Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе"

На правах рукописи

СЪ2$

Пилипенко Даниил Игоревич

Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе

специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

1

7 ОЕ5 2911

4854475

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор В.П.Скулачёв

доктор биологических наук, профессор Л.Е.Бакеева

доктор медицинских наук, профессор О.В.Макарова, зам. директора по научной работе ГУ НИИ морфологии человека РАМН

доктор медицинских наук, профессор В.И.Капелько, руководитель лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, г. Москва

Защита состоится 15 февраля 2011 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, д. 1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

—7

Е.Н.Капистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние два десятилетия внимание многих исследователей направлено на изучение окислительного стресса. Показано, что окислительный стресс лежит в основе множества нейродегенеративных заболеваний, таких, как, например, атаксия Фридриха [Kaplan, 1999], болезнь Альцгеймера [Götz et al., 1994] и болезнь Паркинсона [Di Monte et al, 1992]. Показано, что окислительный стресс сопровождает процессы поражения при инфаркте миокарда [Loeper et al., 1991] и мозга [Choi, 1993]. Продемонстрирована роль окислительного стресса при сахарном диабете [Matkovics et al., 1982; Green et al., 2004]. Обнаружено, что в основе ряда возрастных патологий также лежит окислительный стресс. Одной из таких патологий, считающихся причиной ухудшения и потери зрения людьми старшего возраста, является макулярная дистрофия сетчатки [Островский, 2005].

К настоящему времени существует множество неоспоримых доказательств того, что важнейшую роль в процессе старения играют внутримитохондриальные активные формы кислорода (АФК). Согласно одной из теорий старения (теория Дэнхена Хармана) накопление повреждений под действием окислительного стресса и АФК приводит к возраст-зависимому повреждению тканей и старению [Harman, 1956]. Митохондрии считаются основным источником АФК, из-за чего функциональные и структурные характеристики митохондрий связывают со свободно-радикальной теорией Хармана [Skulachev et al, 2009].

Важнейшей особенностью митохондрий является значительная динамичность их морфологии в ответ на различные изменения клеточного метаболизма. Изменяться могут не только их форма, расположение, размеры и количество, но и внутренняя организация - ультраструктура. Изучение особенностей ультраструктуры митохондрий в сочетании с современными теоретическими представлениями митохондриологии чрезвычайно перспективны в исследовании обусловленных возрастом патологий, и не только с точки зрения фундаментальных исследований, но и для разработки, профилактики и, возможно, даже для лечения заболеваний, связанных с возрастом.

з

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - исследование изменений ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе, а также защитного эффекта митохондриально-направленного антиоксиданта БкС^ по отношению к этим изменениям методами морфометрического и стереологического анализа.

Были поставлены задачи разработки и применения указанных методов для оценки наблюдаемых изменений ультраструктуры митохондрий:

• летательной мышцы Иго^орИИа melanogaster при естественном старении;

• кардиомиоцитов мышей, мутантных по Ро^А-субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы, при ускоренном старении;

• кардиомиоцитов крыс при экспериментальном инфаркте миокарда.

Также в задачи настоящей работы вошла количественная оценка состояния ультраструктуры клеток пигментного эпителия (динамики липофусциновых и электронно-плотных гранул) крыс линии ОХУв при естественном старении, а также оценка действия 8к(3ь получаемого крысами в виде глазных капель, на состояние ультраструктуры клеток пигментного эпителия.

Научная новизна. Разработанные нами методы морфометрико-стереологического анализа ультраструктуры митохондрий являются принципиально новыми по сравнению с методами, использовавшимися ранее. Кроме того, применение нами компьютерных технологий, программных алгоритмов обработки изображений и распознавания образов не только позволило значительно повысить эффективность классических методов стереологии и морфометрии, но и дало возможность значительно их усовершенствовать.

Результаты, полученные с использованием данных методов, впервые статистически достоверно показали, что БкС^ оказывает защитный эффект на ультраструктуру митохондрий при различных процессах, обусловленных и/или сопровождаемых окислительным стрессом: при экспериментальном инфаркте миокарда, при ускоренном и естественном старении. Кроме того, нами показан защитный эффект БкС?! по отношению к клеткам пигментного эпителия крыс линии ОХУв при естественном старении. Данные результаты вносят весомый вклад в большую работу, посвященную борьбе со старением и лечению обусловленных возрастом заболеваний.

Практическая ценность работы. Использование компьютерных методик анализа изображений в целом повышает удобство и ускоряет процесс исследования. Широкое применение данных методов может сделать изучение ряда биологических объектов и процессов более эффективным и интересным.

Разработанные нами методы могут быть в дальнейшем использованы для оценки функционального состояния митохондрий. Алгоритм распознавания мембран митохондрий на электронно-микроскопичеких снимках позволяет оценить множество параметров, характеризующих функциональное состояние митохондрий: плотность упаковки и упорядоченность крист, размеры областей, лишённых крист, длину, количество и форму крист.

Применение специализированных компьютерных методов в биологических исследованиях нам представляется чрезвычайно перспективным направлением.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 года) в г. Новосибирске, на XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (РКЭМ-2010) в г. Черноголовке (31 мая - 4 июня 2010 года), а также на открытом семинаре отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ 24 июня 2010 года. Кроме того, различные результаты работы регулярно представляются на других семинарах отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ с 2008 года.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты и методы», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 128 страницах, включает 74 рисунка, список литературы содержит 291 ссылку.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Изменения ультраструктуры митохондрий летательной мышцы Drosophila melanogaster при естественном старении. Влияние антиоксиданта SkQi

Описание модели. Исследовалась ультраструктура митохондрий летательной мышцы D. melanogaster обоих полов, получавших и не получавших

8к<31 в концентрации 1,85 нМ в течение всей жизни с сухим кормом. Исследовались особи четырёх возрастов: 1,5 дня, 10 дней, 20 дней и 65 дней. Было показано, что с возрастом в митохондриях развиваются деструктивные изменения различного характера и, прежде всего, происходит реорганизация участков внутренней мембраны в миелиноподобные концентрические образования (рис. 1Б). Причём у особей, получавших БкСЬ, количество таких образований и степень их проявления ниже, чем у особей, не получавших БкСЬ (рис. 1В).

1,5 дня 52 дня ббдней + БкСИ

Рис. 1. Ультраструктура митохондрий летательной мышцы Ю. те1апо%Шег. А - 1,5 дня. Б -52 дня. В - 65 дней (особи, получавшие 8к(3]).

Для объективного сравнения количества митохондрий, имеющих деструктивные изменения, у особей разных возрастов и оценки влияния БкС^ на возрастную динамику этих изменений рассчитывалась доля сечений митохондрий, имеющих такие изменения.

Методы. Для получения электронно-микроскопических препаратов во всех проведённых исследованиях использовалась общепринятая методика. На электронно-микроскопических фотографиях подсчитывалось количество сечений митохондрий, имеющих «повреждения», а также общее количество

митохондриальных сечений. В результате вычислялась доля митохондрий, имеющих повреждения, как отношение количества повреждённых митохондрий к общему числу митохондрий на снимке. Для подсчёта отбирались и сканировались непересекающиеся снимки продольных срезов (относительно пространственной ориентации миофибрилл), содержащие не менее 80-ти митохондрий. Подсчёт митохондрий проводился на компьютере с использованием программы Adobe Photoshop.

Результаты. На графиках (рис. 2) представлены результаты измерений и расчётов для самцов и самок, соответственно. Полученные результаты показывают, что с возрастом доля повреждённых митохондрий в летательной мышце самцов и самок D. melanogaster значительно возрастает, в то время как у насекомых, получавших SkQi в течение всей жизни с сухим кормом в концентрации 1,85 нМ, этот процесс происходит менее интенсивно.

Самцы

Самки

Контроль w

: A" SkQl

: / J--—-1 . !

20 40 60 Возраст, дней

20 40 60 Возраст, дней

80

Рве. 2. Доля митохондрий, имеющих повреждения, в летательной мышце А тг/ллв£(ы<гг, получавших и не получавших вкС}]. Планки погрешностей соответствуют величинам стандартной ошибки.

2. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов мышей, мутантных по Ро^А, при ускоренном старении. Влияние антиоксиданта 5к0[

Описание модели. Исследовались мыши, мутантные по кодируемой в ядре Ро^А-субъсдинице митохондриальной ДНК-полимеразы. Известно, что данная мутация приводит к преждевременному появлению у мышей множества признаков старения, а также к сокращению продолжительности жизни [ТпГипоук е( а1, 2004]. В исследованном нами опыте две группы мышей (мутантные и дикого типа) получали 5к<31 в течение всей жизни с питьевой водой в концентрации 1 мкмоль на 1 кг веса, а другие две группы (также мутантные и дикого типа) не получали БкСЬ.

Была исследована ультраструктура митохондрий кардиомиоцитов мышей указанных четырёх групп в возрасте от 36 до 42 недель. При электронно-микроскопическом исследовании отличия ультраструктуры митохондрий мутантных мышей, получавших и не получавших 8к(3ь очевидны (рис. 3). Более детальное сравнение возможно при большем увеличении (рис. 4 и 5).

\Л/Т Мутант Мутант + Эк01

Рис. 3. Ультраструктура митохондрий мышей дикого типа («\\'Т»), а также мутантов, не получавших («Мутант») и получавших 8к(2( («Мутант + 8к<31»),

Для более точной и объективной оценки наблюдаемого эффекта БкСЬ на ультраструктуру митохондрий были проведены измерения и рассчитаны следующие параметры: относительное количество сечений митохондрий (на 1 мкм2 снимка), поверхностная плотность внутренней мембраны (мкм2/мкм3) и относительная электронная плотность матрикса митохондрий. Первый параметр получен методами количественной морфологии, а второй и третий - с помощью специально разработанного нами метода распознавания и анализа мембран.

Методы. Для измерения относительного количества сечений митохондрий (на единицу площади среза) отбирались непересекающиеся снимки, содержащие не менее 90 сечений, затем подсчитывалось их количество, и измерялась площадь снимка, на которой производился подсчёт.

Мы измеряли два параметра, наилучшим образом характеризующие наблюдаемые изменения ультраструктуры митохондрий: поверхностную плотность внутренней мембраны (мкм2/мкм3) и относительную электронную плотность матрикса (измеряемую относительно электронной плотности мембран).

Для анализа внутренней мембраны и матрикса митохондрий и последующего вычисления указанных параметров была специально написана компьютерная программа, центральной частью которой стал алгоритм распознавания мембран митохондрий на снимках. Алгоритм реализован на основе методов стереологии и аналитической геометрии (рис. 6), компьютерной денситометрии (рис. 7), а также распознавании образов (рис. 8).

Рис. 6. Основное стереологическое преобразование двумерного изображения мембраны в трёхмерную модель, позволяющую оценить площадь поверхности мембраны.

Расстояние« нм

Рис. 7. Иллюстрация соответствия фрагмента электронно-микроскопического снимка графику денситометрии. Видно, что график отражает набор параллельных крист и позволяет приблизительно оценить их параметры.

Рис. 8. Иллюстрация алгоритма распознавания «мембранных точек» по четырём чередующимся экстремумам (рисунок и график слева) позволяет распознавать мембраны с высокой точностью (центральный и правый рисунки).

Результаты. Данные обсчётов относительного количества сечений митохондрий представлены на рис. 9. Полученные результаты свидетельствуют о том, что относительное количество сечений митохондрий в кардиомиоцитах мышей, мутантных по Ро^А-субъедшшце митохондриальной ДНК-полимеразы, ниже, чем у мышей дикого типа того же возраста (столбцы 3 и 1 на рис. 9), а у мутантов, получавших антиоксидант БкС^, это значение соответствует значению у мышей дикого типа (столбцы 4 и 1 на рис. 9). В то же время, приём БкС^ достоверно не влияет на этот параметр у мышей дикого типа по сравнению с мышами дикого типа, не получавшими антиоксидант (столбцы 2 и 1 на рис. 9).

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 ОД 0,0

р< 0,0001 10

уя Мутант 0'д

1,6 : !■

I

Ш

Мутант Мутант + БкСП

\Д/Т+ Мутант Мутант+ 5кСЦ 5кЦ1

Рис. 9. Количество сечений митохондрий в расчёте на 1 мкм2 снимка. Планки погрешностей на левом рисунке - стандартная ошибка среднего, на правом - стандартное отклонение.

Результаты измерений поверхностной плотности внутренней мембраны митохондрий, приведённые на рис. 10, свидетельствуют о том, что данный параметр в кардиомиоцитах мутантных мышей, не получавших ЭкСЬ, достоверно ниже, чем у мышей дикого типа, а также у мутантных мышей, получавших ЭкСЬ. При этом значения поверхностной плотности внутренней мембраны практически не отличаются у мышей дикого типа и у мутантных мышей, получавших 8к(2|.

50 40 30 20 10 0

II а

Рис. 10. Поверхностная плотность внутренней мембраны митохондрий (мкм /мкм1). Планки погрешностей соответствуют величинам стандартной ошибки среднего.

ШТ \Л/Т + ЬкСЦ Мутант Мутант+ 5кСП

Полученные значения относительной электронной плотности матрикса, представленные на рис. 11, позволяют сделать вывод о том, что митохондрии кардиомиоцитов мутантных мышей, не получавших ЭкСЬ, имеют более электронно-прозрачный (обводнённый) матрикс по сравнению с мышами дикого типа, а также с мышами, получавшими БкС^. Значения относительной электронной плотности матрикса митохондрий мутантных мышей, получавших БкС^, практически не отличаются от таковых у мышей дикого типа.

1 -.- Рис. 11. Относительная электронная

и среднего.

\Л/Т \Л/Т + 5к01 Мутант Мутант+

ЭкСЦ

3. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс при экспериментальном инфаркте миокарда. Влияние антиоксиданта вкС^

Описание модели. Исследовалось защитное действие 8кС>1 на ультраструктуру митохондрий кардиомиоцитов при экспериментальном инфаркте миокарда у 3-месячных крыс-самцов линии \Vistar. Были исследованы четыре группы крыс: две группы крыс, подвергнутые и не подвергнутые экспериментальному инфаркту, не получали БкС?], а две другие - также подвергнутые и не подвергнутые инфаркту - получали вкС^ с кормом в дозе 250 нмоль на килограмм веса в сутки. Митохондрии кардиомиоцитов животных, подвергнутых экспериментальному инфаркту миокарда, имели хаотично расположенные фрагментированные кристы и более светлый матрикс, в то время как митохондрии кардиомиоцитов крыс, подвергнутых инфаркту, но получавших перед этим 8к<31, соответствовали митохондриям контрольных животных (рис. 12).

Для объективизации и характеристики наблюдаемых изменений ультраструктуры митохондрий были измерены и рассчитаны поверхностная плотность (мкм2/мкм3) внутренней мембраны, а также относительная электронная плотность матрикса митохондрий.

0,8 0,6 0,4 0,2 0

плотность матрикса митохондрий (относительно электронной плотности мембран, принимаемой за единицу). Планки погрешностей соответствуют величинам стандартной ошибки

контроль

инфаркт

>3

... ^

Ж'Ш''* л,.

1 г г М

«"¡МК I Л ф/Л'-У^ ¿,.1

Рис. 12. Ультраструктура митохондрий крыс трёх групп при экспериментальном инфаркте.

Методы. Методы измерений и подсчётов поверхностной плотности внутренней мембраны и относительной электронной плотности матрикса митохондрий описаны в предыдущем разделе (стр. 8-10, рис. 6-8).

Результаты. Полученные значения поверхностной плотности внутренней мембраны и относительной электронной плотности матрикса митохондрий приведены на рис. 13.

Инфаркт Бкси + инфаркт

Контроль

Инфаркт

5кЦ1 + инфаркт

Рис. 13. Слева - поверхностная плотность (мкм2/мкм3) внутренней мембраны, справа -относительная электронная плотность матрикса митохондрий. Каждый столбец соответствует данным по 50 митохондриям. Планки погрешностей соответствуют значениям стандартной ошибки среднего.

Полученные данные показали, что поверхностная плотность внутренней митохондриальной мембраны достоверно ниже у крыс, подвергнутых экспериментальному инфаркту миокарда, чем у таких же крыс, получавших SkQi в течение трёх недель до инфаркта. У крыс, получавших SkQi и подвергнутых затем экспериментальному инфаркту миокарда, данный параметр соответствует значениям, полученным для митохондрий крыс контрольной группы. Аналогичным образом коррелирует электронная плотность матрикса: после экспериментального инфаркта митохондрии кардиомиоцитов крыс, не получавших SkQb имеют достоверно меньшую электронную плотность по сравнению с тремя другими группами животных, у которых значение этого параметра примерно одинаково.

4. Ультраструктура клеток пигментного эпителия крыс линии OXYS в процессе старения. Динамика липофусциновых гранул. Действие SkQi

Описание модели. Нами была исследована ультраструктура клеток пигментного эпителия (ПЭ) крыс линий OXYS и Wistar, а также терапевтический эффект антиоксиданта SkQi на развитие у крыс OXYS зависимой от возраста макулярной дистрофии сетчатки.

Наличие и степень выраженности очаговых изменений макулярной области сетчатки оценивались офтальмоскопически в баллах согласно классификации Кацнельсона (1990). Исследования состояния сетчатки крыс линий OXYS и Wistar были выполнены в Институте цитологии и генетики СО РАН.

Крысы OXYS были разделены на 2 группы: первой группе закапывали в глаза 0,9% раствор NaCl, а второй - капли, содержащие 0,9% раствор NaCl и SkQi в концентрации 250 нМ. Третья группа - крысы линии Wistar - не получали капли с SkQi.

При электронно-микроскопическом исследовании ПЭ крыс Wistar, не имевших признаков поражения сетчатки, было показано наличие непрерывного слоя электронно-плотных цитоплазматических включений (рис. 14). Детальный анализ ультраструктуры данного слоя показал, что он содержит чрезвычайно гетерогенные по своей морфологии структуры, небольшая часть которых представляет собой липофусциновые гранулы. Ультраструктура клеток ПЭ 11-ти месячных крыс OXYS с признаками поражения сетчатки, оцениваемыми в 2 балла,

сильно отличалась от таковой у крыс '\Vistar, в частности, отсутствием непрерывного слоя электронно-плотных гранул (рис. 15). Вместо него гранулы (в основном, липофусциновые) образовывали скопления в основаниях выростов цитоплазмы, окружающих палочки. У крыс, получавших в течение 2-х месяцев капли 8к(5ь патологические изменения сетчатки полностью исчезли либо значительно уменьшились.

ч» ИИК<" « Рис- И- Участок ПЭ крысы -.^ЕЙ^ЗРГ» в вочрасте 11 месяцев. 1

1 ' V - фагосома, 2 - непрерывный

(^¡^ .¿Г. \ 5 слой электронно-плотных

' - гранул (цитоплазматических

л^Й»#* л" • включений), 3 - митохондрии,

.г; ¿2. - . ¿<

■■■ ■

Рис. 15. Участок ПЭ крысы ОХУ8 в возрасте 11 месяцев (поражение сетчатки 2 балла). 1 - граница двух клеток с прилегающими к мембранам митохондриями; 2 -скопления электронно-плотиых гранул.

Для оценки наблюдаемых изменений были проведены измерения и рассчитаны следующие количественные параметры: относительное количество липофусциновых гранул и всех электронно-плотных гранул в расчёте на 1 мкм длины ПЭ (мембраны Бруха), распределение площадей сечений, а также ширина зоны распределения всех электронно-плотных гранул.

Методы. Подсчеты проводили на снимках, охватывающих участки срезов протяженностью 50-250 мкм. Для анализа таких участков снимки высокого разрешения склеивались на компьютере при помощи графического редактора.

Результаты. Полученные нами данные показали, что у 11-месячных крыс линии OXYS, имеющих повреждения сетчатки, количество липофусциновых

15

гранул в 4,5 раза выше, чем у крыс линии \Vistar того же возраста, не имевших таких повреждений. В то же время у крыс линии ОХУБ, получавших глазные капли ЗкС^, количество липофусциновых гранул выше, чем у здоровых крыс, чуть менее чем в 2 раза (рис. 16). 1,0----------------------

Рис. 16. Относительное количество 0 5 - ШЁЛ _ липофусциновых гранул (в расчёте на 1

0 о _яавц—...........—^ИИИЦ. , ..ЯИй.., мкм длины ПЭ). Планки погрешностей

Ю^аг ОХУЭ (1-2 ОХУЗ + ЭкСИ соответствуют величинам стандартной

(0 баллов) балла) (0 баллов) ошибки среднего.

Согласно данным, представленным на рис. 17, относительное количество гранул в клетках ПЭ у крыс линии ОХУ8, не получавших 8к<Зь несколько ниже, чем у крыс линии \Vistar (р < 0,05). В то же время у крыс ОХУв, получавших 8кС>ь этот параметр соответствовал значению у крыс линии \Vistar.

2,0

1,

О,

Рис. 17. Относительное количество (плотность) всех электронно-плотных гранул (в расчёте на 1 мкм длины ПЭ). Планки погрешностей соответствуют МЛйаг охуь (1-2 ОУУЬ + 5к<д1 значениям стандартной ошибки

(0 баллов) балла) (0 баллов) среднего.

Другой рассчитанный нами параметр - площадь сечения

электронно-плотных гранул, отнесенная к 1 мкм мембраны Бруха, - коррелирует

(рис. 18) с плотностью гранул (коэффициент корреляции равен 0,7).

Рис. 18. Относительная суммарная площадь сечения всех электронно-плотных гранул в квадратных микрометрах (мкм2) в расчёте на 1 микрометр длины ПЭ. Планки И^аг ОХУ5 (1-2 ОХУБ + БкЦ! погрешностей соответствуют значениям

(0 баллов) балла) (0 баллов) стандартной ошибки среднего.

Измерения ширины зоны распределения электронно-плотных гранул в клетках ПЭ показали, что у крыс линии '^Д^аг и у крыс линии ОХУБ, получавших 8к(3ь гранулы располагаются компактно, образуя сплошной слой в апикальной части цитоплазмы клеток ПЭ, в то время как у крыс ОХУЗ, не получавших 8кСЬ, гранулы не образуют сплошного слоя: они располагаются не только в апикальной части клеток ПЭ, но и в их цитоплазматических отростках, оплетающих клетки-палочки.

0,20 0,10 0,00

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Визуальное описание выявляемых изменений ультраструктуры митохондрий, как, впрочем, и других клеточных компонентов, при различных патологических процессах является недостаточным и малоинформативным: оно не может дать точную, объективную и статистически достоверную оценку степени этих изменений. Такая оценка возможна лишь с использованием специальных методов, - методов морфометрии и стереологии, - позволяющих объективизировать исследование и получить принципиально новые данные о строении и пространственной организации изучаемых структур.

Нами были разработаны и применены методы оценки основных параметров ультраструктуры митохондрий, характеризующих их функциональное состояние. Метод оценки доли митохондрий, имеющих миелиноподобные структуры, показал, что БкСЬ существенно замедляет накопление этих структур в митохондриях летательной мышцы О. melanogaster с возрастом. Количественные методы, а также методы анализа мембран и матрикса митохондрий показали, что БкС^ снижает степень основных ультраструктурных изменений митохондрий при ускоренном старении мышей, а также при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс.

Методы морфометрии также были применены нами для оценки эффекта ЭкСЬ на ухудшающееся с возрастом состояние пигментного эпителия (ПЭ) быстро стареющих крыс ОХУ8. Нами было показано, что количество липофусциновых гранул в клетках ПЭ с возрастом увеличивается, а непрерывность слоя электронно-плотных гранул уменьшается. Недавно нами были получены данные, согласно которым у 24-месячных крыс линии ОХУБ, имеющих максимальную степень выраженности патологических изменений сетчатки, оцениваемую в 3 балла, слой электронно-плотных включений состоит только лишь из гранул липофусцина.

По-видимому, накопление липофусциновых гранул и снижение количества электронно-плотных структур, а также фагосом, являющихся фагоцитированными обломками фоторецепторов, в цитоплазме клеток ПЭ свидетельствует о нарушении зрительного цикла у крыс ОХУБ, не получавших 8кС2ь в то время как глазные капли, содержащие БкС^, предотвращают эту патологию и восстанавливают зрительный цикл, что, в результате, приводит к нормализации состояния сетчатки.

Морфометрико-стереологические методы анализа митохондрий, на наш взгляд, следует применять наряду с гистологическими и биохимическими методами, чтобы лучше выявлять и понимать корреляции между параметрами ультраструктуры митохондрий и их функциональным состоянием.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны морфометрико-стереологические методы, позволяющие анализировать и оценивать изменения ультраструктуры митохондрий.

2. Применение разработанных методов для анализа ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе показало, что:

а. В процессе старения в летательной мышце D. melanogaster происходит увеличение доли митохондрий, имеющих миелиноподобные структуры, а получение SkQi в виде сухого корма в концентрации 1,85 нМ снижает долю таких митохондрий, как у самок, так и у самцов.

a. У 39-недельных мышей, мутантных по PoIgA-субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы и подверженных ускоренному старению, по сравнению с мышами дикого типа того же возраста наблюдается снижение относительного количества сечений (на 1 мкм2), поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3) и относительной электронной плотности матрикса митохондрий кардиомиоцитов. При ежедневном получении мутантными мышами препарата SkQ[ (в концентрации 1 мкмоль на килограмм веса животного) в течение всей жизни снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у мышей дикого типа.

b. У крыс при экспериментальном инфаркте миокарда наблюдается снижение поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3) и относительной электронной плотности матрикса митохондрий кардиомиоцитов в зоне ишемического повреждения. При ежедневном получении крысами SkQi в концентрации 250 нМ в течение 3-х недель до инфаркта снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у крыс, не подвергнутых инфаркту.

с. У 11-месячных крыс ОХУБ (модель ускоренного старения) по сравнению с крысами \Vistar в клетках пигментного эпителия (ПЭ) сетчатки наблюдается значительное увеличение относительного количества липофусциновых гранул, снижение относительного количества и суммарной площади сечений, а также увеличение ширины зоны распределения электронно-плотных гранул в расчёте на 1 мкм длины ПЭ. При получении БкС?: в виде глазных капель (250 нМ) в течение 68 суток указанные изменения не наблюдаются, а значения соответствуют значениям у крыс \Vistar.

1. Бакеева JI.E., Сапрунова В.Б., Пилипенко Д.И. Ультраструктура митохондрий в условиях эндогенного окислительного стресса, защитное действие митохондриального антиоксиданта SkQi. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 г., с. 329.

2. Пилипенко Д.И. Динамика липофусциновых гранул при развитии возрастной макулодистрофии: морфометрический анализ. // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии (РКЭМ-2010), Черноголовка, 31 мая - 4 июня 2010 г., с. 139.

3. Анисимов В.Н., Бакеева Л.Е., Егормин П.А., Филенко О.Ф., Исакова Е.Ф., Манских В.Н., Михельсон В.М., Пантелеева A.A., Пасюкова Е.Г., Пилипенко Д.И., Пискунова Т.С., Попович И.Г., Рощина Н.В., Рыбина О.Ю., Сапрунова В.Б., Самойлова Т.А., Семенченко A.B., Скулачев М.В., Спивак И.М., Цыбулько Е.А., Тындык М.Л., Высоких М.Ю., Юрова М.Н., Забежинский М.А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 5. SkQl увеличивает продолжительность жизни и предотвращает развитие признаков старения. // Биохимия, 2008, 73 (12), с. 1329-1342.

4. Нероев В.В., Архипова М.М., Бакеева JI.E., Фурсова А.Ж., Григорян Э.Н., Гришанова А.Ю., Зиновкин P.A., Иомдина E.H., Иващенко Ж.Н., Катаргина JI.A., Хорошилова-Маслова И.П., Килина О.В., Колосова Н.Г., Копенкин Е.П., Коршунов С.С., Ковалева H.A., Новикова Ю.П., Пилипенко Д.И.. Робустова О.В., Сапрунова В.Б., Сенин И.И., Скулачев М.В., Сотникова Л.Ф., Стефанова H.A., Тихомирова Н.К., Цапенко И.В., Щипанова А.И., Филиппов П.П., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 4. С вязанные с возрастом заболевания глаз. SkQ возвращает зрение слепым животным II Биохимия, 2008, 73 (12), с. 13171328.

5. Сапрунова В.Б., Пилипенко Д.И.. Алексеевский A.B., Фурсова А.Ж., Колосова Н.Г., Бакеева Л.Е. Динамика липофусциновых гранул при развитии макулодистрофии, зависимой от возраста. // Биохимия, 2010, 75 (2), с. 130-138.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Подписано в печать: 20.12.10

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пилипенко, Даниил Игоревич

Введение

Обзор литературы

I. Методы морфометрии и стереологии

1. Краткая история стереологии

2. Основные принципы стереологического анализа

2.1. Фундаментальные стереологические формулы и 10 преобразования

2.2. Методы подсчёта точек и пересечений

2.3. Принципы отбора снимков

2.4. Изотропные и анизотропные структуры

2.5. Выбор тестовых систем для стереологического анализа

2.6. Преимущества стереологических методов

3. Параметры, получаемые методами стереологии

3.1. Разнообразие стереологических параметров

3.2. «Дисектор» — метод подсчёта количества объектов

3.3. Метод расчёта поверхностной плотности

3.4. Метод расчёта объёмной плотности структуры

3.5. Стереологический анализ митохондрий

4. Альтернативные методы анализа пространственной 23 структуры объектов в электронной микроскопии

4.1. Метод трёхмерной реконструкции

4.2. Высоковольтная электронная микроскопия

II. Динамичность митохондрий, окислительный стресс и 24 антиоксидант БкСЬ

1. Динамичность и полиморфизм митохондрий

1.1. Внутриклеточная локализация митохондрий

1.1.1. Хондриом летательных мышц насекомых

1.1.2. Хондриом скелетных мышц

1.1.3. Хондриом кардиомиоцитов

1.2. Фрагментация и слияние митохондрий

1.2.1. Размеры и количество митохондрий

1.2.2. Фрагментация митохондриального ретикулума

1.2.3. Слияние митохондрий

1.2.4. Значение слияния и деления

1.3. Элиминирование митохондрий 38 1.3.1. Клетки хрусталика глаза

1.3.2. Созревание ретикулоцитов в эритроциты

1.3.3. Митоптоз и «энергетический шок» 44 1.4. Ультраструктура митохондрий

1.4.1. Общие представления

1.4.2. Корреляция с функциональным состоянием

2. Окислительный стресс

2.1. Генерация АФК в митохондриях

2.2. Антиоксидантная защита и митоптоз

2.2.1. Внутренняя мембрана и межмембранное пространство

2.2.2. Митохондриальный матрикс

2.2.3. Защита от перекисного окисления липидов

2.2.4. Пора во внутренней мембране и митоптоз

2.3. Роль окислительного стресса в старении и развитии патологий

2.3.1. Нейродегенеративные заболевания

2.3.2. Инфаркт миокарда

2.3.3. Возрастная макулодистрофия сетчатки

2.3.4. Процесс старения

2.4. Ультраструктура митохондрий при окислительном стрессе

3. Антиоксидант SkQi 63 III. Задачи работы '

Результаты и методы

I. Изменения ультраструктуры митохондрий летательной мышцы 65 Drosophila melanogaster при естественном старении. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

3. Результаты

II. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов мышей, 72 мутантных по PolgA, при ускоренном старении. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

2.1. Относительное количество сечений митохондрий

2.2. Анализ внутренней мембраны и матрикса митохондрий

3. Результаты

3.1. Относительное количество сечений митохондрий

3.2. Поверхностная плотность и объёмная доля внутренней 89 мембраны митохондрий

3.3. Относительная электронная плотность матрикса митохондрий

III. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс при 91 экспериментальном инфаркте миокарда. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

3. Результаты

IV. Ультраструктура клеток пигментного эпителия крыс линии OXYS в 99 процессе старения. Динамика липофусциновых гранул. Действие SkQi

1. Описание модели

1.1. Крысы линии OXYS и действие антиоксиданта SkQi

1.2. Описание экспериментальных групп

1.3. Описание состояния сетчатки крыс линии Wistar

1.4. Описание состояния сетчатки крыс линии OXYS

1.5. Описание состояния сетчатки крыс линии OXYS, 105 получавших антиоксидант SkQi в виде глазных капель

1.6. Количественная оценка: параметры

2. Методы

2.1. Электронная микроскопия

2.2. Статистическая обработка

2.3. Подсчёт относительного количества (плотности) 109 липофусциновых гранул и всех электронно-плотных гранул

2.4. Подсчёт площадей сечения электронно-плотных гранул

2.5. Подсчёт ширины зоны распределения электронно-плотных 111 гранул

3. Результаты

3.1. Относительное количество (плотность) липофусциновых 112 гранул

3.2. Относительное количество (плотность) электронно-плотных 114 гранул

3.3. Относительная средняя площадь сечения электронно-плотных 116 гранул

3.4. Ширина зоны распределения электронно-плотных гранул

3.5. Корреляция с балльной оценкой

Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе"

В последнее время находится всё больше подтверждений того, что основой процесса старения и ряда патологических возрастных заболеваний является действие активных форм кислорода. Основным источником активных форм кислорода в клетке считаются митохондрии, характерная особенность которых - взаимосвязь структуры и функции.

В.П.Скулачёвым был разработан митохондриально-направленный антиоксидант SkQb представляющий собой соединение молекулы хлоропластного антиоксиданта пластохинона и проникающего катиона додецилтрифенилфосфония. Ключевой особенностью SkQi является способность избирательно накапливаться в митохондриях за счёт трансмембранного потенциала. Показано, что SkQi замедляет или предотвращает развитие огромного числа патологий и процессов старения [Скулачёв, 2007]. На клеточном уровне показано, что SkQi способен предотвращать апоптоз, вызываемый перекисью водорода. На мышах показано, что SkQi замедляет развитие трёх различных типов ускоренного старения (прогерии). Аналогичный эффект получен на беспозвоночных - плодовой мушке Drosophila melanogaster и дафниях. SkQi обладает мощным лечебным действием при множестве глазных заболеваний: при врождённой дисплазии сетчатки, при возрастной макулярной дистрофии, при экспериментальном увейте и глаукоме. Показан защитный эффект SkQj при экспериментальном инфаркте миокарда на крысах, получавших SkQi с пищей в течение трёх недель до эксперимента. Предварительный приём SkQi спасает животных при экспериментальном инфаркте почки и сильно снижает зону поражения мозга при экспериментальном инсульте [Скулачёв, 2007].

Визуальное описание выявляемых изменений в исследовании методами электронной микроскопии структуры митохондрий при различных патологических процессах, как, впрочем, и других клеточных компонентов, является недостаточным и малоинформативным: оно не может дать точную, объективную и статистически достоверную оценку степени этих изменений. Такая оценка возможна лишь с использованием специальных методов, — методов морфометрии, стереологии и трёхмерной реконструкции, -позволяющих объективизировать исследование и получить принципиально новые данные о строении и пространственной организации изучаемых структур.

Центральной задачей настоящей работы была разработка и применение методов морфометрического и стереологического анализа для количественной характеристики изменений ультраструктуры митохондрий при различных патологических процессах, обусловленных окислительным стрессом, при естественном и ускоренном старении, а также для количественной характеристики защитного эффекта ЭкСЬ, проявляющегося на уровне ультраструктуры митохондрий.

В рамках настоящей работы были разработаны компьютерные методы оценки поверхностной плотности внутренней митохондриальной мембраны — отношения площади поверхности мембраны к объёму митохондрии. Метод также позволяет оценить электронную плотность матрикса и другие параметры, дающие возможность судить о функциональном состоянии митохондрий.

Разработка методов количественной оценки состояния ультраструктуры митохондрий по большим выборкам электронно-микроскопических фотографий, на наш взгляд, является перспективным направлением, поскольку позволяет характеризовать ультраструктуру митохондрий с высокой точностью по сравнению с обычно принятыми описательными характеристиками наблюдаемых явлений. В связи с повышенным вниманием исследователей к митохондриям, играющим ключевую роль в огромном множестве патологий, а также, по-видимому, в развитии процесса старения, разработка компьютерных методов морфометрико-стереологического анализа митохондрий в настоящее время является чрезвычайно актуальной.

Обзор литературы I. Методы морфометрии и стереологии

Морфометрия — это наука об измерении структуры, совокупность различных методов, с помощью которых можно получить информацию о реальных размерах трёхмерных структур.

Стереология - это система методов, разработанных на основе аналитической геометрии и теории вероятностей, предназначенных для исследования трёхмерных структур по их двумерным изображениям (фотографиям срезов или проекциям). Стереологические методы позволяют получить морфометрические результаты, так как с их помощью можно установить форму и пространственную ориентацию изучаемых структур [Непомнящих и др., 1986].

Ультратонкие срезы, используемые в электронной микроскопии, можно считать двумерными, поэтому применение инструментов стереологии к исследованию клеточных структур, исследуемых с помощью электронного микроскопа, является целесообразным. Использование методов стереологического анализа в количественной микроскопии при изучении тканевых, клеточных и внутриклеточных структур имеет существенное преимущество перед описательными методами исследований [БеНой-, ЫЫпез, 1968].

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Пилипенко, Даниил Игоревич

Выводы

1. Разработаны морфометрико-стереологические методы, позволяющие анализировать и оценивать изменения ультраструктуры митохондрий.

2. Применение разработанных методов для анализа ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе показало, что митохондриально-направленный антиоксидант SkQl снижает степень основных ультраструктурных изменений митохондрий при естественном и ускоренном старении, а также при экспериментальном инфаркте миокарда, а именно: a. В процессе старения в летательной мышце Drosophila melanogaster происходит увеличение доли митохондрий, имеющих миелиноподобные структуры ("swirls"), а получение SkQl в виде сухого корма в концентрации 1,85 нМ снижает долю таких митохондрий, как у самок, так и у самцов. Причём у самцов это снижение имеет более выраженный характер. b. У 39-недельных мышей, мутантных по PolgA-субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы (подверженных ускоренному старению), по сравнению с мышами дикого типа того же возраста наблюдается снижение трёх параметров митохондрий кардиомиоцитов:

• относительного количества сечений митохондрий (на 1 мкм2);

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении мутантными мышами препарата SkQl (в концентрации 1 мкмоль на килограмм веса животного) в течение всей жизни снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у мышей дикого типа. c. У крыс при экспериментальном инфаркте миокарда наблюдается снижение двух параметров митохондрий кардиомиоцитов зоны ишемического повреждения:

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении крысами препарата 8к(^1 в концентрации 250 нМ в течение 3-х недель до инфаркта и последующем инфаркте миокарда снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у крыс, не подвергнутых инфаркту. с1. У 11-месячных крыс линии ОХУБ (модель ускоренного старения) по сравнению с крысами линии \yistar в клетках пигментного эпителия сетчатки наблюдается:

• снижение относительного количества электронно-плотных гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха);

• снижение суммарной площади сечений электронно-плотных гранул в расчёте на 1 мкм длины мембраны Бруха;

• увеличение ширины зоны распределения электронно-плотных гранул;

• значительное увеличение относительного количества липофусциновых гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха).

При получении препарата 8кС>1 в виде глазных капель (250 нМ) в течение 68 суток указанные изменения не наблюдаются, а значения соответствуют значениям у крыс \Vistar.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пилипенко, Даниил Игоревич, Москва

1. Авцын А.П., Шахламов В. А. (1979) Ультраструктурные основы патологии клетки. М.Медицина. 320с.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. (1994) Молекулярная биология клетки. М., издательство «Мир»; 3-й том, стр. 154-156.

3. Бакеева JI.E., Северина И.И., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С., Ясайтис A.A. (1971) Проникающие ионы и структура митохондрий. В сб.: "Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии". М: Наука, с. 67.

4. Бакеева Л.Е., Ясайтис A.A. (1972) Изменения структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия. В книге «Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций» М: Наука; стр. 56-64.

5. Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1977) Митохондриальный ретикулум: строение и возможные функции внутриклеточных структур нового типа в мышечной ткани. Вестн. Моск. Ун-та. сер. Биология, том 3, стр. 23-38.

6. Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1982) Межмитохондриальные контакты кардиомиоцитов. Цитология, том 24 (2), стр. 161-166.

7. Бакеева Л.Е., Зоров Д.Б., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1986) Мембранный электрический кабель. 1. Нитчатые митохондрии фибробластов. Биологические мембраны, том 3 (11), стр. 1130-1136.

8. Бакеева Л.Е., Ченцов Ю.С. (1989) Митохондриальный ретикулум: строение и некоторые функциональные свойства. «Итоги науки и техники», сер. общая биол. -М.: ВИНИТИ, том 9, 104 с.

9. Бакеева Л.Е., Сапрунова В.Б., Пасюкова Е.Г., Рощина Н.В. (2007) Митоптоз в летательной мышце Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук, том 413 (3), стр. 1-3.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 252 с.12,13,14,15,1617,18