Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ последовательностей, полученных из банка кДНК мозга человека и активно функционирующих в нервных и опухолевых клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ последовательностей, полученных из банка кДНК мозга человека и активно функционирующих в нервных и опухолевых клетках"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи УДК 577:25:612.6.(05)

СЛОМИ некий Петр Андреевич

АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ БАНКА кДНК МОЗГА ЧЕЛОВЕКА И АКТИВНО ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ В НЕРВНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Кавсан В. М., кандидат биологических наук Генинг Л. В.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всесоюзный научный медико-генетический центр АМН СССР.

Защита диссертации состоится 1990 года в

часов на заседании специализированного совета Д.0.16.11.01 при

Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627 Киев-142, ул. Заболотного, д. 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан « Д/ » се/У^/^ 1990

года.

Ученый секретарь специализированного совета

Т. И. Бужиевская

Актуальность проблемы. Б последнее время ъ мслекуляснс-П нейробиологии все больший интерес вызывают исследования по структурно-функциональной организации генома нервной ткан», что связано с существенным вкладом экспрессии генов в осуществление высших функции мозга, таких как обучение и память (5и1сИГГ, ' 1 988). Нервная система . является наиболее сложно организованной системой организма, что проявляется на всех уровнях - от макроанатомнческого до молекулярного. Ка уровне экспрессии генов выражением такой' сложности нервной ткани является сложность мРНК мозга, которая превышает в 2-5 раз сложность РНК любого другого органа или ткани организма, причем такая-картина наблюдается у самых разных видов животных - от беспозвоночных (осьминог) до человека (Кар1ап. 1982!. Считается в связи с этим, что в мозге экспрессируется большое число так называемых мозгоспецифичных генов с преобладающей экспрессией в нервной ткани. Именно эти гены и могут играть ключевую роль в определении специфичности нервной ткани как целого, в осуществлении ею своих специфических функций (мипег, 1983). В связи с этим актуальной является задача

клонирования мозгоспецифичных генов, анализа их структурной организации и экспрессии в различных структурах мозга и при различных физиологических условиях. Возможен ряд подходов к клонированию таких генов и одним из них является вариант методологии -обратной генетики-, при котором клонирование специфичных для нервной ткани генов базируется только на распределении в различных тканях соответствующих РНК и не связано каким-либо образом с функциональной активностью продуктов этих генов (Ог1ап, 1986).

Цель работы. Целью настоящей работы была идентификация и детальная характеристика последовательностей. активно экспрессируюшихся преимущественно в нервной ткани. с использованием методологии -обратной генетики-. Основой для. решения поставленной задачи стало получение банка клонов кДНК поли!А)-содержащих РНК коры головного мозга человека. Этот банк был использован для:

1. Выделения клонов, содержащих в составе кДНК вставок повторяющиеся элементы генома.

2. Выделения клонов. содержащих последовательности с

преимущественной экспрессией в нервной ткани.

3. Определения первичной структуры этих последовательносте! н анализа их экспрессии в различных нормальных и опухолевь тканях человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. В х'о; выполнения диссертационной работы был получен банк клонов кЛН? нз основе поли.(А)-содержащих цитоплазматпческих РНК коры головного мозга человека.

Из этого банка был выделен клон, содержащий в своем состг ве копию повторявшегося элемента генома человека и путем ана.и за его первичной структуры было показано, что эта кот относится к повторам Aiu-типа. С использованием гибридизации кЛНК разных тканей были выделены и детально охаракт.еризова! два клона, содержащих в составе вставок последовательное" кЗНК с преимущественной экспрессией в нервной ткани. Экспресс1 первого из этих клонов была найдена в коре головного мозга некоторых гормонально активных опухолях, тогда как экспресс! второго клона найдена в коре мозга и опухолях различного гене: Проведенный анализ нуклеотидной последовательности кДНК вставс в этих клонах позволил выявить особенности их первичной cTpvi туры. При сравнении с Гейдельбергским банком нуклеотидных пос. довательностей не было выявлено значительной гомологии клонир! ванных кЛНК с последовательностями банка. Слабая гомология бы. найдена только между кДНК второго клона и 3' нетранслируем< областью гена проопиомеланокортина человека. Таким образо; клонированные последовательности кДНК с преимущественж экспрессией в нервной ткани не были описаны ранее.

Показано также.: что ген. кодирующий последовательность кДНК второго клона, является уникальным. Он картирован у че.и века на хромосоме 3 в области q21-q25.

Апробация. Основной материал диссертации доложен и обсужд' на VI и vu симпозиумах "Молекулярные механизмы генетическ! процессов" (Москва. 198". 1989). на симпозиуме "Метаболизм энвимология нуклеиновых кислот- (Братислава. 198").i международном симпозиуме -Интегративная деятельность нейрон; молекулярные аспекты (У'осква. '1988). школе по молекулярн' нейообнологир (Варшава. 1989). . Материалы представлены второй конгресс по нейронаукам (Будапешт.. 198") и десят

- з -

совещание по картированию генома человека (США. 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы из пяти глав, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включает 1 таблицу и 20 рисунков. Список цитируемой литературы насчитывает 198 работ, из них 189 работ иностранных авторов.

Материалы и методы. Для получения банка кДНК использовали плазмиду pBR322 (Bolivar.1977) и клетки Е.coli штамма НВ101. Для выделения ДНК плазмид использовали методы Боливара и др. (Bolivar.1977), Бирнбойма и Доли (Birnboim. 1979) и Кейзера (Reiser, 1984). Ткань коры головного мозга получали при анатомических вскрытиях лиц. погибших в результате острой травмы. Остальные ткани получали при операциях, проводившихся по медицинским показаниям. Цитоплазматическую РНК из тканей выделяли с использованием фенольно-детергентного метода (Milner, 1983), поли(А)+-содержаиую РНК получали с использованием хроматографии на олиго (dT) целлюлозе.

Для получения банка кДНК синтез первой цепи кДНК вели в присутствии ингибитора РНКаз из плаценты человека без добавления актиномицина D. Вторую цепь синтезировали с использованием ревертаэы и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I без предварительного выделения одноцепочечной кДНК. Полученную двухиепочечную кДНК обрабатывали нуклеазой si и клонировали в Pst I сайт плазмиды pBR322 с использованием олиго(de) коннекторов/олиго (dC) коннекторов. Для повышения эффективности трансформации использовали метод, основанный на применении сочетания хлористого кальция и хлористого рубидия .Отбор реком-бинантных клонов вели с помощью метода гибридизации с колониями (Maniatis, 1982).

Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами и электрофорез фрагментов ДНК проводили в стандартных условиях (Maniatis. 1982). Фрагменты переносили на нитроцеллюлозные фильтры по методу Саузерна (Southern. 1975). Электро ф оретическое фракционирование РНК проводили в горизонтальном V- агарозном геле в присутствии 2.2 M формальдегида (Lehrach, 1977). Перенос РНК на нитроиеллгслозный Фильтр осуществляли по методу Томэсз

(Thomas, 1980). Гибридизацию фиксированных на фильтра нуклеиновых кислот вели в стандартных условиях. Определени первичной структуры ДНК прроводили" по методу Максама и Гилберт (1977) в твердофазной модификации (chuvpiHo. 1985).

Картирование клонированных последовательностей ДНК на хромосмах проводили с использованием метода гибридизации i situ с препаратами метафазных хромосом лейкоцито периферической крови человека (Call, 1971. Yurov, 1985). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОбСУЖДЕНИЕ 1. Получение банка клонов кДНК на основе иитоплазматической поли(А)-содержащей РНК мозга человека.

i

Для получения банка кДНК коры головного мозга человек

были использованы препараты суммарной цитоплазматическо

поли(А)-содержащей РНК, выделенной из коры головного мозг

человека. Синтез первой цепи кДНК вели в присутствии

ингибитора РНКаз из плаценты человека без добавлени

актиномицина D. Эффективность синтеза первой цепи кДНК

составила около 25*. Вторую цепь синтезировали с использование

ревертазы и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I бег

предварительного выделения одноцепочечной кДНК. 'Полученн$

двухцепочечную кДНК обрабатывали нуклеазой si; ее стабильност!

по отношению к нуклеазе si составила 65*. Полученщ

двухцепочечную кДНК клонировали в Pst i сайт плазмяды pBR.322

использованием олиго(йс)/олиго(йс)коннекторов и получению

рекомбинантными пдазмидами трансформировали клетки Е. со]

штамма НВ101. Эффективность трансформации в этих эксперимент! fí

составила 4x10 колоний на 1 мкг. реяомбинантной ДНК, ( содержание рекомбинантных клонов составило 71>

5

Обшив обьем полученного банка был равен 1.4x10 колоний.

2 Определение и анализ рекомбинантых клонов,

содержащих повторяющиеся последовательности.

Для выявления в банке кДНК коры головного мозга рекомбинан-

ных клонов, содержащих повторяющиеся последовательности, была

32

проведена гибридизация бактериальных клонов с меченой по Р суммарной ДНК человека. ■ В использованных нами условиях mi гли гибридизоваться только клоны, содержащие повторяюшиеся элементы генома. На первом этапе при анализе 1440 клон-гибридизацию вели в буфере, не содержавшем ДНК спермы лосос.

что позволило отобрать клокы. несущие как рассеянные повторяющиеся элементы, так и простые повторы. Всего было отобрано 29 таких клонов (2* от общего числа рекомбинантов), из которых при повторном скрининге о использованием ДНК спермы лосося было выбрано 3' клона, содержаоих. по-видимому, копии рассеянных повторяющихся последовательностей. Таких клонов в составе банка оказалось около 0,2у- .

Можно предположить, что видоспецифичные повторяющиеся последовательности генома человека - присутствуют в цитоплазматической поли(А)-содержащей РНК коры головного мозга примерно в 0'. 2* молекул РНК. Такая цифра хорошо согласуется с данными, полученными для ' поли(А)-содержащей РНК фибробластов мыши {Ryskov, 1983), фибробластов человека (Корнеев, 1986), мозга крысы (Иванов, 1987).

Для дальнейшего исследования был взят один из клонов, рвнк17 При обработке плазмидной ДНК из этого клона рестриктазой Pst i вырезалась вставка кДНК размером около 200 п. н. При

гибридизации по методу Саузерна с тотальной геномной ДНК

32

человека, меченой Р. эта вставка активно гибридизовалась, что говорит о том, что в состав этой вставки кДНК входят повторяющиеся последовательности, представленные в геноме большим числом копий (рис. 1).

Нуклеотидная последовательность^ кДНК вставки клона pBHKl7 представлена на рис. 2. На этом рисунке приведены хонсенсус-по-следовательность Alu повтора, последовательность.клона pBHRl7 и последовательности Alu 11 и Alu 40, полученные С. А. Корнеевым из банка кДНК фибробластов человека (Корнеев, 1986). Видно, что кДНК вставка этого' клона содержит копию повторяющейся последовательности^ Alu типа. Повторы этого типа образуют основное семейство коротких рассеянных повторов генома человека, сходное по своей организации с В1 и ' В2 повторами грызунов, представленное в геноме человека 1 миллионом копий и составляющее около 60к всех рассеянных повторов (Scmid. 1982).

Анализ нуклеотидной последовательности клонированного нами Фдг повтора позволил показать, что он относится к повторам sa типа по классификации Юрка и Смита (1989 )или к классу и по классификации Бриттена и др.(1989). то есть входит в число Alu

- ccpiu " J

..4 . ^ .. v'J

- !

л

: j

! Pне. 1. Анализ ДНК рекомбинант»

плазмиды pEHRl7,; обработанной {

I стриктазой Pst I, путем гибрид!

| зации по методу Саузерна с то, i ос

1 тальной Р меченой ДНК челов«

повторов с промежуточной гомологией с 7sl РНК (Weiner, 19£ Таким образом, клонированный нами Alu повтор входит в cocí подсемейства Alu повторов, возникших на ранних этапах эволю! приматов более 43 миллионов лет назад. Наиболее вероят1

что клонированный нами Alu повтор входит либо в интронные з< ядерной пре-мРНК. либо в 3' нетранслируемые облас поли(А)-содержащих РНК и не . имеет самостоятельнс функционального значения. Необходимо отметить. что клонированном повторе не сохранен первый из двух промото; РНК-полимеразы ill - в этой области наблюдаются значителы отличия от консенсус последовательности Alu повтора. Btoj промотор для РНК-полимеразы iii не входит в cocí клонированного нами участка последовательности Alu. Интерес» является также то. что в трех Alu повторах, полученных настояией работе и работе Корнеева и др. ! 1986 ) из'банка к' фибробластов найдена одна и та же замена Т->С области.гомологичной участку связывания Т антигена в ДНК вир> SV40.

3- Определение и анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности с преимущественной

испрессией в нервной ткани.

Для выделения из банка кДНК корн головного мозга клонов, содержащих последовательности кДНК с преимущественной экспрессией в нервной,ткани, часть клонов из банка кДНК была иммобилизована на нитроцеллюлозных фильтрах и была проведена гибридизация на колониях с кДНК различных тканей. По результатам гибридизации для дальнейшей работы были отобраны два клона - рВН71 и рВНЗ. Для клона рНВ71 характерна гибридизация с кДНК коры головного и с кДНК двух опухолевых тканей -аденокарциномы коры надпочечников и рака желудка, тогда как гибридизация' полностью отсутствовала с кДНК селезенки. В

А. 1 СБССАТСССС АСТСССТСАС АССТСТССТС ССАССАСТТТ

41 СССАСвСССА ССССССТССА ТТСССССААС ТСАССАСТТС 81 ААСАССАССС ТААССААСАТ ССТСАААССС ССТСТСТССТ 121 ААААССАСАА ААААААА

В. Alu-C GGCT*GGG***CGTGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGC

Alu-11 ----Т---САС.....

Alu-40 ---C*AT-•»*-А---

AIu-17 ---C*AT-«»"»--CA-

-T-

-G-

-G-

-GG-

Alu-C

AlU-11

Alu-40

GAGGTGGGTGCATCAC»»CTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCACCCTGGCCAA

С---------------CT--------G--------T-------

CAA-----»•««---------------G--------T------А----------------------AA----

----C----CA

Alu-17 ----С......--TGC»»GC

ATGG»G»AAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAA«TTA

----.-С-------А---------------------»- —

----TA»-------A--------'--...............

----X- »-------------G------GC-------AAA-

Нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона

Alu-C Alu-11 Alu-40 Alu-17

Рис. 2. А. pBHRl7.

в. Сравнение консенсус-последовательности Alu повтора (Alu-C), АДГ ПОВТОра КЛОНа pBHR17 (Alu-17) и клонов Alu-и и и Alu-40. Подчеркнут участок, гомологичный области связывания Т антигена в ДНК вирусе SY40. Дважды подчеркнуты промоторы РНК-полимераэы Iii.

* *

случае клона рВНЗ очень едабый сигнал выявляется только при гибридизации с кДНК кори голевного мозга.

Экспрессия отобранных клонов "была проанализирована более тщательно с использованием метода блот-гибридиэации с поли(А)-содержащими РНК различных тканей. При этом былс показано, что кДНК обоих этих клонов не гибридизуются с мРН8 нормальных тканей человека за исключением коры головного мозга, но гибридизуются с РНК различных опухолей. Таким образом, пс классификации клонов в банке кДНК головного мозга крысы, предложенной Сатклиффом (1985), полученные в настоящей работ« клоны могут быть отнесены к второму или третьему;классу кДМ клонов.

Экспрессия клона рВНЗ была найдена при гибридизации на колониях только в нервной ткани, тогда как при блот-гибриди-зации спектр экспрессируюших эту последовательность тканей оказался более широким - она была найдена в мРНК невриномы, рака желудка, аденокарииномы коры надпочечников (рис. 3). Тако< отличие в результатах может быть объяснено различно! чувствительностью этих методов гибридизации. Интересно, что экспрессия клона рВНЗ найдена либо в нервной ткани или е< производных (невринома - опухоль глиального происхождения, развивающаяся из шванновских клеток) или в гормонально активны: опухолях - аденокарциноме коры надпочечников (опухол: мезодермального происхождения) и раке желудка (опухоль эктодермального происхождения), и, таким: образом, она ограничена нейроэктодермальнвыми тканями различного происхождения. Возможно, что клон рВНЗ соотвествует мРНК, кодирующей какой-либо пептидный гормон. Так как размер этой мРНК равен примерно 800 нуклеотидам. а размер йставки равен только 71 п.н., то по анализу нуклеотиднов последовательности кДНК вставки этого клона структуру соответствующих РНК и белка установить не удалось. При сравнении этой последовательности с Гейдельбергским банком нуклеотидных последовательностей не удалось выявить гомологии с каким либо из расшифрованных генов.то есть последовательность клона рВНЗ до сих пор не изучалась.

Экспрессия кдона р8Н?1 при гибридизации с поли(А)-содержа-жащими РНК различных тканёй найдена либо в коре головного

- 9 -

? -

■■■ -

Е .:■.■:(

[

г ■■ .. ■■ ; '■. ^ -

■К" :.■;.!

Рис. 3. Блот-гибридизация клона рВНЗ с поли(А)-содержащими РНК различных тканей: плацента (1), кора головного мозга (2), аде-нокарцинома коры надпочечников (3>, рак желудка (4), невринома (5), фибробласты кожи (6), селезенка (7)-.

1 СААСАССССС ССССТТТТТС ТТСТТТТТСТ ССТТССАТТА 41 СТССТСДСТС АААССААААА АААААААААА А

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность кДНК/вставки клона рВНЗ

мозга, либо в опухолевых тканях самого различного происхождения - от нейроглиальных (нейробластомы. глиомы)до миомы матки. В то же время не найдено экспрессии этой последова- . тельности в ряде нормальных тканей - фибробластах кожи, щитовидной железе, плаценте, селезенке, желудке.' размер мРНК, со-отвествуюшей кДНК вставке клона рВН71, был равен 2000 нуклео-тидов. Кроме того, в некоторых образцах коры головного мозга кроме транскрипта размером 2000 нуклеотидов был найден второй транскрипт размером 3500 нуклеотидов (рис. 5). Этот транскрипт может представлять собой не до конца сплайсированный . пред-

шеетвенник РНК размером 2000 нуклеотидов или быть результатом альтернативного сплайсинга или процессинга гена рВН71. Такой -альтернативный сплайсинг или проце'ссинг, связанный с альтернативным использованием зкзонов. применением различных сигналов полиаденилирования, гетерогенностью Бэ концов мРНК, широко распространен в нервной ткани и найден примерно в половине мозгоспецифичных генов, а альтернативный сплайсинг с использованием только различных экзонов -в 10 из 34 проанализированных генов {Suicl'iff, 1988).Эти механизмы позволяют повысить разнообразие белковых продуктов нервной ткани и обеспечить тонкую регуляцию их трансляции, но точное функциональное значение такого полиморфизма в структуре РНК не известно.

При анализе нуклеотидной последовательности кДНК вставки клона рВН71 в ней не было найдено ни в одной из цепей кДНК поли(А) последовательности. В связи с этим значашая цепь в кДНК вставке была определена с использованием дот-гибридизации отдельных цепей кДНК с мРНК разных тканей - как нормаль-. ных, так и опухолевых. Результаты такой гибридизации приведены на рис.6. Видно, что во всех проанализированных тканях с мРНК гибридизуется только одна из цепей кДНК, обозначенная нами как цепь В и. таким образом, значащей в кДНК вставке клона рВН71 является в этих тканях цепь А. Кроме того видно, что из нормальных тканей с кДНК вставкой клона рВН71 гибридизуется только мРНК коры головного мозга и не гибридизуется с мРНК фибробластов. селезенки и желудка. В то же время кДНК клона рВН71 гибридизуется с РНК опухолей различного происхождения - глиом, нейробластом, гепатобластоыы,- шоиы матки.

Для оценки числа копий последовательности кДНК вставки клон

DBH71 в геноме человека проводили дот-гибридизацию меченой по оо

Р кДНК вставки клона рВН71 с тотальной геномной ДНК человека Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что эта после довательность представлена в геноме одной или несколькими копиями. Такой уникальный характер гена, кодирующего*кДНК клон рВН71, был показан также путем анализа по методу Саугерн геномной ДНК человека (рис. 7). Видно, что при гибридизации в жестких условиях кДНК клона рВН71 гибридизуется с одним EcoRl фрагментом (дорожка 4) и одним Kind ill фрагментом (дорожка 2) геномной ДНК человека, что указывает на уникальность гена

- 11 Г

t

1 9.4-

I 6.7-I 4.3-

Iм"

['•20

- ^«в

t- О

t b-v

Г i...... -

4

1

Рис. 5. Блот-гибридизация клона pBH71 с поли(А)-содержащими РНК различных тканей: а - кора головного мозга (1), плацента (2) б - кора головного мозга (1>, плацента <2), селезенка (3), щитовидная железа (4). __

рВН71. Так как кДНК клона РВН71 не содержит сайтов узнавания для рестриктаз Pst i и Ban hi, то наличие трех гибридизующих-ся Pst I фрагментов геномной ДНК человека {дорожка'1) и двух гибридизующихся Hind iii фрагментов геномной ДНК (дорожка 3) говорит о том, что этот ген имеет интроны.

Нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона рВН71 была определена после переклонирования в плазмиде puci 9. На рис. 8 представлена нуклеотидная последовательность цепи А вставки клона рВН71 размером 447 п. н.

При проведении анализа этой нуклеотидной последовательности в клонированной кДНК выявлен ряд прямых и инвертированных повторов. Наиболее интересны два инвертирозанных повтора (обозначены на рис. 8 стрелками). Первый из них имеет-размер 9 п.н. и спосбен образовывать шпилечную структуру с петлей

N.

щшщт

.»•• ' J t. !.s,

Й

•^vi О

J • • • .7

^ . . . 8

I • • n

~~ 6

i-i

4

Рис. 6. Дот-гибридизация отдельных цепей кДНК вставки,клона рВН71 с поли(А)-содержащими РНК различных тканей, а > гибридизация с цепью А,/ б - гибридизация с цепью В. Справа указаны ткани, из которых была получена РНК: кора головного мозга ; (1), фибробласты (2), селезенка (3), желудок (4), глиома 1 (5), глиома XI (6), глиома III (7), гепатобластома (8), нейррблас-тома I (9), нейробластома II (10), миома матки (11).

Рис. 7. рестрикиионный анализ геномной ДНК человека с использованием в качестве гибридиэа-ционной пробы вставки кДНК клона рВН71. Рестриктазы Pst I (1), Hind III <2), Bam HI (3). Eco RI C4>. Справа - контрольная шкала в т. п. н.

'12 3 4

-23.1

-ЗА

-6.7

-43- .

-2.3 :

-2.0

1 СССААССТТС ССААТСССТА АСТАСССССТ GTCACCAAGG 40

41 • АТАСССТССТ CCCAACCCCG GACAGCCCAT TCCCAAGTAT 80

81 CGCCGAGTCC TTGTGTTCCG ACGCCCACAC CCCATCCAGG 120

121 СССАААСССТ CCCCCCCGAT ССТСАТТССС TTCGATTATA 160

>>>>>>>>>

161 TTCTGTGTTT CCCGCCTCCC CAGTTCTTCC АСССССССТТ 200 ->

201 CGTTCGAACC CCAAGACCCC GTTCCGAAGC ТССАСАССТА 240

<-

241 GTTCCTGTTC GAAGCTTGAA CGCCTCCCCA AGGGCGAACC 280 «< «««

281 CGTCATGAAC GGCGGGCCCG CCCCGCAGGG СТСССТАСАС 320

321 CCACTGAGGT ЛАССТССТСС GGGGTGAACA CGTGACCACG 360

361 ААССАААССА ТСАТССАССС ССААСССАСА CGACATCCTA 400

401 САССТАСТСС GTGTCCCGCC GCCCCTACCT ACCGGTCGAG 440 441 GAATCAA

Рис. 8. Нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона РВН71 (цепь А). Подчеркнуты возможные неканонические сигналы полиаденилирования. Инвертированные повторы обозначены стрелками и знаками >. и <• .

размером 87 п.н. Второй повтор размером 12 п. н. является несовершенным - у него некомплементарны нуклеотиды в 210 и 246 положения*. Этот повтор способен образовывать шпилечную структуру с петлей размером 25 п. н. Интересно, что шпилечные структура которые могут быть образованы этими повторами, расположены в одной и той же области кДНК - центры петель расположены соответственно на 242 и 227 п. н. Другие повторы в последовательности кДНК вставки клона рВН71 имеют размер менее 9 п.н;S повторы такой длины встречаются в геноме с дост^-

- -

0 0,1 0.2 0.3 0,4

-----> Цепь А 1 ***«т • т т

2 «**т т т т

Цепь в

-2 т т т

-3

т тт т

Рис. 9. Возможные варианты трансляции кДНК вставки клона рВН71. Цепь А коллинеариа последовательности поли(А) содержащей РНК. Направление трансляции показано стрелкой, возможные белковые продукты - звездочками. Т - терминирующие колоны, МЕТ -инициирующий кодон. Сверху контрольная контрольная шкала в т.п. н.

точно высокой частотой.

В цепи А кДНК вставки клона рВН71 отсуствует на 3' конце поли(А) последовательность, что скорее всего связано с утратой ее при клонировании. 3* конец цепи А заканчивается динуклеотияом. АА, входящим в состав гексануклеотида ААТСАА. Этот гексануклеотид может играть роль,неканонического сигнала полиадегшднровакия. Сходного.типа сигналы полиаденилирования был описаны ранзе. но их эффективность по сравнению с каноническим сигналом полиаденилирования очень низка. Второй неканонический сигнал полиаденилирования AACCAÁ найден в области 3SI-366 п. н,цепи А кДНК, но он расположен на достаточно боль-»йм расстоянии от 3' конца мРНК. что нетипично для. сигналов полиаденилирования - обычно расстояние между сигналом полиаденилирования и началом поли(А) последовательности составляет -20-30 П. н. (Maníсу. 1988) .

На рис. 9 приведены данные анализа рамок трансляции клона рВН71¡ обозначены инициирующие и терминирующие кодоны и

<

pBH71 A AG CGC CAA - GC CCTCATCAAC GCCCCGCCCG GCCCGCAGGG CTG *** *** » * • ** ******** ***** **

POMC AAC CGC CAG TCA GGGCACA--- GCGGCCCC......CAGGG CTC

LYS CLT GLU ,

PBH71 -CC-TACACCCACT-CACGT-AACGTGCTCG GCGTCAACAC GTGACCA-G ** .* ***** ***** ** * * ** *

POMC ACCTTC- - CCCACAGGAGGTCGACCCCAAAC ---------- -TCCCCTTG

pBH7i CAACCAAA---CCA TCATGCACGG CGAA-CCCACA-----GGACATCCTA

' * * *** ***** ***» ** * * *

POMC GCTCT CCCCTGCCA T----CCTGC CCCCTCCCACCTGGGGCGTCGTGGCA

pBH71 САССТЛСГСС СГСТСССССС СССССГАССГ ACCGGTCGAGGAA-TCAA * **" ******* *** * ***** * **

POMC GA--TAATCA GCCTCTTAAA GC--TTGCCT GTAGTT--AGGAAATAAA

Рис. 10. Сравнение в области частичной гомологии нуклеотидных-леотидных последовательностей (нуклеотиды 270-447 цепи А) клона рВН71 и 3' фланкирующей области гена проопиомеланокортина (РОМС). Совпадающие нуклеотиды отмечены звездочками.

рамки считывания; открытые с 5' конца. В цепи А наиболее длинная открытая рамка считывания кодирует фрагмент белка размером 109 аминокислот (рамка +1, рис. 10) в двух остальных рамках считывания возможные белковые продукты намного короче. Однако нами не установлено;— какая именно из рамок считывания в цепи А используется in viro. Не исключено, что вся клонированная нами часть кДНК входит в состав 3' ■ нетранслируемой области мРНК, так как для мозгоспецифичных РНК характерен очень большой размер этой области (Sutcliff, 1988) Длинная открытая рамка считывания найдена и в цепи В кДНК клона рВН71. Интересно, что в гене ДОФА-декарбоксилазы дрозофилы с одной цепи считывается мРНК ДОФА-декарбоксилазы, тогда как с другой цепи - РНК с неизвестной функцией. Эти две мРНК по-разному экспресснруются в разных тканях и на разных этапах морфогенеза дрозофилы (Spencer,1986). Аналогично организованный локусы были описаны у млекопитающих. Уильяме и Фред (1986) идентифицировали участок геномной ДНК мыши, с разных цепей которого транскрибируются мРНК. имеющие общий участок размером 133 п. н. в 3' некодирующей области мРНК. Аделман и др.

т 16 -

(1987) описали участок ДНК крысы, содержащий два перекрывающихся занимающих разные цепи ДНК гена. Транскрибирующиеся с этих генов мРНК имеют комплементарные экзоны, причем один из генов кодирует экспрессирующийся в нервной системе рилизинг-гормон гонадотропина, а транскрипты второго гена имеют неизвестную функцию и обнаружены в сердце. В связи с этим возможно, что в каких-либо тканях на определенных этапах развития у человека может синтезироваться мРНК, соответствующая цепи В. кДНК вставки клона рВН71.

Сравнение нуклеогидной последовательности кДНК вставки клона рВН7! с Гейдельбергским банкой нуклеотидных последовательностей показало, что высоко гомологичные кДНК рВН71 последовательности в этом банке отсутствуют (рис. 10) . Слабая гомология найдена только между 3* концом цепи А кДНК клона рВН71 и 3' концевой гена проопиомеланохортина■(белка - предшественника целого ряда пептидных гормонов гипофиза - АКТГ. р-липотропина, Р-эндор-фина, а-меланотропина)( Chang, 1980). Однако ив этом случае очень низка и ограничена областью между терминирующим кодоном и сигналом полиаденилирования гена проопиомеланокортина. Видимо, эта гомология является случайной , так как в целом гомология кодирующей части у родственных генов выше, чем гомология фланкируюших последовательностей. .

Для картирования последовательности кДНК вставки клона рВН71 на хромосомах человека использован метод гибридизации in sit«. При анализе 52 .метафаз было найдено 198 зерен серебра, 28* из которых локализовались иа хромосоме 3. Наиболее вероятна локализация последовательности кДНК вставки,клона рВН71 в Области q21-q25 хромосомы 3. В этой области картирован ¡еще один ген. имеющий отношение к нервной системе' - ген родопсина, а также гены трансферрина, Хнейтральной эндопептидазы, ретинол свзязывающего белка, кислой фосфатазы. (Nayior, 1989 ).

Таким образом, путем анализа банка кДНК коры головного мозга человека удалось получить клоны, содержащие кДНК новы*, ранее не исследовавшихся генов человека с преимущественной экспрессией в нервной ткани. Необходимо отметить, что использованный при этом подход, основанный на анализе банка кДНК с применением методов дифференциальной гибридизации, позволяет получать кДНК клоны независимо от функциональных

свойств соответствующих белков. Это в свою очередь дает возможность .подойти к- анализу структурно-функциональной организации белков с новой, неожиданной стороны я , возможно. подойти к изучению новых, ранее не известных групп белков мозга.

ВЫВОДЫ.

1. На основе цитоплазматической поли(А)-содержащей РНК лобной коры головного мозга человека получен банк кДНК, в котором рекомбинантные клоны составили 71*. Общий размер

е

полученного банка равен 1,4x10 клонов.

2. В банке кДНК выявлены клоны, несущие копии повторяющихся последовательностей генома человека. Показано, что их содержание сотавляет около 0,2*.

3. Определена нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона рвнк17. содержащего копию повторяющегося участка генома. Показано, что данная кДНК содержит повторяющуюся последовательность, принадлежащую к Ala семейству повторов. С помощью машинного анализа установлено, что Alu последовательность клона рВНК17 на 84* гомологична консенсус-последовательности Alu повтора s типа. Обнаружен ряд особенностей структуры клонированного повтора.

4. Из банка кДНК выделены клоны, содержащие последовательности кДНК с преимущественной экспрессией в нервной ткани. Последовательность кДНК вставки клона рВН71 экспрес-сируется в ткани коры головного мозга, ряде опухолевых тканей различного генеза и не экспрессируется в нормальных тканях человека, таких как селезенка, плацента, печень, фибробласты кожи, щитовидная железа. кДНК клона рВНЗ экспрессируется в коре головного мозга, и гормонально активных опухолевых тканях ( аденокариинома коры надпочечников, рак желудка, невринома).

5. Определены нуклеотидные последовательности кДНК вставок клонов рВН71 и рВНЗ. проанализированы особенности их"нукдеотидного состава. В кДНК вставке клона рВН71 выявлены протяженные открытые рамки считывания как в значащей цепи кДНК, так и в комплементарной ей цепи. При сравнении с Гейдельбе|ггским банком нуклеотидных последовательностей выявлена слабая гомология 3' конца значащей цепи кДНК вставки

- IB -

клона pBH71 и 3' Фланкирующей областью гена проопиомелано-кортина. У кДНК вставки клона рВНЗ не выявлено какой-либо гомологии с последосательностыми банка.

6. Показано, что кодирующая кДНК клона рВН71 последовательность в геноме человека является уникальной и расположена на хромосоме 3 в области ч21-ч25.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. П. А. Сломинский, Н.Е. Малеева, С. Г. Царьков. С. А.Лимборская, А.П.Рысков. Получение банка клонов кДНК мозга человека и анализ последовательностей, дифференциально экспрессирующихся в клетках разных тканей. Тез. докл. vi Всесоюзного симпозиума, ■Молекулярные механизмы генетических процессов- М. 1S87 с.52.

2. Limborska S. А. , Maleeva N. Е. , Tsarkov S. С. , Slominsky Р. А: , Ryskov А. P. Isolation and analysis of human brain cDNA clones containing differentially expressed genes and copies of repeated sequences. J. Neuroscience 1987 V. 22, suppl.p. 121.

3. Limborska S. A. , Kaleeva N. E. . Korneev S.A. , Slorainsky F. A. Cloning and characterisation of human genes expressed in neural cells. "Metabolism and cnzymology of nucleic acids" Pergamon Press. NT, 1988. p.287-294.

4. П. А. Сломинский, Н. Е.Малеева, О.И.Буякова, С.Г. Царьков, Т.Н.Панина , А. П.Рыоков, С. А. Лимборская . Анализ последовательностей, полученных из банка кДНК мозга человека и активно функционирующих в нервных и опухолевых клетках. Генетика, 1989. 25 Т 11 с. 1925-1936.

5. Limborska S. А. , Pcrgunova L. V. , Maleeva N. Е. . Slominsky P. A.", Kornccv S. А. , Buyakova О. I., Вагдпоуа E.I. Analysis of genes, actively operating in both human and rat brain cells. Cytogc n ct. and Cells Ccnetics", 1989, N 1-4,

6. П. А.Сломинский, Л.Г.Полукарова, О.И.Буякова. Анализ и локализация на хромосомах последовательности, полученной из банка кДНК головного мозга человека и функционирующей в нервных и опухолевых клетках. Тез. докл. VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов-

М. 1989 с.53.