Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансмиссия природных и искусственных хромосом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и ее генетический контроль

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Трансмиссия природных и искусственных хромосом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и ее генетический контроль"

РГ6 ол

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

1 3 ПИВ ^НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ЗДОРОВЬЯ США

---

на правах рукописи

^ ^ УДК 582.232:576.316:576.35.1.7

КУПРИНА Наталия Юрьевна —

ТРАНСМИССИЯ ПРИРОДНЫХ И ИСКУССТВЕННЫХ ХРОМОСОМ У ДРОЖЖЕЙ ЯАССНЛИОМУСЕЗ СЕ!ШУ151ЛЕ И ЕЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

Клеточная биология 03.00.25

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биодошческнх наук в форме намного доклада

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена п Иненпую шполопш РАН и в Национальном Именную Здоровья, США.

Официальные ошюнешы: член-корр. РАИ, проф. С. Г. Пше-Всчюмо»

СПб Гос. Униьсрстег, Санкт-Носрбург

член-корр. РАСХ, проф. К. Г. Скрябин Цешр биоинжснсрнигМоскиа-

доктор бишмппсских паук, пр >ф. В. И. Bopo6iA.ii Институт имюл01 ни РАН, Саикт-Пскрбурт

Ведущее учреждение: Институт молекулярной снетки РАН, Москва

Зашита состой гея " января 1997 I. и 13 час. "а заседании Дпссеркишоппою

совета Д.002ЛЗ.Ш Институт цитологии РАН но аирссу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан "«¿у" декабря 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук ¡II

(у Л.Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов трансмиссии хромосом при клеточных делениях у эукариот является фундаментальной проблемой современной клеточной биологии. На протяжен ¡и последней декады изучение трансмиссии хромосом у эукариот преимущественно происходило путём выявления новых энзимов, участвующих в репликации и репарации хромосомной ДНК. Очевидно, что такой подход не применим для изучения процесса сегрегации хромосом. Более того, большое число генов, кодирующих структурные белки, необходимые для процесса репликации хромосом, оставалось невыявленным. Прогресс в изучении трансмиссии хромосом начался I разр?">отки мутационного подхода, то есть с получением первых мутантов с дестабилизацией хромосом. На сегодняшний день мутационный подход может быть применён только для ограниченного числа эукариотических объектов. Одним из наиболее удобных модельных организмов для изучения трансмиссии хромосом у эукариот являются дрожжи-сахаромицеты. Именно на дрожжах получены мутанты по основным генам, обеспечивающим энзимологию репликации ДНК, а именно, генам трёх ДНК полимераз, гену ДНК лигазы и генам основных репликативных факторов. Преимущество дрожжей-сахаромицетов, как модельного объекта, объясняется не только лёгкостью получения мутантов на гаплоидных линиях дрожжей, но также и тем фактом, что главные структурные элементы воспроизведения хромосом (центромерные последовательности, области начала репликации и теломерныс последовательности) изолированы и детально охарактеризованы у дрожжей. Несмотря на значительный прогресс в изучении генетического контроля репликации и сегрегации хромосом у дрожжей, приведший к описанию более 50 генов, значительное число генов, необходимых для трансмиссии хромосом у дрожжей, пока остаётся невыявленным. Именно поэтому представляется актуальным идентификация и характеристика новых генов, контролирующих сегрегацию и репликацию хромосом у дрожжей; Ввиду высокой консервативности процесса репликации и сегрегации хромосом у эукариот данные, полученные на дрожжах, могут быть использованы и для изучения хромосомного цикла у высших организмов, включая

человека. Прогресс, достигнутый в изучении трансмиссии хромосом у дрожжей, привёл к конструированию искусственных хромосом дрожжей или YAC (от Xeast Artificial Chromosome), способных поддерживать воспроизведение больших фрагментов хромосом человека Ввиду своей высокой клонирующей ёмкости. YAC являются основным материалом для построения физических карт хромосом человека и выделения индивидуальных генов. Эта работа^роводится в рамках международной программы "Геном Человека*. Существующие библиотеки YAC клонов~ сод ржат набор случайных фрагментов хромосом человека протяжённостью до 1 миллиона пар оснований. Изолирование специфических фрагментов из библиотек основано на трудоёмком гибридизационном анализе многих десятков тысяч случайных YAC клонов. Таким образом, разработка новых подходов, позволяющих селективно изолировать интересующие участки хромосом человека в виде искусственных хромосом дрожжей, представляется актуальнейшей задачей на современном этапе развития геномного проекта

Цель и задачи иссчдования. Цель данного иследования-изучение генетического контроля трансмиссии природных и искусственных хромосом (YAC) у дрожжей-сахаромицетов. В задачу исследования входило: 1)разработка селективной системы идентификации генов, влияющих на митотическую стабильность хромосом у дрожжей; 2) разработка генетической системы, позволяющей отделять мутанты с нарушением репликации от мутантов с нарушением сегрегации хромосом; 3) картирование, клонирование и структурный анализ новых генов, контролирующих хромосомный цикл у дрожжей; 4) разработка новой системы селективного клонирования фрагментов хромосом человека в виде искусственных хромосом дрожжей.

Научная новизна. Идентифицировано 12 новых генов CHL (от CHíomosomeLoss), контролирующих митотк-lecxyjo трансмиссию хромосом у дрожжей. Анализ поведения различных типов искусственных хромосом у полученных мутантов позволил разделить новые гены на две группы: группу, контролирующую репликацию хромосомной ДНК, и группу, определяющую расхождение хромосом. Два гена, относящихся к первой группе, CHL12 и CHL15, и один из генов, относящийся ко второй группе, СНЫ, были физически и генетически картированы и выделены в виде ДНЮ клонов. Установлено, что ген CHLI5 кодирует полипептид с

2

молекулярной массой 105 кД и входит в состав комплекса ДНК полимеразы а. Второй ген, CHLI2, кодирует белок с молекулярной массой 84 кД и, судя по структурным данным и анализу мутантных аллелей, является частью репликативного фактора С (RF-C). Установлено, что ген CHL4, необходимый для расхождения хромосом, кодирует неизвестный ранее бело к с молекулярной массой 53 к/1, содержащий ДНК-связывающий домен. Анализ мутантов с полной делецией гена CHL4 согласуется с ролью этого гена в формировании кинетохора. Таким образом, в ходе данного Исследования разработаны новые подходы к изучению генетического контроля трансмиссии хромосом у дрожжей-сахаромицетов, а также детально охарактеризовано несколько новых генетических локусов важных для репликации и расхождения хромосом в митозе. В дополнении к этому, анализ поведения в митозе и при трансформации искусственных хромосом у дрожжей позволил создать принципиально новую систему селективного клонирования генов млекопитающих, основанную на рекомбинации in vivo (TAR-клонирование).

Научно-практическая значимость. Разработанный подход отбора мутантов по репликации и сегрегации хромосом может быть использован для выявления новых генов, контролирующих этот процесс у дрожжей. Структурный и функциональный анализ генов, охарактеризованных в ходе данного исследования, расширяет наши представления о механизме трансмиссии хромосом у дрожжей-

I

сахаромицетов и може г помочь при изучении этого процесса у высших эукариот после обнаружения соответствующих гомологов. Международная программа "Геном Человека "является важнейшим проектом 20-ого столетия. Одним из главных этапов этой программы является физическое картирование хромосом человека с использованием искусственных хромосом дрожжей (YAC). В ходё настоящего исследования была разработана принципиально новая технология селективного клонирования больших фрагментов хромосом человека в виде YAC, основанная на рекомбинации молекул ДНК при трансфекции в сферопласты дрожжей TAR-клонирование). Новый подход позволяет конструировать библиотеки индивидуальных хромосом человека, а также селективно клонировать различные группы генов и индивидуальные гены из общей геномной ДНК. Таким образом, TAR-клонирование имеет важное значение для завершения физического хартирования хромосом и

3

функционального исследования индивидуальных генов человека. Разработанные в диссертации методы и практические результаты используются в Институте молекулярной генетики РАН (Москва), в Центре генной инженерии РАН (Москва), в Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург), в Институте гриппа (Санкт-Петербург), в Центре изучения генома человека (Лос-Аламос, США), в Университете им. Дж. Гопкинса (Балтимор, США), в Мелборнском институте детских

болезней (Австралия), вТохокском университете (Япония), в Марбургском-

униг ^рситете (Германия), в Институте прикладной микробиологии (Базель, Швейцария), в Государственном университете в Буэнос-Айросе (Аргентина), в Центре геномных исследований (Кэмбридж, США)

Место проведения работы. Работа проводилась в Институте цитологии РАН (зав. лаб. д б н В. Л. Ларионов) и частично в Университете им. Джона Гопкинса и Национальном институте здравохранения, США. Основные результаты получены в соавторстве с д б н В Л. Ларионовым, с лабораторией дб.н. В М. Захарьева (Институт молекулярной биологии РАН), с лабораторией проф. Ф. Хитера и с лабораторией проф М Резника (США).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены или представлены на конференции "Биология кжтгки" (Тбилиси, 1985), на международном симпозиуме "Физико-химические свойства ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси 1987), на сьезде ВОГиС им. Н. И. Вавилова (Москва, 1987), на симпозиуме "Клеточная биология дрожжей" (Колд Спринг Харбор, США, 1987), на 14 международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Эспо, Финляндия, 1988), на 16 международном конгрессе "Генетика" (Торонто, Канада, 1988), на симпозиуме "Молекулярная биология дрожжей" (Колд Спринг Харбор, США, 1989), на международном симпозиуме "Трансмиссия хромое« 1" (Ленинград, 1990), на международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Гаага, Голландия, 1990), на ФАСЕБ конференции "Репликация и сегрегация хромосом у дрожжей" (Сакстонс Рива, США, 1990), на международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Сан-Франциско, США. 1991), на двустороннем симпозиуме Россия-США "Геном Человека" (Санкт-Петербург, 1992), на ежегодной Средне-Атлантической конференции "Дрожжи" (Балтимор. США, 1992), на

4

ФАСЕБ симпозиуме "Структура, репликация и сегрегация у дрожжей" (Сноумасс, США, 1992), на 3-ем рабочем совещании Департамента энергетики США по проекту "Геном человека" (Сайта Фе, США, 1992), на 16 международной конференции " Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Вена, Австрия, 1992), на Гордоновской ежегодной конференции "Динамика плаэмид и хромосом" (Плимаус, США, 1993), на конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Мэдисон, США, 1993), на второй конференции "биологические последствия нестабильности генома" (Чапел Хил, США, 1994), на конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Сиэтл, США, 1994), на 4-ом рабочем совещании Департамента энергетики США по программе "Геном Человека" (Сайта Фе. США, 1994), на ФАСЕБ симпозиуме "Генетическая рекомбинация и геномные перестройки" (Сноумасс, США, 1995), на конференции "Картирование и секвенирование генома" (Колд Спринг Харбор, США, 1996), на конференции "Генетика дрожжей и болезни человека" (Балтимор, США, 1996).

Структура и объбм диссертации. Диссертация изложена на 36 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 9 рисунков, список опубликованных по теме диссертации статей включает 31 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

>

Глава 1. Получение и характеристика мутантов с нарушением трансмиссии хромосом в мнтозе.

Процесс передачи хромосом у эукариот в митозе происходит с высокой надёжностью. У дрожжей частота потери одной из 16 пар хромосом происходит приблизительно один раз на сто тысяч клеточных делений. Высокая надёжность трансмиссии хромосом у дрожжей обеспечивается взаимодействием большого числа ге. ов, контролирующих ¡репликацию и последующее расхождение сестринских хроматид. Так как значительная часть эти*, генов представлена в геноме одной копией, первоначально их идентификация была основана на отборе условно-летальн ч мутаций. Таким способом были получены мутанты по генам, кодирующим основные ферменты репликации ДНК, ДНК-полнмераэам и ДНК-лигазе, а также мутанты но гену топоиэомеразы П, необходимой для

■ 5 .

разделения сестринских хроматид в митозе Материалом для отбора этих мутантов послужила коллекция температуро-чувствительных мутантов, cdc, полученная около 30 лет тому назад в лаборатории Л. Хартвелла ' (Hartwell, 1970). Главное ограничение использования ts-мутантов для поиска новых генов, важных для воспроизведения хромосом- это разнообразие мутаций, приводящих к температуро-чувствительному фенотипу. К этому признаку могут приводить повреждения в самых

разных генах, включая гены, контролирующие метаболизм Как результат-

этого, мутации, связанные с нарушением воспроизведения хромосом, составляют лишь небольшую часть температуро-чувствительных мутаций. Кроме этого было показано, что не для всех генов возможно получение температуро-чувствительных мутаций С использованием классического метода получения температуро-чувствительных мутантов к началу нашей работы было описано около 20 генов, важных для воспроизведения хромосом у дрожжей. Хотя общее число генов, необходимых для хромосомного цикла, до сих пор неизвестно, не было сомнений, что их число значительно превышает число описанных мутаций, и, в связи с этим, разработка новых методов отбора мутантов с нарушением трансмиссии хромосом представлялась актуальной. Разработка новых методов стала возможной после изолирования структурных .лементов воспроизведения хромосом у дрожжей, ценромерной последовательности (CEN), области начала репликации (ARS) и теломерной последовательности (TEL) На основе этих элементов были сконструированы первые искусственные хромосомы дрожжей, которые можно было вводить в клетки дрожжей с помощью трансформации. Было установлено, что искусственные хромосомы, содержащие CEN локус, воспроизводятся в клетке аналогично природным хромосомам. Вместе с тем. искусственные хромосомы не содержат жизненно важных генов и поэтому их потеря или накопление при клеточном делении не влияют на жизнеспособность клетки. Таким образом, искусственные хромосомы исключительно удобны для обнаружения мутантов с неполным нарушением функции генов хромосомного цикла.

В 1988 году три группы (лаборатории Ф. Хитера, Д. Ботштейна и наша лаборатория) одновременно начали работу по получению коллекции мутантов с нарушением хромосомного цикла у дрожжей с использованием штам эв, несущих искусственные хромосомы (Spencer et.

6

а!., 1990; Ноу| а1„ 1990; Коирппа е1. а1., 1988). Каждая из трёх лабораторий предложила собственную схему получения мутантов, и, как результат проведённой работы, было идентифицировано более 100 новых генов хромосомного цикла у дрожжей. Среди них такие важные гены, как гены, кодирующие белки кинетохора и белки репликативного комплекса.

1.1. Схема получения мутантов сЫ, проявляющих нестабильность хромосом в митозе.

Основной метод отбора мутантов с нестабильностью хромосом был нами разработан на гаплоидном штамме дисомном по хромосоме Щ (Рис.1).

Ьы МI (74) МАГ а **4

хромосома Щ

НК4 1*1} 1? ПН) МАГ. р«<

-СПЖ1Э -Э-ЕЗ-СШ- «РО-ОСОМ.Ш

рпоибннтиа рекомбншния потеря хромосомы

1К» rfNi МЛТа **4 Ыз4 ' СГ*1 МЛТа ТНЯ4 Ьп4 Г ГМ МЛТ{1

•ши-оо-м-со- -{кэ-сэ-о-^ш-с!!- -шзнга-о-я-сю-

ИП4 1еи1 СРЧ1 МАТ* ШМ

Н1и ки}-17 АМТ* ГНК4

Рис. 1. Регис! ^ация событий потери хромосомы Ш и межгенной рекомбинации на дисомном штамме.

Присутствие двух копий хромосомы П1 даёт возможность регистрировать события потери этой хромосомы, поскольку эти события но являются деталью. В тоже время на дисоми^е удобно отбирать рецессивные мутации. Гаплоидные штаммы, дисомные по одной из хромосом, обычно получают методом цитодукции с использованием мутанта с нарушением кариогамии каг1. Этот метод достаточно трудоёмок и не исключает одновременной передачи нескольких хромосом. Именно поэтому мы разработали альтернативный метод конструирования

дисомных штаммов, основанный на трансфекции хромосом в сферопласты дрожжей (Larionov et. al., 1994). Мы показали, что при оптимальных условиях до 90Х трансформантов, отобранных по центромерному маркеру передаваемой хромосомы, содержат интактную хромосому. Дисомный штамм, который был использован в данной работе, гетерозиготен по локусу типа спаривания МАТ Как известно, гетерозиготы по локусу МАТ не способны скрещиваться с МАТа и МАТа гаплоидными штаммами. Потеря дисомиком одной из копий хромосомы Ш— приводит к гемизиготизации МАТа или МАТа аллелей и, следовательно, к экспрессии фенотипов МАТа или МАТа. Мутанты с высокой частотой потери хромосомы III были отобраны по их способности скрещиваться как с а так и с а-тестерами (фенотип биполярного скрещивания). Значительное число мутантов, проявляющих биполярное скрещивание, возникают за счёт повышения частоты переключения локуса типа сларирания. Чтобы исключить из последующего анмиэа такие, цутантные колонии, отобранные мутанты проверялись на способность стабильно поддерживать в митозе искусственные кольцевые минихромосомы. Напомним, что кольцевые минихромосомы представляют собой плазмиды, содержащие генетический маркер, область начала репликации ARS и центромерный локус CEN, благодаря чему пл'пмида способна стабильно поддерживаться в клетке в количестве одной копии, проходя один раунд репликации в S-фазе и правильно сегрегируя в митозе в оба дочерних ядра. Таким образом, поведение минихромосомы в клетке очень сходно с поведением естественных хромосом. Среди 853 независимо-отобранных мутантов, проявляющих фенотип биполярного скрещивания, 18 мутантов обнаруживали нестабильное поддержание 5 проверенных минихромосом, различающихся центромерным локусом и областью начала репликации. Частота потери минихромосом у этих мутантов была приблизительно в 20 раз выше , чем в изогенном штамме дикг о типа. 17 мутаций оказались рецессивными и одна доминантной. Анализ рецессивных мутаций выявил 12 комплементационных групп. С помощью тетрадного анализа удалось показать, что мутантный фенотип (дестабилизация хромосомы Ш и минихромосом) у каждого из полученных мутантов контролируете» ядерным геном (Kouprina et. al., 1988,1993). В Таблице 1 представлен список генов CHL, выявленных в ходе данной работы.

Таблица 1. Общий список генов СНЬ, идентифицированных в настоящей работе.

Название гена Хромосомная локализация Частота потери хромосомы Ш

CHL2 хп 5.1x10-3 Х460*

CHL3 ХП 6.0x10-3 Х520

CHL4 IV 4.6x10-3 Х420

CHL5 IX 1.7x10-2 Х155

CHL6 V . 7.7x10 Х700

CHL7 но.*» 3.8x10-3 х350

CHL8 IV 2.8x10-3 Х260

CHL9 vn 2.4x10-3 Х220

CHL10 VI 5.6x10"4 Х510

CHLl 2 хш 1.6xl0"2 Х90

CHL14 но. 1.3x10-2 Х120

CHL15 XVI 5.8x10*3 х530

♦приведено повышение частоты потери хромосомы по сравнению с изогенным

дисомным штаммом дикого типа

**н.о-не определено

10 из 12 генов были нами картированы (Таблица 1). Привязка генов

CHL к хромосомам осуществлялась методом, .описанным Фалко и

Ботштейном (1983). Для генов CHL3, CHL4, CHÍO СН12 и СН15 была

определена их точная позиция в пределах соответствующих хромосом.

Ген CHL3 бЫл генетически картирован между генами ILV5 и URA4 на

хромосоме ХП. Ген CHL10 был локализован вблизи центромерного локуса

на хромосоме VI. Ген CHL15 оказался сцепленным с геном KAR3 на

хромосоме XV. Два гена CHL (CHL4 и CHL12) были картированы на

физической карте. Для физического картирования этих генов 5ыли

использованы космидные клоны, перекрывающие участки хромосом IV и

XIII, полученные в лаборатории М. Олсона. Результаты экспериментов

показали; что ген СНЫ физически сцеплен с геном SUP2 на правом плече

хромосомы IV, а ген CHL12- с генами ADH3 и SEC14, локализованными на

правом плече хромосомы XIII. Судя по данным комплементационного

анализа и результатам картирования, все 12 идентифицированных генов

не соответствуют известным генам, контролирующим трансмиссию

9

хромосом у дрожжей. Учитывая, что большинство мутантов в коллекции образуют отдельные комплементационные группы, можно заключить, что предложенная нами методика отбора мутантов, основанная на двойной селекции, позволит в будущем выявить много других новых генов важных для хромосомного цикла у дрожжей.

_1.2. Определение частоты потери природных и_

искусственных хромосом у мутантов chl.

Комбинация генетических маркеров в дисомном штамме позволяет отличать события потери хромосомы III от событий митотической рекомбинации, приводящих к гомозиготизайии локуса МАТ (Рис.1). При потере копии хромосомы III, несущей локус МАТа, происходит гемизиготизация хромосомных' маркеров . his3, thr4 и leu2-2l. Если способность к биполярному .скрещиванию у мутанта определяется только высокой частотой спонтанной потери копий хромосомы III, фенотип митотических сегрегантрв у т-сого мутанта должен быть His+Thr+ или His" Thr (в зависимости от того, какая из копий хромосомы потерена) Если же способность к скрещиванию вызвана сопровождающимся повышением митотической рекомбинации, ожидаемы., фенотип митотических сегрегантов у таких мутантов - His+Thr или His-Thr1" Повышение уровня митотической рекомбинации может быть также зарегистрировано по числу спонтанных Leu+ рекомбинантов. так как исходный дисомный штамм несёт гетероаллели Ieu2-l/leu2-21. В Таблице 1 представлены данные по определению стабильности хромосомы III. Как можно видеть, частота потери хромосомы Ш у мутантов повышена на 2-3 порядка по сравнению с изогенным штаммом дикого типа. Такой же уровень дестабилизации был зарегистрирован и для трбх других хромосом V, XIV и XV. У всех полученных мутантов chl была оправлена частота спонтанноЯ митотической рекомбинации. Уровень рекомбинации у все мутантов, за исключением мутантов chll2 и сЫ15, не отличался значительно от уровня в изогенном штамме дикого типа (Kouprina et. al., 1988,1993; Куприна и др., 1993). Частота митотической межгеиной рекомбинации у мутантов chU2 и chl 15 оказалась повышенной в 10 и 40 раз, соответственно (Kouprina et. al., 1992; Kouprina et; al., 1994). Частота митотической внутригенной рекомбинации была также повышена у этих мутантов (Таблица 2). -

10

Таблица 2. Частота митотической рекомбинации у мута-нто» с hi.

Штамм Частота межгенной-рекомбинации! xlO-5 'Рас гот» виутрнгениой! рекомбинации ХИГ7

дикий тип 6 »

сЫ12/сЫ12 6 0' ИЗ1

chl i 5/chll 5 25© 26

chl4/chl4 & Г

Таким образом, полученные мутанты могут быть разделены на две группы. 1) мутанты, у которых повышена как частота потери природных и искусственных хромосом, так и частота спонтанной митотической межгенной и внутригенной рекомбинации; и 2) мутанты, характеризующиеся только повышением частоты потери хромосом.

1.3. Механизм дестабилизации минихромосом у мутантов chl.

Физическая потеря хромосом при митотичёских делениях у мутантов chl может быть обусловлена двумя различными событиями: нерасхождением хромосом (сегрегацией хромосом по типу 2 : 0) или элиминацией хромосом (сегрегацией хромосом по типу 1 •. 0). Эти события по-разному влияют на число копий хромосомы в клетке. Очевидно, что события нерасхождения должны приводить к накоплению хромосом в части, клеточной популяции. Этого не происходит при событиях элиминации хромосомы. Учитывая, что у всех мутантов наблюдается дестабилизация не только природных, но и искусственных хромосом, мы попытались выяснить механизм хромосомной дестабилизации у мутантов chit с использованием искусственных минихромосом. Для того, чтобы обличишь событие иерасхождения от событий, хромосомной потери, мы проанализировали' сегрегацию маркера, минихромосомы в мейозе у пибридов- мута-н.тов со штаммом; дикого типа. Сегрегация минихромосомнопо маркера по типу 4* : О1 или* 3+: 1 ■ может наблюдаться иолько в гом> случае, если в мутантной) илетк» происходит накопление вопий минихромосомы. Без накопления, числа-, копий' минихромосомы а

мутантной клетке ожидаемая сегрегация маркера минихромосомы в мейозе будет 2+: 2" или 1 +: 0. Тетрадный анализ показал, что у мутантов сЫ2, chl5, chl 12, chll4 и chll5 число копий минихромосомы не увеличено (Куприна и др.. 1987; Kouprina et. al., 1988) Таким образом, основной механизм дестабилизации хромосом у этих мутантов связан с утратой хромосом. Интересно, что у двух мутантов этой группы, chlI2 и chil5, повышена частота митотической рекомбинаций. Данные тетрадного

анализа Тшказали~что~мутанты_сЬ]ЗгсЬ14 и chllO характеризуются-

нак( лением копий минихромосомы при митотических делениях (Kouprina et. al., 1988; Kouprina et. al., 1993) На основании этих данных мы отнесли мутанты chl3, chl4 и QhllO к мутантам по нерасхождению хромосом. У этих мутантов частота спонтанной митотической рекомбинации была такой же, как и в штамме дикого, типа. Таким образом, на основании анализа поведения минихромосомы в мийозе отобранные мутанты разделены на две группы: группу потенциальных мутантов по репликации хромосом (chl2, chl5, chll2, chll4 и chll5) и группу потенциальных мутантов по нерасхождению хромосом (<№ chl4 и chl 10).

1.4. Селекция мутантов с нарушением сегрегации хромосом с использованием минихромосомы, маркированной геном CUP1, определяющим устойчивость к меди.

Основываясь на результатах работы по изучению сегрегации минихромосом у мутантов chl, мы предположили, что мутанты по нерасхождению хромосом могут быть отобраны непосредственно по фенотипу накопления минихромосом при митотических делениях (Larionov et. al., 1989; Ларионов и др.. 1988). Мы проверили эту гипотезу, сконструировав минихромосому УСр24, содержащую ген металлотиснеина CUP1. Увеличение ,,озы гена CUP1 приводит к повышению устойчивости клеток дрожжей к ионам меди. Ис-одный штамм, используемый для отбора мутантов, содержал одну копию гена CUPI в хромосоме VIII и был чувствителен к 0.2 мМ Си2+. в этом штамме частота потери минихромосомы УСр24 не превышала 5Ж на генерацию. Штамм, несущий минихромосому УСр24. был облучён мутагенной дозой УФ, после чего были отобраны мутанты, способные расти в присутствии повышенной концентрации ионов меди (2.2 мМ). Около 1000 отобранных мутантных

12

клонов, проявляющих устойчивость к ионам меди, были проверены на стабильность поддержания различных исскуственных минихромосом. У 4 из отобранных мутантов минихромосомы проявляли нестабильность. Частота потери минихромосом в мутантных клопах составляла около 60* на генерацию. Все четыре мутации оказались рецессивными и как было установлено, вызваны мутационными изменениями в одном из четырёх ядерных генов. Отобранные мутанты, обозначенные как chl6, сШ, chl8 и chl9, также проявляли нестабильность природных хромосом (Таблица 1).

В отдельных экспериментах мы показали, что мутанты chl3, chl4 и chllO, полученные на дисомном штамме, обнаруживают способность расти в присутствии высокой концентрации ионов меди при введении в них минихромосомы, несущей ген CUP1. Именно эти мутанты были отнесены к группе мутантов, по нерасхождению хромосом на основании генетического анализа. Таким образом мы показали, что минихромосомы, маркированные геном металлотионеина, могут быть использованы не только для прямой селекции мутантов с нерасхождением хромосом у дрожжей, но и для изучения механизма дестабилизации хромосом у мутантов chl. Так как все четыре, отобранные с помощью минихромосомы УСр24, мутации оказались не аллелъны ранг описанным мутациям, можно думать, что новый метод может значительно упростить получение новых мутаций с нерасхождением хромосом.

»

1.4. Поведение дицектрнческих минихромосом у мутантов сМ.

Широта известно, что хромосомы, содержащие две копии центромерной последовательности (дицентрики), исключительно нестабильны. Это объясняется тем, что два центромера, находящиеся на одной и той же хромосоме, в митозе могут сегрегировать к противоположным полюсам веретена. При этом между полюсами образуется нестабильный "хромосомный мост", разрыв которого приводит к потере повреждённой хромосомы или к сложным геномным перестройкам. Сходную • естабильность в дрожжевой клетке проявляют и дицентрические минихромосомы (Mann and Davis, 1983). Мы предположили, что у некоторых мутантов с нарушением расхождения хромосом дицентрики могут быть стабильны за счёт ослабления взаимодействия между кинетохором й митотическим веретеном. Чтобы

13

проверить это предположение, отобранные мутанты chl были проверены на способность поддерживать дицентрнческие минихромосомы (Куприна и др., 1993; Kouprina et. al., 1993) Как было установлено, штаммы дикого типа трансформируются дицентрическими минихромосомами с высокой частотой. Однако, образующиеся колонии трансформантов гетерогеннь: по размеру. В отдельных колониях митотическая стабильность плазмидного маркера варьирует от IX до, 95%. Эти вариации объясняются происходящими в колониях структурными перестройками минихромосомы, приводящими к образованию стабильных моноцентрических, вариантов (Mann and Davis, 1983). Для одного из проверенных мутантов, chl4, не наблюдалась характерная гетерогенность колоний трансформантов по размеру. Более того, митотическая стабильность моно- и дицентрическнх плазмид была одинакова в этом мутанте. Рестрнкционный анализ плазмид, выделенных из трансформантов мутанта chl4, показал отсутствие каких-либо перестроек дицентриков (Kouprina et. al., 1993). Таким образом, мутант chl4 проявляет уникальную способность стабильно подлаживать дицентрнческие минихромосомы. Мы предполагаем, что стабильное поддержание дицентрическнх плазмид у мутанта chl4 обусловлено ослаблением взаимодействия между трубочками митотического аппарата и центро ером. Отметим, что мутант chl4 был ранее отнесён к группе мутантов по нерасхождению хромосом (Глава 1.3).

Глава 2. Клонирование генов C1IL4, CHL12 и СШ5.

Как уже описано, мутанты chl были отобраны по признаку нестабильности хромосомы III и кольцевых минихромосом. Три из двенадцати идентифицированных генов CHL были изолированы из геномного банка дрожжей. Один из генов, ген CHL12, был клонирован по восстановлению фенотипа стабильного поддержания хромосомы III и минихромосомы в мутантном штамме (Kouprina et. al., 1994). С этой целью мутантный штамм дисомный по хромосоме III был трансформирован банком дрожжей, сконструированном на основе центромерсодержащей плазмиды р366 (CEN3/LEU2/ARS1). Отдельные трансформанты мутанта были проанализированы на стабильность хромосомы III (способность к биполярному скрещиванию) и далее на стабильность центромерных

14

плазмиД. Клон/коМплементирующий мутацию chll2, был отобран при анализе 5 тысяч индивидуальных трансформантов.

Гены CHL4 и СНЫ 5 были выделены из геномной библиотеки с использованием другого подхода (Kouprina et. al., 1992; Kouprina et. al., 1993). Мутантные диплоидные штаммы chI4 и chil5 были трансформированы фрагментом хромосомы VII дрожжей, содержащим ген SUP11, кодирующий супрессорную тРНК. Присутствие этого гена влияет на цвет колоний у аденин-зависимых штаммов Дрожжей. Штаммы, мутантные по гену ADE2, накапливают красный пигмент. Этот фенотип может быть супрессирован геном SUP 11 у ашЬег-мутанта ade2-101. Существенно, что колонии клеток, содержащих одну копию хромосомного фрагмента, маркированного геном SUP11, имеют розовую окраску, в то время как колонии клеток, содержащих две копии хромосомного фрагмента имеют белый цвет. Колонии клеток, утративших хромосомный фрагмент с геном SUP11, имеют красный цвет (Hieter et. al., 1985). В штаммах дикого типа хромосомный фрагмент стабилен в митозе и частота его потери практически не отличается от частоты потери дрожжевых хромосом (10~5 на одно клеточное деление). У мутантов chl с нарушением трансмиссии хромосом хромосомный фрагмент дестабилизирован. Его потеря или накопление при ормировании колонии приводит к появлению секторных колоний (Рис. 21.

Рис. 2 Фенотип секторных колоний дрожжей, обусловленный потерей хромосомного фрагмента, несущего ген 30Р11.

Клетка, потерявшая хромосомный фрагмент, даёт начало красному сектору в розовой колонии, Клетка, получившая в результате нерасхождения две копии фрагмента, несущего ген вЦРП, даёт начало

красному сектору в белой колонии. Мы использовали комплементацию секторного фенотипа у соответствующих мутантов при клонировании генов CHL4 и CULI5. Как и в случае C11L12, мутантные штаммы были трансформированы геномным банком дрожжей, полученным на плазмиде рЗСО.

2.1. Структурная организация гена CHL4. Анализ мутантов с -полной делецней гена CHL4,-

Исходно ген СНЫ был клонирован в составе фрагмента протяжённостью 12 т.п о. Последующее субклонирование позволило локализовать ген в пределах фрагмента длиной 2 0 т.п.о. Этот фрагмент бил секвенирован по методу Сэнгера совместно с лабораторией д б н В. М. Захарьева (ИМБ РАИ). Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента выявил наличие открытой рамки считывания протяжённостью около 1.4 т.п.о., кодирующей белок с молекулярной массой 53 кЛ Мы не обнаружили какой-либо гомологии гена CHL4 с известными на сегодняшний день белками. Характерной особенностью белка C1IL4 является присутствие в нём ДНК-связываюшего домена типа спираль-поаорот-спираль (Н;Т-Н) (Рис 3).

a-helix turn a-helix

I 2 3 < 5 6 7 • I 10 II 1! 13 11 13 It 17 11 It 20 21 22 23

MSQRELKNELGAGIATITRGSNS KVGF1¿KH¿IHSRÍX.TTKIiKFMG

Рис. 3 Сравнение доменов спираль-поворот-спираль (Н-Т-Н) в белке СНЫ и в репрессоре триптофанового оперона у ... coli.

Непосредственная роль этого типа доменов в специфическом узнавании последовательностей ДНК продемонстрирована для ряда белков млекопитающих (Harrison and Aggarwal, 1990).

Установление первичной структуры гена СНЫ сделало возможным конструирование штамма дрожжей с полной делецней этого гена. Такой

Е. coli дрожжи

штамм был нами сконструирован (Kouprina ct. al., 1993). Мы показали, что при нормальных условиях фенотип мутанта с делсиией гена CHL4 не отличался от фенотипа исходных мутантов, отобранных нами по фенотипу биполярного скрещивания. Мутанты с деление!» гена проявляли характерн'/ю нестабильность природных хромосом и высокую частоту потери центромерных плазмид при сохранении нормального уровня спонтанной мнтотической рекомбинации. Однако, в отличие от исходных мутантов, мутант с полной инактивацией функции СНЫ был не способен к росту при повышенной температуре (35°С). При переносе мутантных клеток в непермессивную температуру происходила несинхрониэированная остановка клеточного цикла, сопровождающаяся гибелью клеток Как и исходные мутанты, мутант с делецией гена C11L4 прояьлял способность к стабильному поддержанию дицентричрскнх хромосом Этот фенотип наряду со свойством мутанта cfi!4 накапливать копии центромер-содержащих плазмид позволяет предполагать, что ген CHL4 кодирует один из регуляторных белков, необходимых для формирования и/или сохранения структуры кинетохора. К настоящему моменту у дрожжей описано только четыре книетохорных белка. Один из белков, СРВ), связывается с элементом CLiil центромерной ДНК (Cai and Davi' 1990). Три других белка, а именно CDF3B (64 кД), C13F3C (58 кД) и CBF3A (110 кД), образуют комплекс, который связывается с другим элементом центромерной ДНК- CDEIII (Lechner and Carbon, 1993). Поиск новых генов, кодирующих центромерные белки, продолжается и мы думаем, что CHL4 относится к этой группе белков. Высказанное предположение подтверждается недавними экспериментами по изучению особенностей индуцированной транскрипции центромерной ДНК, проведёнными в лаборатории Ф. Хитера (Dohely et. al., 1994)) . Авторы показали, что в штаммах дикого типа ДНК-полимераза неспособна транскрибировать район центромерной ДНК из-за присутствия п этом р йоне прочно связанных кинетохорных белков. У мутанта по гену СНЫ авторы не обнаружили какого-либо значительного торможения ДНК-полимеразы. Таким же фенотипом обладали и мутанты по двум известным кинетохорным белкам. Таким образом, фенотип мутантных клеток согласу ся с предположением о важной роли гена CHL4 в организации или сборке кинетохора.

г.г. Структур« гена CHL15. Фенотип мутанта с полной делецией гена CHL15.

Эксперименты по субклонированию гена CHL15 показали, что минимальная длина фрагмента способного комплементировать мутацию chl 15 составляет около 4 т.п о. Этот фрагмент, комплементирующий мутацию, был секвенирован по методу Сэнгера (работа выполнена совместно с лабораторией д.б.нГВГЖ~Захарьева~ИМБТАН)^Анализ нук"<ютидной последовательности выявил наличие открытой рамки считывания протяжённостью около 2.8 т.п.о. Эта рамка способна кодировать белок с молекулярной массой 105 кД (Kouprina et. al., 1992). Сравнение с базой данных показало, что последовательность гена CHL15 идентична последовательности гена РОВ1, клонированного одновременно с нами в лаборатории Т. Формозы (Miles and Formosa, 1992). В этой лаборатории было показано, что продукт гена POB1/CHL15 способен связываться in vitro с ДНК полимеразой а дрожжей. В 5' некодогенной области гена CHL15/POB1 в позиции -122 присутствует вырожденный повтор сайта Mlul (АЦГЦГ. ALU ЦГГ). Как известно, этот мотив характерен для промоторных областей дрожжевых генов, участвующих в метаболизме ДНК. К настоящему моменту идентифицировано более 30 генов этой группы, включая гены, кодирующие белки репликативного комплекса. Экспрессия всех этих генов происходит в фиксированной точке клеточного цикла перед репликацией ДНК. Присутствие мотива Mlul в промоторной области гена CHL15 согласуется с ранее высказанным заключением, что продукт этого гена участвует в метаболизме ДНК. Характерной особенностью белка CHL15 является наличие в нём домена типа спираль-петля-спираль (H-L-H), локализованного вблизи С-конца молекулы (Рис. 4). Этот домен определяет межбелковые взаимодействия и описан для ряда белковых факторог контролирующих клеточную дифференцировку (Voronova and Baltimore, 1990). В специально поставленных экспериментах мы показали, что домен H-L-H необходим для нормальной функции белка CHL15. Так как домены H-L-H участвуют в формировании межбелковых комплексов, можно предположить, что продукт гена CHL15 функционирует в клетке в виде гомодимера или гетеродимера в комплексе с другими белками, имеющими H-L-H. Одним из

таких белков является ДМК-полимераза а., судя по данным, полученным группой Т. Формозы (Miles аы) Formosa, 1992).

consensúa

CTF4

Helix 1 1234567890123456

Loop Helix 2

123456789012345678

E47 Human VRD1NEAFRELGRMCQ----MHLK---SDKAQTKLLILQQAVQVILGLEQQ

Hyo D House LSKVNEAFETLKRCTS----SNP-----NQRLPKVEILRNAIRYIEGLQAL

L myc Human RNDLRSRFIALRDQVP----TLAS----CSKAPKWILSKALEYLQALVGA

CBF1 Veast RENINTAINVLSDLLP------------VRESSKAAILARAAEYIQKLKET

t К IL A L

I III

Yeast YGNENEVLAALNGAYDKALLRLFASACSDQNEVKALSIAHELKQDRALTAA

Рис. +. Сравнение доменов спираль-петля-спираль (H-L-H) в различных белках.

Эксперименты по полной делеции гена CHL15 показали, что ген не необходим для вегетативного роста дрожжей. Штаммы с делецией гена CHL15 характеризуются тем же уровнем повышенной митотической рекомбинации и потери природных и искусственных хромосом, как и исходный мутант chll5.

Для получения дополнительной информации о функции гена CHL15 в клеточном цикле мы проанализировали фенотип мутантов, несущих делению гена CHL15 на фоне дефекта репарации ДНК (при инактивации гена RAD52). Так как продукт гена CHL15 участвует в ДНК репликации, можно предположить, что мутации в этом гене приводят к накоплению одно- и двунитевых разрывов или другим хромосомным повреждениям, которые могут репарироваться с участием продукта гена RAD52 (Resnick and Martin, 1976). Двойной мутант chll5 rad52 обнаруживал резкое замедление в росте и низкую выживаемость. Таким образом, фенотип двойного мутанта chllS rad52 согласуется с предположением о накоплении в хромосомной ДНК повреждений при мутациях в гене CHL15.

2.3. Ген CHL12 кодирует белок, имеющий гомологию с белками репликативного фактора С.

Как и два других гена, описанных выше, ген CHL12 был изолирован

из геномного банка- в виде большого фрагмента. После серии

19

субклонирований ген был локализован в пределах фрагмента длинной 2.5 т.п.о. Введение этого фрагмента с помощью трансформации в мутантный штамм chII2 приводило к полному восстановлению дикого типа (стабильному наследованию хромосом и минихромосом, а также низкому уровню спонтанной митотической рекомбинации). Секвенирование фрагмента, выполненное совместно с лабораторией д.б.н. В. М. Захарьева (ИМБ РАН), выявило наличие открытой рамки считывания протяжённостью около 2.2 т. по, кодирующей белок с молекулярной массой 84 кД (Kouprina-— et. al., 1994). Анализ банка белковых последовательностей обнаружил ограниченную гомологию белка CHL12 с группой белков репликативного фактора С человека и дрожжей (Chen el. al., 1992; Li and Burgers, 1994). Гомология наблюдается в районе трёх кластеров длиной 19, 50 и 53 аминокислотных остатк ., располагающихся в одном и том же порядке у всех проанализированных белков (Рис. 5).

Ci OGLTFAC 421 HVIXIKKfTStKilVGQAS» «V»

128kD hRfС 591 HVDKYKPTSLKTJIGOOCO И*

37»D hWC 40 WVeKIRFKCVDEVATOC»» 58

37kD у RFC 27 WVZKtRPKNUiEVTfcQDPn 4S

40 kD у RFC IS KVEKrBPETUieVfGOtWH 33

40kD hRFC 38 WVEKYRPVKUlEiVGNE»« J(

CML12 lit WVEK»RPKSFU>LVGNEKT »4

Consensus WVEKYRP—l.-E*'Gg---

DROGLTFAC 480 ALL.SGPPGIGKTTTATLWKEI.......GTI>AVXri»S£>TRSKAUJ(DeV3TU.SN 528

128kO hRFC 447 AI.I.SGPPGVGKTITASLVCOK.......CiMVUJeSBTBSKSSllOUVXtSUM 651

37kD hKTC 74 LLFVGPPGTGKTSIILAAARELrGPELFRtkVLKtWlSBERGlQWREKVKH.ICH 128

37kD У RFC <1 HLFyGPPGIGKTSIIUai«LJG»tm«S14l£tN«S«IIRGlSlV .EKVKHLIC» 11(

UOkO у RFC 4» LLFY(;PiGTG*tS1IVWJAEl,y&iH.y5H»(LEUa,SDBRGJl!\r,HHQlK7iVlAH 10J

40kD hRFC 74 1IlAGPPGTGKTTSXLCLAAALLGA. . LKDAM1.CLUASNDRG1DWRHK!K.HACN 12«

СИЧ2 179 LLLH'PPGIGKTSVAHViAKO......3G*'3VS8IKAS0ERAGPWVKEK I IHiim 229

Consensu* th*-GPPG~GK7*T*~**—SI;--------—* *£UiASD&R*--* v* **V---«-К

DROGLTFA'" 595 CYDLRFQRPRUOIKGXlMSICrUKVKll.'AKVEtllM.TWCnQSlntlA <41

128kD hi 767 CFOLRFORPRVEQIKGAW«TAFKEGZ.KJPPPAHMiJtG.AaCEJIIK>VI.W«,3 >20

3Tk0 hRTC 194 CSSERfKPl,SD140O0W.EBlV»KEevri3.HI«;iAll.VltVSE0BlWU ТГ1Л 246

I'M У RFC 184 CSKFRFKALDASMAIORtaFISEQENVKCD.DGVitRIbOlSACDLWlGIItLtf 23<

130kD У RFC 1C1 CTRFRFQPLPQEATERRJANVl.VHEKLKLSPNAEKALfcl8tSNCDHRRVLNVLQ 214

40XD hRFC 1ЪК CAVLRlTKl.lDAQll.TtUIHWIEA'.RVV'I'tDDGI.EAIITT.kQGOmQAbmiQ 238

CHL12 112 CE1 lAVKRPSDTTLbERLKLlCHKE^MHIPIKAIHD. LIOLAQGOVHNC1WNLQ )(4

Consensus С—+RF4-+-------RL—I—КЙ-*—-—-——

Рис 5. Гомология белка CHL12 с субъедаишцами репликативного фактора

человека и дрожжей. hRFC н у RFC - репликпиьпые факторы С человека и

дрожжей, сг ответственно.

Учитывая, что в клетке решткативный фактор С функционирует как сложный комплекс, состоящий из более чем 10 различных полипептидов,

20

можно предположить, что обнаруженные кластеры играют роль в образовании комплекса RF-C Отличием CHL12 от известных белков RF C является отсутствие в CHL12 консервативного домена, определяющего связывание ГГФ и АТФ. Анализ 5' последовательности гена CHLI2 выявил наличие двух дегенеративных мотивов MluI в позициях -84 (АЦАЦГГ) и -105 (ТЦГЦГГ). Эта последовательность, как уже описывалось в Главе 2 2, характерна для генов, контролирующих репликацию ДНК у дрожжей, включая гслы репликативных факторов RF-A и RF-C (White et. al., 1987). Наличие мотивов Mlul в промоторной области CHL12, а также гомология с отдельными полипептидами репликативного фактора RF-C согласуется с ранее сделанным заключением, что этот ген относится к группе генов, контролирующих репликацию ДНК. Мутанты с полной делецией гена CULI2 оказались жизненноспособными по фенотипу не отличались от исходных мутантов, отобранных по фенотипу биполярного скрещивания (холодочувствительность, замедленный рост, повышенная частота потери природных и искусственных хромосом, повышение частоты спонтанной митотлческой рекомбинации). Таким образом, совокупность генетических и структурных данных согласуются с высказанным предположением об участии продукта гена CHL12 в ДНК синтезе.

Глава 3. Структурная стабильность искусственных хромосом дрожжей (YAC) у дрожжей.

Генетическая трансформация является универсальным методом введения генетического материала в клетку. Однако, несмотря на широкое использование этого метода, механизм генетической трансформации остаётся мало изученным. Общим признаком трансформирующей ДНК является её повышенная рекомбиногенность, по-видимому, вызванная отсутствием упорядоченной нуклеосомной структуры (Larionov et. al., 1994). Изучение судьбы трансформирующей молекулы ДНК приобрело актуальность после разработки системы клонирования больших фрагментов хромосом человека в виде дрожжевых искусственных хромосом (YAC) (Burke et. al., 1987) и начала проекта "Геном Человека". Дело в том, что, несмотря на широкое использование мега-клонирования в дрожжах, технология конструирования YAC клонов далека о\

1

совершенства. До 60* клонов в существующих библиотеках YAC представлены химерами, образованными слиянием фрагментов различных хромосом и/или содержат внутренние перестройки и делении. В настоящей работе мы провели детальное исследование причин образования химерных и делецированных YAC клонов. Полученные данные позволили создать новую систему штаммов-хозяев для клонирования геномной ДНК, а также были использованы для разработки

принципиально новой технол0гйи~клонирования больших фрагментов-

ДНК в дрожжах, основанной на рекомбинации in vivo.

3.1. Изучение структурной стабильности YAC, содержащих ДНК человека.

Основываясь на .экспериментальных данных, полученных с небольшими кольцевыми плазмидами (Larionav et. al., 1994), мы предположили, что основные перестройки в YAC клонах происходят на стадии их трансформации в сфероцласты дрожжей. Для проверки этой гипотезы мы сконструировали несколько модельных искусственных хромосом, которые позволяют количественно оценить уровень перестроек в YAC на этапе их введении в дрожжи и при последующих митотических делениях колонии трансформанта (Kouprina et. al., 1994). С этой целью во внутренние участки нескольких YAC, содержащих фрагменты ДНК человека длиной около 300 т.п.о. , была введена кассета, маркированная генами URA3 и ADE2. Сконструированные YAC имели следующую структуру: теломер-центромер-ТЯР1-Д' С человека-URA3-АОЕ2-ДНК иеловека-НШ-теломер. Таким образом, деления внутренних участков в Y АС может быть зарегистрирована по потере маркеров URA3 и ADE2. Использование данных маркеров имеет ряд преимуществ. Во-первых, как уже отмечалось выше, потеря гена ADE2 легко определяется визуально по изменению цвета колонии. Во-вторых, для гена URA3 разработана система контрселекции, позволяющая отбирать клетки с потерей этого гена. Система основана на использовании сред с 5-фтор-оротатом, который токсичен для клеток ауксотрофных по урацилу. Сконструированные YAC были ретрансформированы в сферопласты дрожжей при условиях идентичных созданию геномных библиотек. Трансформанты селектировали по двум теломерным маркерам YAC: TRP1

22

и HIS3. Частота трансформации составляла приблизительно 10 тысяч колоний в пересчёте на 1 микрограмм ДНК YAC. Около 1000 трансформантов, полученных в нескольких независимых экспериментах, были проверены на присутствие внутренних маркеров YAC. Как было установлено, около одной трети Тгр+ и His+ клонов не содержат внутренние маркеры URA3 и ADE2 (Таблица 3).

Таблица 3 Потеря внутренних маркеров YAC при их ретрансформации в дрожжи.

Доля клонов с делецией внутренних маркеров ADE2 и URA3

YAC в штамме дикого типа в мутанте rad52

12-1 15/41 (27%) 1/91 (1%)

12-2 110/132 (45%) 0/13 (0%)

12-3 91/104 (47%) 0/14 (0%)

12-4 42/118 (26%) . 2/10 (17%)

12-5 29/101 (22%) 11/216 (5%)

Судя по данным пульс-электрофореза, все YAC, потерявшие внутренние маркеры, были короче исходных YAC на 10-100 т.п.о. Таким образом впервые было показано, что ДНК человека, включённая в состав YAC, подвержена внутренним делециям при её введении в клетки дрожжей. Основываясь на высокой частоте повторяющихся последовательностей в ДНК человека (например, повторы типа Alu последовательностей встречаются в среднем один раз на 4 т.п.о.), мы предположили, что события внутренних делеций имеют рекомбинационную природу. Чтобы проверить данное предположение, опыты по ретрансформации YAC были повторены с реципиентным штаммом rad52, дефектным по основным типам рекомбинации (Resnick and Martin, 1976). Данные, полученные в экспериментах с изогенным штаммом rad52,m полностью согласовались с высказанным предположением. Частота внутренних делеций в YAC понизилась более, чем на порядок (Таблица 3). Так как повторы могут быть причиной нестабильности YAC клонов и при их последующей репликации в клетке-реципиенте, мы также провели исследование внутренней стабильности YAC при митотических делениях

в различных штаммах-хозяевах. С этой целью на штаммах, содержащих YAC, были получены изогенные мутанты с дефектом в различных генах, контролирующих митотическую рекомбинацию. Для каждого из мутантов была определена часота потери внутренних маркеров YAC в митозе. В Таблице 4 приведены данные, • полученные для одного из проанализированных YAC.

Таблица4ГПотеря внутренних маркеров YAC12-1 при митотическом-

росте различных штаммов-реципиентов.

Штамм Частота потери внутренних маркеров URA3 ADE2

х10'4

дикий тип 2.5

radl 0.35

rad51 , 1.1

rad52 0.07

rad54 0.9

rad55 2.7

Как можно видеть, потеря внутренних маркеров в YAC у всех мутантов с нарушением рекомбинации, за исключением rad55, значительно ниже, чем у штамма дикого типа. Максимальная стабилизация структуры YAC наблюдалась у мутанта с делецией гена RAD52. В этом мутанте частота потери внутренних маркеров была снижена приблизительно в 40 раз по сравнению со штаммом дикого типа. Мы заключили, что мутантный штамм rad52 не только важен для предотвращения дел ций в YAC при их трансформации, но может также значительно повысить структурную стабильность клонируемой геномной ДНК при последующих митотических явлениях трансформанта. Таким образом, мутант rad52 исключительно перспективен в качестве, штамма-хозяина 'при клонировании ДНК млекопитающих.

3.2. Роль рекомбинации в образовании химерных YAC.

Химерные Y АС, составляйте около половины клонов в существующих библиотеках, исключительно затрудняют физическое

картирование хромосом Начболее простое объяснение появления химер-это лигирование двух или более фрагментов ДНК при соединении теломерных плеч к клонируемой ДНК. Может ли рекомбинация при трансформации быть причиной появления химерных клонов? Для ответа на этот вопрос были поставлены эксперименты по ретрансформании различных пар YAC в компетентные сферопласты дрожжей (Larionov et. al., 1994). Каждый YAC в паре содержал различные генетические маркеры (например URA3 и TRPI или LYS2 и HIS3). Таким образом было возможно идентифицировать события рекомбинации между YAC, имитирующими образование химерного клона. Для того, чтобы максимально приблизить эксперимент к реальным условиям трансформации дрожжей лигазной смесью, YAC были выделены вместе с хромосомами штамма-хозяина. Таким образом, молекулы YAC ДНК составляли приблизительно ЗЯГ от общего числа молекул ДНК в препарате. Эксперимент проводился таким образом, что сначала отбирали трансформанты по центромерному маркеру одного из YAC (например, по маркеру TRP1, сцепленному с CEN4), после чего в трансформанте проверялось присутствие маркеров неселектируемого YAC (LYS2 и HIS3). В качестве контроля на частоту кот, .шсформации YAC (УАСи, выбранные для этих экспериментов, имели длину приблизительно 300 т.п.о.) использовали небольшую центромерную плазмиду (10 т.п.о ), которая добавлялась в трансформационную смесь в количестве эквимолярном YAC ДНК. Данные экспериментов по ко-трансформации позволили сделать два важных заключения. Во-первых, частота ко-трансформации больших молекул YAC значительно не отличалась от частот ко-трансформации небольших плазмид. Во-вторых, большинство событий (около 90Х) совместного переноса YAC при трансформации сопровождались рекомбинацией с образованием химерных молекул (т. е. центромерный маркер одного YAC оказывался' сцепленным с теломерным маркером второго YAC). Эти результаты однозначно показывают, что рекомбинация при трансформации является важным источником химерных YAC клонов. Для того, чтобы установить роль гена RAD52 в образовании химерных YAC, эксперименты по ко-трансформации пар генетически маркированных YAC. несущих фрагменты ДНК человека, были поставлены на иЗогенном штамме с делецией RAD52. Выход химерных YAC в этих экспериментах не превышал 8*. т. е. был приблизительно на порядок ниже, чем при использовании штамма-

¿5

реципиента дикого типа. Низкий выход химерных YAC в модельных экспериментах предполагает, что мутант с делецией гена RAD52 является оптимальным штаммом для конструирования библиотек YAC с пониженным содержанием аберрантных клонов. Это заключение получило подтверждение в недавней работе Ландера и соавторов (1995), которые сконструировали представительную библиотеку YAC клонов генома мыши на нашем штамме, несущем делецию гена RAD52. Проведённый анализ показал, что уровеньтсимерных клонов в этой библиотеке снижен более чем на порядок по сравнению с библиотеками, полученными на штаммах дикою типа.

Глава 4. Селективное клонирование геномных • последовательностей в дрожжах с помощью, рекомбинации

ia viivo.

Как и все существующие на сегодняшний! день меюдьц клонирование геномной ДНК в YAC основано на использовали» ДМК-лигазы. Процесс клонирования в YAC исключительно трудоёмок, поскольку включает три стадии отделения больших молекул ДНК ол низкомолекулярных фрагментов (до и после обработки эндонуклеааой| рестрикции и после лигирования теломерных плеч). Хотя использование штамма rad'52 с дефектом по рекомбинации практически исключает, образование химерных YAC при трансформации, определённая, часта» клонов коллекции всё-таки содержит неколинеарные геномные последовательности, возникающие в результате лигирования двух или. более фрагментов, геномной ДиК. Для того, чтобы, исключить образование химерных YAC на гадии лигирования. теломерных плечк мы. разработали, альтернативную систему клонирования в дрожжах, которая, не содержит, стадию лигирования. Система основана,на соединении»молекул, клонируемоЯиДНК и векторов in vivo, за, счёт рекомбинационной. машины, клеткигхозяинеь Разработка нового метода клонирования« который, мы, назвали HAR-клонирование (от Uransforraationr^ssociatedi ILecombination), была, стимулирована экспериментами по> изучение рекомбинации. между трансформирующими, молекуламг YAG, описанными, выше. Важным, приложением. TAR-клрнирования. явилось возможность селективного.

26

изолирования ДНК человека из ' монохромосомальных и субхромосомальных гибридных клеточных линий человек-мышь, а также селективное клонирование семейства генов и индивидуальных генов из общей геномной ДНК человека.

4.1. Принцип TAR-клонирования геномной ДНК.

Общая схема конструирования YAC новым методом представлена на Рис 6. _

Аа /1НК человека

" Рис. 6 Клонирование фрагментов хромосом человека, основанное на

рекомбинации in vivo. G2I - повторяющиеся последовательности Alu а ДНК человека.

Сферопласты дрожжей трансформируют хромосомной ДНК человека совместно с. двумя векторами, маркированными различными генами. Каждый вектор ердержит на одном конце теломерную последовательность TEL, а на другом-Alu последовательность многократно повторённую в геноме человека. Рекомбинация между Alu последовательностями в

, 27

векторах и геномной ДНК приводит к образованию YAC. Так как один из векторов содержит центромерную последовательность CEN, образовавшийся YAC способен упорядоченно сегрегировать при клеточных делениях. Репликация YAC может быть обеспечена последовательностью ARS, включённой в состав второго теломер-содержащего вектора. Альтернативно, репликация YAC может инициироваться с ARS-подобных последовательностей в клонируемой ДНК. Как было показано, частота встречаемости таких последовательностей в геномных ДНК млекопитающих достаточно высока (Stincomb et. al., 1980). В геномной ДНК человека ARS-подобные элементы повторены приблизительно 100 тысяч раз, то есть встречаются один раз на каждые 40 т.п.о. Вторая предложенная схема TAR-клонирования основана на конструировании колицевых YAC (Рис. 7).

Рис. 7 Образование кольцевых YAC при «»трансформации дрожжей ДНК человека и TAR вектора.

В этом случае сферопласты дрожжей трансформируют геномной ДНК человека совместно с вектором, содержащим повторы Alu на обоих концах. Рекомбинация при трансформации приводит к образованию кольцевой молекулы. Как и в случае линейного TAR- клонирования, вектор содержит центромерную последовательность; репликация YAC обеспечивается ARS-подобным элементом в клонируемом фрагменте.

4.2. Селективное клонирование ДНК человека из монохромосомальных гибридов.

Хромосом-специфические библиотеки значительно облегчают физическое картирование, хромосом и изолирование индивидуальных генов. В настоящее время существуют два метода конструирования таких библиотек. Первый метод основан на использовании сортированных хромосом. (..vlcCormick et. al., 1993). Второй-на создании геномных библиотек монохромосомальных гибридов мышь-человек или хомяк-человек и последующей идентификацией клонов, содержащих фрагменты ДНК человека, молекулярной гибридизацией, используя пробу, специфичную для ДНК человека (Schlessinger et. al., 1991). Оба метода исключительно трудоёмки и Именно поэтому до сих пор созданы библиотеки YAC клонов только для нескольких хромосом человека. Мы попытались использовать TAR метод для селективного выделения фрагментов ДНК человека из общей ДНК монохромосомальных гибридов, содержащих хромосому 16. В монохромосомальном гибриде ДНК человека составляет около 3*. Геномная ДНК, изолированная из гибридных клеток, была трансформирована в сферопласты дрожжей вместе с двумя TAR векторами, содержащими Alu повторы, как описано в Рис. 6. Трансформанты селектировали по маркеру центромер-содержащего вектора, а затем проверяли на присутствие маркера второго неселектируемого вектора. В стандартном эксперименте, используя 108 сферопластов и по 1 мкг векторной ДНК и геномной ДНК, выход двойных трансформантов составлял около 500 колоний. Более 60* этих трансформантов содержали YAC с фрагментами хромосом человека протяжённостью от 100 т.п.о. до >600 т.п.о. Таким образом, использование линейного TAR-клонирования привело к 300-кратному обогащению ДНК Человека (при пересчёте на содержание ДНК человека в гибридных клетках). 80 YAC клонов, содержащих фрагменты хромосомы 16 , были проверены на присутствие ДНК мыши. Ни один из клонов не гибридизовался с мышинной ДНК. Таким образом Мы заключили, что TAR-клонирование не только обладает селективностью, Но и лишено основного недостатка обычного клонирования,'« именно образования химерных YAC клонов. Ещё более высокое обогащение клонами, содержащими ДНК человека, было достигнуто при использований кольцевого TAR вектора,

"9

содержащего Alu последовательности. В этом случае более 80* трансформантов содержало фрагменты хромосомы человека в виде больших кольцевых молекул (Larionov et. al., 1996). В Таблице 5 суммированы данные по "1 AR-клонированию ДНК человека из 3 различных монохромосомальных гибридов, содержащих хромосомы 10, 16 и 22.

Таблица 5. Селективное TAR-клонирование ДНК человека из ___монохромосомальных гибридов.__

Хромосома человека, присутствующая в гибриде мышь-человек X трансформантов, содержащих YAC со вставками ДНК человека

16 80Х

10 76 X

22 85*

Выход клонов, содержащих кольцевые YAC с фрагментами ДНК человека, составлял около 1000 при использовании условий трансформации идентичных описанным выше для линейного TAR-клонирования ДНК человека. Средний размер кольцевых YAC в трансформантах составлял около 150 т п о. (Рис. 8).

t-IMkk HI-MU

Рис. 8 Распределение длины кольцевых YAC, содержащих фрагменты хромосомы 16 человека.

Ни один из 200 проанализированных YAC не оказался химерным. Приведенные данные позволяют заключить, что TAR-клонирование является эффективным методом создания хромосом-специфических и субхромосом-специфических библиотек человека. Одна из таких библиотек, созданная в ходе данного исследования, в настоящее время используется Геномным центром национальной Лос Аламоской лаборатории (США) для построения детальной физической карты хромосомы 16 человека.

4.3. Изолирование уникального гена BRCA2 из геномной ДНК человека с помощью TAR-клонирования.

Высоко селективное клонирование фрагментов хромосом человека из монохромосомальных гибридов стимулировало нас применить TAR технологию для изолирования уникальных генов из общей геномной ДНК человека Для этих экспериментов мы выбрали ген BRCA2, картированный на хромосоме 13. Выбор данного гена определялся двумя основными причинами Прежде всего этот ген не был клонирован. (Была известна только последовательность к-ДНК этого гена). Во-вторых, ген BRCA2 исключительно важен для клинических исследований, поскольку около половины опухолей молочной железы вызвано нарушением экспрессии этого гена (Claus et. al., 1991; Friend, 1996) Схема клонирования гена BRCA2 с помощью TAR метода приведена на Рис. 9. Для клонирования гена был сконструирован кольцевой TAR вектор, содержащий на одном конце уникальную последовательность, соответствующую промотору BRCA2, а на втором-уникальную последовательность дистальную открытой рамки считывания Протяжённость каждой из последовательностей, включённой в состав TAR вектора, составляла около 400 п о. Рекомбинация между TAR вектором и фрагментом геномной ДНК, содержащим BRCA2, в клетке дрожжей должна приводить к образованию кольцевого YAC как показано на Рис. 9. Используя стандартные условия трансформации сферопластов дрожжей, было отобрано около 1000 трансформантов в 10 независимых экспериментах. Среди полученных трансформантов 3 клона гибридизовались с пробой на экзон 11 гена BRCA2. Как было показано в дальнейших экспериментах, все три клона содержат полноразмерный ген BRCA2.

Экзон 11

Рис. 9 Селективное изолирование уникального гена BRCA2 из хромосомной ДНК человека TAR методом.

Таким образом мы заключили, что TAR-клонирование может быть использован-: не только для создания хромосом-специФичных библиотек, но и для селективного выделения специфических последовательностей из геномной ДНК человек.. Следует отметить, что новый метод выделения генов человека исключительно прост и сокращает время изолирования интересую ™ гена до I недели. Бол'ее того, так как для выделения гена требуется небольшое количество ДНК, TAR метод открывает возможность выделения мутантных форм генов из тканей пациентов для последующего их изучения. Всё сказанное предполагает, что новый метод селективного tar-хлонирования генов может полностью заменить клонирование, основанное на получении случайных геномных фрагментов.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлен ряд новых компонентов аппарата трансмиссии хромосом у эукариотнческого микроорганизма (д(южжи Saceharomyces cerevisiae). С помощью двух различных оригинальных методов идентифицировано 12 новых ichob О IL, контролирующих репликацию и cciperamno хромосом. 10 из 12 идентифицированных генов картированы на хромосомах с помощью генетических и физических методов. Изучение мутантных фенотипов позволило разделить icin.i CHL на две ipyimu: группу генов, контролирующих репликацию, п группу lenou, необходимых для сегрегации хромосом в митозе.

2. Два lena, относящиеся к первой группе (гены СН1Л2 и CHL15), изолирован! в виде ДНК клонов и детально охарактеризованы. Установлено, что гены СИМ 2 и CHL15, кодирующие пошшенгиды с молекулярной массой 84 кД и 105 кД, соответственно, играют важную роль в процессе репликации хромосом у дрожжей. Один из гашых продуктов (CHL12) имеет гомологию с субъедшшцами реплнкативного фактора С (RF-C), другой (CHL15) -взаимодействует с ДНК-нолнмеразой альфа. Показано, что ген СНЫ, относящий.» ко второй группе (группе генов, контролирующих сегрегацию хромосом), кодирует полипептид с молекулярной массой 53 кД, который участвует в формировании кинетохора.

3. Исходя из особенностей аппарата репликации, сегрегации и рекомбинации у дрожжей, разработан новый метод клонирования больших фрагмешов хромосом человека в дрожжах (TAR-клонирование). Метод основан на соединении клонируемых фрагментов с вектором in vivo с использованием рекомбинации при трансформации клеток дрожжей. TAR-клоннрованне обладает высокой селективностью и может быть использовано дли

конструирования хромосом-сиецнфичных библиотек человека и виде линейных или кольцевых YAC.

ТАК-клониропанис может быть использовано для быстрого селективного изолирования уникальных генов т общей хромосомной ДНК человека. Изолирован моЛ11ор;пмсриыи геи В1*СЛ2 размером КК) т.и.о., мугашш в котором приводят к раку молочной жслеэм.~----

СПИСОК СТАТЕЙ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ларионов В., Куприна Н . Аверьянов А. Изучение репликатора 2 ц ДНК.

ДАН, 260, стр. 1240-1 ^.44, 1983.

2. Kouprina N., and Larionov V. The study of rDNA replicator in Saccharomyces.

Current Genetics, 7, p. 433-438, 1983.

3. Ларионов В., Куприна H., Легчилина С., Арман И. Мутант S, cerevisiae с

нарушением гомологичной рекомбинации. Молекулярная генетика, вирусология и микробиология, 3, стр. 33-38, 1983.

4. Ларионов В., Куприна Н., Трауготт М. Экстрахромосомная ДНК у дрожжей Saccharomyces. Молекулярная биология, 17, стр. 983-991, 1983.

5. Ларионов В., Куприна Н. Генетический анализ дрожжевого штамма с

высоким уровнем содержания экстрахромосомной рибосомальной ДНК. Генетика, 20, стр. 767-774, 1984.

6. Larionov V., and Kouprina N. Stability of recombinant plasmids containing the ARS

sequence of yeast extrachromosomal rDNA in several strains of S. cerevisiae. Gene, 28, p. 229-235, 1984,

7. Куприна H., Карпова Т., Ларионов В. Идентификация генов, влияющих н»

митотическую стабильность центромерных плазмид в дрожжа*. Молекулярная генетика, вирусология и микробио. 1гия, 3, стр. 29-3 j. 1984.

8. Piroshkov V., Tzouladze A., Kouprina N.. ami Larionov V. Determination of

probability of plasmid loss per generation. Gene, 28, p. 237-239, 1984.

9. Larionov V., Karpova Т., and Kouprina N. A mutant of S. cerevisiae with impaired

maintenance of centromeric plasmids. Current Genetics, 10, p. 15-20,1986.

10. Куприна H., Цуладзе А., Ларионов В. Изучение поведения искусственных минихромосом в мутанте S. cerevisiae с нестабильным поддержанием природных хромосом. ДАН, 292. стр. 734-737, 1987.

11. Ларионов В., Куприна Н., Киселёв О., Свердлов А. Штамм дрожжей S. cerevisiae - продуцент человеческого а-интерферона. Патент 4403017/31,29.12.1987.

12. Larionov V., Karpova Т., Zhouravleva G., Pashina О., Nikolaishwili N., and Kouprina N. The stability of chromosomes in yeast. Cuirent Genetics, 11, p. 435443, 1987.

13. Эльдаров М , Карпычел И , Куприна Н., Ларионов В. Поведение исскуственных минихрс мосом в клетке дрожжей при индукции транскрипции в центромериых плазмидах, Молекулярная генетика, вирусология и микробиология, 4, стр. 39-44, 1988.

14. Ларионов В , Куприна Н., Власов А , Струнников А. Получение дрожжевых мутантов с накоплением исскуственных минихромосом. ДАН, 300, стр. 1485-1488, 1988.

15. Kouprina N., Pashina О., Nikolaishwili N., Tzouladze A., and Larionov V. Genetic control of chromosome stability in the yeast Saccharomyces cerevisiae. YEAST, 4, p. 25'/-¿69, 1988.

16. Larionov V., Kouprina N., Strunnikov A., and Vlasov A. Direct selection procedure for isolation of yeast mutants with impaired segregation of artificial minichromosomes. Current Genetics, 15, p.17-25,1989.

17. Larionov V., Kouprina N., Strunnikov A., Vlasov A. Selection of mutants with i..,ndisjunction of minichromosomes in yeast S. cerevisiae. In: Mechanisms of Chromosome Distribution and Aneuploidy, (Ed. by M. Resnick and B. Vig, Alan R. Liss Inc., USA) p. 307-316,1989.

18. Larionov V., Kouprina N., Strunnikov A., Vlasov A., and Pirozhkov V. Direct selection procedure for isolation of yeast mutants with impaired segregation of chromosomes. Prog. Clin. Biol. Res., 318, p. 307-316, 1989.

19. Kouprina N., Koryabin M., Bannikov V., Bliskovsky V., Gizatullin R., Kirillov A., Zakharyev V., Hieter P., Spencer F., a-id Larionov V. CHLIS (CTF4) is a new DNA synthesis gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 12, p. 5736-5746, 1992.

20. Kouprina N., Tzouladze A., Koryabin M., Hieter P., and Larionov V. Identification and genetic mapping of CHL genes controlling mitotic chromosome transmission in yeast. YEAST, 9, p. 11-19,1993.

21. Kouprina N., Kroll E., Koryabin M., Shestopalov, В., Zakharyev V., Bannikov V., Kirillov A., and Larionov V. Identification and cloning of the CHL4 gene controlling chromosome segregation in yeast. Genetics, 135, p. 327-341, 1993.

22. Куприна H , Кроль E., Корябин M., Банников В., Кириллов А.. Захарьев В., Ларионов В. Стабильное поддержание дицентрических минихромосом в chl4 мутанте дрожжей. Молекулярная биология, 27, стр. 589-607, 1993.

23. Куприна Н., Кроль Е., Корябин М., Шестопалов В, Блисковский В., Банников В., Гизатулин Р., Кириллов А., Кравцов В., Захарьев В., Ларионов В. CHL15-новый ген, контролирующий репликацию хромосом в дрожжах Saccharomyces: клонирование, картирование, сиквенирование и анализ последовательности. Молекулярная биология, 27, стр. 569-588, 1993.

24. Larionov V., Kouprina N., Eldarov M., Perkins E., Porter G., and Resnick M. A. Transformation-associated recombination between diverged and homologous DNA repeats is induced by strand breaks. YEAST, 10, p. 93-104,1994.

25. Larionov, V., Graves J., Kouprina N., and Resnick M. A. The role of recombination and RAD52 in mutation of chromosomal DNA transformed into yeast. Nucl. Acids Res., 22, p. 4234-4241, 1994.

26. Larionov, V., Kouprina N., Nikolaishvili N.. and Resnick M. A. Recombination during transformation as a source of chimeric mammalian artificial chromosomes in yeast (YACs). Nucl. Acids Res. 22, p. 4154-4162, 1994.

27. Kouprina N., Eldarov M., Moyzis R., Resnick M., arid Larionov V. A model system to assess the integrity of mammalian YACs during transformation and propagation in yeast. Genomics, 21, p. .7-17,1994.

28. Kouprina N., Kroll E„ Kirillov A., Bannikov V., Zakharyev V., and Larionov V. CHL12, a gene essential lor the fidelity of chromosome transmission in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 138, p. 1067-1079, 1994.

29. Resnick M., Larionov V., Kouprina N., and Perkins E. Transformation-assosiated

recombination cloning. (USA) Patent. Filed July, 1996.

30. Larionov, Kouprina, N.,,Graves, J. and Resnick, M. A. Specific cloning of human DNA as YACs by transformation-associated recombination.—ProcrNat.— Acad. Sci. USA, 93, p. 491-496, 1996.

31. Larionov, V., Kouprina, N., Graves, J. and Resnick, M. A. Highly selective isolation of human DNAs from rodent-human hybrid cells as circular YACs by TAR cioning. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93,1996.

J3aK.I50. PITLi BAH, 19303^. CauKi-IIeTepCypr, EnpiseBafl jxuii. ,I