Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка, оптимизация и масштабирование биотехнологического производства пэгилированной формы рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка, оптимизация и масштабирование биотехнологического производства пэгилированной формы рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора"

На правах рукописи

Пучков Илья Александрович

РАЗРАБОТКА, ОПТИМИЗАЦИЯ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ПЭГИЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

15НДЯ23И

Москва 2014

005547841

Работа выполнена на базе ЗАО «Масгерклон» при содействии кафедры биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, академик РАН

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, заместитель директора по производству НПО «Биоцентр»

Колышкин Владимир Михайлович

Кандидат химических наук,

Гусаров Дмитрий Алексеевич

старший научный сотрудник, руководитель группы экспериментального биотехнологического производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Ведущая организация:

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика»

Защита состоится «23» июня 2014 г. в 16 часов 30 минут на заседании диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском Государственном Университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Государственного Университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (119571, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 86) и на сайте http://www.mitht.ru.

С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайте ВАК РФ: http://vak.ed.gov.ru и на сайте http://www.mitht.ru.

Автореферат разослан апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.х.н., с.н.с.

А. И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является главным регулятором выработки нейтрофилов в организме человека. Его рекомби-нантная метионилированная форма (рчГ-КСФ, Филграстим) впервые была введена на фармацевтический рынок в 1991 году для лечения нейтропении, являющейся результатом применения химиотерапии у больных раком. Филграстим имеет небольшое время полувыведения из сыворотки крови человека, что подтолкнуло к созданию его пэгилированной формы путем ковалентной модификации с инертным, гидрофильным полимером полиэтиленглико-лем (ПЭГ).

Разработка препарата ПЭГ-Г-КСФ связана с возрастающей потребностью в нем в трансплантологии, для лечения ВИЧ-инфицированных лиц, миелосупрессии у онкологических больных после радио- и химиотерапии, у людей с врожденной нейтропенией различной этиологии для коррекции иммунодефицитных состояний, а также для профилактики различных инфекционных осложнений.

Препарат ПЭГ-Г-КСФ (ПЭГ-филграстим) получают путем присоединения 20 кДа ПЭГ-альдегида к а-аминогруппе //-концевого остатка метионина молекулы рчГ-КСФ (реакция пэгилирования). Модификация увеличивает гидродинамический объем молекулы, делая ее слишком большой для почечного клиренса. Это приводит к повышению времени полувыведения препарата белка (саморегулируемый клиренс) и к улучшению биофизических параметров молекулы, пониженной восприимчивости к протеолизу и агрегации, а также к повышенной растворимости. В результате, препарат на основе пэгилированной формы рчГ-КСФ требует меньшей частоты введения пациентам за курс химиотерапии, что снижает риск возникновения побочных эффектов при его использовании (Мо1теих в., 2004).

Важными предпосылками для селективного протекания пэгилирования являются расположение сайта присоединения в белковой АК последовательности и способ образования ковалентной связи с молекулой белка. В случае рчГ-КСФ, стратегия эффективного пэгилирования предполагает создание предусмотренных улучшенных клинических и биофизических свойств продукта, но и частичную потерю биологической активности за счет пространственного влияния сайта присоединения.

Реакция пэгилирования представляет собой двухстадийный процесс с образованием неустойчивых оснований Шиффа, что приводит к небольшому выходу целевого конъюгата. Помимо этого конечная реакционная смесь содержит массу нежелательных продуктов, такие как пэгилированные изоформы, мультипэгилированные примеси, нативный белок, остаточный ПЭГ и др., что осложняет схему дальнейшей очистки ПЭГ-Г-КСФ, которая на настоящий момент еще не описана в научной литературе.

"Список используемых сокращений: АК - аминокислотный, АФС - активная фармацевтическая субстанция; ТВ - тельца включения; Л АЛ - лизат амебоцитов Ыти1ш; Г-КСФ -гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; рчГ-КСФ - рекомбинангный человеческий Г-КСФ; ПЭГ - полиэтиленгликоль; ЛИС - липополисахариды; ОФ ВЭЖХ - обращен-но-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ИОХ - ионообменная хроматография; ГХ - гидрофобная хроматография; БЭ - бактериальные эндотоксины; ЕЭ - единица эндотоксина, 1 ЕЭ = 0.1нг;ТФУ-трифторуксусная кислота.

Цель исследования заключалась в создании новой методики получения активной фармацевтической субстанции пэгилированной формы рекомбинантного человеческого Г-КСФ, обладающей повышенной стабильностью in vivo, с помощью модифицированного мо-но-метил-ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 21.5 кДа по а-аминогруппе TV-концевого остатка.

Задачи исследования:

1. Оптимизация условий пэгилирования рчКСФ в зависимости от значения рН, состава буферной системы, исходной концентрации рчКСФ, ПЭГ-альдегида и восстановителя;

2. Разработка полной схемы очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ с использованием уже описанной схемы очистки рчГ-КСФ (Кононова Н.В., 2009) с оптимизацией отдельных стадий;

3. Исследование структуры полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ.

Научная новизна. В результате изучения реакции пэгилирования рчГ-КСФ и дальнейшей оптимизации этого процесса проведен ряд экспериментов по исследованию факторов, влияющих на ход данной реакции, и впервые доказано, что на процесс конъюгации белков (на примере рчГ-КСФ) с модифицированным ПЭГ влияет состав буферной системы. В данном случае установлено, что использование буферной системы, содержащей цитрат-анион (цитрат натрия) приводило к наибольшей эффективности процесса селективной модификации рчГ-КСФ с ПЭГ. Также впервые установлено, что существуют диапазоны оптимальных концентраций взятого в реакцию присоединения рчГ-КСФ, в рамках которых выход конъюгата ПЭГ-Г-КСФ значительно увеличивается, а содержание неспецифически связанных конъюгатов ПЭГ сокращается, что, по-видимому, связано с механизмом взаимодействия ПЭГ с белками, который заключается в стерическом исключении молекулы ПЭГ из «белковой зоны» за счет связывания воды полимером.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработаны условия проведения конъюгации концентрированного рчГ-КСФ с ПЭГ, позволяющие проводить данную стадию в минимальном объеме, что делает процесс более технологичным;

2. Минимизирован расход дорогостоящего конъюгационного агента, ПЭГ, позволяя сделать стадию модификации белка более экономичной и таким образом снизить себестоимость препарата ПЭГ-Г-КСФ;

3. Исследовано влияние различных факторов на ход реакции ковалентного присоединения ПЭГ с рчГ-КСФ, сокращено содержание примесей, образующихся в ходе данной реакции, что упростило схему дальнейшей очистки препарата;

4. Разработана унифицированная схема очистки ПЭГ-Г-КСФ на основе существующей схемы для рчГ-КСФ, приемлемая для двух препаратов (рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ);

5. Полученный конечный препарат ПЭГ-Г-КСФ прошел доклинические исследования in vitro, и было установлено, что уровень его биологической активности не уступает уровню активности препарата рчГ-КСФ, что позволяет ввести на российский фармацевтический

рынок замену дорогостоящему импортному аналогу «Neulastim» (F.Hoffinann-La Roche

Ltd, Швейцария).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация получения пэгилированного рчГ-КСФ с понижением молярного количества ПЭГ-альдегида и цианборгидрида натрия, и масштабирование данного процесса;

2. Доказано влияние состава буферной системы на ход реакции пэгилирования рчГ-КСФ методом восстановительного jV-алкилирования;

3. Создание схемы очистки пэгилированной формы рчГ-КСФ на основе схемы очистки немодифицированного препарата рчГ-КСФ.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении исходных данных и в научных экспериментах, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подготовке основных публикации по выполненной работе.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Во введении обоснована актуальность работы и сформулирована ее цель и практическая значимость.

Литературный обзор состоит из трех частей. В первой части описывается структура и функции рчГ-КСФ, а также механизм его физиологического действия и применение. Во второй части обосновывается уникальность использования различных видов ПЭГ для создания модифицированных форм препаратов на основе пептидов и белков; рассматриваются различные производные ПЭГ в качестве конъюгационных агентов, их физико-химические характеристики и способы активации. Также во второй части описываются недостатки и преимущества присоединения ПЭГ к биологическим молекулам, сложности проектирования ПЭГ-консггруктов и история создания зарегистрированных на фармацевтическом рынке белковых ПЭГ-препаратов, рассматриваются механизмы реакции пэгилирования (в т.ч. ненаправленное и сайт-специфичное) по различным функциональным группам белков. В третьей части приводится описание препарата ПЭГ-Г-КСФ (ПЭГ-фипграстима), подробно рассматривается реакция ковалентного направленного присоединения модифицированного ПЭГ-альдегида к рчГ-КСФ и излагаются результаты доклинических и клинических испытаний ПЭГ-Г-КСФ.

В экспериментальной части дается перечень оборудования и материалов, использованных при получении ПЭГ-Г-КСФ, при создании схемы его очистки и при анализе препарата.

В обсуждении результатов описан ход разработки методики получения пэгилированной формы рчГ-КСФ с помощью модифицированного ПЭГ-альдегида и построение схемы ее дальнейшей очистки. Приведены результаты масштабирования процесса пэгилирования и анализа полученного препарата.

Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 22 рисунка, 12 таблиц и список литературы из 239 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть

Объект исследования

Получение рчГ-КСФ осуществляли с помощью штамма-продуцента E.coli BL-21(DE3)/pES3-7, сконструированного в ИБХ РАН. Продуктивность штамма составляла 400 мг рчГ-КСФ с 1 л культуральной жидкости. Синтезируемый белок образовывал нерастворимые тельца включения (ТВ) в клетках.

Методы исследования

Концентрацию белка определяли с помощью метода ОФ ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке Symmetry 300Â С4 (4.6x250 мм) (Waters, США) в системе, состоящей из элюента А, содержащего 0.1% ТФУ в НгО, и элюента Б, содержащего 20% ацетоншрила в 1-пропаноле с 0.1% ТФУ. Линейный градиент задавали от 40 до 50% по элюенту Б, скорость потока составляла 1 мл/мин, t=35°C, длина волны 210 нм.

Пептидное картирование. Концентрированный рчГ-КСФ и очищенный ПЭГ-Г-КСФ обессоливали на одноразовых колонках NAP-5 с использованием в качестве элюента 100 мМ NH4HCO3. К 1 мл раствора белка с концентрацией 1 мг/мл прибавляли 50 мкл 0.1% раствора трипсина. Гидролиз проводили при температуре 37°С в течение 4 ч и останавливали добавлением 50 мкл 1% раствора ТФУ. Анализ гидролизатов белков, полученных с помощью расщепления трипсином, проводили в градиентном режиме на обращенно-фазовой колонке Luna C,g(2) (Phenomenex, США). Подвижная фаза: А - 0,1 % ТФУ; Б - 90% ацетошприл с 0,1 % ТФУ; градиент: 0-20 % В за 40 мин, 20-40 % В за 40 мин, 40-80 % В за 20 мин; скорость потока: 1 мл/мин, температура 30 °С; длина волны 214 нм.

ESI-TOF LC/MS-анализ гидролизатов белков, полученных расщеплением трипсином осуществляли в режиме on-line на микроколоночной ОФ ВЭЖХ-сисгеме Agilent 1200, оснащенной времяпролегным (ESI-TOF) масс-анализатором серии Agilent 6224. Анализ выполняли на микроколонке YMC С» 300Ä (4.6x250 мм). Подвижная фаза: А - 0.1% ТФУ; Б -70% ацетонитрил в 0.1% ТФУ; градиент: 10-100%В за 17 мин; скорость потока 0.25 мл/мин, температура 40°С; длина волны 220 нм.

В качестве внешних стандартов ОФ ВЭЖХ и пептидном картировании использовали фармацевтические препараты «Neipogen» (Amgen Inc., США) и «Neulastim» (F.Hoffinann-La Roche Ltd., Швейцария).

Содержание белков, продуцируемых клетками £ coli, определяли твердофазным им-муноферментным анализом с использованием набора «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of E.coli Host Cell Proteins» (Cygnus Technologies Inc., США).

Качественное и количественное определение БЭ проводили гель-тромб тестом с помощью ЛАЛ-реакгива Endosafe (Charles River Endosafe, США) с заявленной чувствительностью >.=0.03 ЕЭ/мл КСЭ 10 нг/мл.

Определение специфической активности in vitro полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ по сравнению с активностью препарата «Neulastim» (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария) было выполнено в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в лаборатории лучевых методов лечения опухолей методом МТТ-клеточной пролиферации с Г-КСФ-зависимой культурой клеток. Выявляли стимуляцию роста клеток после добавления препарата «Neulastim» и полученных образцов ПЭГ-Г-КСФ к лимфоидной линии клеток NFS-60, окрашенных красителем Alamar Blue. Проверку специфической активности, полученных препаратов проводили в сравнении с Международными стандартами (NIBSC, Великобритания).

Очистку проводили с помощью хроматографической системы ÄKTA Purifier (GE Healthcare, Швеция), управляемой с помощью программы «Unicom». Использовали препаративные колонки ХК26, ХК50 (GE Healthcare, Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Молекула ПЭГ-Г-КСФ представляет собой ковалентный конъюгат ПЭГ с молекулярной массой 21.5 кДа с молекулой рчГ-КСФ, присоединенной по а-аминогруппе JV-концевого остатка метионина. Ковалентная модификация с ПЭГ увеличивает гидродинамический объем молекулы рчГ-КСФ, что делает ее слишком большой для почечного выведения. Как и все пэгилированные белки, ПЭГ-Г-КСФ (ПЭГ-филграстим) имеет тот же механизм действия, что и «нативная» молекула. Однако ПЭГ-Г-КСФ имеет более длительный период полувыведения in vivo по сравнению с рчГ-КСФ (Molineux G., 2004).

Изучение и оптимизация условий проведения конъюгации ПЭГ-Г-КСФ

Присоединение ПЭГ к молекуле рчГ-КСФ как правило происходит за счет образования ковалентной связи между активированной гидроксильной группой ПЭГ и е-аминогруппой лизина, а также a-аминогруппой //-концевого метионина или имидазольной группой гистидина в молекуле рчГ-КСФ. Ранее было установлено, что присоединение ПЭГ к //-концевому AK-остатку рчГ-КСФ повышает время циркуляции препарата в крови и не влияет на его активность, поскольку не происходит нарушения нативной пространственной организации белковой молекулы (Kinstler О., 1995). Конъюгацию по аминогруппе JV-концевого Met рчГ-КСФ возможно осуществить с помощью двух реакций - ацилирования и алкилиро-вания. В результате реакции ацилирования происходит образование амидной связи, сопровождающееся потерей заряда на аминогруппе //-концевого метионина рчГ-КСФ, вследствие чего происходит агрегация молекул белка.

Алкилирование с сохранением заряда аминогруппы проводится с помощью модифицированного акцептора ПЭГ-альдегида с образованием по JV-концевому метионину вторичного амина. Таким образом, удается избежать образования агрегатов белка и потери активности полученного конъюгата.

Восстановительное //-алкилирование рчГ-КСФ с образованием активной пэгилирован-ной формы проводили с помощью модифицированного акцептора моно-метил-ПЭГ-пропиональдегида (а-метил-ш-[3-оксопропокси]полиоксиэтилен) с молекулярной массой

21,5 кДа, способного селективно взаимодействовать со свободной а-аминогруппой N-концевого Met при значениях рН раствора 5.0-6.0. Схема реакции представлена на Рис. 1.

В первоначальных экспериментах для модификации рчГ-КСФ использовали условия, описанные в литературе, согласно которым реакцию конъюгации проводили в течение 18 ч при температуре 4°С в буферном растворе 0.1 М фосфат натрия (рН 5.0) в присутствии 80-кратного избытка цианборгидрида натрия (1.34 мг/мл) и 5-кратного избытка ПЭГ (28.65 мг/мл) при концентрации белка 5 мг/мл.

рН3.0

HjN-Г-КСФ

а-метл-ю-(3-оксопропо1гси)-ПЭГ

НО

\ /мю cv ^XN^ ^¿N.

NaCNBHj

Основание Шиффа

Рис. 1. Схема реакции модификации рчГ-КСФ по а-аминогруппе //-концевого остатка метионина методом восстановительного Л'-алкилирования.

Для оценки эффективности методики проводили масштабирование процесса конъюгации в 5,10 и 50 раз, что соответствовало 50, 100 и 500 мл реакционной смеси. Как видно из результатов, представленных в Таблице 1, в данных условиях масштабирование процесса приводило к снижению выхода ПЭГ-Г-КСФ и к образованию в ходе реакции конъюгатов с более высокой степенью модификации.

Поскольку в результате масштабирования процесса пэгилирования рчГ-КСФ не удалось воспроизвести показатели, соответствующие первоначальной методике реакции присоединения ПЭГ-альдегида, то проводили ряд экспериментов по оптимизации факторов, влияющих на ход данной реакции, а именно: значений рН (в области 4.0-8.0) и состава буферной системы, исходной концентрации белка, конъюгационного агента ПЭГ и восстановителя ЫаСОТНз. Поскольку уже на первой ступени масштабирования выход ПЭГ-Г-КСФ снижался (с 59.5 до 48.3%), то оптимизацию условий осуществляли в объеме реакционной смеси равном 50 мл.

Оценка масштабирования процесса модификации рчГ-КСФ, (к*- коэффициент масштабирования).

к* Объем реакционной смеси, мл г Выход ПЭГ-Г-КСФ, % Оставшийся рчГ-КСФ, % Побочные продукты конъюгации, %

1х 10 0.050 59.5 38.1 2.4

5х 50 0.250 48.3 46.0 5.7

10х 100 0.500 38.8 51.8 9.4

50х 500 2.500 35.0 51.2 13.8

Для поддержания значений рН реакционной смеси от 4.0 до 5.5 использовали 50 мМ CH3COONa; для рН 6.0 - 5 мМ цитрат натрия; для рН 6.5 - 20 мМ Na2HP04; для рН 7.0 - 20 мМ Tris; для рН 8.0 - 20 мМ HEPES. Выбор диапазона значений рН 4-8 объясняется разницей значений рКа a-аминогрупп //-концевого Met (7.8), по которому происходит селективное присоединение ниже данного значения рКа, и e-аминогрупп Lys (10.1), а также неустойчивостью модифицированного ПЭГ-альдегида в кислых средах ниже рН 4.0, вызванной гидролизом ацетальной группы, и выше 7.5 - засчет альдольной конденсации.

80 °г 70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -

А -1-1-1_I_I_I_I_I_I_!_L

3 4 5 6 7 8 рН

Рис. 2. Изучение влияния рН среды реакционной смеси на выход ПЭГ-Г-КСФ; а - оптимальный диапазон рН для проведения реакции (5.8-6.4).

На Рис. 2 показано влияние рН среды на выход ПЭГ-Г-КСФ (в %) от исходного количества белка, взятого в реакцию.

Как следует из представленных данных на Рис.2, наиболее полному протеканию реакции с выходом ПЭГ-Г-КСФ около 58% соответствует диапазон значений рН 5.8-6.4, что объясняется селективным присоединением ПЭГ-альдегида в данных условиях к а-аминогруппе jV-концевого Met рчГ-КСФ.

Далее изучали влияние типа аниона буферной системы на выход ПЭГ-Г-КСФ. Реакцию проводили в растворах, сохраняющих свою буферную емкость при рН 6.0. Реакцию прово-

дили в течение 18 ч при 4°С в присутствии 80-кратного избытка ЫаСЫВНэ (1.34 мг/мл) и 5-кратного избытка ПЭГ (28.65 мг/мл) при концентрации белка 5 мг/мл. В Таблице 2 представлены результаты изучения влияния различных буферных систем на степень селективности (а) протекания процесса пэгилирования, а именно - на отношение количества ПЭГ-филграстима, образовавшегося в ходе реакции, к общему количеству образовавшихся побочных продуктов и не вступившего в реакцию рчГ-КСФ.

Как следует из представленных в Таблице 2 данных, использование буферной системы содержащей цитрат-ион приводило к наиболее селективному протеканию процесса конъюгации ПЭГ-Г-КСФ. Таким образом, впервые нами было установлено, что селективность протекания реакции пэгилирования рчГ-КСФ определяется не только свойствами белка, но и типом использованной буферной системы.

Таблица 2

Влияние анионов на коэффициент селективности реакции модификации (а).

Состав буферной системы а

50 мМ ацетат натрия 1.1

20 мМ Na2HP04 0.96

10 мМ малонат натрия 1.06

20 мМ MES 1.21

5 мМ цитрат натрия 1.45

20 мМ MOPS 0.7

Установление исходной оптимальной концентрации рчГ-КСФ проводили в буферной системе 5 мМ цитрат натрия при значении рН 6.0. Исследовали диапазон значений концентрации рчГ-КСФ от 1.0 до 20 мг/мл.

В Таблице 3 приведены данные, показывающие влияние концентрации рчГ-КСФ в реакционной смеси на выход ПЭГ-Г-КСФ. Из анализа этих данных следует, что увеличение исходной концентрации рчГ-КСФ в растворе от 1 до 13 мг/мл приводит к более высокому выходу конечного продукта и, как следствие, селективному протеканию реакции. При этом выделяли два диапазона значений концентраций белка в растворе, при которых выход ПЭГ-Г-КСФ остается практически неизменным: от 5 до 8 мг/мл - диапазон I, и от 10 до 12 мг/мл -диапазон И.

Реакция модификации с исходными концентрациями рчГ-КСФ в диапазоне I имеет коэффициент селективности равный 1.41-1.45 и характеризуется наименьшими потерями белка. Коэффициент селективности с использованием концентраций диапазона II значительно выше (2.19-2.27), однако при высоких концентрациях взятого в реакцию рчГ-КСФ из-за ограничения растворимости белка его потери увеличиваются, а равновесие реакции смещается в сторону образования побочных продуктов.

Исходя из того, что селективность реакции достигала своего максимального значения в диапазоне И, то оптимальной концентрацией рчГ-КСФ в реакции принимали значение 10 мг/мл.

Влияние исходной концентрации рчГ-КСФ на выход ПЭГ-Г-КСФ.

Конц. рчГ-КСФ, мг/мл Определяемый параметр после проведения реакции модификации

ПЭГ-Г-КСФ, % рчГ-КСФ, % Побочные продукты реакции, % Конц. общего белка, мг/мл Потери белка, % а

1 6.63 92 - 1 - -

3 36.5 63 0.5 2.95 1.7 0.57

I 5 58.8 38.2 3.0 4.88 2.5 1.43

7 58.5 38.5 6.8 3 1.41

8 59.2 37.3 3.5 7.66 4.3 1.45

9 63.0 32.2 4.8 8.65 4.5 1.70

II 10 69.0 23.0 8.0 9.4 6 2.23

11 68.7 23.3 9.79 11 2.19

12 69.4 22 8.6 10.2 15 2.27

13 67.2 22.3 10.5 10.0 23 2.06

14 64.9 23.2 11.9 9.75 25 1.85

15 61.5 25.7 12.8 10.4 30.6 1.60

20 56.8 30.2 13.0 9.8 51 1.31

Далее проводили ряд опытов, в ходе которых варьировали концентрацию ПЭГ и КаСЫВНз, сохраняя при этом постоянными время реакции (18 ч) и объем реакционной смеси (50 мл). Реакцию проводили при температуре 4°С в буферной системе 5 мМ цитрат натрия при рН 6.0 и концентрации рчГ-КСФ 10 мг/мл.

Исследовали влияние значений молярных избытков компонентов реакции пэгилирова-ния: для ИаС^Нз в 1, 5, 10, 20, 30, 40, 80 раз; и для ПЭГ в 1, 2, 3, 4, 5 раз по отношению к количеству рчГ-КСФ, взятого в реакцию. На Рис. 3 представлены данные в виде трехмерной зависимости степени пэгилирования рчГ-КСФ от концентрации КаСЫВНз и ПЭГ.

Проведенные эксперименты показали, что при концентрации белка 10 мг/мл существуют молярные соотношения этих реагентов, при которых степень конъюгации рчГ-КСФ с ПЭГ достигает 90%. Это соотношение реагентов составило 20 (0.67 мг/мл) и 3 (34.37 мг/мл) (ЫаСЫВНзЛЭГ).

Анализ с помощью ОФ ВЭЖХ состава реакционной смеси, полученной в результате проведения реакции подтвердил правильность выбора условий проведения модификации ПЭГ-Г-КСФ. Результаты ОФ ВЭЖХ хроматограмм представлены на Рис. 4.

Так, площадь пика 3, соответствующего времени выхода непрореагировавшего рчГ-КСФ составляла 5% от площади общего белка, а пика 2, соответствующего побочным продуктам реакции конъюгации (продуктам с более высокой степенью модификации) - 5-7%.

Избыток ПЭГ

Рис. 3. Трехмерная диаграмма влияния концентрации компонентов реакции на степень модификации филграстима.

О 5 10 И мин

Рис. 4. ОФ ВЭЖХ-анализ стандарта рчГ-КСФ (а) и реакционной смеси (б), полученной после проведения реакции в оптимизированных условиях. Пик 2 - побочные продукты, получаемые в процессе реакции (5-7 %); Пик 3 - непрореагировавший рчГ-КСФ (5%, б); Пик 1 - ПЭГ-Г-КСФ.

Для оценки эффективности полученной методики в препаративных условиях проводили повторное масштабирование процесса конъюгации ПЭГ-Г-КСФ в оптимизированной системе: в буферном растворе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0 в присутствии 20-кратного избытка

12

ЫаСЫВНз и 3-кратного избытка ПЭГ с исходной концентрацией белка 10 мг/мл. Результаты ОФ ВЭЖХ анализа полученных реакционных смесей приведены в Таблице 4.

Таблица 4

Оценка масштабирования процесса модификации рчГ-КСФ в оптимизированных условиях.

Начальные условия реакции Определяемые параметры после проведения реакции

ВЫХОД Потери белка

Объем реакц. смеси, мл Белок, г ПЭГ-Г-КСФ Филграстим Побочные продукты

% г % г % г г %

50 0.5 90 0.38 5 0.021 5 0.021 0.075 15

100 1.0 0.77 0.043 0.043 0.15

500 5.0 87 3.7 8 0.34 0.21 0.75

Как следует из приведенных данных, высокий выход конечного продукта реакции -конъюгата ПЭГ-Г-КСФ - сохранялся вплоть до 10-кратного увеличения исходного объема реакционной смеси, что свидетельствовало о работоспособности полученной методики конъюгации ПЭГ-Г-КСФ в полупромышленных масштабах.

Идентификация сайта конъюгации ПЭГ

Для подтверждения селективности связывания ПЭГ с а-аминогруппой рчГ-КСФ осуществляли трипсинолиз очищенного конъюгата ПЭГ-Г-КСФ при соотношении фер-мент:субстрат 1:50 при рН 7.5 в течение 4 ч. Разделение полученного гидролизата проводили с помощью микроколоночной ОФ ВЭЖХ в системе, оснащенной времяпролетным масс-анализатором в режиме on-line. Для сравнения использовали гидролизат немодифицирован-ного рчГ-КСФ. В результате удалось выделить 12 фракций, каждая из которых представляла индивидуальный пептид. Пептидные карты белков представлены на Рис. 5 (а, б), а распределение соединений по фракциям и результаты их анализа методом ESI-TOF LC/MS - в Таблице 5.

Как видно из Таблицы 5, пептиды с одинаковой структурой идентифицированы во фракциях 1-7, 9, 11-13 и 1а-7а, 9а, 11а—13а. Пептиды, находящиеся в составе этих фракций имели близкие времена удерживания на колонке и по значениям данных [М+Н]+ соответствовали немодифицированным участкам полипептидной цепи молекулы рчГ-КСФ. Однако величины га/г для двух компонентов гидролизатов (фракции 5 и 5а, 6 и 6а) 1491.78 и 1619.84 Да, соответственно, не были сопоставимы ни с одним из рассчитанных значений ожидаемых масс пептидов. Как оказалось, эти пептиды образуются в результате окисления остатка Cys18 в процессе трипсинолиза и являются дисульфидными производными фрагмента Cys18-Arg23,

13

что подтвердилось результатами анализа тандемной масс-спектрометрии этих пептидов после модификации их 4-винилпиридином.

за: (а) - рчГ-КСФ, (б) - ПЭГ-Г-КСФ.

Таблица 5

Сравнительный анализ пептидов, полученных в ходе трипсинолиза рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-

КСФ.

Номера пиков на хроматограммах, рис.5 (а,б) Участок АК последовательности цепи белка т/г, Да [М+Н+1 Мрлсч» Да

1,1а Уа1,Ь8-Агйш 387.3 386.27

2,2а ^'"-Рго^ 565.31 564.31

3, За Пе"-!^5 1129.59 1128.59

4,4а Ьув^-Ьув" 1256.68 1256.68

5,5а А^^-Суч1 "-Сув '"-Ьу в''4 1619.84 1618.87

6, 6а Агя''-Сув "-С^' "-Агя" 1491.78 1490.76

7,7а Агй'"-АГВ"" 2190.2 2189.19

8 Ме^-Ьув 1786.89 1785.9

9,9а А1а'4';-Агй|Ь' 2033.00 2032.08

10 ПЭГ-Мег-Ьуэ" 23311.5 23311.0

11, 11а Ме1'-Рго"5 18786.3 18785

12, 12а Ьеи^-Агй14' 11288.8 11288.8

13, 13а Ьеи"-АгЙ14' 11967.0 11967.0

Уникальными для состава гидролизатов рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ оказались фракции 8 и 10. Поскольку различие молекулярных масс фрагментов 8 (гидролизат рчГ-КСФ, пептид Ме^уэ'7) и 10 (гидролизат ПЭГ-Г-КСФ) составляло 21524.6 Да и соответствовало массе

моно-метил-ПЭГ-пропиональдегида, то был сделан вывод, что присоединение ПЭГ к рчГ-КСФ происходит по //-концевому фрагменту цепи рчГ-КСФ. Поскольку при трипсинолизе конъюгата ПЭГ-Г-КСФ в составе смеси других фрагментов рчГ-КСФ, содержащих ПЭГ, обнаружено не было, то явилось очевидным, что присоединение моно-метил-ПЭГ-пропиональдегида в данных условиях синтеза осуществляется только по //-концевому остатку Met полипептидной цепи рчГ-КСФ.

Таким образом, были установлены условия селективной модификации рчГ-КСФ с помощью ПЭГ (21.5 кДа) по //-концевому остатку полипептидной цепи белка с выходом целевого продукта не менее 85% от общего белка, взятого в реакцию; а также доказано, что присоединение ПЭГ идет по а-аминогруппе рчГ-КСФ.

Очистка препарата ПЭГ-Г-КСФ

Получение и очистка пэгилированных лекарственных препаратов на практике представляет собой достаточно сложную задачу. Основной проблемой разработки схемы очистки модифицированного белка является получение высокого выхода целевого продукта, изоляция «пэгамеров» и обеспечение биологической активности конечного препарата. К сожалению, на данный момент в научной литературе отсутствует исчерпывающая информация о схеме очистки ПЭГ-Г-КСФ, поэтому с увеличением потребности в этом препарате появилась необходимость детально исследовать процесс очистки для разработки отечественных промышленных и полупромышленных технологий его получения.

В 2007 году фармацевтическая компания ЗАО «Мастерклон» разработала схему выделения и очистки рчГ-КСФ, которая включала в себя стадию солюбилизации рчГ-КСФ из ТВ, ренатурацию, ионообменную хроматографию на сорбенте SP Sepharose FF при рН 6.0, гидрофобную хроматографию на Butyl Sepharose 4 FF при рН 6.0 и гель-фильтрацию на сорбенте Sephadex G-25 (Кононова Н.В., 2009).

Таблица 6

Определение чистоты ренатурированного рчГ-КСФ и его потерь при понижении рН раствора.

рН Примеси, % Потери белка*, % (от общ.) Электропроводность, mS/cm

4.0 1.6 26 0.62

5.0 0 39 0.55

6.0 2.2 31 0.49

7.0 14.6 2 0.49

8.0 16.0 0 0.50

* - за счет денатурации.

Основываясь на полученных ранее данных, значение рН раствора рчГ-КСФ после рена-турации понижали до значения 4.0 с помощью 1 М уксусной кислоты. В результате данной операции препарат подвергался первичной очистке за счет осаждения нестабильных форм рчГ-КСФ. Однако проведя повторное исследование осаждения белковых фракций рчГ-КСФ

из ренатурата, по результатам ОФ ВЭЖХ установили, что уже при значении рН 6.0 основная масса примесей выпадает из раствора. А при значении ниже 6.0 происходит осаждение рчГ-КСФ, в результате чего понижается его концентрация, уменьшается выход и увеличивается общий объем раствора, что затрудняет дальнейший процесс очистки (Таблица 6).

Из полученных данных следует, что оптимальное значение рН раствора для дальнейшей очистки на ионообменном сорбенте SP Sepharose FF составляет рН 6.0. В качестве подвижной фазы использовали оптимизированную буферную систему для проведения реакции пэгилирования рчГ-КСФ - 5 мМ цитрат натрия. Скорость потока выбирали, основываясь на данных, полученных ранее — 250 см/ч. Подбор условий разделения проводили на хромато-графических колонках ХК 26 (GE Healthcare, Швеция) 100 мл.

Рис. 6. Сравнение хроматограмм первой стадии очистки рчГ-КСФ на сорбенте ЭР-8ерЬаго5е РР при рН 6.0: А) по методике получения Филграсгима; Б) для получения пэгилированной формы рчГ-КСФ.

На Рис. 6 представлены хроматограммы очистки рчГ-КСФ на первой стадии на сорбенте БР ЗерЬагове РР по методике получения Филграсгима и ПЭГ-Г-КСФ. Поскольку разработанные ранее условия не позволяли получить препарат с концентрацией выше 5 мг/мл рчГ-КСФ, которая требовалась для проведения реакции модификации по новой, наиболее технологичной методике, то для получения раствора рчГ-КСФ с концентрацией выше 9 мг/мл время протекания градиента сократили в 3 раза, а также изменили конечную концентрацию соли в градиенте (с 0.5 до 1 М №С1). Содержание примесей в препаратах рчГ-КСФ, полученных как по одной, так и по другой схеме, составило 5-10 %, что подтвердилось данными ОФ ВЭЖХ анализа

Таким образом, нами была разработана схема первичной очистки препарата рчГ-КСФ от основных клеточных компонентов в буферной системе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0 на

16

ионообменном сорбенте SP Sepharose FF, позволяющая получить белок с концентрацией 1112 мг/мл для последующего проведения реакции пэгилирования. Потери на данном этапе составили 10-15% от общего белка.

Гидрофобная хроматография на Butyl-Sepharose 4 FF

Для очистки препарата после стадии конъюгации требовались такие условия разделения, которые позволили бы очистить монопэгилированный препарат от основной массы по-липэгилированных примесей и немодифицированного рчГ-КСФ. Применение ГХ в данном случае объяснимо довольно заметным различием гидрофобных свойств моно-ПЭГ-Г-КСФ и его «нативной» формы, а также высокомолекулярных олигомеров.

Как известно, молярная концентрация нейтральной соли и повышение поверхностного натяжения с увеличением молярности в буферной системе для проведения ГХ являются важнейшими параметрами, определяющими степень удерживания биомолекул на гидрофобной матрице и их последующее разделение. Исходя из этого, исследовали комплексное влияние состава и значений рН различных буферных систем, на очистку ПЭГ-Г-КСФ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF.

Проводили изучение предельной концентрации соли в буферной системе, при которой не происходит преципитации белка из раствора препарата ПЭГ-Г-КСФ при общей концентрации белка 3-4 мг/мл. Основываясь на полученных данных, использовали системы, содержащие 0.8 М (NH^SOí, 1.5 М KF, 1.5 М NaCl. В качестве основы буферных систем в интервале рН 6.0-7.0 использовали 5 мМ трехзамещенный цитрат Na, а также 20 мМ Tris - в интервале рН 7.0-8.0. Максимальная динамическая емкость сорбента, установленная ранее, составила 20 мг белка на 1 мл геля. Скорость потока выбирали, основываясь на данных, полученных ранее - 100 см/ч. Время проведения обратного градиента концентраций составило 62 мин. Градиент проводился до 100% по буферной системе Б, не содержащей основного солевого компонента. Разделение проводили на тестовых колонках Tricorn 10/100 объемом 8 мл.

Эффективность хроматографической очистки ПЭГ-Г-КСФ оценивали по выходу препарата (% от общего белка) после проведения элюции обратным линейным градиентом концентрации соли, коэффициенту распределения белка (К), равному отношению количеств связавшегося и не связавшегося с сорбентом препарата, а также по коэффициенту разрешения Rs (время между максимальным выходом выбранных соседних пиков, деленное на полусумму их ширины у основания). Оптимальное значение Rs должно составлять не менее 1.5, но для большинства практических приложений, достаточным значением Rs является 1.2 или меньше. Для уменьшения ошибки при определении характеристик, описывающих процесс ГХ таких как степень очистки и коэффициента разрешения (Rs), в препарат ПЭГ-Г-КСФ, содержащий после стадии конъюгации не более 15% примесей добавляли нативный рчГ-КСФ до концентрации 30-40%.

Как видно из результатов, представленных в Таблице 7, наилучшие показатели хроматографической очистки ПЭГ-Г-КСФ были получены при использовании в качестве буферной системы 20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 для проведения ГХ на сорбенте Butyl Sepharose

Таблица 7

Влияние гидрофобного лиганда, состава и рН буферной системы на важнейшие хрома-тографические характеристики очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ.

Условия Выход (от общ. белка), % К Rs

Butyl Sepharose 4 FF 5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH4)2S04 рН 6.0 95.7 31 3.67

5 мМ цитрат натрия, 1.5 М NaCl рН 6.0 12 0.1 0.91

5 мМ цитрат натрия, 1.5 М KF рН 6.0 16 0.6 1.17

5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH^SOí рН 7.0 83.3 10.4 0.94

20 мМ Tris, 1.5 М NaCl рН 7.0 35.1 1.7 1.04

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 93.8 00 4.78

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 8.0 81.7 00 4.81

20 мМ Tris, 1.5 М NaCl рН 8.0 23.9 2.4 1.17

Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) 5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH4)2S04 рН 6.0 71.8 83 0.79

5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 67.7 19.7 0.28

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 71.5 197 0.13

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.5 66.9 159 1.22

Octyl Sepharose 4 FF, 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2S04 рН 7.0 18 0.9 0.72

4 FF, что отразилось в сочетании высокого выхода моно-конъюгата ПЭГ-Г-КСФ с высокими коэффициентами распределения (К) и разрешения (Rs). В то время как при очистке ПЭГ-Г-КСФ в этой же системе при значении рН 8.0 наблюдалось образование примесных форм, что, по-видимому, связано с нестабильностью рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ при данном значении рН.

Для исследования влияния сорбента на процесс очистки ПЭГ-Г-КСФ на стадии ГХ использовали наиболее часто применяющиеся для выделения белков гидрофобные матрицы: Octyl Sepharose 4 FF и Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (GE Healthcare, Швеция). Очистку проводили в условиях описанных выше для выделения препарата рчГ-КСФ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF. Основываясь на данных, представленных в Таблице 7, можно сделать заключение, что наилучшими хроматографическими характеристиками для очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ обладает сорбент Butyl Sepharose 4 FF, несмотря на то, что очистка препарата на Phenyl Sepharose 6 FF протекала гораздо эффективнее, чем на Octyl Sepharose 4FF, на котором модифицированный белок практически не сорбировался (что, по-видимому, объясняется меньшим сродством к нему молекулы ПЭГ-Г-КСФ).

Сводные результаты хроматографии препарата ПЭГ-Г-КСФ на различных гидрофобных сорбентах представлены на Рис. 7.

Важнейшей характеристикой степени очистки препарата является отсутствие в нем белков грамотрицательных бактерий, которые в большинстве случаев даже в микроколиче-сгвах (более 10 нг/мл) способны вызывать побочные реакции и снижать эффективность дей-

Рис. 7. Сравнение хроматограмм очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ на гидрофобных сорбентах Butyl Sepharose 4 FF (A), Octyl Sepharose 4 FF (В) и Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (С) (GE Healthcare, Швеция) в буферной системе А: 20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 pH 7.0. Скорость потока 100 см/ч. Градиент 0—>100% по буферной системе Б (20 мМ Tris pH 7.0) за 62 мин.

ствия препарата. Как правило, при использовании в качестве реципиентов культур микроорганизмов для экспрессии рекомбинантных препаратов требуется дополнительная стадия очистки от белков штамма-продуцента.

Для определения иммуногенных белков Е. coli использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА) (Cygnus Technologies, США), основанного на специфической реакции «антиген-антитело» и позволяющего определить контаминантные белки с

19

чувствительностью до 0.2 нг/мл, которую невозможно установить с помощью таких методов как ОФ ВЭЖХ или электрофорез.

Таблица 8

Влияние гидрофобного литанда, состава и pH буферной системы на степень очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ от белков штамма К coli BL21.

Примеси, % Белки штамма BL21, нг/мг БЭ, ЕЭ/мг/ мл

ТРЕБУЕМОЕ ЗНАЧЕНИЕ <7 <10 <5

Butyl Sepharose 4 FF 5 мМ цитрат натрия, 0.8 M (NH4)2S04 рН 6.0 5-7 245 >5

5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 2-4 58 >5

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 0 6 >5

Phenyl Sepharose 6 FF 5 мМ цитрат натрия, 0.8 М (NH4)2S04 рН 6.0 5 133 >5

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0 7-9 26 >5

20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04pH 7.5 3-4 144 >5

Также проводили анализ препарата ПЭГ-Г-КСФ полученного нами после стадии ГХ на Butyl Sepharose 4 FF в оптимизированных условиях на содержание БЭ (ЛПС клеточных стенок грамотрицательных бактерий, способных вызывать повышение температуры тела, лихорадку, шок) с помощью ЛАЛ-теста. ЛАЛ-тест считается надежным, широко применяемым, перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных препаратов. Результаты ИФА и ЛАЛ-теста образцов препарата ПЭГ-Г-КСФ после очистки на сорбентах Butyl Sepharose 4 FF и Phenyl Sepharose 6 FF представлены в Таблице 8.

Как следует из данных, приведенных в Таблице 8, наименьшее количество белков штамма Е. coli BL21 было обнаружено после очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF в буферной системе 20 мМ Tris, 0.8 М (NH4)2S04 рН 7.0, однако содержание БЭ во всех образцах превышало допустимое значение.

Ионообменная хроматография на SP Sepharose FF

Поскольку большинство БЭ имеет pl~2, то при проведении очистки положительно заряженных белков, таких как ПЭГ-Г-КСФ (pi 5.8-6.6) на катионнообменном сорбенте в буферных системах с рН 4+5 основная часть этих коптаминантов не сорбируется на носителе. Это основные причины, по которым было оправдано использование ИОХ для очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ от БЭ, а также от незначительных примесей поликонъюгатов и нативно-го рчГ-КСФ, и для концентрирования белка перед приготовлением его АФС.

С целью изучения оптимального значения рН буферной системы для очистки ПЭГ-Г-КСФ на SP Sepharose FF проводили хроматографию в буферном растворе А (50 мМ ацетат натрия) в диапазоне рН 4+5, поскольку известно, что при значениях близких к рН 4.0 Г-КСФ

и ПЭГ-Г-КСФ проявляют максимальную конформационную стабильность (Piedmonte D.M., 2008). Эффективность осуществления процесса очистки оценивали по выходу препарата и коэффициенту распределения белка (К).

Таблица 9

Выход ПЭГ-Г-КСФ после стадии катионообменной хроматографии на БР ЗерЬагове РР в буферной системе А (50 мМ ацетат натрия) при различных значениях рН раствора.

Выход, Динамическая ем- Потери белка, Содержание Концентрация

% кость, мг/мл * БЭ, ЕЭ/мг/мл ПЭГ-Г-КСФ на

% белка выходе, мг/мл

pH 45 - 42 0.5-1.5 10

4.0

рн 58 20 21 0.5-1.5 13

4.5

pH 39 20 27 <5 7

5.0

* - за счет необратимой сорбции.

При элюировании препарата использовали линейный градиент 50% по буферной системе Б (50 мМ ацетат натрия, 1 М NaCl), протекающий за 5.5 мин, что было обусловлено высокой концентрацией финальной формы - 10 мг/мл. Раствор ПЭГ-Г-КСФ после ГХ переводили с помощью дополнительно введенной стадии гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция) в буферные системы, содержащие 50 мМ ацетат натрия со значениями рН 4.0,4.5. и 5.0.

Как следует из данных, представленных в Таблице 9, оптимальное значение рН, при котором следует проводить хроматографическую очистку ПЭГ-Г-КСФ на сорбенте SP Se-pharose FF составляет 4.5. Такой выбор обусловлен высоким выходом ПЭГ-Г-КСФ в данных условиях (58 %) и минимальными потерями белка (21 %). При рН 4.0 ПЭГ-Г-КСФ необратимо сорбируется на матрице колонки, за счет чего его выход снижается. При значении рН 5.0 ионогенных групп недостаточно для полного (или почти полного) связывания, из-за чего большая часть белка выходит в проскоке. Хроматограммы очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ на катионообменном сорбенте SP Sepharose FF при различных значениях рН буферной системы 50 мМ ацетат натрия (4.0,4.5, 5.0) представлены на Рис. 8.

С помощью ЛАЛ-тесга измеряли пирогенность полученных фракций ПЭГ-Г-КСФ после стадии ИОХ, которая во всех случаях не превышала допустимые нормы (не более 6 ЕЭ/мг в 1 мл раствора белка). Незначительное повышение уровня БЭ в буферной системе со значением рН 5.0 объясняется близостью его к pi ПЭГ-Г-КСФ.

Как следует из Таблицы 9, только буферная система со значением рН 4.5 соответствовала требованиям, установленным для концентрации ПЭГ-Г-КСФ, достаточной для дальнейшего перевода в буфер хранения (концентрация ПЭГ-Г-КСФ 13 мг/мл), так как применение гель-фильтрации всегда предполагает некоторое разбавление препарата.

atli 3000 1 |

ш |рН4Л| I 1 1 1 1 1

- 1 1 г — ■

♦к* ✓ 1

1 1

юсс SB 1

О » 10) Ш 200 350 Ы

Рис. 8. Сравнение хроматограмм очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ на катионообменном сорбенте SP Sepharose FF при различных значениях pH (4.0-5-5.0) буферной системы, содержащей 50 мМ ацетат натрия. Пунктирной линией изображена зависимость электрической проводимости раствора в миллисименс/см от объема элюата.

Итак, в результате изучения процесса катионообменной хроматографии ПЭГ-Г-КСФ на SP Sepharose FF в буферной системе 50 мМ ацетат натрия были установлены оптимальные условия его очистки от БЭ К coli, а также условия, позволяющие получать препарат в высокой концентрации без значительных потерь целевого белка (не более 10 % от общей массы ПЭГ-Г-КСФ).

Заключительной стадией очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ стала стадия гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция) в буферной системе 10 мМ ацетат

натрия, 5 % сорбнтол, 0.004 % Твнн-20 со значением pH 4.0 при скорости потока 170 см/ч. Значение pH буферной системы было ранее экспериментально подтверждено как оптимальное для стабильности ПЭГ-Г-КСФ, как и ее состав, основанный на ацетате натрия, который при данном pH проявляет максимальное значение своей буферной емкости и препятствует агрегации белковых молекул (Piedmonte D.M., 2008). Выход препарата по целевому белку на этой стадии составил не менее 70 %, а содержание примесей - не более 0.6 %.

Оценка чистоты и активности ПЭГ-Г-КСФ после ИОХ

Примеси, содержащиеся в АФС, могут снижать активность препарата, вызывать аллергические реакции в организме человека и обладать токсическим эффектом, поэтому содержание их строго регламентировано Фармакопеями. В основном, это продукты деградации целевых белков (родственные белки).

После каждой стадии очистки качество препарата ПЭГ-Г-КСФ оценивали двумя методами: электрофорезом на микрофлюидных чипах и ОФ ВЭЖХ. Микрофлюидные чипы представляют собой устройства с разветвленной сетью микроканалов, в которых возможно осуществление аналитических операций в микрофлюидных потоках с чувствительностью 2.5 нг/мкл в диапазоне молекулярных масс от 10-260 кДа. Детекцию осуществлют посредством измерения флюоресценции, вызванной действием лазера на окрашенные мицеллы SDS с белком.

Как следует из полученных данных на Рис. 9, конечный препарат был очищен от примесей и после финальной стадии соответствовал качеству стандарта ПЭГ-Г-КСФ. Несоответствие молекулярной массы ПЭГ-Г-КСФ 40 кДа на электрофореграмме вызвано значительным гидродинамическим радиусом молекулы ПЭГ, которое ведет к замедленной миграции модифицированного белка в геле.

ОФ ВЭЖХ проводили на колонке Symmetry 300Ä С4 (4.6x250 мм) (Waters, США). На Рис. 10 представлены хроматограммы стандартов рчГ-КСФ, ПЭГ-Г-КСФ и препарата ПЭГ-Г-КСФ, полученного нами на разных стадиях очистки. Как видно из представленных данных, чистота препарата ПЭГ-Г-КСФ после конечной стадии очистки полностью соответствует стандарту ПЭГ-Г-КСФ «Неуластим» (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария).

Для определения качества полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ также проводили сравнительный анализ пептидных карт гидролизатов образца и стандарта.

Расщепление белков трипсином позволяет получить пептиды, в структуре которых даже незначительное изменение АК состава приводит к изменению хроматографической подвижности модифицированных фрагментов относительно исходных, что позволяет обнаружить в структуре белка АК модификацию или замену. Расщепление стандарта ПЭГ-Г-КСФ и препарата ПЭГ-Г-КСФ, полученного после стадии ИОХ, проводили с помощью рекомби-нантного препарата трипсина TrypZean (Sigma, США). Хроматограммы пептидных карт гидролизатов стандарта ПЭГ-Г-КСФ и образца, полученного после стадии финальной очистки, представлены на Рис. 11. Сравнение пептидных карт ПЭГ-Г-КСФ со стандартом выявило полную структурную идентичность образцов.

Рис. 9. Электрофореграмма образцов рч-Г-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ после различных стадий очистки.

А.-.

Рис. 10. Сравнение результатов ОФ ВЭЖХ-хроматограмм стандартов и препарата ПЭГ-Г-КСФ на различных стадиях очистки.

Необходимым условием чистоты фармацевтических субстанций является отсутствие в ее составе БЭ и белков, продуцируемых клетками Е. coli. Поэтому очищенный препарат ПЭГ-Г-КСФ тестировали не только на содержание родственных примесей (согласно методам ЕР - Европейской Фармакопеи), но и на содержание иммунореактивных белков и БЭ. Результаты представлены в Таблице 10. Как следует из представленных в Таблице 10 данных,

полученный препарат не требовал дополнительной стадии очистки и соответствовал стандарту качества Европейской Фармакопеи.

А214

Рис. 11. ОФ ВЭЖХ гидролизатов стандарта ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ, полученных в ходе трипсинолиза: образец после ИОХ - снизу, стандарт - сверху. Подвижная фаза: А - 0,1 % ТФУ; В - 90% ацетонитрил с 0,1 % ТФУ; градиент: 10-20% В за 20 мин, 20-40% В за 60 мин, 40-80% В за 20 мин; колонка - Luna Cu (2) 100Á, 5 мкм (4,6x250 мм) (Phenomenexj; скорость потока 1 мл/мин.

Таблица 10

Проверка чистоты препарата ПЭГ-Г-КСФ после ИОХ методами ЕР (Европейской Фармакопеи).

Определяемый параметр Требуемое значение ПЭГ-Г-КСФ Г-КСФ

Родственные белки, % <7 1-3 <2

Белки штамма BL21, нг/мг <3 <3 <3

БЭ, ЭЕ/мг <5 <2.0 <2.5

Также была определена биологическая активность in vitro полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ по сравнению с активностью препарата «Neulastim» (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария). Работа выполнена в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Выявляли стимуляцию роста клеток после добавления препарата «Neulastim» и полученных образцов ПЭГ-Г-КСФ к лимфовдной линии NFS-60. Результаты представлены на Рис. 12. Согласно результатам проведенного эксперимента, специфическая активность полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ сопоставима с активностью Международных стандартов и находилась в пределах воспроизводимости биологического эксперимента.

-Пег-филгр -t

-й- Пег-филгр - 2

Концентрация белка, МЕ/мл

Рис. 12. Оценка активности препарата ПЭГ-Г-КСФ «Neulastim» (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария) (H-1,2), образцов двух серий полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ (ПЭГ-филгр-1,2). Посеяно 15 ООО клеток на лунку. Клетки росли 45 ч, затем на 10 ч добавляли Аламарблю.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны, масштабированы и описаны условия получения препарата ПЭГ-Г-КСФ посредством восстановительного JV-алкилирования рчГ-КСФ с линейным, модифицированным ПЭГ-альдегидом 21,5 кДа;

2. Идентифицирован сайт присоединения ПЭГ и установлена структура полученного конъюгата ПЭГ-Г-КСФ;

3. Разработана полная, унифицированная для двух препаратов белков (рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ) схема очистки АФС ПЭГ-Г-КСФ с использованием схемы очистки рчГ-КСФ, а также методы анализа препарата ПЭГ-Г-КСФ;

4. Впервые доказано, что на процесс конъюгации белков (на примере, рчГ-КСФ) с ПЭГ влияет состав буферной системы, в которой проводится реакция присоединения;

5. Установлено, что при повышении концентрации, взятого в реакцию присоединения рчГ-КСФ, выход конъюгата ПЭГ-Г-КСФ увеличивается;

6. Биологическая активность in vitro полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ сопоставима с активностью препарата «Neulastim» (F.Hoffinann-La Roche Ltd, Швейцария).

ПУБЛИКАЦИИ ПО РАБОТЕ:

1. Пучков, И. А. Рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (филграстим): оптимизация условий конъюгирования с полиэтиленгликолем / И. А. Пучков, Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, Д. И. Баирамашвили, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер И Биоорганическая химия. - 2012. - №5. - С. 545-554.

2. Пучков, И. А. Пегилированный рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирую-щий фактор пролонгированного действия: новая схема получения активной фармацевтической субстанции / И. А. Пучков, |Д. И. Баирамашвилй|, И. В. Мягких, В. И. Швец // Биотехнология. - 2014. - №2. - С. 31-62.

3. Пучков, И. А. Пэгилирование, как метод создания пролонгированных форм белковых препаратов, на примере ПЭГ-Г-КСФ / И. А. Пучков, [Д. И. БаирамашвилД В. И. Швец // Вестник МИТХТ. - 2014. - №2. - С. 3-32.

4. Пучков, И. А. Разработка технологии получения активной фармацевтической субстанции (АФС) отечественного препарата ПЭГилированного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора / И. А. Пучков, М. М. Ильяшенко, Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме «Биофарма-2011: От науки к промышленности»: Израиль, Тель-Авив, 16-18 мая 2011 г.-Тель-Авив, Израиль, 2011.-С.28.

5. Пучков, И. А. Разработка стадии гогилирования рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с целью улучшения его терапевтических свойств / И. А. Пучков, А. И. Бобрускин, Н. В. Кононова, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер // Тезисы научных докладов на Российском симпозиуме «Биофарма-2010: От науки к промышленности»: Армения, Ереван, 17-20 мая 2010 г. - Ереван, Армения, 2010. - С.40.

6. Кононова, Н. В. Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах / Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, Пучков И.А., Д. И. Баирамашвили // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции, посвященной 40-летию создания ГосНИИ Генетики. - Москва, Пущино, 2008. - С.49.

7. Кононова, Н. В. Сравнительный анализ качества российского препарата Растан с зарубежными аналогами Генотропин и Хуматроп / Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, И. А. Пучков, Т. Г. Галкина, Д. И. Баирамашвили // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме «Биофарма-2009: От науки к промышленности»: Анталия, Турция, 25-27 мая 2009 г. - Турция, 2009. - С. 19.

Подписано в печать: 22.04.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1119 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Пучков, Илья Александрович, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХ ХИМИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ ЗАО «МАСТЕРКЛОН»

РАЗРАБОТКА, ОПТИМИЗАЦИЯ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ПЭГИЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

На правах рукописи

Пучков Илья Александро

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук профессор, академик РАН

Швец Виталий Иванович

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ..........................................4

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................6

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР....................................................................12

1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ)........................12

1.1. Функции, биологическое значение и механизм секреции Г-КСФ.........12

1.2. Структура Г-КСФ......................................................................................15

1.3. Применение рчГ-КСФ в медицине.................................................18

2. Полиэтиленгликоли (ПЭГ)................................................................................20

2.1. Преимущества, направления и перспективы использования пэгилирования в области создания новых классов биофармацевтических препаратов...20

2.2. Свойства ПЭГ как модифицирующего агента.........................................28

2.3. Виды ПЭГ-реагентов.................................................................................33

2.3.1. Обзор современных ПЭГ-реагентов.........................................33

2.3.2. Линейные пэгилирующие агенты............................................42

2.3.3. Разветвленные пэгилирующие агенты......................................45

2.3.4. Сильноразветвленные пэгилирующие агенты............................45

2.4. Пэгилированные биофармацевтические препараты............................48

2.4.1. Препараты, полученные с помощью неспецифического пэгилирования...................................................................48

2.4.2. Препараты, полученные с помощью сайт-направленного (сайт-специфического) пэгилирования.............................................50

3. Пэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ПЭГ-Г-КСФ)................................................................................52

3.1. Краткое описание препарата ПЭГ-Г-КСФ.......................................52

3.2. Пэгилирование рчГ-КСФ............................................................53

3.3. Доклинические и клинические испытания ПЭГ-Г-КСФ......................56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................61

1. Оборудование и реактивы

61

2. Методы.......................................................................................62

2.1. Аналитические методы...............................................................62

2.2. Препаративные методы...............................................................64

3. Математические расчеты..................................................................68

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................70

1. Изучение и оптимизация условий проведения конъюгации ПЭГ-Г-КСФ......70

1.1. Введение.................................................................................70

1.2. Оптимизация условий и масштабирование пэгилирования рчГ-КСФ......70

1.3. Идентификация сайта конъюгации ПЭГ..........................................78

2. Очистка препарата ПЭГ-Г-КСФ.........................................................81

2.1. Основные подходы к очистке пэгилированных препаратов..................81

2.2. Первичная очистка ренатурированного рчГ-КСФ для получения его

пэгилированной формы.............................................................82

2.3. Гидрофобная хроматография ПЭГ-Г-КСФ.......................................85

2.3.1. Очистка ПЭГ-Г-КСФ от рчГ-КСФ и ПЭГ-олигомеров.................85

2.3.2. Очистка от белков Е. coli......................................................91

2.4. Ионообменная хроматография ПЭГ-Г-КСФ....................................93

2.5. Заключительная стадия очистки ПЭГ-Г-КСФ..................................99

2.6. Оценка чистоты и активности препарата ПЭГ-Г-КСФ........................100

ВЫВОДЫ........................................................................................106

БЛАГОДАРНОСТИ...........................................................................107

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................108

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CHU-2 - сквамозная клеточная карцинома

ESI-TOF - времяпролетная электроспрей-ионизация

Fab'-фрагмент - участок связывания антигена

Fc-регион - кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина

FDA - Управление по контролю за продуктами и лекарствами в США

IFN-a, -ß - интерферон-альфа, -бета

MALDI-TOF - времяпролетная матрично-активированная лазерная

десорбция/ионизация

NAcGal - N-ацетилгалактозамин

PEGPH20 - пэгилированная человеческая рекомбинантная гиалуронидаза

АК - аминокислотный

АКО - аминокислотный остаток

АФС - активная фармацевтическая субстанция

АЧН - абсолютное число нейтрофилов

БСА - бычий сывороточный альбумин

БТЗ-ПЭГ - ПЭГ-бензотриазолилкарбонат

БЭ - бактериальный эндотоксин

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарный макрофагальный КСФ

ГРЧ - гормон роста человека

ГСО - Государственный Стандартный Образец

ГХ - гидрофобная хроматография

ДЕ - динамическая емкость сорбента

ЕЭ - единица эндотоксина

ИОХ - ионообменная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста I

КБИ-ПЭГ - ПЭГ-карбонилимидазол

КМ-ПЭГ - карбоксиметилированные ПЭГ КСФ - колониестимулирующий фактор ЛАЛ-тест - Цтгйт атеЬосу1е 1у8а1е-тест

*

ЛПС - липополисахариды НФК-ПЭГ - ПЭГ-нитрофенилкарбонат

ОФ ВЭЖХ - обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная

хроматография ПДС-ПЭГ - ПЭГ-поли(диметилсилоксаны) ПЛ - поли(Х-лизин) ПЭГ - полиэтиленгликоль

рчГ-КСФ - рекомбинантный человеческий Г-КСФ РЭС - ретикулоэндотелиальная система

СБА-ПЭГ - ПЭГ-производные сукцинимидил-масляной кислоты СКМ-ПЭГ - сукцинимидильные ПЭГ СК-ПЭГ - ПЭГ-сукцинимидилкарбонат

СПА-ПЭГ - ПЭГ-производные сукцинимидил-прогшоновой кислоты

СС-ПЭГ - ПЭГ-сукцинимидилсукцинат

ТВ - тельца включения

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТХФ-ПЭГ - ПЭГ-трихлорфенилкарбонат

ФНО - фактор некроза опухоли

ФРСЭ - фактор роста сосудистого эндотелия

ЯМР-спектроскопия - спектроскопия ядерного магнитного резонанса

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является главным регулятором выработки нейтрофилов в организме человека. Его рекомбинантная метионилированная форма (рчГ-КСФ, филграстим) впервые была введена на фармацевтический рынок в 1991 году для лечения нейтропении, являющейся результатом применения химиотерапии у больных раком. Филграстим имеет небольшое время полувыведения из сыворотки крови человека, что подтолкнуло к созданию его пэгилированной формы путем ковалентной модификации с инертным, гидрофильным полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ).

Разработка препарата ПЭГ-Г-КСФ связана с возрастающей потребностью в нем в трансплантологии, для лечения ВИЧ-инфицированных лиц, миелосупрессии у онкологических больных после радио- и химиотерапии, у людей с врожденной нейтропенией различной этиологии для коррекции иммунодефицитных состояний, а также для профилактики различных инфекционных осложнений.

Препарат ПЭГ-Г-КСФ (ПЭГ-филграстим) получают путем присоединения 20 кДа ПЭГ-альдегида к а-аминогруппе ТУ-концевого остатка метионина молекулы рчГ-КСФ (реакция пэгилирования). Модификация увеличивает гидродинамический объем молекулы, делая ее слишком большой для почечного клиренса. Это приводит к повышению времени полувыведения препарата белка (саморегулируемый клиренс) и к улучшению биофизических параметров молекулы, пониженной восприимчивости к протеолизу и агрегации, а также к повышенной растворимости. В результате, препарат на основе пэгилированной формы рчГ-КСФ требует меньшей частоты введения пациентам за курс химиотерапии, что снижает риск возникновения побочных эффектов при его использовании.

Важными предпосылками для селективного протекания пэгилирования

являются расположение сайта присоединения в белковой АК последовательности

и способ образования ковалентной связи с молекулой белка. В случае рчГ-КСФ,

6

стратегия эффективного пэгилирования предполагает создание предусмотренных улучшенных клинических и биофизических свойств продукта, но и частичную потерю биологической активности за счет пространственного влияния сайта присоединения.

Реакция пэгилирования представляет собой двухстадийный процесс с образованием неустойчивых оснований Шиффа, что приводит к небольшому выходу целевого конъюгата. Помимо этого конечная реакционная смесь содержит массу нежелательных продуктов, такие как пэгилированные изоформы, мультипэгилированные примеси, нативный белок, остаточный ПЭГ и др., что осложняет схему дальнейшей очистки ПЭГ-Г-КСФ, которая на настоящий момент еще не описана в научной литературе.

Цель исследования

Цель исследования заключалась в создании новой методики получения активной фармацевтической субстанции пэгилированной формы рекомбинантного человеческого Г-КСФ, обладающей повышенной стабильностью \п vivo, с помощью модифицированного моно-метил-ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 21.5 кДа по a-аминогруппе А^-концевого остатка.

Задачи исследования

1. Оптимизация условий пэгилирования рчКСФ в зависимости от значения рН, состава буферной системы, исходной концентрации рчКСФ, ПЭГ-альдегида и восстановителя;

2. Разработка полной схемы очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ с использованием уже описанной схемы очистки рчГ-КСФ с оптимизацией отдельных стадий;

3. Исследование структуры полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ.

Научная новизна полученных результатов

В результате изучения реакции пэгилирования рчГ-КСФ и дальнейшей оптимизации этого процесса проведен ряд экспериментов по исследованию факторов, влияющих на ход данной реакции, и впервые доказано, что на процесс конъюгации белков (на примере рчГ-КСФ) с модифицированным ПЭГ влияет состав буферной системы. В данном случае установлено, что использование буферной системы, содержащей цитрат-анион (цитрат натрия) приводило к наибольшей эффективности процесса селективной модификации рчГ-КСФ с ПЭГ. Также впервые установлено, что существуют диапазоны оптимальных концентраций взятого в реакцию присоединения рчГ-КСФ, в рамках которых выход конъюгата ПЭГ-Г-КСФ значительно увеличивается, а содержание неспецифически связанных конъюгатов ПЭГ сокращается, что связано с механизмом взаимодействия ПЭГ с белками, который заключается в стерическом исключении молекулы ПЭГ из «белковой зоны» за счет связывания воды полимером.

Практическая значимость полученных результатов

1. Разработаны условия проведения конъюгации концентрированного рчГ-КСФ с ПЭГ, позволяющие проводить данную стадию в минимальном объеме, что делает процесс более технологичным;

2. Минимизирован расход дорогостоящего конъюгационного агента, ПЭГ, позволяя сделать стадию модификации белка более экономичной и таким образом снизить себестоимость препарата ПЭГ-Г-КСФ;

3. Исследовано влияние различных факторов на ход реакции ковалентного присоединения ПЭГ с рчГ-КСФ, сокращено содержание примесей, образующихся в ходе данной реакции, что упростило схему дальнейшей очистки препарата;

4. Разработана унифицированная схема очистки ПЭГ-Г-КСФ на основе существующей схемы для рчГ-КСФ, приемлемая для двух препаратов (рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ);

5. Полученный конечный препарат ПЭГ-Г-КСФ прошел доклинические исследования in vitro, и было установлено, что уровень его биологической активности не уступает уровню активности препарата рчГ-КСФ, что позволяет ввести на российский фармацевтический рынок замену дорогостоящему импортному аналогу «Неуластим» (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимизация получения пэгилированного рчГ-КСФ с понижением молярного количества ПЭГ-альдегида и цианборгидрида натрия и масштабирование данного процесса;

2. Доказано влияние состава буферной системы на ход реакции пэгилирования рчГ-КСФ методом восстановительного jV-алкилирования;

3. Создание схемы очистки пэгилированной формы рчГ-КСФ на основе схемы очистки немодифицированного препарата рчГ-КСФ.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении исходных данных и в научных экспериментах, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подготовке основных публикации по выполненной работе.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации:

1. Пучков, И. А. Рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (филграстим): оптимизация условий конъюгирования с полиэтиленгликолем / И. А. Пучков, Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, Д. И. Баирамашвили, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер // Биоорганическая химия. -2012,-№5.-С. 545-554.

2. Пучков, И. А. Пегилированный рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор пролонгированного действия: новая схема

получения активной фармацевтической субстанции / И. А. Пучков, [Д. И.

Баирамашвили], И. В. Мягких, В. И. Швец // Биотехнология. - 2014. - №2. - С. 31-62.

3. Пучков, И. А. Пэгилирование, как метод создания пролонгированных форм

белковых препаратов, на примере ПЭГ-Г-КСФ / И. А. Пучков, |Д._И.

Баирамашвили|, В. И. Швец // Вестник МИТХТ. - 2014. - №2. - С. 3-32.

4. Пучков, И. А. Разработка технологии получения активной фармацевтической субстанции (АФС) отечественного препарата ПЭГилированного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора / И. А. Пучков, М. М. Ильяшенко, Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме «Биофарма-2011: От науки к промышленности»: Израиль, Тель-Авив, 16-18 мая 2011 г. - Тель-Авив, Израиль, 2011. - С.28.

5. Пучков, И. А. Разработка стадии пэгилирования рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с целью улучшения его терапевтических свойств / И. А. Пучков, А. И. Бобрускин, Н. В. Кононова, В. А. Мартьянов, А. М. Шустер // Тезисы научных докладов на Российском симпозиуме «Биофарма-2010: От науки к промышленности»: Армения, Ереван, 17-20 мая 2010 г. - Ереван, Армения, 2010. - С.40.

6. Кононова, Н. В. Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах / Н. В.

Кононова, А. И. Бобрускин, Пучков И.А., Д. И. Баирамашвили // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции, посвященной 40-летию создания ГосНИИ Генетики. - Москва, Пущино, 2008. - С.49.

7. Кононова, Н. В. Сравнительный анализ качества российского препарата Растан с зарубежными аналогами Генотропин и Хуматроп / Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, И. А. Пучков, Т. Г. Галкина, Д. И. Баирамашвили // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме «Биофарма-2009: От науки к промышленности»: Анталия, Турция, 25-27 мая 2009 г, - Турция, 2009. - С. 19.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ)

Колониестимулирующие факторы (КСФ) - это семейство молекул, стимулирующих производство зрелых клеток крови в организме человека. КСФ впервые были выделены и охарактеризованы в начале 70-х годов XX века, когда было обнаружено, что колонии, содержащие зрелые нейтрофилы и макрофаги, подвергались быстрому росту после иммобилизации кроветворных клеток на гелевой матрице и обработке различными средами. КСФ участвуют в различных стадиях созревания, деления и пролиферации гемопоэтических клеток из илюрипотентных стволовых в различные зрелые клетки, гранулоцитарные макрофаги, эритроциты и тромбоциты [1]. Многие факторы роста проявляют универсальные свойства, стимулируют клеточное деление различных типов клеток, в то время как другие являются довольно узко специфичными.

КСФ относятся к цитокинам, которые представляют собой класс сигнальных белков, участвующих в клеточном взаимодействии, иммунной функции и эмбриогенезе. Цитокины экспрессируются с помощью различных кроветворных и некроветворных типов клеток и могут оказывать аутокринный, паракринный и эндокринный эффекты [2].

1.1. Функции, биологическое значение и механизм секреции Г-КСФ

Г-КСФ - один из представителей цитокинов - гликопротеин с молекулярной массой 19.6 кДа и состоящий из 174 аминокислотных остатков, -влияет на состояние системы кроветворения, образование функционально активных нейтрофилов и их выделение из костного мозга в кровеносную систему [3], а также обладает сигнальной функцией для поддержания стационарного уровня нейтрофилов in vivo [4].

Основное действие Г-КСФ на нормальные гемопоэтические клетки ограничивается клетками линии нейтрофилов. In vitro Г-КСФ избирательно

стимулирует пролиферацию и дифференцировку нейтрофилов колониеобразующих клеток и изменяет некоторые функции зрелых нейтрофилов. Г-КСФ также действует на относительно зрелые клетки-предшественники, которые ответственны за дифференциацию нейтрофилов. Г-КСФ часто проявляет синергетическую кроветворную активность в присутствии других цитокинов in vitro, таких как интерлейкин-3, интерлейкин-6 и гранулоцитарный макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ). Синергетическую активность Г-КСФ также проявляет в комбинации с клонированными лигандами (факторами стволовых клеток) на опротоонк�