Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение генов, специфически экспрессирующихся в командных нейронах оборонительного поведения виноградной ултики Helix lucorum L.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение генов, специфически экспрессирующихся в командных нейронах оборонительного поведения виноградной ултики Helix lucorum L."

п ь им

1 6 ШШ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ К*. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

УДК 575: 595

БОГДАНОВ Юрий Дмитриевич

КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ, СПЕЦИФИЧЕСКИ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ В КОМАНДНЫХ НЕЙРОНАХ

ОБОРОНИТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ Helix lucomm L.

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических' наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в КНК " Молекулярные- основы днффереевяровка в рдавнтня" Института молекулярной биологиа ни. ВЛ. Эвгельгардта РАН

Ндучцые руководители: яквдгмотг РАН, АД- МвряаСев»

кяядидат баолоппеасах щук А.В. Белмсган Официальные оппоненты: доктор (вошлкш варт А.В. Ипхс

кандидат биологических ифк СЛ. Лушшга

Иясттут бвиюшк рвпвпа ш. Н.К. Кольцова РАН

Защита^яссертадин состоится "9 ' оЬб^лхМ. 19?^. в ¿С? часов на заседании диссертационного Совета Д 002.79.01 в Институте молекулярной биология им. Б.А- Энгельгардта РАН по адоесу!

117984, Москва В-334, ул. Вавилова, 32

С диссертгдией можно ознакомиться в библиотеке Института малекулярнон биологии як. В .А. Зпгельгардта РАН

Автореферат разослан " € 'О^ЛлЛХ 199.5г.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Нервная система любого организма ответственна за выполнение многочисленных к сложных функций, поэтому одной нз важных проблем современней ненробиологии язляется проблема обеспечения морфологического и функционального разнообразии нейронов. Каким образом может возникнуть уникальность отдельных нейронов или их групп? Очевидно, что возможны несколько путей решения этой задачи.

Один кз путей заключается в той, что в нервной системе могут работать лены, аксп ротирующиеся в достаточно больших популяциях нейронов. Подобных, генов может быть не много. Перекрытое "полей" их экспрессии может создавать уникальные условия в каждой точке ЦНС, т.е. в разных участках нервной системы будут экспрессироваться частично перекрывающиеся наборы генок. Их уникальные сочетания и будут той генетической основой, которая обеспечивает уникальность свойств отдельных клеток или функциональных популяций нейронов.

Подобный путь реализуется при развитии организма, когда в днффереяциоовке эмбриональных органов и тканей участвуют частично перекрывающиеся по картине экспрессии наборы гомеобокс-содержаздих генов. Очевидно, что такого рода сценарий может реаднгсвываться и в случае образования уникальных популяций нейронов в нервной системе. Если принять только это решение проблемы, то, скорее всего, генов, которые экспресснруются исключительно в одном? нейроне или очень ограниченных популяциях нейронов не существует.

Однако, данная картена значительно усложняется, если предположить, что наряду с первым решением этой проблемы может существовать и второе, а именно: в каждой нейроне ( нли очень малых их популяциях) экспресснруются кроме общих для всех клеток генов еще и набор уникальных генов, который и отеечает за спецкфютескне свойства данного нейрона или их функциональных групп. Подобные гены могут слузкнть своеобразными "метками" ^определенных групп нейронов.

Таким образом, вопрос обеспечения уникальных свойств нейронов разбивается на целый рад более мелких вопросов: какие йменно гены отличают одни нейроны от других?; насколько ограничена картина их экспрессии?; экспрессируются лн они в ((гункциоиально родственных группах нейронов или

l>?ltfV>VJJDUblb

n. gesL ant

п. past. post.

n. gland, saliv,

n. phar. prim.

n. phar. sec.

ЦЕРЕБРАЛЬНЫЕ п. pcritenU inL

п. art. сег. ссг. — buc. con. ccr. — pcd. con.

СТАТОЦИСТ

п. pall. tin. ВИСЦЕРАЛЬНЫЙ

сет. — pie. con.

СОЛНЕЧНОЕ СПЛЕТЕНИЕ п. musc. retr.

п. cut. ped. prim.

п. cut. ped. iec. n. cut. ped. tcrt.

n. muse, coium. n. pall. dex. ext. et int.

n. aortae

ouaiiib

Рисунок 1.. Схема расположения КАетифицнрованьых^ нейронов в нервной системе виноградной улитки НсИх (исогит L. Командные нейроны зачернены, область проиереоралъных сенсорных нейронов заштриховали. Точками отмечены области скопления серотонинэргнческнх ненооноц. Гнгактскки пенсмеикерный нейрон отмечен стиелкой.

г

спектр их экспрессии довольно широк?; относятся ли продукты экспрессии подобных генов в каким-то определенным функциональным группам белков и к каким именно?

Для того, чтобы понять, действительно ли существуют гены, экспрессля которых ограничивается довольно малыми популяциями нейронов, необходим тщательный выбор объекта исследования. Нервная система виноградной улитки предоставляет нам уникальную возможность попытки доказательства существования подобных генов. Нервная система виноградной улитки Helix lecorass L- является одной из хорошо изученных, модельных систем современней ненробнплопга. Благодаря работам ряда исследователей, созданы подробные карты расположения большого количества морфологически н функционально идентифицированных нейронов (Балабан и др, 1979; Захаров и др, 1982; Максимова и Балабан, 1983; Иерусалимский н др., 1992; Иерусалимским и Захаров, 1992) (Рис.1).

В ЦНС виноградной улитки к настоящему времени обнаружены девять нейронов, расположенных в плевральных и париетальных ганглиях, характеристики функционирования которых позволяют их отнести к классу командные. поскольку их активность может вызывать целостную оборонительную решецкю животного. Иначе говоря, командные нейроны ответственны за "принятие решения" о запуске комплекса оборонительных реакций.

Командные нейроны являются уникальными образованиями как с морфологической (их размер достигает 200 мкм), так и с функциональной (командная функция) точек зрения. Вышеприведенные характеристики явились теми предпосылками, которые определили наш выбор данных нейронов в качестве объекта исследований.

В связи с вышеизложенным клонирование генов, предпочтительно акспресснрующихся в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки Helix luconun L. представляет собой актуальную задачу.

Цель работы:

Целью настоящей работы является поиск и изучение генов, которые предпочтительно акспресснрукхтся в парных командных нейронах LPa2/RPa2 и LPa3/RPa3, расположенных в париетальных ганглиях ЦНС виноградоой улитки He!ix lucomm L.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Модификация метода субтрактавного клонирования и дифференциального скрининга с целью клонирования генов, специфически

экслрессирукждихся в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки.

2. Клонирование полноразмерных кДНК полученных генов н • установление их нуклеотхдных последовательностей.

3. Модификация метода гибридизации in atu с целыми нервными системами моллюсков.

4. Получение полной картины экспрессии. данных генов в ЦНС виноградной улитки.

Натчияя понизив н практическое значение работы;

В настоящей работе был модифицирован метод субтрзктивного клонирования генов, экспрессия которых специфична для отдельны* клеток ЦНС виноградной улитки. Были клонированы полноразмерные кДНК новых генов HCS1 н HCS2, предпочтительно экспрессирующихся в командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки, а также кДНК генов HDSI н HDSZ, специфически вкспрессирующихся в D-группе нейронов ЦНС. С помощью модифицированного метода гибридизации от situ с целыми нервными системами виноградной улитки получена полная картина экспрессии данных гента в ЦНС. Предполагается, что полученные гены кодируют секретируемые белки, которые могут представлять собой нейропептиды или факторы роста.

Практическое значение данной работы состоит в том, что открытие новых, генов, специфвчных для отдельных нейронов, и модификация процедуры их клонирования может послужить удобным средством для изучения нервной системы в целом и построения более подробных карт расположения нейронов. ' Открытие же новых нейропептидов может повлечь за собой разработку новых фармакологических средств.

Апробация работы:

Материалы работы представлены на региональной конференции международного общества ненробиологкн беспозвоночных "Простые нервные системы" (Пущино, 26-28 мая 1994 г.) и SYMPOSIUM ON MOLLUSCAN NEUROBIOLOGY, Amsterdam, June 1-4,1994.

Публикдшн:

По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Объем я структура лиеггртацви:

Рабата вложена на 100 страницах машинописного текста. Она включает: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (всего 110 названий). Диссертация содержит 22 рисунка и 1 таблицу.

» г

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

4.1. Клонирование геноз, предпочтительно вкспрессирукндггхся в командных нейронах оборонительного поведения виноградной

улитки.

В настоящее время с^таествуе-г методологическая база, позволяющая изучать экспрессию различных генов на уровне одной клепш. С угон целою применялся метод, предложенный A.B. Белявским (Belyavsky et а], 1989), который позволяет получать препараты кДНК из единичных клеток.

Анализ генов, дифференциально экспрессирующихся в различных органах н тканях, упростился благодаря разработке методов субтрактквного клонирования и дифференциального скрининга (Sive and StJoKn, 1988; Johnes A al, 1991; Tram and Sutcliffe. 1988). .

Объединив метод получения препаратов кДНК из индивидуальных клеток и методы субтрактквной гибридизации и дифференциального скрининга, мы получим эффективную методическую базу для клонирования генов, которые специфически зкспрессируются в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки (Рис.2).

Для поиска подобных генов было проведено два параллельных вычитания. В одном из них в качестве лидера (истощаемый препарат кДНК) использовался препарат кДНК. полученный нз парных, командных нейронов LPa3 н RPa3. а в другом - препарат кДНК, полученный из гигантского пенсмейкерного нейрона. Оба лидера были одноцепочечньши. Кроме того, в отличие от драйвера (истощающий препарат кДНК), лидер можно было амплкфнцнровазь itaK с Т-н С- праймерами, так и с М13-резерсным и С- праймерами. Для получения лидера с подобными характеристиками мы использовали G53-npaÜMep, содержащий последовательности М13-реверсного н Т- праймеров.

Подобный способ приготовления лидера мы использовали исходя из следующих соображений. Во-первых, одноцепочечность лидера значительно улучшает гффектнвностъ гибридизации. Во-вторых, переход на другие гзраймеры диктуется тем, что драйверная ДНК не может быть полностью удалая из гнбрнднгаднрнной смеск. Согласно данным предварительных экспериментов содержанке драйвера не удается уменьшить более чем в 80-90 раз. Следовательно, после процедуры гибридизации и очистки тг драйвера лидер все

Гкгитсшк ■етсркейроаи ГмготгхлА вскмсйкер кия

Lff3.RP.i3 иейрок

I I

Амшшфкцироваян ы й препарат *ДНК

А кплнфдцнро ванный препарат кДНК

Т-сграАмср

Г-праАмср

Клоны, специфичные для гигантских иитервейроаов

Рисунок 2. Схема зонирования гснос. спсшгфичсски экслрсссирующизсся о командных, нейронах оборонительного поведения виноградной улитки.

б

равно будет содержать значительное количество драйвернон кДНК.. При последующей амплиф-лкацни истощенного препарата в случае одинаковых для лидера н драйвера пргймеров мы получим сильно загоязненныи драйвером препарат кДНК, т.е. сама процедура истощения теряет смысл.

Драйверная кДНК была получена амплификацией с помощью ПЦР препарата кДНК из гигантского пейсмейкерного нейрона. Драйвер был помечен фогоактивируемым бнотнвом согласно протоколу, предложенному Sive. and

Stjohn, 1988.

Процедура вычитания, в которой в качестве лидера использовалась кДНК из командных нейронов, имела целью получение препарата кДНК для создания библиотеки, обогащенной последовательностями, специфичными для командных нейронов. Кроме того, этот препарат использовался в качестве пробы при дифференциальном скрининге вышеупомянутой библиотеки кДНК. Процедура вычитания, в которой в качестве лидера использовался препарат кДНК из гигантского пейсмейкерного нейрона служила для контроля эффективности истощения, а препарат кДНК, полученный при атом, также использовался при дифференциальном скрининге истощенной билиотекк кДНК нз командных нейронов.

Процедура истощения включала в себя два одинаковых этапа. Соотношение лидер/драйвер ка первом этапе было 1:50. На втором этапе гибридизации количество драйвера было таким же, как и на первом. Гибриды убирались инкубацией со сгрептгвиднном с последующей фенолькой экстракцией.

Часть истощенного препарата кДНК из командных нейронов была клонирована в фаговый вектор XZAP II с последующим высевом около 5000 бляшек. С культуральных чашек снимались по 2 реплики, одна из которых гибридизовалась с радиоактивно меченным истощенным препаратом кДНК из командных нейронов, а вторая - с истощенным препаратам кДНК на гигантского пейсмейкерного нейрона. Клоны, которые тнбридизовались исключительно с истощенным препаратом кДНК нз командных нейронов, отбирались на отдельную культуральную чашку. Таким образок, ка вторичный скрининг было взято около 250 клонов.

Вторичный скрининг заключался в гибридизации клонов, отобранных после первого скрининга, с неистощенными препаратами кДНК из командных и пейсмейкерного нейронов. Необходимость использования во вторичном скрининге неистощенных препаратов кДНК диктовалась стремлением избежать возможных артефактов, которые могут возникать при проведении процедуры истощения н последующей алшлнфикацин с помощью ПЦР, связанных с неравномерной амплификацией фрагментов разных длин.

1 1

После вторичного скрининга было отобрано 54 клока, среди которых было выявлено 23 независимых клона. Четыре клона, представляющие наибольший интерес, т.к. гнбридизовались с препаратом кДНК нз командных нейронов более чем в 100 раз сильнее, чем с кДНК из пейсмейкерного нейрона, были отобраны для дальнейшей работы. Клоны получили названия НСП, НСВ2,

НОБ1 И Ш52.

Гены НС£>1 и НС52 аксирессируются главным образом в командных нейронах оборонительного поведения виноградной

улитки.

Для полученных, в ходе субтракшвиого клонирования кДНК генов НСБ1 и НС52 мы провели ряд экспериментов, направленных на изучение картины их экспрессии в нервной системе виноградной улитки.

Поскольку нам не удалось провести Ыог&ет-гибриднзацию из-за низкого содержания иРНК вышеупомянутых генов в яодглоточном комплексе ганглиев, мы начали изучение их экспрессии с гибридизации полученных клонов с препаратами кДНК из отдельных нейронов или их групп. Для этого были приготовлены три серии препаратов кДНК, в каждую из которых, входили препараты кДНК на различных командных нейронов, пейсмейкерного нейрона, групп серотонинэргических и сенсорных нейронов и ряда других. Эти препараты фракционировались в денатурирующем агарозном геле и переносились на мембраны НуЬодс! Необходимость использования нескольких серий

препаратов кДНК кз разных нейронов диктуется стремлением свести к минимуму артефакты, связанные с неравномерной амплификацией фрагментов разных длин при приготовлении препаратов кДНК. Кроме того, даже небольшое загрязнение одного препарата другим, измеряемое несколькими молекулами, способно существенно исказить результаты эксперимента.

Гибридизация зондов НС31 и НСХ2 с разными сериями препаратов кДНК нз различных нейронов представлена на Рнс.3 и 4. Клон НСБ1 гибридизуется главным образом с препаратами кДНК, полученными из нейронов ЬРаЗ и ИРаЗ. Такое совпадение результатов с несколькими независимыми сериями препаратов кДНК позволяет сделать вывод о том, что ген НСБ1 экспресснруется в основном в парных нейронах РаЗ. Геи НС52 демонстрирует другую картину экспрессии. Его гибрндизационнын сигнал с препаратами нейронов РаЗ значительно слабее такового для гена НСБ1.

8

\224 567Z9 10

Рисуиос 3. Экспрессия гена НСЭ1 в раалкчыаге типах аервтадт хлетох- .Тотальная хДНК, пллучекяая как огтсаяо Ве1уаг*1су с1 &1. 1989 была фракпиотфоодк в дсиатурируюгаем вгарояясм геле, перенесена иа мембрану НуЪовх! N4- и прогнбрндкаовака с радмоахтянн» мечекноа пробе« НСЭ1. Количество кДНК та дорожке - 03 мкг. На доражкн аавесся* кДНК ив слсдукядкх

ненрозоБ:

1. «ДНК. из веярока ЬРаЗ. 2. кДНК. га всирсга. ЬРа2

3. кДНК кз левровл вомер 2В 4. хДНК кз пдангацд-о «етаверебраливог© иевронй. 5. хЛНК на гигантского пенсмеихерного векро«а Ь. кДНК. на группы ауотояяяэрстгждкх венронав 7. «ДНК. на веёрона ЯРаЗ 8. кДНК. иа дродуеброльшдс сяясоревес иеярсвся

9. кДНК к» 15енроаов ЬРаЗ н ЯРаЗ 10. кДНК. на продеребральних сеясорньа вейроеов (второй прспарет)

12 3 к 5 6

Рисутгюк 4. Экспрессия гека НСБ2 в раалячвых типах верЕВЫХ клеток. Тотальная кДНК* иилучеккая как. ссосано Ве}уау#1:у ей а!, 1989 был*, фрдоцно*шрован& а лоштурврующол агароаком геле, перенесена па мсибрлггу НуЬогкЗ N4- я прегябродявовава с радяовхткяяо ыгтенпои пробоя НС52. Количество кДНК. на дорсяхке - 03 мкг. На дорожки нанесена лДНК. на следующих нейронов;

1. кДНК. иа нейрона ЬРаЗ. 2. аДНК. га кенроиа ЬРа2

3. кДНК на нейрона номер 4. «ДНК. из гигантского метаперебралъного иейрока

5. кДНК ка гигантского пеисмемкерного нейрона 6. ьДНК на группы серотонинэргнчссккх яелровов

А

В

t ■ ? -

Рисунок 5. А- - Гибридизация in siin зонда HCS1 с нервной системой виноградной улитки. В - Гибридизация in situ зонда HCS2 с нервной системой виноградной улитки. Гнбрндкзационные сигналы отмечены стрелками.

Максимальный уровень экспрессии гена HCS2 наблюдается в нейронах Ра2 (см. Рис. 4)

Изучение экспрессии генов посредством гибридизации с препаратами кДНК из разных нейроноп или их групп имеет существенное ограничение, которое заключается а той, что физически невозможно создать несколько серий препаратов кДНК для всех нейронов ЦНС-Получить полную пространственную картину зкспресии выбранных генов можно с помощью метода гибридазадаи in. situ с целыми органами или организмами (whole-mount in. situ hybridization). Нам удалось модифицировать процедуру гибридизации меченных дигоксигенином an ti sense- трапскрнптов полученных генов с целыми ЦНС виноградной улитки.

На Рис. 5А приведены результаты гибридизации antisense- транскрнпта гена HCS1 с нервной системой виноградной улитки. Гибрндизацноннын сигнал наблюдается в парных нейронах LPa3/RPa3, нендентифицированном нейроне, находящемся в педальном ганглии и неидетифицнрованном нейроне, расположенном в церебральном ганглии. Следовательно, во всей нераной системе только 4 нейрона зкслрессируют данный ген. Рис. 5В иллюстрирует картину экспрессии гена HCS2 в ЦНС виноградной улитки. Сигнал наблюдается в пар.чых нейронах Ра2 и РаЗ, причем сигнал в нейронах Ра2 сильнее такового в РаЗ, что совпадает с данными, полученными в результате экспериментов по гибридизации этого клока с препаратами кДНК из различных нейронов. Кроме того, экспрессия гена HCS2 наблюдается в нескольких мелких неидентнфнцированных нейронах педального ганглия. Исходя из того, что разные командные нейроны экспрессируют неодинаковый набор генов, можно сделать вывод о том. что популяция командных нейронов функционально неоднородна.

По литературным данным (Балабан и Захаров, 1992) известно, что функциональные характеристики командных нейронов оборонительного поведения изменяются в онтогенезе. В частности, зафиксировано отсутствие процесса сенситизации у животных в возрасте до 1 месяца после вьиода из яиц. Для того, чтобы прозеритв отличается ли экспрессия генов HCS1 и HCS2 у животных в возрасте до 1 месяца и у взрослых особей и, следовательно, могут ли данные гены участвовать - в процессах долговременного изменения функциональных характеристик командных нейронов, мы провели ряд экспериментов по гибридизации зондов из генов HCS1 и HCS2 с целыми ЦНС виноградных улиток разных возрастов. Показано, что транскрипты вышеупомянутых генов присутствуют в командных нейронах уже у новорожденных животных (Рис. 6А и В). Полученные результаты служат

Рисунок 6. Гибридизация in situ зондов HCS1 и HCS2 с нервными системами новорожденных виноградных улиток. А - картина экспрессии гена HCS1 в нервной системе виноградной улитки. Гибркдкзационкые сигналы отмечены стрелками. В -картина экспрессии гена HCS2 в нервной системе виноградной улитки. Гибридкзационные сигналы отмечены стрелками.

косвенным доказательством того, что данные гены, скорее всего, не участвуют в процессах изменения функциональных характеристик командных нейронов.

Кроме того, мы провели ряд экспериментов по выяснению картины экспрессии данных генов у родственных организмов, принадлежащих надсемейству Helicoidea. Для этого были проведены гибридизации с целыми нервными системами моллюсков Helix pomatiа и Eobania vermiculata. Картина экспрессии вышеупомянутых генов в данных моллюсках совпадала с таковой у Helix lucomm за исключением картины экспрессии клона HCS2 в нервной системе Eobania vermiailata. Для последнего организма характерно отсутствие парных нейронов Ра2, и гнбридизационный сигнал, следовательно, наблюдается только в нейронах РаЗ (данные не приведены).

4.2.2. Гены HDS1 н HDS2 вкспресснруготся исключительно в D-груиие нейронов нервной системы виноградной улитки.

Для кДНК генов HDS1 и HDS2. которые были получены из препаратов кДНК командных нейронов, нам удалось . получить сигнал при Northern-гибридизации с тотальной РНК из различных тканей (Рис.7). Естественно, что для получения РНК для последующей гибридизации мы брали достаточно большие участки нервной системы, поэтому в данном случае нельзя говорить о разрешении до одной клетки. Тем не менее, полученные в этих экспериментах, данные говорят о том. что эта гены экспрессируются в тех участках нервной системы, где находятся командные нейроны.

Для выяснения точной пространственной картины экспресии генов HDS1 и HDS2 мы провели гибридизацию in siiu с целыми нервными системами виноградных улиток. Оказалось, что экспрессия этих генов отсутствует в командных нейронах, тогда как сильный сигнал наблюдается в D-rpynne нейронов, расположенных в правом париетальном ганглии (Рис. 8).

Эта группа нейронов является одной из довольно малочисленного набора ассиметричных образований в ЦНС виноградной улитки. Нейроны D-группы легко идентифицируются морфологически как компактная группа опалеснирующнх нейронов среднего размера. Исследования ультраструктуры этих клеток показали, что они содержат большое количество алектронноплотиых гранул. Это свидетельствует о том, что они секретируют гормоны или нейропептиды (Сахаров, 1974). D-группа нейронов является довольно слабо изученной, поэтому данные гены представляют определенный интерес.

А В

1 2 3 4 5 12 3 4 5

Рисунок 7 •• Экспрессия генов НОБ1 и НОБ2 в организме виноградной улитки. Тотальная РНК из различных органов была фракционирована в денатурирующем 1,2% агарозном геле (10 мкг на дорожку), перенесена на фильтр НуЬопс! N и прогкбркдизована с пробами НОБ1 (А) и НОБ2 (В). На дорожки нанесена' РНК из следующих тканей:

1. РНК из коллумеллярной мьшщы

2. РНК из печени

3. ' РНК из церебральных ганглиев ЦНС -

4. РНК из плевральных и париетальных ганглиев ЦНС

5. РНК из педальных ганглиев ЦНС

Рисунок 8. Гибридизация т ¡¡1и зондов НОБ1 и НОБ2 с нервными системами виноградных улиток. А - картина экспрессии гена НОБ1 в нервной системе виноградной улитки. Гнбридизодионныс сигналы отмечены стрелками. В - картина экспрессии гена НОБ2 ц нервной системе иинограднон улитки. Гнбридизационные сигналы отмечены стрелками.

»- ft

Подобные системы нейронов существуют и в других моллюсках надсемейсгаа Helicoidea. Экспрессия генов HDS1 и HDS2 обнаруживается в D-группах нейронов Helix vulgaris. Helix pomatia и Eobania venniculata (данные не приведены).

Выделение кДНК генов HDS1 и HDS2 из препарата кДНК командных нейронов, скорее всего, обменяется сложностью манипуляций с командными нейронами. Нейроны D-группы очень тесно примыкают к командным, поэтому при выделении командного нейрона могло произойти загрязнение РНК командного нейрона РНК нейрона нз D-группы. Таким образом, оказалось, что наш препарат кДНК командного нейрона содержал ряд последовательностей кДНК, специфичных для нейронов D-группы.

4.3.1. Клонирование лолноразмерных копни генов HCS1, I1CS2, HDSi и HDS2,

Для получения полных кДНК копии генов HCS1, HCS2, HDS1 и HDS2 была сконструирована полноразмерная библиотека кДНК из - комплекса плевральных париетальных и висцерального ганглиев нервной системы виноградной улитки Helix Iucoram L. На культуральные чашки было высеяно окало 600 ООО клонов. Данная библиотека была скрнннрована радиоактивно меченными зондами, соответствующими клонам HCS1, HCS2, HDS1 и HDS2, полученным из истощенной библиотеки кДНК (см. выше). В результате скрининга палноразкерной библиотеки кДНК были получены следующие результаты: для клока HCS1 "получено" 39 гибридазационных сигналов, для HCS2 - 1. для HDS1 - около 2 тыс.. для HDS2 - около 2 тыс. Из полученных таким образом клонов были отобраны клопы со вставкой наибольшей длины, которые и использовались в дальнейшей работе.

4.3.2. Гены НСSi, HCS2, HDS1 и HDS2 кодируют

секретвруемые молекулм, которые по тески структурным

особенностям похожи ка нсйропептнды иди факторы роста.

Наиболее .длинные клоны, полученные из полноразмерной библиотеки кДНК, генов HCS1, HCS2, HDS1 и HDS2 были секвеннрованы по двум цепям по методу Сенгера. Клокы HCS1, HDS1 и HDS2 были секвеннрованы полностью, а для HCS2 - определена только нуклеотндная последовательность, соответствующая его кодирующей части.

Самый длинный клон гена HCS1 содержит 1412 пл. HCS2 - примерно 1900 п.н., HDS1 - 532 п.н., a HDS2 - 605 п.н. Данные гены кодируют белки, содержащие соответственно 100, 172, 107 и 102 аминокислоты. Каковы же особенности предполагаемых аминокислотных последовательностей клонированных генов, которые позволяют отнести их к нейропептидам или факторам роста?

Во-первых, все палнпелтиды, кодируемые вышеупомянутыми генами, содержат обогащенный гидрофобными аминокислотами N-концевой участок размером 20-30 аминокислот. Эта общая структурная особенность соответствует сигнальным пептидам, которые характерны для сек ротируемых белков, к которым относятся и нейропешнды.

Во-вторых, вышеупомянутые гены кодируют сравнительно небольшие белковые молекулы. Этот факт позволяет отбросить целый ряд семейств белков и резко сузить круг поиска.

В-третьих, в аминокислотных последовательностях, кодируемых генами HCS1, HCS2. HDS1 и HDS2, содержатся участки узнавания эндопептидазами процесскнга нейрспептадов н гормонов. Аминокислотная последовательность HCS1 содержит 1 подобный сайт, HCS2- 6, HDS1-2, HDS2 - 2. Эти участки узнавания представляют собой дносновные или моноосновные последовательности аминокислот, достаточно подробно описанные в литературе (данные не приведены).

B-чггаертых, для аминокислотных последовательностей HCS1, HDS1 и HDS2 характерно наличие отрицательно заряженного участка между • • сигнальным пептидом и- первым сайтом расщепления- эндопептидазами . процессинга. Возможно, что этот участок представляет» собой спейсерную последовательность, участвующую в правильной упаковке нейропептидов. Подобные участки отмечены и в структуре полипептада HCS2, но они расположены между участками расщепления эндопептидазами.

В-пятых, для палипотгада HCS2 характерно наличие трех участков, расположенных, между сайтами процессинга и имеющих общий С-коицевой тетрапептнд YPR? ( где ¥ это I, V или L). Кроме того, сразу же после упомянутой последовательности стоит остаток глицина, за которым следует сайт узнавания эндопептидазами процессинга. Наличие остатка глицина в этой позиции служит сигналом амидирования предполагаемых пептидов (Eipper et al, 1992). Последовательности пептидов, содержащих С-концевой тетрапептнд YPR7, следующие: DYPRL-амид: SFFTTVNGNHYPRJ-амид; GVFTQGAHCSYPBV-амнд. Кроме того, последовательность HCS2 содержит еще один амидированнын пеггтид, характеризующийся наличием большого

количества отрицательно заряженных аминокислот. Его последовательность

следующая : LQAGHSGlPLEILFIAYDSDND-амид.

Для того, чтобы выяснить, были ли вышеупомянутые гены описаны ранее, был проведен поиск по базам данных нуклеотидных (EMBLbank) н аминокислотных (SwissPiot) последовательностей. Для генов HCS1, HDS1 и HDS2 сколько-нибудь значимых гоиологкй не обнаружено, что служиг свидетельством того, что данные гечы не были описаны ранее и ,таким образом, являются новыми.

Для полипешнда, кодируемого геном HCS2. обнаружено,, что пептиды, содержащие последовательность YPRf-амид, напоминают представителей семейства пирокнниноЕ, мноактивных пептидов насекомых, для которых характерно наличие С-концевого пентапгптида FXPRL-амнд (где X - S, Т или V) (Davis et al, 1992; Nacbnan et al, 1993; Nachman et al, 1991).

Таким образом, мы клонировали кДНК четырех новых генов, которые, вероятно, кодируют нейропепгиды. Гены HCS1 в HCS2 экспрессируются главным образом в командных нейронах, а гены HDS1 и HDS2 - в нейронах D-группы.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирована процедура поиска к клонирования гс^ск, предпочтительно экспрессируютнхсн в единичных клетках нервного снстсшя.

2. Модифицирована процедура гибридизации in situ с целыми ' нервными системами наземных гастропод. ■

3. Клонированы кДНК генов HCS1 н HCS2, гкспрессирующнхся предпочтительно в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улкпш.

4. Установлено, что популяция командных нейронов гшлястся функционально гетерогенной« поскольку в разных нейронах втон группы акспрессируется разный набор геиоа.

5. Клонированы кДНК генов HDS1 н HDS2, которые специфично вкспресснруются в D-грутше нейронов нервной сасгигы виноградной улитая.

6. Гены HCS1, HCS2, HDS1 и HDS2 кодируют секретируемые белки, которые по ряду признаков могут быть отнесены к нейрепептвдам или факторам роста.

«

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Богданов Ю.Д., Овчинников Д.А., Балабан П.М., Белявский A.B. (1994) HCS1 - Новый ген, специфичный для гигантских интернейронов плевральных и париетальных ганглиев нервной системы виноградной улитки Helix tucarum L. - Доклады Академии Наук. т. 335, номер 2. се. 108-112.

2. Begdanov. Yu.D.. Ovchinnikov, DA-, Balaban, P.M.. and Belyavsky, A.V. (1994) Novel gene HCS1 is specifically expressed in the giant interneuroru of the terrestrial snail Neuroreport 5, pp. 589-592.

3. Bogdanov, Yu.D!. Ovchinnikov, D.A., Balaban, P.M., and Belyavsky, A.V. identification of new genes which are specifically expressed in the giant intemeurons of pleural and parietal ganglia of snail Helix lucorum L. Abstracts of regional conference ISIN "Simple nervous systems", Пущнно, 26-23 мая 1994

4. Bogdanov, Yu.D., Ovchinnikov, D.A., Balaban, P.M., and Belyavsky, A.V. Identification of new genes which are specifically expressed in the giant intemeurons in parietal ganglia of snail Helix lucorum L. - Abstracts of SYMPOSIUM ON MOLLUSCAN NEUROBIOLOGY, Amsterdam, June U 4.1994

i9