Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная организация воротничковых нитей бактриофага Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная организация воротничковых нитей бактриофага Т4"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

УДК 578,8111,1 +575.22.4.2:577.112.083

НИКОЛАЕВА Людмила Ивановна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВОРОТНИЧКОВЫХ НИТЕЙ БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1988

Работа выполнена в Институте вирусологии имени Д. И. Ивановского АМН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук В. В. Месянжинов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Б. Н. Ильяшенко, доктор биологических наук М. Э. Талъянский.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Защита состоится «/У» ¡^¿¿ьё/гл- 1988 г. ъic{ час. на заседании Специализированного совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии имени Д. И. Ивановского АМН СССР, 123098, Москва, Д-98, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии имени Д. И. Ивановского АМН СССР.

Автореферат разослан « » (ИС-пъсДъЯ' 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета .кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

дуальность проблемы. Изучение организации и функции белковых труктур является одним из актуальных направлений современной молеку-ярной биологии. Несмотря на больше достижения, полученные в этой об-асти за последние года, до сих пор недостаточно исследована струк-урная организация фибриллярных белков, их сборка и регуляция актив-ости. Удобным объекте« для изучения олигомерных фибриллярных белков вляется бактериофаг Т4 Escherichia coli , в составе которого шлется три типа фибриллярных компонентов: длинные хвостовые фибриллы, ороткив хвостовые фибриллы и воротничковые нити. Последние явились бъектом изучения в данной диссертации.

Воротничковые нити,или "бакенбарды", локализованы в месте сооди-ения капсида И ХВОСТа. Ген wac ( whisker antigen control ), асположанный на генетической карте фага Т4 меаду генами 12 и 13, одирует воротничковые нити. К иоменту начала данной работы отсутствовали сведения по структуре гена wao а ого продукта, хотя уже иди известны функции воротничковых нитей: участие в сборке длинных востовых фибрилл, присоединения ах к ьирусной частице а регуляции дсорбции фага на клетке бактерии.

Воротничковые нити представляют жтерес не только как удобная одоль для изучения структурно-функциональных свойств фибриллярных шподеятов, по п. как удачный объект для выяснения детальной природ отдельных антигенных детерминант в состава олигеиеряого кгашлзкеа, ; та готе как иэдаль для направленной белковой ннзенерни.

Иялж.и заяачзу^ссладоваяпя. Цела работы заключались в разра-отка быстрого метода выделения и очистка воротничковых нитей в превративши количествах» изучения молекулярной организации "бакенбард" i их структурной характеристике. Данная работа является частьв про-■одишго в Институте вирусологии иа«Д.й.Ивановского АМН СССР кома-

лексного исследования по программе Всемирной организаций здравоох- ' ранения (ВОЗ) "Идентификация антигенных детерминант и экспрессия доменов структурных белков вируса гепатита А в составе гибридных белков". В связи с этим обсуждается возможность использования Воротниковых нитей в качестве белка-носителя дня встраивания антигенных детерминант«

В работе поставлены следуйте задачи:

1. Разработать быстрый препаративный метод выделения я очистка натившх воротничковых нитей и их мономера - ОТ «во х.

2. Определить основные молекулярные параметры "бакенбард": размер, молекулярную массу, субъеданичный состав, изоэлектрическую точку,

3. Сделать частичную характеристику первичной структуры: аминокислотный состав, ын2- и СООЦ-коыцеше последовательности.

4. Изучить структурированность "бакенбард" и их мономера,

5. Определить распределение элементов вторичной структуры по полипептидаой цепи ПГ "во .

Научная новизна работы. Комбинацией методов нпзкоскоростной колоночной хроматографии и быстрой аидкостной хроиатографап (fplc ) впераце получены нативные воротничковые нити а их тнсмер. Определены размер, молекулярная масса, субьеднничный состав в изоэлектрзческая точка "бакенбард". Обнаружено, что формирование воротничковых нитей из мономерных субьедикиц сопровождается увеличением структурированности. Определена близость "бакенбард" по аминокислотному составу к фда-геллину и водорастворимый апидергальным кератинам илекопитавднх. Показано, что воротничковые нити являются высокоетруктурарованным да-мерным комплексом пг «rao , во вторичной структуре которого преоб-

х Использованы сокращения: ПГ - продукт гена, Ш - молекулярная масса, ПМГ - полиакриламидннй гель.

¿гадает ¿¿-спиральная конфорнация.

Рряктгтавсхоа тячвжга^тбот. Полученные данные по молекулярной организации воротничковых нитей расширяют представление о структуре фибриллярных белков. Сведения по молекулярной организации "бакенбард" помогут выяснить тонкий механизм регуляции сборки длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4, присоединения их к фаговой частице и регуляцию адсорбции фага на клетке бактерии.

Методические подхода данной работы могут быть использованы при выделении и очистке вирусных белков и структурных элементов вирусов в различных медико-биологических исследованиях.

Прямое практическое применение воротничковые нити могут приобрести в дальнейшей при создании вакцин нового типа на основе хи м ер-ных белков с встроенными антигенными дзтерыганантама вируса гепатита А.

1. Разработка метода получения воротничковых нитей а их ноноиэра.

В связи с восцолностьв практического использования воротничковых

нитей как белка-носителя душ встраивания антигенных детерминант необходимо было разработать быстрый препаративный метод их выделения а счистка. Предлагаемая канз схет^а очислся вютлает две стадии хроматог-рафдчгс.:ого разделения: первая - гель-фильтрация на тойояэрле от -55, вторая - быстрая ацдкостшп хро.'^2Тографм на Superóse 12.

2. Определенно основных параметров иолекулы воротничковых isitu£.

Впервые установлены размеры гндзленшх воротничковых нитей:

длила 70,0^10 ем а даамзтр 3,0-4,0 ci. Подтворздеяа фабрзлдярность дашшх структур, ¿нализ галгкуляряой гзссы "бакенбард" д их цояедара* определенна азсэлезтрлчосгоЗ точка л ин2 -концевого остатка показал» что воротшпгоныо нпзя сформированы из двух идентичных субъодшпщ 2 EK3DT l£?I III,0±3,0 иоземер - 55,5±2,5 кДа.

3. Частичная характеристика первичной структуры ПГ лас .

Цри аналпзв аминокислотного состава ОТ нас обнарувено высокое содержание сушарных остатков аспарагнна в аспарагиновой кислоты, глутяотяя и глутямкяовой кислоты, а также свршш и глицина. Содержание ненолярных аминокислот достигает 332. Среди изученных фибриллярных белков наиболее близкими к "бакенбардам" по аминокислотному составу являются фдагаллин £ некоторые водорастворише эпидерыадъные кератнш те..одитащих. Определена нн2 -концевая последовательность пяти остатков в СООН-еонцевая последовательность трех остатков, что позволило локализовать райку считывания гена «гас .

4. Анализ структурированности "бакенбард" и их мономера.

Больше значение для дальнейших исследований шест данные о

структурированности "бакенбард" и ИГ «во , которые были получены при анализе действия различных протеаа. Димерный нативный комплекс очень устойчив к протеолитическому раедеашш?, ионсшер более доступен. Анализ продуктов гидролиза ЦТ час протеяназой К свидетельствует о той, что в центре шдашептвдной цепи мономера имеется неструктурированная область, протякенностьв около 50 аминокислотных остатков с экспонированными пептидными связями, К}^- и СООЫ-когцевне участки по 200-220 аминокислотных остатков внсокоструктурарованы.

5. Расчет распределения элементов вторичной структура в ПГкео • Цри анализе аминокислотное последовательности ПГ *во , выведанной пз первичное структуры соответствутаего гена, обнаружены участки, содержащие «с-спираль, /-структуру, /¡-изгиб в неупорядоченную конфоршцев. Во вторичной структуре ПГ »ас юено выделить две области: первую с преобладанием ¿-спирали, вторув с преобладанием -структуры а шеокна содзрганнеи -изгибов.

Аптюбахтя работы. Результата диссертации дологены на Д Зседрвэ-ной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташкент, 8-11

октября 1986г.), на конференции колодах ученых Института вирусологии ЕИ.Д.И.Ивановского (Москва, 24-25 февраля 1987г.), где работа удоо-тоеаа поощрительной премии, на УП Всесоюзном Симпозиуме по хшид балков а пептидов (Таллин, 1Э-23 октября, 1987 ).

Структура я объем диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора научной литературы, описания методической части исследования, изложения результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературу. Общий объем работы составляет ¡27 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 14 табл. и 31 ряс. Список литературы включает 138 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Выделение доротничкорчх татея я их мономера - пг^.

Для наделения белков был использован тройной а»бер-мутаят фага по генам Ю~18~23~ (аа В255~ап EI8 -ап Ш). При неперьшссавных условиях у этого мутанта заблокирована сборка кадсида и хвоста, что облегчает выделение отдельных структур. Начальные этапы получения белхоз выполнялись по стандартной методике выделения фибриллярных белков бактериофага Î4.

Воротдзчковые нити посла рззруиения клеток и высокоскоростного центрифугирования бшп обнаружены з супорнатанте вместе с другими фаговыми и бактериальные балка'н (рис.1). Разделению такой сложной сглеся препятствовала склоеность к. агрегации некоторых фаговых белков. Поэтсцу vu просела серию эксперз:эятоз для подбора оптз.олъяых условий зро^атографдческого разделения белковой смеси.

Е£шз исследовано влияние природа носителя а элюирупдей система на эффективность разделения фагоЕых белков. Наиболее удачниц носителе! среда исследованных (сефароза cl -ев, биогазь д-0,5 а ,

Рис. I. Здехтрофоретически4 анализ денатурированных белков исходного супернатанта :

I - фаг Т4, 2 - суперватант I. Стрелкой отмечено полcatease ПГ »ас.

тойоперл Ш -55) оказался тойоперд ш -55, который является гидрофильный полимером на основе винила я, следовательно, полностью устранял специфическое взаимодействие ряда фаговых белков с углеводными остатками носителей. Среди различных буферных систем (фосфатной, бикарбонатной, трисовой) и дополнительных солюбшшярувдих агентов (луброла, ЭДХД, этиленгликоля) наилучшие результаты были получены прп использовании 50 Ш трио-HCI буфера, рН 8,5, содерзэдего 30% стилен-

ГЛЕКОЛЯ.

ЭлектрофоретстаскЕй анализ фракций, получензых при гель-фзльтра-цик смеси фаговых и бактериальных белков ш колонке с тойопзрдоп ш -55 (рис, 2), показал, что воротничковые неге алшругзхся в области высокомолекулярных банков в довольно узкой диапазоне - с 46 го 52 мл. Но главное достоинство этой стадии очистки - эффективное удаление примесных белков и получение концентрированного препарата белков за сравнительно короткий щхэмегуток времени - 2 часа.

Следующей стадией очистки воротничковых нитей была быстрая гель-фильтрация на колонке Superóse 12 (рис. 3). Ира этш впервые были получены воротничковые нити в их мономер - ИГ «гас . Выделенные

I 2

J

Б Номера фракций 2 4 6 8 10

! Ю - л

l-i

1. ; t •

о

m

Номера фракции

20

.a fa*.*.

Рис. 2. Разделение белков супернатанта на колонке 1,6x100 си о тойоперлом ни -55 (а) и электрофоретический анализ отдельных фракций в ПААГ (б). На хроыатограше над осью абсцисс отмечена фракция, содержащая воротничко-вые нити.

"бакенбарда" были идентифицированы после денатурации как ПГ wac злектрофоретически по сравнению с белками фага дикого типа и en -мутанта по гену ■ vrac и как фаговый белок ишунологически по взаимодействию с антителами к фагу Т4Д.

Доказательство« того, что нами получены "бакенбарда" и их мономер - ПГ wac - является их различное время выхода с колонки, а также разные молекулярные массы, подученные при злектрофоретическом разделении нзденатурированных образцов (ряс. 3, б).

. ' В результата выделения из 4x10^ клеток бактвргй (10 л культуры) инфицированных тройным амбер^мутантом фата Т4 по генам 10" 18" 23" ( аа В225 - аа ЕШ - аа НИ) С множественностью 5 фаговых частиц на клетку, подучено до 10 иг "бакенбард" и 0,5 мг мономера. Чистота препаратов по данным денсятометриа составляла 95-9SS.

б

%о

о л

0.1

( Б )

1г з

♦ ♦

-4*

я «

20

40

Номера фракций

Рис. 3. Разделение фракции, содеркадеЕ во-

рОТЯИЧКОВЫе НИТИ,На КОЛОШсе Бирегоее 12

. (а) в 0,05Ы ыансо^ (рЗ 8,3) и алектрофоре-

тический анализ неденатурированшх образцов

(б) полученных фракций:

I - фракция П, 2 - фракция I, 3 - фаг Т4Д Сдан для сравнения).

Стрелками отпечено место выхода белков:

а - ферритин (440 кДа), б - каталаза (232 кДа), в - фрсфорилаза В (94 кДа), с г-, альбумин (67 кДа), д - овальбуыин 143 кДа), е - карбоангидраза (30 «да).

МШИ™ )шкроскоп11я. Впервые определенные с помощь» электронной микроскопия размера выделенных воротничковых нитей - длина 70,0±10 им е диаметр 3,0-4,0 в» - оказалась больше данных, полученных при анализе цельного фага (рис. 4). Вероятно, это связано с типом контрастирования препаратов и, возможно, с определенным положением "бакенбард" в коннекторе, которое может привести к уменьшению их размера. Длина молекулы воротничковых нитей, определенная при негативном контрастировании, - 50±10 нм - более близка к литературным данным. Но четкой картины при данном типе констрастирования мы не получили.

Для фибриллярных белков бактериофага Т4 характерно образование агрегатов в концентрированных растворах солей. У воротничковых нитей тип агрегатов совершенно иной, чем у длинных и коротких хвостовых фибрилл, что свидетельствует о различных свойствах и организации этих структур.

При иимуноэлектронной микроскопии фага Т4Д с антителами к "бакенбардам" подтверждена локализация воротничковых нитей в верхней части хвоста.

Рис. 4. Электронная микроскопия "бакенбард", контрастироваяных круговым напылением сплавом платины с палладием (4:1) под углом 6-7°. Увеличение х90 ООО.

Молекулярная масса и пубъяттиничный состав. Ввиду сильной асишетркк фибриллярных белков число методов определения зх молеку-

лярной массы ограничено. Наиболее аффективный и простым является электрофорез в поднакрдламилном геле с додецилсульфетом натрия. Для болев точного определения молекулярной массы было исследовано поведение во-ротничковых нитей и ПГ*ас в гелях разной концентрации (5,6,7,8,IQÍ) и в качестве "маркерных" белков были выбраны изученные фаговые белки, среди которых есть фибриллярные. Определенная таких образом малакуляр-на; масса воротничковых нитей равна III,0*3,О вДа, ПГ»ас - 55,5^2,5 кДа (рис. 5). Полученные данные свидетельствуй о той, что "бакенбарды" являются диыарами ПГ wac . -концевым аминокислотным остатком воротничковых нитей оказался фы • При определении изоэлектрической точки была обнаружена одна белковая зоне с pi 4,9±0,3. Таким образом, "бакендарды" сформированы двумя идентичными субъединицами.

Аминокислотный состав ПГ wac представлен в табл.1, где для сравнения даны результаты других авторов. Содержание гидрофобных аминокислотных остатков в ПГ wae достигает 33%, что характеризует их как водорастворимые белки со средний содержанием гидрофобных аминокислот« Высокое содержание двх, Gix, ser, Gly свидетельствует о гидрофильыоста воротничковых нитей. Среди особенностей аминокислот-' ного состава следует отметить отсутствие сув . очень низков содержание Met .

Сравнительный анализ аминокислотного состава "бакенбард" с другими изученными фибриллярными белками показал, что наиболее близкими к воротничковым нитям являются флагеллин и некоторое водорастворимые эпидерыальныв кератины млекопитающих, которые также в большинстве случаев сформированы из двух субъединиц« Коэффициент гомологачности аминокислотного состава в пределах 7ЦС совпадения наиболее высокий у флагеллина - 0,59.

Отмаши отшиж пшягоятшяуете! ПГгас * нв2 нюнцввая

MÛ, яДа

■ИТ 120

ТОО

во

со

Bf К 9 Я в

Рис. 5* График зависимости электрофоротической подвижности ( af ) от Ш (молекулярной массы), значения которой даны в логарифмической шкале. Стрелкой отпечено положение "бакенбард" и ПГ wao. В качества "маркерных" белков использованы: I - ПГ34 (147 кДа), 2 - ПГ7 (133 ^Да), 3 - DT37^(II8 ада), 4 - ПП8 (75 кДа), 5 - ПГ20 (65 кДа), 6 - ПГ23 (47,5 кДа).

последовательность пяти остатков определена по методу Здмана:ты<-Авр_ не- val- Leu- . СООЗ-ковдевая последовательность трех остатков определена с пошцыз карбоксипептазы Y : - Ser- Pro - Ala»

A^ure^ ртртктупУгоовднности. Еодьшоа заачениа для дальнейших исследований имеютданныв о структурированности "бакенбард" и ш>ао , которые были получены при анализе действия различных протеаз. Как известно, в натдвяых белках в первую очередь протеолизу подвергается доступные ферсенту пептидные связи, а компактные структурные области выделятся в виде фрагментов, устойчивых к дальнейшему расщеплению. В таком случае ограниченный протеолиз воротшгсковых нитей и ЦТ «ао может служить простым тестом на наличие в них компактных структурных участков.

Воротннчковне нити обладал высокой устойчивость» к протеоли-тнчоскому расявшюншз. При 2-х часовен гидролизе трздеином и про-

Аминокислотный состав ПГ и-ао.

Таблица I,

Аминокислота Содержание . в мольных % Количество остатков на полипептидаув цепь . Литературные данные

Азх 13,01 62,23 60,6

ТЬг 8,20 39,22 .34,0

Эег 10,62 50,80 33,6

. 01х 11,04 52,84 60,3

Рго 3,96 18,93 24,3

01у 10,52 50,35 46,3

Суз 0 0 0

А1а 5,42 ' 25,97 36,0

Уа1 6,70 32,05 40,3

•Met 0,11 • 0,54 10,0

Не 9,88 47,27 40,3

Ье« 7,43 . 35,57 46,3

Туг 1,56 7,47 9,3

Иге 1.63 8,09 10,6

1ув 3,78 18,07 24,6

Ш.В 0,85 4,08 6,33

Ате 3,44 16,48 20,3

Игр 1.74 8,34 X

Триптофан не определяли.

теиназой К с фергент - субстратном соотношением 1:50 образуется в незначительном количестве одинаковый продукт с молекулярной массой 85,8±2,6 кДа (рис. 6).

По-видимому, у ^бакенбард" имеется частично доступная для .проте-олиза пептидная связь, образованная ^ ш ^ I локализованная около одного из концов молекулы ^или две пептидные связи у хажлото конца.

Рас. 6. Элвктрофоретическяй анализ продуктов расщепления воротниковых нитей:

1 - контрольный белок (без обработки) ,

2 - трЕПСияовый гидролиз в течение I часа i

3 - то re в течёяиэ 2 часов i

4 - контрольный белок >

5 - гидролиз протеиназой К в течение I часа щ

6 - то же в течение 2 часов.

В отличие от воротначковых нитей UTwao ценее устойчив к проте-олитическому расщвплонию (рас. 7). Особенно эффективно он расщепляется протадназой К. Таким образом, конформация "бакенбард" отлична от конфоркации ОТ . Интересно отметить, что в случае ПГ*»ао образуется серия из 8 продуктов с молекулярной массой около 28-34 кДа, СООН-концезые остатки которое на содержат iya в Arg , так как они не образуется при трилсшовон гидролизе.

Такие по величина продукта гидролиза возможны, если расщепляйся пептидные связи в центра полипептидной цепа, ПГ яао • По-видимому, конформация полипептида такова, что г центре имеется область, протяженностью около 50 аминокислотных остатков, о экспонированными пеатядншш связями, а дальше ш2 - и СООН-концзвыэ шсокоструктури-рованкне области длиной в 200-220 аминокислотных остатков. (Все расчета даны, считая, что ПГ nao содершга 490 амшшокислотннх остатков).

По различному действию протеаштнческях ферментов обнаружено, что образование дглера сопровождается кон^ороцпокныма изменениями мономера. Димер представляет собой шсокоструктурзрованный белковый комплекс.

12 3

4 6 6

67 _ 43 _

30 —

21 —

1 2 3 4 5 6 Ш, «Да

67

43

■ зо

21

Рис. 7. Злектрофоретическое разделение продуктов протеолиза ПГ ттс •

1 - фаг Т4Д (дан для сравнения), гидролиз трипсином в течение

2 час., 3 - то ае в течение I час., 4 - контрольный белок,

5 - гидролиз протейной К в течение I час., 6 - то ае в течение

2 час.

Расчет распределения элементов вторичной структуры по полипептидной пепи ПГ у я г. Цри анализе аминокислотной последовательности ПГ пв.0 , выведенной из первичной структуры соответствущего гена, определено распределение элементов вторичной структуры. Обнаружены участки, содержалдае об-спнредь, ^ -структуру, £ -изгибы и неупорядоченную конфорыацшв (рис. 8). Полученные данные характеризуют мономерную субъединвду воротничковых нкэй как белок, у которого «¿-спиральные и^-структурные участки чередуются га. ходу полипептвдной цени. Однако, распределение всех элементов вторичной структуры в ПГиао таково, что в белке можно выделить две области. Первую - с I по 220 остаток о преобладанием; об-спирали и ^дяким содержанием ^ -изгибов. Вторую - с 221 по 486 остаток с я высоким

Ht

er йгт

'»t^ü Ши!"... aj^^üuuL-JL-n—п_л—л--nr.

В.У.Л1 , fU_un fJLfl-n_n-ГУ-U-lUUUU

I ilPM Hllice*

OfCM|> ütn

JV-TL

_n_n_

шгл_П_П_ _ПАП_Л_Л_ЛЛЯЛ-П-ПЛТи1-пл.

j_ II Щ I II I 1

Рис. 8. Распределение элементов вторичной структур* по полипептидной цепи НГ weo , где кроме того отмечены участки с индексом антигенности больше 1,2 и места возможного гликози-лирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целят сокращения названия а подчеркивания, фибриллярных свойств воротнпчковых нитей мы предлагаем для них новый термин -фабрнтия.

Предясаешшй иетод ввделешхя я очистки фибрзтина и его мономера позволяет быстро получать около 10 кг "бакенбард" и 0,5 иг ЯГ wac из 4XI012 клеток з. coli , зараяенных в стандартных условиях тройным акбер-цутантом фага Т4 по генаи 10""18~23**. Очпотка белков выполнена в две хро>латогра£ические стадии: первая - гель-фильтрадия за тойопвряэ j етг-55 . вторая - быстрая жидкостная

хроматография па 2ир«гсае 12,

Результаты алектрофюретического анализа выделенных препаратов фибритька и И!' чгао в ПЛАТ показали» что фибриткн является доирни'.: комплексом ЦГ^ао .Молекулярная масса натииного белкового комплекса Ш,0±3,0 кДа, мономер - 55,512,5 кДа. Определение кн2 -концевого остатка и изоэлектрической точки однозначно свидетельствуют, что фдбритин сформирован из двух идентичных субъедкшщ.

С иомскоью электронной микроскопии показано, что вороткячксвие нити - фибриллярные структуры, имевдпе длину 70,0110 нм и диаметр 3,1Ы,0 им, на препаратах контрасткрованных круговым напылением сплава платины с палладием. Определенные нами размеры фибритана несколько вице тех, которие были получены при электронно-микроскопическом анализе структур в цельном, неразрушенной фаге.

Среди изученных физико-химических свойств фибритииа следует отметить хорошую растворимость и отсутствие заметной агрегации при хранении препарата на протяжстш длительного времена,

Ира анализе аминокислотного состава ПГ пас обнаружено высокое содержание остатков /Юх,С1х,Зег к , содержание гидрофоб-

ных аминокислот достигает 33;', Ср-еди известных фибриллярных белков наиболее близкими к фибрктину по аминокислотному составу являются флагеллин и некоторые воде, аствориыые опздер»юльные кератины млеко-пптаин/х, которые так же в большинстве случаев сформированы из двух субьодинкц.

Как и для большинства фибриллярных белков для фибритпна характерна высокая структурированность, анализ которой выполнен с использованием протеолитических Зерментоз, Химерный комплекс флбритина очень устойчив к действию протеаз. При гидролизе трипсинов и проте-инасой К в течение 2 ч (фермент - субстратное соотношение 1:50)

образуется в незначительном количестве один и тот же продукт о ММ около 85,8+2,6 кДа. Мономер менее устойчив к протеолизу. Обработка его протекназой К приводит к появлению не менее 8 продуктов гидролиза с МИ около 28,0-34,0 кДа. Эти данные свидетельствуют о том, что п центре полипептидной цепи ПГ «ао имеется неструктурированная область, протяженностью около 50 аминокислотных остатков с экспонированными пептидными связями, ая^- и СООН-концевыв области ПР*ас длиной около 200-220 аминокислотных остатков высокоструктурированы. При формировании дикера структурированность мономера увеличивается.

Определены концевые аминокислотные последовательности мономера фибритина. Проанализирована аминокислотная последовательность, выведенная из структуры соответствующего гена. Сделан расчет распределения элементов вторичной структуры по полипептвдной цепи ПГ Обнаружены участки, содержащие ¡>-. —спираль, —структуру, —изгибы и неупорядоченную конфориацию. Во вторичной структуре ПГ «гас выделены две области: первая - -концевая с преобладанием оС-спирали, вторая - СООН-концевая с преобладанием / -структуры и ,¿-изгибов.

Полученные данные по фдзико-хккическим свойствам я молекулярной организации фибриткна характеризуют его как белок отличный от других фибриллярных компонентов бактериофага Т4. На основании изученных свойств фибритина, а также его функциональных особенностей возможно прккенеяке этого белка в белковой инженерии.

ВЫВОДЫ

I. Разработан быстрый кетод препаративного год «гения продукта гена я катквкых воротничковых нитей (фпбркткна). Очистка

препаратов выполнена з два стадия хроиатографкческого разделения: первая - гель-фильтрецзя на той оперла ня-55 , вторая - быстрая

жидкостная хроматография ка Superóse 12.

2. Определены основные параметры молекулы фибритина: молекулярная масса - 111,0+3,0 кДа по данным электрофоретического анализа; изоэлектрическая точка - 4,9+0,3 ; число субъединиц - две идентичные по 55,5+2,5 кДа; размер молекулы - 70,0+10 нм при диаметре 3,0-4,0 нм по данным электронной микроскопии.

3. Частично охарактеризована первичная структура ПГ WBC : определен аминокислотный состав, установлена NH2 -концевая последовательность пяти íuvi'/нокислотных остатков ( Thr-Aap-Ile-VaX-leu-... )

и СООП-концевая последовательность трех аминокислотных остатков i... -Пог-Рго-Ala ), что позволило локализовать рамку

сиитчвания продукта гена wac„

4. ¡lo действию протеолитических ферментов показано, что фиб-ритнн является высокоструктурированньм комплексом, мономерные субъединицы которого менее структурированы.

5. Во вторичной структуре ПГиас , рассчитанной по аминокислотной последовательности, обнаружено, что в Шг -концевой области преобрадают сС -спиральные участки, а в СООК-концсвой - J)-струк-турные тяжи и Ji-изгибы.

6. На основании изученных своРств, - а также функциональных особенностей фибритина предлагается использование его в белковой инженерии как белка-носителя антигенных детерминант вкусов человека.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

I. Николаева Л.И., Месянжинов В.В., Жданов В.Ы. Особенности молекулярной организации воротничковых нитей бактериофага Т4. -. Доклады Академии Наук СССР, 1987, т.295, PI, с.249-252.

2. Селиванов H.A., Веньяминов С.Ю., Голицына Н.Л., Николаева Л.И.,

Месяккинов В.В. Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. I. Выделение и спектральные свойства длинных фибрилл. - Молекулярная биология, 1987, т.21, JF5, с.1256-1267.

3. Николаева Л.И,, Маныкин A.A., Клименко С.М., Месянхинов В.В.

Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. П. Выделение и начальная структурная характеристика воротничковых нитей. - Молекулярная биология, 1987, т.21, F5, C.I268-I27S.

4. Николаева Л.И,, Месянжинов В.В. Молекулярная организация ворот-

ничковых нитей бактериофага Т4. - Материалы УП Всесоюзного Симпозиума по химии белков и пептидов, Таллин, 1987, с.82.

5. Mesyanzhinov V.V., Prilipov А.О., Salivanov П.A., Nikojaera L.I.

iíuoleotido sequence of bacteriophage T4 gene wao. - Deposit la sequence data liblary European Molecular Biology laboratory, t3.XZ.1988, Accession number X128S3 wao.