Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков-новая модельная система для исследования механотранстдукции

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков-новая модельная система для исследования механотранстдукции"

На правахдукописи-

ЖАДАН Петр Михайлович

АБДОМИНАЛЬНЫЙ СЕНСОРНЫЙ ОРГАН ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ - НОВАЯ МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНОТРАНСДУКЦИИ

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2006

Работа выполнена в Тихоокеанском океанологическом институте им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Исаева Валерия Васильевна

Доктор биологических наук Незлин Леонид Павлович

Доктор медицинских наук Калиниченко Сергей Георгиевич

Ведущая организация: Институт физиологии или И.П. Павлова РАН

Защита состоится 28 декабря 2006 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д005.008.01 при Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН

Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17

Факс: (4232)31-09-00 E-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Автореферат разослан 20 октября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

fycutJ&tStOO

кандидат биологических наук М.А. Ващенко

Актуальность проблемы. Чувствительность к механическому воздействию является одним из фундаментальных свойств, лежащих в основе функционирования одноклеточных и многоклеточных организмов. Способность клеток трансформировать механическое воздействие в электрический и химический сигналы (механотранедукция) обеспечивает восприятие звука и вибрации, гравитации, ускорения, скорости, давления, прикосновения, изменения формы и объема клетки, ее местоположения относительно внеклеточного матрикса и окружающих клеток. Эта способность лежит в основе таких разнообразных явлений, как слух и чувство равновесия, тактильная чувствительность, проприорецепция, осморегуляция. Исследования последних лет свидетельствуют, что механический стресс - это чрезвычайно важный фактор, влияющий на формирование тканей и органов, дифференцировку клеток и апоптоз.

Поскольку явления, связанные с механочувствительностью, так разнообразны, процесс выяснения механизмов, лежащих в их основе, замедлен относительно исследований других сенсорных модальностей. Зрение, обоняние и вкус имеют в своей молекулярной основе единый эволюционно консервативный механизм, включающий систему вторичных мессенжеров на основе ГТФ-связывающих белков (Firestein, 2001; Arshavsky et al., 2002). В то же время, механопреобразующие системы, по-видимому, не имеют универсального механизма. Структурное многообразие (клеточная мембрана, свободные нервные окончания, инкапсулированные рецепторы, волосковые рецепторы, ресничные рецепторы), различное тканевое происхождение (нервные и не нервные клетки), значительные различия в чувствительности и скорости преобразования стимула свидетельствуют о множественности механорецепторных систем, возникших параллельно в ходе эволюции. На это же указывают различия в молекулярной структуре первичных преобразователей - механочувствительных каналов - не только у филогенетически далеких групп, но и у одного и того же организма (Sukharev, Corey, 2004).

Второй причиной, объективно тормозящей исследования механорецепции, являются методические трудности. Механосенсорные клетки не образуют значимых скоплений, достаточных для получения необходимою количества материала для биохимических исследований, эти клетки имеют малые размеры; кроме того, мало количество механочувствительных каналов и связанных с ними молекулярных комплексов в клетке.

К настоящему времени сформировалось представление о том, что существуют две системы управления механочувствительным каналом. В одной из них управление механотрансдукционным каналом осуществляется латеральным натяжением в клеточной мембране. Предполагается, что во второй системе механотрансдукцшнный канал управляется молекулярными мостиками, которые связаны с одной стороны с цитоскелетом, а с другой - с внеклеточными структурами. Смещение любой из этих структур, вызванное механическим стимулом, передается через молекулярные мостики на канал, изменяя вероятность его нахождения в открытом состоянии. Чувствительность такого молекулярного комплекса может изменяться молекулярным мотором, который регулирует натяжение связанных с каналом молекулярных мостиков.

В последние годы накапливаются данные о том, что существуют иные механизмы, лежащие в основе восприятия механического стимула. Так, в механотрансдукции с участием белков клеточной адгезии — интегринов на начальном этапе требуется высокоспецифичное лиганд-рецепторное взаимодействие с внеклеточным матриксом (Coppolino, Dedhar, 2000; Ali, Schumacker, 2002). В механочувствительных первичных ресничках ключевым моментом для запуска механопреобразования, по-видимому, является взаимодействие рецепторного белка полицистина-1 с канальным белком полицистином-2. Аутокринный механизм механопреобразования с участием растворенных лигандов (факторов роста) выявлен в клетках эпителия легких млекопитающих (Tschumperlin et al., 2004). Такое разнообразие говорит о том, что прежде чем будут сделаны обобщения представлений о механизмах

механотрансдукции и их эволюции, необходимо провести тщательный анализ каждой механосенсорной системы, а также поиск и исследование новых модельных систем.

Такая модельная система должна в идеале обеспечивать получение достаточного количества материала для биохимического анализа и быть удобной для биофизических и физиологических исследований. Разнообразие морских организмов предоставляет широкое поле для решения данной задачи, тем более что механорецепторные системы морских организмов исследованы лишь в малой степени.

Цели и задачи работы. В результате поиска перспективных модельных механосенсорных систем у морских животных наше внимание привлек абдоминальный сенсорный орган (ACO) двустворчатых моллюсков - малоизученное образование с неизвестной в то время функцией, но представляющее потенциальный интерес в качестве удобной модели для исследования механизмов механотрансдукции. Это обстоятельство определило основную цель настоящего исследования - выяснить функцию ACO и исследовать механизм его работы.

Достижение цели обеспечивалось решением следующих задач:

1 Исследовать строение ACO, обратив особое внимание на апикальный участок сенсорной клетки и ее ресничный аппарат.

2 Исследовать липидный и полипептидный состав мембран механосенсорных клеток и сравнить его с биохимическим составом несенсорных органов и тканей. Изучить биохимические особенности ресничного аппарата сенсорных клеток.

3 В электрофизиологических и поведенческих экспериментах выяснить функцию ACO, определить его основные функциональные характеристики и выяснить роль сенсорной реснички.

4 • Получить полиспецифические антитела к внешней поверхности сенсорной реснички и

исследовать механизм их действия.

5 Исследовать фармакологические свойства ACO, уделив. особое внимание веществам, используемым для исследований других механорецепторных образований.

6 "Исследовать роль регуляторов клеточного метаболизма в функционировании

механорецепторных клеток.

7 Исследовать механические свойства сенсорной реснички.

8 Исследовать роль реснички механосенсорных клеток ACO в восприятии механического стимула.

Новизна полученных результатов. Впервые показано, что ACO двустворчатых моллюсков является механосенсорным образованием. На основе морфологических, поведенческих и электрофизиологических исследований сделан вывод, что ACO выполняет функцию детектора вибрационных колебаний в водной среде и является аналогом акустико-латеральной системы позвоночных животных.

Впервые у беспозвоночных животных обнаружены филаменты, радиально связывающие сенсорную ресничку ACO с окружающими ее стереомикровиллами. Показано сходство этих соединений с таковыми, связывающими киноцилию и стереоцилии в волосковых клетках позвоночных животных.

Впервые обнаружена структурная неоднородность сенсорной реснички ACO и показана связь ■ между особенностями морфологической организации аксонемы и механическими свойствами реснички.

В экспериментах по регенерации реснички ACO впервые установлена связь между длиной реснички и чувствительностью механорецепторных клеток к механическому стимулу.

Впервые получены данные о липидном и полипептидном составах мембраны сенсорной реснички ACO и выявлены их особенности по сравнению с таковыми несенсорных мембран и мембран механочувствигельных клеток жаберного эпителга.

В экспериментах с применением полиспецифических антител против поверхностных антигенов мембраны сенсорной реснички и конканавалина А впервые исследовано влияние

агглютинации ресничек на чувствительность механосенсорных клеток к механическому стимулу. Результаты этих исследований указывают на важную роль дистального участка сенсорной реснички в восприятии механического стимула.

Впервые получены данные о существовании поверхностного мембранного транспорта вдоль механосенсорной реснички.

Впервые обнаружено изменение геометрии сенсорного эпителия, синхронизированное с изменением чувствительности ACO. Показано, что эта синхронность обуславливается изменением кривизны поверхности сенсорного эпителия и, соответственно, изменением расстояния между дистальными участками ресничек.

Впервые показано, что процесс механотрансдукции может инициироваться латеральным взаимодействием сенсорных ресничек.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные свидетельства того, что у двустворчатых моллюсков, в отличие от брюхоногих и головоногих моллюсков, сформировалось специальное сенсорное образование, ответственное за восприятие колебаний в водной среде - ACO, способствуют более глубокому пониманию биологии этой многочисленной группы беспозвоночных животных и важны для выяснения вопросов, связанных с эволюцией механорецепторных органов. Установленный в настоящей работе факт, что воротничковые клетки ACO являются механосенсорными, подтверждает существовавшее на основе морфологических исследований мнение о том, что эти клетки, широко представленные в эпителии беспозвоночных животных, являются эволюционными предшественниками волосковых клеток акустико-вестибулярной системы позвоночных животных. Полученные данные о строении волоскового аппарата сенсорных клеток ACO, о механических свойствах сенсорной реснички, о липвдном и полипептидном составе ее мембраны, о механизмах регуляции чувствительности сенсорных клеток ACO являются новыми' и вносят существенный вклад в понимание механизмов работы механорецепторных клеток. Обнаружение транспорта вдоль наружной поверхности мембраны механосенсорной реснички ACO является предпосылкой для изучения механизмов этого явления и его роли в функционировании ресничных механорецепторов.

Введение в практику научного исследования ACO в качестве модели для изучения механорецепиии открывает новые перспективы в научно-методическом плане. Этот орган дает возможность получать достаточное количество материала для биохимических исследований механосенсорных мембран. Легкость в манипулировании в электрофизиологических и биофизических экспериментах делает ACO почти идеальной модельной системой для исследований механотрансдукции. Результаты настоящей работы, принципиально важные для понимания механизмов восприятия клеткой механического стимула, получены при сравнительно низких материальных затратах, что подтверждает высокую эффективность предлагаемой модели.

Положения, выносимые на защиту:

1. Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков - это высокоспециализированный механосенсорный орган, воспринимающий механические колебания в широком диапазоне частот. Высокая чувствительность ACO к механическим колебаниям в водной среде обеспечивается воротничковыми клетками. Определяющими факторами, ответственными за высокую чувствительность ACO, являются большая длина сенсорной реснички и малая жесткость ее дистального участка.

2. Являясь самым крупным из известных механосенсорных образований, обладая уникально высокой однородностью клеточного состава и экстремально длинной сенсорной ресничкой, ACO представляет собой почти идеальную модельную систему для исследований механизмов работы механорецепторов. В отличие от традиционных модельных систем, ACO обеспечивает получение достаточного количества материала для биохимического анализа и значительные преимущества при проведении биофизических и физиологических исследований.

3. Сенсорная ресничка ACO является активным элементом, участвующим в процессе преобразования механического стимула в электрический сигнал. Наиболее вероятным механизмом первого этапа механотрансдукции является латеральное взаимодействие мембран соседних ресничек.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Симпозиуме «Биология шельфовых зон Мирового океана» (Владивосток, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), V Всесоюзном симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Пущино, 1984), V Всесоюзном съезде биохимиков (Москва, 1986), Всесоюзном совещании по нейронаукам (Киев, 1986), Всесоюзной конференции по морской биологии (Севастополь, 1988), Всесоюзном симпозиуме «Современные проблемы эволюции биохимии и происхождение жизни» (Телави, 1988), XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).

Публикации. Список публикаций соискателя включает 126 работ, 41 из них - по теме диссертации, в том числе 28 статей, включая 22 статьи в журналах из списка ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендуемого ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация общим объемом 336 страниц, содержит 11 таблиц и 106 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 422 наименования.

Личный вклад соискателя. В диссертации обобщены результаты экспериментальных исследований, проведенных в 1980-2005 гг. соискателем в Тихоокеанском океанологическом институте им. В.И. Ильичева ДВО РАН. Основная часть исследований выполнена соискателем самостоятельно или в совместных работах, в которых его участие было определяющим. Это отражено в публикациях: соискатель является единственным автором 10 и первым автором 11 статей. Из соавторов наиболее существенный вклад в работу внес A.B. Сизов (биохимические и иммунологические исследования), который под руководством соискателя защитил кандидатскую диссертацию.

Благодарности. Самые теплые слова я должен высказать проф. О.Б. Ильинскому, под руководством которого я начинал свою научно-исследовательскую деятельность. С особой благодарностью я вспоминаю академика A.B. Жирмунского, благодаря которому я попал на Дальний Восток и получил возможность проводить исследования на морских животных, и академика В.Л. Касьянова, в лаборатории которого я проработал 3 года и получил бесценный опыт формирования отношений в коллективе. Я признателен академику В.А. Акуличеву, который стимулировал написание этой работы.

Я признателен сотрудникам Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН и соавторам публикаций A.B. Сизову, С.Ю. Зайцу, Н.М. Чекмасовой, П.Г. Семенькову, В.В. Мельникову, A.M. Трухину, а также С.Ш. Даутову (Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН) за неоценимый вклад в проведенные исследования и дружескую поддержку.

Я искренне благодарен П.А. Дорошенко за многолетнее научное сотрудничество и, в особенности, за помощь в обеспечении необходимой научной литературой, которую он мне оказывал и продолжает оказывать, будучи сотрудником университета Оттавы (Канада).

Я искренне признателен водолазной группе Института биологии моря и особенно А.Г. Голосееву, обеспечившим материал для проведения исследований.

Особую признательность и теплые слова я адресую моей жене и коллеге М.А. Ващенко за поддержку, понимание и помощь в работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили двустворчатые моллюски приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis (Jay) (поведенческие, морфологические, электрофизиологические, биохимические, иммунологические, спектроскопические, спекрофлуориметрические и микроспектрофлуориметрические исследования), гребешок Свифта Chlamys swift i (Bernardi)

(поведенческие, электрофизиологические, биохимические и иммунологические исследования), глицимерис японский Glycymeris yessoensis (Sowerby) (морфологические, иммунологические и электрофизиологические исследования), анадара Броутона Anadara broughtonü (Schrenck) (морфологические, электрофизиологические, и биохимические исследования), устрица гигантская Crassostrea gigas (Thunberg) (морфологические и электрофизиологические исследования), арка Боукарда Arca boucardi (Jousscaumc) (морфологические и электрофизиологические исследования). Животных собирали водолазным способом в зал. Петра Великого (Японское море) и содержали перед опытом в аквариумах с проточной либо сменяемой водой с постоянной аэрацией.

Большая часть исследований проведена на приморском гребешке М. yessoensis.

Методика поведенческого эксперимента

Приморских гребешков с высотой раковины 12-15 см и гребешков Свифта с высотой раковины 6-10 см сразу после отлова делили на 3 группы по 5 особей. Первая группа жтотных оставалась интактной (контроль 1). У животных второй группы (контроль 2) удаляли участок мантийного валика ниже места расположения ACO. У третьей группы животных (опытная группа) ACO удаляли полностью. Моллюсков выдерживали после операции в море в садке на глубине около 2 м в течение 3-6 сут. Непосредственно перед экспериментом их содержали в аквариуме с проточной аэрируемой водой при температуре 14-17 °С.

Опыты проводили в проточном аквариуме размером 60x40x40 см без аэрации при температуре 14-17 °С. Животных помещали левой или правой створкой вниз на платформу, которая представляла собой резиновое кольцо диаметром 13 см, подвешенное в толще воды на тонких нитях примерно на равном расстоянии от дна аквариума и поверхности воды. Положение животного относительно излучателей звука изменяли, вращая платформу на 360° вокруг вертикальной оси и наклоняя ее до 45°. Расстояние от излучателей до края раковины животного составляло 6 см.

Для стимуляции использовали излучатели звука двух типов. Первый, стационарный, представлял собой динамик мощностью 0.5 Вт, помещенный в герметичный пластиковый бокс с тонкой (1 мм) передней стенкой и прикрепленный к стенке, или дну аквариума прямо напротив платформы с животным. Второй - пьезокерамический излучатель в форме диска диаметром 150 мм и толщиной 15 мм - крепился к шарнирной штанге и мог перемещаться вокруг платформы.

Питание излучателей осуществлялось от двух пар генераторов синусоидальных колебаний ГЗ-112/1 и ЗГ-34. При использовании стационарного излучателя частота стимуляции составляла 140 Гц, время нарастания амплитуды стимула - 25 мс. Стимуляция от пьезокерамического излучателя осуществлялась амплитудно-модулированными колебаниями ультразвуковой частоты с несущей частотой 40 кГц. Большинство экспериментов проведено при частоте модуляции 150 Гц с глубиной модуляции около 100%.

Для определения порога реакции восприятия звука гребешку предъявляли по пять стимулов длительностью 2 с, следующих с интервалом в 2 мин. Пороговой интенсивностью стимула считалась такая, которая вызывала минимальную видимую реакцию животного на 3 предъявления из 5. Для каждого животного измерения пороговых стимулов проводили 3-4 раза в течение одного эксперимента.

Для измерения колебаний створки раковины гребешка использовали измерительную схему оригинальной конструкции. Датчиком служил измерительный конденсатор, одна из обкладок которого через тонкий стержень контактировала со створкой. Измерения интенсивности звукового сигнала перед каждым экспериментом проводили пьезокерамическим шариковым гидрофоном диаметром 30 мм по всему объему аквариума. В работе представлены результаты измерений в месте, где располагался ближний к излучателю край раковины животного. Данные об интенсивности звукового сигнала и амплитуде

колебаний раковины моллюска представлены в виде величин выходного сигнала гидрофона и емкостного датчика.

Эксперименты проводили в темное время суток. Чтобы исключить влияние зрительных стимулов на результаты опытов, освещали только платформу с животным.

Методика токсикологического эксперимента

Контрольную и опытную группы приморских гребешков помещали в ванны объемом 350 л, по 15 экз. в каждую. У 7 животных из каждой группы ACO удаляли. Воду сменяли полностью трижды в день. В ванны с опытными животными добавляли хлористый кадмий до конечной концентрации ионов кадмия 50 мкг/л при каждой смене воды. Аэрация в ваннах была постоянной. После недельного содержания измеряли чувствительность моллюсков к механической стимуляции в поведенческих и электрофизиологических экспериментах, а также исследовали поглощение 45Са2+ ресничками в радиоизотопных экспериментах.

Морфологические методы

Анатомические методы. Иннервацию ACO исследовали на переживающих препаратах мягких тканей моллюсков. Пути нервных проводников прослеживали, последовательно удаляя окружающие ткани вольфрамовыми иглами. Препарирование проводили при температуре около ССс использованием сгереомикроскопа МБС-9 или МБС-10.

Морфометрия. Измерение длины ресничек и размеров органа проводили на переживающих препаратах ACO с помощью окуляр- и объект микрометров стереоскопического микроскопа или поляризационно-интерференционного микроскопа «Biolar» (Польша).

Количественный состав сенсорных клеток в эпителии ACO определяли по электронным микрофотографиям, исходя из площади сенсорного эпителия, частоты встречаемости клеток и площади их апикальной поверхности Рассчитывая площадь поверхности ACO, исходили из того, что фиксированный для электронной микроскопии ACO состоит из цилиндра (средняя часть) и двух конусов разной высоты. Соотношение высот конусов принималось равным 1:3. Соотношение сенсорных и секреторных клеток в сенсорном эпителии определяли по электронным микрофотографиям тангенциальных срезов. Размер клеток и органелл определяли по сканированным микрофотографиям с использованием компьютерных программ SigmaScan-Pro (версия 5.0) и AdobePhotoshop (версии 5.5-7.1).

Прижизненная микроскопия. Исследования агглютинации и автоагглютинации ресничек ACO и изучение их механических свойств проводили на живом изолированном органе, который помещали в специально сконструированную стеклянную проточную микрокамеру размером 15x5x0.4 мм. Объем микрокамеры ограничивался сверху и снизу покровным и предметным стеклами, а с боков - бортиками из тонких силиконовых нитей. Температуру в комнате поддерживали на уровне 10-14°С. Растворы, поступающие в микрокамеру, охлаждали до 0-6°С.

Исследование механических свойств ресничек. Для исследования механических свойств ресничек использовали интактные ACO и органы, с поверхности которого были удалены все реснички за исключением тонкого пучка. Для получения такого препарата ACO выделяли вместе с небольшим участком мантийной складки и помещали в камеру объемом 250 мкл с постоянным протоком фильтрованной натуральной морской воды (НМВ). Скорость протока составляла 1 мл/мин. К небольшому участку сенсорного эпителия подводили полиэтиленовую пипетку с диаметром отверстия 80-150 мкм. Внутри пипетки создавали отрицательное давление около 50 мм водного столба, что обеспечивало плотное прижатие кончика пипетки к эпителию. Затем через камеру в течение 15-20 с пропускали морскую воду утроенной осмотичности (НМВ с добавлением 64 г/л хлористого натрия - НМВЗ). После этого проток вновь переключали на натуральную морскую воду. После

полной замены растворов через камеру с ACO пропускали пузырьки воздуха в течение 5-10 с. В результате реснички с поверхности органа удалялись, за исключением участка, защищенного пипеткой.

Затем ACO помещали в микрокамеру таким образом, чтобы направление потока жидкости было перпендикулярно оси пучка Скорость протока воды изменяли ступенчато в пределах 0.15-1.5 мм/с, в зависимости от диаметра сменяемого капилляра, через который в камеру поступала вода. Скорость потока определяли по видеозаписи, измеряя скорость перемещения микрочастиц диаметром менее 5 мкм. Степень деформации реснички определяли, используя программу для анализа видеоизображения SigmaScan-Pro (версия 5.0) или графическую программу AdobePhotoshop (версии 5.5-7.1). Для оценки степени деформации дистального участка реснички измеряли угол между прямой, совпадающей с направлением кончика реснички, и нормалью к поверхности сенсорного эпителия. Отклонение проксимального участка определяли по углу отклонения его оси от первоначального положения.

Для наблюдения использовали поляризационно-интерференционный микроскоп «Biolai» (Польша). Для фото- и видеорегистрации применяли пленочные фотокамеры «Зоркий» с фотоприставкой МФН-1 (СССР), «Olimpus» (Япония), цифровую фотокамеру «Nikon D100» (Япония) или видеокамеру LSL-902HS (Япония) с записью видеоизображения на жестком диске персонального компьютера.

Определение связывания конканавалина А на поверхности абдоминального сенсорного органа. Локализацию связывания конканавалина А (Кон-А) на поверхности ACO и динамику удаления лектина исследовали на интактном органе и на органе, с поверхности которого были удалены все респшкн, за исключением тонкого пучка.

Для подавления неспецифического связывания ACO инкубировали в течение 20 мин в фильтрованной НМВ, содержащей 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Затем орган промывали в течение 20 мин в фильтрованной НМВ и помещали в проточную микрокамеру. Через камеру пропускали фильтрованную НМВ, содержащую 100, 200 или 1000 мкг/мл раствора Кон-А или Кон-А, меченого флуоресцеинизотиоиионатом (ФИТЦ-меченый Кон-А) в течение 25 мин. Скорость протока через камеру поддерживали на уровне 0.8 мкл/с. Затем проток переключали на НМВ без Кон-А.

Для наблюдения и регистрации флуоресценции использовали микроскоп МБИ-14 (СССР) с возбуждающим (420±10 нм) и запирающим (460±10 им) интерференционными светофильтрами.

Определение связывания Кон-А на поверхности сенсорных ресничек проводили на изолированных ресничках.

Сенсорные реснички выделяли, помещая несколько ACO на предметное стекло в каплю НМВЗ объемом 100 мкл на 20 с, затем НМВЗ отбирали пипеткой и замещали 100-200 мкл НМВ. Реснички отделяли от органа, проводя по его поверхности тонкой вольфрамовой иглой, затем органы удаляли. Полученная суспензия содержала около 4* 107 ресничек в миллилитре. К суспензии добавляли Кон-А из маточного раствора (2мг/мл) до конечной концентрации 500 мкг/мл и инкубировали реснички в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем аликвоту суспензии помещали между покровным и предметным стеклом, наблюдали и фотографировали с помощью поляризационно-интерференционного микроскопа «Biolai» (Польша) с фотоприставкой.

Световая и электронная микроскопия. ACO отделяли вместе с небольшим участком мантийной складки и помещали на 2-3 ч в фильтрованную морскую воду при 4°С, после чего фиксировали в охлажденном до 4 °С 2.5% растворе глутаральдегида на 0.1 М какодилатном буфере (pH 7.2), содержащем 0.335 М NaCl для поддержания изотоничности с морской водой.

После постфиксации в течение часа в 1% растворе четырехокиси осмия на какодилатном буфере образцы обезвоживали в серии спиртов и заливали в эпон-аралдит. Тонкие срезы для световой микроскопии получали на ультратоме Reichert OmU2 и

окрашивали смесью 1% азурина и 2% метилеиового синего на дистиллированной воде. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB 4801 А, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, наблюдали и фотографировали на микроскопе JEOL JEM-100B. Для сканирующей электронной микроскопии препараты после обезвоживания в спиртах сушили методом критической точки в атмосфере С02, покрывали золотом и просматривали в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S-405A.

Измерение активности ионов калия К*-селективными микроэлектродами К+-селективный микроэлектрод на основе жидкого ионообменника № 9286 фирмы «Орион» (США) изготавливали из стеклянного капилляра с наружным и внутренним диаметрами 1.35 и 0.9 мм соответственно. Для калибровки микроэлектродов использовали серию растворов КС1 с концентрациями 1, 10, 50, 100 и 500 мМ. В отсутствие других ионов в калибровочных растворах потенциал микроэлектродов изменялся на 55-59 мВ при десятикратном изменении концентрации К1" в растворе. При добавлении к калибровочным растворам 470 мМ NaCl, 10 мМ СаСЬ и 50 мМ MgCl2 (что примерно соответствует составу морской воды) изменение потенциала электрода составляло от 2 до 20%. Для экспериментов отбирали экземпляры с наиболее высокими показателями селективности. Перед экспериментом электроды дополнительно калибровали в морской воде с различной (в пределах ожидаемой) концентрацией К*.

Электрофизиологические методы

ACO с небольшим участком прилегающей ткани и иннервирующим его нервом помещали в камеру объемом 150 мкл с постоянным протоком фильтрованной НМВ со скоростью 30-50 мкл/с. В зависимости от задач эксперимента орган фиксировался в камере с помощью присоски, расположенной в дне камеры, или с помощью присоски, которая была смонтирована непосредственно на стимуляторе. В обоих случаях присоска фиксировалась на тканевой полоске у основаши органа.

При использовании стимулятора-присоски гарантировалось постоянство контакта наконечника стимулятора с основанием ACO, что особенно важно в экспериментах, в которых проводили стимуляцию сократительной активности сенсорного эпителия.

В экспериментах, в которых требовалось удаление ресничек с периферии сенсорного эпителия, применялась обработка этого участка ACO морской водой с трехкратным содержанием хлористого натрия (НМВЗ). Одномоментное удаление ресничек перед началом эксперимента проводили в специально сконструированной камере. ACO помещали в камеру таким образом, чтобы часть сенсорного эпителия находилась над уровнем жидкости. Эта часть ACO сверху через трубку омывалась НМВ. Затем натуральную морскую воду в ванночке заменяли на НМВЗ. Через 40-60 с НМВЗ вновь заменяли на НМВ. В результате с той части поверхности ACO, которая была подвергнута воздействию НМВЗ, реснички полностью удалялись.

Для последовательного удаления ресничек с поверхности органа в процессе эксперимента использовали коаксиальную пипетку. Регулируя соотношение давления в ее внешней и внутренней частях, можно было менять размер перфузируемого пространства, для визуализации которого в раствор добавляли флуоресцеин в концентрации 1 мМ. Коаксиальную пипетку использовали также в экспериментах, в которых требовалось изменение ионного состава среды на отдельных участках сенсорного эпителия.

Отведение импульсной активности биполярными платиновыми электродами осуществляли как от целого нерва, так и от отпрепарированных тонких пучков, состоящих из 3-10 одиночных нервных волокон. Такие тонкие пучки получали путем последовательного разделения нерва с помощью тонких вольфрамовых игл. В некоторых случаях для регистрации импульсной активности от радиальных мантийных нервов использовали электрод-присоску. Сигнал усиливался стандартным усилителем переменного тока.

В экспериментах, в которых исследовали влияние различных веществ, тестируемое вещество вначале добавляли в ванночку с нервом. Если это вещество влияло на проводимость по нерву, то его не использовали в опытах с применением метода регистрации импульсной активности в целом нерве или в тонких пучках нервных волокон

Внеклеточную регистрацию рецепгорного потенциала осуществляли стеклянными микроэлектродами, наполненными ЗМ КС1, с сопротивлением кончика 3-10 мОм. Для усиления сигнала был разработан специальный микроэлектродный усилитель. Он обеспечивал возможность чередования циклов регистрации и электрической стимуляции объекта через один электрод. Длительность каждого цикла составляла 5 мкс. Это позволяло с высокой точностью контролировать сопротивление в системе микроэлектрод-объект. Необходимость такого контроля обусловлена наличием периодических сокращений сенсорного эпителия ACO и связанной с этим нестабильностью условий регистрации.

Для регистрации сигнала (с экрана осциллографа) использовали фоторегистратор ФОР-2. Постоянную регистрацию активности вели на быстродействующем самописце Н3021-3. Параллельно осуществлялась запись на жесткий диск персонального компьютера. Температуру в камере контролировали термодатчиком на основе микротерморезисгора Карманова МТ-54 с регистрацией на ленте самописца и цифровой индикацией.

Для механической стимуляции ACO были использованы стимуляторы двух типов. Первый - магнитодинамический - был сконструирован на основе вибростимулятора ВТ-2. Он был дополнен демпферным устройством для уменьшения осцилляций и емкостным датчиком перемещения, который позволял регистрировать амплитуду стимула непосредственно в эксперименте. Второй стимулятор представлял собой пьезокерамическую трубку длиной 30 мм и диаметром 3 мм. Один конец трубки жестко крепился к микроманипулятору, а ко второму соосно крепился тонкий стеклянный капилляр (наконечник стимулятора) с шариком на конце. Этот стимулятор обладал малой инерционностью, и форма механического стимула практически точно воспроизводила форму прямоугольного электрического импульса.

Калибровку датчика магнитодинамического стимулятора в динамическом режиме проводили с использованием стробоскопического освещения на микроскопе «Jenaval» при общем увеличении ><400. Эти измерения показали, что зависимость между амплитудой смещения кончика стимулятора и выходным сигналом емкостного датчика была линейной в диапазоне от 2 до 800 мкм.

Калибровку пьезоэлектрического стимулятора проводили в статическом (при постоянном напряжении на пьезоэлементе) и динамическом (на частоте 250 Гц) режимах. Для измерения смещений кончика использовали окуляр-микрометр. В динамическом режиме измерений использовалось стробоскопическое освещение. Результаты калибровки показали, что зависимость между напряжением на пьезоэлементе и амплитудой смещения, а также между амплитудой смещения кончика стимулятора и напряжением выхода фотодатчика была линейной.

Минимальная амплитуда смещения кончика стимуляторов, которую можно было измерить в процедуре калибровки, составляла 2 мкм. Поскольку при больших амплитудах смещения зависимость между напряжением на выходе емкостного датчика и смещением кончика стимулятора была линейной, то она заведомо должна оставаться линейной и для малых амплитуд. Это позволяло аппроксимировать результаты калибровки в сторону малых амплитуд.

В эксперименте амплитуду и форму механического стимула, в случае использования магнитодинамического стимулятора, контролировали по показаниям емкостного датчика. В случае использования пьезоэлектрического стимулятора - по величине подаваемого на датчик электрического сигнала и выходному сигналу фотоэлемента, на который проецировалось изображение наконечника стимулятора. Позиционирование стимулятора осуществлялось с помощью гидравлического манипулятора из комплекта СЭЖ-3 или

механического микроманипулятора «Zeiss» (ГДР). Питание стимуляторов осуществляли электростимулятором ЭСУ-2 или генератором синусоидальных сигналов ГЗ-112/1.

Для визуального контроля над состоянием препарата в экспериментах использовали стереоскопические микроскопы МБС-9 или МБС-10, а в случае использования микроэлектродной техники - инвертированный микроскоп «Polar» («Zeiss», ГДР). Регистрацию положения стимуляторов относительно ACO и состояния сенсорного эпителия проводили с помощью видеокамеры LSL-902HS (Япония) с записью видеоизображения на персональный компьютер.

Иммунологические методы

Выделение ресничек. Жабры и ACO приморского гребешка тщательно промывали холодной фильтрованной морской водой, содержащей 0.1 М ЭДГА. Реснички выделяли обработкой органов морской водой, содержащей дополнительно 32 г/л NaCl и 0.1 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 12 мин. Слизь и целые клетки осаждали при 1000 g в течение 5 мин. Осадок ресничек получали центрифугированием супернатанта при 10000 g в течение 10 мин и затем дважды очищали дифференциальным 1000g/10000g осаждением из фильтрованной холодной морской воды. Качество полученной суспензии определяли с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Иммунизация. Кроликов иммунизировали ресничками ACO или же вначале гомогенатом ACO, а затем ресничками. Взвесь ресничек (20 мкг белка) или гомогената ACO (600 мкг белка) в физиологическом растворе эмульгировали с равным объемом неполного адюванта Фрейнда и вводили подкожно вдоль спины. Усиление иммунного ответа и отбор крови проводили по стандартной методике.

Выделение гамма-глобулинов. Фракцию глобулинов получали двукратным высаливанием сывороток сульфатом аммония до 50% насыщения. Осадок растворяли, диализовали и полученную фракцию доводили до исходного объема. Для выделения иммуноглобулинов G (Ig-G) из контрольной сыворотки фракцию глобулинов получали пятикратным высаливанием сульфатом аммония до 33% насыщения.

Выделение Ig-G. Ig-G очищали хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (DEAE-Servacel-32), емкость 0.9-1.0 мгэкв/г, фракция 100-200 мкм, в 0.0175 М Na-фосфатном буфере, рН 6.3. Раствор глобулинов пропускали через колонку диаметром 1.6 см и объемом 32 см3 со скоростью 11-15 мл/ч. Несорбированный Ig-G элюировали этим же буфером, концентрировали высаливанием сульфатом аммония до 50% насыщения и диализовали.

Приготовление иммуносорбента. К суспензии жаберных ресничек приморского гребешка в изотоничном растворе (концентрация белка 2—3 мг/мл) при мягком перемешивании добавляли по каплям 2.5% водный раствор глютарапьдегида до его конечной концентрации 0.07-0.08%. Смесь инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре. Фиксированные реснички осаждали центрифугированием, и осадок промывали переосаждением последовательно в 0.2 М Ыа-фосфатном буфере (рН 7.3), затем в 0.2 М глицин-HCI буфере (рН 2.8) и в 0.01 М Na-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.15 М NaCl, до значений оптической плотности промывочной среды (Е280 нм, 1 см) меньше 0.01.

Иммупоаффинное выделение антител. Растворы глобулинов или Ig-G антисывороток в 0.01 М Ыа-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.150 М NaCl, добавляли к осадку иммуносорбента, суспендировали и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Сорбент осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осадок промывали тем же буфером до достижения оптической плотности (Е280 нм, 1 см) супернатанта меньше 0.01. Сорбированные антитела элюировали трехкратно 0.2 М глицин-HCI буфером (рН 2.8) и затем диализовали. Иммуносорбент регенерировали отмывкой в 0.01 М Na-фосфэтном буфере (рН 7.0), содержащим 0.150 М NaCl.

Получение моновалентных (Fae) фрагментов антител. Моновалентные Fae-фрагменты антител получали двумя способами. По первому способу антитела, выделенные с помощью иммуносорбента, гидролизовали папаином (Ferak, Merk), и FaB-фрагменты

выделяли хроматографией на КМ-целлюлозе. По второму способу проводили полный папаиновый гидролиз фракции иммуноглобулинов G антисывороток, а активные Fae-фрагменты очищали с помощью иммуносорбента.

Чистоту Fab-фрагментов контролировали гель-электрофорезом с додецилсульфатом натрия. Электрофорез белков выполняли в пластинах 85x70*l.l мм полиакриламидного 15Т/2.6С геля по методу Леммли.

Диализ, концентрирование и хранение фракций. Перед тестированием активности фракций в электрофизиологических экспериментах все растворы были доведены до тоничности морской воды диализом при 4 "С в течение 1-2 сут против избытка морской воды. Образовавшийся осадок удаляли после центрифугирования диализата. Концентрирование белковых растворов осуществляли помещением диализных мешков в сухую сахарозу или аквацит либо добавлением в раствор сухого сефадекса G-25 (Pharmacia). Белковые растворы хранили при -10 °С и ниже.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли спектрометрически по оптической плотности (1=280 нм) или модифицированным методом Лоури, нормированным относительно БСА (Serva).

Тестирование склеивания ресничек. К отпрепарированным ACO добавляли по 20 мкл изотоничного раствора, содержащего антитела. Суспензию жаберных ресничек (4 мг белка/мл, 10 мкл) смешивали с равным объемом тестируемой фракции. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре определяли степень склеивания ресничек с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Радиоиммунологические методы Для определения содержания цАМФ и цГМФ ACO приморских гребешков преинкубировали в течение 1 ч в искусственной морской воде (ИМВ) следующего состава: NaCl - 450, MgS04 - 26.5, СаС12 - 10, КС1 - 10, Трис НС1 - 10 мМ, рН 8. В бескальциевой ИМВ СаСЬ заменяли эквимолярно на Трис НС1. Затем ACO помещали в пластиковые пробирки (по шесть органов в каждую), содержавшие 200 мкл ИМВ с соответствующими добавками: теофилина - 5, ШМХ - 0.5, форсколина - 0.03 мМ, нитропруссида натрия - 50 мкМ, кальциевого ионофора А23187 - 3.5 мкМ и трипсина 0.1 мг/мл. По истечении времени инкубации пробирки помещали в жидкий азот.

В экспериментах с механической стимуляцией пробирки с ACO закрепляли на виброплощадке и подвергали вибрации с частотой 200 Гц и амплитудой стимула в 80 дБ над уровнем порога. Пробирки замораживали погружением в этиловый спирт, предварительно охлажденный жидким азотом.

Для определения содержания циклических нуклеотидов в ACO в каждую пробирку добавляли 200 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, гомогенизировали, отбирали аликвоту для определения белка. Осадок удаляли центрифугированием. Супернатант 5 раз отмывали пятикратным объемом диэтилового эфира, затем выпаривали под вакуумом, осадок растворяли и определяли содержание цАМФ и цГМФ в соответствии с инструкцией к набору для определения содержания цАМФ и цГМФ фирмы Amerscham international.

Радиоизотопные методы Реснички ACO приморского гребешка промывали бескальциевой средой (470 мМ NaCl, 9 мМ MgCh, 25.5 мМ MgS04, 30 мМ Трис-HCl, рН 8.0). Затем их инкубировали с растворами антител (в контроле - с Ig-G нормальной сыворотки) в бескальциевой среде (в соотношении белок антител/белок ресничек =1/10) в течение 30 мин при комнатной температуре, и добавляли 43Са2+ до конечной концентрации 200 мкМ. Через определенные интервалы времени аликвоты фильтровали через мембранные фильтры (Synpor, 0.23 мкм) и промывали избытком искусственной морской воды (460 мМ NaCl, 9 мМ КС1, 22.9мМ MgCh, 25.5 мМ MgS04 10 мМ СаСЬ, 30 мМ Трис-HCl, рН 8.0). Аналогично определяли

радиоактивность ресничек в токсикологических экспериментах. Радиоактивность фильтров определяли с помощью сцинтилляционного счетчика.

Флуоресцентная спектрофотомерия

Выделение латеральных клеток жабр. Жабры приморского гребешка выдерживали в течение 1-2 ч в холодильнике и трижды промывали холодной (4 °С) фильтрованной морской водой для удаления слизи. Затем жабры помещали в 200 мл фильтрованной морской воды, содержащей дополнительно 360 мМ NaCl и 10 мМ ТрисНС1, рН 8.2. Через 30-40 мин инкубации выделившиеся клетки отделяли от слизи фильтрованием через мельничный газ с диаметром ячеи 40 мкм. Тонкодисперсные примеси удаляли осаждением клеток в течение 3 мин при 3000 g. Клетки ресуспендировали в морской воде и хранили до опыта в холодильнике.

Выделение ресничек латеральных клеток жабр. Выделение ресничек латеральных клеток жабр проводили так же, как описано выше. После очистки реснички ресуспендировали в фильтрованной морской воде и непосредственно перед опытом осаждали при 10000 g в течение 10 мин, осадок взвешивали и ресуспендировали в ИМВ полного состава или в воде, где NaCl эквимолярно был замещен на холин хлорид.

Реснички ACO выделяли, опуская орган на 15-20 с в НМВЗ и затем в нормальную морскую воду. Легкое встряхивание приводило к отделению ресничек. Микроскопический контроль суспензии ресничек показал, что она не содержала посторонних примесей.

Для мониторинга мембранного потенциала использовали потенциал-чувствительный краситель dis-C(3)-(5) в концентрации 0.8-1 мкМ. Аликвоту латеральных клеток жабр (200 мкл) вносили в кювету с ИМВ объемом 2.8 мл, конечная концентрация клеток составляла около 10' клеток/мл. Концентрацию ресничек латеральных клеток жабр в кювете подбирали таким образом, чтобы соотношение краситель/фосфолипиды мембран составляло примерно 0.008. Для этого определяли концентрацию белка и из ранее определенного для ресничек этих клеток соотношения белок/фосфолипиды рассчитывали концентрацию фосфолипидов. Концентрацию ресничек ACO определяли исходя из того, что реснички каждого органа содержат 0.12 мкг фосфолипидов.

Регистрацию флуоресценции проводили на спектрофлуориметре «Jasko» (Япония) при длинах волн возбуждение/эмиссия 630/670 нм и при постоянном перемешивании суспензии.

Биохимические методы

Определение липидного состава тканей и органов. ACO, мантийные нервы и висцеральные ганглии моллюсков М. yessoensis и A. broughtonii отпрепаровывапи на льду под бинокулярным микроскопом и тщательно промывали холодной фильтрованной морской водой. Реснички ACO и жабр гребешка выделяли как описано выше.

Липиды экстрагировали по методу Блая и Дайера (Bligh, Dayer, 1959) и разделяли микротонкослойной хроматографией (Svetashev, Vaskovsky, 1972) в системах растворителей, предложенных Роузером с соавторами( Rouser et al., 1968). Общее количество фосфолипидов и содержание фосфора в пятнах определяли макро- и микрометодами (Vaskovsky et al., 1975). Количество холестерина измеряли после хроматографического разделения липидов (Виркемп, Броукхьюз, 1979). Плазмалогены определяли реакционной микрохроматографией (Vaskovsky, Dembitzky, 1975). Липиды метилировали, и метиловые эфиры жирных кислот хроматографировали в хроматографе «Цвет» с пламенноионизационным детектором. Содержание белка определяли модифицированным методом Лоури в микроварианте, используя БСА («SERVA», ФРГ) как стандарт.

Содержание фосфолипидов по классам и холестерина в ресничках определяли на одной хроматограмме. Экстракт липидов ресничек наносили в точку на пластинку (6*6 см) с силикагелем, импрегнированным 1% раствором щавелевокислого калия, и липиды разделяли в первом направлении в системе растворителей для полярных липидов. После высушивания

пластинку подвергали хроматографии во втором направлении в системе растворителей для нейтральных липидов и очищали слой силикагеля так, чтобы при повторной хроматографии во втором направлении в системе для полярных липидов пятна нейтральных липидов не подвергались бы действию восходящего тока жидкости.

Определение полипептидного состава механорецепторных клеток и ресничек. Реснички АСО и жабр приморского гребешка выделяли, обрабатывая органы НМВ2, содержащей дополнительно 0.1 мМ EDTA и 0.005% PMSF (phenyl-metyl sulfonylfluoride) в течение 12 мин при комнатной температуре. Реснички латеральных клеток жабр выделяли обработкой жабр НМВЗ, содержащей 1 мМ EDTA и 0.0005% PMSF в течение 3 мин при комнатной температуре. Слизь и выделившиеся клетки осаждали при 1000 g в течение 5 мин. Осадок ресничек получали осаждением при 10000 g в течение 10 мин и затем дважды очищали дифференциальным 1000/10000 g центрифугированием. Реснички ресуспендировали в Трис-Mg растворе (30 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 3 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA и 0.001% PMSF) осаждали и хранили в жидком азоте.

Мембранную фракцию клеток сенсорного эпителия получали из АСО с удаленными ресничками, хранившихся в жидком азоте. После оттаивания АСО гомогенизировали в Трис-Mg растворе, и гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Мембраны из супернатанта осаждали при 10000 g в течение 10 мин и дважды очищали дифференциальным 1000/10000 g центрифугированием из Трис-Mg раствора.

Фракцию мембранных полипегггидов сенсорных ресничек АСО получали солюбилизацией ресничек в Трис-Mg растворе, содержащем 1% Тритона Х-100 при 0 "С в течение 30 мин. Суспензию затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин, супернатант собирали, а осадок подвергали процедуре экстракции еще дважды. Для определения доли мембранных полипептидов в ресничке определяли содержание белка в начальной суспензии ресничек и в солюбилизированных Тритоном Х-100 фракциях.

Электрофорез с додецилсульфатом натрия выполняли в линейном градиенте 5Т-15Т/2.6С полиакриламидного геля. Осадок ресничек (50-60 мкг белка) или мембранной фракции клеток АСО суспендировали в 5 мкл Трис-Mg раствора, содержащего 1% Тритона X-100, экстрагировали в течение 30 мин при 0-4 °С и осаждали при 15000 g в течение 30 мин. Супернатант тщательно обирали, а осадок экстрагировали в том же растворе в течение 60 мин при 0-4 °С и вновь осаждали. Смесь обоих супернатантов смешивали в соотношении 1:1 с электрофорезным буфером двойной концентрации. Осадок аксонем и интактных ресничек суспендировали в минимальном объеме одинарного электрофорезного буфера. Пробы выдерживали при 100 °С в течение 2 мин, охлаждали и наносили на гели микрошприцем.

Электрофорез проводили при 20 мА/гель. Затем белки фиксировали 50% трихлоруксусной кислотой и окрашивали 0.05% кумасси R-250 в 50% метанол-10% уксусной кислоте, обесцвечивали в 5% этанол-10% уксусной кислоте и хранили в 10% уксусной кислоте. При визуализации серебром гели предварительно обрабатывали 5% формамидом в смеси 25% этанола и 10% уксусной кислоты. Денситометрические измерения проводили на 2202 UltroScan Laser Densitometer с 2220 Integrator (LKB Producter AB).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфология абдоминального сенсорного органа

У исследованных видов двустворчатых моллюсков АСО располагается на поверхности заднего мускула-замыкателя рядом с анальным отверстием. У A. boucardi, А. broughtonii и С. gigas АСО лежит непосредственно на поверхности мантийного эпителия, покрывающего мускул-замыкатель, а у G. yessoensis он прикреплен к эпителию соединительнотканным валиком. У М. yessoensis и Ch. swifti АСО располагается на мантийной складке, к которой он прикреплен тканевой полоской. У A. boucardi и A. broughtonii имеется два АСО, которые располагаются симметрично относительно анального отверстия. У G. yessoensis, С. gigas, Ch. swifti, М. yessoensis АСО имеется только с правой

стороны. Форма ACO у разных видов различается незначительно. У СИ. swift и М. yessoensis ACO несколько вытянут и напоминает по форме банан. У A. boucardi, A. broughtonii. G. yessoensis и С. gigas ACO имеет овальную форму. Размер ACO в значительной степени зависит от вида и размера животного: у G. yessoensis и A. boucardi он не превышает 1.5-2 мм, а у крупных особей A. broughtonii и М. yessoensis достигает 6 мм вдоль длинной оси.

Невооруженным глазом можно видеть, что ACO окружен опалесцирующим ореолом из многочисленных сенсорных ресничек. При наблюдении в отраженном свете проксимальный участок сенсорных ресничек выглядит серебристо-голубым, а дистальный - красно-коричневым. Высота этих участков не одинакова и в разных частях органа колеблется от 60 до 100 мкм (голубой участок) и от 80 до 120 мкм (красно-коричневый участок).

Сенсорный эпителий ACO весьма однороден по клеточному составу. В нем преобладают тонкие веретенообразные сенсорные клетки с единствешой очень длинной (около 250 мкм) ресничкой. Кроме волосковых клеток в состав сенсорного эпителия входят секреторные клетки, имеющие на апикальной поверхности только микровиллы. На одну секреторную клетку приходится примерно 11-14 сенсорных. На периферии сенсорного эпителия очень редко встречаются клетки с многочисленными короткими (4-6 мкм) ресничками.

К началу наших исследований тонкое строение ACO было описано в лишь в двух электронномикроскопических работах, дающих представление об общем плане строения эпителия и сенсорных клеток ACO (Moir, 1977; Haszprunar, 1985). В настоящей работе особое внимание уделено детальному исследованию ультраструктуры сенсорной клетки и, в первую очередь, строению апикальной ее части, реснички и стереомикровилл (рис. 1).

В апикальной части латеральные мембраны соседних сенсорных клеток соединены друг с другом и секреторными клетками комплексом межклеточных контактов: адгезивных (zonula adherens), для которых характерны глубокие взаимные впячивания мембран, глубоко проникающих в тела клеток, и расположенных ниже септальных контактов.

Вокруг реснички

сенсорной клетки имеется девять стереовилл и несколько микровилл. Каждая из девяти стереовилл располагается напротив одной из внешних пар микротрубочек реснички. Стереовилла образует с ближайшей микровиллой

Рис. 1. Схема строения апикального участка сенсорной клетки и реснички абдоминального сенсорного органа.

а — апикальный участок сенсорной клетки; б, в и г -проксимальный, переходный и дистальный участки сенсорной реснички соответственно.

бт - базальное тельце, дм - мембранно-связанный диффузный материал, зс - звездообразная заякоривающая структура, к -корешки, мв — микровиллы, св — стереомикровиллы. Справа и слева на рисунке указаны размеры соответствующих структур.

пару, которая имеет общее короткое основание. Иногда пара стерео-микровилла сливаются у основания на протяжении до 1/3 своей длины. Длина стереовилл и микровилл составляет 2.02.5 мкм. Стереовиллы имеют выступ в виде овального плотного нароста, направленного к ресничке. Вдоль всего этого выступа располагается связанный с мембраной электроноплотный материал. Этот материал образует также электроноплотную шапочку в дистальной части стереовиллы. Мембрана вдоль выступа покрыта толстым рыхлым слоем.

Все волосковые структуры ACO - ресничка, стерео- и микровиллы - объединены системой фибрилл. Связи между соседними микро- и стереовиллами и между самими микровиллами не упорядочены, и они не отличаются от таковых в секреторных клетках. Напротив, девять стереовилл сенсорных клеток объединены отчетливо выраженными латеральными фибриллярными связями. Такие латеральные связи между окружающими ресничку стереовиллами характерны для воротничковых клеток беспозвоночных (Montalvo et al., 1996).

Особый интерес вызывают обнаруженные нами радиальные соединения между стереовиллами и сенсорной ресничкой (рис. 1). Они связывают электроноплотный материал мембраны базальной части реснички и электроноплотный материал мембраны стереовиллы. Эта горизонтальные связки, механически объединяющие ресничку и стереовиллы, напоминают те, которые описаны в волосковых клетках вестибулярного аппарата и улитки уха позвоночных (Neugebauer, Thurm, 1987).

Базальное тельце реснички снабжено многочисленными корешками, наиболее длинные из которых, проходя вдоль латеральной мембраны, достигают перинуклеарного пространства. Базальные ножки близлежащих клеток ориентированы параллельно друг другу. Такая пространственная организация этих структур свидетельствует о способности ресничек к метахрональному движению

Строение реснички неоднородно вдоль ее длины. Проксимальная часть на уровне микровилл выглядит наиболее жесткой из-за электроноплотного материала, ассоциированного с внешними девятью дублетами микротрубочек, и электроноплотного материала, связанного с мембраной. Диаметр реснички на этом участке на 40-50 нм больше, чем на участке, находящемся над уровнем микровилл. Выше, на протяжении примерно 100 мкм, ресничка имеет типичное строение с нормальным аксонемальным набором микротрубочек 9x2+2. Далее следует переходный участок, где структура реснички изменяется. Уменьшается расстояние между соседними периферическими дублетами микротрубочек и между центральным дублетом и кольцом периферических дублетов. Микротрубочки периферических аксонем все более смещаются к центру и занимают все внутреннее пространство реснички. Затем, вероятно, происходит диссоциация микротрубочек, и весь дистальный участок реснички оказывается заполненным однородным материалом. В результате диаметр реснички уменьшается до 80-100 нм. Примерно на уровне переходного участка обнаруживается связанный с внешней поверхностью мембраны диффузный материал, который присутствует далее на протяжении всего дистального участка реснички.

По ряду морфологических признаков ACO является уникальным сенсорным образованием. Это наиболее крупный из известных механорецепторных органов. Сенсорный эпителий ACO включает в себя более 4 миллионов сенсорных клеток, что в Ю0 раз больше, чем в ближайшем по этому параметру органе Корти. Необычно мало число вспомогательных клеток в сенсорном эпителии ACO, почти полностью состоящем из механосенсорных клеток. Сенсорные клетки доминируют в клеточном составе всего ACO. Характерной особенностью сенсорных клеток ACO является строение реснички - ее необычная длина, размеры и строение суженной дистальной части, которая структурно дезинтегрирована.

Биохимический состав абдоминального сенсорного органа

Доминирование сенсорных клеток в клеточном составе ACO позволяет считать, что биохимический состав органа в значительной степени отражает биохимический состав

механорецепторных клеток. Это обстоятельство дало нам возможность не только впервые определить липидный и полипептидный состав механосенсорного органа и сравнить его с биохимическим составом других органов и тканей моллюсков, но и получить данные, максимально близко отражающие липидный состав мембран механорецепторных клеток. Кроме того, большое количество сенсорных клеток в составе ACO и, соответственно, возможность выделения достаточного для анализа количества ресничек позволило также получить информацию о липидном и полипептидном составе этих органелл. Эти данные представляют особый интерес в связи с той важной ролью, которая отводится ресничке в рецепции механического стимула.

Липидный состав ACO. В таблице 1 приведены данные о содержании липидного и белкового компонентов абдоминального сенсорного органа и сенсорных ресничек ACO приморского гребешка.

Таблица 1. Содержание белков и липидов в абдоминальном сенсорном органе _приморского гребешка (п — число органов)_

Компоненты Целый орган Реснички

Фосфолипиды, мкг на 1 орган Белок, мкг на 1 орган 6.6 (п=246) 116 (п=17) 0.12 (п=270) 0.54 (п=139)

Молярное соотношение холестерин/фосфолипиды в ACO составляет 0.38 ±0.08 и практически не отличается от такового мантийных нервов - 0.3б±0.06.

Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и один из двух церамидаминоэтилфосфонатов (ЦАЭФ-1) составляют почти 90% всех фосфолипидов ACO гребешка и анадары. Второй церамидаминоэтилфосфонат (ЦАЭФ-2), фосфатидилинозит и дифосфатидилглицерин - минорные компоненты. Часть фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина ACO гребешка представлена в алкенилацильной форме. Сумма плазмалогенов приблизительно одинакова в сенсорном органе и нервах гребешка, хотя алкенилацилфосфатидилхолина в ACO меньше (р<0.05).

Соотношение фосфатидилэтаноламин/фосфатидилхолин в ACO приморского гребешка и анадары равно единице, в то время как во всех других органах моллюсков, кроме мантийных нервов, это соотношение меньше единицы. Липиды ACO гребешка содержат больше ненасыщенных жирных кислот, чем липиды мантийных нервов и висцерального ганглия. В липидах ACO почти в 1.5 раза больше полиеновых жирных кислот, чем в липидах нервов и ганглия.

В целом, липидный состав ACO имеет следующие особенности по сравнению с несенсорными тканями: во-первых, уменьшенное содержание фосфатидилхолина; во-вторых, относительно высокое содержание арахидоновой кислоты, более чем в 3 раза превышающее ее содержание в других тканях моллюсков; в-третьих, высокий уровень ненасыщенных жирных кислот; в-четвертых, относительно высокое содержание полиеновых жирных кислот.

Липидный состав ресничек ACO и ресничек латеральных клеток жабр. Фосфолипидный состав сенсорных и жаберных ресничек качественно сходен и различия касаются минорных компонентов мембраны (табл. 2). В ресничках ACO меньше холинсодержащих фосфолипидов и фосфатидилэтаноламина, но больше фосфатидилсерина и фосфатидилинозита. Интересно также, что два типа ресничек имеют различное соотношение двух основных аминоглицерофосфолипидов - фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, хотя их суммарное количество одинаково. Пониженное содержание фосфатидилэтаноламина в ресничках ACO компенсируется увеличением фосфатидилсерина. Хорошо известно, что процессы механобиоэлектрического преобразования протекают с участием ионов Са2*. Вероятно, увеличенное количество фосфатидилсерина и фосфатидилинозита в ресничках ACO может иметь значение в регуляции Са**-зависимых процессов. Отрицательно заряженные группировки фосфатидилсерина могут связывать Са2*

и, таким образом, играть роль буферной емкости для поступающих в ресничку ионов кальция. Оба типа ресничек содержат высокое количество (89%) аминофосфолипидов, что говорит о значительной доле этих липидов в составе внешнего слоя мембраны и, следовательно, о высокой электроотрицательное™ наружной ее стороны. Это обстоятельство может иметь значение в рефляции пространственных взаимоотношений между ресничками.

В целом сенсорные и жаберные реснички по набору фосфолипидов проявляют высокую степень сходства с хорошо изученными прежде ресничками одноклеточных и многоклеточных организмов. Это сходство состоит в обогащенности мембран ресничек сфингофосфоновыми липидами, этаноламиновыми глицерофосфолипидами и фосфатидилсерином, отсутствием дифосфатидилглицерина, обедненностью холин-содержащими фосфолипидами и фосфатидилинозитом. Появление на различных ступенях эволюционного развития одинаковых черт липидного состава позволяет говорить о его типичности для ресничек, а поэтому о существовании стабильных фундаментальных механизмов, формирующих лигидный состав ресничек.

Таблица 2. Фосфолипидный состав ресничек абдоминального сенсорного органа и жабр приморского гребешка (% от суммы всех фосфолипидов±стандартное _отклонение)_

Фосфолипиды Реснички ACO Реснички жабр

Фосфатидилэтаноламин 42.2±3.8 49.7± 2.2

Фосфатидилхолин 5.81 1.0 6.1± 0.6

Фосфатидилсерин 22.812.0 16.710.5

ЦАЭФ-1 16.9±3.0 14.7± 0.4

ЦАЭФ-2 3.4±2.6 5.2± 1.0

Фосфатидилинозит 2.1± 1.0 0.9± 0.2*

Лизофосфатидилэтаноламин 3.6± 1.6 2.3± 0.5

Лизофосфатидилхолин 0.21 0.2 2.210.3

Фосфатидная кислота 1.3+ 1.8 0.6± 0.4

Стартовая зона 1.5± 1.0 1.610.5

Сумма аминофосфолипидов 89.0± 4.7 88.711.6

Сумма холинофосфолипидов 6.0± 0.9 8.310.7"

Сумма сфингофосфолипидов 20.3± 1.3 19.910.6

Сумма фосфатидилэтаноламина и 65.1±5.1 66.911.9

фосфатидилсерина

Аминофосфолипиды/холинофосфо 15.15±2.81 10.8511.16*

липиды

Фосфатидилэтаноламин/фосфатиди 1.85±0.13 2.96+0.19"*

лсерин

Холестерин/фосфолипиды 0.60 0.6310.11

(моль/моль) (п=2; 0.59; 0.61)

Примечание. Различия достоверны при: *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001.

Вместе с тем следует отметить, что для мантийных нервов двустворчатых моллюсков также характерно уменьшенное содержание фосфатидилхолина, увеличенное содержание фосфатидилсерина и сфингофосфоновых липидов и меньшее, чем в других исследованных тканях, количество фосфатидилинозита. Таким образом, отмеченные особенности липидного состава ресничек, возможно, отражают общую закономерность в распределении липидов между сомой клетки и ее отростками.

Полипептидный состав ресничек. Полипептидный состав сенсорной реснички ACO и реснички латеральных клеток жабр двустворчатых моллюсков обнаруживает как сходные черты, так и ряд различий. Основной белок - аксонемальный тубулин - составляет

около 80% белка аксонем обоих типов ресничек (табл. 3). Аксонема сенсорной реснички ACO содержит заметно большее количество динеина (динеинподобного полипептида по классификации Стефенса) (Stephens, 1977), с молекулярной массой 300 кДа. Этот полипеггтид составляет 8.3% общего белка в целой ресничке ACO, тогда как в ресничке латеральных клеток жабр его содержание в 2.5 раза меньше. При этом в аксонемальной фракции ресничек ACO количество 300 кДа полипептида в 1.5 выше, чем в аксонемальной фракции ресничек жабр. Поскольку в мембранной фракции ресничек обоих типов этот полипептид не обнаруживается, можно говорить о том, что в ресничке ACO значительная часть динеинподобного полипептида или не связана, или слабо связана с аксонемой. Кроме того, два минорных полипептида с молекулярной массой 125 и 149 кДа обнаруживаются только в аксонемальной фракции ресничек ACO.

Таблица 3. Молекулярная масса и содержание основных полипептидов в целой ресничке, ее аксонеме и мембране ресничек сенсорных клеток ACO и латеральных клеток жабр приморского ___гребешка__

Тубулин Динеин

молекулярная содержание, молекулярная содержание,

Фракция Орган масса, кДа % масса, кДа %

Ресничка ACO 50 79.5 302 8.3

Ресничка Жабры 54 77.5 301 2.5

Аксонема ACO 49 76.5 295 3.7

Аксонема Жабры 51 82.5 293 2.5

Мембрана ACO 57 55.9 - 0

Мембрана Жабры 57 58.8 - 0

В целом, несмотря на отличия в составе минорных полипептидов, полипептидный состав аксонемы сенсорных ресничек ACO и ресничек латеральных клеток жабр сходен. В то же время, данные электронномикроскопических исследований свидетельствуют о значительных различиях в морфологической организации аксонем ресничек ACO и латеральных клеток жабр. В отличие от реснички жаберных клеток, примерно 50% длины сенсорной реснички ACO занимает ее дистальный участок, где аксонема не структурирована в виде микротрубочек, а представлена гомогенным электроноплотным материалом. Вместе с тем, содержание основных полипептидов в «классической» аксонеме ресничек жабр и в модифицированной аксонеме ресничек ACO сходно (табл. 3). Это сходство говорит о том, что гомогенный электроноплотный материал, заполняющий дистальную часть реснички ACO, скорее всего, представляет собой диссоциированный материал классической аксонемы.

Полипептиды мембраны составляют около 13% от всего белка реснички ACO и 15% белка реснички латеральных клеток жабр, в их составе доминирует мембранный (гликозилированный) тубулин с молекулярным весом 57 кДа (56-59%). Преобладание мембранного тубулина в составе белков мембран рассматривается как молекулярный маркер, отличающий мембрану реснички от мембраны жгутика (Dentier, 1981). Исходя из топологии этого белка, некоторые авторы отмечают его важную роль в построении скелета мембраны (Stephens et al., 1987). Показано, что мембранный тубулин соседствует с высокомолекулярным динеинподобным белком (Dentier et al., 1980), который, в свою очередь, является компонентом молекулярного комплекса, связывающего мембрану с внешними трубочками аксонемы. Авторы предположили, что этот комплекс обеспечивает транспортировку микрочастиц вдоль поверхности мембраны реснички. Впоследствии было показано, что, действительно, в состав молекулярного комплекса входят цитоплазматический динеин и кинезин-II, и этот комплекс обеспечивает внутриресничный транспорт (intraflagellar transport) частиц, необходимых для построения и обновления реснички (Rosenbaum, Witman, 2002).

Наиболее существенно полипегггидный состав мембран ресничек ACO и ресничек латеральных клеток жабр различается по содержанию полипептида с молекулярной массой 159 кДа. Он составляет 22.5% полипептидного состава мембраны сенсорной реснички, тогда как в мембране жаберной реснички этот белок содержится в следовых количествах. Возможно, что этот полипептид уникален, поскольку он не обнаружен в мембране ресничек различных организмов в исследованиях других авторов.

Первоначально, мы предположили, что более высокое, чем в жаберных ресничках, содержание 159 кДа-полипептида в мембране реснички ACO связано с большей, чем у жаберных клеток, чувствительностью рецепторных клеток этого органа к механическому стимулу (Sizov, Zhadan, 1989). Обнаружение в морфологических исследованиях диффузного материала, связанного с поверхностью мембраны дистального участка реснички, дает основание полагать, что этот материал является морфологическим коррелятом 159 кДа-полипептида в мембране реснички ACO.

Функциональные свойства абдоминального сенсорного органа и механорецепторов края мантии

Первая попытка выяснить функцию ACO была предпринята в поведенческих экспериментах Дакиным в 1910 году (Dakin, 1910). Однако ему не удалось выявить каких либо изменений в поведенческих реакциях моллюсков после удаления ACO. С того времени, функция ACO оставалась неизвестной вплоть до наших исследований. В электрофизиологических экспериментах мы исследовали функцию ACO у ряда видов двустворчатых моллюсков, однако ACO приморского гребешка оказался наиболее удобным из-за сравнительной легкости препарирования и манипулирования в опытах, а также вследствие высокой продолжительности (около 3 сут) сохранения своих функциональных свойств. Поэтому основная часть исследований была проведена именно на этом объекте.

В электрофизиологических экспериментах ACO приморского гребешка обнаруживает высокую чувствительность к механической стимуляции. При последовательном расщеплении ветви мантийного нерва, иннервирующего ACO, на тонкие веточки были выделены два типа ответов на вибростимуляцию в различном диапазоне частот. К первому типу относились ответы в нервных волокнах, демонстрирующие чувствительность органа в диапазоне частот от 16 до 1000-1200 Га Максимум чувствительности достигался в диапазоне 200-300 Гц, а минимальный порог реакции составлял 0.006 мкм. Во второй группе волокон ответ на вибрационный стимул регистрировался в более узком диапазоне частот- 200-340 Гц. Максимальная чувствительность рецепторов, иннервируемых этими волокнами, наблюдалась в диапазоне 100-150 Гц и составляла 0.8-2 мкм.

В экспериментах с удалением ACO и удалением ресничек с периферии органа было обнаружено, что высокая чувствительность ACO к вибрационным стимулам обеспечивается воротничковыми клетками с единственной длинной ресничкой. Эти клетки реагируют на вибрационный стимул в сравнительно широком частотном диапазоне - от 16 до 1200 Гц. Клетки с многочисленными короткими ресничками, располагающиеся на периферии ACO и прилегающей к нему тканевой полоске, менее чувствительны к механическому стимулу. Порог реакции на вибрационный стимул у них примерно на два порядка выше, чем у воротничковых клеток ACO, а верхняя граница диапазона воспринимаемых частот не превышает 300 Гц.

Сравнительные исследования частотно-пороговых характеристик ACO разных видов двустворчатых моллюсков показал, что наибольшей чувствительностью к вибрационным колебаниям обладал G. yessoensis, затем по степени возрастания амплитуды порогового стимула следовали: М. yessoensis = Ch. swifii < С. gigas = A. boucardi < А. broughtonii. Диапазон воспринимаемых частот у перечисленных видов отличался незначительно. Он был максимальным (от 16 до 1200 Гц) у G. yessoensis и минимальным (от 16 до 850 Гц) у А. broughtonii. Основные характеристики ответов ACO разных видов двустворчатых моллюсков были сходными с таковыми у приморского гребешка Так,

чувствительность к вибрации была максимальной, если наконечник стимулятора располагался у основания ACO и был в тесном контакте с подстилающей орган тканью. Для всех вышеперечисленных видов характерен максимум чувствительности к вибрации в пределах 150— 300 Гц.

В сравнении с другими волосковыми рецепторами сенсорные клетки ACO по чувствительности к механическому стимулу можно отнести к наиболее чувствительным сенсорам. Их чувствительность близка к чувствительности механосенсорных клеток таких высокоспециализированных механорецепторных органов как органы слуха позвоночных животных, достигающей 0.0006 мкм (Hudspeth, 1997), и кутикулярных механорецепторов насекомых, по разным данным составляющей 0.001-0.002 мкм (Thurm, 1983; Walker et al., 2000). Чувствительность механосенсорных клеток ACO заметно выше, чем у механорецепторов боковой линии рыб - 3.3 мкм (Sand, 1981), ресничных механорецепторных клеток каракатицы -0.06 мкм (Bleckmann et al., 1991), волосковых клеток статоциста осьминога - 0.12 мкм (Williamson, 1988), клеток механорецепторного комплекса морского анемона - около 1 мкм (Watson, Mire, 1999). Это говорит о том, что ACO двустворчатых моллюсков является высокоспециализированным механорецепторным органом, способным обеспечивать высокую чувствительность животных к механическим колебаниям в водной среде.

Рецепторный потенциал сенсорных клеток абдоминального сенсорного органа. Механорецепторные клетки ACO имеют в диаметре около 1 мкм, что не дает возможности использовать микроэлектроды для внутриклеточной регистрации электрической активности. Как альтернативу этому методу мы использовали экстраклеточную регистрацию рецепторного потенциала с помощью микроэлектродов.

При погружении микроэлектрода в сенсорный эпителий ACO на глубину около 10 мкм регистрировался постоянный трансэпителиальный потенциал +10-+15 мВ. Вибростимуляция органа сопровождалась рецепторным потенциалом, частота которого при низких частотах (20400 Гц) совпадала с частой стимуляции. При более высоких частотах в начальный момент подачи стимула частота рецепторного потенциала отличалась от частоты стимула. Это несовпадение частот обуславливалось суммацией потенциалов. Прекращение стимуляции сопровождалось гиперполяризационным ответом. Латентное время рецепторного потенциала варьировало в пределах 2.2-3.2 мс и, таким образом, оно намного больше, чем в волосковых клетках позвоночных животных - 40 мкс (Crawford et al., 1989) и чувствительных волосков насекомых - 200 мкс (Walker et al., 2000), но сопоставимо с латентным временем ресничных клеток у хордотональных сенсилл - 1.2 мс (Eberl et al., 2000).

В генерации рецепторного потенциала волосковых клеток ACO, по-видимому, принимают участие два катиона - Na* и Са2+. Замена во внеклеточной среде NaCl на холин-хлорид сопровождалась значительным снижением амплитуды рецепторного ответа, однако полного его подавления в среде без Na* не происходило. Сходная картина наблюдалась также и при удалении из внешней среды Са2+ — амплитуда рецепторного потенциала снижалась на 7080%. При быстром восстановлении исходной среды величина рецепторного потенциала восстанавливалась.

В этом отношении сенсорные клетки ACO оказались отличными от рецепторных клеток статоцистов головоногих моллюсков, у которых Na*, но не Са2+, принимает участие в генерации рецепторного потенциала (Stommel et al., 1980). Напротив, в латеральных клетках жабр двустворчатых моллюсков рецепторный потенциал имеет кальциевую природу, в то время как ионы натрия вовлечены в генерацию регенеративного ответа (Saimi et al., 1983).

Функциональные свойства и некоторые морфологические характеристики механорецепторов края мантии. Для понимания роли ACO в биологии двустворчатых моллюсков представлялось интересным сравнить его функциональные свойства со свойствами механорецепторов края мантии. Известно, что эта область богата сенсорными структурами (Stephens, 1978; Frenkiel, 1980). На глазных щупальцах расположены органы зрения - глазки; кроме глазных щупалец, здесь имеются три типа не специализированных

щупалец. Край мантии, как и ACO, получает иннервацию от висцерального ганглия, и ACO наряду с рецепторами края мантии включены в единую систему обработки сенсорной информации о состоянии внешней среды.

В составе коротких и длинных щупалец имеются клетки с короткими ресничками, функция которых остается в значительной степени не известной. В ранних работах (Dakin, 1910; Moir, 1977) эти клетки по морфологическим признакам были отнесены к сенсорным клеткам с предположительно механосенсорной функцией. Результаты наших морфологических исследований в основном согласуются с результатами этих исследований.

Электрофизиологические исследования механорецепторов края мантии показали, что механическая стимуляция больших и малых щупалец сопровождалась импульсной реакцией в радиальном нерве. Их чувствительность гак к вибрационным, так и к одиночным механическим толчкам оказалась существенно ниже, чем у сенсорных клеток ACO. При дистанционном способе стимуляции (когда наконечник стимулятора находился вблизи, но не касался щупальца) пороги на вибрационный стимул для больших и малых щупалец находились в пределах от 1.5 до 25 мкм, а частотный диапазон воспринимаемых ими колебаний составил 16260 Гц. Реакция больших и малых щупалец на вибрационный стимул имела фазово-тоничный характер. Средние щупальца не обнаруживали чувствительности к дистанционным вибрационным стимулам, но от прикосновения сокращались, и это сопровождалось редкой импульсной активностью в радиальном нерве.

Исследование функции абдоминального сенсорного органа в поведенческих экспериментах. Роль ACO в поведенческих экспериментах была исследована на двух видах двустворчатых моллюсков - М. yessoensis и СА. swifii. Оказалось, что оба вида моллюсков обладают слабой дирекционной чувствительностью к вибрационным колебаниям в водной среде. При этом они наиболее чувствительны к колебаниям, источник которых расположен сверху (со стороны левой створки) и смещен в антеро-дорсальном направлении. Это, по-видимому, не лишено биологического смысла. С вентральной, вентро-антеральной и вентро-каудальной сторон моллюски имеют хорошее сенсорное обеспечение (многочисленные глазки, малые и большие щупальца края мантии), отсутствующее с дорсальной (замковой) стороны. Поэтому получение дополнительной сенсорной информации с этой стороны целесообразно, поскольку у животного появляется возможность обнаружить приближающихся сверху хищников, детектируя создаваемые ими колебания в водной среде.

Направленная чувствительность к колебаниям в водной среде, обнаруженная в поведенческих экспериментах, обусловлена присутствием у двухстворчатых моллюсков ACO, поскольку его удаление лишало животных этой чувствительности и вместе с тем значительно (почти в 20 раз) увеличивало порог поведенческой реакции на вибрационный стимул.

В поведенческих экспериментах было обнаружено, что гребешки способны воспринимать модулированные колебания ультразвуковой частоты в тех случаях, когда частота модуляции лежит в пределах 30-1000 Гц. Это явление потребовало дополнительного анализа. Оказалось, что модулированный ультразвук вызывает слабые колебания створок раковины моллюсков с частотой, равной частоте модуляции.

Таким образом, если сопоставить данные поведенческих и электрофизиологических экспериментов, то можно заключить, что механорецепторная система, включающая ACO и механорецепторы края мантии, имеет двухуровневый характер чувствительности. Более чувствительные механорецепторные клетки ACO обеспечивают восприятие слабого сигнала и, соответственно, детектируют источник этого сигнала на более далеком расстоянии, чем менее чувствительные клетки мантии и тканевой полоски. При этом наличие раковины существенно увеличивает частотный диапазон воспринимаемых колебаний.

Фармакологические свойства абдоминального сенсорного органа

По своим функциональным свойствам ACO близок другим высокоспециализированным механорецепторным органам. Поэтому представлялось

интересным провести исследование фармакологических свойств этого образования и сравнить их со свойствами других механорецепторов. Такие сравнительные исследования, направленные на поиск общих блокаторов и активаторов процесса механотрансдукции, могут дать сведения о молекулярной организации механочувствительного кашла в воротничковых клетках ACO.

Полученные результаты показывают, что по своим фармакологическим характеристикам сенсорные клетки ACO существенно отличаются от других механорецепторных клеток, несущих на апикальной поверхности волоски (стереоцилии) или реснички. Обладая высокой чувствительностью к механическим колебаниям, сенсорные клетки ACO не имеют механизма, обеспечивающего дополнительный трансмембранный электрохимический потенциал, который в волосковых клетках позвоночных животных и кутикулярных механорецепторах членистоногих создается повышенным содержанием К+ в среде, омывающей апикальную часть сенсорных клеток.

Эффект блокаторов механотрансдукционных каналов. Существенные отличия имеются у механорецепторных клеток ACO и в отношении их чувствительности к известным блокаторам механочувствительных каналов. Сенсорные клетки ACO почти не чувствительны к амилориду. Амилорид и его производные фенамил и 3',4'-дихлоробензамил не оказывали никакого влияния на чувствительность ACO к механическому стимулу при концентрации вплоть до 2 мМ. 5-(Ы-этил-Ы-изопропил)амилорид, обладающий наибольшей специфичностью к Na+/H+ обменнику, уменьшал амплитуду суммарного импульсного ответа на 50% при концентрации 680 мкМ. Еще меньшей ингибирующей способностью обладал 5-(NN-диметил)амилорид. При концентрации 2 мМ он снижал амплитуду суммарного импульсного ответа только на 30%. Таким образом, чувствительность сенсорных клеток к амилориду и его производным оказалась близка к максимально достижимой концентрации этих веществ в воде, что делает амилорид и его производные не очень удобным инструментом для исследований функции ACO.

Чувствительность к аминогликозидным антибиотикам (стрептомицина сульфат, дигидрострептомицину, гентамицину и неомицину) у ACO оказалась на 2-3 порядка ниже, чем у большинства волосковых и ресничных клеток: 50% ингибирование ответа ACO достигалось при концентрации антибиотиков 8-10 мМ. Можно было бы думать, что эта особенность обусловлена средой обитания. Морская вода по ионному составу значительно отличается от жидкостей, омывающих волосковые механорецепторы позвоночных животных. Однако имеется пример того, что рецепторный потенциал механорецепторов морских животных подавляется дигидрострептомицином в концентрации, близкой к таковой для механорецепторов позвоночных животных: всего 100 мкМ дигидрострептомицина полностью блокировали рецепторный потенциал в механорецепторном комплексе морского анемона (Mire, Watson, 1997). По чувствительности к аминогликозидным антибиотикам механосенсорные клетки ACO близки к ресничным клеткам статоцистов кальмара, для которых блокирующая механочувствительные каналы концентрация превышает 10 мМ (Williamson, 1990).

Для широкого спектра механочувствительных ионных каналов (принадлежащих не только сенсорным клеткам, но и половым, мышечным, клеткам крови и др.) характерные блокирующие концентрации лантаноидов лежат, в основном, в пределах 1-20 мкМ (Hamill, McBride, 1996). Полученная нами величина в 300 мкМ существенно выше этих значений. Флуоресцентный липофильный краситель FM 1-43, диаметр молекулы которого близок диаметру иона Caï+, вызывает блокаду механочувствительного канала волосковых клеток при концентрации 6 мкМ (Gale et al., 2001; Meyers et al., 2003). Проведенные нами исследования показали, что FM 1-43 обратимо блокировал механочувствительность ACO лишь в концентрации 150 мкМ. Ионы Cd2+ и Со2*, неспецифические блокаторы потенциал-зависимых кальциевых и механочувствительных каналов, вызывали полную блокаду рецепторного потенциала сенсорных клеток ACO при концентрации 10 и 30 мМ

соответственно, что говорит о неспецифичности их действия и в отношении сенсорных клеток ACO.

Все эти данные свидетельствуют о том, что, вероятней всего, механочувствительные каналы ресничных клеток ACO отличаются по своим свойствам от большинства известных механопреобразующих каналов. То обстоятельство, что ответ сенсорных клеток на механический стимул подавлялся при достаточно низких концентрациях дигидропиридинов (D600 - 3*10"* M и нифвдипина - 5x10"* М) - блокаторов потенциал чувствительных Са2+-каналов L-типа, может свидетельствовать о том, что механотрансдукционные каналы сенсорных клеток ACO по своим свойствам близки к этому типу каналов, или о том, что в мембране присутствуют потенциал-чувствительные каналы L-типа, которые вносят свой вклад в регенеративный компонент ответа механорецепторных клеток.

Эффект удаления ионов кальция. Ионы кальция играют особое место в осуществлении механотрансдукции во всех механорецепторных системах (см. обзоры: Hamill, Martinac, 2001; Hudspeth, 2005; Iqbal, Zaidi, 2005). Помимо того, что Са2+ является переносчиком значительной части тока через механоуправляемые каналы, он также играет ключевую роль в процессах адаптации и регуляции чувствительности механочувствительных каналов. Присутствие Са2+ необходимо для поддержания системы управления механотрансдукционными каналами. Полное удаление Са2* из среды вызывает разрушение верхушечных связей (tip-links) - филаментов, управляющих воротным механизмом механочувствительного канала в волосковых клетках позвоночных (Crawford et al., 1991; Zhao et al., 1996) и беспозвоночных животных (Watson et al, 1999; Watson, Mire, 2001).

Кратковременное (1-1.5 мин) удаление CaJ* из среды примерно на 70% обратимо снижало величину рецепторного потенциала клеток ACO и амплитуду суммарного импульсного ответа в нерве. Более продолжительное воздействие среды без ионов кальция сопровождалось значительной по продолжительности (12-24 ч) потерей механочувствительности ACO.

Как уже говорилось выше, подобное воздействие разрушает tip-links в волосковых клетках позвоночных животных, что, предположительно, ведет к потере управления механотрансдукционными каналами (Osborne, Comis, 1990; Meyer et al., 1998; Watson et al., 1998). Наши морфологические исследования не выявили структур, подобных tip-links, в области кончиков ресничек ACO. Вместе с тем, была выявлена система микрофиламентов, объединяющих основание реснички и окружающие ее стереомикровиллы. Однако ниже будут представлены доказательства того, что проксимальный участок реснички вряд ли может быть местом, где происходит процесс механобиоэлектрического преобразования, и, следовательно, сомнительным представляется предположение, что разрушением этой системы может быть объяснен эффект бескальциевой среды. Тем не менее, длительная потеря механочувствительности сенсорными клетками ACO после удаления из среды Са2*, вероятно, свидетельствует о том, что происходит разрушение (диссоциация) каких-то структур, ответственных за восприятие механического стимула.

Эффект протеаз. Верхушечные связи в волосксвых механорецепторах позвоночных животных разрушают также эластаза и ионы La3\ Но эластаза в наших экспериментах не оказывала никакого влияния на механочувствительность клеток ACO, а блокирующий эффект La3+ был полностью обратимым. Коллагеназа также не влияла на механочувствительность ACO. Следовательно, либо процесс преобразования механического стимула в сенсорных клетках ACO не включает в себя известные для других механорецепторов внеклеточные структуры, управляющие механотрансдукционными каналами, либо они по какой-то причине не доступны для этих воздействий. Вместе с тем, проназа и трипсин в концентрации 0.1 и 1 мг/мл соответственно медленно и необратимо ингибфовали механочувствительность ACO.

Эффект модуляторов внутриклеточного метаболизма. Предпосылкой для исследования возможного участия системы обмена инозитольных фосфолипидов в функционировании ACO послужили ранние работы, в которых было показано, что звуковая

стимуляция рецепторных клеток моли и волосковых клеток органа Корти увеличивает включение радиоактивного фосфора в трифосфоинозитиды (Kilian, Schacht, 1980; Yanagisawa et al., 1982) и стимулирует их распад (Ono, Schacht, 1989).

В элеюрофизиологических экспериментах мы исследовали влияние функциональных аналогов диглицерида ТРА (phorbol 12-myristate 13-acetate) и OAG (l-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol) с тем, чтобы проверить возможное участие протеинкиназы С в регуляции чувствительности сенсорных клеток ACO. Оказалось, что ни ТРА, ни OAG в концентрациях 1 х10"'2-1 хЮ"6 M и lxlC^xlO"4 M соответственно не влияли на чувствительность ACO к механическому стимулу. Эти данные свидетельствуют о том, что диацилглицерид-зависимая протеинкиназа С, вероятно, не участвует в регуляции процесса механобиоэлектрического преобразования в сенсорных клетках ACO.

В настоящее время роль цАМФ в регуляции механорецепторной функции волосковых клеток позвоночных животных не вызывает сомнений (Drescher et al., 1995; Ricci, Fettiplace, 1997; Jagger, Ashmore, 1999; Martin et al., 2003). Показано, что цАМФ и связанные с ним ферменты, в основном, обеспечивают регуляцию проводимости каналов, активности ионообменников и состояния цитоскелета. Роль цГМФ в регуляции механорецепторной функции менее исследована, хотя имеются сведения об участии этого нуклеотида в регуляции подвижности волосковых клеток, вызванной электрической стимуляцией (Deak et al., 2005), и проводимости каналов (Chen, Eatock, 2000) волосковых клеток позвоночных животных. В то же время данные об участии системы обмена циклических нуклеотидов в регуляции функции механосенсорных клеток беспозвоючных животных к началу наших исследований практически отсутствовали.

Для исследований роли цГМФ в регуляции чувствительности механосенсорных клеток ACO мы использовали нитропруссид натрия и дибутирил-цАМФ. Известно, что нитропруссид натрия может влиять на функционирование механорецепторных клеток тремя путями. Во-первых, он может оказывать токсичное действие из-за выделения цианидов (Ruan et al., 1999). Во-вторых, нитропруссид натрия является донором NO и может через эту молекулу непосредственно влиять на метаболизм клетки и ионную проницаемость ее мембраны (Chen et al., 1995; Takumida et al., 2000). В-третих, повышение концентрации NO может стимулировать растворимую гуанилатциклазу и, соответственно, вызывать увеличение концентрации цГМФ (Garthwaite, Boulton, 1995; Chen, Eatock, 2000), и уже через цГМФ-зависимые протеинкиназы влиять на функционирование механорецепторных клеток. Радиоиммунологические исследования показали, что нитропруссид натрия увеличивал содержание цГМФ в клетках ACO, но это увеличение не проявлялось в реакции ACO на механический стимул.

Отсутствие влияния повышения содержания цГМФ на механочувствительность ACO, вероятно, не позволяет утверждать, что этот нуклеотид не участвует в регуляции функции сенсорных клеток ACO, а может указывать на более опосредованную роль гГМФ.

Вещества, вызывающие увеличение содержания цАМФ, в значительной степени изменяли функциональное состояние ACO. При этом были выявлены три эффекта, сопровождающие увеличение уровня цАМФ в клетках ACO: во-первых, изменение чувствительности ACO к механическому стимулу; во-вторых, возникновение ритмической активности сенсорных ресничек в направлении длинной оси органа; в-третьих, изменение геометрических размеров сенсорного эпителия. При этом изменение геометрии сенсорного эпителия всегда сопровождалось изменением чувствительности ACO к механическому стимулу. В большинстве случаев воздействие веществ, вызывающих повышение внутриклеточного уровня цАМФ (дибутирил-цАМФ, теофилина, форсколина, IBMX, серотонина и трипсина в концентрации 0.1 мг/мл), сопровождалось одиночным циклом, состоящим из начального увеличения ответа на механический стимул с дальнейшим восстановлением исходной чувствительности. Но в некоторых случаях чувствительность ACO к механическому стимулу периодически возрастала и уменьшалась. Так, амплитуда суммарных импульсных ответов ACO на тестовые механические стимулы в присутствии

серотонина изменялась в 1.4—1.9 раза относительно среднего уровня (рис. 26). Синхронно с изменением чувствительности к механическому стимулу изменялись линейные размеры ACO. Так, длина ACO в присутствии 1 л 10"7-3 * 10"6 М серотонина увеличивалась на 4-9%. Оказалось, что и в норме геометрические размеры сенсорного эпителия ACO постоянно изменяются, но гораздо в меньших пределах - изменение размера органа вдоль длинной оси составляет всего 1-1.5%. Амплитуда суммарных импульсных ответов на тестовую механическую стимуляцию несколько варьировала, но отчетливой синхронизации между изменениями геометрии сенсорного эпителия ACO и вариациями амплитуды ответа не наблюдалось (рис. 2а). В морфологических исследованиях ACO (см. выше) мы не обнаружили каких-либо сократительных структур (например, гладкомышечных волокон), которые могли бы быть ответственными за сократительную активность сенсорного эпителия. Поэтому можно полагать, что изменение геометрических размеров сенсорного эпителия ACO обусловлено сократительной активностью самих сенсорных клеток.

В доступной нам литературе мы не нашли свидетельств того, что механосенсорные клетки моллюсков способны к сокращению. Вместе с тем хорошо известно, что наружные волосковые клетки органов слуха позвоночных животных могут изменять свою длину при их электрической стимуляции или аппликации ацетилхолина (Brownell et al., 1985; Brownell, 1990; Dulon, Schacht, 1992; Kalinec et al., 1992). При этом деполяризация клетки вызывает уменьшение длины клетки, а гиперполяризация — увеличение. Такая сократительная активность, обусловленная электромеханическим преобразованием в белках, встроенных в латеральную плазматическую мембрану клетки, регулируется цАМФ- и калмодулин-зависимыми протеинкиназами ( Minamino et al., 1998; Deak et al., 2005).

Изменение геометрических размеров сенсорного эпителия ACO можно вызвать

добавлением в среду хлористого калия или антидромной стимуляцией сенсорных клеток через иннервирующий орган нерв. Это указывает на то, что мембраны сенсорных клеток ACO так же, как и мембраны волосковых клеток позво-ночных животных, могут содержать белки, обеспечивающие электромеханическое преобразование. О сходстве

Рис. 2. Периодические изменения продольного размера абдоминального сенсорного органа (ACO) и его чувствительности к

механическому стимулу в натуральной морской воде (а) и в присутствии 2x1o-6 М серотонина (б).

Амплитуда суммарного импульсного ответа и размер ACO вдоль длинной оси приведены в относительных единицах. За единицу принят начальный уровень соответствующих

величин.

процессов, лежащих в основе сократимости сенсорного эпителия ACO и волосковых клеток позвоночных животных, свидетельствует ингибирование механической активности ACO блокатором протеинкиназ - толбутамидом - и блокаторами калмодулина - трифторперазином и калмидозолиумом.

Имеющиеся данные позволяют обсудить два механизма, по которому повышение содержания цАМФ могло оказывать влияние на чувствительность ACO к механическому стимулу. Первый механизм, вероятно, связан с цАМФ-зависимым фосфорилированием. Известно, что одним из звеньев в процессе механорецепции, которое регулируется цАМФ-зависимым фосфорилированием, является проводимость ионных каналов мембраны рецепторных клеток. Такое влияние описано для механотрансдукционных и потенциал-чувствительных каналов волосковых клеток позвоночных животных (Ricci, Fettiplace, 1997; Jagger, Ashmore, 1999; Chambard, Ashmore, 2005). Второй механизм, вероятно, также включающий цАМФ-зависимое фосфорилирование, может быть связан с изменением состояния (геометрических параметров) сенсорного эпителия. О том, что изменение геометрических характеристик сенсорного эпителия может влиять на эффективность восприятия механического стимула, в первую очередь, свидетельствует синхронизация этих процессов.

Если получение доказательств суиествования первого механизма (прямых измерений проводимости каналов в условиях их фосфорилирования) не представлялось возможным по методическим причинам, то участие второго механизма в регуляции чувствительности ACO к механическому стимулу было рассмотрено нами детально.

Воздействия, приводящие к увеличению концентрации внутриклеточного цАМФ, помимо сократительной активности сенсорного эпителия, стимулировали двигательную активность сенсорных ресничек. Тот факт, что в норме неподвижные реснички ACO проявляют способность к биению, выглядит закономерным в свете установленной Гибонсом закономерности (Gibbons, 1961), что если центральные аксонемы и базальные ножки ресничек ориентированы в одном направлении, то это свидетельствует об их способности к метахрональному движению. Кроме того, давно известно, что серотонин является регулятором биения ресничек эпителиальных клеток у многих видов животных: латеральных клеток жабр мидий Mytilus edulis (Saimi et al., 1983), клеток подошвы ноги брюхоногих моллюсков Tritonia diomedea (Audesirk et al., 1979) и Lymnea stagnatís (Syed, Winlow, 1989), слизистой неба лягушки (Maruyama et al., 1984), личинок морского ежа (Mogami et al., 1992), эмбрионов брюхоногого моллюска Helisoma trivolvis (Doran et al., 2004), и др. Во многих случаях действие серотонина опосредуется системой обмена циклических нуклеотидов (Murakami, 1983, 1987; Bergles, Tamm, 1992; Lansley et al., 1992; Walczak, Nelson, 1994).

Однако какова связь между повышением чувствительности ACO к механическому стимулу, изменением геометрических параметров сенсорного эпителия и биением ресничек?

В экспериментах со стимуляцией ACO в двух плоскостях обнаружено, что повышение чувствительности под воздействием веществ, увеличивающих уровень цАМФ в клетках ACO, наблюдается в большей степени к механическому стимулу, направленному в плоскости биения ресничек. Можно предположить, что жесткость реснички в направлении биения меняется и это влияет на чувствительность механосенсорных клеток. Однако в морфологических исследованиях мы показали, что ресничка сенсорной клетки ACO отличается по своему строению от классической реснички. Аксонема в дистальной части реснички (около 50% длины реснички) заполнена гомогенным материалом и не имеет морфологических признаков поляризации. Следовательно, жесткость этой части реснички должна быть одинакова независимо от направления изгиба. Кроме того, известно, что, например, ресничка механочувствительных латеральных клеток жабр имеет одинаковую жесткость вдоль всей ее длины независимо от того, проводились ли эти измерения в плоскости биения или в любом другом направлении (Baba, 1972).

Наконец, преимущественное повышение чувствительности ACO к механическому стимулу, совпадающему с плоскостью биения ресничек, наблюдалось независимо от того,

происходило ли биение ресничек или нет. Таким образом, предположение о том, что изменение жесткости ресничек может быть причиной повышения чувствительности сенсорных клеток ACO, выглядит малоубедительным.

Сопоставление характера изменений геометрии сенсорного эпителия и реакции ACO на механический стимул показало, что постоянным фактором, связывающим чувствительность органа и сократительную активность в сенсорном эпителии, является изменение кривизны поверхности сенсорного органа. Увеличение кривизны сенсорного эпителия сопровождалось снижением чувствительности ACO к механическому стимулу, а ее уменьшение — увеличением чувствительности. К увеличению чувствительности приводило также и сжатие сенсорного эпителия без изменения кривизны поверхности сенсорного эпителия. Если учесть, что увеличение кривизны сенсорного эпителия приводит к увеличению расстояния между кончиками ресничек, а ее уменьшение, напротив, к уменьшению этого расстояния, то естественно предположить, что именно этот параметр и является одним из факторов, влияющим на чувствительность ACO. Доказательства того, что изменение расстояния между ресничками влияет на чувствительность ACO к механическому стимулу, будут приведены ниже.

В целом, в способности сенсорного эпителия ACO изменять свои геометрические размеры может заключаться ранее неизвестный механизм регуляции чувствительности ресничных клеток.

В естественных условиях животные встречаются с различными по интенсивности механическим воздействиями. В связи с этим большое значение имеет способность их сенсорных приборов осуществлять тонкую настройку чувствительности в соответствии с имеющимся на данный момент фоновым уровнем. Периодические изменения геометрических параметров сенсорного эпителия, которые могут приводить к изменению расстояния между ресничками и, соответственно, к изменению чувствительности ACO, свидетельствуют принципиальной возможности существования такого механизма тонкой настройки. Реализуют ли двустворчатые моллюски, имеющие ACO, такого рода механизм регуляции чувствительности, предстоит еще выяснить. Тот факт, что сократительная активность сенсорного эпителия может быть усилена серотонином - широко распространенным медиатором нервной системы двустворчатых моллюсков, говорит о возможности такой регуляции.

Исследование роли реснички в восприятии механического стимула

До сих пор спорным остается вопрос о роли реснички в восприятии механического стимула С одной стороны, накоплен значительный экспериментальный материал, указывающий на то, что вторичная ресничка (ресничка с полным набором микрофилача ггов 9*2+2) является пассивным элементом, передающим механический сигнал к соме клетки (Hudspeth, Jacobs, 1979; Stommel et al., 1980; Machemcr-Rohnisch, Machemer, 1984; Pape, Machcmcr, 1986; Krüppel etal., 1993). С другой стороны, более поздние исследования, проведенные на механорецегпорач, имеющих первичную ресничку (модифицированную ресничку с аксонемальным набором 9*2+0), показали, что процесс механопреобразования, по-видимому, протекает на цилиарной мембране (Yoshimura, 1996, 1998; Jalali et al., 2001; Pazour, Witman, 2003) и что ресничка, вероятно, является активным элеме!гшм, непосредственно участвующим в преобразовании механического стимула в электрический сигнал.

Исследование роли реснички в процессе ее регенерации. Необычно длинная для механосенсорных клеток (более 200 мкм) ресничка ACO может служить эффективной антенной для восприятия колебаний в водной среде. Чем больше длина, тем более высоким гидродинамическим сопротивлением ресничка обладает и в большей степени она способна смещаться под воздействием колебаний окружающей среды. Одним из возможных путей выяснения роли реснички и ее размера в рецепции механического стимула является исследование явлений, связанных с удалением реснички и последующим

восстановлением функциональных характеристик механорецепторных клеток в процессе ее регенерации.

Мы исследовали последствия удаления ресничек у сенсорных клеток ACO у двух видов двустворчатых моллюсков - приморского гребешка М. yessoensis и глицимериса С. yessoensis. Реснички ACO удаляли непосредственно в эксперименте либо быстрым снижением температуры, либо переводом органа в гиперосмотическую среду с одновременной механической стимуляцией. Сразу после удаления ресничек чувствительность ACO к дистанционным стимулам, когда наконечник стимулятора находился на некотором расстоянии от поверхности органа, уменьшалась более чем в 100 раз у гребешка и более чем в 50 раз у глицимериса. При нанесении стимула непосредственно на апикальную поверхность сенсорных клеток чувствительность ACO снижалась было меньшим в 50 и 20 раз у гребешка и глицимериса соответственно.

Этот результат свидетельствует о том, что чувствительность механорецепторной клетки ACO в значительной части определяется наличием реснички. Однако он не дает оснований говорить о том, какую роль играет ресничка: пассивную - как устройство, передающее механический стимул к соме клетки, или активную - как преобразователь механического стимула в электрический сигнал. Мы судили о снижении чувствительности по порогу возникновения нервных импульсов. Их генерация зависит от величины генераторного потенциала, который инициируется рецепторным потенциалом, зависящим от активации механочувствительных каналов. Поэтому если в мембране реснички имеются потенциал-зависимые каналы, принимающие участие в формировании генераторного потенциала, то удаление реснички неизбежно должно вести к снижению порога импульсной реакции на механический стимул. Известно, что в мембране ресничек простейших могут находиться как механочувствительные, так и потенциал-чувствительные каналы (Erhrlich et al., 1984; Yoshimura, 1996, 1998).

Возможность исследовать роль реснички в процессе ее длительной и полной регенерации представилась после того, как мы обнаружили, что реснички ACO глицимериса могут быть полностью удалены легким постукиванием по переднему краю раковины. Затем реснички в течение месяца регенерировали со скоростью около 0.52 мкм/ч, что позволило исследовать функциональные свойства механорецепторных клеток в отсутствие ресничек и на разных стадиях их регенерации.

Оказалось, что в процессе регенерации ресничек восстановление механочувствительности начиналось не одновременно с началом их регенерации. На протяжении первых 5 сут, когда длина ресничек возрастала примерно до 50 мкм, чувствительность оставалась практически постоянной. Увеличение чувствительности, по сравнению с только что дециллиированным органом, проявлялось, когда длина ресничек достигала 80 мкм и заметным становилось наличие их тонких дистальных участков. Затем чувствительность механорецепторных клеток постепенно возрастала и через 25-30 сут восстанавливалась до ее уровня у контрольных животных. Отсутствие изменений чувствительности ACO к механическому стимулу на ранних стадиях цилиогенеза, вплоть до появления тонкого дистального участка реснички, говорит о важной роли этого участка в восприятии механического стимула. Интересно, что в исследованиях на латеральных клетках жабр мидии был получен сходный результат - механочувствительность этих клеток появляется на поздних стадиях цилиогенеза, уже после появления подвижности у ресничек (Good et al., 1990). Вместе с тем очевидно, что прямая зависимость между длиной реснички и чувствительностью сенсорных клеток к механическому стимулу является прямым указанием на то, что необычно длинная ресничка сенсорных клеток ACO может рассматриваться как одно из эволюционных приспособлений, обеспечивающих сенсорным клеткам ACO высокую чувствительность к вибрационным колебаниям в водной среде.

Использование антител в исследованиях роли реснички в восприятии механического стимула. Более детальные представления о функции реснички ACO, на наш

взгляд, могли быть получены с применением антител против молекул, располагающихся на поверхности реснички и, предположительно, в той или иной степени участвующих в процессе механобиоэлеюрического преобразования. Предполагалось, что связывание антител с такими молекулами будет сопровождаться блокированием этого процесса.

При отсутствии какой-либо информации о природе и локализации механочувствительных комплексов в сенсорных клетках ACO мы решили наработать антитела путем иммунизации кроликов гомогенатами целых ACO или их ресничек. Полученные антисыворотки подавляли чувствительность ACO к механическому стимулу у трех видов двустворчатых моллюсков - гребешков М. yessoensis и Ch. swifti и глицимериса G. yessoensis, а также вызывали агглютинацию ресничек ACO и ресничек механочувствительных латеральных клеток жабр этих моллюсков независимо от их вида. Инкубация иммунной сыворотки с жабрами приморского гребешка вела к ее обеднению антителами, способными влиять на чувствительность ACO к механическому стимулу. Это привело к мысли выделять антитела, а в последствии и их Fab-фрагменты на иммуносорбенте, приготовленном из фиксированных глютаральдегидом ресничек латеральных клеток жабр. Теоретическими предпосылками для иммуноаффинного выделения антител на таком иммуносорбенте явилось сходство полипептидного состава мембран жаберных ресничек и ресничек ACO - около 30 общих полипептидов, часть которых, безусловно, экспонирована на внешнюю поверхность мембраны, а также наличие механочувствительности у обоих типов ресничек.

Действие полиспецифических иммунных антител, выделенных из иммуноглобулинов класса G антисывороток на иммуносорбенте, проявилось в двух четко выраженных эффектах: в подавлении чувствительности механорецепторных клеток и склеивании их ресничек. Поскольку на функционирование механорецепторных клеток могут влиять как изменение механического состояния ресничек, так и взаимодействие антител с антигенами, представлялось важным разделить эти эффекта и вычленить вклад каждого из них.

Fab-фрагменты антител не вызывали агглютинации сенсорных ресничек ACO, но уменьшали ответ сенсорных клеток ACO на механический стимул. Однако скорость подавления механочувствительности ACO антителами была на порядок выше, а уровень ингибирования был существенно больше, чем Fab-фрагментами антител. Так, при приблизительно равных концентрациях антиген-связывающих центров антитела через 10 мин вызывали почти полное (около 95%) подавление ответа ACO на механический стимул, тогда Fab-фрагменты за это время подавляли ответ примерно на 50%. Поэтому очевидно, что подавление чувствительности механосенсорных клеток ACO нативными антителами происходит главным образом за счет агглютинации ресничек. Поскольку в первую очередь агглютинация наблюдалась в области тонких и гибких дистальных кончиков сенсорных ресничек, можно полагать, что этот участок реснички играет важную роль в восприятии механического стимула.

Действие Fab-фрагментов обусловлено их связыванием с антигенами мембраны. И подавление ответа волосковых клеток ACO на механические стимулы может происходить за счет нескольких механизмов. Наиболее вероятны из них следующие: а) воздействие на рецепторный молекулярный комплекс, воспринимающий энергию стимула; б) нарушение функционирования ион-транспортных клеточных систем, обеспечивающих динамичное ионное равновесие; в) изменение величины поверхностного заряда мембран ресничек. Какой конкретный механизм имеет место в действительности, остается неизвестным.

Действие лектинов. Еще одну возможность для исследования функции реснички ACO предоставляет использование лектинов. Было обнаружено, что нативный тетрамерный конканавалин А (Кон-А) и его димерное сукцинильное производное (сКон-А), подобно антителам, способны подавлять чувствительность ACO к механическому стимулу и агглютинировать реснички.

Следует отметить, что из лектинов Кои-А является наиболее часто используемым молекулярным инструментом для исследований биологических процессов на клеточном уровне. Вместе с тем сведения о влиянии Кон-А на механорецепторные клетки ограничено небольшим количеством работ, выполненных на волосковых клетках позвоночных животных (Kossl et al., 1990; Zheng, Gao, 1999). Показано, что Кон-А, связываясь с мембраной стереоцилий волосковых клеток органов слуха позвоночных животных, вызывал увеличение их жесткости, хотя и не блокировал процесс механопреобразования.

Кон-А, обладающий большей агглютинирующей способностью, увеличивал порог реакции ACO приморского гребешка на порядок эффективнее и вызывал более сильную агглютинацию ресничек, чем сКон-А. Изменение порога реакции протекало синхронно с агглютинацией для каждого из лектинов. Кроме того, если ACO предварительно инкубировали в среде с сКон-А, а затем обрабатывали антителами против Кон-А, то степень агглютинации ресничек усиливалась и одновременно повышался порог реакции ACO на механический стимул. Поскольку сами по себе антитела к Кон-А не влияли на механочувствительность, то можно заключить, что, действительно, агглютинация дистальных участков ресничек сенсорных клеток является причиной подавления чувствительности механорецегггорных клеток к механическому стимулу. Интересно, что со временем происходит реагглютинация ресничек и восстановление чувствительности механорецегггорных клеток. Использование ФИТЦ-меченого Кон-А показало, что вначале лектин связывался со всей поверхностью эпителия ACO и сенсорной реснички. Со временем он перемещался с поверхности органа и ресничек в состав тонкой пленки, слабо связанной с кончиками ресничек, и удалялся в окружающую среду. Это свидетельствует о наличии механизма, обеспечивающего транспорт связанного с мембраной реснички материала.

Чем обусловлено снижение чувствительности механорецегггорных клеток при агглютинации кончиков ресничек? Склеивание кончиков ресничек превращает весь реснитчатый слой в единую трехмерную решетку. Способность отдельных ресничек в составе такой решетки быть приемником (преобразователем) или же пассивным передатчиком механического стимула к механотрансдукционным каналам, где бы они ни находились, безусловно, иная, чем у свободных ресничек. Были рассмотрены два возможных механизма, обуславливающие последствия агглютинации.

- Агглютинация меняет условия передачи механического стимула к соме клетки, где, возможно, находятся структуры, ответственные за гроцесс механотрансдукции.

- Агглютинация изменяет условия механопреобразования на самой ресничке.

Чтобы проверить предположение о том, что агглютинация сенсорных ресничек ACO

может снижать механочувствительность из-за изменения эффективности передачи механического стимула к телу клетки или основанию реснички, был использован метод, который позволял удалять с поверхности органа все реснички, за исключением небольшого пучка диаметром 80-100 мкм. Это позволило сравнить реакцию группы механосенсорных клеток до и после агглютинации в условиях, когда стимул наносится непосредственно к основанию их ресничек. Механический стимул наносился микропипеткой с внутренним диаметром, примерно равным диаметру пучка, которая надвигалась на пучок вплоть до его основания. Поскольку агглютинация не сопровождалась изменением диаметра пучка ресничек в его проксимальной части, можно с определенной уверенностью говорить о том, что при положении кончика пипетки у основания пучка условия стимуляции до и после агглютинации оставались неизменными. Тем не менее, агглютинация, вызванная Кон-А, существенно повышала порог реакции механорецепторных клеток к механическому стимулу. Таким образом, уменьшение механочувствительности рецепторных клеток ACO в результате агглютинации кончиков ресничек лишь в малой степени может быть связано с изменением условий пассивной передачи механической энергии к телу клетки. Следовательно, необходимым условием эффективного восприятия механического стимула сенсорными клетками ACO является свободное состояние тонкого дистального участка реснички.

Автоагглютинация ресничек. Использование антител и лектинов позволило выяснить, что тонкий гибкий дистальный участок реснички механосенсорной клетки ACO играет важную роль в восприятии механического стимула. Однако использование этих инструментов ограничено тем, что процесс восстановления чувствительности органа занимает продолжительное время. Более удобным инструментом для такого рода исследований оказалось явление автоагглютинации ресничек, названное так потому, что склеивание ресничек происходило за счет эндогенных факторов. Было обнаружено, что быстрое нагревание ACO на 10-15 °С с последующим (через 20-30 с) быстрым охлаждением приводит к обратимой агглютинации дистальных участков сенсорных ресничек. Такой же эффект вызывала непродолжительная (20-30 с) инкубация в морской среде с повышенной на 30-100 мМ концентрацией хлористого калия. Причиной автоагглютинации являлась повышенная секреция клеток сенсорного эпителия. Через 20-30 с после стимуляции хлористым калием на поверхности сенсорного эпителия образовывался прозрачный слой, граница которого постепенно поднималась вдоль ресничек. Когда граница прозрачного слоя достигала дистальных участков реснички, происходила их агглютинация. Примерно через 1 ч реснички возвращались в исходное состояние.

Чувствительность ACO к механтескому стимулу не менялась во время перемещения секрета вдоль проксимального участка ресничек. По достижении секретом дистальных участков сенсорных ресничек развивалась агглютинация и синхронно с ней ингибировался ответ на механический стимул. Реагглютинация сопровождалась восстановлением исходной чувствительности ACO. Таким образом, динамика реакции ACO на стимул в процессе автоагглютинации еще раз указывает на то, что условием высокой механочувствительности сенсорных клеток является свободное состояние дистального участка ресничек. Наряду с агглютинацией, вызванной антителами и Кон-А, явление автоагглютинации - это уже третий пример того, что изменение механических свойств дистальных участков ресничек приводит к уменьшению чувствительности механорецепторных клеток ACO.

Благодаря быстрому протеканию процессов агглютинации и реагглютинации, удалось показать, что агглютинация в первую очередь вызывает снижение чувствительности ACO к дистанционному стимулу, а затем к контактному. Восстановление чувствительности во время реагглютинации происходит вначале к контактному стимулу, а потом к дистанционному. Таким образом, можно сделать вывод, что в результате автоагглютинации ресничек эффективность восприятия механосенсорными клетками смещения частиц окружающей жидкости подавлялась сильней, чем восприятие смещения, передаваемого от наконечника контактного стимулятора через ткани ACO к основанию ресничек. Следовательно, тонкий и гибкий дистальный участок реснички вносит важный вклад в обеспечение высокой чувствительности механорецептортых клеток ACO к дистанционным стимулам.

Перемещение секрета вдоль поверхности сенсорных ресничек явилось подтверждением данных, полученных в опытах с Кон-А, о существовании транспорта вдоль поверхности реснички.

Транспорт вдоль внешней поверхности реснички (flagellar surface motility) впервые был обнаружен у простейшего Chlamydomonas moewusii (Lewin, 1952) и значительно позже — у эмбрионов морского ежа (Bloodgood, 1992). Благодаря этому транспорту хламидомонада способна перемешаться (скользить), прикрепившись неподвижными ресничками к твердому субстрату (Lewin, 1952; Bloodgood, 1981), и перемещать связанные с мембраной микрошарики из полистирола от основания к кончику реснички и в обратном направлении (Bloodgood, 1977, 1981; Hoffman, Goodenough, 1980). Связанные с поверхностью мембраны антитела и Кон-А также транспортируются к кончику ресничек с последующим удалением их в окружающую среду (Goodenough, Jurivich, 1978; Bloodgood et al., 1986).

Наличие поверхностного мембранного транспорта вдоль сенсорной реснички (и реснички двустворчатых моллюсков в частности) нами показано впервые. Можно полагать, что этот транспорт у жгутиков хламидомонад и ресничек ACO имеет сходные механизмы, о чем

говорят близкие значения скоростей транспортировки. У С. moewusii она составляет 1.7 мкм/с при 23°С (Bloodgood, 1977), а у ACO - 1.3 мкм/с при 14°С. Практически полного совпадения скоростей транспорта следует ожидать, если учесть сильную температурную зависимость этого процесса.

Биологическая роль мембранного транспорта вдоль ресничек до конца не ясна Предполагается, что он используется для передвижения и осуществления полового размножения у простейших. В то же время транспорт в плоскости мембраны реснички обнаружен в неподвижных (апикальных) и подвижных ресничках эмбрионов морских ежей, которые не используют реснички для перемещения по твердому субстрату или для размножения. Эта говорит о фундаментальном характере явления транспортировки частиц вдоль внешней поверхности мембраны реснички. Возможно, что этот вид транспорта обеспечивает поставку на внешнюю поверхность мембраны молекул, молекулярных комплексов и отдельных органелл, необходимых для построения и функционирования реснички (Dentier, 1981;Nakamuraetal., 1996).

Механические свойства реснички. Поскольку ресничка является связующим звеном между внешней средой и клеткой, то информация о ее механических свойствах важна для понимания тех процессов и механизмов, которые обеспечивают восприятие сенсорной клеткой механического стимула.

В связи с отчетливыми различиями в ультраструктуре проксимального и дистального участков аксонемы ресничка на своем протяжении должна обладать значительной неоднородностью механических свойств. Действительно, если наблюдать за поведением ресничек ACO, то можно видеть, что дистальные (красно-коричневые участки) ресничек легко деформируются в потоке воды. Различия в жесткости дистального и проксимального участков реснички отчетливо видны, если воздействию подвергается тонкий пучок ресничек. Отклонение дистальных участков ресничек в потоке воды, направленном перпендикулярно оси пучка, могло достигать 90° при сохранении проксимальными участками своего первоначального положения. При этом точка перегиба располагается на границе между проксимальным и дистальным участками реснички. Зависимость между углом отклонения дистальных участков ресничек и скоростью потока близка к линейной. Аппроксимация этой кривой показывает, что отклонение тонкого, лишенного аксонем дистального участка реснички возможно при скорости потока, лишь немного отличной от нуля. В проксимальной части пучка ресничек деформация обнаруживается только при сравнительно больших скоростях протока: появляется вторая точка перегиба, которая находится несколько выше уровня микровилл, т.е. выше участка, где, по данным электронной микроскопии, ресничка выглядит наиболее ригидной из-за увеличенного диаметра и наличия связанного с мембраной и аксонемой электроноплотного материала.

Таким образом, ресничка сенсорных клеток ACO по своим механическим свойствам не может быть эффективным передатчиком механического стимула к соме сенсорной клетки в силу чрезвычайно малой жесткости ее дистального участка. Особенно очевидно, это демонстрируют результаты экспериментов на целом органе. Отсутствие видимой деформации в проксимальной части реснички и отчетливо проявляющаяся деформация дистальных кончиков под воздействием потока жидкости говорят о том, что в условиях интактного органа механическая энергия смещения окружающей жидкости поглощается в основном в дистальной части ресничного слоя. Исходя из морфологического строения и механических свойств реснички, можно с большой степенью уверенности полагать, что ее кнутообразное строение (массивная и жесткая проксимальная часть и гибкая и тонкая дистальная) пригодно для эффективной передачи механического стимула от основания к кончику реснички, чем наоборот.

Исследование роли расстояния между ресничками как фактора, влияющего на чувствительность сенсорных клеток. Анализ феномена ритмических изменений чувствительности ACO, сопряженных с периодическими изменениями его геометрических параметров (линейных размеров и кривизны поверхности), дали основания выдвинуть гипотезу о том, что чувствительность ACO к механическому стимулу определяется расстоянием между соседними ресничками, а процесс механотрансдукции запускается латеральным взаимодействием соседних ресничек. Анатомические особенности ACO дают возможность проверить это предположение

Такие эксперименты были проведены в двух вариантах. Суть первого состояла в изменении расстояния между ресничками, входящими в состав изолированного пучка. Стабильный уровень ответа на механический стимул достигался постоянным протоком воды, направленным внутрь микропипетки, расположенной у кончика пучка. В этих условиях реснички в их дистальной части сближались, и пучок имел почти конусообразную форму. Снижение скорости потока вызывало расширение пучка за счет увеличения расстояния между кончиками ресничек, и это сопровождалось уменьшением ответа на механический стимул. Напротив, сближение ресничек в пучке сопровождалось увеличением амплитуды суммарного импульсного ответа.

Во втором варианте опытов уменьшали расстояние между соседними ресничками за счет заполнения пространства между ресничками одного ACO ресничками другого. Для этого два органа постепенно сближали до тех пор, пока области дистальных участков ресничек полностью не перекрывались. Механическую стимуляцию и регистрацию активности проводили на одном из органов. Постепенное введение ресничек одного органа в межресничное пространство другого сопровождалось увеличением ответа на механический стимул. Причем следует подчеркнуть, что в обоих вариантах экспериментов расстояние менялось главным образом в области дистальных участков ресничек

Возможные механизмы работы ACO. Результаты этих экспериментов позволили нам предложить модель, описывающую механизм работы сенсорных клеток ACO (рис. 3) (Жадан, Сизов, 1999; Zhadan et al., 2004). Согласно этой модели, механический стимул увеличивает вероятность соприкосновения соседних ресничек. При этом мембранные белки, расположенные на поверхности одной реснички, взаимодействуют и образуют временные аффинные связи с мембранными белками, расположенными на поверхности соседней реснички. В результате сам процесс образования таких связей или же последующее смещение ресничек управляют механотрансдукционными каналами.

В рамках этой модели может быть найдено объяснение, каким образом высокая чувствительность ACO к механическому стимулу связана с уникальными морфологическими особенностями его строения в целом и строения сенсорных клеток в частности. Понятно, что чем выше вероятность латерального взаимодействия мембран соседних ресничек при данном уровне механического воздействия, тем выше будет чувствительность органа в целом. Факторами, обеспечивающими высокую вероятность такого взаимодействия, являются:

1) уникально большое количество (свыше 4 миллионов) сенсорных ресничек на поверхности органа;

2) высокая степень деформируемости дистального участка ресничек, обеспечивающая его смещение при слабом механическом воздействии;

3) малое расстояние между ресничками.

Первый фактор обеспечивается уникально высоким количеством сенсорных клеток в составе органа. Второй - строением и механическими свойствами дистального участка реснички. Третий - очень малым количеством вспомогательных клеток в составе сенсорного эпителия и, следовательно, небольшим пространством, отделяющим реснички соседних клеток друг от друга.

Эта модель достаточно хорошо объясняет, почему при сближении ресничек в пучке или при введении в межресничное пространство одного органа ресничек другого происходит увеличение ответа ACO на постоянные по амплитуде механические

стимулы. На ее основе может быть объяснено действие лектинов и антител. Встраиваясь между мембранами соседних ресничек, молекулы этих веществ препятствуют их взаимодействию и, соответственно, подавляют механочувствительность. Морфологической структурой, отвечающей за процесс латерального взаимодействия, может быть диффузный материал, покрывающий дистальный участок реснички.

К настоящему времени можно выделить несколько механочувствительных систем, различающихся по структурным функциональным свойствам. Наиболее простая система включает механочувствительный канал, управляемый латеральным натяжением мембраны (НатШ, МсВпс1е, 1996; НатШ, МаПтас, 2001). Она в деталях описана у бактерий, имеется у сенсорных и несенсорных клеток всех филогенетических групп и характеризуется низкой чувствительностью к механическому стимулу.

Область лиганд-рецептрорного взаимодействия

-«н

ск

о

ск

О

«с

■Механотрансдукционные каналы

мр мр

мф.смв

/ У мв

ж

ск

О

Рис. 3. Схема предполагаемого механизма работы сенсорных клеток абдоминального сенсорного

органа.

Предполагается, что в мембране дистальной часто реснички имеются механорецеторные белки (мрб). Предполагается также, что мрб-белок связан с механосенсорным ионным каналом (мк) либо является' его регулярной частью. Экстраклеточная часть мрб-белка может взаимодействовать с подобным участком мрб-белка соседней реснички за счет аффинных связей. При отсутствии взаимодействия с другим мрб-белком, его сенсорная часть находится в энергетическинасыщенном состоянии (мрб*). Латеральный контакт соседних ресничек вызывает конформационную перестройку мрб-белка и открытие механотрансдукционного канала.

вн - внутриресничное пространство, вш — внешняя среда, мр - мембрана реснички, мв -микровилла, мф - микрофиламенты, ск - сенсорная клетка, смв - сгереомикровилла

Вторая система характеризуется высоким уровнем структурной организации, обеспечивающей фокусировку механического стимула на определенном участке сенсорной клетки. Ключевым элементом этой системы является механотрансдукционный канал, функционирующий в составе надмолекулярного комплекса, который связывает его с элементами цитоскелета и внеклеточного матрикса (Hudspeth, 1992; Gillespie, Walker, 2001; Sukharev, Corey, 2004). Деформация внеклеточных структур (кожи, стереоцилий волосковых клеток, кутикулярных волосков и т.д.) вызывает натяжение в системе связей механотрансдукционного канала и изменяет вероятность его нахождения в открытом состоянии. В волосковых клетках позвоночных (возможно, и в других механорецепторах) молекулярный мотор, регулирующий степень натяжения в системе связей канала, регулирует его чувствительность и системы в целом. Эта механочувствительная система, отличающаяся высокой чувствительностью и скоростью реагирования, используется в сенсорных клетках и обеспечивает поступление информации в центральную нервную систему.

В третьей механочувствительной системе связь механотрансдукционного комплекса с внеклеточным матриксом обеспечивается белками клеточной адгезии - интегринами (Coppolino, Dedhar, 2000; Ali, Schumacker, 2002). Такие связи высоко специфичны, поскольку образуются по принципу лиганд-рецепторного взаимодействия интегринов с RGD-последовательностью молекул коллагена. Время преобразования механического стимула в клеточный ответ может быть достаточно быстрым, сопоставимым со временем - механопреобразования в сенсорных клетках (Chen, Grinnell, 1997).

Помимо высокой скорости механобиоэлектрического преобразования, вторую и третью механотрансдукционные системы роднит недавно обнаруженное обстоятельство, заключающееся в том, что мутация по гену, кодирующему кадгерин - кальций-зависимый белок клеточной адгезии (cdh23), ведет к потере слуха и чувства равновесия (Bolz et al., 2001; Bork et al., 2001; Wada et al., 2001; Wilson et al., 2001). Предполагается, что кадгерин является компонентом tip-links, поскольку он локализован в области кончиков стереоцилий волосковых клеток органов слуха позвоночных животных (Siemens etal., 2004; Sollner et al., 2004).

Таким образом, белки клеточной адгезии являются распространенной составляющей надмолекулярного механотрансдукционного комплекса. В свете этих сведений представление о том, что механотрансдукционный процесс в клетках АСО может запускаться латеральным взаимодействием соседних ресничек с участием молекул, обладающих адгезивными свойствами, выглядит теоретически обоснованным. О том, что между ресничками АСО могут образовываться временные связи за счет эндогенно секретируемого материала, свидетельствует обнаруженное нами явление автоагглютинации ресничек.

Однако окончательные выводы о том, что механотрансдукция может активироваться при латеральном взаимодействии мембран соседних ресничек, можно будет сделать после обнаружения механотрансдукциошых каналов в дистальной части реснички.

ВЫВОДЫ

1 Абдоминальный сенсорный орган (АСО) двустворчатых моллюсков является самым крупным из известных механорецепторных органов и отличается уникально большим количеством сенсорных клеток и высокой однородностью клеточного состава. Воротничковые клетки, составляющие 90% клеточного состава сенсорного эпителия АСО, имеют ряд особенностей:

- уникально длинную ресничку;

— систему радиальных филаментов, соединяющих основание реснички с стереомикровиллами;

- необычное строение аксонемы - классическое строение (9x2+2) в проксимальной

части реснички, и гомогенный электроноплотный материал в ее дистальной части;

- присутствие диффузного материала на внешней поверхности мембраны реснички.

2 Липидный состав ACO отличается от липидного состава несенсорных органов и тканей. Для ACO характерны уменьшенное содержание фосфатидилхолина, относительно высокое содержание арахидоновой кислоты, высокий уровень ненасыщенных жирных кислот и относительно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот. Особенностью липидного состава сенсорных ресничек ACO (по сравнению с липидным составом ресничек латеральных клеток жабр) является повышенное содержание фосфатидилинозита и фосфатидилсерина, а также сниженное содержание фосфатидилэтаноламина. Липидный состав мембран обоих типов ресничек в целом обнаруживает высокое сходство с таковыми ресничек других многоклеточных животных, а также простейших.

3 При сравнительно высоком сходстве полипептидного состава сенсорные реснички ACO и реснички латеральных клеток жабр различаются по содержанию трех аксонемальных полипептидов - 125, 149 и 300 кДа - и одного мембранного полипептида - 159 кДа-полипеггтида. Отличительной особенностью мембран ресничек ACO является высокое содержание 159 кДа-полипептида, который составляет 22% мембранного белка.

4 Высокую чувствительность ACO к механическому стимулу обеспечивают воротничковые клетки, реагирующие на механические колебания в диапазоне частот 16-1200 Гц. Чувствительность механорецепторных клеток ACO существенно выше, а частотный диапазон шире, чем у механорецепторов края мании. Частотный диапазон воспринимаемых моллюском колебаний может быть значительно расширен в сторону высоких частот благодаря свойствам раковины преобразовывать высокочастотный модулированный сигнал в низкочастотные колебания.

5 Сенсорные клетки ACO не имеют механизма, обеспечивающего дополнительный электрохимический потенциал, как у волосковых клеток позвоночных животных и ресничных механорецепторов членистоногих. По своим фармакологическим характеристикам механорецепторные клетки ACO отличаются от всех других механорецепторных клеток, несущих на апикальной поверхности волоски (стереоцилии) или реснички. Известные блокаторы механочувствительных каналов (аминогликозидные антибиотики, амилорид и его производные, лантан, флуоресцентный краситель FM1-43) мало эффективны в отношении механорецепторных клеток ACO.

6 Циклический АМФ играет значительную роль в регуляции механорецепторной функции сенсорных клеток ACO. Роль другого циклического нуклеотида - цГМФ, а также оксида азота менее очевидна. Повышение содержания цАМФ в клетках ACO приводит к трем эффектам:

- изменению чувствительности сенсорных клеток к механическому стимулу;

- увеличению амплитуды циклических изменений геометрических параметров

сенсорного эпителия;

- появлению ритмической двигательной активности сенсорных ресничек.

7 Изменение геометрических параметров сенсорного эпителия является одним из факторов, влияющих на чувствительность ACO к механическому стимулу.

8 Исследования механических свойств сенсорной реснички ACO показали, что она не может быть эффективным передатчиком механического стимула к соме сенсорной клетки. Это обусловлено тем, что дистальный участок, составляющий около 50% длины реснички, обладает чрезвычайно малой жесткостью. Особенно очевидно малая эффективность передачи механической энергии смещения жидкости из внешней среды к соме клетки проявляется на интактном органе.

9 Полиспецифические антитела против антигенов внешней поверхности ресничек подавляют механочувствительность ACO по двум механизмам:

- из-за агглютинации дистальных участков сенсорных ресничек;

- вследствие связывания с антигенами внешней поверхности мембраны реснички.

10 Исследования явлений агглютинации и автоагглютинации сенсорных ресничек ACO показали, что необходимым условием высокой чувствительности органа к механическому стимулу является свободное состояние дастальных участков сенсорных ресничек.

П Получены доказательства того, что изменение расстояния между дистальными участками соседних ресничек влияет на чувствительность ACO к механическому стимулу. Уменьшение расстояния между ресничками ведет к увеличению ответа органа на механический стимул, а увеличение расстояния - к его уменьшению. Этот результат дает основание выдвинуть гипотезу о том, что запуск процесса механотрансдукции в механосенсорных клетках ACO осуществляется путем латерального взаимодействия мембран соседних ресничек.

Основные публикации по теме диссертации

1 Жадан П.М., Семеньков П.Р., Чекмасова Н.М. Морфологическое и электрофизиологическое изучение сенсорной системы края мантии приморского гребешка Patinopecten yessoensis (Jay) // Гистология эффекторных и рецепторных механизмов нервной системы морских организмов / Под ред. Мотавкина П.А. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1980. С. 33-43.

2 Жадан П.М., Семеньков П.Г. Исследование функции абдоминального органа приморского гребешка Patinopecten yessoensis // Докл. АН СССР. 1982. Т. 262, № 1. С. 248-250.

3 Жадан П.М., Дорошенко П.А. Изучение распределения калия вблизи механорецепторных клеток абдоминального органа приморского гребешка с помощью К+-селективного микроэлектрода // Физиол. ж. 1983. № 6. С. 741-744.

4 Zhadan P.M., SemenTcov P.G. An electrophysiological study of the mechanoreceptory function of the abdominal sense organ of the scallop Patinopecten yessoensis (Jay) // Comp. Biochem. Physiol. 1984. V. 78A, No l.P. 865-870.

5 Дорошенко П.А., Жадан П.М. Роль ионов кальция в генерации ответа абдоминального сенсорного органа приморского гребешка// Нейрофизиология. 1984. Т. 16, № 4. Р. 475-480.

6 Жадан П.М., Дорошенко П.А. сАМР-зависимые процессы и механочувствительность абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Patinopecten yessoensis (Jay) // Биол. мембраны. 1985. Т. 2, № 3. С. 285-291.

7 Жадан П.М., Семеньков П.Г., Чекмасова Н.М. Органы чувств приморского гребешка // Приморский фебешок/ Под ред. Мотавкина П.А. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1986. С. 4861.

8 Жадан П.М., Чекмасова Н.М. Исследование функции ресничек в механорецепторных клетках абдоминального сенсорного организма двустворчатого моллюска Glycymeris yessoensis // Докл. АН СССР. 1986. Т. 286, № 4. С. 1016-1020.

9 Сизов A.B., Жадан П.М. Уникальный полипептидный состав мембран ресничек у волосковых клеток//Сенсорные системы. 1989. Т. 3,№ 1. С. 101-104.

10 Сизов A.B., Челомин В.П., Жадан П.М. Особенности липидных составов ресничек механочувствительных клеток и механорецепторного органа двустворчатых моллюсков // Биохимия. 1989. Т. 54, №11. С. 1821-1829.

11 Sizov А.V., Zhadan P.M. Protein differences in cilia of mechanoreceptor hair and gill cells of the scaüop Mizuhopecten yessoensis // Comp. Biochem. Physiol. 1989. V. 94B. P. 277-284.

12 Сизов A.B., Жадан П.М. Механочувствительность рецепторных волосковых клеток двустворчатого моллюска: подавление антителами против антигенов внешней поверхности ресничек // Деп. ВИНИТИ, №. 6712-В89. 1989.32 с.

13 Жадан П.М. Исследование роли циклических нуклеотидов в регуляции механочувствительности абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Сенсорные системы. 1992. Т. 6, № 1. С. 21-28.

14 Жадан П.М. Влияние конканавалина-А и его сукцинильного производного на чувствительность абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Сенсорные системы. 1999. Т. 13, № 4. С. 309-316.

15 Жадан П.М., Сизов A.B. Действие антител против антигенов внешней поверхности ресничек на механочувствительность рецепторных волосковых клеток двустворчатого моллюска//Сенсорные системы. 1999. Т. 13, №4. С. 301-308.

16 Жадан П.М. Исследование роли реснички в восприятии механического стимула воротничковыми механорецепторными клетками абдоминального сенсорного органа двустворчатых моллюсков // Сенсорные системы. 2000. Т. 14, № 2. С. 130-137.

17 Жадан П.М. О возможном участии лиганд-рецепторного механизма в функционировании механорецепторных реснитчатых клеток моллюсков // Докл. РАН. 2000. Т. 371, № 1. С. 125-128.

18 Жадан П.М., Сизов A.B. Ультраструктура абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Сенсорные системы. 2000. Т. 14, № 2. С. 117-128.

19 Жадан П.М. Локализация связывания конканавалина-А на поверхности абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Сенсорные системы. 2003. Т. 17, № 3. С. 241-248.

20 Жадан П.М., Даутов С.Ш. Ультраструктура и механические свойства сенсорной реснички абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Докл. РАН. 2003. Т. 390, № 2. С. 264-267.

21 Жадан П.М., Даутов С.Ш. Уникальное строение и механические свойства сенсорной реснички абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) (Mollusca, Bivalvia)//Сенсорные системы. 2003. Т. 17, № 3. С. 231-240.

22 Zhadan P.M., Sizov A.V., Dautov S.S. Ultrastructure of the abdominal sense organ of the scallop Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Cell Tissue Res. 2004. V. 318, No. 3. P. 617-629.

23 Жадан П.М. Влияние автоагглютинации ресничек на механочувствительность абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска Mizuhopecten yessoensis // Сенсорные системы. 2005. Т. 19, Jfe 2. С. 113-122.

24 Жадан П.М. Дирекционная чувствительность приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis и гребешка Свифта Chlamys swifii к механическим колебаниям в водной среде // Биол. моря. 2005. Т. 31, № 1. С. 37-44.

25 Жадан П.М. Изменение геометрии сенсорного эпителия и механочувствительности абдоминального сенсорного органа гребешка Mizuhopecten yessoensis // Сенсорные системы. 2005. Т. 19, №. 3. С. 259-262.

26 Жадан П.М. Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков: строение и функция//Сенсорные системы. 2005. Т. 19, № 4. С. 314-326.

27 Жадан П.М. Изменение расстояния между ресничками воротничковых клеток абдоминального сенсорного органа - новый механизм регуляции механочувствительности // Докл. РАН. 2005. Т. 405, № 4. С. 557-560.

Отпечатано в ТОЙ ДВО РАН 690041, Владивосток, ул. Балтийская, 43.

Заказ № 60, Усл. п. л. 2.0, Формат 60x84 1/16, Тираж 100 экз. Подписано в печать 25.09.2006 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Жадан, Петр Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение и функция волосковых клеток органов акустико-вестибулярной системы позвоночных животных.

1.1.1. Строение волосковой клетки.

1.1.2. Функция волосковой клетки.

1.1.3. Свойства механочувствительного канала волосковой клетки позвоночных животных.

1.1.4. Природа механочувствительного канала.

1.1.5. Аналог волосковой клетки позвоночных у беспозвоночных животных.

1.2. Волосковые и хордотональные механорецепторы насекомых.

1.3. Первичная сенсорная ресничка позвоночных животных.

1.3.1. Зародышевая ресничка (nodal cilia).

1.3.2. Первичная ресничка эпителиальных клеток почечных канальцев.

1.4. Механотрансдукция с участием интегринов.

1.5. Вторичная ресничка как механосенсор.

1.5.1. Роль вторичной реснички в восприятии механического стимула.

1.5.2. Вторичная ресничка в механочувствительных клетках дыхательного эпителия.

1.5.2. Ресничка (жгутик) хламидомонады.

1.6. Воротничковые механорецепторы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков-новая модельная система для исследования механотранстдукции"

Актуальность проблемы. Чувствительность к механическому воздействию является одним из фундаментальных свойств, лежащих в основе функционирования одноклеточных и многоклеточных организмов. Способность клеток трансформировать механическое воздействие в электрический и химический сигналы (механотрансдукция) обеспечивает восприятие звука и вибрации, гравитации, ускорения, скорости, давления, прикосновения, изменения формы и объема клетки, ее местоположения относительно внеклеточного матрикса и окружающих клеток. Эта способность лежит в основе таких разнообразных явлений, как слух и чувство равновесия, тактильная чувствительность, проприорецепция, осморегуляция. Исследования последних лет свидетельствуют, что механический стресс - это чрезвычайно важный фактор, влияющий на формирование тканей и органов, дифференцировку клеток и апоптоз.

Поскольку явления, связанные с механочувствительностью, так разнообразны, процесс выяснения механизмов, лежащих в их основе, замедлен относительно исследований других сенсорных модальностей. Зрение, обоняние и вкус имеют в своей молекулярной основе единый эволюционно консервативный механизм, включающий систему вторичных мессенжеров на основе ГТФ-связывающих белков (Firestein, 2001; Arshavsky et al., 2002). В то же время, механопреобразующие системы, по-видимому, не имеют универсального механизма. Структурное многообразие (клеточная мембрана, свободные нервные окончания, инкапсулированные рецепторы, волосковые рецепторы, ресничные рецепторы), различное тканевое происхождение (нервные и не нервные клетки), значительные различия в чувствительности и скорости преобразования стимула свидетельствуют о множественности механорецепторных систем, возникших параллельно в ходе эволюции. На это же указывают различия в молекулярной структуре первичных преобразователей - механочувствительных каналов - не только у филогенетически далеких групп, но и у одного и того же организма (Sukharev, Corey, 2004)

Второй причиной, объективно тормозящей исследования механорецепции, являются методические трудности. Механосенсорные клетки не образуют значимых скоплений, достаточных для получения необходимого количества материала для биохимических исследований, эти клетки имеют малые размеры; кроме того, мало количество механочувствительных каналов и связанных с ними молекулярных комплексов в клетке.

К настоящему времени сформировалось представление о том, что существуют две системы управления механочувствительным каналом. В одной из них управление механотрансдукционным каналом осуществляется латеральным натяжением в клеточной мембране. Предполагается, что во второй системе механотрансдукционный канал управляется молекулярными мостиками, которые связаны с одной стороны с цитоскелетом, а с другой - с внеклеточными структурами. Смещение любой из этих структур, вызванное механическим стимулом, передается через молекулярные мостики на канал, изменяя вероятность его нахождения в открытом состоянии. Чувствительность такого молекулярного комплекса может изменяться молекулярным мотором, который регулирует натяжение связанных с каналом молекулярных мостиков.

В последние годы накапливаются данные о том, что существуют иные механизмы, лежащие в основе восприятия механического стимула. Так, в механотрансдукции с участием белков клеточной адгезии - интегринов на начальном этапе требуется высокоспецифичное лиганд-рецепторное взаимодействие с внеклеточным матриксом (Coppolino, Dedhar, 2000; Ali, Schumacker, 2002). В механочувствительных первичных ресничках ключевым моментом для запуска механопреобразования, по-видимому, является взаимодействие рецепторного белка полицистина-1 с канальным белком полицистином-2. Аутокринный механизм механопреобразования с участием растворенных лигандов (факторов роста) выявлен в клетках эпителия легких млекопитающих (Tschumperlin et al., 2004). Такое разнообразие говорит о том, что прежде чем будут сделаны обобщения представлений о механизмах механотрансдукции и их эволюции, необходимо провести тщательный анализ каждой механосенсорной системы, а также поиск и исследование новых модельных систем.

Такая модельная система должна в идеале обеспечивать получение достаточного количества материала для биохимического анализа и быть удобной для биофизических и физиологических исследований. Разнообразие морских организмов предоставляет широкое поле для решения данной задачи, тем более что механорецепторные системы морских организмов исследованы лишь в малой степени.

Цели и задачи работы. В результате поиска перспективных модельных механосенсорных систем у морских животных наше внимание привлек абдоминальный сенсорный орган (АСО) двустворчатых моллюсков - малоизученное образование с неизвестной в то время функцией, но представляющее потенциальный интерес в качестве удобной модели для исследования механизмов механотрансдукции. Это обстоятельство определило основную цель настоящего исследования - выяснить функцию АСО и исследовать механизм его работы. Достижение цели обеспечивалось решением следующих задач:

1. Исследовать строение АСО, обратив особое внимание на апикальный участок сенсорной клетки и ее ресничный аппарат.

2. Исследовать липидный и полипептидный состав мембран механосенсорных клеток и сравнить его с биохимическим составом несенсорных органов и тканей. Изучить биохимические особенности ресничного аппарата сенсорных клеток.

3. В электрофизиологических и поведенческих экспериментах выяснить функцию АСО, определить его основные функциональные характеристики и выяснить роль сенсорной реснички.

4. Получить полиспецифические антитела к внешней поверхности сенсорной реснички и исследовать механизм их действия.

5. Исследовать фармакологические свойства АСО, уделив особое внимание веществам, используемым для исследований других механорецепторных образований.

6. Исследовать роль регуляторов клеточного метаболизма в функционировании механорецепторных клеток.

7. Исследовать механические свойства сенсорной реснички.

8. Исследовать роль реснички механосенсорных клеток АСО в восприятии механического стимула.

Новизна полученных результатов. Впервые показано, что АСО двустворчатых моллюсков является механосенсорным образованием. На основе морфологических, поведенческих и электрофизиологических исследований сделан вывод, что АСО выполняет функцию детектора вибрационных колебаний в водной среде и является аналогом акустико-латеральной системы позвоночных животных.

Впервые у беспозвоночных животных обнаружены филаменты, радиально связывающие сенсорную ресничку АСО с окружающими ее стереомикровиллами. Показано сходство этих соединений с таковыми, связывающими киноцилию и стереоцилии в волосковых клетках позвоночных животных.

Впервые обнаружена структурная неоднородность сенсорной реснички АСО и показана связь между особенностями морфологической организации аксонемы и механическими свойствами реснички.

В экспериментах по регенерации реснички АСО впервые установлена связь между длиной реснички и чувствительностью механорецепторных клеток к механическому стимулу.

Впервые получены данные о липидном и полипептидном составах мембраны сенсорной реснички АСО и выявлены их особенности по сравнению с таковыми несенсорных мембран и мембран механочувствительных клеток жаберного эпителия.

В экспериментах с применением полиспецифических антител против поверхностных антигенов мембраны сенсорной реснички и конканавалина А впервые исследовано влияние агглютинации ресничек на чувствительность механосенсорных клеток к механическому стимулу. Результаты этих исследований указывают на важную роль дистального участка сенсорной реснички в восприятии механического стимула.

Впервые получены данные о существовании поверхностного мембранного транспорта вдоль механосенсорной реснички.

Впервые обнаружено изменение геометрии сенсорного эпителия, синхронизированное с изменением чувствительности АСО. Показано, что эта синхронность обуславливается изменением кривизны поверхности сенсорного эпителия и, соответственно, изменением расстояния между дистальными участками ресничек.

Впервые показано, что процесс механотрансдукции может инициироваться латеральным взаимодействием сенсорных ресничек.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные свидетельства того, что у двустворчатых моллюсков, в отличие от брюхоногих и головоногих моллюсков, сформировалось специальное сенсорное образование, ответственное за восприятие колебаний в водной среде - АСО, способствуют более глубокому пониманию биологии этой многочисленной группы беспозвоночных животных и важны для выяснения вопросов, связанных с эволюцией механорецепторных органов. Установленный в настоящей работе факт, что воротничковые клетки АСО являются механосенсорными, подтверждает существовавшее на основе морфологических исследований мнение о том, что эти клетки, широко представленные в эпителии беспозвоночных животных, являются эволюционными предшественниками волосковых клеток акустико-вестибулярной системы позвоночных животных. Полученные данные о строении волоскового аппарата сенсорных клеток АСО, о механических свойствах сенсорной реснички, о липидном и полипептидном составе ее мембраны, о механизмах регуляции чувствительности сенсорных клеток АСО являются новыми и вносят существенный вклад в понимание механизмов работы механорецепторных клеток. Обнаружение транспорта вдоль наружной поверхности мембраны механосенсорной реснички АСО является предпосылкой для изучения механизмов этого явления и его роли в функционировании ресничных механорецепторов.

Введение в практику научного исследования АСО в качестве модели для изучения механорецепции открывает новые перспективы в научно-методическом плане. Этот орган дает возможность получать достаточное количество материала для биохимических исследований механосенсорных мембран. Легкость в манипулировании в электрофизиологических и биофизических экспериментах делает АСО почти идеальной модельной системой для исследований механотрансдукции. Результаты настоящей работы, принципиально важные для понимания механизмов восприятия клеткой механического стимула, получены при сравнительно низких материальных затратах, что подтверждает высокую эффективность предлагаемой модели.

Положения, выносимые на защиту:

1. Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков - это высокоспециализированный механосенсорный орган, воспринимающий механические колебания в широком диапазоне частот. Высокая чувствительность АСО к механическим колебаниям в водной среде обеспечивается воротничковыми клетками. Определяющими факторами, ответственными за высокую чувствительность АСО, являются большая длина сенсорной реснички и малая жесткость ее дистального участка.

2. Являясь самым крупным из известных механосенсорных образований, обладая уникально высокой однородностью клеточного состава и экстремально длинной сенсорной ресничкой, АСО представляет собой почти идеальную модельную систему для исследований механизмов работы механорецепторов. В отличие от традиционных модельных систем, АСО обеспечивает получение достаточного количества материала для биохимического анализа и значительные преимущества при проведении биофизических и физиологических исследований.

3. Сенсорная ресничка АСО является активным элементом, участвующим в процессе преобразования механического стимула в электрический сигнал. Наиболее вероятным механизмом первого этапа механотрансдукции является латеральное взаимодействие мембран соседних ресничек.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Симпозиуме «Биология шельфовых зон Мирового океана» (Владивосток, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), V Всесоюзном симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Пущино, 1984), V Всесоюзном съезде биохимиков (Москва, 1986), Всесоюзном совещании по нейронаукам (Киев, 1986), Всесоюзной конференции по морской биологии (Севастополь, 1988), Всесоюзном симпозиуме «Современные проблемы эволюции биохимии и происхождение жизни» (Телави, 1988), XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).

Публикации. Список публикаций соискателя включает 126 работ, 41 из них -по теме диссертации, в том числе 28 статей, включая 22 статьи в журналах из списка ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендуемого ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация общим объемом 336 стр., содержит 11 таблиц и 106 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 422 наименования.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Жадан, Петр Михайлович

выводы

1. Абдоминальный сенсорный орган (АСО) двустворчатых моллюсков является самым крупным из известных механорецепторных органов и отличается уникально большим количеством сенсорных клеток и высокой однородностью клеточного состава. Воротничковые клетки, составляющие 90% клеточного состава сенсорного эпителия АСО, имеют ряд особенностей:

- уникально длинную ресничку;

- систему радиальных филаментов, соединяющих основание реснички с стереомикровиллами;

- необычное строение аксонемы - классическое строение (9x2+2) в проксимальной части реснички, и гомогенный электроноплотный материал в ее дистальной части;

- присутствие диффузного материала на внешней поверхности мембраны реснички.

2. Липидный состав АСО отличается от липидного состава несенсорных органов и тканей. Для АСО характерны уменьшенное содержание фосфатидилхолина, относительно высокое содержание арахидоновой кислоты, высокий уровень ненасыщенных жирных кислот и относительно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот. Особенностью липидного состава сенсорных ресничек АСО (по сравнению с липидным составом ресничек латеральных клеток жабр) является повышенное содержание фосфатидилинозита и фосфатидилсерина, а также сниженное содержание фосфатидилэтаноламина. Липидный состав мембран обоих типов ресничек в целом обнаруживает высокое сходство с таковыми ресничек других многоклеточных животных, а также простейших.

3. При сравнительно высоком сходстве полипептидного состава сенсорные реснички АСО и реснички латеральных клеток жабр различаются по содержанию трех аксонемальных полипептидов - 125, 149 и 300 кДа - и одного мембранного полипептида - 159 кДа-полипептида. Отличительной особенностью мембран ресничек АСО является высокое содержание 159 кДа-полипептида, который составляет 22% мембранного белка.

4. Высокую чувствительность АСО к механическому стимулу обеспечивают воротничковые клетки, реагирующие на механические колебания в диапазоне частот 16-1200 Гц. Чувствительность механорецепторных клеток АСО существенно выше, а частотный диапазон шире, чем у механорецепторов края мантии. Частотный диапазон воспринимаемых моллюском колебаний может быть значительно расширен в сторону высоких частот благодаря свойствам раковины преобразовывать высокочастотный модулированный сигнал в низкочастотные колебания.

5. Сенсорные клетки АСО не имеют механизма, обеспечивающего дополнительный электрохимический потенциал, как у волосковых клеток позвоночных животных и ресничных механорецепторов членистоногих. По своим фармакологическим характеристикам механорецепторные клетки АСО отличаются от всех других механорецепторных клеток, несущих на апикальной поверхности волоски (стереоцилии) или реснички. Известные блокаторы механочувствительных каналов (аминогликозидные антибиотики, амилорид и его производные, лантан, флуоресцентный краситель FM1-43) мало эффективны в отношении механорецепторных клеток АСО.

6. Циклический АМФ играет значительную роль в регуляции механорецепторной функции сенсорных клеток АСО. Роль другого циклического нуклеотида - цГМФ, а также оксида азота менее очевидна. Повышение содержания цАМФ в клетках АСО приводит к трем эффектам:

- изменению чувствительности сенсорных клеток к механическому стимулу;

- увеличению амплитуды циклических изменений геометрических параметров сенсорного эпителия;

- появлению ритмической двигательной активности сенсорных ресничек.

7. Изменение геометрических параметров сенсорного эпителия является одним из факторов, влияющих на чувствительность АСО к механическому стимулу.

8. Исследования механических свойств сенсорной реснички АСО показали, что она не может быть эффективным передатчиком механического стимула к соме сенсорной клетки. Это обусловлено тем, что дистальный участок, составляющий около 50% длины реснички, обладает чрезвычайно малой жесткостью. Особенно очевидно малая эффективность передачи механической энергии смещения жидкости из внешней среды к соме клетки проявляется на интактном органе.

9. Полиспецифические антитела против антигенов внешней поверхности ресничек подавляют механочувствительность АСО по двум механизмам:

- из-за агглютинации дистальных участков сенсорных ресничек;

- вследствие связывания с антигенами внешней поверхности мембраны реснички.

10. Исследования явлений агглютинации и автоагглютинации сенсорных ресничек АСО показали, что необходимым условием высокой чувствительности органа к механическому стимулу является свободное состояние дистальных участков сенсорных ресничек.

11. Получены доказательства того, что изменение расстояния между дистальными участками соседних ресничек влияет на чувствительность АСО к механическому стимулу. Уменьшение расстояния между ресничками ведет к увеличению ответа органа на механический стимул, а увеличение расстояния - к его уменьшению. Этот результат дает основание выдвинуть гипотезу о том, что запуск процесса механотрансдукции в механосенсорных клетках АСО осуществляется путем латерального взаимодействия мембран соседних ресничек.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механические колебания в водной среде - одно из важнейших явлений в окружающей среде для всех гидробионтов, включая беспозвоночных животных. Особое значение информация о механическом состоянии среды приобретает для водных животных со слабо развитыми органами зрения и химического чувства, а также в условиях плохой видимости, не позволяющим им определять движущихся хищников, добычу или животных своего вида. Долгое время предполагалось, что моллюски не обладают специализированными органами чувств для детектирования механических колебаний в водной среде. Считалось, что эта функция обеспечивается органами гравиорецепции и равновесия - статоцистами (дополнительно к их основной функции) или же рассеянными по поверхности тела механорецепторными клетками.

В настоящей работе впервые приведены доказательства того, что абдоминальный сенсорный орган (АСО) двустворчатых моллюсков является высокоспециализированным механорецепторным органом, способным эффективно играть роль детектора механических колебаний в водной среде. АСО, обладая чувствительностью к механическому стимулу в пределах десяти нанометров, стоит в одном ряду с такими высокочувствительными механорецепторными образованиями, как органы слуха и вестибулярного аппарата позвоночных животных и волосковые механорецепторы насекомых. Частотный диапазон, в пределах которого наблюдается реакция рецепторных клеток АСО, ограничен 1000 - 1200 герцами, но наличие раковины позволяет двустворчатым моллюскам значительно расширить диапазон воспринимаемых колебаний вплоть до ультразвукового диапазона. Такой эффект достигается благодаря тому, что раковина моллюска выступает в роли фильтра низкой частоты и преобразует модулированный высокочастотный сигнал в низкочастотный.

К настоящему времени АСО обнаружен у представителей 19 семейств двустворчатых моллюсков из подклассов Pteriomorpha и Palaeoheterodonta. У двустворчатых моллюсков, не имеющих АСО, имеются органы, структурно сходные с ним. Например, у Tellinidae это сенсорный орган крестообразной мышцы (cruciform sense organ), у Nuculidae - орган Штемфли (Stemphell's organ). И хотя функциональную роль этих образований предстоит еще уточнить, можно полагать, что у двустворчатых моллюсков, в отличие от брюхоногих и головоногих, в процессе эволюции сформировались особые механосенсорные органы - функциональный аналог акустико-латеральной системы позвоночных животных.

Абдоминальный сенсорный орган является анатомически отчетливо выделяющимся образованием. По целому ряду параметров он отличается от известных механорецепторных органов у других животных.

В первую очередь АСО уникален своими размерами. Это самый крупный из известных механорецепторных органов, в некоторых случаях он достигает 5 мм в длину, 3 мм в ширину и 2 мм в высоту. АСО содержит около 4 млн. сенсорных клеток, тогда как в ближайшем по этому параметру органе Корти число клеток составляет от 20 до 40 тыс. Необычной является высокая однородность клеточного состава АСО - механорецепторные клетки составляют около 90% всего клеточного состава сенсорного эпителия. Для сравнения, в органе Корти механорецепторные клетки составляют лишь небольшую долю от всех клеток. То обстоятельство, что механорецепторную функцию АСО обеспечивают главным образом воротничковые клетки, также не характерно для других механосенсорных органов. Так, в сенсорном органе крестообразной мышцы и органе Штемфли двустворчатых моллюсков воротничковые клетки встречаются реже, чем многоресничные сенсорные клетки. Органы равновесия моллюсков - статоцисты включают в себя только многоресничные сенсорные клетки,

Воротничковые клетки, входящие в состав сенсорного эпителия АСО обладают рядом особенностей, которые отличают их от других воротничковых клеток. Многие авторы отмечали, что у воротничковых клеток пространство между ресничкой и стереомикровиллами заполнено аморфным материалом. Детальное исследование апикального участка сенсорных клеток АСО показало, что волосковые образования сенсорных клеток - ресничка, стерео- и микровиллы объединены системой фибрилл. В связях между микро- и стереовиллами и между самими микровиллами не обнаруживается упорядоченности, и они не отличаются от таковых между микровиллами секреторных клеток. Напротив, стереовиллы объединены отчетливо выраженными латеральными фибриллярными связями, которые характерны для воротничковых клеток. Кроме того, мы обнаружили также тонкие соединения между электроноплотным материалом, связанным с мембраной базальной части реснички, и электроноплотнымным материалом мембраны стереовиллы. Эта система связей, механически объединяющих ресничку и стереовиллы, сходна с теми, которые описаны в волосковых клетках вестибулярного аппарата и улитки позвоночных. Такая морфологическая гомология механосенсорных клеток позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует о высокой значимости этих структур для работы волосковых и ресничных клеток. Вместе с тем, функция этих соединений остается не выясненной для волосковых клеток как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Кроме того, остается не ясным, являются ли радиальные связи между ресничкой и стереомикровиллами особенностью сенсорных клеток АСО или же они присутствуют и в других воротничковых клетках.

Наиболее очевидной особенностью сенсорных клеток АСО, отличающих их от других воротничковых клеток, является необычная длина сенсорной реснички, размеры и строение ее суженной дистальной части. Ресничка с модифицированной дистальной частью - не редкое явление среди механочувствительных ресничных клеток двустворчатых моллюсков и других животных. Вместе с тем, ресничка сенсорных клеток АСО существенно отличается от других модифицированных ресничек. Она на порядок длиннее, а ее модифицированный участок на два порядка длиннее. Уникальной (в сравнении со всеми известными модификациями) особенностью реснички АСО является отсутствие в ее дистальной части структурированных микротрубочек. Этот участок реснички заполнен гомогенным материалом, который, по-видимому, представляет собой диссоциированный материал микротрубочек. На это указывают результаты сравнительного анализа полипептидного состава аксонем ресничек АСО и латеральных клеток жабр.

Обнаружение длинного (около 100 мкм) участка аксонемы, не содержащего структурированных микротрубочек, ставит вопрос о том, каким образом в ресничке АСО происходят процессы, обеспечивающие поддержание ее структуры в норме и регенерацию после ее удаления. Согласно современным представлениям, эти процессы обеспечиваются внутриресничным транспортом (ВРТ). Антероградный мотор кинезин-П в комплексе с другими молекулами ВРТ перемещает необходимый для строительства или поддержания функций реснички материал (элементы мембран и аксонем, ретроградного мотора, сигнальные молекулы и др.) к кончику реснички вдоль внешних микротрубочек аксонемы, используя их как направляющие. Сходным образом, специальные транспортные молекулы, использующие элементы цитоскелета (микротрубочки и микрофиламенты) перемещают внутри клетки вновь синтезированные молекулы и материал, требующий утилизации.

Данные о наличии в одной ресничке участка с классическим строением аксонемы и участка с диссоциированной аксонемой в какой-то степени противоречат устоявшимся представлениям о механизмах ВРТ. В то же время, они дают возможность выяснить некоторые детали механизма ВРТ и, в частности, роль в этом процессе микротрубочек внешних дублетов и обнаруженного в дистальной части реснички неструктурированного тубулина. Не исключено, что использование электронной микроскопии высокого разрешения позволит уточнить структурную организацию аксонемы дистальной части реснички. Такая детализация представляется важной, поскольку может выявить структурированность, подобную той, которая описана для трубчатого тельца ресничек сенсорных нейронов насекомых - структуры, которая, по-видимому, принимает непосредственное участие в процессе механотрансдукции.

Уникальные особенности строения АСО (большое количество сенсорных клеток и небольшое количество вспомогательных клеток) дают возможность получения материала для биохимических исследований. Это позволило нам впервые исследовать о липидный состав мембран механорецепторных клеток, липидный и полипептидный состав мембран сенсорных ресничек.

Результаты этих исследований показали, что липидный состав АСО во многом сходен с липидным составом других органов и тканей моллюсков. Так, АСО практически не отличается по фосфолипидному составу от жабр и не имеет резко выраженных отличий от пищеварительной железы, женских и мужских гонад и фоточувствительных глазков края мантии. Тем не менее, в фосфолипидах АСО приморского гребешка выявлена тенденция уменьшения количества фосфатидилхолина, а также более высокое соотношение фосфатидилэтаноламин/фосфатидилхолин (1.0), чем в фосфолипидах других органов (за исключением мантийных нервов) моллюска (<1). Кроме того, для липидов АСО характерно высокое содержание арахидоновой кислоты, более чем в 3 раза превышающее ее содержание в других тканях моллюска, высокий уровень ненасыщенных жирных кислот и полиеновых жирных кислот. Подобные особенности липидного состава АСО характерны как для М. yessoensis, так и для A. broughtonii.

По набору характерных черт фосфолипидные составы сенсорных и жаберных ресничек двустворчатых моллюсков в высокой степени сходны не только между собой, но с фосфолипидными составами ресничек простейших, оболочников, жгутиков сперматозоидов морских ежей, наружных сегментов палочек сетчатки. Это сходство проявляется в отсутствии в мембранах сенсорной реснички дифосфатидилглицерина, наличии нескольких форм сфингофосфоновых липидов, обогащенности этаноламиновыми глицерофосфолипидами и фосфатидилсерином, обедненности фосфатидилинозитом.

Таким образом, реснички АСО и латеральных клеток жабр двустворчатых моллюсков по составу липидов обнаруживают сходство не только с ресничками многоклеточных животных, но и с ресничками простейших. Появление на различных ступенях эволюционного развития одинаковых черт липидного состава позволяет говорить об их типичности для ресничек, а поэтому и о существовании стабильных фундаментальных механизмов, формирующих этот состав. Тем не менее, функциональное значение большого количества аминофосфолипидов (около 90% всего липидного состава) и незначительного содержания холинофосфолипидов в мембранах реснички не совсем ясно. Высокий уровень аминофосфолипидов на внешнем листке бислоя и, соответственно, высокая электроотрицательность наружной стороны мембраны может иметь значение в регуляции пространственных взаимоотношений между ресничками.

Вместе с тем, следует отметить, что для мантийных нервов двустворчатых моллюсков также характерно уменьшенное содержание фосфатидилхолина, увеличенное содержание фосфатидилсерина и сфингофосфоновых липидов и меньшее, по сравнению с другими исследованными тканями, количество фосфатидилинозита. Таким образом, возможно, что отмеченные особенности липидного состава ресничек отражают общую закономерность в распределения липидов между сомой клетки и ее отростками.

При сравнении ресничек двух типов клеток - сенсорных и жаберных, различающихся уровнем механочувствительности, обращает на себя внимание более высокое содержание фосфатидилинозита и фосфатидилсерина в сенсорных ресничках

2+

АСО. Учитывая важную роль этих липидов в регуляции Са метаболизма, а также фундаментальную роль этого иона в регуляции рецепторной функции, эта особенность представляется закономерной.

Сравнительный электрофоретический анализ белков ресничек двух типов механочувствительных клеток (сенсорных и жаберных) показал высокое сходство их полипептидных составов. Несмотря на то, что морфологически аксонема реснички АСО существенно отличается от классической аксонемы латеральных клеток жабр, обе имеют примерно одинаковое (около 80%) содержание основного белка аксонемы - тубулина. Небольшие различия, выявленные в составе минорных полипептидов аксонем реснички АСО и клеток жабр, не дают оснований полагать, что дистальный участок аксонемы в ресничке АСО отличен по молекулярному составу от классической аксонемы. Иными словами, электроноплотный диффузный материал, заполняющий дистальный участок реснички АСО, скорее всего, состоит из того же материала, что и классическая аксонема проксимального участка реснички. Функциональное значение такой организации аксонемы сенсорной реснички предстоит еще выяснить.

Основным мембранным белком в мембране обоих типов ресничек является мембранный тубулин. Он составляет 56-59% мембранного белка. Для мембран ресничек АСО характерно наличие второго основного полипептида с молекулярным весом 159кДа. Он составляет примерно 23% мембранного белка реснички АСО, а в мембране реснички жаберных клеток обнаруживается лишь в следовых количествах. Если мембранный тубулин ранее находили в мембранах ресничек довольно часто и, главным образом, в ресничках механочувствительных клеток, то 159 кДа-полипептид был обнаружен нами впервые.

159 кДа-полипептид отвечает некоторым критериям, предложенным для гипотетических сенсорных рецепторов. Эти критерии следующие:

1) обогащенность ресничек этим полипептидом по сравнению с сомой клетки;

2) обогащенность ресничек специализированных сенсорных клеток этим полипептидом по сравнению с ресничками менее механочувствительных клеток;

3) мембранная локализация;

4) высокая концентрация в месте, где наиболее вероятно преобразование механического стимула в биоэлектрический сигнал.

Обнаруженный в морфологических исследованиях АСО диффузный материал, связанный с мембраной реснички, локализован главным образом в дистальной ее части. Само наличие значительного количества диффузного материала дает основание полагать, что он в своей основе образован вторым по количеству, после мембранного тубулина, 159 кДа-полипептидом. Поскольку нет прямых доказательств того, что 159 кДа-полипептид входит в состав диффузного материала, соответствие этого полипептида последнему из четырех вышеперечисленных критериев лишь предполагается.

По своим фармакологическим характеристикам сенсорные клетки АСО существенно отличаются от всех других механорецепторных клеток, несущих на апикальной поверхности волоски (стереоцилии) или реснички. Обладая сравнительно высокой чувствительностью к механическим колебаниям, сенсорные клетки АСО не имеют механизма, обеспечивающего дополнительный электрохимический потенциал как у волосковых клеток позвоночных животных, так и у кутикулярных механорецепторов членистоногих.

Существенные отличия имеются у механорецепторных клеток АСО и в отношении их чувствительности к известным блокаторам механочувствительных каналов. Сенсорные клетки АСО, в отличие от большинства известных механорецепторов, почти не чувствительны к амилориду, а чувствительность к аминогликозидным антибиотикам на 3 порядка ниже, чем у большинства волосковых и ресничных клеток. Липофильный зонд FM1-43, имеющий диаметр молекулы, соответствующий диаметру поры большинства известных механочувствительных каналов, подавляет чувствительность клеток АСО к механическому стимулу при концентрациях в 1000 раз более высоких, чем это наблюдается в волосковых клетках позвоночных животных. Это говорит о том, что, вероятней всего, механочувствительные каналы ресничных клеток АСО отличаются по своим свойствам от большинства известных механопреобразующих каналов. То обстоятельство, что ответ сенсорных клеток на механический стимул подавляется при достаточно низких концентрациях дигидропиридинов - блокаторов потенциал

2+ чувствительных Са -каналов L-типа, может свидетельствовать или о том, что механотрансдукционные каналы сенсорных клеток АСО по своим свойствам близки к этому типу каналов, или о том, что в мембране присутствуют потенциал-чувствительные каналы L-типа, которые вносят свой вклад в регенеративный компонент ответа механорецепторных клеток.

Общим свойством для сенсорных клеток АСО и волосковых клеток позвоночных является длительная потеря их механочувствительности после удаления из среды Са2+. Возможно, это свидетельствует о разрушении (диссоциации) в отсутствие ионов кальция каких-то структур, ответственных за восприятие механического стимула.

Установлено, что цАМФ играет значительную роль в регуляции механорецепторной функции сенсорных клеток АСО. Роль другого циклического нуклеотида - цГМФ, а также оксида азота менее очевидна. Повышение содержания цАМФ в клетках АСО приводит к трем эффектам: 1) изменению чувствительности сенсорных клеток к механическому стимулу; 2) увеличению амплитуды циклического изменения геометрических параметров сенсорного эпителия; 3) появлению ритмической двигательной активности сенсорных ресничек.

Последний из указанных эффектов цАМФ интересен сходством действия этого мессенжера на двигательную активность латеральных клеток жабр двустворчатых моллюсков. цАМФ через цАМФ-зависимое фосфорилирование запускает биение реснички этих клеток даже в том случае, если у последней разрушена мембрана. Сходство становится еще более выраженным, если учесть, что биение ресничек и сенсорных клеток АСО, и жаберных клеток может быть стимулировано серотонином. Это говорит о том, что в ресничке АСО, которая в норме неподвижна, сохранились общие с эпителиальными клетками жабр молекулярные механизмы, контролирующие двигательную активность ресничек. цАМФ может оказывать влияние на чувствительность АСО к механическому стимулу, изменяя проводимость механотрансдукционных и потенциал-чувствительных каналов путем цАМФ-зависимого фосфорилирования. Такой механизм описан для волосковых клеток позвоночных. На возможность наличия подобного механизма регуляции чувствительности в сенсорных клетках АСО указывает ингибирующее действие толбутамида на ответ сенсорного органа.

Результаты исследований природы периодических изменений чувствительности АСО, синхронных с изменением механической активности сенсорного эпителия, показывают, что имеется и иной, не описанный ранее в литературе, механизм регуляции чувствительности, связанный с изменением геометрических параметров сенсорного эпителия. Выяснилось, что постоянным фактором, связывающим чувствительность и изменение геометрии сенсорного эпителия, является изменение кривизны поверхности сенсорного органа. Поскольку изменение кривизны поверхности сенсорного эпителия влечет изменение расстояния между кончиками ресничек, то эти эксперименты дали основание считать, что именно в изменении расстояния между ресничками и заложен механизм, позволяющий регулировать чувствительность АСО к механическому стимулу.

Ресничка механосенсорных клеток водных животных является частью клетки, которая в наибольшей степени испытывает воздействие смещения жидкости в окружающей среде. При этом она может быть или пассивным элементом, играя роль передатчика механического стимула к соме клетки, или активным элементом, преобразуя механический стимул в электрический сигнал.

Исследования механических свойств сенсорной реснички АСО показали, что она не может быть эффективным передатчиком механического стимула к соме сенсорной клетки. Дистальный участок, составляющий около 50% длины реснички, обладает чрезвычайно малой жесткостью и, следовательно, мало эффективен для такой передачи. Результаты экспериментов на целом органе с особой эффективностью демонстрируют, что передача механической энергии смещения жидкости из внешней среды к соме клетки мало эффективна. Отсутствие видимой деформации в проксимальной части реснички и отчетливо проявляющаяся деформация ее дистального кончика говорит о том, что в условиях интактного органа механическая энергия смещения окружающей жидкости поглощается в основном дистальной частью ресничного слоя. Исходя из морфологического строения и механических свойств, можно с большой долей уверенности полагать, что кнутообразное строение реснички (массивная и жесткая проксимальная часть и гибкая и тонкая дистальная) в большей степени пригодно для эффективной передачи механического стимула от основания к кончику реснички, а не наоборот.

Тем не менее, необычно длинная для механосенсорных клеток (более 200 мкм) ресничка может служить эффективной антенной для восприятия колебаний в водной среде. Чем больше длина, тем более высоким гидродинамическим сопротивлением ресничка обладает и тем в большей степени она способна смещаться под воздействием колебаний окружающей среды. С этой точки зрения значительное снижение чувствительности механорецепторных клеток АСО и ее восстановление в опытах с удалением и последующей регенерацией реснички можно объяснить устранением и последующим восстановлением связующего звена между средой и механорецепторной клеткой. Установлено, что восстановление чувствительности АСО становилось заметным только после того, как начинался процесс регенерации тонкого дистального участка реснички. Это косвенно свидетельствует о том, что не только длина реснички определяет чувствительность сенсорных клеток АСО.

С целью выяснения роли реснички в восприятии механического стимула были использованы антитела против поверхностных антигенов мембраны реснички и лектины. Оказалось, что антитела против поверхностных антигенов мембраны реснички подавляли чувствительность к механическому стимулу и одновременно склеивали дистальные участки ресничек. Естественно, возник вопрос: чем обусловлено подавление антителами механочувствительности АСО -блокированием механосенсорных элементов на поверхности мембраны или же механическим объединением кончиков ресничек? Использование Fab-фрагментов этих антител, которые в силу моновалентности не способны склеивать реснички, показало, что они также способны подавлять чувствительность механосенсорных клеток. Однако при равных концентрациях антиген-связывающих центров эффективность Fab-фрагментов была значительно меньше, чем нативных антител. Из этого следует, что, во-первых, антигенные детерминанты ресничек АСО сходны с таковыми ресничек латеральных клеток жабр (они были использованы для иммуноафинного выделения антител и Fab-фрагментов), связывание с которыми подавляет механочувствительность; во-вторых, агглютинация кончиков ресничек, по-видимому, является основной причиной подавления антителами механочувствительности АСО.

Роль агглютинации ресничек в снижении чувствительности АСО к механическому стимулу была выяснена в экспериментах с конканавалином А (КонА), и его димерным сукцинильным производным (сКон-А) и антителами против Кон-А. Эти два лектина, содержащие разное количество связывающих центров, обладают различной агглютинирующей способностью. Кон-А вызывал более сильную агглютинацию ресничек и в большей степени снижал чувствительность АСО к механическому стимулу, чем сКон-А. Кроме того, антитела против Кон-А усиливали агглютинацию ресничек и увеличивали порог реакции на механический стимул, если АСО был предварительно инкубирован в среде с сКон-А. В то же время сами антитела к Кон-А, без предварительной обработки органа сКон-А, не влияли на его механочувствительность.

Эти эксперименты, тем не менее, не давали ответа на вопрос, чем обусловлено снижение чувствительности механорецепторных клеток при агглютинации кончиков ресничек? Склеивание кончиков ресничек превращает весь ресничный слой в единую трехмерную решетку. Способность отдельных ресничек в составе такой решетки быть активным приемником (преобразователем) или пассивным передатчиком механического стимула к механотрансдукционным каналам, где бы последние ни находились, безусловно, иная, чем у свободных ресничек. Поэтому были рассмотрены два возможных механизма, обуславливающих последствия агглютинации.

1. Агглютинация меняет условия передачи механического стимула к соме клетки, где, возможно, находятся структуры, ответственные за процесс механотрансдукции.

2. Агглютинация изменяет условия механопреобразования на самой ресничке.

Предположение о том, что агглютинация сенсорных ресничек АСО может снижать механочувствительность из-за изменения эффективности передачи механического стимула к телу клетки или основанию реснички, было проверено в опытах с использованием небольшого пучка ресничек диаметром 80-100 мкм. Это позволило сравнить реакцию группы механосенсорных клеток до и после агглютинации в условиях, когда стимул наносился непосредственно к основанию их ресничек. Поскольку агглютинация не сопровождалась изменением диаметра пучка ресничек в его проксимальной части, можно с определенной уверенностью говорить о том, что при положении кончика пипетки (диаметром равным диаметру пучка ресничек) у основания пучка условия стимуляции до и после агглютинации оставались неизменными. Тем не менее, агглютинация, вызванная Кон-А, существенно повышала порог реакции механорецепторных клеток к механическому стимулу. Таким образом, уменьшение механочувствительности рецепторных клеток АСО в результате агглютинации кончиков ресничек лишь в малой степени может быть связано с изменением условий пассивной передачи механической энергии к телу клетки. Следовательно, необходимым условием эффективного восприятия механического стимула является свободное состояние тонкого дистального участка реснички.

Этот вывод был подтвержден исследованиями обнаруженного нами явления автоагглютинации ресничек АСО. Оказалось, что быстрая смена температуры или повышенное содержание в среде хлористого калия стимулируют секреторную деятельность клеток сенсорного эпителия АСО. Секретируемое вещество постепенно перемещается вверх вдоль ресничек, не меняя ответа сенсорных клеток на механический стимул, и только достигнув дистального участка, вызывает агглютинацию и подавление ответа.

Преимущество явления автоагглютинации для исследований функции реснички по сравнению с использованием антител и лектинов состоит в относительно быстром восстановлении (реагглютинации) исходного состояния ресничек. Это позволило в течение одного опыта исследовать явления, сопровождающие как агглютинацию, так и реагглютинацию. Благодаря этому обстоятельству выяснилось, что ответ АСО на дистанционный стимул, вызывающий смещение частиц жидкости в окружающей орган среде, подавляется значительно сильней, чем ответ на контактный стимул, приложенный к основанию органа. Следовательно, свободное состояние тонкого и гибкого дистального участка реснички важно в первую очередь для рецепции смещения жидкости в окружающей среде.

Какой физический фактор может инициировать механотрансдукционный процесс в ресничке АСО? Во-первых, это может быть деформация (изгиб) тонкого дистального участка реснички. Во-вторых, это может быть латеральное взаимодействие (касание) соседних ресничек.

Прямые доказательства того, что уменьшение расстояния между дистальными участками соседних ресничек влияют на чувствительность АСО к механическому стимулу, получены нами в экспериментах со сближением ресничек в изолированном пучке и в экспериментах, где уменьшение расстояния между ресничками достигалось путем заполнении межресничного пространства одного органа ресничками другого органа. Как показали эти эксперименты, оба способа уменьшения расстояния между ресничками приводили к увеличению ответа АСО на механический стимул.

Этот результат дал основание выдвинуть гипотезу о том, что запуск процесса механотрансдукции в механосенсорных клетках АСО осуществляется путем латерального взаимодействия мембран соседних ресничек. Учитывая неоднородность физических свойств реснички, наиболее вероятным местом локализации этого процесса является ее гибкий, легко деформируемый дистальный участок.

В рамках этой гипотезы может быть найдено объяснение, каким образом высокая чувствительность АСО к механическому стимулу связана с уникальными морфологическими особенностями его строения в целом и строения сенсорных клеток. Понятно, что чем выше вероятность латерального взаимодействия мембран соседних ресничек при данном уровне механического воздействия, тем выше будет чувствительность органа в целом. Факторами, обеспечивающими высокую вероятность такого взаимодействия, являются:

1) уникально большое количество (свыше 4 миллионов) сенсорных ресничек на поверхности органа;

2) высокая степень деформируемости ресничек при слабом механическом воздействии;

3) малое расстояние между ресничками.

Первый фактор обеспечивается большим количеством клеток в составе органа, второй - строением и механическими свойствами дистального участка реснички, третий - очень малым количеством вспомогательных клеток в составе сенсорного эпителия и, следовательно, небольшим пространством, отделяющим реснички друг от друга.

Следует отметить, что остаются открытыми многие вопросы, связанные со структурой и функционированием АСО. Неясно, какую роль играет система тонких филаментов, объединяющих стереовиллы и основание реснички; только предположительно можно говорить о функции диффузного материала, покрывающего ее диетальный участок. Особый интерес представляют данные о том, что аксонемы реснички сенсорных клеток АСО дезинтегрированы примерно на 50% их длины. Это дает уникальную возможность исследовать роль аксонемы реснички в рецепции механического стимула. Остаются совершенно не выясненными механизмы обнаруженной у реснички АСО способности осуществлять транспортировку лектинов и частиц секрета на своей внешней поверхности. Вместе с тем, длинная ресничка АСО является удобным объектом для исследования внутриресничного транспорта частиц и транспорта частиц вдоль наружной поверхности мембраны реснички, что важно не только для исследований в сенсорной рецепции, но и в целом для исследований в области клеточной биологии.

Остаются открытыми многие вопросы, связанные с функционированием сенсорных клеток АСО. Наиболее интересным представляется выяснение вопроса о локализации механотрансдукционных каналов. Здесь перспективным представляется использование внутриклеточных Са -индикаторов и липофильного зонда FM1-43. Предстоит еще выяснить природу механотрансдукционных каналов, механизм их активации и регуляции.

Следует особенно подчеркнуть, что благодаря своим особенностям - высокой однородности клеточного состава, большому числу клеток в составе органа, необычно длинной сенсорной ресничке и легкости выделения - это сенсорное образование является уникальным объектом для исследований. Легкость в манипулировании в электрофизиологических и биофизических экспериментах возможность получения достаточного количества материала для биохимического анализа делает АСО почти идеальной модельной системой для исследований механизмов работы механорецепторов. Кроме того, исследование этого уникального сенсорного образования представляет значительный интерес для понимания путей эволюции органов чувств.

К недостаткам АСО как модельной системы следует отнести малый размер сенсорных клеток. Это, а также постоянная сократительная активность сенсорного эпителия затрудняли использование микроэлектродной техники в наших исследованиях. Однако этот недостаток, хотя и выглядит существенным при современном уровне обеспечения отечественной науки, но может быть преодолен в будущем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Жадан, Петр Михайлович, Владивосток

1. Брок Й. Фракционирование иммуноглобулинов // Иммунологические методы. / Под ред. Фримель Х.М. М: Медицина, 1987. С. 413-427.

2. Виркемп Д., Броукхьюз Р. Методы анализа липидов мембран // Биохимическое исследование мембран / Под ред. Мэдди Э.М. М: Мир, 1979. С. 222-226.

3. Дорошенко П.А., Жадан П.М. Роль ионов кальция в генерации ответа абдоминального сенсорного органа приморского гребешка // Нейрофизиология. 1984. Т. 16, №4. С. 475-480.

4. Жадан П.М., Семеньков П.Г. Исследование функции абдоминального органа приморского гребешка Patinopecten yessoensis II Докл. АН СССР. 1982. Т. 262. № 1. С. 248-250.

5. Жадан П.М., Дорошенко П.А. Изучение распределения калия вблизи механорецепторных клеток абдоминального органа приморского гребешка с помощью К+-селективного микроэлектрода// Физиол. ж. 1983. № 6. С. 741-744.

6. Жадан П.М., Дорошенко П.А. сАМР-зависимые процессы и механочувствительность абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Patinopecten yessoensis (Jay) // Биол. мембраны. 1985. Т. 2, № 3. С. 285-291.

7. Жадан П.М., Семеньков П.Г., Чекмасова Н.М. Органы чувств приморского гребешка // Приморский гребешок / Под ред. Мотавкина П.А. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1986. С. 48-61.

8. Жадан П.М., Чекмасова Н.М. Исследование функции ресничек в механорецепторных клетках абдоминального сенсорного организма двустворчатого моллюска Glycymeris yessoensis II Докл. АН СССР. 1986. Т. 286, № 4. С. 1016-1020.

9. Жадан П.М., Чекмасова Н.М. Морфологические исследования абдоминального сенсорного органа приморского гребешка // Препринт ТОЙ ДВО АН СССР. Владивосток. 1988.15 с.

10. Жадан П.М. Исследование роли циклических нуклеотидов в регуляции механочувствительности абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Сенсорные системы. 1992. Т. 6, № 1. С. 21-28.

11. Жадан П.М., Павленко А.Ю. Избирательное выделение латеральных клеток из жабр приморского гребешка в условиях мягкого осмотического шока // Биол. моря. 1996. Т. 22, № 1. С. 40-47.

12. Жадан П.М. Влияние конканавалина-А и его сукцинильного производного на чувствительность абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска// Сенсорные системы. 1999. Т. 13. № 4. С. 309-316.

13. Жадан П.М., Сизов А.В. Действие антител против антигенов внешней поверхности ресничек на механочувствительность рецепторных волосковых клеток двустворчатого моллюска// Сенсорные системы. 1999. Т. 13. № 4. С. 301-308

14. Жадан П.М. Исследование роли реснички в восприятии механического стимула воротничковыми механорецепторными клетками абдоминального сенсорного органа двустворчатых моллюсков // Сенсорные системы. 2000а. Т. 14, № 2. С. 130-137.

15. Жадан П.М. О возможном участии лиганд-рецепторного механизма в функционировании механорецепторных реснитчатых клеток моллюсков // Докл. АН СССР. 20006. Т. 371, № 1. С. 125-128.

16. Жадан П.М., Сизов А.В. Ультраструктура абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Сенсорные системы. 2000. Т. 14, №2. С. 117-128.

17. Жадан П.М. Локализация связывания конканавалина-А на поверхности абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Сенсорные системы. 2003. Т. 17, № 3. С. 241-248.

18. Жадан П.М., Даутов С.Ш. Ультраструктура и механические свойства сенсорной реснички абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска // Докл. РАН. 2003а. Т. 390, № 2. С. 264-267.

19. Жадан П.М., Даутов С.Ш. Уникальное строение и механические свойства сенсорной реснички абдоминального сенсорного органа приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) (Mollusca, Bivalvia) // Сенсорные системы. 20036. Т. 17, №3. С. 231-240.

20. Жадан П.М. Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков: строение и функция // Сенсорные системы. 2005а. Т. 19, № 4. С. 314-326.

21. Жадан П.М. Влияние автоагглютинации ресничек на механочувствительность абдоминального сенсорного органа двустворчатого моллюска Mizuhopecten yessoensis II Сенсорные системы. 20056. Т. 19, № 2. С. 113-122.

22. Жадан П.М. Дирекционная чувствительность приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis и гребешка Свифта Chlamys swifti к механическим колебаниям в водной среде // Биол. моря. 2005в. Т. 31, № 1. С. 37-44.

23. Жадан П.М. Изменение геометрии сенсорного эпителия и механочувствительности абдоминального сенсорного органа гребешка Mizuhopecten yessoensis II Сенсорные системы. 2005г. Т. 19, №. 3. С. 259-262.

24. Жадан П.М. Изменение расстояния между ресничками воротничковых клеток абдоминального сенсорного органа новый механизм регуляции механочувствительности // Докл. РАН. 2005д. Т. 405, № 4. С. 557-560.

25. Ильинский О.Б. Физиология механорецепторов. Л.: Наука, 1975. 560 с.

26. Поляновский А.Д., Алексеева Т.М. Механотрансдукция у беспозвоночных: молекулярные механизмы и ультраструктурные корреляты // Сенсорные системы. 2001. V. 15. № 2. С. 155-166.

27. Сизов А.В., Жадан П.М. Уникальный полипептидный состав мембран ресничек у волосковых клеток моллюска // Сенсорные системы. 1989. Т. 3, № 1. С. 101104.

28. Сизов А.В., Жадан П.М. Механочувствительность рецепторных волосковых клеток двустворчатого моллюска: подавление антителами против антигенов внешней поверхности ресничек // Деп. ВИНИТИ, №. 6712-В89. 1989. 32 с.

29. Сизов А.В., Челомин В.П., Жадан П.М. Особенности липидных составов ресничек механочувствительных клеток и механорецепторного органа двустворчатых моллюсков//Биохимия. 1989. Т. 54, № 11. С. 1821-1829.

30. Alenghat F.J., Ingber D.E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins // Sci. STKE. 2002. V. 119, P. PE6.

31. АН M.H., Schumacker P.T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor? // Crit. Care. Med. 2002. V. 30, No 5, Suppl. P. S198-S206.

32. Baumann M., Roth A. The Ca2+ permeability of the apical membrane in neuromast hair cells //J. Сотр. Physiol. 1986. V. 158, No 5. P. 681-688.

33. Bedini С., Ferrero E., Lanfranchi A. Fine structural observations on the ciliary receptors in the epidermis of three otoplanid species (Tubelaria, Proseriata) // Tissue Cell. 1975. V. 7. P. 253-266.

34. Benham C.D., Davis J.B., Randall A.D. Vanilloid and TRP channels: a family of lipid-gatedcation channels //Neuropharmacology. 2002. V. 42, No 7. P. 873-888. Bennet-Clark H.C., Ewing A.W., Manning A. The persistence of courtship stimulation in

35. Drosophila melanogaster H Behav. Biol. 1973. V. 8, No 6. P. 763-769. Benos D.J. Amiloride: a molecular probe of sodium transport in tissues and cells // Am. J.

36. Bull. 1992. V. 182, No 3. P. 382-390. Betz W.J., Mao F., Smith C.B. Imaging exocytosis and endocytosis // Curr. Opin.

37. Neurobiol. 1996. V. 6, No 3. P. 365-371. Biagi B.A., Enyeart J.J. Gadolinium blocks low- and high-threshold calcium currents in pituitary cells // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1990. V. 259, No 3 Pt 1. P. C515-C520.

38. Bligh E.L., Dayer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J.

39. Bloodgood R.A., Woodward M.P., Salomonsky N.L. Redistribution and shedding of flagellar membrane glycoproteins visualized using an anti-carbohydrate monoclonal antibody and concanavalin A // J Cell Biol. 1986. V. 102, No 2. P. 1797-1812.

40. Bloodgood R.A. Directed movements of ciliary and flagellar membrane components: a review // Biol. Cell. 1992. V. 76, No 3. P. 291-301.

41. Blum J.J. Existence of a breaking point in cilia and flagella // J. Theor. Biol. 1971. V. 33, No 2. P. 257-263.

42. Boland L.M., Brown T.A., Dingledine R. Gadolinium block of calcium channels: influence of bicarbonate //Brain Res. 1991. V. 563, No 1-2. P. 142-150.

43. Bone Q., Ryan K.P. Cupular sense organs in Ciona (Tunicata: Ascidiacea) // J. Zool. bond. 1978. V. 186. P. 417-426.

44. Bosher S.K., Warren R.L. Very low calcium content of cochlear endolymph, an extracellular fluid//Nature. 1978. V. 273, No 5661. P. 377-378.

45. Brownell W.E. Microscopic observation of cochlear hair cell motility // Scan Electron Microsc. 1984, No Pt 3. P. 1401-1406.

46. Brownell W.E., Bader C.R., Bertrand D., de Ribaupierre Y. Evoked mechanical responses of isolated cochlear outer hair cells // Science. 1985. V. 227, No 4683. P. 194-196.

47. Brownell W.E. Outer hair cell electromotility and otoacoustic emissions // Ear Hear. 1990. V. 11, No 2. P. 82-92.

48. Bruns D., Jahn R. Real-time measurement of transmitter release from single synaptic vesicles //Nature. 1995. V. 377, No 6544. P. 62-65.

49. Budelmann B.U. Hair cell polarization in the gravity receptor systems of the statocyst of the cephalopods Sepia officialis and Loligo vulgaris // Brain Res. 1979. V. 160, No 2. P. 261-270.

50. Budelmann B.U. Equilibrium and orientation in cephalopods // Oceanus. 1980. V. 23. P. 34-43.

51. Budelmann B.U. Hydrodynamic receptor systems in invertebrates, Budelmann B.U. ed. New York: Springer-Verlag, 1989. 607-631 c.

52. Budelmann B.U. Hearing in nonarthropod invertebrates // The evolutionary biology of hearing / D.B. Webster, R.R. Fay, A.N. Popper ed. New York, 1992. P. 141-152.

53. Budelmann B.U., Williamson R. Directional sensitivity of hair cell afferents in the Octopus statocyst//J. Exp. Biol. 1994. V. 187. P. 245-259.

54. Burlacu S., Tap W.D., Lumpkin E.A., Hudspeth A.J. ATPase activity of myosin in hair bundles of the bullfrog's sacculus // Biophys. J. 1997. V. 72, No 1. P. 263-271.

55. Caldwell J.C., Eberl D.F. Towards a molecular understanding of Drosophila hearing // J. Neurobiol. 2002. V. 53, No 2. P. 172-189.

56. Chambard J.M., Ashmore J.F. Regulation of the voltage-gated potassium channel KCNQ4 in the auditory pathway // Pflugers Arch. 2005. V. 450, No 1. P. 34-44.

57. Charles G.H. Sense organ (less Cephalopods) // Physiology of mollusca / K.M. Wilbur, C.M.N.Y. Yonge ed. London.: Acad. Press, 1966. V. 2. P. 445-522.

58. Chen B.M., Grinnell A.D. Kinetic, Ca dependence, and biophysical properties of integrin-mediated mechanical modulation of transmitter release from frog motor nerve terminals // J. Neurosci. 1997. V. 67, No 3. P. 904-916.

59. Chen C., Nenov A., Skellett R., Fallon M., Bright L., Norris C., Bobbin R. Nitroprusside suppresses cochlear potentials and outer hair cell responses // Hear Res. 1995. V. 87, No 1-2. P. 1-8.

60. Chen J.W., Eatock R.A. Major potassium conductance in type I hair cells from rat semicircular canals: characterization and modulation by nitric oxide // J. Neurophysiol. 2000. V. 84, No 1. P. 139-151.

61. Chen Z., Lancet D. Membrane proteins unique to vertebrate olfactory cilia: candidates for sensory receptor molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81, No 6. P. 1859-1863.

62. Chrachri A., Williamson R. Voltage-dependent conductances in cephalopod primary sensory hair cells // J. Neurophysiol. 1997. V. 78, No 6. P. 3125-3132.

63. Biochem. Cell Biol. 2000. V. 32, No 2. P. 171-188. Corey D.P., Hudspeth A.J. Response latency of vertebrate hair cells // Biophys. J. 1979a. V. 26, No 3. P. 499-506.

64. Corey D.P., Hudspeth A.J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell //

65. Nature. 1979b. V. 281, No 5733. P. 675-677. Corey D.P., Hudspeth A.J. Kinetics of the receptor current in bullfrog saccular hair cells // J.

66. Cragg S.M., Nott J. A. The ultrastructure of the statocysts in the pediveliger larvae of Pecten maximus (L) (Bivalvia) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1977. V. 27. P. 23-36.

67. Crawford A.C., Evans M.G., Fettiplace R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells // J. Physiol. 1989. V. 419. P. 405-434.

68. Crawford A.C., Evans M.G., Fettiplace R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells // J. Physiol. 1991. V. 434. P. 369-398.

69. Crawford B.J., Campbell S.S. The microvilli and hialine layer of embrionic asteroid epithelial collar cells: A sensory structure to determine the position of locomotory cilia? // Anat. Record. 1993. V. 236. P. 697-709.

70. Crisp M. Epithelial sensory structures of trocnids // J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 1981. V. 61. P. 95-106.

71. Cui C., Smith D.O., Adler J. Characterization of mechanosensitive channels in Escherichia coli cytoplasmic membrane by whole-cell patch clamp recording // J. Membr. Biol. 1995. V. 144, No 1. P. 31-42.

72. Dakin W.J. The visceral ganglion of Pecten, with some notes on the physiology of the nervous system, and enquiry into the innervation of the ospradium in the Lamellibranchiata // Mitth. Zool. Staz. Napoli. 1910. V. 20. P. 1-40.

73. Deak L., Zheng J.L., Orem A., Du G.G., Aguinaga S., К. M., Dallos P. Effects of cyclic nucleotides on the function of prestin // J. Physiol. 2005. V. 563, No Pt 2. P. 483-496.

74. Demer L.L., Wortham C.M., Dirksen E.R., Sanderson M.J. Mechanical stimulation induces intercellular calcium signaling in bovine aortic endothelial cells // Am. J. Physiol. 1993. V. 264, No 6 Pt 2. P. H2094-2102.

75. Dentler W.L., Pratt M.M., Stephens R.E. Microtubule-membrane interactions in cilia II Photochemical cross-linking of bridge structures and the identification of a membrane-associated dynein-like ATPase // J. Cell. Biol. 1980. V. 84, No 2. P. 381403.

76. Dentler W.L. Microtubule-membrane interaction in cilia and flagella // Int. Rev. Cytol. 1981. V. 72. P. 1-47.

77. Dery O., Corvera C.U., Steinhoff M., Bunnett N.W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases // Am. J. Physiol. 1998. V. 274, No 6 Pt 1. P. C1429-C1452.

78. Dewey C.F.J., Bussolari S.R., Gimbrone M.A.J., Davies P.F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress // J. Biomech. Eng. 1981. V. 103, No 3. P.177-185.

79. Di Benedetto G., Manara-Shnediac F.S., Menta A. The effect of dibutyryl-cyclic AMP on ciliary activity of human respiratory epithelium in vitro // J. Physiol. 1990. V. 422. P. 36.

80. Dirksen E.R., Sanderson M.J. Regulation of ciliary activity in the mammalian respiratory tract // Biorheology. 1990. V. 27, No 3-4. P. 533-545.

81. Docherty R.J. Gadolinium selectively blocks a component of calcium current in rodent neuroblastoma x glioma hybrid (NG108-15) cells // J. Physiol. 1988. V. 398. P. 3347.

82. Dolgobrodov S.G., Lukashkin A.N., Russell I.J. Electrostatic interaction between stereocilia: I Its role in supporting the structure of the hair bundle // Hear Res. 2000. V. 150, No 1-2. P. 83-93.

83. Drescher M.J., Kern R.C., Hatfield J.S., Drescher D.G. Cytochemical localization of adenylyl cyclase activity within the sensory epithelium of the trout saccule // Neurosci. Lett. 1995. V. 196, No 3. P. 145-148.

84. Dulon D., Schacht J. Motility of cochlear outer hair cells // Am J Otol. 1992. V. 13, No 2. P. 108-112.

85. Dute R., Kung C. Ultrastructure of the proximal region of somatic cilia in Paramecium tetraurelia IIJ Cell Biol. 1978. V. 78, No 2. P. 451-464.

86. Eberl D.F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. // Curr Opin Neurobiol. 1999. V. 9, No 4. P. 389-393.

87. Eberl D.F., Hardy R.W., Kernan M.J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila // J. Neurosci. 2000. V. 20, No 16. P. 5981-5988.

88. Ehlers S., Ehlers B. Monociliary receptors in interstitial Proseriata and Neorhabdocoela (Tubellaria, Neoophora) // Zoomorphologie. 1977a. V. 86. P. 197-222.

89. Ehlers U., Ehlers B. Monociliary receptors in interstitial Proseriata and Neorhabdocoela (Tubellaria Neoophora) // Zoomorphology. 1977b. V. 86. P. 197-222.

90. Eisenbach L., Ramanathan R., Nelson D.L. Biochemical studies of the excitable membrane of Paramecium tetraurelia IX. Antibodies against ciliary membrane proteins // J. Cell Biol. 1983. V. 97, No 5, Pt. 1. P. 1412-1420.

91. Eisig H. Monographic der capitelliden des golfes von Neapel, 1887. 906 c.

92. Elinder F., Arhem P. Effects of gadolinium on ion channels in the myelinated axon of

93. Firestein S. How the olfactory system makes sense of scents // Nature. 2001. V. 413, No 6852. P. 211-218.

94. Furness D.N., Hackney C.M., Steyger P.S. Organization of microtubules in cochlear hair cells // J. Electron Microsc. Tech. 1990. V. 15, No 3. P. 261-279.

95. Furness D.N., Zetes D.E., Hackey C.M., Steelt C.R. Kinematic analysis of shear displacements as a means for operating mechano-electrical transduction channels in mammalian cochlear hair cells // Proc. R. Soc. Lond. 1997. V. B264, No 1378. P. 4552.

96. Gale J.E., Meyers J.R., Corwin J.T. Solitary hair cells are distributed throughout the extramacular epithelium in the bullfrog's saccule // J. Assoc. Res. Otolaryngol. 2000. V. 1, No 2. P. 172-182.

97. Gale J.E., Marcotti W., Kennedy H.J., Kros C., Richardson G.P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel // J. Neurosci. 2001. V. 21, No 18. P. 7013-7025.

98. Gallin E.K., Wiederhold M.L. Response of Aplysia statocyst receptor cells to physiologic stimulation // J. Physiol. 1977. V. 266, No 1. P. 123-137.

99. Gao W.Q. Role of neurotrophic and lectins in prevention of ototoxicity // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. V. 884. P. 312-327.

100. Garthwaite J., Boulton C.L. Nitric oxide signaling in the central nervous system // Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 683-706.

101. Geng L., Segal Y., Pavlova A., Barros E.J., Lohning C., Lu W., Nigam S.K., Frischauf A.M., Reeders S.T., Zhou J. Distribution and developmental^ regulated expression of murine polycystin // Am. J. Physiol. 1997. V. 272, No 4, Pt 2. P. F451-459.

102. Gibbons L.R. The relationship between the fine structure and the direction of beat in gill cilia of a lamellibranch mollusc // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. V. 11. P. 179205.

103. Gillespie P.G., Hudspeth A.J. Adenine nucleoside diphosphates block adaptation of mechanoelectrical transduction in hair cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90, No 7. P. 2710-2714.

104. Gillespie P.G., Walker R.G. Molecular basis of mechanosensory transduction // Nature. 2001. V. 413, No 6852. P. 194-202.

105. Gilula N.B., Satir P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization // J. Cell Biol. 1972. V. 53, No 2. P. 497-509.

106. Good M.J., Stommel E.W., Stephens R.E. Mechanical sensitivity and cell coupling in the ciliated epithelial cells of Mytilus edulis gill // Cell Tissue Res. 1990. V. 259. P. 5160.

107. Goodenough U.W., Jurivich D. Tipping and mating-structure activation induced in Chlamydomonas by flagellar membrane antisera // J Cell Biol. 1978. V. 79, No 3. P. 680-693.

108. Gopfert M.C., Robert D. Motion generation by Drosophila mechanosensory neurons // Proc.

109. Hackney C.M., Furness D.N. Mechanotransduction in vertebrate hair cells: structure and function of the stereociliary bundle // Am. J. Physiol. 1995. V. 268, No 1, Pt. 1. P. C1-C13.

110. Haszprunar G. The fine morphology of the ospradial sense organs of the Mollusca. I. Gastropoda, Prosobranchia // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. 1984. V. В 307. P. 457496.

111. Haszprunar G. The fine structure of the abdominal sense organs of Pteriomorpha (Mollusca,

112. Bivalvia) // J. Moll. Stud. 1985a. V. 51. P. 315-319. Haszprunar G. On the anatomy and fine-structure of a peculiar sense organ in Nucula

113. Bivalvia, Protobranchia) // The Veliger. 1985b. V. 28, No 1. P. 52-62. Hawkins A.D. The sensitivity of fish to sound // Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. 1973. V. 11. P. 291-340.

114. Hillman D.E. New ultrastructural findings regarding a vestibular ciliary apparatus and itspossible functional significance//Brain Res. 1969. V. 13. P. 407-412. Hoffman J.L., Goodenough U.W. Experimental dissection of flagellar surface motility in

115. Howard J., Hudspeth A.J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell // Neuron. 1988. V. 1, No 3. P. 189-199.

116. Howard J., Roberts W.M., Hudspeth A.J. Mechanoelectrical transducing by hair cells // Ann. Rev. Biophys. Biophys. 1988. V. 17. P. 99-124.

117. Hudspeth A.J., Corey D.P. Sensitivity, polarity, and conductance change in the response of vertebrate hair cells to controlled mechanical stimuli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74, No 6. P. 2407-2411.

118. Hudspeth A.J., Jacobs R. Stereocilia mediate transduction in vertebrate hair cells // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1979. V. 76, No 3. P. 1506-1509.

119. Hudspeth A.J. Extracellular current flow and the site of transduction by vertebrate hair cells // J. Neurosci. 1982. V. 2, No 1. P. 1-10.

120. Hudspeth A.J. The cellular basis of hearing: the biophysic of hair cells // Science. 1985. V. 230, No 4727. P. T13-T20.

121. Hudspeth A.J. Hair bundle mechanics and a model for mechanoelectrical transduction by hair cells // Sensory Transduction / D.P. Corey, Roper, S.D. ed. New York: Rockefeller University press, 1992. P. 357-370.

122. Hudspeth A.J. How hearing happens // Neuron. 1997. V. 19, No 5. P. 947-950.

123. Hudspeth A.J. How the ear's works work: mechanoelectrical transduction and amplification by hair cells // C. R. Biol. 2005. V. 328, No 2. P. 155-162.

124. Keil T.A. Functional morphology of insect mechanoreceptors // Microsc. Res. Tech. 1997.

125. V. 39, No 6. P. 506-531. Kernan M., Cowan D., C. Z. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila // Neuron. 1994. V. 12, No 6. P. 1195-1206.

126. Kleyman T.R., Cragoe E.J. Amiloride and its analogs as tools in the study of ion transport // J. Membr. Biol. 1988. V. 105, No 1. P. 1-21.

127. Kolesnikov S.S., Rebrik T.I., Zhainazarov A.B., Tavartkiladze G.A., Kalamkarov G.R. A cyclic-AMP-gated conductance in cochlear hair cells // FEBS Lett. 1991. V. 290, No 1-2. P. 167-170.

128. Kossl M., Richardson G.P., Russell I.J. Stereocilia bundle stiffness: effects of neomycin sulphate, A23187 and concanavalin A // Hear Res. 1990. V. 44, No 2-3. P. 217-229.

129. Koulen P., Cai Y., Geng L., Maeda Y., Nishimura S., Witzgall R., Somlo S. Polycystin-2 is an intracellular calcium release channel // Nat. Cell, Biol. 2002. V. 4, No 3. P. 191197.

130. Kozminski K.G., Johnson K.A., Forscher P., Rosenbaum J.L. A motility in the eukaryotic flagellum unrelated to flagellar beating // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1993. V. 90, No 12. P. 5519-5523.

131. Kozminski K.G., Beech P.L., Rosenbaum J.L. The Chlamydomonas kinesin-like protein FLA 10 is involved in motility associated with the flagellar membrane // J. Cell. Biol. 1995. V. 131, No 6 Pt 1. P. 1517-1527.

132. Kroese A.B., Das A., Hudspeth A.J. Blockage of the transduction channels of hair cells in the bullfrog's sacculus by aminoglycoside antibiotics // Hear Res. 1989. V. 37, No 3. P. 203-217.

133. Kruppel Т., Furchbrich V., Leuken W. Electrical responses of the marine ciliate Euplotes vannus (Hypotrichia) to mechanical stimulation at the posterior cell end // J. Membr. Biol. 1993. V. 135, No 3.P. 253-260.

134. Macfarlane S.R., Seatter M.J., Капке Т., Hunter G.D., Plevin R. Proteinase-activated receptors // Pharmacol. Rev. 2001. V. 53, No 2. P. 245-282.

135. Machemer-Rohnisch S., Machemer H. Receptor current following controlled stimulation of immobile tail cilia in Paramecium caudatum // J. Сотр. Physiol. A. 1984. V. 154. P. 263-271.

136. Machemer H., Ogura A. Ionic conductances of membranes in ciliated and deciliated Paramecium // J. Physiol. 1979. V. 296. P. 49-60.

137. Mackie G.O., Singla C.L. The capsular organ of Chelyosoma productum (Ascidiacea: Corellidae): a new tunicate hydrodynamic sense organ // Brain. Behav. Evol. 2003. V. 61, No l.P. 45-58.

138. Malnic G., Berliner R.W., Giebisch G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat // Am. J. Physiol. 1989. V. 256, No 5, Pt. 2. P. F932-F941.

139. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert N.E. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in the membrane and lipoprotein samples // Analyt. Biochem. 1978. V. 87, No 1. P. 206-210.

140. Maroto R., Hamill O.P. Brefeldin A block of integrin-dependent mechanosensitive ATP release from Xenopus oocytes reveals a novel mechanism of mechanotransduction // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, No 26. P. 23867-23872.

141. Marshall W.F., Rosenbaum J.L. Intraflagellar transport balances continuous turnover of outer doublet microtubules: implications for flagellar length control // J. Cell. Biol. 2001. V. 155, No 3. P. 405-414.

142. Marszalek J.R., Liu X.Z., Roberts E.A., Chui D., Marth J.D., Williams D.S., Goldstein L.S. Genetic evidence for selective transport of opsin and arrestin by kinesin-II in mammalian photoreceptors // Cell. 2000. V. 102, No 2. P. 175-187.

143. Martin P., Bozovic D., Choe Y., Hudspeth A.J. Spontaneous oscillation by hair bundles of the bullfrog's sacculus // J. Neurosci. 2003. V. 23, No 11. P. 4533-4548.

144. Martinez A., Lopez J., Villaro A.C., Sesma P. Choanocyte-like cells in the digestive system of the starfish Marthasterias gracilis (Echinodermata) // J. Morphol. 1991. V. 208. P. 215-225.

145. Maruyama I., Inagaki M., Momose K. The role of serotonin in mucociliary transport system in ciliated epithelium of frog platine mucosa // Eur. J. Pharmac. 1984. V. 106, No 3. P. 499-506.

146. McGrath J., Brueckner M. Cilia are at the heart of vertebrate left-right asymmetry // Curr.

147. Mire P., Nasse J. Hair bundle motility induced by chemoreceptors in anemones // Hear. Res. 2002. V. 163, No 1-2. P. 111-120.

148. Mogami Y., Watanabe K., Ooshima C., Kawano A., S.A. B. Regulation of ciliary movement in sea urchin embryos: Dopamine and 5-HT change the swimming behavior// Сотр. Biochem. Physiol. 1992. V. 101C. P. 251-254.

149. Moir A.J.G. On the ultrastructure of the abdominal sense organ of the giant scallop Placopecten magellanicus (Gmelin) // Cell Tissue Res. 1977a. V. 184. P. 359-366.

150. Moir A.J.G. Ultrastructural studies on the ciliated receptors of the long tentacles of the giant scallop Placopecten magelanicus (Gmelin) // Cell. Tiss. Res. 1977b. V. 184. P. 367380.

151. Montalvo S., Junoy J., Roldan C., GarciaCorrales P. Ultrastructural study of sensory cells of the proboscidial glandular epithelium of Riseriellus occultus (Nemertea, Heteronemertea) // J. Morphol. 1996. V. 229. P. 83-96.

152. Montell C. Physiology, phylogeny, and functions of the TRP superfamily of cation channels // Sci. STKE. 2001. V. 2001, No 90. P. RE1.

153. Moran D.T., Varela F.J., Rowley I.J.C. Evidence for active role of cilia in sensory transduction // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74, No 2. P. 793-797.

154. Morris R.L., Scholey J.M. Heterodimeric kinesin-II is required for the assembly of motile 9+2 ciliary axonemes on sea urchin embryos // J. Cell Biol. 1997. V. 138, No 5. P. 1009-1022.

155. Moulins M. Ultrastructure of chordotonal organs // Structure and function of proprioreceptors in the invertebrates / P. Mill ed. London: Chapman and Hall, 1976. P. 387-426.

156. Murakami A., Machemer H. Mechanoreception and signal transmission in the lateral ciliated cells on the gill of Mytilus II J. Сотр. Physiol. 1982. V. 145. P. 351-362.

157. Murakami A. Control of ciliary beat frequency in Mytilus II J. submicrosc. Cytol. 1983. V. 15. P. 313-316.

158. Murakami A. Control of ciliary beat frequency in the gill of Mytilus I Activation of lateral cilia by cyclic AMP // Сотр. Biochem. Physiol. 1987. V. 86C, No 2. P. 273-279.

159. Nakagawa Т., Kakahata S., Akaike N., Kiomune S., Takasaka Т., Uemura T. Effects of Ca2+ antagonists and aminoglucoside antibiotics on Ca currents in isolated outer hair cells of guinea pig cochlea // Brain Res. 1992a. V. 580, No 1-2. P. 345-347.I

160. Nakagawa Т., Kakehata S., Akaike N., Komune S., Takasaka Т., Uemura T. Effects of Ca antagonists and aminoglycoside antibiotics on Ca current in isolated outer hair cells of guinea pig cochlea // Brain Res. 1992b. V. 580, No 1-2. P. 345-347.

161. Nakamura S., Tanaka G., Maeda Т., Kamiya R., Matsunaga Т., Nikaido O. Assembly and function of Chlamydomonas flagellar mastigonemes as probed with a monoclonal antibody // J. Cell Sci. 1996. V. 109, No Pt. 1. P. 57-62.

162. Neugebauer D.-C., Thurm U. Surface charges of the membrane and cell adhesion substances determine the structural integrity of hair bundles from the inner ear of fish // Cell Tissue Res. 1987. V. 249. P. 199-207.

163. Nicolson T. Fishing for key players in mechanotransduction // Trends Neurosci. 2005. V. 28, No 3. P. 140-144.

164. Niemeyer B.A., Suzuki E., Scott K., Jalink K., Zuker C.S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL // Cell. 1996. V. 85, No 5. P. 651-659.

165. Nishikawa S., Sasaki F. Internalization of styryl dye FM1-43 in the hair cells of lateral line organs in Xenopus larvae // J. Histochem. Cytochem. 1996. V. 44, No 7. P. 733-741.

166. Noben-Trauth K., Zheng Q.Y., Johnson K.R. Association of cadherin 23 with polygenic inheritance and genetic modification of sensorineural hearing loss // Nat. Genet. 2003. V. 35, No 1. P. 21-23.

167. Nomura K., Naruse K., Watanabe K., Sokabe M. Aminoglycoside blokade of Ca2+-activated K+ channels from rat brain synaptosomal membranes incorporated into planar bilayers // J. Membr. Biol. 1991. V. 115, No 3. P. 241-251.

168. Nonaka S., Shiratori H., Saijoh Y., Hamada H. Determination of left-right patterning of the mouse embryo by artificial nodal flow // Nature. 2002. V. 418, No 6893. P. 96-99.

169. Norrevang A., Wingstrand K.G. On the occurrence and structure of choanocyte-like cells in some echinoderms // Acta Zool. 1970. V. 51. P. 249-270.

170. Ohmori H. Mehano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick//J. Physiol. 1985. V. 359. P. 189-217.

171. Ohno M., Cooke J.P., Dzau V.J., Gibbons G.H. Fluid shear stress induces endothelial transforming growth factor beta-1 transcription and production Modulation by potassium channel blockade // J. Clin. Invest. 1995. V. 95, No 3. P. 1363-1369.

172. Okada Y., Nonaka S., Tanaka Y., Saijoh Y., Hamada H., Hirokawa N. Abnormal nodal flow precedes situs inversus in iv and inv mice // Mol. Cell. 1999. V. 4, No 4. P. 459-468.

173. Okhuno M., Hiramoto R. Direct measurements of the stiffness of echinoderm sperm flagella // J. Exp. Biol. 1979. V. 79. P. 235-243.

174. Okuno S., Inaba M., Nishizawa Y., Inoue A., Morii H. Effect of tolbutamide and glyburide on cAMP-dependent protein kinase activity in rat liver cytosol // Diabetes. 1988. V. 37, No 7. P. 857-861.

175. Ono Т., Schacht J. Acoustic stimulation increases phosphoinositide breakdovn in the guinea pig cochlea // Neurochem. Int. 1989. V. 14, No 3. P. 327-330.

176. Osborne M.P., Comis S.D., Pickles J.O. Further observations on the fine structure of tip links between stereocilia of the guinea pig cochlea // Hear Res. 1988. V. 35, No 1. P. 99-108.

177. Osborne M.P., Comis S.D. Action of elastase, collagenase and other ensymes upon linkages between stereocilia on outer hair cells in the guinea pig cochlea // Acta Otolaryngol. (Stok). 1990. V. 110, No 1-2. P. 37-45.

178. Pan J., Snell W.J. Signal transduction during fertilization in the unicellular green alga, Chlamydomonas II Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. V. 3, No 6. P. 596-602.

179. Paparo A., Murphy J.A. The regulation of intracellular calcium and relase of neurotransmitters in the mussel, Mitilus edulis 11 Сотр. Biochem. Physiol. 1979. V. 66, No 6. P. 517-520.

180. Pape H.-C., Machemer H. Electrical properties and membrane currents in ciliate Didinium II J. Сотр. Physiol. A. 1986. V. 158. P. 111-124.

181. Pariselle A., Matricon-Gondran M. A new type of ciliated receptor in the cercariae of Nicollagallica (Trematoda) HZ. Parasitenkd. 1985. V. 71. P. 353-364.

182. Pazour G., Baker S., Deane J., Cole D., Dickert В., Rosenbaum J., Witman G., Besharse J. The intraflagellar transport protein, IFT88, is essential for vertebrate photoreceptor assembly and maintenance // J. Cell Biol. 2002. V. 157, No 1. P. 103-113.

183. Pazour G.J., Dickert B.L., Witman G.B. The DHClb (DHC2) isoform of cytoplasmic dynein is required for flagellar assembly // J. Cell. Biol. 1999. V. 144, No 3. P. 473481.

184. Pazour G.J., Rosenbaum J.L. Intraflagellar transport and cilia-dependent diseases // Trends Cell Biol. 2002. V. 12, No 12. P. 551-555.

185. Pazour G.J., Witman G.B. The vertebrate primary cilium is a sensory organelle // Curr Opin Cell Biol. 2003. V. 15, No 1. P. 105-110.

186. Pelseneer P. Contribution a l'etude des Lammellibranches. // Archive des Biologie. 1891. V. 9. P. 147-312.

187. Pennekamp P., Karcher C., Fischer A., Schweickert A., Skryabin В., Horst J., Blum M., Dworniczak B. The ion channel polycystin-2 is required for left-right axis determination in mice // Curr Biol. 2002. V. 12, No 11. P. 938-943.

188. Peteya D.J. The ciliary-cone sensory cell of anemones and cerianthids // Tissue Cell. 1975. V. 7, No 2. P. 243-252.

189. Phillips A.P., Martin K.L., Horton W.H. The choice of methods for immunoglobulin purification: yield and purity of antibody activity // J. Immunol. Meth. 1984. V. 74, No 2. P. 385-397.

190. Phillips C.E., Friessen W.O. Ultrastructure of water-movement-sensitive sensilla in the medicinal leech // J. Neurobiol. 1982. V. 13, No 6. P. 443-486.

191. Pichon Y., Moueza M., Frenkiel L. Physiologie de l'organe sensorial du muscle cruciforme de Donax trunculus II J. Physiol. 1978. V. 74. P. 9A.

192. Pichon Y., Moueza M., Frenkiel L. Mechanoreceptor properties of the sense organ of the cruciform muskle in tellinacean lamellibranch Donax trunculus L // Mar. Biol. Lett. 1980. V. l,No 5. P. 273-284.

193. Pickles J.O., Comis C.D., Osborne M.P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transducing // Hear Res. 1984. V. 15, No 2. P. 103-112.

194. Pickles J.O. A model for the mechanics of the stereociliar bundle on acousticolateral hair cells // Hear Res. 1993. V. 68, No 2. P. 159-172.

195. Piperno G., Mead K., Henderson S. Inner dynein arms but not outer dynein arms require the activity of kinesin homologue protein КНР 1 (FLA 10) to reach the distal part of flagella in Chlamydomonas II J. Cell. Biol. 1996. V. 33, No 2. P. 371-379.

196. Porter M.E., Bower R., Knott J.A., Byrd P., Dentler W. Cytoplasmic dynein heavy chain lb is required for flagellar assembly in Chlamydomonas II Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10, No 3. P. 693-712.

197. Porter R.R. Separation and isolation of fraction of rabbit gamma-globulin containing the antibody and antigenic combining sites // Nature Lond. 1958. V. 182, No 4636. P. 670-671.

198. Praetorius H.A., Spring K.R. Bending the MDCK cell primary cilium increases intracellular calcium//J. Membr. Biol. 2001. V. 184,No 1. P. 71-79.

199. Praetorius H.A., Spring K.R. Removal of the MDCK cell primary cilium abolishas flow sensing // J. Membr. Biol. 2003. V. 191, No 1. P. 69-76.

200. Praetorius H.A., Praetorius J., Nielsen S., Frokiaer J., Spring K.R. Betal-integrins in the primary cilium of MDCK cells potentiate fibronectin-induced Ca2+ signaling // Am J Physiol Renal Physiol. 2004. V. 287, No 5. P. F969-978.

201. Praetorius H.A., Spring K.R. A physiological view of the primary cilium // Annu. Rev. Physiol. 2005. V. 67. P. 515-529.

202. Preyer S., Hemmert W., Zenner H.P., Gummer A.W. Abolition of the receptor potential response of isolated mammalian outer hair cells by hair-bundle treatment with elastase: a test of the tip-link hypothesis // Hear Res. 1995. V. 89, No 1-2. P. 187193.

203. Quarmby L.M. Cellular deflagellation // Int. Rev. Cytol. 2004. V. 233. P. 47-91.

204. Repass J.J., Watson G.M. Anemone repair proteins as a potential therapeutic agent for vertebrate hair cells: facilitated recovery of the lateral line of blind cave fish // Hear. Res. 2001. V. 154, No 1-2. P. 98-107.

205. Rhoads D.E., Kaneshiro E.S. Characterizations of phospholipids from Paramecium tetraurelia cells and cilia // J. Protozool. 1979. V. 26, No 2. P. 329-338.

206. Ricci A.J., Fettiplace R. The effects of calcium buffering and cyclic AMP on mechanoelectrical transduction in turtle auditory hair cells. // J. Physiol. 1997a. V. 501, No Pt l.P. 111-124.

207. Ricci A.J., Fettiplace R. The effects of calcium buffering and cyclic AMP on mechanoelectrical transduction in turtle auditory hair cells // J. Physiol. 1997b. V. 501, No Pt LP. 111-124.

208. Roberts W.M., Howard J., Hudspeth A.J. Hair cells: transduction, tuning, and transmission in the inner ear // Annu. Rev. Cell. Biol. 1988. V. 4. P. 63-92.

209. Rosenbaum J.L., Witman G.B. Intraflagellar transport // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. V. 3,No 11. P. 813-825.

210. Rouser G., Nelson G., Fleischer S., Simon G. The biological membranes. New York: Acad. Press., 1968. 5-69 c.

211. Ruan R.S., Leong S.K., Yeoh K.H. Ototoxicity of sodium nitroprusside is not due to nitric oxide // Exp. Neurol. 1999. V. 158, No 1. P. 192-201.

212. Rubanyi G.M., Romero J.C., Vanhoutte P.M. Flow-induced release of endothelium-derived relaxing factor//Am. J. Physiol. 1986. V. 250, No 6 Pt 2. P. HI 145-H1459.

213. Rusch A., Kros C.J., Richardson G.P. Block by amiloride and its derivatives of mechanoelectrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures // J. Physiol. 1994. V.474,No l.P. 75-86.

214. Russell I.J., Sellick P.M. Measurements of potassium and chloride ion concentrations in the cupulae of the lateral lines of Xenopus laevis II J. Physiol (Lond). 1976. V. 257, No l.P. 245-255.

215. Sabatini B.L., Regehr W.G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain //Nature. 1996. V. 384, No 6605. P. 170-172.

216. Saimi Y., Murakami A., Takahashi K. Electrophysiological correlates of nervous control of ciliary arrest responce in the gill epithelial cells of Mytilus II Сотр. Biochem. Physiol. 1983. V. 74A, No 4. P. 499-506.

217. Sand O. The lateral line and sound reception // Hearing and sound communication in fishes / W.N. Tavolga, A.N. Popper, R.R. Fay ed. New York: Acad. Press., 1981. P. 459478.

218. Sanderson M.J., Slegh M.A. Serum proteins agglutinate cilia and modify ciliary coordination // Pediatr. Res. 1981. V. 15, No 3. P. 219-228.

219. Sanderson M.J., Sleigh M.A. The effects of serum immunuglobulins on the metachronal coordination of the lateral cilia of Mytilus edulis // Cell Motility. 1984. V. 4, No 2. P. 103-119.

220. Sanderson M.J., Dirksen E.R. Mechanosensitivity of cultured ciliated cells from the mammalian respiratory tract: implications for the regulation of mucociliary transport // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83, No 19. P. 7302-7306.

221. Schacht J. Purification of polyphosphoinositides by chromatography on immobilized neomycin. //J. Lipid Res. 1978. V. 19, No 8. P. 1063-1067.

222. Schacht J. Molecular mechanisms of drug-induced hearing loss // Hear Res. 1986. V. 22. P. 297-304.

223. Scholey J.M. Intraflagelar transport // Annu. Rev. Cell. Dev. 2003. V. 19. P. 423-443.

224. Schwartz E.A., Leonard M.L., Bizios R., Bowser S.S. Analysis and modeling of the primary cilium bending response to fluid shear // Am. J. Physiol. 1997. V. 272(1 Pt 2), No 1 Pt. 2. P. F132-138.

225. Sedgwick S.G., Smerdon S.J. The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework//Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24,No 8. P. 311-316.

226. Seiler C., Nicolson T. Defective calmodulin-dependent rapid apical endocytosis in zebrafish sensory hair cell mutants // J. Neurobiol. 1999. V. 41, No 3. P. 424-434.

227. Sidi S., Friedrich R.W., Nicolson T. NompC TRP channel required for vertebrate sensory hair cell mechanotransduction // Science. 2003. V. 301, No 5629. P. 96-99.

228. Siemens J., Lillo C., Dumont R.A., Reynolds A., Williams D.S., Gillespie P.G., Muller U. Cadherin 23 is a component of the tip link in hair-cell stereocilia // Nature. 2004. V. 428, No 6986. P. 950-955.

229. Sizov A.V., Zhadan P.M. Protein differences in cilia of mechanoreceptor hair and gill cells of the scallop Mizuhopecten yessoensis II Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V. 94B. P. 277-284.

230. Snell W.J. Mating in Chlamydomonas: a system for the study of specific cell adhesion. I. Ultrastructural and electrophoretic analyses of flagellar surface components involved in adhesion // J. Cell Biol. 1976. V. 68, No 1. P. 48-69.

231. Stephens P.J. The sensitivity and control of the scallop mantle edge // J. Exp. Biol. 1978. V. 75. P. 203-221.

232. Stommel E.W., Stephens R.E. Calcium-dependent phosphatidylinositol phosphorylation in lamellibranch gill lateral cilia. // J. Сотр. Physiol. A. 1985. V. 157, No 4. P. 441449.

233. Stommel E.W., Stephens R.E. EGTA induces summed depolarizations in Mytilus gill coupled epithelial cells: Implication for the control of ciliary motility // Cell Motil. Cytoskel. 1988. V. 10, No 4. P. 4640-4670.

234. Strassmaier M., Gillespie P.G. The hair call's transduction channel // Curr. Opin. Neurbiol. 2002. V. 12, No 4. P. 380-386.

235. Strathmann R.R. The feeding behavior of plantonic echinoderm larvae: Mechanisms, regulation and rates of suspension feeding // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1971. V. 6. P. 109-160.

236. Sudol M., Chen H.I., Bougeret C., Einbond A., Bork P. Characterization of a novel protein-binding module the WW domain // FEBS Lett. 1995. V. 369, No 1. P. 67-71.

237. Sukharev S., Corey D.P. Mechanosensitive channels: multiplicity of families and gating paradigms // Sci. STKE. 2004. V. 219. P. 1-23.

238. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin-layer microchromatography of lipids // J. Chromatogr. 1972. V. 67, No 2. P. 376-378.

239. Syed N.I., Winlow W. Morphology and electrophysiology of neurons innervating the ciliated locomotorr ephithelium in Lymnea stagnalis (L) // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V. 93A, No 4. P. 633-644.

240. Takumida M., Anniko M., Popa R., Zhang D.M. Localization of soluble guanylate cyclase activity in the guinea pig inner ear // Acta Otolaryngol. (Stockh). 2000. V. 120, No 1. P. 28-33.

241. Tamaoki J., Kondo M., Takizawa T. Effect of cAMP on ciliary function in rabbit tracheal epithelial cells //J. Appl. Physiol. A. 1989. V. 66, No 3. P. 1035-1039.

242. Tardent P., Schmid V. Ultrastructure of mechanoreceptors of the polyp Cotyne pintneri (Hydrosoa, Athecata) // Exp. Cell Res. 1972. V. 72, No 1. P. 268-275.

243. Thiele J. Ein neues sinnesorgan der Lamellibranchier // Zool. Anzeiger. 1887. V. 10. P. 413424.

244. Thiele J. Die abdominalen sinnesorgane der Lamellibranchier // Z. wiss. Zool. 1889. V. 48. P. 47-59.

245. Thurm U. Mechanoreceptors in the cuticle of honey bee: fine structure and stimulus mechanism//Science. 1964. V. 145. P. 1063-1065.

246. Thurm U. An insect mechanoreceptor. Part I: fine structure and adequate stimulus // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1965. V. 30. P. 75-82.

247. Thurm U. Steps in the transducer process of mechanoreception // Symp. Zool. Soc. London. 1968. V. 23. P. 199-216.

248. Thurm U., Kuppers J. Eputhelial physiology of insect sensilla // Insect biology in the future / M. Locke, D. Smith ed. New York: Academic Press, 1980. P. 735-763.

249. Thurm U. Mechano-electric transduction // Biophysic / L.W. Hoppe W., Markl H., Zeiler H. ed. Berlin: Springer-Verlag, 1983. P. 666-671.

250. Tschumperlin D.J. EGFR autocrine signaling in a compliant interstitial space // Cell Cycle. 2004. V. 3, No 8. P. 996-997.

251. Tsiokas L., Arnould Т., Zhu C., Kim E., Walz G., Sukhatme V.P. Specific association of the gene product of PKD2 with the TRPC1 channel. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96, No 7. P. 3934-3939.

252. Tu Y., Budelmann B.U. Effects of L-arginine on the afferent resting activity in the cephalopod statocyst// Brain Res. 1999. V. 845, No 1. P. 35-49.

253. Uga S., Kuwabara M. On the fine structure of the chordotonal sensilum in antena of Drosophila melanogaster // J. Electron Microsc. 1965. V. 14. P. 173-181.

254. Vaskovsky V.E., Dembitzky V.M. Determination of plasmalogen contents of phospholipid classes by reaction micro-thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1975. V. 115, No 2. P. 645-647.

255. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr. 1975. V. 114, No 1. P. 129-141.

256. Wada Т., Wakabayashi Y., Takahashi S., Ushiki Т., Kikkawa Y., Yonekawa H., Kominami R. A point mutation in a cadherin gene, Cdh23, causes deafness in a novel mutant, Waltzer mouse niigata // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 283, No l.P. 113-117.

257. Walczak C.E., Nelson D.L. Regulation of dynein-driven motility in cilia and flagella // Cell Motility and the Cytoskeleton. 1994. V. 27, No 2. P. 101-107.

258. Walker C.W. Ultrastructure of somatic portion of the gonads in asteroids, with emphasis on flagellated-collar cells and nutrient transport // J. Morphol. 1979. V. 162. P. 127-162.

259. Walker R.G., Hudspeth A.J., Gillespie P.G. Calmodulin and calmodulin-binding proteins in hair bundles // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1993. V. 90, No 7. P. 2807-2811.

260. Walker R.G., Hudspeth A.J. Calmodulin controls adaptation of mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93, No 5. P. 2203-2207.

261. Walker R.G., Willingham A.T., Zuker C.S. A Drosophila mechanosensory transduction channel // Science. 2000. V. 287, No 5461. P. 2229-2234.

262. Watson G.M., Hessinger D.A. Cnidocyte mechanoreceptors are tuned to the movements of swimming prey by chemoreceptors // Science. 1989. V. 243, No 4898. P. 1589-1591.

263. Watson G.M., Roberts J. Chemoreceptor-mediated polymerization and depolymerization of actin in hair bundles of sea anemones // Cell Motil. Cytoskeleton. 1995. V. 30, No 3. P. 208-220.

264. Watson G.M., Mire P., Hudson R.R. Hair bundles of sea anemones as a model system for vertebrate hair bundles // Hear. Res. 1997. V. 107, No 1-2. P. 53-66.

265. Watson G.M., Mire P., Hudson R.R. Repair of hair bundles in sea anemones by secreted proteins//Hear. Res. 1998. V. 115, No 1-2. P. 119-128.

266. Watson G.M., Mire P. A comparison of hair bundle mechanoreceptors in sea anemones and vertebrate systems // Curr. Top. Dev. Biol. 1999. V. 43. P. 51-84.

267. Watson G.M., Venable S., Hudson R.R., Repass J.J. ATP enhances repair of hair bundles in sea anemones // Hear. Res. 1999. V. 136, No 1-2. P. 1-12.

268. Watson G.M., Mire P. Reorganization of actin during repair of hair bundle mechanoreceptors //J. Neurocytol. 2001. V. 30, No 11. P. 895-906.

269. Wheatley D.N. Primary cilia in normal and pathological tissues // Pathobiology. 1995. V. 63, No 4. P. 222-238.

270. Wiederhold M.L. Aplysia statocyst receptor cells: intracellular responses to physiologicalstimuli // Brain Res. 1974. V. 78, No 3. P. 490-494. Wilkens L.A. Neurobiology of the scallop. I Starfish-mediated escape behaviours // Proc. R.

271. Soc.Lond. 1981. V. В 211. P. 341-372. Williams P.L., Warwick P., Dyson M., Banister L.H. Cell and Tissues // Grays Anatomy /

272. Yanagisawa К., Yoshioka Т., Inoue H., Hayashi Т. Potassium effects on phosphatidylinositol phosphorilation in cochlea tissues // Neurosci. Lett. 1982. V. 9. P.S113.

273. Yoder B.K., Hou X., Guay-Woodford L.M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia // J. Am. Soc. Nephrol. 2002. V. 13, No 10. P. 2508-2516.

274. Yoshimura K. A novel type of mechanoreception by the flagella of Chlamydomonas // J. Exp. Biol. 1996. V. 199, No Pt 2. P. 295-302.

275. Yoshimura K. Mechanosensitive channels in the cell body of Chlamydomonas II J. Membr. Biol. 1998. V. 166, No 2. P. 149-155.

276. Zhadan P.M., Semen'kov P.G. An electrophysiological study of the mechanoreceptory function of the abdominal sense organ of the scallop Patinopecten yessoensis (Jay) // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. V. 78A, No 4. P. 865-870.

277. Zhadan P.M., Sizov A.V., Dautov S.S. Ultrastructure of the abdominal sense organ of the scallop Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Cell Tissue Res. 2004. V. 318, No 3. P. 617629.

278. Zhao Y., Yamoah E.N., Gillespie P.G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 94, No 26. P. 15469-15474.

279. Zheng J.L., Gao W., Q. Concanavalin A protects hair cells against gentamicin ototoxicity in rat cochlear explant cultures // J. Neurobiol. 1999. V. 39, No 1. P. 29-40.