Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора"

ОУ4Ы2171

На правах рукописи

Кононова Наталья Вячеславовна

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ: ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА И ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА.

Специальность - 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии). 02.00.10 - Биоорганическая химия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 1 НОЯ 2010

МОСКВА-2010 г.

004612171

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, опытно-промышленном производстве ЗАО «Мастерклон» и на опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук

доктор химических наук, профессор, академик РАМН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, ИНЭОС РАН

доктор химических наук, МГУ им. М.В. Ломоносова

Баирамашвили Дмитрий Ильич Швец Виталий Иванович

Ямсков Игорь Александрович Селшдева Алла Анатольевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится « 15 » ноября 2010 года в 15® часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте МИТХТ им. М.В. Ломоносова: http//www.mitht.ru.

Автореферат разослан « 15 » октября 2010 г.

Ученый секретарь » t

диссертационного совета, к.х.н., с.н.с. -j( А. И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.

В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирунмцего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов. Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.

Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков - лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончится. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях вМР, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

*Сиисок используемых сокращений: АФС - активная фармацевтическая субстанция; ТВ - тельца включения; ЛАЛ-реактив - лизат амебоцитов Ытикт; ГРЧ - гормон роста человека; рГРЧ - рекомбинантный ГРЧ; ¡УЫ-рГРЧ - рГРЧ, содержащий Ы-концевой метионин; Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; рчГ-КСФ - рекомбинантный человеческий Г-КСФ; ЛПС - липополисахариды; ОФ ВЭЖХ-обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ДЕ - динамическая емкость сорбента; ИОХ - ионообменная хроматография; ГХ - Гидрофобная хроматография; КСЭ - контрольный стандарт эндотоксина; ЕЭ - единица эндотоксина, 1 ЕЭ = 0,1нг; ЭФ ПААГ - электрофорез и полиакриламидном геле; КЭФ - капиллярный электрофорез; МС - масс-спектрометрия; ИЭФ - Изоэлектрическое фокусирование; ФС - фармакопейная статья; ВЭТТ - высота, эквивалентная высоте теоретической тарелки; СКБ - Европейский стандарт рГРЧ; ЕР - Европейская фармакопея; СМР - надлежащая производственная практика.

Цель исследования:

Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и рснэтурашт рГРЧ и рчГ-КСФ в различных условиях.

2. Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическуго очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.

3. Подобрать условия ферментативного отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.

4. Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.

5. Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.

6. Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.

Научная новизна полученных результатов \. Впервые, для ренатурации белков, Met-рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.

2. Установлено, что применение C11SO4 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.

3. Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи Cys182-Cys18' в тиоэфирную при рН 12.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ ' один производственный цикл.

2. Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производеп лекарственного препарата «Растан».

3. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанций рчГ-КС1 за один производственный цикл.

4. Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется дг производства лекарственного препарата «Нейпомакс».

Сведения об апробации работы.

Основные положения диссертации доложены на четвертом московском международнс конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: Состояние и перспективы развития» (Москва 2007); i

международной школе-конференции, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика (Москва 2008), на Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2009» (Турция, Анталия 2009); на международной научной конференции по биооргаиической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика 10. А. Овчинникова (Москва - Пущине 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Во введении обоснована актуальность работы и сформулирована ее цель и практическая значимость.

Литературный обзор состоит из трех частей. В первой части кратко описано строение и функция ГРЧ и Г-КСФ, проведено сравнение первичной структуры природных белков с их рекомбинантными аналогами. Описано применение лекарственных препаратов рГРЧ и рчГ-КСФ. Во второй чаем обсуждается тема, касающаяся солюбшшзации и ренатурации белков, выделяемых из ТВ. В третьей части представлены основные требования, предъявляемые Европейской фармакопеей к фармацевтическим препаратам. Также достаточно подробно рассмотрены химические и биологические свойства эндотоксинов и обсуждены методы удаления эндотоксинов из биофармацевтических препаратов.

В экспериментальной части дается описание оборудования и материалов, использованных при проведении исследования и методик анализа.

В обсуждении результатов описаны этапы разработки технологии производства рГРЧ и рчГ-КСФ, проблемы, возникшие при оптимизации той или иной стадии и способы их решения. Приведены результаты масштабирования процессов и сравнительного анализа выделенных препаратов с импортными аналогами.

Диссертация изложена на 112 страницах, содержит 26 рисунков, 11 таблиц и список литературы из ¡28 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Экспериментальная часть.

Объекты исследования. Получение рГРЧ и рчГ-КСФ осуществляли в штаммах-продуцентах Е. coli BL-21(DE3)/pESl-6 и Е. coli BL-21(DE3)/pES3-7, ранее сконструированных в ИБХ РАН. Продуктивность штаммов составляла 800 мг Met-рГРЧ и 400 мг рчГ-КСФ с 1 л культуральной жидкости. Синтезируемые белки образовывали нерастворимые тельца включения в клетках.

Методы исследования. Анализ фракций проводили методами ЕР 6.0 и ФС ЗА< «Мастерклои». В качестве внешних стандартов использовали Европейский стандар соматотропина (Cedex, Швейцария) и фармацевтический препарат Г-КСФ «Нейпоген (Amgen Inc. США).

Динамическую емкость сорбентов по соматотропину и филграстиму определяли к модельных колонках Tricorn 5/50 (GE Healthcare, Швеция), заполненных соответствующи сорбентом, следующим образом: осуществляли сорбцию целевого белка на I мл геля ;: наблюдения десорбции. Количество сорбировавшегося белка рассчитывали по формуле:

ДЕ = С„сх х (V„ct - Von.) (1)

Где ДЕ - динамическая емкость сорбента в г белка/л сорбента, С„к - исходная концентращ целевого белка в г/л, V„cx - объем исходного раствора белка в я, V^r. - объем раствора белка, i прошедшего через колонку в я.

Коэффициент емкости (к) рассчитывали по формуле:

k = (t*-to)/to (2)

Где tx - время удерживания белка на колонке, to - время выхода свободного объема колонки.

Фракционирование проводили в условиях хроматографии среднего давлени Элюироваше осуществляли линейным градиентом ионной силы. Во фракциях определя.1 концентрацию общего белка, родственных белков и наличие эндотоксинов и белко продуцируемых клетками E.coli.

Качественное и количественное определение эндотоксинов проводили гель-тро» тестом с помощью ЛАЛ-реактива Endosafe ("Charles River Endosafe", США) с заявлен» чувствительностью Х=0,03 ЕЭ/мл КСЭ 10 нг/мл.

Содержание белков, продуцируемых клетками E.coli, определяли твердофазщ иммуноферментным анализом с использованием набора "Immunoenzymetric Assay for t Measurement of E. coli Host Cell Proteins"("Cygnus Technologies, Inc", США).

Масштабирование процесса проводили с помощью хроматографической cucrres AKTAPilot (GE Healthcare, Швеция), управляемой программой «UNICORN». Использова промышленные колонны серии BPG 140/500,200/500 (GE Healthcare, Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГРЧ (соматотропин, соматотропный гормон) - белковый гормон, вырабатываем! передней долей гипофиза. Представляет собой одиоцепочечный полипептид с молекулярл массой 22 кДа, структура которого стабилизирована двумя внутримолекулярны дисульфидными связями в положениях Cys54- Cys165 и Cysm-Cysm. Основной функцией Г

является регуляция соматического роста. Помимо этого, он участвует в регуляции метаболизма белков и липидов, влияет на углеводный и минеральный обмен, воздействует на скелет, соединительную, мышечную ткани, а также внутренние органы, такие как печень, кишечник и почки. Лекарственные препараты на основе ГРЧ применяют для лечения малорослости, синдрома Шерешевского - Тернера, гипофизарного нанизма и при комплексной терапии таких заболеваний, как диабет II типа, гипертония, атеросклероз, сердечно - сосудистая недостаточность, ожирение.

Г-КСФ - гликопротеин с молекулярной массой 19 кДа, содержит в положении Су$17 свободную сульфгидрильную группу и две внутримолекулярных дисульфидных связи в положениях Суэ36- Су542 и Су564-Суз74. Продуцируется моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Обладает стимулирующим действием на стволовые клетки, регулирует образование функционально активных нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. В отличие от природной молекулы, рекомбинантный Г-КСФ (рчГ-КСФ), полученный путем экспрессии в клетках Е.соИ, не подвергается гликозилированшо, но по аминокислотной последовательности и конформационной структуре идентичен природному. Большинство клинических данных по Г-КСФ были получены именно с этим препаратом. Лекарственные препараты на основе рчГ-КСФ применяются при лечении нейтропений различной этиологии и онкологических заболеваний.

Оптимизация процессов солюбилнзации и ренатурации МеЬрГРЧ и рчГ-КСФ.

Рекомбинантпые белки, экспрессированные в ТВ, могут иметь как нативно-подобную вторичную структуру, так и структуру статистического клубка. Поэтому солюбилизация рекомбинантных белков из телец включения очень важный этап. Г-КСФ и ГРЧ относится к одному суперсемейству цитокинов типа I, так как обладают сходной третичной структурой (пучок из четырех антипараллельных а-епиралей и три нерегулярных участка). Исходя из этого, мы предположили, что солюбилизация и ренатурации данных белков должна проходить по одинаковой схеме.

Растворение ТВ, в основном, зависит от температуры, времени экспонирования белка в растворе, рН и солюбилизирующего агента. На рис. 1 показана схема проведения исследования ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ из ТВ. Эффективность процесса оценивали по следующим характеристикам: выход целевого белка после ренатурации, время, затраченное на процесс и масштабируемость процесса.

Подбор условий солюбшшзации и ренатурации начали проводить для рчГ-КСФ, так как данный белок является более сложным объектом, поскольку имеет свободную БН-группу.

ЬыхоЭ, мг бремя, ч мшпштюйируемость

йыхоЗ, мг бремя, ч масштабируемость

Рис. 1. Схема исследования процесса ренатурации.

Солюбмизация в мягких условиях (Схема 1). ТВ рчГ-КСФ помещали в буферные растворы с различными значениями рН (от 7,0 до 12,5), которые содержали 20 мМ Трис-НС1 и не содержали мочевину. Как следует из данных, представленных на рис. 2а, при значениях рН >10 выход белка из ТВ резко увеличивается. Таким образом, значение рН равное 12, было выбрано и на тот момент считалось оптимальным.

Далее изучали влияние концентрации мочевины на высвобождешю белка из ТВ (с учетом выбранного значения рН) рис. 2Ь и на процесс ренатурации рис. 2с. Процедуру ренатурации проводили по следующей схеме: сначала раствор солюбилизированного белка в соотношении 1:100 разбавляли водой, затем рН реакционной смеси доводили до значения 8,0 и оставляли на 16-18 ч при комнатной температуре.

Рис. 2 Подбор условий солюбилизации рчГ-КСФ из ТВ. а) Влияние рН раствора на солюбилизацию рчГ-КСФ из ТВ; Ь) Зависимость концентрации рчГ-КСФ в солюбилизате от концентрации мочевины; с) Зависимость выхода рчГ-КСФ, % после ренатурации от концентрации мочевины в солюбилизате. За 100 % принято количество белка, солюбилизированного 8Ммочевиной;

Как следует из представленных на рис. 2 данных, концентрация солюбилизированного рчГ-КСФ из ТВ в 8 М мочевине выше на 15 %, чем при солюбилизации в 2 М мочевине. Однако максимальный выход целевого белка после ренатурации наблюдался при концентрации мочевины 2М и составлял 85-90 % от исходного количества солюбилизированного белка. Поэтому в качестве оптимальной была выбрана концентрация мочевины 2 М. Максимальная концентрация белка в 2 М мочевине при рН 12, составляла 6 мг/мл.

Поскольку Г-КСФ имеет свободную БН-группу цистеина, поэтому его рснатурацшо нельзя проводить в присутствии окислительно-восстановительных пар. Из литературных данных известно, что сульфат меди (СиЗОО в концентрации 40 мкМ катализирует процесс окисления цистеинов в молекуле рчГ-КСФ и позволяет использовать в процессе высокую концентрацию белка. Изучение кинетики окисления вН-групп в присутствии СиБ04 позволило установить максимальную концентрацию белка (0,5 мг/мл) и, время (16-18 ч), за которое рчГ-КСФ приобретает нативное конформационпое состояние. Однако это время было также слишком долгим для технологического процесса.

Окисление 8Н-групп молекулярным кислородом в присутствии каталитических количеств ионов двухвалентных металлов происходит с образованием перекиси водорода Ш2О2) по следующей реакции:

| | 0 | ]

сн2— (СНОНЬ— СН2 СН2—(СНОН)2—СН2

Последняя может, в свою очередь, при нейтральных и кислых значениях рН также, окислять ЭН-группы цистеинов. Окислительно-восстановительный потенциал (Е°, В) Н2О2 выше, чем потенциал Ог почти в 2,5 раза (Е=+1,77 и +0,682). Мы предположили, что более высокий Е Н2О2 будет способствовать более эффективному образованию дисульфидных связей. Согласно реакции (4) мы теоретически рассчитали количество 37% Н202 (р=1Д38 г/см3), необходимое для образования двух дисульфидных связей в молекуле рчГ-КСФ (5,ЗмкМ):

БН в----й

2 СН2 — (СНОН)2 — СН2 + 2 НА—2 СН2— (СНОН)2 — сн2+ 4н2о (4)

В Табл. 1 представлены результаты изучения влияния Н202 на процесс ренатурации рчГ-КСФ в течение 60 мин и концентрации рчГ-КСФ 0,05 мг/мл .

Таблица 1. Влияния Н20-2 на ренатурацию рчГ-КСФ.

.№ образца I 2 3 4 5

Н202, мкМ 6,0 60 245 490 740

Выход белка, % ~1 15 32.8 73.2 98,5

Как следует из приведенных в таблице 1 данных, реакция (4) проходит не стехиометрически и, скорее всего, при окислении цистеинов Н2О2 является сложной реакцией. Для полного сворачивания рчГ-КСФ в описанных выше условиях необходимо 740 мкМ Н2О2. Далее мы провели ряд экспериментов с целью минимизации объема. В ходе опытов меняли степень разведения солюбилизата (в 20, 10, 5 и 2 раз), при концентрации Н2О2 (740мкМ), времени ренатурации 60 мин и концентрации белка в солюбшшзате 5 мг/мл. Эксперименты показали, что в процессе ренатурации максимальная концентрация белка может быть 1 мг/мл (в условиях описанных выше). Также было установлено, что при увеличении концентрации белка в растворе в 20 раз концентрацию Н2О2 необходимо увеличить в 1,4 раза.

Солюбияизаиия в жестких условиях (Схема 2).

Ранее лабораторией биокатализа ИБХ РАН был предложен высокоэффективный процесс получения рГРЧ, который согласно опубликованным данным, хорошо масштабировался. Мы оптимизировали стадии солюбилизации и ренатурации предложенного процесса.

Солюбшшзацию Ме^рГРЧ из ТВ проводили по стандартной процедуре с применением высокой концентрации хаотропных агентов (7 М гуанидин-НС1 гаи 8 М мочевины) в присутствии ДТТ при 37°С. Максимальная растворимость белка в 8 М мочевине составляла 4-5 мг/мл. Использование 7 М гуацидин-НС1 позволило обеспечить наиболее полное растворение ТВ, восстановление дисульфидных связей в молекуле и увеличить концентрацию солюбилизированного Ме1-рГРЧ до 9-10 мг/мл.

Для образования нативных дисульфидных связей была применена система буферных растворов, содержащих окислительно-восстановительную пару цистеамин/цистамин в соотношении 1:0,1. Оптимизацию условий проводили по нескольким параметрам: степень и скорость разбавления солюбилизата, состав буферного раствора для ренатурации. Процес вели методом разбавления белка в буферном растворе с низкой ионной силой. Процедур ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала солюбилизированный белок переводили в буферный раствор, содержащий 8 М мочевину и 10 мМ цистеамин, с помощью гель-фильтрации для удаления ДТТ и гуанидин-НС1. Условия хроматографии были подобран таким образом, чтобы конечная концентрация белка составляла 4-5 мг/мл. Затем полученны раствор белка разбавляли при комнатной температуре буферным раствором для ренатурации течение 4 часов, варьируя степень разведения белка и концентрацию мочевины в конечне точке. Как следует из приведенных в таблице 2 данных, оптимальная концентрация белка растворе для ренатурации в данных условиях составила 0,1 мг/мл, содержат мочевины 0,3 М, время ренатурации 8-10 часов.

Таблица 2. Оптимизация условий проведения ренатурации МеЛ-РГРЧ в присутствии окислительно-восстановительной пары цистеамин:цистамт (1:0,1).

Параметр Разведение мочевина Выход

Размерность разы М %

1 5 1 36,5

2 5 0,5 34,9

3 5 0,3 35

4 5 0,2 35,2

5 5 ОД 32

6 10 1 43,6

7 10 0,5 44,9

8 10 0,3 42

9 10 0,2 44,5

10 10 ОД 42,4

11 50 1 54,6

12 50 0,5 59,3

13 ; - 50 0,3 61

14 50 0,2 58

15 50 ОД 52,7

16 1 00 1 29,6

17 1 00 0,5 32,8

18 1 00 0,3 35

19 1 00 0,2 35

20 1 00 ОД 33,1

Далее оценили производительность каждой схемы. Для этого схему 1 применили для Ма-рГРЧ. Оценивали следующие характеристики: выход целевого белка после ренатурации, время, затраченное на процесс и масштабируемость процесса.

Таблица 3. Сравнение эффективности схемы 1 и схемы 2 (Б-солюбшизация, Я-ренатурация).

Коэффициент масштабирование Количество белка, взятого на стадию ^ г Схема 1 Схема 2

рчГ-КСФ | МеЬрГРЧ Ме^рГРЧ

выход выход

г 1 % 1 г 1 % г 1 %

И К

1х 1 0,9 90 0,85 85 1,2 0,62 62 1 10

5х 5 4,5 90 4,3 86 1,5 2,6 52 20

20х 20 17,9 89,5 16,8 84 9,5 47,5

200х 200 174 87 160 80 3 *

* процесс провести не удалось, вследствие большого объема раствора белка (800 л)

Как следует из приведенных в таблице 3 данных, схема 1 является более эффективной, чем схема 2. В результате проведенных экспериментов было установлено: схема 1 применима в случае МеорГРЧ, но для полного сворачивания в течение 60 мин необходимо 650 мкМ Нг02. Таким образом, проведенный многофакторный анализ солюбилизации и ренатурации

Met-рГРЧ и рчГ-КСФ позволил подобрать оптимальные общие условия для двух белков и добиться высокого выхода (-80-87%) каждого белка с правильно замкнутыми S-S связями. Исследование процесса ренатурации белков в присутствии Н2О2 в данной работе проводилось впервые. Оно показало, что Н2Ог в микромолярной концентрации эффективно окисляет SH-группы цистеинов в течение 60 мин при высокой концентрации белка и без образования побочных продуктов.

Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

Ионообменная хроматография

Первой стадией очистки была выбрана ионообменная хроматография среднего давления (ИОХ). Преимуществами использования ИОХ в технологическом процессе на первой стадии очистки являются: высокая рабочая скорость, сорбционная и разделяющая способность сорбентов. Подбор условий разделения проводили на тестовых колонках Tricorn 5/50 (GE Healthcare, Швеция) объемом 1 мл и заполненных следующими сорбентами: Mono Q, Mono S, Q-Sepharose FF, SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Швеция). Нагрузка на сорбент по общему белку при подборе условий разделения составляла 20 %. Исследовали влияние на процесс следующих факторов: рН буферных растворов, динамической емкости сорбента, рабочей скорости па процесс сорбции и десорбции. 1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ. Для очистки Met-рГРЧ методом ИОХ исследовали значения рН 7.0 и 8.0.

Рис. 3. Оптимизация условий разделения рГРЧ методом ИОХ на сорбенте Q-Sepharose FF (а), MonoQ (б, в).

Пик 1 соответствует рГРЧ Скорость потока: 1 т/мин (300 см/ч); подвижная фаза: А) 20мМ Tpuc-HCl, Б) 20 мМ Трис-ИС1, 1М NaCl рН 7.0 (в) и рН 8.0 (а, б); колонка: Tricorn 5 х 50 мм (GE Healthcare, Швеция); градиент: 0-25 % Б за 25 мин.

0 10 20, мин

Как следует из приведенных на рис. 3 данных, очистка рГРЧ от примесей происходи наиболее эффективно на сорбенте Mono Q при значении рН 8.0. Следует отметить, что Q-Sepharose FF также обеспечивает эффективность разделения (Rs>l), достаточную да очистки рГРЧ от примесей.

Для очистки рчГ-КСФ методом ИОХ исследовали рН в интервале значений от 4.0-6.' Из литературных данных известно, что при значении рН 4.0 Г-КСФ проявляет максимально

конформационную стабильность. Поэтому рН раствора белка после ренатурации доводили до значения 4.0 с помощью уксусной кислоты, что приводило к помутнению раствора.

Как следует из данных, приведенных на рис. 4, примеси (пик 1, 3 и 4), содержащиеся в растворе при рН 8.0 (рис. 4а, б) отсутствуют в нем, после доведения рН до значения 4.0. (рис. 4в). Эти данные позволяют сделать вывод, что стадия закисления является необходимой

Рис. 4. ОФ ВЭЖХ солюбилизированного (а), ренатурированнаго рН 8.0 (б) и рН 4.0 (в) рчГ-КСФ.

Пик 2 - ренатурированный рчГ-КСФ Пик 3 - солюбилизированныйрчГ-КСФ. Пик 1,4 - примеси.

Колонка: ШС С4, 5мкм, 300 А, 4,6x250 мм; Скорость потока: 1 мл/мин; Температура: 35 °С; элюент: А) 0.1% ТФУвводе, Б) 80% 1-Пропанол, 20% МеСН, 0.1% ТФУ; градиент: 30-45 %Бза 15 мин.

16, мин

для очистки препарата от нестабильных форм. Далее супернатант шеюсили на ЗР-ЗерЬапме НИ. Во время проведения процесса хроматографии весь белок сорбировался на колонке, однако потери на стадии десорбции (градиентное элюирование) составляли 45-50 % от исходного количества.

Важным фактором, оказывающим определяющее влияние на процесс ионообменной хроматографии, является состав буферных растворов. В таблице 4 представлены результаты изучегам влияния СНзСОО и С6Н5О73" анионов на селективность процессов сорбции, десорбции рчГ-КСФ и выпадение примесей из раствора после ренатурации при различных значениях рН раствора.

Таблица 4. Влияние типа аниона на селективность процесса ИОХ

Иошшй состав буферного раствора 50MMNaCH3COO 5мМ Na3 CJI5O7

РН 4,0 | 5,0 5,0 | 6,0

Содержание примесей, % < 1

Электропроводность стартового буферного раствора, мБ/см 3,5±0,2 0,8±0,2

Потери белка на стадии сорбции и промывки сорбента, % - - - 5

Выход по белку, % от исходного 45-50 50-55 60-65 70-75

Как следует из представленных в таблице 4 данных, несмотря на снижение ионного состава стартового буферного раствора и, как следствие, электропроводности, замена ацетат-иона на цитрат-иол приводит к снижению потерь белка на стадии десорбция, а значение рН раствора ниже изометрической точки белка (р! 6.2) приводит к выпадению в осадок

нестабильных форм рчГ-КСФ. Таким образом, оптимальное значение pH для очистки рчГ-КСФ на SP-Sepharose FF приняли значение 6.0, поддерживаемое 5мМ NaäCsHsCb.

2. Определение динамической емкости сорбента. Для этого осуществляли сорбцию целевого белка (Met-рГРЧ или рчГ-КСФ) при подобранных условиях на 1 мл геля до наблюдения десорбции. Резкое возрастание оптической плотности (А) при длине волны 280 им означало, что в данных условиях достигнуто насыщение ионогенных групп сорбента выделяемым белком. Количество сорбировавшегося белка рассчитывали по формуле (1).

Таким образом, проведенные исследования показали, что динамическая емкость Q-Sepharose FF по Met-рГРЧ составляла 75 мг/мл геля, а емкость SP-Sepharose FF по рчГ-КСФ составляла 63 мг/мл. Исходя го этого, оптимальной была принята нагрузка белка на сорбент 75±5% (рекомендовано производителем) от динамической емкости сорбента (60 мг/мл и 50 мг/мл геля соответственно).

3. Определение рабочей скорости проведения ИОХ. Исследовали интервал значений рабочей скорости от 50 до 500 см/ч. На первом этапе изучали влияние рабочей скорости на процесс сорбции белка на колонку. Для этого на тестовые колонки Tricorn 5/50, заполненные соответствующими сорбентами, накосили Met-рГРЧ или рчГ-КСФ (75% от динамической емкости). Затем белок элюировали соответствующим буферным раствором, содержащим 0,5 М NaCl, и определяли количество десорбированного белка при заданной скорости элюирования. По полученным результатам строили график зависимости количества белка, десорбированного с колонки, от скорости элюирования (рис 5 а, б).

60

s 50 S

|40 g

а 30

¡Я

20

100 200 300 400 500 Линейная скорость, см/ч

Рис. 5. Влияние линейной скорости элюирования на процесс ИОХ. 60 мг Мн-рГРЧ(О-ЯерНагозе ЬУ) Подвижная фаза: А) 20мМ Трис-НС1;

Б) 20 мМ Трис-НС1, 0.5МШС1. а - Изократическое элюирование. в - градиент : 0-25 % Б за 25 мин. 50 мг рчГ-КСФ (5Р-$еЫшго$е ГЛ Подвижная фаза: А) 5мМ ^'ауС^ЬОу;

Б)5мМЫазСбН50?, 0.5МИаС1. б - Изократическое элюирование. г - градиент: 0-25 % Б за 30 мин.

Как следует из данных, представленных на рис.5 а, б, скорость нанесения рГРЧ рчГ-КСФ лежит в широком диапазоне значений 50-200 см/ч. На втором этапе при скорос нанесения раствора белка на колонку равное 100 см/ч изучали влияние линейной скорости I процесс десорбции белка во время градиентного элюирования. В результате проведенш исследований был построен график зависимости рабочей скорости от количества бел полученного после хроматографического разделения (рис. 5 в, г).

Как следует из данных, представленных на рис. 56 и 5в, уменьшение рабочей скорости до 50 см/ч и увеличение свыше 300 см/ч для рГРЧ, и свыше 250 см/ч для рчГ-КСФ приводит к снижению выхода выделяемых белков. Результаты проведенных экспериментов показали, что параметр линейной скорости имеет существенное технологическое значение и влияет как на процесс сорбции белка на колонку, так и на процесс десорбции. Рабочим значением линейной скорости приняли значение равное 150 см/ч, что с точки зрения проведения технологического процесса является оптимальным. Выбранное значение скорости обеспечивает наибольший выход продукта и позволяет провести масштабирование процесса на всех стандартных колоннах BPG без потери эффективности разделения. При этом время, затраченное на процесс, не превышает 11 ч при использовании колонны с самым большим диаметром.

Оценка чистоты Met-рГРЧи рчГ-КСФ после ИОХ.

Примеси, содержащиеся в фармацевтических субстанциях, могут снижать активность препарата, вызывать аллергические реакции в организме человека или обладать токсическим эффектом, и их содержание строго регламентировано фармакопеями. В основном это продукты деградации целевых белков (родственные белки). Совместное использование ОФ ВЭЖХ и MC позволяет быстро выявлять и идентифицировать полипептидные примеси, которые потенциально могут присутствовать в образце и разработать дополнительные (пли доработать имеющиеся) стадии очистки. Однако отсутствие родственных примесей является не единственным показателем чистоты генно-инженерных препаратов. Необходимым условием чистоты фармацевтической субстанции является отсутствие эндотоксинов и белков, продуцируемых клетками Е. coli. Ограниченное количество методов анализа позволяет провести только количественную оценку, но не позволяет установить природу данных примесей. При определенных условиях может произойти неспецифическое связывание эндотоксинов и белков Е. coli с целевым белком, вследствие чего процесс очистки сильно затруднен. Поэтому полученные после стадии ИОХ Met-рГРЧ и рчГ-КСФ тестировали не только на содержание родственных примесей, но и на содержание иммунореактивных белков и эндотоксинов (таблица 5).

Таблица 5. Проверка чистоты препаратов после ИОХ методами ЕР.

Определяемый параметр Нормативы Met-рГРЧ рчГ-КСФ

Родственные белки <6% < 10% <2%

Белки штамма ВЬ21 < 3 нг/мг 60±10 нг/мг 40±10 нг/мг

Эндотоксины (СаБО^ < 5 нг/мг - > 20 ЕЭ/мг1

Эндотоксины (Н2О2) < 1 ЕЭ/мг < 1 ЕЭ/мг1

' Значение, полученное после использования Сий04 в процессе ренатурации. 2 Значение, полученное после использования ([20г в процессе ренатурации.

На данном этапе исследований было продемонстрировано, что применение СиЭО« в качестве катализатора окисления ЭН-групп цистеинов, затрудняет процесс очистки белков от эндотоксинов. Как следует из представленных в таблице 5 данных, полученные препараты требовали дополнительной стадии очистки.

Подбор условий отщепления И-кониевого метионина от Ме1-рГР Ч.

Для решения поставленной задачи была выбрана лейциновая аминонептидаза Аеготопая рго!ео1у11са. Процесс протеолитического гидролиза К-конневого метионина контролировали методом изократической ОФ ВЭЖХ. Был проведен ряд экспериментов, целью которых являлось: 1) оптимизировать температуру ферментативного гидролиза, влияющую на степень протекания процесса и выход побочных продуктов, и 2) минимизировать нагрузку дорогостоящего фермента. В ходе опытов варьировали температуру реакции и концентрацию аминопептидазы, сохраняя при этом неизменными время реакции (16-18 ч), объем реакционной смеси (1-1,2 л) и концентрацию белка (4-6 мг/мл).

Таблица б. Оптимизация условия процесса ферментативного гидролиза Ме1-рГРЧ.

Нагрузка фермента, ед. /Г&лк, Температура °С Степепь гидролиза, % Содержание примесей, % (рис.ба, пик 2)

2,5 60 -

5 68 -

7,5 4 84 -

15 94,2 -

19 95 -

2,5 90 -

5 93 -

■:■7,5: 20-22 <98,5

15 <99 8

19 100 9,5

2,5 92,2 1

5 95 2,5

7,5 37 <99 7,3

15 100 15

19 100 23

Как следует из данных, представленных в таблице 6, более высокая степень гидролиза Ме!-рГРЧ достигались при температурах 20-22 и 37°С. Однако увеличение количества фермента и повышение температуры приводило к росту примесей (пик 2), которые затрудняли дальнейшую очистку белка (рис. 6). Тот факт, что проведение гидролиза при температуре 20-22°С обеспечивает высокую степень отщепления К-концевого метионина наряду с низким выходом нежелательных примесей, позволил выбрать указанную температуру в качестве оптимальной при заданных условиях. Из полученных результатов также следует, что при

20-22°С минимальное количество внесенного в реакционную смесь фермента должно поддерживаться на уровне 7.5 ед/г белка. Действительно, в этих условиях отщепление ^концевого метионина происходило практически полностью без образования побочных продуктов, тогда как дальнейшее уменьшение концентрации аминопептидазы сопровождалось снижением степени гидролиза МеЬрГРЧ. Рисунок 6 наглядно подтверждает правильность выбранных условий проведения ферментативного гидролиза. Так, практически полное отсутствие пика 3, соответствующего Ма-рГРЧ, на хроматограмме (рис.бв) образца рГРЧ после гидролиза свидетельствует о полноте протекания процесса.

I

А,м I Рис. 6. ОФ ВЭЖХ МеЬрГРЧ (6) и рГРЧ после

ферментативного гидролиза Мег-рГРЧ аминопептидазой Аеготопая ршео1уйса, содержащий (в) и не содержащий примеси (а). Пик 1 -рГРЧ. Пик 2 - примеси. Пик 3 - Ме1-рГРЧ.

Скорость потока: 1 мл/мин; температура: 45 °С; подвижная фаза: 0.5 МКН2Р04, рН6.5, 24%

f ) \ 1-пропанол; колонка: Symmetry С18, 5мкм, 300 А, tfs- ■ ■ ■ "'■ --в 4,6x250мм

О 10 20 30 40, мин

Гидрофобная хроматография.

На второй стадии очистки белков было целесообразно использовать другой механизм фракционирования. Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильными аминокислотами, но в то же время содержит до половины от их общего содержания гидрофобных остатков, нередко образующих скопления. Такие гидрофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характерную особенность структуры каждого белка. Основываясь на этом факте, в качестве метода для дальнейшей очистки было принято решение применить метод ГХ. Преимуществами использования ГХ в технологическом процессе также являются: высокая рабочая скорость, сорбционная и разделяющая способность сорбентов, а применение ГХ в качестве второй стадии очистки делает схему более технологичной, так как сорбция белка на колонку происходит в высокой концентрации соли непосредственно после предыдущей стадии.

Подбор условий разделения также проводили на тестовых колонках Tricom 5/50 (GE Healthcare, Швеция) объемом 1 мл, заполненных следующими сорбентами: Butyl Sepharose 4 FF и Phehyl Sepharose 6 FF (high sub) (GE Healthcare, Швеция). Исследовали влияние на процесс ГХ следующих факторов: лиганда, концентрации соли в подвижной фазе, pH системы подвижной фазы, динамической емкости сорбента и рабочей скорости.

Объект лиганд pH С соли, М Допустимая нагрузка белка, мг/мл и, см/ч Выход, % к

Butyl 7,0 2,0 80±2

рГРЧ 8,0 2,2 45±2 5 Ь

Phenyl 7,0 1,8 100 62±5 9,5

8,0 2 70±5

рчГ-КСФ Butyl 6,0 1,6 35±2 65±2 1й:4,3 ;:■?

Phenyl 25£2 32±2 6,0

Как следует из данных, представленных в таблице 7, при выбранной рабочей скорости равной 100 см/ч (использовали те же принципы, что и для ИОХ) и заданных условиях, оба геля обладают хорошим сродством к выделяемым белкам (подтверждается высокими значениями динамической емкости). Эффективность процесса фракционирования оценивали по характеристикам, отражающим процесс, а именно, выходу препарата (по общему белку, в %) после проведения элюирования обратным линейным градиентом концентрации NaCl, и по коэффициенту емкости (к), рассчитанному по формуле (2). Оптимальное значение к должно было лежать в пределах 3-5, что соответствовало максимуму выхода белка на середине градиента. Сопоставление полученных результатов позволило выбрать Butyl Scpharosc в качестве сорбента для очистки рГРЧ и рчГ-КСФ на второй стадии. Все образцы рГРЧ и рчГ-КСФ, полученные после ГХ на Butyl Sepharose не содержали родственных белков и белков штамма BL21, что свидетельствовало о правильности выбора сорбента. Далее качество, полученных препаратов рГРЧ и рчГ-КСФ оценивали сравнением пептидных карт образца и стандарта. Расщепление белков трипсином позволяет подучить такое количество фрагментов, в структуре которых даже незначительное изменение аминокислотного состава приводит к значительному изменению хроматографической подвижности модифицированных фрагментов относительно исходных, что позволяет обнаружить в структуре белка аминокислотную модификацию или замену. Первичная структура рГРЧ с указанием сайтов расщепления трипсином приведена на рис. 7. Триптические карты стандарта и образцов рГРЧ, полученных после гидрофобной хроматографии, показаны на рис. 7а, б и в. Сравнение триптических карт между собой позволило увидеть в образцах дополнительные пептиды (рис. 7а и б), соответствующие пикам T-Xl, Т-Х2 и Т-ХЗ), и значительное снижение интенсивности фрагментов Т2 и Т4 (рис 7а).

Дальнейшее исследование всех перечисленных пептидов методами MALD1 масс-спектрометрии для определения массы и тандемной масс-спектрометрии для определения

Лч/

Lß

Т-Х1 /

FPT!PLS^t,F,0DNAMU!^HKjL20HQLAFDTYQE./EEAYIPKjEQwK.YSFLQNPQT5i SU^SESffl^PS^EETQQKjjjSNLELmSLj^LUQSWLEPV^FLEjsVFANS^LV YGASDSNV,I0YDLL43LEEG,M[QTLMGíjLED,3OaSPRrGQIF440QTYSK)FDTHS,5 ir^DALLKjw,wGLLWR^M,,0DKVETFLR|lV180Q|R^VEGS|G,,0F

__1—

10

15

20

25 30 35 Время, мин

40

45

50

55

60

Рис. 7. ОФ ВЭЖХ гидролюатое рГРЧ.образец после ГХ очищенный при pH 8,0 (а), образец после ГХ очищенный при pH 7,0 (б), стандарт (в). Подвижная фаза: А- 0,1 % ТФУ; В -90% ацетонитрш с 0.1% ТФУ; градиент: 0-20 % В за 20 мин, 20-25 % В за 20 мин, 25-50 % В за 25 мин; колонка - Phenomenex, Luna CI 8 (2), 100 А, 5 мкм, 4,6x250 мм; скорость потока: 1 мл/мин, температура: 30 "С.

последовательности выявило, что пептиды Т21-Т22 и Т-Х1 соответствовали С-концевому фрагменту (Ile179-Arg183+Ser!84-Phe191), при этом наличие Т-Х1 обусловлено модификацией дисульфидной связи в тиоэфирную связь. Исследование

триптических карт всех промежуточных продуктов позволило установить, что появление пептида Т-Х1 связано с пребыванием белка в щелочной среде во время проведения солюбилизации. Исчезновение дополнительного фрагмента было достигнуто только при снижении рН до значения 11,0. Фрагменты Т-Х2 и Т-ХЗ соответствовали пептидам Т2 (Leu10-Arg19) и Т4 (Leu20-Lys38). Однако Т-Х2 и Т-ХЗ не содержали N-концевую аминокислоту-лейцин. Дополнительная фрагментация пептидов Т-Х2 и Т-ХЗ происходила во время трипсинолиза и была связана с тем, что образец рГРЧ, очищенный на Butyl Sepharose 4 FF при рН 8.0, содержал лейциновую аминопептвдазу Aeromonas proteolytica, что было подтверждено добавлением субстрата лейцил-/т-нитроанилида к данному образцу.

Сравнение пептидных карт рчГ-КСФ со стандартом показало их полную идентичность (рис. 8). Л210

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Рис. 8 ОФ ВЭЖХ анализ триптических гидролизатов рчГ-КСФ: образец, полученный после ГХ (а), стандарт (б). Подвижная фаза: А- 0.1 % ТФУ; В - 90% ацетонитрил с 0.1 % ТФУ; градиент: 0-0 % В за 10 мин, 0-25 % В за 25 мин, 25-50 % В за 40 мин; колонка - Phenomenex, Luna С18 (2), 100 Á, 5 мкм, 4.6х 250мм; скорость патока: I мл/мин.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить значения факторов, влияющих на процесс хроматографичсского фракционирования рГРЧ и рчГ-КСФ на Butyl Sepharose 4 FF: рГРЧ - рН системы подвижной фазы 7.0, концентрация NaCl 2,2 М и линейная скорость элюирования 100 см/час; рчГ-КСФ- рН системы подвижной фазы 6.0, концентрация NaCl 1,6 М и линейная скорость элюирования 100 см/ч.

Далее очищенные препараты переводили в фармакологические буферные растворь используя гель-фильтрацию на Sephadex G-25, для подтверждения их специфическо активности. Образцы были переданы в ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН. Проверк специфической активности проводили in vitro в сравнении с Международными стандартам (NIBSC, Великобритания). Выявляли стимуляцию роста клеток после добавления рГРЧ лимфоидной линии КЬ2 и рчГ-КСФ к миелоидной линии NFS-60. Эксперименты показали, чт специфическая активность субстанций сопоставима с активностью Международных стандарте и находилась в пределах, воспроизводимости биологического эксперимента.

Масштабирование процесса.

Масштабирование проводили по следующей схеме: рассчитывали необходимый объе сорбента, затем подбирали колонну нужного диаметра, хроматографическую очистку белке проводили, не изменяя подобранных условий. Для того чтобы выбратьвыбора колонны оценивали следующие характеристики: высоту, эквивалентную высоте теоретической тарелр (ВЭТТ) и фактор ассиметрии пика (Acs). Значение ВЭТТ и Acs вычисляли по пику, полученному при загрузке в колонну 5%-ного раствора ацетона объемом 1,5 % от объе(. сорбента.

время, мин

Ст. Объем колонны, л D х Н, мм V, мл/мин и, см/ч Значения ВЭТТ, мкм Значения Ас.,

Опыт Реком Опыт Рском

иох 5 140 х 300 385 150 250 <500 0,95 0,8-1,5

200 x 200 785 480 1,23

гх 5 140 х 300 257 100 258 1,38 0,8-1,8

200 x 200 523 350 1,50

Как следует из результатов расчета значений ВЭТТ и Acs (табл. 8), полученные значения ВЭТТ сравнимы с рекомендуемыми значениями для ионообменников и гидрофобных сорбентов. Значения факторов асимметрии для всех колонн не превышают значений Acs, приведенных в инструкциях к колоннам данного типа, что свидетельствовало о правильной упаковке колонны.

В результате проведенных экспериментов были выбраны колонны с более низким ВЭТТ, диаметром 140 мм и высотой столба геля 300 мм. i Рисунки 9, 10 и 11 (в качестве примера) наглядно демонстрируют проведение и

контроль некоторых стадий производственного процесса получения рГРЧ и рчГ-КСФ на подобранных колоннах.

Рис. 9 Первая стадия хроматографической очистки рГРЧ на колонне ВРй 140 х 300мм, заполненной <2-Сефарозой № Скорость потока: 385 мл/мин (150 см/ч); Подвижная фаза: А) 20 мМ Трис-НС1 рН 8.0, Б) 20 мМ Трис-НС1, 0.5М МаС1 рН 8.0; градиент: 0-40 % Б за 110 мин. Фр.1 (заштрихованный участок) - основная фракция. Фр. 2,3,4,5 - «родственные белки». Пунктир - линейный градиент концентрации соли.

110.0 130.0, мии

Прибор-. Muttipte Ц

Ampholyte PAG — рН 4,0-6,5; Мощность: 30 Вт; Время фокусирования: 2,5ч: Максимальный ток: 50мА; Линия I: фр J 'оошчн'ш; Линии 2-5: фракции 2-5 Линия 6: стандарт рТ

Нзоэлектрическое фокусирование фракций 1-фр] 2 3 4 5

Ш ' "

"•4.5 #%5.2

mS/cm

А

ОФ ВЭЖХ фракций 1-5. Колонка: YMC С4 300А

4.6 х 150 мм Элюэнт: А)-0,1% ТФУ Ю-1 -рго:МеШ:ТфУ(80:2.№0, i) Скорость,логака: З'мл/мн Температура: 30\

1200 1000 800 600 400 200 О

___

\ ч С\ А

\

1 \

} у \

о

so

120

160 мин

_ДА_А__л___*iM- —»to

.к кii

0 15 25

35

45

55, мин

Рис. 10 А: Вторая стадия хроматографической очистки рГРЧна колонне BPG 140 х 300 мм, заполненной Butyl Sepharose 4 FF. Скорость потока: 260 мл/мин (100 см/ч); подвижная фаза: А) 20 мМ Tpuc-HCl, 2М NaCl рН 7.0, Б) 2ОмМ Трис-HCl рН 7.0; градиент: 100-0 % Б за 200 мин. Заштрихованный участок ~ основная фракция. Пунктир - линейный градиент концентрации соли. Б: ОФ ВЭЖХ анализ (подтверждение подлинности) триптических гидролизатов препаратов соматотропина: рГРЧ после ГХ (а), Генотротн (б), Хуматроп (в), стандарт соматотропина (г). Условия анализа Рис. 7.

mAU

mS/cm

120 J 05 90 75 60 45 30 15 0

200, мни

12 3 4 Б

5

4.5

5.2

5.8 р!

Рис. НА: Вторая стадия хроматографической очистки рчГ-КСФ на колою BPG140 х 300 мы, заполненной Butyl Sepharose 4 FF. Скорость потока: 260 мл/мин (100 см/ч: Подвижная фаза: А) 5 мМ NajCtflsO?, 1,6МNaClpH 6.0, Б) 5мМNajCiflsO?рН 6.0; Градиенп 100-0 % Б за 200 мин. Заштрихованный участок - основная фракция. Пунктир - линейны градиент концентрации соли, mS/см. Б: Изоэлектрическое фокусирование рчГК-СФ. Условг: анализа Рис. 1ХБ: Линия 1: образец сравнения рчГ-КСФ - «Нейпоген»; Линия 2: рчГ-КС ' после стадии солюбилизации; Линия 3: Met-рчГ-КСФ после стадии ИОХ; Линия 4: рчГ-КС после стадии IX; Линия 5: стандарты pi.

Как следует из данных, представленных на рис. 9, 10, 11, лабораторные методиг выделения рГРЧ и рчГ-КСФ из ТВ легко масштабируются и позволяют в условиях опыты промышленного производства с использованием хроматографов AKTAPilot получать до 150 АФС рГРЧ и рчГ-КСФ.

Пригодность данных технологий была подтверждена выпуском 50 серий АФС рГРЧ и 20 серий рчГ-КСФ. Основные валидавдгонные характеристики технологических процессов получения субстанции рГРЧ и рчГ-КСФ на каждой стадии выделения изложены в диссертационной работе. Таким образом, разработана единая схема выделения и очистки рГРЧ и Г-КСФ из телец включения (рис. 12). Результаты исследований вошли в состав опытно-промышленных регламентов на производство готовых препаратов «Растан» и «Нейпомакс».

Рис. 12. Технологическая схема очистки препаратов рГРЧ и рчГ-КСФ.

В заключительной части работы был проведен сравнительный анализ качества выпускаемых АФС методами Европейской фармакопеи 6.0 с препаратами иностранных производителей.

Таблица 9. Результаты сравнительного анализа качества препаратов.

Название препарата Дезамид. | формы, % Сульфок-сиды, % Другие примеси, % Димеры и полимеры, % Чистота по ИЭФ, % 1 Чистота по КЭФ, % Эндотоксины ,Еэ/мг Белки Е.соИ, нг/мг ДНК, пг/мг

Растан 1,6 0,5 0,5 0,4 98 98,7

Генотропин 0,9 0,35 0,16 0,3 99 99

Хуматроп 1,85 0,95 0,2 0,9 97,5 98,0 <1 <2 <5

Нейпомакс 1,8 0,5- 1.2 <0,5 99 <99

Нейпоген 1,3 0,8 0,8

Как следует из представленных в таблице 9 данных, качество получаемых в соответствии со схемой (рис. 12) серий препаратов рГРЧ и рчГ-КСФ соответствует требованием действующей Европейской фармакопеи 6.0 и не уступает импортным аналогам.

Выводы.

1. Подобраны оптимальные условия солюбилизации, ренатурации и хроматографической очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения.

2. Оптимизированы условия отщепления метионина от N-концевой части Mct-рГР1 лейциковой амнонептидазой Aeromonas proteolytica. Показано, что отщепление метионин происходит полностью, без образования побочных продуктов.

3. Проведены масштабирование и валидация каждого технологического процесса сформулированы основные универсальные подходы к масштабированию хроматографически методов очистки рекомбинантных белков.

4. Разработана общая технологическая схема выделения двух препаратов рГРЧ и Г-КС4 которая стандартизует процедуру документирования технологического процесса соответствии с требованиями GMP.

5. Показано, что выделяемые белки соответствуют фармакопейным требованиям и н уступают в качестве импортным аналогам.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации:

1. Н.В. Кононова, А.й. Бобрускин, Т.Н. Костромина, Т.Д. Мелихова, A.A. Вайнсои, Ei Свешникова, A.A. Зинченко, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили: Разработка и оптимизаци технологического процесса получения субстанции филграстима II Биотехнология.—2009-№ 5.—С.24- 32.

2. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, С.А. Косарев, Г.О. Кожевников, A.B. Демш Д.И. Баирамашвили, А.И. Мирошников // Опытно-промышленная технология полученг активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона рос человека.—Биотехнология.—2008.—№ 5.—С.ЗЗ - 42.

3. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Т.Г. Галкина, Д.И. Баирамащвил: Сравнительный ап&тиз качества российского препарата РАСТАН с зарубежными аналогак ГЕНОТРОПИН и ХУМАТРОП // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российекс симпозиуме Биофарма 2009 —2009.—Турция.—С.19.

4. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Д.И. Баирамашвили: Тсхиолоп производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора промышленных масштабах // Тезисы научных докладов на Международной школ конференции посвященной 40-летаю создания ГосНИИгенетики.—2008.—Москва.—С.49.

5. А.И. Бобрускин, Н.В. Кононова, Д.И. Баирамашвили: Промышленная технолог! производства рекомбинантного гормона роста II Тезисы научных докладов на IV Московскс международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспсктш развития.—2007.—Москва.—С.85.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.10.2010 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 450. Тел. 939-3890. Телефакс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кононова, Наталья Вячеславовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Характеристика выделяемых объектов.

1.1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

1.1.1. Функции.

1.1.2. Структура.

1.1.3. Секреция и механизм действия.

1.1.4. Применение препарата рчГ-КСФ в медицинской практике.

1.2. Соматотропин.

1.2.1 Функции.

1.2.2. Структура.

1.2.3. Секреция и механизм действия.

1.2.4. Свойства рекомбинантного ГРЧ.

1.2.5. Применение препарата ГРЧ в медицинской практике.

2. Солюбилизация и ренатурация эукариотических белков, экспрессируемых в Е. coli в виде телец включения.

2.1. Введение.

2.2. Характеристика телец включения.

2.3. Фолдинг белков в живой клетке.

2.4. Промежуточные состояния и их роль в образовании агрегированных форм белка.

2.5. Ренатурация белков in vitro.

2.6. Методы солюбилизации и ренатурации белков, формирующих тельца включения.

2.6.1. Традиционные методы.

2.6.2. Методы, позволяющие улучшить проведение процесса ренатурации белка, полученного из телец включения.

2.6.3. Новейшие методы солюбилизации белков, позволяющие добиться высокого выхода белка после ренатурации.

3. Требования зарубежных фармакопей к фармацевтическим генноинженерным препаратам.

3.1. Введение.

3.2. Определяемые примеси и методы контроля.

3.3. Эндотоксины.

3.3.1. Методы определения эндотоксинов.

3.3.2. Взаимодействие эндотоксинов с белками.

3.3.3. Методы удаления эндотоксинов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Оборудование, реактивы, сорбенты.

2. Методы.

2.1. Аналитические методы.

2.2. Препаративные методы.

3. Математические расчеты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Оптимизация процесса ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

1.1. Введение.

1.2. Солюбилизация в мягких условиях (Схема 1).

1.3. Солюбилизация в жестких условиях (Схема 2).

1.4. Масштабирование процесса ренатурации.

2. Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

2.1. Ионообменная хроматография.

2.1.1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ.

2.1.2. Определение динамической емкости сорбента.

2.1.3. Определение рабочей скорости проведения ИОХ.

2.2. Оценка чистоты Met- рГРЧ и рчГКСФ после ИОХ.

2.3. Подбор условий отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.

2.4. Гидрофобная хроматография.

2.5. Масштабирование процессов очистки.

3. Анализ качества выпускаемых препаратов.

3.1. Анализ рГРЧ.

3.2. Анализ рчГКСФ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора"

Актуальность исследования.

Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.

В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов. Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.

Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков - лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончился. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях ОМР, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми.препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

Цель исследования:

Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ в различных условиях.

2. Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическую очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.

3. Подобрать условия ферментативного отщепления Ы-концевого метионина от Ме^рГРЧ.

4. Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.

5. Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.

6. Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.

Научная новизна полученных результатов

1. Впервые, для ренатурации белков, Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.

2. Установлено, что применение Си804 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.

3. Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи

11 СО

Суэ -Суэ в тиоэфирную при рН 12.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ за один производственный цикл.

2. Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производства лекарственного препарата «Растан».

3. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанции рчГ-КСФ за один производственный цикл.

4. Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется для производства лекарственного препарата «Нейпомакс».

Список опубликованных научных работ по теме диссертации:

1. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, Т.И. Костромина, Т.Д. Мелихова, A.A. Вайнсон, Е.В. Свешникова, A.A. Зинченко, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили: Разработка и оптимизация технологического процесса получения субстанции филграстима // Биотехнология.—2009.— № 5.—С.24 - 32.

2. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, С.А. Косарев, Г.О. Кожевников, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили, А.И. Мирошников // Опытно-промышленная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека.—Биотехнология.—2008.—№ 5.—С.ЗЗ - 42.

3. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Т.Г. Галкина, Д.И. Баирамашвили: Сравнительный анализ качества российского препарата РАСТАН с зарубежными аналогами ГЕНОТРОПИН и ХУМАТРОП // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме Биофарма 2009 —2009.—Турция.—С. 19.

4. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Д.И. Баирамашвили: Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетики.—2008.—Москва.—С.49.

5. А.И. Бобрускин, Н.В. Кононова, Д.И. Баирамашвили: Промышленная технология производства рекомбинантного гормона роста // Тезисы научных докладов на IV Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития.—2007.—Москва.—С.85.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Кононова, Наталья Вячеславовна

выводы.

1. Подобраны оптимальные условия солюбилизации, ренатурации и хроматографической очистки Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения.

2. Оптимизированы условия отщепления метионина от 1М-концевой части Ме^рГРЧ лейциновой амнопептидазой Аеготопаэ рго1ео1уиса. Показано, что отщепление метионина происходит полностью, без образования побочных продуктов.

3. Проведены масштабирование и валидация каждого технологического процесса и сформулированы основные универсальные подходы к масштабированию хроматографических методов очистки рекомбинантных белков.

4. Разработана общая технологическая схема выделения двух препаратов рГРЧ и Г-КСФ, которая стандартизует процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями вМР.

5. Показано, что выделяемые белки соответствуют фармакопейным требованиям и не уступают в качестве импортным аналогам.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы: д.х.н., профессору В. И. Швецу; д.х.н. Д. И. Баирамашвили; начальнику цеха экспериментальной ферментации ОБП ИБХ РАН Т. И. Костроминой; с.н.с лаборатории протеомики ИБХ РАН, к.б.н P. X. Зиганшину за помощь в проведении масс-спектрометрического анализа; руководителю лаборатории лучевых методов лечения опухолей, д.б.н. А. А. Вайнсону за помощь в проведении экспериментов по выявлению специфической активности препаратов; всех сотрудников ЗАО «Мастерклон» за помощь в проведении экспериментальных исследований; доценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н Ю. Г. Кирилловой; доценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н О. В. Есиповой; с.н.с. лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, к.х.н. Р. С. Есипову, руководителю отдела сервиса GE Healthcare А.Н. Веретенникову и заведующему центра коллективного пользования ГосНИИгенетики, к.т.н. Е. И. Кандыбе за консультации во время проведения работы и написания диссертации.

Отдельно автор выражает глубокую признательность и особую благодарность заведующему лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, академику РАН, д.х.н А. И. Мирошникову за всестороннее участие и поддержку в работе; профессору, чл.-корр. РАН д.х.н. Е. В. Гришину за помощь в приобретении опыта и знаний в области молекулярной биологии, белковой химии и хроматографии во время работы в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кононова, Наталья Вячеславовна, Москва

1. River, Andrew V. Turnbull and Catherine L.: Regulation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis by Cytokines: Actions and Mechanisms // Physiological reviews — 1999.—V.—P. 61-71.

2. Avalos B.R.: Molecular analysis of the granulocyte colony-stimulating factor receptor//Blood.—1996.—Aug.—'V. 88(3).—P. 761 777.

3. Motojima H., Kobayashi Т., Shimane M. et al.: Quantitative enzyme immunoassay for human granulocyte colonystimulating factor (G-CSF) // J. Immunol. Methods.— 1989.— Vol. 31.— 118(2).—P. 187 192.

4. Козлов В. А.: Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы // Цитокины и воспаление.—2004.— Т. 3.—№ 2. С. 315.

5. Nicola N.A, Metcalf D.: The colony-stimulating factors and myeloid leukemia // Cancer Surv.—1985.—V. 4(4).—P. 789 815.

6. Emerson S.G., Sieff C.A., Wang E.A., Wong G.G., Clark S.C., Nathan D.G.: Purification of fetal hematopoietic progenitors and demonstration of recombinant multipotential colony-stimulating activity // J Clin Invest.— 1985.—V. 76(3).—P. 1286-1290.

7. Ki Jun Jeong and Sang Yup Lee: Secretory Production of Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor in Escherichia coli // Protein Expression and Purification.—2001 .—V. 23.— P. 311 318.

8. Kubota N., Orita Т., Hattori K.: Structural characterization of natural and recombinant human granulocyte colony-stimulating factors // J Biochem.— 1990.—V. 107.—P. 486 492.

9. Lu H.S., Boone T.C., Souza L.M., Lai P.H.: Disulfide and secondary structures of recombinant human granulocyte colony stimulating factor // Arch Biochem Biophys.— 1989.—Jan.—V. 268(1).—P. 81-92.

10. Asano S.: Human granulocyte colony-stimulating factor: its basic aspects and clinical applications // Am J Pediatr Hematol Oncol.— 1991.—V. 13(4).—P. 400-413.

11. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Yamazaki Т.: The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor // EMBO J.— 1986.—Mar;5(3).—P. 575 581.

12. Higuchi M., Oh-eda M., Kuboniwa H., Tomonoh K., Shimonaka Y., Ochi N.: Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin // J. Biol. Chem.—1992.—V. 267.—P. 7703 7709.

13. Gervais, V., Zerial, A., Oschkinat, H.: NMR investigations of the role of the sugar moiety in glycosylated recombinant human granulocyte-colony stimulating factor // Eur. J. Biochem.—1997.—V. 247—P. 386 395.

14. Lovejoy В., Choe S., Cascio D., McRorie D.K, DeGrado W.F., Eisenberg D.: Crystal structure of a synthetic triple-stranded alpha-helical bundle // Science.—1993.—Feb 26.—V. 259(5099).—P. 1288 1293.

15. Lovejoy B, Cascio D, Eisenberg D.; Crystal structure of canine and bovine granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) // J Mol Biol.— 1993.—Dec 5.—V. 234.—No.3 .—P. 640 653.

16. Wells J.A., Vos A.M.: Hematopoietic receptor complexes // Annu Rev Biochem.—1996.—V. 65.—P. 609 613.

17. Румянцев C.A., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г.: Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток // Вопросы гематологии, онкологии и иммунологии в педиатрии.—2003.— Т. 2,—№ 4.—С. 5 9.22,2324,25