Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые подходы к изучению гранулоцитарного направления индуцированной дифференцировки промиелоцитарной клеточной линии HL-60

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Некоторые подходы к изучению гранулоцитарного направления индуцированной дифференцировки промиелоцитарной клеточной линии HL-60"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ

ИМ. И. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591.

ТОЛКУНОВА Елена Николаевна

НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ГРАНУЛОЦИТАРНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПРОМИЕЛОЦИТАРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ Ш.-60

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Е К Кольцова РАН ( Директор - академик РАН Е Г. Хрущов ), Медико-генетический научный центр РАМН (Директор - чл.-корр. РАМН В. И. ИваноЕ)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, академик РАН Н. Г. Хрущов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, академик РАЕН X И. Корочкин кандидат биологических наук Раевская Г. Б.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгардта

Защита состоится 1995 г. в час. на заседании

Специализированного совета Д002. 85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биологии развития им. Н К Кольцова РАН (117334, Москва, ул. Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

биологии развития им. Е К. Кольцова.РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Е. М. Протопопова

Актуальность темы: Изучение механизмов пролиферации'и дифференцировки кроветворных клеток - один из наиболее интенсивно разрабатываемых разделов экспериментальной онкологии и гематологии. За последние тридцать лег значительно расширились знания о нормальном и злокачественном гемопоэзе. Благодаря возможности индуцировать дифференцироЕку нормальных миелоидных клеток в культуре и наличию индуцибельных к дифференцировке миелоидных лей-козных клеточных линий активизировались исследования миелоидной дифференцировки. В частности, изучаются гены, участвующие в осуществлении и регуляции процессов нормальной миелоидной дифференцировки, а также нарушения .которые могут приводить к возникновению и развитию лейкозов. Очевидно, что различия между клетками при дифференцировке возникают на каких-то начальных этапах реализации генетической информации, и фенотипические отличия между клетками являются следствием количественных и качественных отличий в популяциях мРНК клеток. Исследование изменений в наборе мРНК клеток при дифференцировке могут позволить найти как регуляторы, участвующие в изменении паттерна экспрессии генов, так и дополнительные генетические маркеры для детальной характеристики миелоидной дифференцировки в норме и при лейкозах. Удобным объектом в качестве модели для изучения миелоидной дифференцировки in vitro служит иммортализованная клеточная линия промиелоцитов человека HL-60, благодаря способности к дифференцировке в разные ростки миелоидного ряда под воздействием различных химических индукторов. Представляет большой интерес применение метода дифференциального клонирования кДНК популяций, для сравнения клеток HL-60, принадлежащих пролиферативному пулу и индуцированных к дифференцировке в одном из возможных направлений.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы явилось изучение индуцируемой дифференцировки клеток линии HL-60 в гра-нулоцитарном направлении под воздействием ретиноевой кислоты. Используя методы молекулярного клеонирования и гибридизационного анализа мы пытались еыяснить 1)отличаются ли популяции мРНК клеток линии HL-60,находящихся в состоянии активной пролиферации и индуцированных к дифференцировке, 2) содержит ли отличаюиря их группа мРНК ("вычтенная популяция") последовательности,кодирующие мотив "цинковых пальцев",характерный для ДЦНК-связывающего дормена белков,активаторов транскрипции, 3)что представляют собой обнаруженные последовательны и какова их возможная роль в индуцируемой дифференцировке и 4) насколько избранная нами модель отражает нормальную гранулоцитарную дифференцировку in vivo, и может быть использована при изучении нормального гемопо-эза.

Г\

- л. -

Конкретными задачами исследования были :

-Создание полных кДНК банков клеток линии НЬ-60 в недифференцированном и индуцированном к дифференцировке состоянии,дифференциальный скрининг полученных банков.

-Проведение насыщающей гибридизации с целью создания "вычтенного" кДНК банка.

-Скрининг библиотек зондом, содержащим консенсусный мотив цинковыых пальцев ДШ-связывагацего домена белков, активаторов транскрипции.

-Поиск отличий в популяциях мРНК, клеток, подвергшихся разным срокам воздействия индуктора дифференцировки методом полиме-разной цепной реакции.

-Определение структуры и первичной последовательности отобранных из кДНК библиотеки клонов.

Научно-практическое значение работы: Показана возможность сравнения популяций мРНК клеток, находящихся на разных стадиях кроветворной дифференцировки, что может иметь практическое значение для исследований в области молекулярной биологии, экспериментальной онкологии и гематологии. Проведенные исследования позволили сделать вывод об ограниченной применимости клеток линии НЬ-60 промиелоцитарного лейкоза человека для исследования нормального гемопозза. Полученные полные и "выычтенные" кДНК банки представляют интерес для дальнейшей работы, поскольку несут последовательности, кодирующие белки, синтезируемые некоми-тированными клетками, приближенными к стволовым, а также отражающие изменения, происходящие при индукции дифференцировки активно пролиферирующих в культуре клеток в гранулоцитарном направлении.

Апробация работы: Диссертация апробирована на научной конференции ИБР РАН, 1994 год; межлабораторном семинаре ИБР, 1994 год.

Объем работы: Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и методов,результатов и обсуждения и выводов. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы насчитывает 163 работы. В обзоре литературы рассмотрены результаты исследования клеточной линии Ш-60, как модели для изучения нормального гемопозза и сведения о регуляции транскрипции генов эукариот. Основные методы, применяемые в работе и результаты собственных исследований приводятся ниже.

- U ~

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования использовали клетки острого промиелоцитар-ного лейкоза человека линии HL-60 и клетки эритробластного лейкоза человека К 562. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Flow), в которую добавляли 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 0.12% (w/v) NaHCO при температуре 37 С в атмосфере 5% СО . Дифференцировку индуцировали, ресуспендируя клетки в среде культивирования, содержащей 1 мкМ ретиноеЕой кислоты, индуктора гра-нулоцитарной дифференцировки клеток линии HL-60 (Collins et al.,1977). Для контроля за ходом дифференцировки служила реакция преобразования растворимого в воде красителя нитросинего тетра-золия в нерастворимый в клетках сине-черный формазан (Collins et al.,1979). Клетки,обработанные индуктором дифференцировки в течении определенного времени, собирали центрифугированием при 3 ООО об/мин 5 минут при 4 С, промывали средой RPMI 1640 без сыворотки и ресуспендировали в денатурирующем буфере, содержащем гуанидин изотиацианат. Лизаты хранили в жидком азоте для предотвращения деградации РНК.

Тотальную клеточную РНК выделяли методом экстракции кислым фенолом в модификации Хомчинского (Chomc2ynski P. et al. ,1987). Клетки растущие в суспензионной культуре,собирали центрифугированием, суспендировали в 1 мл-денатурирующего раствора, имеющего состав: 4 М гуанидин цианат, 25 мМ цитрат натрия (рН7. 0), 0.5% саркозил, 0.1 М 2-меркапгоэтанол. Для выделения РНК из небольшого числа клеток пользовались также рекомендациями Маниатиса по экстракции РНК для ПЦР, с использованием в качестве матрицы одноцепо-чечной кДНК. Клетки осаждали на микроцентрифуге 5 секунд при 4 С, удаляли супернатанг отсасыванием. Добавляли 10-20 мкл охлажденного во льду лизирующего раствора следующего состава: 2. О % Nonidet Р-40,10 мМ трис рН 8.0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl. Осторожно встряхивали, распределяя клетки в лизирующем растворе, затем помещали пробирки в лед на 5 минут и центрифугировали 2 минуты при 4 С в микроцентрифуге. Использовали супернатант непосредственно как матрицу для синтеза кДНК-цепи, служащей матрицей для ПЦР.

Для выделения poly(A) РНК использовали метод хроматографии на oligo(dT) целлюлозе (Edmonds et al. ,1971; Aviv,Leder,1972). При электрофорезе в денатурирующем агарозном геле (1.5%) использовали буфер на основе MDPS (20 мМ , рН 7.2). Электрофорез проводили при напряжении 30-100 V в течении 2 часов (Маниатис и др.,1984).

Все операции по работе с ДНК (выделение плазмидной ДНК, очистку с использованием хлористого цезия, получение рекомбинан-тных плазмид, рестрикционный анализ ДНК рекомбинантных клонов, введение радиоактивной метки в ДНК, приготовление компетентных клеток для плазмидной трансформации и для заражения фагом лямб-

да, упаковку рекомбикантных молекул лямбда gt 10) проводили, как описано в руководстве Маниатиса и др. (1984). Высокомолекулярную эукариотическую ДНК выделяли , как описано для клеток, растущих в культуре ( Blin et al. ,1976).

Для дот-гибридизации (Tanaka,Shiosaka,1990) РНК наносили на нитроцеллшозный фильтр, используя вакуумную ячейку. Для блотпе-реноса нитроцеллшозный фильтр смачивали на поверхности горячей воды, инкубировали 10 минут в 10* SSC и вели перенос, используя систему для вакуумного блотинга VacuGene XL и протоколы к ней фирмы Pharmacia. Перенос вели в течение часа в 20* SSC. Запекали фильтр 2 часа при 80 С в вакууме. Саузерн-гибридизацию, а также гибридизацию реплик колоний и фаговых бляшек проводили обычно руководствуясь рекомендациями фирмы Dupont, для мембран Colony/PlaqueScreen.

Получение меченных ДНК-зондов. Для мечения олигонуклеотид-ного зонда, представляющего собой консенсусную последовательность цинкового пальца, 2 цепи (15-членник: ССС АСА ОТ С GST GCA и 42-членник: ACT САС ACT 6GG GAG AAG ССС TAC GAG TGC ACC GAG TGT GGG) отжигали в зквимолярном соотношении и метили фрагментом Кленова 2 часа при 20-28 С.

Одноцепочечные кДНК зонды синтезировали .используя модифицированную реакцию синтеза первой цепи по протоколу фирмы Pharma- ci а с использованием случайных затравок. Меченный зонд денатурировали 5 минут в кипящей водяной бане перед добавлением в гибридизационную смесь.

Мечение продуктов ПЦР проводили, используя 5- 100 нг фрагмента, полученного при амплификации. Денатурировали ДНК 4 минуты при 94 С и проводили 4 цикла реакции по программе амплификации, заменив в реакционной смеси один из dNTP на меченный.

Двуцепочечную ДНК метили с помощью ник-трансляции. Удаляли невключившуюся метку хроматографией на колонке G-50 при помощи центрифугирования (Sambrook et al. ,1989).

Получение, анализ и клонирование продуктов полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции использовали одноцепочечную кДНК, синтезированную на основе РНК, выделенной экстракцией кислым фенолом в модификации Хомчин-ского, как описано выше. Реакцию обратной транскрипции проводили час при 42 С, останавливали добавлением раствора, содержащего 0.1 M NaCl и 40 мМ ЭДТА. Из реакционной смеси брали 5 мкл для проведения ПЦР ( в случае выделения материала из малого числа клеток). Если использовали материал синтеза на матрице 1 мкг РНК, для ПЦР брали 1/10 объема реакционной смеси.

Проводили амплификацию, используя программируемый нагревательный блок РНС-1 фирмы Techne. Продукты ПЦР фракционировали в

геле, выделяли фенольной экстракцией из легкоплавкой агарозы или смывая с ватмана, вставленного в разрез геля, перед выбранной полосой. Для клонирования использовали не менее О. 5-1 мкг фрагмента ДНК. Лигирование проводили в молярном соотношении вектор: вставка 10:1. Плазмидный вектор обрабатывали рестриктазой Sma I, дающей тупые концы. Обработку вектора фосфатазой исключили, так как отметили снижение эффективности клонирования при использовании дефосфорилированного вектора.

Чтобы создать у продуктов ПЦР концы .совместимые с вектором, "затупляли" вставку, обрабатывая фрагментом Кленова,заполняющего выступающие концы гомологичными нуклеотидами. Для увеличения эффективности клонирования, а также чтобы исключить применение геля, пользовались рекомендациями к набору GENECLEAN (BIO 101 Inc. ). Реакционную смесь экстрагировали хлороформом для удаления масла и добавляли 3 объема 6 М Nal и 15 мкл glassmlk. Ос тавляли для адсорбции ДНК на 5-30 минут при комнатной температуре. Отмывку сорбента и элюцию ДНК вели по протоколу фирмы-произ-Едителя. Для модификации концов готовили реакционную смесь следующего состава: 25 мкл реакционной смеси ПЦР, 10 мкл 10* буфера для pol I (0.5 М трис рН 7.5, 0.1 II MgC12, 10 мМ ДТТ, 0.5 мг/мл ЕСА, 200 мкМ dNTPs), гАТР до 1 мМ ,10 ед. Т4 полинуклеотидкиназы и 10 ед. ДНК полимеразы ¡.Доводили до конечного объема 100 мкл бидистиллятом и инкубировали при 37 С час. Останавливали реакцию добавлением 1 «ял 0.5 М ЭДТЛ и проводили вторую обработку GENECLEAN. Использовали 20 мкл glassmi 1 k, элшровали в -' <0 мкл воды.

Продукты ПЦР,полученные путем амплификации с использованием нинкфингерного прайм-?ра и клонированные в пдаамиде p'-íLUESCRiPT (ЗК+), секБенироьайи методом теоминации роста цепи включением дидедокеинуклеотидов (Sanger et al. , 1077) с использованием цгнк-фингериых прайме;:'!.)!-; и набора дли. сиквенса производств- F*ri№i<tas, основанного на работе 77 ДНК-тю.яимеразы.

Получение библиотек кДНК. Создание кДНК библиотек проводили, используя наборы производства фирмы Amersham : "cDNA Synthesis System Plus" и "cDNA Cloning System". Для создания библиотеки вычитания проводили насыщающую гибридизацию 0.5 мкг од-ноцепочечной кДНК из одной популяции клеток с 15 мкг матричной РНК, выделенной из клеток другой популяции. Использовали методику реассоциации в фенольной эмульсии (Kohne et al. ,197?*). Реакцию проводили 5 часов при комнатной температуре в 10% фенольной эмульсии. Реакционную смесь экстрагировали хлороформом, осаждали спиртом. Полученный препарат обрабатывали ДНК полимеразой Т4, экстрагировали фенолом, фенол-хлороформом, хлороформом и осаждали абсолютным этанолом. Затем готовили к клонированию гибриды ДНК/ДНК по протоколам фирмы Amersham.

- б -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Культивирование клеток HL-60 и индукция дифференцировки в гранулоцитарном направлении

При культивировании клеток HL-60 в среде RPMI 1640 (Flow), содержащей 20 Z инактивированной теплом эмбриональной телячьей сыворотки период деления клеток составлял около 43 часов. Мы отметили высокую чуствительность клеток к качеству эмбриональной телячьей сыворотки. Для изучения индуцируемой дифференцировки мы использовали клеточную суспензию, процент мертвых клеток в которой не превышал 10 %.

Дифференцировку клеток индуцировали, добавляя в среду культивирования ретиноевую кислоту в концентрации один микромоль при плотности суспензии 100 ООО клеток на миллилитр. Индуцируемая in vitro дифференцировка клеток линии HL-60 ретиноевой кислотой приводила к уменьшению пролиферации. После инкубирования с ретиноевой кислотой в течение суток, клетки не возвращались в проли-феративный пул даже при полной смене среды (то есть при исключении индуктора из среды культивирования). На этой стадии индукции клеточная морфология и размер клеток изменяются мало, но происходит решаются активация гена тяжелой цепи оксидазы фагоцитов (Barker et al. ,1988). Применяемая для контроля созревания грану-лоцитов реакция преобразрования растворимого нитроеинего тетра-золия в нерастворимый формазан, позволила нам выявить увеличение в популяции процента клеток, содепржащих нерастворимый формааан с 2-3 % до 50 % на вторые сутки воздействия индуктора.

На третий день обработки клетки, содержаще гранулы форма-зана, составляли 82-86 В таблице 1 представлены данные по составу клеточной популяции, подвергнутой разным срокам обработки индуктором дифференцировки, полученные в ходе анализа морфологии клеток. Очень невелико в популяции было число зредых грану-лоцитов, "созревание" популяции выражается в росте доли миелоци-тов и метамиелоцитов среди клеток гранулоцитарного ряда различной степени дифференцировки. При увеличении срока обработки индуктором, процент зрелых клеток увеличивался незначительно, доля же мертвых клеток резко возрастала. Решая вопрос о выборе срока обработки индуктором, при котором популяция клеток была бы для данной модели адекватна определению "дифференцированные клетки", - мы условно приняли клетки,обработанные индуктором в течение трех дней за "дифференцированные", а клетки необработанные индуктором, соответственно, называли "недифференцированными".

Обработка ретиноевой кислотой приводила к прекращению пролиферации и на третий день обработки мегамиелоциты составляли 82-86 Z клеток. В таблице 1 представлены данные по составу кле-

точной популяции,подвергнутой разным срокам обработки индкутором ифференцировки. Присутствие большого числа неполностью дифференцированных клеток является нежелательным для целей сравнения популяций, условно принимаемых за " недифференцированные" и "дифференцированные клетки "С далее в тексте используются эти обозначения ). Кроме того, на четвертый и пятый день обработки рети-ноевой кислотой, даже при полной смене среды, резко возрастала доля мертвых клеток. Поскольку популяция клеток линии НЬ-60, подвергнутых обработке индуктором в течение трех суток, содержа^ ла значительный процент зрелых клеток, а увеличение срока обработки. лишь увеличивало процентное содержали мертвых клеток, мы избрали именно ату популяцию клеток для выделения РНК дифференцированных клеток.

Таблица 1. Состав популяции клеток линии НЬ-бО, подвергнутой разным срокам обработки ретиноевой кислотой ( в концентрации 1 мкМ)

стадия I время обработки ретиноевой кислотой, 0 1.5 сутки I 3 I

миелобласт I 8 10 5 I

промиелоцит I 89 33 9 I

миелоцит I 3 27 40 I

метамиелоцит I О 29 45 I

нейтрофил I 0 1 1 I

Разработка экспериментального подхода к изучению дифференциальной транскрипции при дифференцировке клеток линии НЬ-бО в культуре

Нами была поставлена задача клонировать последовательности кДНК,характеризующие индуцируемую дифференцировку клеток линии НЬ-60 в гранулоцитарном направлении и провести поиск клонов, несущих последовательности,кодирующие белки,содержащие мотив "цинковых пальцев", характерный для ДНК-связывающего домена белков, активаторов транскрипции. "Вычитая" из популяций мРНК клеток, подвергшихся воздействию обработки индуктором дифференцировки, мРНК клеток , находящихся в состоянии активной пролиферации, мы имели бы некоторую "разность", популяцию мРНК, среди которых вели бы поиск последовательностей, содержащих мотив цинковых пальцев, которые экспрессируются только при переходе клеток к инду-

цированной дифференцировке. Но и в случае обнаружения таких последовательностей, нельзя было бы говорить с уверенностью, что они: непосредственно вовлечены в процесс индуцированной дифференци-ровки клеток НЬ-бО в гранулоцитарном направлении. Для того, чтобы исключить последовательности, экспрессирующиеся при индукции дифференцировки в любом направлении миелоидного ростка ( зритро-цитарном в том числе), мы избрали путь вычитания двух " индуцированных ". популяций : НЬбО промиелоцитов и клеток линии эрит-робластного лейкоза человека К562. Поскольку клетки линий НЬ-60 и К562 произошли от общей стволовой клетки, то производя вычитание по предлженной выше схеме (представленной на рисунке 1а),мы вероятно удаляли бы последовательности, кодирующие все общие белки "домашнего хозяйства" и некие общие регуляторные белки.

На рисунке 1, кроме схемы экспериментального подхода к решению поставленной задачи, представлена схема гемопоэза и место, которое занимает в ней используемые клеточные линии. А.

Плюрипотентная стволоЕая клетка

Миелоидная стволовая клетка

ВРи-Е

СРи-Е

СРЦ -6ЕММ \

СРи-Мее СРи-ВМ

/ \

СРи-6 СРи-М СРи-Ео

Лимфоидная^стволовая^клетка ргеВ клетка протимоцит СРи-ВаБ

мегока-риобласт

миело бласт

Г1

прозрит-робласт

мегока-риоцит

моно-бласт

г- I

нейтро- профильный моно-миелоцит цит

миело- миело- В лимфо-бласт бласт бласт

эозино- базо-фильный фильный миелоцит миелоцит

«--К 562

Т лимфо-бласт

зритро- тромбо-| нейторо- моноцит | базофил цит цит фил полимор- эозинофил В клетка I фонуклеар I

Т клетка

Рисунок 1А.

Схема гемопоэза и место на ней используемых линий

клеточных

Б.

Эритроидная клеточная линия К 562

Миелоидная клеточная линия НЬ-60

Индукция дифференцировки

Вычитание кДНК

Клонирование вычтенной популяции кДНК в фаговом векторе

т

Отбор клонов, гибридизующихся с последовательностью цинковых пальцев

Анализ клонов

Рисунок 1 Б. Схема поиска в вычтенной библиотеке последовательностей, гомологичных последовательностям цинкобых пальцев

Получение кДНК клонов, специфических для клеток линии НЬ-60, дифференцирующихся в гранулоцитарном направлении методом " вычитания " популяций мРНК

Для того, чтобы сравнить популяции мРНК недифференцированных клеток НЬ-бО и индуцированных к дифференцировке в гранулци-тарном направлении на первом этапе мы использовали метод дот-гибридизации мРНК с зондом, содержащим консенсусную последовательность цинковых пальцев , представленнкую на рисунке 2.

Гибридизационный сигнал с суммарной РНК, выделенной из не-индуцированных клеток НЬ-БО и клеток, индуцированных к дифференцировке обработкой региноевой кислотой, существенно не отличается, то есть общая представленность гибридизующихся последовательностей не изменяется при индукции дифференцировки в степени, достаточной для регистрации этим способом. Представленность гибридизующихся с цинк фингерным зондом последовательностей в популяции мРНК, выделенных из клеток линии К562, оцененная дот-гиб-

ридизацией, значительна меньше, чем в популяции мРНК из клеток линии Н1.-60.

А.

Cys »His

I ^ \

Cys^ ^HiS

Cys .His

/ >c \

Б.

10 20 30 40

ACTCACACTGQGGAGMGCCCTACGAGTGCACCGAGTGTGGG нуклеотиды ThrHi sThrGlvGluLysProTyrGluCysThrGluCysGlу аминокислоты

Рисунок 2. Структура "цинковых пальцев". А. общая схема "пальцев": Б. последовательность используемого олигонуклеотидного зонда.

Для того, чтобы провести "вычитание" популяций мРНК по предложенной выше схеме, мы выделяли матричную РНК из клеток линии К 562 и НЬ-60, а затем на матрице РНК НЬ-60 синтезировали первую цепочку кДНК.

2 1

г 1

—start

-- 0. 580 kb 0.504 kb

-- 0.192 кЬ 0.124 кЬ

Рисунок 3. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов синтеза кДНК на матрицах РНК из клеток НЬ-бО и головного мозга человека.

а. Продукты синтеза одноцепочечной кДНК; б. продукты синтеза двуцепочечной кДНК :1-кДНК клеток головного мозга человека; 2-кДНК клеток линии НЬ-60.

Мы проводили синтез первой цепи кДНК клеток линии НЬ-бО, анализировали ее размер (электорофорезом ) и качество (ее способность служить матрицей для синтеза второй цепи кДНК). Наибольшей представленностью характеризовались двуцепочечные молекулы кДНК, имеющие размер более 500 пар оснований, что свидетельствовало о нативности первой цепи кДНК и ее пригодности для использования в последующей реакции гибридизации (рис.3).

Далее синтезированную кДНК мы гибридизовали в фенольной эмульсии с избытком мРНК клеток К562 , и клонируя продукты ,не подвергшиеся реассоциации (то есть, не "нашедшие себе пару" при гибридизации), получили кДНК библиотеку, составляющую около пяти тысяч независимых клонов. Подробно создание "библиотеки вычитания" описано в разделе "Материалы и методы". Размер вставок в рекомбинантных клонах лямда gt 10 анализировали методом концевого мечения рестриктов ЕсоР I фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1. Он колебался от 200 до 1800 пар оснований с максимальной представленностью вставок размером около 600 пар оснований.

Поиск в "вычтенной" кДНК библиотеке последовательностей. несущих мотив цинковых пальцев с использование олигонуклеотидного зонда.

При анализе полученной кДНК библиотеки был использован оли-гонуклеотидный зонд, содержащий мотив цинковых пальцев (его последовательность приведена выше). Мы обнаружили двенадцать клонов, дающих сильный гибридизационный сигнал с зондом. Каждый позитивный клон (одиночную бляшку бактериофага) переносили с кусочком агара в пробирку с буфером и рассевали на другую чашку в верхнем агаре. Реплику повторно гибридизовали с цинк-фингерным зондом (вторичный скрининг) и отбирали отдельно расположенную позитивную бляшку бактериофага. На рисунке 4 представлен результат вторичного скрининга.

Темные пятна на радиоавтографе соответствуют бляшкам рекомби-нантного бактериофага лямбда содержащего е геноме участки

кДНК из клеток НЬ-бО, гибридизующиеся с мотивом цинковых пальцев.

При определении первичной последовательности одного из клонов выявили большую гомологию первичной последовательности клона и последовательности гена интерлейкина-1 человека (рисунок 5).

Известно что спектр биологического действия этого вещества на дифференцировочные события клеток кроветворного ряда достаточно широк , его действие,в частности, связано с высвобождением лимфокинов Т клетками, с дифференцировкой В клеток, с приобретением свойства цитотоксичности, с высвобождением простогландина и коллагеназы макрофагами.

Рисунок 4. Гибридизация рекомбинантных лямбда %Ы0 с олигонуклео-•гидным цинк-фингерным зондом (вторичный скрининг рекомбинантов).

10 20 30 40 50

TGTTCCTTCTCAGCAGACTACTTTCCAATCAGAATTTCCTCTCGCCTTGT

TAAATCTGATTTAAAGACTACTTTCCCATTACAAGTCCCTCCAGCCTTGG

60 70 80

CACCTTGACATGGCTATTACCCCACATTAAA последовательность :::::: :::::: :: вставки

GAC3TGGA— GGCTATCCAGATGTGTTGTT hunan IL-1 beta gene

Рисунок 5. Первичная последовательность вставки рекомбинантно-го клона бактериофага лямбда ^10, имеющая гомологию с геном интерлейкина-1 (человека.

Для того, чтобы подтвердить, что клонированная последова-'' тельность действительно экспрессируется при индуцированной диф-ференцировке клеток НЬ-60 ,мы провели Нозерн-блот гибридизацию с мРЩ неиндуцированных и индуцированных клеток НЬ-60. Был выявлен продукт с массой около 2.3 тысяч пар нуклеотидов. В неиндуцированных клетках этого продукта мы не обнаружили.

- 13 -

Получение зонда для поиска последовательностей, участвующих в индуцированной дифференцировке клеток линии НЬ-бО в гранулоцитарном направлении.

Использованный нами для скрининга библиотеки зонд представлял собой небольшой олигонуклеотид, и нельзя было судить о степени специфичности его гибридизации при скрининге. Перед нами встала задача найти зонд, чтобы продолжить поиск в библиотеке последовательностей, характеризующих гранулоцитарное направленно индуцируемой дифференцировки клеток НЬбО.

С этой целью мы проводили полимеразную цепную реакцию 'на матрице одноцепочечной кДНК клеток, подвергнутых разным срокам обработки ретиноевой кислотой. Картина, полученная при электрофорезе продуктов полимеразной цепной реакции в полиакриламидном геле представлена на рисунке 6А. Первичный анализ злектрофорети-ческой картины не позволяет увидеть отличий в наборе амплифици-руюадехся продуктов.

1 2 3

8

2.100 кЬ

1.230 кЬ-^® 1.033 кЬ -в»

0.653 кЬ - • 0.517 кЬ-

10.453 кЬ -

Рис. 6А Электрофорез продуктов ПЦР на матрицах кДНК из клеток линий НЬ-60 и К 562 и ДНК из различных клеток человека. 1,8-маркер молекулярного веса; 2- кДНК неиндуцированных клеток НЬ-60; 3-кДНК НЬ-б0, -обработанных НА в течении 1 суток; 4-2 суток; 5-3 суток; 5-4 суток; 7-кДНК индуцированных клеток К562;9-ДНК клеток НЬ-60; 10-почки человека.

- 14 -

Мы модифицировали условия реакции и разделения полученных фрагментов ДНК , что позволило нам составить обобщенную схему картины электрофореза и локализовать продукты полимеразной реакции, отличающиеся для образцов кДНК из клеток, подвергнутых разным срокам обработки индуктором дифференцировки (обозначены овалами на рис 6Б).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

*' —' ' —- -О.

-0.653 кЬ --0.517 кЬ

-о- в

0.453 кЪ

Рис. 6Б Схема электрофореграмы продуктов полимеразной цепной реакции. 1-ПЦР на матрице кДНК неиндуцированных клеток НЬ-60; 2-индуцированных клеток К 562 ; 3- индуцированных клеток К562 с эритропоэтиновыми праймерами; 4-кле-ток НЬ-60,обработанных ЯА 1 сутки,5-2 суток,6-3 суток, 7-4 суток ^ 8-ДНК фага лямбда ; '9-ДНК почки человека.

С целью снизить возможную неспецифичность отжига праймера температура отжига праймера была повышена нами до 42 о С. Количество "полос" заметно сократилось, что позволяет предположить неспецифичность отжига праймера при более мягких условиях (стандартной температуре отжига праймера 37 о С). На рисунке 7 приводится картина, полученная при разделении продуктов ШР в агароз-ном геле после модификации температурных параметров ПЦР.

На матрицах, полученных из клеток, обработанных индуктором трое суток при использовании цинк-фингерных праймеров, происходила амплификация ряда последовательностей. На четвертые сутки обработки индуктором картина, наблюдаемая при электрофорезе продуктов. полимеразной цепной реакции, меняется (данные представлены на рисунке 7). Мы обратили внимание на дифференциально эксп-

рессируюшийся на третьи сутки обработки индуктором дифференци-ровки продукт, размер которого составлял около полутора тысяч пар оснований. Как видно из рисунка 7, этот продукт амплифици-руется на матрице из клеток, обработанных РА трое суток (5 и 8 дорожки геля) и перестает амплифицироваться на матрице клеток, обработанных четверо суток (дорожка 4 геля).

Больший по- размеру продукт амплификации, дифференциально экспрессирующийся на третьи сутки обработки индуктором, был клонирован в плазмидном векторе pBluescript SK(+) (Short J. ,1988) и использован в качестве зонда для поиска последовательностей, участвующих в индуцированной дифференцировке клеток линии HL-60 в гранулоцитарном направлении.

7 8

J' .

. - 2. 200 kb

iiи

ЯН - 0.560 kb

'Je«»

y

Рисунок 7 . Электрофорез в агарозном геле продуктов ЩР с цинк-фингерными праймерами на матрицах кДНК из клеток НЬ-бО активнопролиферирующих и подвергнутых обработке индуктором дифференцировки.

1,7 дорожки-кДНК неиндуцированных клеток, 2-обработанных 1 сутки ретироевой кислотой, 3-обработанных 2 суток ретиное-вой кислотой, 4-обработанных 4 суток ретиноевой кислотой , 5,8-обработанных в течение 3 суток, 6-маркер мол. веса.

1 2 3 4 5 6

- 16 -

Использование вонда, полученного в1ходе полимеразной

цепной реакции с цинк фингерными праймерами

Для того, чтобы продолжить изучение последовательностей, характеризующих гранулоцитарное направление индуцируемой диффе-ренцировки клеток НЬ-60, мы провели гибридизацию ДНК клонов, выделенных ранее из вычтенной библиотеки и несущих мотив цинковых пальцев с новым, полученным в ходе 'полимеразной цепной реакции зондом. Из 12 клонов, дававших сильные гибридизационные сигналы с цинк-фингерным олигонуклеотидным зондом, - 2 гибридизовались и с этим зондом.

Для того, чтобы показать, что клонированная последовательность, дифференциально экспрессирующаяся на третьи сутки обработки индуктором, содержится в геноме клеток НЬ-бО мы провели Саузерн-блот гибридизацию ДНК клеток НЬ-60 и клеток печени человека, рестрицированной эндонуклеазой ЕсоВ 1,с тремя зондами, несущими последовательности с-тус,с-газ и клонированный ЩР продукт, соответственно (рисунок 8).

1 2 3 4 5 6 7 8

- -23.000 kb АЙ» гЭ.ОООкЬ -6.000 кЬ

2.600 kb

c-ras

c-myc

Рисунок 8. Саузерн-блот гибридизация ДНК клеток HL-60 и печени человека с клонированным продуктом ПЦР ( 1-5 дорожки геля ) и последовательностями c-ras ( 6,7 дорожки ) и c-myc ( 8,9 дорожки ) в качестве зондов.

1,6,8 - ДНК печени, рестрицированная EcoR I; 2-ДНК печени, рестрицированная Pst Í; 3-ДНК клеток HL-60, EcoR I неполный гидролиз; 4,7,9 - ДНК клеток HL-60, рестрицированная EcoR I; 5- ДНК клеток HL-60, рестрицированная Pst I.

Как показано на рисунке 8, в геноме клеток HL-60 клонированная последовательность присутствует, как есть и сильный сигнал с с-шус (что соответствует амплифицированному состоянию с-туе в клетках линии HL-60). Мы не наблюдали гибридизации ДНК печени человека ни с одним из использованных зондов.

На рисунке 3 также показан результат гибридизации ДНК печени и клеток линии HL-60 с клонированной последовательностью. Введены дополнительные дорожки, содержащие полный перевар ДНК рестриктазой Pst I (2 и 5). На дорожке 5, соответствующей рест-рицированной ДНК клеток линии HL-60 видны два сигнала гибридизации с ДНК клеток HL-60.

Рекомбинантная плазмида, несушдя дифференциально экспресси-рующйся продукт (обозначенная б-4),была порезана Pst I и из 4 полученных полос ( данные приведены на рисунке 9 ) два легких фрагмента, лежащие ниже отметки 2. 600 по маркеру молекулярного веса, были субклонированы в ллазмидном векторе pUC18.

Рис.9. Субклоны Т и Л, несущие Pst I фрагменты клона 6-4 i - Pstl рестрикт клона Т, 2 - нативная ДНК клона Т, 3 - нативная ДНК клона Л, 4 - Pstl рестрикт клона Л Рестрикция ДНК рекомбинантного клона, несущего клонированный продукт ПДР(клон 6-4)эндонуклеазой Pst. I, 5 - рестрикт ДНК клона 6-4, 6 - маркер мол. веса.

После субклонирования в векторе pUC18, полученную рекомби-нантную ДНК мы использовали для трансформации компетентных клеток Е. col i штамма Jm 105. Выросшие на селективной среде колонии трансформантов анализировали на присутствие вставки методом гибридизации in situ на нитроцеллюлоэном фильтре, используя в качестве зонда дифференциально экспрессирующийея на третьи сутки обработки индуктором продукт полимеразной цепной реакции.

После гибридизационного анализа полученных субклонов мы провели их рестрикционный анализ (рестрикция субклонов Т и Л эн-донуклеавой Pst 1 показана на рисунке 9Б ), и далее определяли цервичную последовательность содержащихся в них вставок.

Изучение последовательностей , дифференциально зкспрессирующихся на третьи сутки воздействия ретиноевой кислоты.

Определение первичной последовательности клонированного продукта амплификации, используемого в качестве зонда, показало наличие в ней последовательности большого Т-антигена вируса SV40 и участка области поздних генов,кодирующего часть гена VP1, гена структурного белка вируса SV40. Кроме них в состав отсеквениро-ванной последовательности входят участки гомологичные на коротком протяжении некодирующим областям ряда человеческих генов' ,минисателлитной ДНК человека. Наличие в определенной последовательности участка гомологии с геном бетта-лактамазы из транспа-зона 3 (ТпЗ),определяющего устойчивость к ампициллину, заставила нас предположить интеграцию какой-то искусственной векторной конструкции в геном HL60 при предыдущем культивировании. Гибридизация отсеквенированного участка с геномной ДНК HL60, показала наличие этой последовательности в геноме клеток HL-60. Ранее для ' конструкций на основе вируса бычьей папилломы описано их присутствие в трансфецированных клетках в виде экстрахромосомных элементов ( минихромосом ), содержащихся в количестве до 100 копий на клетку. Для вируса SV40 не отмечалось экстрохромасомальное существование. ■ Перед нами вставал вопрос, что служило материалом для полимеразной цепной реакции ? Велика вероятность, что ампли-фицировался именно фрагмент ДНК, так как продукт амплификации представляет собой не копию одного транскрипта, а содержит два терминирующих кодона: области ранних генов (Т антигена) и области поздних генов (VP1). Поскольку в геноме вируса. SV40 описана последовательность, сходная с консенсусом мотива цинковых пальцев, то вполне объяснима его амплификация на матрице геномной ДНК при использовании цинк-фингерных праймеров. Однако, если матрицей для амплификации действительно служила ДНК, трудно объ-

яснить, почему амплификация этой последовательности не идет на матрице, выделенной из активно пролиферирующих клеток и клеток, обработанных индуктором одни, двое и четверо суток. На третьи сутки отмечается морфологическое созревание клеток и в это же время амплифицируется описываемый продукт. Эксперимент был проведен повторно: культура была повторно индуцирована к дифференцировав, была выделена РНК, синтезирована первая цепь кДНК и опять на матрице из клеток , претерпевших трехсуточную обработку, шла амплификация описываемого продукта. На рисунке 19 представлена первичная последовательность клонированного продукта амплификации и его локализация на карте генома вируса SV 40.

Обнаруженная последовательность является характеристическим свойством только модели, используемой в эксперименте. Она не гибридизуется с мРНК нейтрофилоЕ периферической крови человека (данные не показаны), и соответственно не может характеризовать гранулоцитарное направление дифференцировки клеток мие-лоидного ростка in vivo.

*** GGGMGCTGTTACTGTTAAAACTGAffiTTATTGGGGTAACTGKTATGTTAAACTTGCATT CAGGGACACAAAAAACTCATGAAAATGGTGCTGGAAACCCATTCAAGGGTCAAATTTTCATTTTT TTGCTGTTGGTGGGGAACCTTTGGAGCTGCAGGGTGTGTTAGGAAACTACAGGACCAAATATCCIT GCTCAAACTGTAACCCCAAAAAATGGTACAGTTGACAGTCAGCAGATGAACACTGACCACAAGGC TGTTTTGGATAAGGATAATGCTTATCCAGTGGAGTGCTGGGTTCCTGATCCAAGTAAAAATGAAA ACACTAGATATTTTGGAACCTACACAGGTGGGGAAAATGTGCCTCCTGTTTTGCACATTACTAAC ACAGCAACCACAGTGCTGCTTGATGAGCAGGGTGTTGGGCCCTTGTGCAAAGCTGACAGGTTGTA TGTTTCTGCTGTTGACATTTGTGGGCTGTTTACCAACACTTCTGGAACACAGCAGTGGAAGGGAC TTCCCAGATATTTTAAAATTACCCTTAGAAAGCGGTCTGTGAAAAACCCCTACCCAATTTCCTTT TTGTTAAGTGACCTAATTAACAGGAGGAGGACACAGAGGGTGGATGGGCAGCOTATGATTGGAAT GTCCTCTCAAGTAGAGGAGGTTAGGGTTTATGAQ3ACACAGAGGAGCTTCCTGGGGATCCAGACA TGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATT TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAÁGCTGCAATAAACAAGTTAACAA CAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGT AAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCATGAACAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAAO CTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCATGAACAGACTGTGAffiACTGAGGGGCCTGAAAT GAGCCTTGGGACTGTGAATCAATGCCTGTTTCATGCCCTGAGTCTTCCATGTTCTTCTCCCCACC ATCTTCATTTTTATCAGCATTTTCCTGGCTGTCTTCATCATCATCATCACTGTTTCTTAGCCAAT CTAAAACTCCAATTCCCATAGCCACATTAAACTTCATTTTTTGATACACTGACAAACTAAAOTCT TTGTCCAATCTCTCTTTCCACTCCACAATTCTGCTCTGAATACTTTGAGCAAACTCAGCCACAGG TCTGTACCAAATTAACATAAGAAGCAAAGCAATGCCACTTTGAATTATTCTCTTTTCTAACAAAA ACTCACTGCGTTCCAGGCAATGCTTTAAATAATCCTTGGCGCTAAAATCTATTTGTTTT***

Рис. 19A Первичная последовательность клонированного продукта

ПЦР, дифференциально экспрессирующегося на 3 сутки обработки

индуктором дифференцировки.

Рисунок 19Б Локализация отсеквенированного клонированного продукта ЩР на карге генома вируса ЗУ 40

Гибридизация дифференциально экспрессирующегося клонированного продукта амплификации, несущего последовательность большого Т-аитигена вируса 5У40, с мРНК клеток НЬ-бО (активно полифериру-ющих-и индуцированных к дифференцировке) показала наличие гибри-дизационного сигнала только в клетках, индуцированных к дифференцировке. Значит вирусные транскрипты тоже появляются на этой стадии. С чем связано необычное, поведение вируса ЗУ40 в клетках линии Н160 неясно, как неясно и то, связано ли появление вирусного транскрипта с переходом клеток от активной пролиферации к диффэрелцироЕке под воздействием обработки ретиноевой кислотой. Наличие вирусного генома в клетках линии НЬбО может служить одной из причин иммортализации этой клеточной линии, хотя ранее основной причиной считалось амплифицированное состояние клеточо-го онкогена с-иус, характеризующее клетки НЬбО. Сама стратегия исследования может использоваться для поиска последовательностей. характеризующих гранулоцитарное направление дифференцирован, при условии подбора соответствующего задачам исследования зонда для скрининга кДНК библиотек.

выводы

1. В кДНК-библиотеке "вычитания ", полученной на матрицах РНК, выделенных из клеток линии НЬ-60, индуцированных к дифферен-цировке в гранулоцитарном направлении и линии К 562, индуцированной к дифференцировке в эритроцитарном направлении, были обнаружены клоны, содержащие последовательности "цинковых пальцев", и определена высокая гомология одного из клонов с геном П_-1 человека.

2. С использованием полимеразной цепной реакции были найдены отличия в популяциях мРНК клеток линии НЬ-60, находящихся на разных стадиях дифференцировки (подвергнутых разным срокам обработки ретиноеЕой кислотой).

3. В клетках линии НЬ-60 была обнаружена последовательность вируса ЗУ 40, экспрессирующаяся на третьи сутки воздействия ре-тиноевой кислотой, и возможно, являющаяся одной из причин иммор-тализации этой клеточной линии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

1. Черников В. Г., Толкунова Е. Н. , Иноземцева (i II , Маршак М. Л. Получение трансфицированных клеток человека методой элект-ропорации. Тезисы второй всесоюзной конференции "Геном челоЕе-ка-91", 1991 г., г. Переяславль-Залесский.

2. Черников В. Г. , Толкунова Е. Н. , Кулагина О. Е. , Маргак М. Л. , Раевская Г. Б. Ростовые и цитогенетические характеристики культивируемых фибробластов человека, трансфицированных плазмидой рЗУЗ neo. Тезисы VI съузда ВОГиС им. Н. И. Вавилова, 1992 г. , г. Шнек.

3. Толкунова Е. Н. Поиск ДНК-последоЕательностей, характеризующих гранулоцитарное- направление дифференцировки клеток линии HL-60. Онтогенез, 1994, N 1, стр. 52-55.

Подписано к печати 30.01.95 Формат 60x84 1/16_

Объем 1,25 п.л. Заказ 22 _Тираж 70

ТОО "Нерей". ВНИРО, 107140, Москва, В.Красноселъская, 17