Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нитроксидергические клетки в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Нитроксидергические клетки в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков"

На правах рукописи

ПИМЕНОВА

Евгения Александровна

НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ В

ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток-2004

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник ИБМДВО РАН А.А. Вараксин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией сравнительной цитологии ИБМ ДВО РАН И.Ю. Долматов

кандидат биологических наук, доцент кафедры клеточной биологии АЭМББТ ДВГУН.П. Токмакова

Ведущее учреждение:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится июня 2004 года в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН (690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17).

Автореферат разослан мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени известно, что оксид азота (N0) синтезируется ферментативным путем и действует как универсальный эндогенный регулятор клеточного и тканевого метаболизма у позвоночных и беспозвоночных животных. Распределение ферментов синтеза N0 и его значение у позвоночных интенсивно исследуется (Garthwaite, Boulton, 1995; Мотавкин, Гельцер, 1998; Ashutosh, 2000; Bogdan, 2001; Martin et al., 2002; Gregg, 2003; Mungrue et al., 2003). У беспозвоночных значение NO изучено в значительно меньшей степени, однако показано, что NO участвует в нейротрансмиссии и нейромодуляции, регулирует мышечную активность, пищевое поведение, респираторную, репродуктивную функции, солевой и водный баланс, участвует в механизмах иммунологической защиты организма, в клеточной пролиферации и дифференцировки (Jacklet, 1997; Colasanti, Venturini, 1998; Lewin, Walters, 1999; Annikova et al., 2001; Torreilles, Guerin, 2001; Katzoffet al., 2002; Licata et al., 2003).

Доказана многогранная роль оксида азота в физиологии пищеварительных функций у высших (Schleiffer, Raul, 1997; Jourd'heuil et al., 1999; Hansen, 2003; Takahashi, 2003; Shah et al., 2004) и низших позвоночных животных (Li et al., 1993, 1994; Li, Furness, 1993; Brilning et al., 1996; Olsson, Karila, 1997; Lamanna et al., 1999; Olsson, Gibbins, 1999; Holmberg et al., 2003). NO участвует в регуляции перистальтики всех органов желудочно-кишечного тракта, контролирует кровяной ток, экзокринную и эндокринную секреции, принимает участие в защитных механизмах. Нарушения экспрессии нейрональной NO-синтазы приводят к появлению различных заболеваний пищеварительной системы (Takahashi, 2003; Ding, Li, 2003; Shah et al., 2004).

Сведения о NO-ергических клетках в пищеварительной системе и роли оксида азота в процессах питания и пищеварения у беспозвоночных крайне малочисленны. NO-ергические клетки найдены в кардиальном желудке морских звезд (Martinez et al., 1994; Elphick, Melarange, 1998) и пищеводе брюхоногих моллюсков, где NO является сенсорным нейромодулятором (Elphick et al., 1994; Moroz et al., 1993; Moroz, Gillette, 1996; Hurst et al., 1999). Известно, что NO-синтаза содержится в центрах, ответственных за ритмы питания, буккальных ганглиев Lymnaea stagnalis (Kobayashi et al., 2000), Clione liacina (Moroz

MM IMIT tKA f° И Д 3301-3

играет важную роль в процессах питания и пищеварения и у двустворчатых моллюсков, сведения о чем, по-видимому, ограничиваются только нашими работами (УагаШп et а1., 2002; Пименова и др., 2002; Пименова, Вараксин, 2003).

Цель и задачи исследования. Цель нашей работы - установить наличие и локализацию, описать морфологию и сезонную динамику нитроксидергических клеток в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков.

В работе решались следующие задачи:

1. Показать наличие нитроксидергических элементов в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков.

2. Описать локализацию, морфологию и природу нитроксидергических клеток и сплетений в ротовых лопастях, губах, пищеводе, желудке, пищеварительной железе и кишечнике.

3. Изучить особенности распределения нитроксидергических клеток в органах пищеварительной системы у разных видов двустворчатых моллюсков.

4. Исследовать сезонную динамику нитроксидергических клеток в пищеварительной системе СгепошуШш grayanus.

Научная новизна. Впервые получены данные о наличии нитроксидергических клеток и сплетений в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков. Подробно описаны их распределение, локализация в пределах органа и морфологические особенности. Установлено, что пищеварительная система двустворчатых моллюсков обладает развитой единой нитроксидергической системой, включающей интра- и субэпителиальные нервные клетки, бази- и субэпителиальные нервные сплетения, а также секреторные и каемчатые клетки. Выявлены сезонные изменения плотности распределения нитроксидергических нервных элементов в пищеварительном тракте С. grayanus. Для кишечного эпителия С. grayanus установлена обратно пропорциональная зависимость между плотностью распределения КО-ергических нервных клеток и пролиферативной активностью эпителия.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о наличии, локализации и основных морфологических характеристиках нитроксидергических клеток в пищеварительной системе двустворчатых моллюсков послужат морфологической базой для дальнейших исследований

физиологической значимости оксида азота в пищеварительной системе двустворок. Эти сведения расширяют теоретические представления о нейротрансмиттерных и нейромодуляторных системах и вносят определенный вклад в изучение фундаментальных механизмов регуляции пищеварительной системы в целом. Они дополняют представления о возникновении и распространении NO-ергической системы у филогенетически ранних групп животных. Данные о сезонных изменениях плотности распределения нитроксидергических элементов, дополняют представления о механизмах пролиферативной активности кишечного эпителия двустворчатых моллюсков. Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах для студентов биологических вузов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и доложены: на ежегодных научных конференциях Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 1999, 2001, 2003); VI Европейской конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных "Простые нервные системы" (Москва-Пущи но, 2000); IV международной конференции по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения-2002" (Санкт-Петербург,

2002); региональной конференции молодых ученых ДВО РАН (Владивосток, 2002); VII дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН,

2003); Всероссийской конференции молодых ученых "Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов" (ТИНРО-Центр, Владивосток, 2003); VII Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, который включает 203 наименований (из них - 161 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 12 таблицами.

Благодарности. Выражаю глубокую благодарность и уважение моему научному руководителю, д.б.н., ведущему научному сотруднику А.А. Вараксину за огромную и неоценимую помощь на всех этапах планирования и выполнения работы, а также анализа полученных результатов. Особую благодарность выражаю

к.б.н. Л.В. Анниковой за практическую помощь в освоении методик и участие в обсуждении результатов исследования, д.м.н., профессору П.А. Мотавкину и к.б.н. Л.Т. Фроловой за ценные замечания и консультации. Благодарю сотрудников лаборатории цитофизиологии ИБМ ДВО РАН за. поддержку и помощь. Признательна к.б.н. Г.Г. Калининой за предоставление возможности работы на световом микроскопе Olympus BH2-RFCA модели BHS.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН ОЗ-3-Г-О6-089 и 04-3-Г-06-045.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Исследования проводили на половозрелых самцах и самках, которых собирали в заливах Амурском, Уссурийском и Восток Японского моря в летний и осенний. периоды 1999-2003 гг. Для адаптации животных содержали в аквариуме с аэрируемой морской водой без кормления в течение 2-3 суток. Перечень исследованных моллюсков и их количество приведен в таблице 1.

Таблица 1

Исследованные двустворчатые моллюски

№ Систематическое положение Количество

Отряд Семейство Род, вид, место сбора

1. Mytilida Mytiiidae Crenomytilus grayanus 42

2. Modiolus modiolus 20

3. Mytilus coruscus 7

4. Glycymerididae Glycymeris yessoensis 9

5. Anadaridae Anadara broughtoni 10

6. Arcidae Arca boucardi 7

7. Crassostreidae Crassostrea gigas 6

8. Pectinida Pectinidae Mizuhopecíen yessoensis 2

9. Swiftopecten swifti 5

10. Cardiida Tellinidae Peronidia venulosa 4

11. Veneridae Ruditapes philippinarum 6

12. Mercenaria stimpsoni 8

13. Callithaca adamsi 5

14. Mactridae Mactra chinensis 5

15. Spisula sachalinensis 11

16. Myidae - Mya japónica 4

В работе использован комплекс общеморфологических, гистохимических, морфометрических и статистических методов исследования.

Морфологические методы. Для общеморфологических исследований участки ротовых лопастей, губ, пищевода, желудка, пищеварительной железы и отделов кишечника фиксировали в жидкости Буэна и/или в 4 % растворе параформальдегида. Парафиновые и/или криостатные срезы толщиной 5 и 20 мкм, соответственно, окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином.

Гистохимические методы. Локализацию и морфологию нитроксидергических клеток в отделах пищеварительной системы изучали с помощью гистохимического метода выявления NADPH-диафоразы (Hope, Vincent, 1989). Метод основан на образовании нерастворимого осадка диформазана в присутствии кофактора -NADPH и экзогенного субстрата - нитросинего тетразолиевого (НСТ).

Известно, что NADPH-диафоразная реакция представляет собой побочную каталитическую активность NO-синтазы (Hope et al., 1991). В ходе гистохимических превращений синтаза оксида азота восстанавливает НСТ в осадок диформазана, который маркирует клетки, содержащие фермент. Считается, что из всей группы оксидоредуктаз, использующих в качестве кофактора NADPH, к параформальдегидной фиксации устойчива лишь NO-синтаза (Matsumoto et al., 1993). В этой связи гистохимическая NADPH-диафоразная активность рассматривается как топографический маркер структур, содержащих NO-синтазу в тканях млекопитающих (Hope et al., 1991; Cobbs et al., 1997) и беспозвоночных, в том числе моллюсков (Moroz, Gillette, 1995, 1996; Moroz et al., 1996; Newcomb, Watson, 2001).

Используемый метод имеет бесспорные преимущества, поскольку, выявляет клетку со всеми отростками на значительном их протяжении, что дает возможность описать ее морфологию, химическую специализацию и предположить функциональную принадлежность. Во-вторых, этот метод принято считать наиболее подходящим и удобным для проведения скрининговых исследований и обнаружения NO-синтазы у впервые изучаемых групп животных, что требует приготовления большого количества препаратов.

Отпрепарированные участки ротовых лопастей, губ, пищевода, желудка, пищеварительной железы, средней и задней кишки фиксировали 4% раствором параформальдегида, приготовленным на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2), в течение 2 ч при температуре 4°С. После фиксации материал промывали в 15%

растворе сахарозы на 0.15 М трис-HCl буфере (рН 8.0) 3-4 раза в течение 20 ч при той же температуре; промежуток времени между первой и второй сменами сахарозы составлял 1 ч. Затем готовили криостатные срезы толщиной 20 и 40 мкм. Участки отделов пищеварительной системы резали серийно в поперечном и продольном направлениях. Срезы инкубировали в среде, содержащей 0.5 мМ (5-NADPH (Sigma), 0.5 мМ нитросинего тетразолиевого (Sigma) и 0.3% тритона Х-100 в 0.15 М трис-HCl буфере (рН 8.0) в термостате при температуре 37°С в течение 1 ч. После инкубации препараты споласкивали в двух сменах дистиллированной воды, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в даммаровую смолу. Контрольные образцы инкубировали в среде с добавлением ингибитора NO-синтазы - 10 мМ Ы^нитро-Ь-аргинина, а также в среде без

добавления P-NADPH и в среде без добавления НСТ. Ни один из проведенных контролей не дал положительной реакции на NADPH-диафоразу.

Исследование сезонной динамики нитроксидергических нервных клеток в пищеварительной системе Crenomytilus grayanus. В губах, пищеводе, средней и задней кишке С. grayanus исследовали плотность распределения интраэпителиальных NO-ергических нервных клеток и толщину бази- и субэпителиального сплетений в разное время года, приуроченное к наиболее активным периодам пролиферативной активности кишечного эпителия этого моллюска (Фролова, Лейбсон, 2000). Материал брали от 5-6 животных в начале марта (нулевая пролиферативная активность), начале апреля (начало пролиферативной активности), конце апреля (максимальная пролиферативная активность), конце августа (снижение пролиферативной активности), конце сентября (умеренная пролиферативная активность).

Для определения зависимости между плотностью распределения NO-ергических клеток и значением митотического индекса в кишечном эпителии С. grayanus в разное время года, определяли общую долю этих клеток от количества эпителиоцитов во всех исследуемых отделах кишечника.

При проведении гистохимических исследований особое внимание обращали на соблюдение стандартизации условий забора, подготовки и обработки материала.

Морфометрические методы. Интраэпителиальные NADPH-д-позитивные клетки каждого исследованного отдела просчитывали на десяти поперечных

срезах, толщиной 20 мкм и определяли среднее их количество на один срез. Для определения доли этих клеток в губах, в начальном, среднем, нижнем отделах пищевода, в средней кишке и в задней кишке просчитывали общее количество эпителиоцитов, приходящееся на один поперечный срез.

Высоту и ширину клеток, толщину бази- и субэпителиальных сплетений определяли с помощью окулярной' сетки и объект-микрометра. Препараты просматривали, фотографировали на микроскопе Olympus BH2-RFCA модели BHS.

Математическую обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием статистической программы Statistica 5.0, пакета MS OFFICE для WINDOWS' 2000. С помощью двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями мы определяли: среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, критерии существенности различий (t). На основе доверительного коэффициента t, используя число наблюдений или число степеней свободы, по таблицам Стьюдента определяли коэффициент вероятности ошибки (р). Разницу между средними арифметическими считали достоверной при значении р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ NO-ергические клетки в пищеварительной системе

У подавляющего большинства исследованных двустворчатых моллюсков в пищеварительной системе обнаружены NO-ергические клетки различной природы и нервные сплетения. Для клеток и для сплетений характерно как интра-, так и субэпителиальное расположение.

Преимущественно во всех органах пищеварительной системы моллюсков присутствуют NO-ергические клетки с веретеновидной формой тела, тонкий апикальный отросток которых направлен к просвету отдела, тогда как базальный устремлен к основанию эпителиального пласта, контактируя с базиэпителиальным нитроксидергическим сплетением (табл. 2). Это клетки "открытого" типа. Реже в составе эпителия встречаются клетки без апикального отростка. Они имеют более округлое очертание и лежат в непосредственной близости к базиэпителиальному сплетению, являясь клетками "закрытого" типа. Осадок диформазана гомогенно маркирует цитоплазму, оставляя свободной от окрашивания область ядра. Доля интраэпителиальных NO-ергических клеток в отделах не превышает 1.42 % от

Таблица 2

Распределение NO-ергических элементов в органах пищеварительной системы

двустворчатых моллюсков

Рото- Губы и Сред, и Желу ПВЖ Сред Зад-

Виды вые начал. нижн. док няя няя

лопа- отдел• отделы киш- киш-

сти пищев. пищев. ка ка

Сем. Mytilidae •

Crenomytilus grayanus - (+) +++(+) ++(+) +++ +[+] +++ +++

Modiolus modiolus + (+) +++(+) + + [+] +++ +++

Myíilus coruscus - (+) + (+) +++ +[+] +++ ++

Сем. Glycymerididae

Glycymeris yessoensis + +++ +++(+) +++ + -Н-+ ++

Сем. Anadaridae

Anadara broughtoni - ++ ++ - - + +

Сем. Arcidae

Arca boucardi + + + +++ - ++ ++

Сем. Crassostreidae

Crassostrea gigas. + (+) ++ ++ + + +++ +++

Сем. Pectinidae

Mizuhopecten yessoensis ■ - ++* - - - - -

Swiftopecten swifti - ++* - - - + +

Сем. Tellinidae

Peronidia venulosa - + ++ + - +++ ++

Сем. Veneridae

Ruditapes philippinarum ? +++ ++ +++ +++ +++

Callithaca adamsi + ++ ++ +++ +[+] +++ +++

Mercenaria stimpsoni - - - + - [+] +++ +++

Сем. Mactridae

Mactra chinensis +++ +-Н- +++ + +[+]{+} +++ +++

Spisula sachalinensis ++ ++ ++ - - [+] {+} +++ +++

Сем. Myidae

Mya japónica ++ - - + - м +++ +++

Обозначения: + + + - интраэпителиальные NO-ергические нервные клетки и

сплетения; ++ - NO-ергические нервные сплетения; + - разреженные сети N0-ергических нервных волокон; (+) - N0-позитивные секреторные клетки; [+] - N0-позитивные каемчатые клетки протоков; {+} - N0-позитивные клетки пищеварительных трубочек; - - активность фермента не обнаружена; * - наличие преципитата только в губных выростах; ? - нет данных. Сокращения: начал., сред., нижн. отделы пищев. - начальный, средний, нижний отделы пищевода, соответственно; ПВЖ - пищеварительная железа.

Рис. 1. Схема распределения NO-ергических элементов в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков. А. ротовые лопасти, губы; Б. начальный отдел пищевода; В. пищеварительная железа; Г. начальный отдел средней кишки; Д. средняя кишка; Е. задняя кишка. Обозначения: 1. Главный проток; 2. Вторичный проток; 3. Пищеварительная трубочка; БМ - базальная мембрана; БТ - большой тифлозоль; БэС -базиэпителиальное сплетение; ВВ - вводной канал; ВЫ- выводной канал; Г- губа; ГП-гладкая поверхность ротовых лопастей; ИН -итраэпителиальная нервная клетка; ИС -интраэпителиальная секреторная клетка; КБ - кишечная борозда; КК - каемчатая клетка; КС - кристаллический стебелек; ЛКС - ложе кристаллического стебелька; МТ -малый тифлозоль; П - просвет отдела; РЛ - ротовые лопасти; СН - субэпителиальная нервная клетка; СП - складчатая поверхность ротовых лопастей; СС -субэпителиальная секреторная клетка; СэС - субэпителиальное сплетение; СТ -соединительная ткань; Э -эпителий.

общего числа эпителиоцитов, найденного в кишечной борозде Glycymeris yessoensis. Средняя ширина маркированных клеток составляет 4.9+0.1 мкм, а высота - 16.01+0.2 мкм. Их локализация в органах не имеет видовой специфичности. Поодиночке, или небольшими группами по 2-3 единицы N0-ергические клетки располагаются в базальной области эпителия преимущественно в дорсальном и вентральном участках органах (рис. 1).

Гистохимические, иммуногистохимические и электронно-микроскопические исследования последних трех десятилетий показали присутствие в эпителии большинства отделов пищеварительной системы беспозвоночных животных, включая и двустворчатых моллюсков, клеток, функция которых не связана непосредственно с процессами пищеварения. Это специализированные клетки, выполняющие регуляторные функции. У двустворчатых моллюсков энтеральная регуляторная система хорошо развита и образована как нервными, так и эндокринными клетками. Данные флуоресцентной гистохимии и иммуногистохимии свидетельствуют о сложном составе регуляторной системы. Описаны клетки, содержащие катехоламины и серотонинподобное вещество, иммунореактивные к инсулину млекопитающих, инсулиноподобному веществу моллюсков, кальцитонину лосося, нейротензину, пептиду - активатору роста головы гидры и РМЕРамиду (Пунин, 2000).

Мы считаем, что выявленные в составе эпителия гладкой поверхности ротовых лопастей, губ, пищевода, желудка, кишечника нитроксидергические клетки двустворок (табл. 2) сходны по строению и локализации с описанными ранее регуляторными клетками пищеварительного тракта других двустворчатых моллюсков и имеют нервную природу. А к разнообразным по химической структуре и направленности действия веществам присоединился и оксид азота. С большой долей уверенности, можно предположить, что обнаруженные нами интраэпителиальные КО-ергические биполярные клетки являются первичночувствующими рецепторными нейронами. Следовательно, вполне вероятно, что данные клетки "открытого" типа воспринимают химические сигналы из просвета пищеварительного тракта и отвечают на эти стимулы выделением сигнального биологически активного вещества. Такая рецепторная клетка участвует в формировании простейшего и наиболее фундаментального механизма

информационной передачи и локальной саморегуляции (Балашов и др., 1992). Первичночувствующие биполярные рецепторные клетки обнаружены в участках кожи ноги, головы, рта, губ и головных щупалец легочных.моллюсков (Зайцева, 1980; 2000). Автор их рассматривает как хемо- и механорецепторы.

У Crenomytilus grayanus, Modiolus modiolus, Mactra chinensis кроме интраэпителиальных NO-ергических нервных клеток встречаются и субэпителиальные нейроны с одним, двумя и более отростками. Такие клетки, вероятно, являются интернейронами и осуществляют разнообразные горизонтальные и вертикальные связи между отдельными рецепторными клетками, а также между рецепторами и эфферентными волокнами, как это имеет место у легочных моллюсков Lymnaea stagnate и Helix vulgaris (Зайцева, 1980,2000).

У двустворчатых моллюсков, главным образом во всех отделах пищеварительной системы, в основании эпителия и за его пределами присутствуют, окрашенные в синий цвет, волокна, формирующие сети разной степени плотности - от разреженных до, чаще, плотных сплетений (табл. 2). Бази-и субэпителиальные NO-ергические сплетения образованы разнонаправленными маловетвящимися варикозными волокнами.- Волокна базиэпителиального сплетения направлены преимущественно вдоль отдела, в то время как субэпителиальное сплетение формируют, прежде всего, циркулярно направленные волокна.

Базиэпителиальное сплетение образованно преимущественно продольно направленными нитроксидпозитивными нервными волокнами с варикозными

Известно, что пищеварительный тракт двустворчатых моллюсков обладает сложной базиэпителиальной и субэпителиальной системами нервных волокон (Giusti, 1970; Пунин, 1981а, 1989). Результаты электронно-микроскопического анализа показали, что, по различиям в размерах присутствующих в них гранул и, соответственно, в химической природе содержащихся биологически активных веществ, обе эти системы обладают определенной самостоятельностью (Пунин, Константинова, 1988; Пунин, 1989). Авторы считают, что субэпителиальное сплетение представляет собой периферическую часть нервной системы.

Прижизненным окрашиванием метиленовым синим и флуоресцентно-гистохимическими методами показано, что базиэпителиальное сплетение

сформировано отростками интраэпителиальных клеток (Пунин, 1981а, Пунин Константинова, 1988). Однако если принять точку зрения, что все его волокна принадлежат интраэпителиальным клеткам, то трудно объяснить порой высокую степень развития базиэпителиального сплетения. Весьма вероятно, что оно связано с волокнами: и клетками, лежащими в соединительной ткани. В пользу этого свидетельствуют картины ухода нервных отростков в прилежащую соединительную ткань у Mytilus edulis при светооптическом исследовании (Пунин, Константинова, 1988), а у Arctica islandica при ультраструктурном (Пунин, 1981а) анализе. Одновременно в базальную часть пласта могут проникать нервные окончания из соединительной ткани, что известно для задней кишки Tapes watlingi (Dougan, McLean, 1970) и средней кишки М. galloprovincialis (Giusti, 1970). Мы неоднократно наблюдали маркированные нервные стволики, связывающие бази- и субэпителиальное NO-ергические сплетения, что свидетельствует о их общности и сложности организации энтеральной нервной системы двустворчатых моллюсков.

Нужно заметить, что при сравнительно небольшом числе интраэпителиальных NO-ергических клеток, базиэпителиальное сплетение в органах пищеварительной системы исследованных двустворок хорошо развито. Часто нитроксидергические перикарионы вовсе отсутствуют, в то время как NO-ергические сети умеренные (табл. 2). Подобная закономерность отмечена в центральной нервной системе у С. grayanus (Анникова и др., 2000), а также у других двустворчатых, брюхоногих моллюсков и иглокожих (Moroz, Gillette, 1996; Дюйзен и др., 1999). Предполагается, что наряду с синтезом NO в теле клетки у двустворок, существует система локального синтеза NO в нейрональных отростках. Этим, видимо, и объясняются обнаруженные нами многочисленные NO-ергические нервные волокна с варикозными расширениями. Варикозные утолщения нервных проводников традиционно рассматривают как места наиболее интенсивного синтеза и высвобождения медиаторов и других биологически активных веществ.

Наличие интра- и субэпителиальных NO-ергических нервных клеток и развитой сети NO-ергических нервных проводников с обилием варикозных утолщений у изученных двустворок дает право предполагать рецепторно-эффекторную функцию нитроксидергических клеток. Это позволяет рассматривать их как морфологический субстрат для формирования местных рефлекторных дуг, а

также предполагать наличие связи этих элементов с отделами центральной нервной системы и считать их рецепторным звеном в регуляторной цепи. Оксид азота в пределах формируемого им "активного поля" может выделяться в расположенные под эпителием гемальные синусы и непосредственно попадать в гемолимфатическую систему либо выступать в качестве паракринного агента, в последнем случае его действие будет направленно на соседние эпителиальные клетки и/или чувствительные нервные окончания, расположенные в непосредственной близости от эпителия. Легко проникая в цитоплазму клеток-мишеней, N0 может либо самостоятельно изменять их физиологическое состояние, либо модулировать высвобождение классического нейромедиатора.

В начальных органах пищеварительной системы и в пищеварительной железе отдельных изученных нами двустворок, наряду с выявленными нитроксидергическими нервными клетками, обнаружены NO-содержащие клетки, не нервной природы. Они имеют определенную топографию и по структуре значительно отличаются от выше описанных нервных клеток.

В ротовых лопастях, губах и пищеводе у митилид, в пищеводе G. yessoensis и в ротовых лопастях Crassostrea gigas нами обнаружены многочисленные N0-содержащие секреторные клетки с интра- и субэпителиальным расположением. Интраэпителиальные секреторные клетки имеют крупное колбовидной формы тело с расширенной ядросодержащей частью в базальной зоне пласта, тонкие их апикальные отростки оканчиваются бульбовидным утолщением. Субэпителиальные клетки имеют более округлую форму тела. N0-синтаза выявлена в каемчатых эпителиоцитах вводного канала главного и вторичного протоков пищеварительной железы большинства моллюсков (табл. 2), в то время как ресничный эпителий не содержит нитроксидергических элементов. Клетки имеют лентовидную форму, простираются от базальной мембраны до апикальной поверхности, часто вдаваясь в просвет протока. Другие N0-содержащие клетки найдены» в избирательно окрашенных пищеварительных трубочках R. philippinarum, M. chinensis и Spisula sachalinensis. Они имеют округлую форму и, прилегая друг к другу, образуют весьма длинные цепочки по окружности эпителия трубочки. Согласно их морфологии и количеству в пределах одной трубочки можно предположить, что N0-синтазу содержат пищеварительные клетки. С

другой стороны, NO-содержащими могут быть секреторные клетки. В пользу этого предположения свидетельствуют найденные в отдельных секреторных клетках трубочек пищеварительной железы Ы11икоре^еп уе88оет\8

лейэнкефалиниммунореактивные включения (Вараксин и др., 1990).

Таким образом, пищеварительная система двустворчатых моллюсков обладает развитой единой нитроксидергической системой, в которую входят интра- и субэпителиальные нервные клетки, бази- и субэпителиальное нервные сплетения, а также секреторные, каемчатые и пищеварительные клетки.

Количественная оценка NO-ергических нервных клеток в пищеварительной системе Сгепоту^Ит ^иуипт в разное время года Во всех изученных отделах пищеварительного тракта: губах, пищеводе, средней и задней кишке С. grayanus выявлены сезонные изменения плотности распределения интраэпителиальных нервных клеток и сплетений (рис. 2).

В начале марта доля нервных клеток в отделах пищеварительной системы моллюска невелика и меняется от 0.02% в губах до 0.60% в задней кишке. Ширина таких клеток, например, в губах составляет 3.3+0.1 мкм, а высота - 15.8±0.3 мкм. Толщина базиэпителиального сплетения изменяется от 3.7+0.1 мкм в начальном отделе пищевода до 7.9+0.1 мкм в кишечной борозде, субэпителиального - от 16.3+0.5 мкм в кишечной борозде до 46.1+1.2 мкм в начальном отделе пищевода. Варикозные волокна в сплетениях истонченные, сплетения разрежены. Кроме нервных элементов в эпителии губ и начального отдела пищевода присутствуют немногочисленные бледно окрашенные секреторные клетки.

В начале апреля доля нервных клеток в отделах значительно возрастает (рис. 2А), ее значение меняется от 0.19% в губах до 0.73% в большом тифлозоле. Размеры клеток увеличиваются, так, в губах их ширина возрастает до 3.5+0.1 мкм, а высота - до 17.3+0.3 мкм. Увеличивается и толщина нервных сплетений. Особенно возрастают размеры субэпителиального сплетения (рис. 2Б), так в губах его толщина увеличивается более чем в два раза и достигает 96.5+2.7 мкм. Нервные волокна с гетероморфными варикозными утолщениями интенсивно окрашены в синий цвет и образуют компактные сети. Напротив, интраэпителиальные секреторные клетки губ и начального отдела пищевода по-прежнему остаются немногочисленными и слабо окрашенными.

Рис. 2. Плотность распределения интраэпителиальных NO-ергических нервных клеток (А), толщина субэпителиального нервного сплетения (Б) в пищеварительном тракте Crenomytilus grqyanus в разное время года. По оси абсцисс: исследованные отделы - 1. Губы; 2. Начальный отдел пищевода; 3. Кишечная борозда начального отдела средней кишки; 4. Большой тифлозоль начального отдела средней кишки; 5. Средняя кишка; 6. Задняя кишка. По оси ординат: доля клеток, %. Обозначения: III. Начало марта; H.IV. Начало апреля; K.IV. Конец апреля; VIII. Конец августа; IX. Конец сентября. Вертикальные линии обозначают доверительный интервал с 95% уровнем значимости.

В конце апреля доля КО-ергических нервных клеток в отделах пищеварительного тракта снижается. Плотность их распределения составляет в эпителии губ 0.14%, а в эпителии средней кишки - 0.67% от общего количества эпителиоцитов. Клетки уменьшаются в высоту, так, в губах при ширине 3.6+0.1 мкм, их высота составляет 15.5+0.4 мкм. Уменьшается толщина нервных сплетений, что особенно характерно для субэпителиального сплетения. Его толщина в губах снижается почти в 4 раза, а в начальном отделе пищевода и в большом тифлозоле - в два раза. Варикозные волокна в разреженных сплетениях более тонкие и не столь ярко окрашены. На фоне общего уменьшения плотности нервных клеток и волокон, интраэпителиальные КО-содержащие секреторные клетки интенсивно окрашены в синий цвет. С дорсальной и вентральной сторон исследованных органов они образуют многочисленные скопления.

В конце августа наблюдается наибольшее развитие элементов, содержащих КО-диафоразу. Доля нервных клеток во всех отделах достигает максимальных показателей (рис. 2А) и составляет, например, в губах 0.44%, а в большом тифлозоле 2.59% от общего количества эпителиоцитов. Размеры клеток несколько увеличиваются, так, в губах их ширина соответствует 3.7+0.1 мкм, а высота -16.2+0.3 мкм. Возрастает толщина нервных сплетений. Особенно увеличивается толщина субэпителиального сплетения, она достигает 91.3+2.3 мкм в губах и 124.4+1.7 мкм в начальном отделе пищевода. Волокна с разноморфными варикозными утолщениями насыщенно окрашены в синий цвет и плотно упакованы в сети. Секреторные клетки по-прежнему многочисленны и интенсивно окрашены.

Осенью (конец сентября) количественные параметры нервных клеток и субэпителиального сплетения, по сравнению с предыдущим месяцем, снижаются, но они выше в сравнении с весенними месяцами. Доля нервных клеток составляет в губах 0.30%, а в большом тифлозоле - 1.28%, от общего числа эпителиоцитов. Варикозные волокна в умеренно развитых сплетениях крупные, интенсивно окрашены с синий цвет. Секреторные клетки немногочисленны и имеют бледно окрашенную цитоплазму.

Исследования количества интраэпителиальных КО-ергических нервных клеток в кишечнике в разные периоды пролиферативной активности кишечного

эпителия С. ^тауапш выявили сезонную изменчивость их плотности распределения (рис. 3).

1 2 3 4 5

Рис. 3. Сезонные изменения митотического индекса (МИ) и доли N0-ергических нервных клеток (Доля) в кишечном эпителии СгвпошуМш дтауапш. Обозначения: по оси абсцисс - периоды пролиферативной активности, 1. Нулевая пролиферативная активность (начало марта); 2. Начало пролиферативной активности (начало апреля); 3. Максимальная пролиферативная активность (конец апреля); 4. Снижение пролиферативной активности (конец августа); 5. Умеренная пролиферативная активность (конец сентября). По оси ординат: митотический индекс и доля NO-ергических нервных клеток, %. Вертикальные линии обозначают доверительный интервал с 95% уровнем значимости.

* Различия достоверны по сравнению с предыдущим месяцем, при р< 0.05.

В период нулевой пролиферативной активности, когда число митозов крайне малочисленно (МИ = 0.005±0.001), доля нервных клеток в кишечнике составляет 0.49±0.02% от общего числа эпителиоцитов. В апреле фигуры митозов встречаются значительно чаще, а митотический индекс возрастает до 0.06±0.01%. Он достигает максимального значения к концу апреля (МИ = 0.24±0.03%) (Фролова, Лейбсон, 2000). В этот период доля нервных клеток в кишечнике минимальна и составляет 0.45±0.05% от общего количества эпителиоцитов. В летний период пролиферативная активность в кишечнике мидии Грея постепенно снижается и

достигает в конце августа 0.08+0.02%. В этот период выявляется наибольшее количество нервных клеток в кишечном эпителии (1.76+0.2% от общего количества эпителиоцитов). Новый подъем количества митозов совпадает с наступлением осени - МИ = 0.18+0.02%. В осенние месяцы пролиферативная активность наиболее стабильна. Однако на фоне увеличения пролиферации кишечного эпителия, доля нервных клеток уменьшается в два раза и составляет 0.88+0.1% от общего числа эпителиоцитов.

Таким образом, мы показали, что во всех исследованных отделах пищеварительного тракта С. grayanus плотность распределения интраэпителиальных КО-ергических нервных клеток и сплетений в разное время года варьирует. Обнаружена сезонная изменчивость между плотностью распределения интраэпителиальных КО-ергических нервных клеток и митотической активностью кишечного эпителия этого моллюска.

Возможные функциональные мишени оксида азота

У большинства исследованных двустворок КО-синтазная активность выявляется в интраэпителиальных нервных клетках и базиэпителиальном нервном сплетении, непосредственно контактирующих с ресничными эпителиоцитами кишечного тракта, а также в нервных структурах расположенных субэпителиально. Оксид азота может модулировать частоту биения ресничек этих клеток, как это показано, например, для ресничного эпителия мантийной оболочки двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis (Ыся1я Ы а1., 2003). Можно предположить, что значение КО в контроле локомоторной функции эпителиоцитов заключается в перемещении с помощью ресничек водных токов с пищевым материалом и фекального шнура по тракту. Однако, в эпителии ложа кристаллического стебелька, с гипертрофированной локомоторной функцией, КО-ергические нервные клетки отсутствуют, а базиэпителиальное сплетение не выделяется особым развитием. Вероятно, значение К0 в контроле ресничной активности эпителиоцитов не является доминирующим в кишечном тракте двустворчатых моллюсков. Сходная закономерность обнаружена и в протоках пищеварительной железы изученных двустворок, где наблюдается неравноценное распределение КО-ергических структур. Напомним, со стороны ресничного эпителия выводного канала главного протока, по которому осуществляется активный циркуляционный

транспорт воды с остатками пищи из железы в желудок, присутствуют лишь отдельные субэпителиальные волоконца, тогда как практически половина каемчатых эпителиоцитов вводного канала главного и вторичного протоков специфически окрашена диформазаном.

Ресничные эпителиоциты участвуют в процессах секреции, всасывании и депонировании веществ (Owen, 1966; Reid, 1966; Giusti, 1970). Наиболее свойственно это для выстилки губ, пищевода, кишечной борозды, большого тифлозоля, средней и задней кишок.. Именно эти отделы содержат NO-ергические нервные клетки и развитые бази- и субэпителиальное нервные сплетения. Напротив, отсутствие NO-ергических клеток и слабое развитие нервных сплетений отмечается в малом тифлозоле и ложе кристаллического стебелька, в которых секреторная активность, невелика. По всей видимости, N0 контролирует секреторную и всасывающую деятельность эпителиоцитов кишечника моллюсков. В пользу этого говорят многочисленные NO-содержащие секреторные и каемчатые клетки органов переднего отдела пищеварительной системы исследованных моллюсков. В настоящее время - хорошо изучена способность оксида азота модулировать процессы секреции и всасывания в желудочно-кишечном тракте млекопитающих (Schleiffer, Raul, 1997; Hansen; 2003; Ding, Li, 2003; Shah et al., 2004). Вовлечение NO в регуляцию секреции слизи показано для мантийной оболочки М. galloprovincialis (Licata et al., 2003), эпидермиса Lumbricus terrestris (Licata et al., 2002).

Другой функциональной мишенью NO могут быть мышечные элементы, расположенные в соединительнотканном слое кишечной стенки двустворчатых моллюсков, на что указывает обилие субэпителиальных NO-ергических волокон. Немногочисленные данные свидетельствуют, что у беспозвоночных, также как у позвоночных животных, NO-цГМФ сигнальная система участвует в контроле тонуса мускулатуры. У морской звезды Asterias rubens NO вызывает релаксацию кардиального желудка (Elphick, Melarange, 1998, 2001; Melarange, Elphick, 2003). Участие оксида азота в регуляции тонуса мускулатуры показано для сосудов и стенки тела дождевого червя L. terrestris (Licata et al., 2002).

Известно, что NO регулирует процессы пролиферации и дифференцировки клеток кишечного эпителия и нейробластов у млекопитающих (Ramachandran et al.,

2000; Gibbs, 2003). Оксид азота контролирует рост у дрозофилы, действуя как антипролиферативный агент, определяющий баланс между клеточной пролиферацией и дифференцировкой (Kuzin et al., 1996). NO может контролировать процессы пролиферации в эпителии органов пищеварительного тракта и у двустворчатых моллюсков. Очевидное снижение митотической активности в августе может быть объяснено высокой температурой воды (Фролова, Лейбсон, 2000), с другой стороны митотическую активность может ингибировать NO. В свою очередь пик концентрации NO-ергических элементов в августе может быть связан с неблагоприятным воздействием высокой температуры воды, в результате чего могут активироваться индуцибельные формы NO-синтаз. Подобное объяснение уместно и для периода нулевой пролиферативной активности. Напротив, на пике (конец апреля) и стабильной (сентябрь) пролиферативной активности показатели плотности NO-ергических элементов снижаются. Вероятно, это связано с подготовкой организма к нересту. Подобная динамика отмечена в гонаде Modiolus kurilensis (Анникова, 2001). Автор отметил, что на преднерестовой, нереста и посленерестовой стадиях число NO-ергических нейронов снижалось. По-видимому, NO вносит коррективы в процессы пролиферации кишечного эпителия у двустворчатых моллюсков.

Обнаруженные нами интраэпителиальные NO-ергические нервные клетки с тонким апикальным отростком, направленным к просвету отдела, свидетельствуют об участии оксида азота в рецепции внешних стимулов. В литературе существуют многочисленные свидетельства, указывающие на сенсорную функцию NO в периферических системах. Известно, что оксид азота играет важную роль в модификации внешнего сигнала, главным образом в обонятельной системе, на всех этапах филогенеза от кишечнополостных до млекопитающих (Colasanti, Venturini, 1998; Ott et al., 2000,2001). Исследования, проведенные на брюхоногих моллюсках, у которых субпопуляция NO-ергических нейронов в некоторых случаях достаточно полно охарактеризована, также указывают на их преимущественно сенсорную функцию (Незлин, 2004). Несомненно, оксид азота выполняет важную функцию и в процессах питания и пищеварения у беспозвоночных, вероятно, выступая в роли сенсорного нейромодулятора, как это было показано для сенсорных клеток пищевода Lymnaea stagnalis (Elphick et al., 1994; Moroz et al., 1993).

Недостаток сведений о функциональном значении оксида азота в регуляции процессов питания и пищеварения у беспозвоночных животных не позволяет делать достаточно полных обобщений. Тем не менее, не вызывает сомнений важное физиологическое значение оксида азота в регуляции процессов питания и пищеварения у двустворчатых моллюсков.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в пищеварительной системе двустворчатых моллюсков выявлены гетероморфные нитроксидергические клетки и нервные сплетения. Их наличие и плотность распределения имеют видовую специфичность.

2. Установлено, что пищеварительный тракт двустворчатых моллюсков обладает единой нитроксидергической нервной системой, которая образована интра- и субэпителиальными нейронами, бази- и субэпителиальными нервными сплетениями.

3. Нитроксидергические нейроны и/или нервные сплетения у Crenomytilus gray anus, Modiolus modiolus, Mytilus coruscus, Glycymeris yessoensis, Crassostrea gigas, Ruditapesphilippinarum, Callithaca adamsi, Mactra chinensis присутствуют во всех органах пищеварительной системы; у Anadara broughtoni, Area boucardi, Peronidia venulosa, Spisula sachalinensis - преимущественно в губах, пищеводе и кишечнике; у Swiftopecten swifti, Mercenaria stimpsoni, Myajaponica - в основном в желудке и кишечнике; у Mizuchopecten yessoensis - в губных выростах.

4. Наиболее распространены в органах пищеварительной системы интраэпителиальные нитроксидергические биполярные нейроны. Их доля в отделах не превышает 1.42% от общего количества эпителиоцитов. У Crenomytilus grayanus, Modiolus modiolus, Mactra chinensis присутствуют единичные субэпителиальные нитроксидергические уни-, би-, реже, мультиполярные нейроны.

5. Нитроксидергические секреторные клетки у Mytilidae найдены в ротовых лопастях, губах и пищеводе, у Glycymeris yessoensis - в пищеводе, у Crassostrea gigas - в ротовых лопастях. В пищеварительной железе у Mytilidae, Veneridae, Mactridae, Myidae NO-синтаза содержится в каемчатых эпителиоцитах вводного канала главных и вторичных протоков; у Ruditapes philippinarum, Mactra chinensis, Spisula sachalinensis - и в эпителиальных клетках пищеварительных трубочек.

6. Установлены сезонные количественные изменения нитроксидергических нервных клеток и сплетений в органах пищеварительного тракта Crenomytilus grayanus. Их наибольшее количество отмечено в начале апреля, конце августа, конце сентября, наименьшее - в начале марта и конце апреля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Annikova L.V., Pimenova E.A., Varaksin A.A. Nitroxidergic elements in the nervous system of bivalve mollusks // Simpler Nervous Systems: VI East Eur. Conf. Intern. Soc. Invert. Neurobiol. Moscow-Pushchino. 2000. P. 26.

2. Анникова Л.В., Пименова ЕА., Дюйзен И.В., Вараксин А.А. Локализация нитроксидергических элементов в центральной нервной системе двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus //Ж. эвол. биохим. и физиол. 2000. Т. 36, № 5. С. 452-457.

3. Varaksin A.A., Pimenova EA, Varaksina G.S., Frolova L.T. Localization of nitroxidergic elements in the intestine of the mussel Crenomytilus grayanus (Mollusca: Bivalvia) // Malacologia. 2002. V. 44 (1). P. 135-143.

4. Пименова ЕА., Хлопова А.В., Вараксин А.А. Нитроксидергические клетки в кишечнике двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis (Mollusca: Bivalvia) // Биол. моря. 2002. Т. 28, № 2. С. 119-124.

5. Пименова Е.А., Вараксин А.А. NO-ергические элементы пищеварительной системы двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus II Колосовские чтения -2002: Тез. докл. IV международной конф. по функциональной нейроморфологии. СПб: Ин-т физиологии им. ИЛ. Павлова. 2002. С. 226-227.

6. Пименова Е.А. Нитроксидергическая иннервация пищеварительной системы двустворчатых моллюсков // Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов: Тез. докл. Всероссийской конф. молодых ученых. Владивосток: ТИНРО-Центр. 2003. С. 67-69.

7. Пименова Е.А. NO-ергические элементы пищеварительной системы двустворчатых моллюсков // Биология - наука XXI века: Тез. докл. VII Пущинской школы-конф. молодых ученых. Пущино. 2003. С. 36.

8. Пименова Е.А., Вараксин А.А. Локализация NO-ергических элементов в ротовых лопастях, губах и пищеводе двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus II Ж. эвол. биохим. и физиол. 2003. Т. 39, № 5. С. 476-481.

Евгения Александровна Пименова

НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ В ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ПЛД № 63-19 от 02.12.1999 г. Зак. № 28п. Формат 60x84 1/16. Усл. пл. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 29.04.2004 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «ДАЛЬПРИБОР». 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел 32-70-49 (32-44)

it-97 02

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пименова, Евгения Александровна

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Питание и пищеварение двустворчатых моллюсков

1.2. Анатомия пищеварительной системы двустворчатых моллюсков

1.3. Клеточный состав эпителиев органов пищеварительной системы двустворчатых моллюсков

1.4. Регуляторные клетки в составе кишечного эпителия

1.5. Химическая специализация регуляторных клеток

1.6. Оксид азота

1.7. Ферменты синтеза оксида азота

1.8. Механизм образования оксида азота при участии NO-синтазы

1.9. Механизмы действия оксида азота

1.10. Оксид азота и его роль в пищеварительной системе позвоночных и беспозвоночных животных

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования -

2.2. Морфологические методы

2.3. Гистохимические методы

2.4. Исследование сезонной динамики NADPH-диафораза-положительных клеток в пищеварительной системе Crenomytilus grayanus

2.5. Морфометрические методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. NADPH-диафораза-положительные клетки и сплетения в органах питания двустворчатых моллюсков

3.1.1. Ротовые лопасти

3.1.2. Губы

3.2. NADPH-диафораза-положительные клетки и сплетения в органах пищеварения двустворчатых моллюсков

3.2.1. Пищевод

3.2.2. Желудок

3.2.3. Пищеварительная железа

3.2.4. Кищечник

3.2.4.1. Средняя кишка

3.2.4.1.1. Начальный отдел средней кишки

3.2.4.1.2. Средняя кишка

3.2.4.2, Задняя кишка

3.3. Количественная оценка NADPH-диафораза-положительных клеток в пищеварительной системе Crenomytilus grayanus в разное время года

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нитроксидергические клетки в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков"

Актуальность проблемы. К настоящему времени известно, что оксид азота синтезируется ферментативным путем и действует как универсальный эндогенный регулятор клеточного и тканевого метаболизма у позвоночных и беспозвоночных животных. Распределение ферментов синтеза N0 и его физиологическое значение у позвоночных интенсивно исследуется (Garthwaite, Boulton, 1995; Мотавкин, Гельцер, 1998; Ashutosh, 2000; Bogdan, 2001; Martin et al, 2002; Gregg, 2003; Mungrue et al, 2003). NO регулирует деятельность органов дыхания, выделительной и половой систем, влияет на функционирование секреторных клеток и тканей, вовлечен в процессы синаптической пластичности. В сосудистой системе N0 расслабляет гладкую мускулатуру. Оксид азота регулирует иммунные реакции, выступая в качестве одного из эффекторов клеточного иммунитета.Накапливаются данные о регуляторной роли N0 в механизмах экспрессии генов и биосинтезе белков.У беспозвоночных значение оксида азота изучено в значительно меньшей степени, однако показано, что N0 участвует в нейротрансмиссии и нейромодуляции, регулирует мышечную активность и пищевое поведение, респираторную и репродуктивную функции, контролирует солевой и водный баланс, участвует в механизмах иммунологической защиты организма, в клеточной пролиферации и дифференцировки (Martinez, 1995; Jacklet, 1997; Colasanti, Venturini, 1998; Lewin, Walters, 1999; Annikova et al, 2001; Torreilles, Guerin, 2001; Katzoff et al., 2002; Licata et al., 2002, 2003).Доказана многогранная роль оксида азота в физиологии пищеварительных функций у высших (Schleiffer, Raul, 1997; Jourd'heuil et al., 1999; Hansen, 2003a, b, c; Takahashi, 2003; Shah et al, 2004) и низших позвоночных животных (Li et al., 1993, 1994; Li, рщпезз, 1993; Bruning et al, 1996; Olsson, Karila, 1997; Lamanna et al, 1999; Olsson, Gibbins, 1999; Holmberg et al, 2003). Показано участие NO в регуляции перистальтики всех органов желудочно-кишечного тракта. N0 контролирует кровяной ток, экзокринную и эндокринную секреции, принимает участие в защитных механизмах. Нарушения экспрессии нейрональной N0синтазы приводят к появлению различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, в частности, расстройство пищеварения, колиты и другие заболевания (Takahashi, 2003; Ding, Li, 2003; Shah et al, 2004).Сведения о NO-ергических клетках в пищеварительной системе и роли оксида азота в процессах питания и пищеварения у беспозвоночных крайне малочисленны. NO-ергические клетки найдены в кардиальном желудке морских звезд (Martinez et al., 1994; Elphick, Melarange, 1998) и пищеводе брюхоногих моллюсков, где N0 является сенсорным нейромодулятором (Elphick et al., 1994; Moroz et al., 1993; Moroz, Gillette, 1996; Hurst et al, 1999). Известно, что NO-синтаза содержится в центрах, ответственных за ритмы питания, буккальных ганглиев Lymnaea stagnalis (Kobayashi et al, 2000), Clione liacina (Moroz et al, 2000). Вероятно, оксид азота играет важную роль в процессах питания и пищеварения и у двустворчатых моллюсков, сведения о чем, по-видимому, ограничиваются только нашими работами (Varaksin et al, 2002; Пименова и др., 2002; Пименова, Вараксин, 2003).Цель и задачи исследования. Цель нашей работы - установить наличие и локализацию, описать морфологию и сезонную динамику нитроксидергических клеток в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков, В работе решались следующие задачи: 1. Показать наличие нитроксидергических элементов в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков.2. Описать локализацию, морфологию и природу нитроксидергических клеток и сплетений в ротовых лопастях, губах, пищеводе, желудке, пищеварительной железе и кишечнике.3. Изучить особенности распределения нитроксидергических клеток в органах пищеварительной системы у разных видов двустворчатых моллюсков.4. Исследовать сезонную динамику нитроксидергических клеток в пищеварительной системе Crenomytilus grayanus.Научная новизна. Впервые получены данные о наличии нитроксидергических клеток и сплетений в пищеварительной системе у двустворчатых моллюсков. Подробно описаны их распределение, локализация в пределах органа и морфологические особенности. Установлено, что пищеварительная система двустворчатых моллюсков обладает развитой единой нитроксидергической системой, включающей интра- и субэпителиальные нервные #" клетки, бази- и субэпителиальные нервные сплетения, а также секреторные и каемчатые клетки. Выявлены сезонные изменения плотности распределения нитроксидергических нервных элементов в пищеварительном тракте Crenomytilus gray anus. Для кишечного эпителия gray anus установлена обратно пропорциональная зависимость между плотностью распределения нитроксидергических нервных клеток и пролиферативной активностью эпителия.Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о наличии, локализации и основных морфологических характеристиках нитроксидергических клеток в пищеварительной системе двустворчатых моллюсков послужат морфологической базой для дальнейших исследований физиологической значимости оксида азота в пищеварительной системе двустворок.Эти сведения расширяют теоретические представления о нейротрансмиттерных системах и вносят определенный вклад в изучение фундаментальных механизмов регуляции пищеварительной системы в целом. Они дополняют представления о возникновении и распространении NO-ергической системы у филогенетически ранних групп животных. Данные о сезонных изменениях плотности распределения нитроксидергических элементов, дополняют представления о механизмах пролиферативной активности кишечного эпителия двустворчатых моллюсков.Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах для студентов биологических вузов.Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и доложены: на ежегодных научных конференциях Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 1999, 2001, 2003); VI Европейской конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных "Простые нервные системы" (Москва-Пущино, 2000); IV международной конференции по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения-2002" (Санкт-Петербург, 2002); региональной конференции молодых ученых ДВО РАН (Владивосток, 2002); VII дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Тихоокеанский инстит5п: биоорганической химии ДВО РАН, 2003); Всероссийской конференции молодых ученых "Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов" (ТИНРО-Центр, Владивосток, 2003); VII Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, который включает 203 наименований (из них - 161 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 12 таблицами.Благодарности. Выражаю глубокую благодарность и уважение моему научному руководителю, д.б.н., ведуш;ему научному сотруднику А.А. Вараксину за огромную и неоценимую помош;ь на всех этапах планирования и выполнения работы, а также анализа полученных результатов. Особую благодарность выражаю к.б.н. Л.В. Анниковой за практическую помощь в освоении методик и участие в обсуждении результатов исследования, д.м.н., профессору П.А. Мотавкину и к.б.н.Л.Т. Фроловой за ценные замечания и консультации. Благодарю сотрудников лаборатории цитофизиологии ИБМ ДВО РАН за поддержку и помощь.Признательна к.б.н. Г.Г. Калининой за предоставление возможности работы на световом микроскопе Olympus BH2-RFCA модели BHS.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Пименова, Евгения Александровна

1. Впервые в пищеварительной системе двустворчатых моллюсков выявлены гетероморфные нитроксидергические клетки и нервные сплетения. Их наличие и плотность распределения имеют видовую специфичность.2. Установлено, что пищеварительный тракт двустворчатых моллюсков обладает единой нитроксидергической нервной системой, которая образована интра- и субэпителиальными нейронами, бази- и субэпителиальными нервными сплетениями.3. Нитроксидергические нейроны и/или нервные сплетения у Crenomytilus grayanus. Modiolus modiolus, Mytilus coruscus, Glycymeris yessoensis, Crassostrea gigas, Ruditapes philippinarum, Callithaca adamsi, Mactra chinensis присутствуют во всех органах пищеварительной системы; у Anadara broughtoni. Area boucardi, Peronidia venulosa, Spisula sachalinensis - преимущественно в губах, пищеводе и кишечнике; у Swiftopecten swifti, Mercenaria stimpsoni, Муа japonica - в основном в желудке и кишечнике; у Mizuchopecten yessoensis - в губных выростах.4. Наиболее распространены в органах пищеварительной системы интраэпителиальные нитроксидергические биполярные нейроны. Их доля в отделах не превышает 1.42% от общего количества эпителиоцитов. У Crenomytilus grayanus, Modiolus modiolus, Mactra chinensis присутствуют единичные субэпителиальные нитроксидергичесьсие уни-, би-, реже, мультиполярные нейроны.5. Нитроксидергические секреторные клетки у Mytilidae найдены в ротовых лопастях, губах и пищеводе, у Glycymeris yessoensis - в пищеводе, у Crassostrea gigas - в ротовых лопастях. В пищеварительной железе у Mytilidae, Veneridae, Mactridae, Myidae NO-синтаза содержится в каемчатых эпителиоцитах вводного канала главных и вторичных протоков; у Ruditapes philippinarum, Mactra chinensis, Spisula sachalinensis - и в эпителиальных клетках пищеварительных трубочек.6. Установлены сезонные количественные изменения нитроксидергических нервных клеток и сплетений в органах пищеварительного тракта Crenomytilus grayanus. Их наибольшее количество отмечено в начале апреля, конце августа, конце сентября, наименьшее - в начале марта и конце апреля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пименова, Евгения Александровна, Владивосток

1. P. 336-338. Colasanti M., Venturini G. Nitric oxide in invertebrates // Mol. Neurobiol. 1998. V.