in mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy syndrome (MNGIE) patients. European Journal of Human Genetics (2003) 11, 102 104

47. Koga A., Koga Y., Akita Y., Fukiyama R., Ueki I., Yatsuga S, Matsuishi T. Increased mitochondrial processing intermediates associated with threetRNALeu(UUR) gene mutations. Neuromuscular Disorders 13 (2003) 259262

48. Labrou N. E., Eliopoulos E., Clonis Y. D. Dye-affinity labelling of bovine heart mitochondrial malat degydrogenase and study of the NADH-binding site. Biochem.-J. 1996 Apr 15; 315 ( Pt 2 ): 687-93.

49. Li Hong, John Duffy, Anna Hansson (2000); Genetic modification of survival in tissue-specific knockout mice with mitochondrial cardiomyopathy. Medical Sciences, 3467 3472.

50. Lindal S; Lund I; Torbergsen T; Aasly J; Mellgren SI; Borud O; Monstad P Mitochondrial diseases and myopathies: a series of muscle biopsy specimens with ultrastructural changes in the mitochondria./ Ultrastruct-Pathol; 1992 May-Jun; 16(3); P 263-75.

51. Luft R. (1994); The development of mitochondrial medicine Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8731 8738.

52. Maly I. P., Toranelli M., Sasse D. Intra-acinar profiles of cytosolic and mitochondrial dehydrogenase isoensymes in rat liver. J-Histochem.-Cytochem. 1994 Jul; 42(7): 855-9.

53. Margulis L. Symbiosis in cell evolution. W.H.Freeman, San Francisco, CA 1981.

54. Materials of the 5 European Meeting on Mitochondrial Pathology (Italy 2001). Mitochondrion2001; 1: Suppl.l.

55. McArdle-A; McArdle-F; Jackson-MJ; Page-SF; Fahal-I; Edwards-RH -Investigation by polymerase chain reaction of enteroviral infection in patients with chronic fatigue syndrome./Clin-Sci-Colch. 1996 Apr; 90(4): 295-300

56. Moraes C.T., Shanske S., Tritschler H.J. et al. mtDNA depletion with variable tissue expression: a novel genetic abnormality in mitochondrial diseases. Am J Hum Genet 1991; 48: 492-501.

57. Nakamura-N; Hattori-N; Tanaka-M; Mizuno-Y Specific detection of deleted mitochondrial DNA by in situ hybridization using a chimera probe./ Biochim-Biophys-Acta. 1996 Sep 11; 1308(3): 215-21.

58. Nardin R. A., Johns D. R. Mitochondrial dysfunction and neuromuscular disease. Muscle Nerve 2001; 24: 170-191

59. Nass S., Nass M.M.K. Ultramitochondrial fibers with DNA characteristics. J Cell Biol 1963; 19: 593-629.

60. Oldfors-A; Holme-E; Tulinius-M; Larsson-NG Tissue distribution and disease manifestations of the tRNA(Lys) A~>G(8344) mitochondrial DNA mutation in a case of myoclonus epilepsy and ragged red fibres./Acta-Neuropathol-Berl. 1995; 90(3): 328-33

61. Olson W., Engel W., Walsh G., Einaugler R. Oculocraniosomatic neuromuscular disease with ragged-red fibers. Arch Neurol 1972; 26: 193211.

62. Ovadi J., Huang Y., Spivey H. O. Binding of malat dehydrogenase and NADH channelling to complex 1. J.-Mol-Recognit. 1994 Dec; 7(4): 26572.

63. Pavlakis S.G., Phillips P.C., DiMauro S. et al Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: A distinctive clinical syndrome. / Ann.Neurol.,1984, v.16, p.481-488.

64. Plasterer T. N., Smith T. F., Morgan S. C. (2001); Survey of human mitochondrial diseases using new genomic/proteomic tools. BioMed Central Ltd., 8843 8850.

65. Plioplys-AV; Plioplys-S Electron-microscopic investigation of muscle mitochondria in chronic fatigue syndrome./Neuropsychobiology. 1995; 32(4): 175-81

66. Popanda O., Fox G., at all. Modulation of DNA polimerases alpha, delta and epsilon by lactate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. Biochim.-Biophys.-Acta. 1998 Apr 1; 1397(1): 102-17.

67. PretschW., Chatteijee B., Favor J., Merkle S., Sandulache R. Molecular, genetic and biochemical characterization of lactate dehydrogenase-A enzyme activity mutations in Mus musculus. //J. Mamm-Genome. 1998 Feb; 9(2): 144-9.

68. Raffaele L., Cooper J. M., Bradley J. L. (1999); Deficit of in vivo mitochondrial ATP production in patients with Friedreich ataxia. Medical Sciences, 11492-11495.

69. Ristow M., Pfister M.F., Schubert M. (2000); Frataxin activates mitochondrial energy conversion and oxidative phosphorylation. Medical Sciences, 12239 12243.

70. Rutig A., Colonna M., Bonnenfont J.P. et al. Mitochondrial DNA deletions in Pearson's marrow/pancreas syndrome. Lancet 1989; 1: 902903.

71. Scheffler I.E. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives. Mitochondrion 2001; 1:1: 3-31.

72. Schuchmann S., Muller W., Heinemann U. Altered Ca2+ signaling and mitochondrial deficiencies in hippocampal neurons of trisomy 16 mice: a model of Down's syndrome. J-Neurosci. 1998 Sep. 15 ; 18(18): 7216-31.

73. Servidei S. Mitochondrial encephalomyopathies: gene mutation. Neuromuscular Disorders 13 (2003) 277-282

74. Shapira A.H.V. Mitochondrial disorders. Biochim Biophys Acta 1999; 1410:2: 99-102.

75. Shapira A.H.V. Mitochondrial involvement in Parkinson's disease, Huntington's disease, hereditary spastic paraplegia and Friedreich's ataxia. Biochim Biophys Acta 1999; 1410: 2: 159-170.

76. Shashidharan P., Michaelidis T.M., Robakis N.K. et al. Novel human glutamate dehydrogenase expressed in neural and testicular tissues and encoded by an Xlinked intronless gene. J Biol Chem 1994 Jun 17;269(24):1697l6.

77. Sligh J.E., Nusinowitz S, McGregor G.R. (2000); Maternal germ-line transmission of mutant mtDNAs from embryonic stem cells-derived chimeric. Genetics, 14461 — 14466.

78. Stadhouders A. M., Paul H. K.Jap, Hans-Peter Winkler, Hans M. Eppenberger, Theo Wallimann (1994); Mitochondrial Creatine kinase: A major constituent of pathological inclusions seen in mitochondrial myopathies. Medical Sciences, 5089 —5093.

79. Staniforth R. A., Cortes A. at all. The stability and hydrophobicity of cytosolic and mitochondrial malate dehydrogenases and their relation to chaperonin-assisted folding. FEBS-Lett. 1994 May 16; 344(2-3): 129-35.

80. Syed S.E., Engel P.C. Inhibition of glutamate dehydrogenase by covalent coenzymesubstrate adducts: a reexamination. Biochem Mol Biol Int 1993 Jun; 30(2):28391.

81. Tanji H., Takeda A., Tateyama M et al. Progressive cerebellar ataxia and distal amyotrophy of CharcotMarieTooth type with hyperglutamataemia: two sibling cases. Rinsho Shinkeigaku 1995 Jul; 35(7):7937.

82. Traff-J; Holme-E; Ekbom-K; Nilsson-BY Ekbom's syndrome of photomyoclonus, cerebellar ataxia and cervical lipoma is associated with the tRNA(Lys) A8344G mutation in mitochondrial DNA./Acta-Neurol-Scand. 1995 Nov; 92(5): 394-7

83. Tritschler H.-J., Medori R. Mitochondrial DNA alterations as a source of human disorders. Neurology 1993; 43: 280-288.

84. Utaka N., Marti R., Copeland W. C., Hirano M. (2003); Site-specific somatic mitochondrial DNA point mutations in patients with thymidine Phosphorylase deficiency. Scholarly science clinical impact, 1913-1931.

85. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T. et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science 1988a; 242: 1427-1431.

86. Wallace D.C., Zheng X., Lott M.T. et al. Familial mitochondrial encephalomyopathy (MERRF): genetic, pathophysiological, and biochemical characterization of a mitochondrial DNA disease. Cell 19886; 55: 601-610.

87. Williams A. J., Coakley J. at all. Automated analysis of mitochondrial enzymes in cultured skin fibroblasts. Anal.- Biochem. 1998 Jun 1; 259(2): 176-80.

Информация о работе

Соколова-Меркурьева, Анна Владимировна
кандидата медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Сравнительный гистологический анализ эпидермоцитов, скелетных мышечных волокон и лимфоцитов крови при митохондриальной патологии у детей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы