Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов

Елагин, Владимир Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов"

МШУ

На правах рукописи

ЕЛАГИН ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ИНТЕГРАЦИИ, НАСЛЕДОВАНИЯ И ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ С МОЛОКОМ КРОЛИКОВ

03.00.23. - Биотехнология Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в лаборатории трансгенных животных Научно-производственного биотехнологического центра по животноводству

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН Михаил Иванович Прокофьев Официальные оппоненты: -доктор биологических наук Наталья

Анатольевна Зиновьева;

-кандидат биологических наук Николай Петрович Зыкунов

Ведущее учреждение Московская государственная академия

ветеринарной медицины н биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита диссертации со:1" заседании диссертации ■ государственном наг. чс

. в "10 " часов, на >¡5 Всероссийском •утководства.

Адрес института' *4'С!?.* :

1'Л. : _„- I:, п. Дубровицы.

С диссертацией мо/ э ог

Автореферат разос; 1 ■'. ■■ ■.

Учёный секретарь

диссертационного совета., /-у. г) кандидат биологически;

Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Достижения молекулярной генетики, позволяющей целенаправленно нарабатывать ДНК, как носителя генетической информации, открывает новые перспективы в животноводстве и в биомедицине. Применение метода генной инженерии связаны с надеждами ученых по улучшению качества животноводческой продукции, повышению резистентности к болезням и созданию так называемых "генных форм" или трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ, главным образом для медицины. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во введении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского назначения.

С молоком трансгенных животных уже получены целый ряд ценных лекарственных веществ: а,-антитрипсин [Archibald et al., 1990], антитромбин - Ш [Meade at al. 1997], ИГФ - 1 [Brem et al., 1994], протеин С [Velander et al„ 1992] и биологически активных веществ технологического назначения - химозин (Эрнст и др.1997, Прокофьев М.И. 1999), лактоферин [Kimpenfort et al. 1991].

В задачу наших исследований входило получение двух рекомбинантных белков с молоком трансгенных кроликов гранулоцитарного колон иести мул нрующего фактора (ГКСФ) и тканевого плазмнногенного активатора (ТПА). ГКСФ регулирует продукцию нейтрофнлов и их выход в кровь из костного мозга. Препарат широко используется в онкологии для борьбы с иейтропенией у больных, получавших цитостатики по поводу злокачественных опухолевых заболеваний, а также при трансплантации костного мозга. Применение этого препарата позволяет резко уменьшить число опасных для жизни инфекционных осложнений, которые развиваются у больных с нейтропенией. ТПА преобразует неактивный плазминоген в активный плазмин. Этот процесс обычно наблюдается при рассасывании сгустков крови или струпа, образовавшегося в связи с различными формами процесса заживления раны. ТПА используется для рассасывания тромбов у больных в остром периоде инфаркта мнохарда после травм с тромбоэмболией легочной артерии, при различных заболеваниях сосудов. Получение этих белков с помощью технологии ре комби нантной ДНК может быть более эффективной формой, а также более дешевой по сравнению с существующими технологиями.

Выбор трансгенного животного определяется, прежде всего, потребностью планируемого продукта на мировом рынке и сроками, требуемыми для производства трансгенных животных, чтобы удовлетворить потребность рынка. _ _____

.Я

I ,.

В наших экспериментах для получения рекомбинантных белков, ГКСФ и ТПА были выбраны кролики, так как потребность в этих препаратах не высокая, около 500-700 граммов для всей страны, а кратчайшие сроки получения л актирующих кроликов для удовлетворения потребность в этом продукте составляют 15 месяцев, тогда как на крупном рогатом скоте 33-54 месяца.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследований было создание трансгенных кроликов -продуцентов лекарственных белков и изучение интеграции, наследования и экспрессии гена.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Получить трансгенных кроликов путем микроинъекции гена тканевого плазмнногенного активатора (ТПА).

2. Изучить эффективность трансплантации микроинъецированных зигот геном ТПА, интеграции и наследования гена в первом поколении кроликов.

3. Изучить наследование гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) в первом поколении кроликов.

4. Изучить экспрессию гена ГКСФ с молоком трансгенных кроликов,

5. Разработать оптимальный режим доения кроликов.

6. Изучить некоторые фенотипические показатели у трансгенных кроликов (рост и развитие, морфологические показатели крови).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые получены трансгенные кролики с геном тканевого плаз миноге иного активатора (ТПА) и транс генные кролики первого поколения с геном гранулоцитарного колон нести мул иру ющего фактора (ГКСФ). Впервые установлен уровень секреции рекомбинантного белка ГКСФ с молоком трансгенных кроликов и выявлены некоторые особенности в динамике его секреции у отдельных транс генных кроликов.

Практическая значимость работы состоит в создании двух групп трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком два ценных лекарственных белка: ТПА, применяемого для рассасывания коронарных тромбов у человека, и ГКСФ, используемого в онкологии после химио- и радиотерапии. Разработаны более эффективные режимы сбора молока у трансгенных кроликов, что повысило надой за лактацию примерно в два раза.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации были представлены иа международной научной конференции "ДНК-тех но лоши в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных4 (ВИЖ, Дубровины 2001) и международной научно-практической конференции "Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства России" (ГНУ НИИПЗК, пос. Родники 2002). По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Объём диссертации 149 страниц машинописи, включая 26 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 291 источник, из них 267 на иностранных языках.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Используемая в эксперименте генная конструкция тканевого плаз ми но генного активатора не оказывает существенного влияния на развитие эмбрионов кроликов вне организма от стадии зиготы до бластоцисты,

2. Продемонстрирована возможность получения трансгенных кроликов путем пересадки микроинъециро ванных зигот геном тканевого плазминогенного активатора,

3. Эффективность наследования чужеродных генов, тканевого плазминогенного активатора (11,1%) и гранулоцитарного колониестимулнрующего фактора (16,6%) у кроликов первого поколения примерно одинакова, с колебаниями от 9,3% до 22,1%.

4. Различные режимы доения кроликов обеспечивают сбор от 974 до 1943 мл молока от одной крольчихи за лактацию.

5. Молочность трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колониестимулнрующего фактора за лактацию незначительно ниже, чем у нетрансгенных (2,4 литра против 2,8 литра), но разница между ними статистически недостоверна.

6. Продемонстрирована экспрессия гена гранулоцитарного колониестимулнрующего фактора с молоком трансгенных кроликов в течение всего периода лактации со значительными колебаниями уровня рекомбинантного белка у различных животных и в течение периода лактации.

7. Не выявлено значительных отклонений у трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора по показателям роста и развития и морфологии крови.

г. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве доноров зигот использовали половозрелых самок кроликов породы шиншилла, начиная с 5-7 месячного возраста.

Для микроннъекцни в эмбрионы кролика мы использовали генноинженерную конструкцию, любезно предоставленную Городецким С. И. (Институт Биологии гена, РАН, Москва).

Для стимуляции суперовуляции у доноров применяли гонадотропии сыворотки жеребых кобыл (Fol ligón, Intervet). Каждому донору инъецировали 40 ME фоллигона и индуцировали овуляцию внутривенным введением 250 ME хорион ичес кого гоиадотропина (Московский эндокринный завод).

Реципиента готовили за 22 - 26 часов до трансплантации, либо непосредственно перед трансплантацией. Реципиента спаривали с вазоэктомированным самцом и инъецировали SO ME ХГ.

Получение зигот производилось путём промывания яйцеводов после убоя либо оперативным промыванием яйцеводов in situ (Adams, 1982). После общей анестезии кролика фиксировали на операционном столе, делали разрез брюшной стенки и выводили наружу рога матки. Среду для вымывания подавали через катетер в отверстие в роге матки, а принимали из другого катетера через бахромку яйцевода.

Поиск эмбрионов в чашках Петри осуществляли под бинокулярной лупой Nicon (Japan), при увеличении 40х. Все манипуляции проводили в среде (PBS с добавлением 5%-ой фетальной сыворотки).

Микроннъекции проводили а специальной камере заполненной культуральиой средой с использованием инвертированного микроскопа * Axiovert 35 при увеличении 200х. В один пронуклеус зиготы инъецировали 1-2 тел раствора ДНК (Вгеш et al. 1985, Hammer et al. 1985). Об успехе микроинъекции судили по увеличению объема пронуклеуса.

Подсадку ми крои нъециро ванных зигот реципиентам осуществляли оперативным путём. Каждому реципиенту пересаживали 10-20 зигот, распределяя их поровну между яйцеводами.

Для доказательства транс ген носги кроликов использовали полимеразную цепную реакцию.

Размножение трансгенных кроликов проводили путем обычного спаривания. Ввиду того, что все исходные трансгенные животные были самцами, то их спаривали с нетрансгенными самками. Каждый самец спаривался два раза в неделю, по одной самке при каждом спаривании.

Сбор молока от транс генных самок осуществляли один раз в сутки. Для этого крольчиху вынимали из клетки и фиксировали на специальных носилках, В ушную вену инъецировали раствор окситоцина (1 ЕД/кг). После выдаивания молока из всех сосков, обрабатывали их антибактериальной мазью. Собранное молоко сразу же замораживали при - 20°С и хранили в замороженном состоянии до определения в нем активности ГКСФ.

При определении состава крови использовалась методика морфологического и иммунологического исследования крови у животных (Коробов А. В. и др, 1998).

Для. количественного определения ГКСФ в молоке трансгенных крольчих использовали метод ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), применяя два специфических вида антител к чГ-КСФ, Оптическую плотность определяли фотометром MR 700 Microplate Reader (Dynatech Ltd.) с длиной волны 405 нм к 490 нм. При проведении метода использовался набор реагентов ProCon G-CSF для научных исследований (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург),

Биологическую активность ПССФ в молоке определяли на основе изучения стимуляции пролиферации и колон необразован и я стволовых клеток. Концентрация контрольны* образцов ГКСФ составляла 10 ng/ml, 100 ng/ml и 1000 ng/ml. Каждый из образцов дублировали. Культуру клеток помещали на 14 дней в термостат с 5 % COj при 37° С. Клетки инкубировали в 24-луночных платах в полужидкой среде RPMI 1640 с 0,3% агаром и 30% FBS, в объеме по 0,5 мл с концентрацией 100 000 клеток на лунку. Результат учитывали визуальным просмотром лунок на наличие кластеров или колоний под микроскопом. Затем считали число клеток в каждой лунке после окраски трипановым синим в камере Горяева,

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью [-критерия Стьюдента, критерия %2 и анализа корреляции (Лакин, 1980).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Влияние мккроинъекции гена на развитие эмбрионов кролика.

Предварительно проверяли влияние чужеродной генной конструкции на эмбриональное развитие кроличьих эмбрионов in vitro. После инъекции гена в зиготы последние помещали в среду для культивирования и наблюдали за их развитием в течение 5 суток. В таблице 1 представлены сравнительные данные раннего эмбрионального развития микроинъецированных и контрольных (интакгных) зигот кролика.

После микроинъекции генной конструкции в зиготы наблюдалась некоторая тенденция ее воздействия на развитие эмбрионов кроликов по сравнению с ннтактными. Из числа контрольных эмбрионов до стадии мору л ы-бла стоцнсты развились 92.8% зигот.

Таблица 1

Эффективность развития мнкроинъециро&анных генжми ТПА и ГКСФ зигот кролика при культивировании in vitro.

Группы зигот Число зигот Дробились Из них развились до стадии бластоцисты

п % п %

Контрольная 42 42 100 39 92,8

Инъецированная ТПА 49 48 97,9 41 83,7

Инъецированная ГКСФ 61 61 100 48 78,7

Геном ТПА было п¡»инъецирован о 49 эмбрионов, из которых 97,9% дробилось, а до стадии бластоцисты развились 83,7%, что на 9,1% меньше по сравнению с контролем. Отсюда можно предположить, что генная конструкция не является токсичной для эмбрионов, а незначительное уменьшение развития до бластоцисты микроииъецированных эмбрионов по сравнению с контролем обусловлено, по-видимому, механическими повреждениями во время микроиньекции. Таким образом, после тестирования генных конструкций была установлена их пригодность для дальнейшего эксперимента.

3.2. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов путем микронньецнрованне ТПА в зиготу.

Микроннъецированные зиготы были пересажены 70 кроликам реципиентам. В результате пересадки 1004 ми крои нъециро ванных зигот, в среднем по 14,34*3,11 зиготы на крольчиху, окролились 43 (6!,4%) из 70 крольчих. Получено 175 крольчат, что составляет 17,4% к числу пересаженных зигот. При этом родились 143 живых кролика, что составляет 81,7% от числа родившихся или 14,2% от числа пересаженных зигот н 32 мертворожденных или 18,3% от числа родившихся и 3,2% от числа пересаженных. Таким образом, эмбриональные потери составили 82,6%. Интеграция гена была установлена у трех крольчат, то есть у 1,7% от числа родившихся. Показатель общей эффективности (трансгенные животные/инъецированные пересаженные эмбрионы) в нашей работе составил 0,3% (Таблица 2).

Таблица 2

Эффективность трансплантация зигот кролика и интеграции гена ТПА

№ п\п Показатели Число Процент

1 Пересажено микроинъецнрованных зигот 1004 100

2. Число кроликов реципиентов 70 100

3 Пересажено яйцеклеток на одного реципиента 14,34*3,1

3. Окролилось реципиентов 43 61,4

4. Получено потомков всего 175 17,4

5. в т.ч.: живых 143 81,7

6. Мертворожден н ых 32 18,3

7. из них трансгенных: к числу родившихся крольчат 3 1.7

8. к числу пересаженных зигот 3 0,3

3.3. На следован не трансгена

3.3.1. Наследование гена ТПА у потомков первого поколения

Для изучения наследования гена ТРА было проведено спаривание трансгенного самца №645 с 10 нетрансгеннымн самками (таблица 3),

Таблица 3

Наследование трансгена ТПА

№ п\п Показатели Трансгенный самец Контроль

п % п %

1 Число спаренных крольчих 10 100% 30 100%

г Число окролов 6 60% 25 83%

3 Всего родилось крольчат 36 100% 150 100%

4 из них мертворожденных 2 5,55% 8 5,33%

5 Наследовали трансген 4 11,1% - -

Из 10 спаренных крольчих окролилось 6 самок (60%), что на 23% меньше, чем при спаривании с нетрансгеннымн самцами. Всего родилось 36 крольчат, в том числе 2 мертворожденных (5,55%), Число мертворожденных не превышало средний показатель в контрольной группе, что указывает на отсутствие токсичности ТПА. Среднее число крольчат в гнездах обеих групп было одинаковым, по б голов. Наследование гена в первом поколении установлено у 4-х (11%) из 36 кроликов. Можно полагать, что снижение процента наследования чужеродного гена связано либо с генетическими нарушениями в геноме, что приводит к гибели части транс генных

эмбрионов или плодов в организме реципиента, либо с мозаицизмом первичнотранегеиного животного,

3.3.2. Наследование гена грану лоцмтарного колон мести мул и рующего фактора (ГКСФ)

Спаривали исходных трансгенных самцов с нетрансгениыми самками (таблица 4),

Таблица 4

Эффективность размножения исходных трансгенных кроликов с геном ГКСФ.

Номер транс генного самца Число осемененных самок Из них окролились

Число %

25 54 36 66,7

512 14 14 100,0

506 26 25 96,1

505 37 27 73,0

Итого 131 102 77,9

Процент окрола крольчих, осемененных семенем трансгенных самцов, был достаточно высоким, в среднем 77,9% (102 из 131). Вместе с тем обнаружились значительные индивидуальные различия оплодотворяющей способности у отдельных трансгенных самцов. У двух самцов (512 и 506) оллодотворяемость по результатам окрола была близкой к 100% (100 и 96,1%), а у двух других (25 и 505) примерно на 30% ниже (66,7 и 73,0%).

Наследование гена ГКСФ у трансгенных исходных кроликов в 1-м поколении изучали в четырех группах кроликов, у потомков от исходных транс генных животных (Таблица 5).

Таблица 5.

Наследование гена ГКСФ у кроликов 1-го поколения.

№ п\п Номер исходного трансгенного :амца Число потомков 1-го поколения Из них грансгенных Пало кроликов 1-го поколения

Число % Нетранс генные Трансгенные

Число % Число %

1 25 154 34 22,1 40 33,3 31 91,2

2 512 96 9 9,3 7 8,0 3 33,3

3 506 170 37 21,8 73 75,2 18 48,6

4 505 205 23 11,2 56 30,8 8 34,8

итого 625 103 16,6 176 33,7 60 58,2

Наследование чужеродного гена ГКСФ у потомков первого поколения составило в среднем 16,6% (у 103 из 625 голов). Этот показатель примерно в 3 раза ниже по сравнению с теоретически возможным по закону Менделя. Низкий уровень наследования чужеродного гена в 1-м поколении можно объяснить мозаицизмом исходных трансгенных кроликов.

При этом степень мозаицизма у потомков разных самцов была различной. У двух самцов наследование гена в 1-м поколении отмечено у 9,3-11,2% потомков, а у двух других у 21,8-22,1% потомков, т.е. вдвое выше. Несмотря ма это, было получено 103 трансгенных кролика 1-го поколения.

Характерной особенностью этого вида животных является высокий процент отхода молодняка. Поэтому представляло интерес изучить процент отхода трансгенных потомков по сравнению с нетрансгенными. Из данных таблицы 5 видно, что отход нетрансгекного молодняка составил в среднем 33,7% по сравнению с 58,2 % трансгенных потомков в тех же пометах. Таким образом, в среднем по всем трансгенным линиям отход трансгенных потомков вдвое выше, чем нетрансгенных. Вместе с тем, необходимо отметить, что у трансгенных потомков двух исходных трансгенных кроликов (№№ 512 и 505) процент отхода молодняка был на уровне нетрансгенных животных (33,3-34,8% против 33,7% у иетрансгенных потомков). В то же время у трансгенных кроликов первого поколения от исходного самца № 25 этот показатель был втрое выше (91,2 %), чем у нетрансгенных кроликов, а от самца № 506 примерно а 1,5 раза выше, чем у нетрансгенных кроликов.

Эти наблюдения свидетельствуют о том, что выживаемость потомков 1-го поколения трансгенных кроликов зависит в значительной степени от индивидуальных особенностей исходных трансгенных животных. При этом выявлены отдельные потомки первого поколения трансгенных животных, выживаемость которых не отличается от нетрансгенных кроликов. А это открывает возможность селекции линий трансгенных кроликов с высокой выж иваемостью.

Сравнивая показатели выживаемости транс генных крольчат с оплодотворявмостью самцов, просматривается взаимосвязь этих двух показателей. Так, кролики от самца 25 с низкой воспроизводительной способностью (66,7 % оплодотворяемости) имели также низкий показатель выживаемости (отход крольчат 91,2 %). Потомки от 512-го исходного трансгенного самца с высокой воспроизводительной способностью (100 %) имели высокий показатель выживаемости {отход крольчат 33,3 %).

Потомки первого поколения от других двух исходных трансгенных самцов, №№ 506 и 505, по показателям воспроизводительной способности и выживаемости занимают промежуточное положение между кроликами, полученными от трансгенных самцов №25 и №512 с тенденцией продвижения по этим показателям к потомкам от 512 самца.

3.4. Разработка оптимального режима доения

В нашу задачу входило выяснить наиболее оптимальное число крольчат в гнезде при доении крольчих, С увеличением гнезда повышается продуктивность крольчихи, однако, при этом снижается и количество выдоенного молока. Мы исследовали продуктивность крольчих с разным числом крольчат в гнезде (Таблица б).

Таблица 6

Продуктивность лактнрующнх крольчих в зависимости от размера гнезда

Число крольчат Число Количество

в гнезде крольчих собранного

молока, мл

1 4 349,6 ±53,1"

2 3 745,6*119,1"

3 4 1096,5 ± 52,5і

4 3 908,3 ± 152,2

* Р < 0,01; ^ Р < 0,05

Наилучшую продуктивность показали крольчихи с тремя-четырьмя крольчатами в гнезде. Средняя продуктивность крольчих с тремя крольчатами в гнезде была 1096,5 мл, с четырьмя крольчатами - 908, мл молока. Достоверной разницы между показателями крольчих этих двух групп не обнаружено (Р > 0,05). Крольчихи с меньшим числом крольчат в гнезде показывали достоверно меньшую продуктивность. Средний уровень продуктивности крольчих, находившихся в гнезде с одним крольчонком, был 349,6 мл, а крольчих с двумя крольчатами в гнезде 743,6 мл молока. Минимальным размером гнезда, позволяющим получать при этом максимальное количество молока от лактирующей крольчихи, стало гнездо с 3-4 крольчатами.

Для исследования оптимального режима ручного доения кроликов были отобраны три группы нетрансгенных крольчих по 5 голов в каждой группе при четырех постоянных крольчатах в гнезде.

В первой группе доение крольчих проводили без отсадки гнезда.

Во второй группе всех крольчат отсаживали на ночь (10-12 часов до начала доения) следя за тем, чтобы они были укрыты пухом и сеном. Доение проводили один раз в сутки.

В третьей группе доение проводили каждые 48 часов. Причем крольчат отсаживали на сутки до начала доения. Для нормального развития таких крольчат подкармливали искусственно из соски или на время кормления подсаживали к крольчихам-кормилицам.

Доение проводили в одно и то же время суток, так как крольчихи кормят детей в основном рано утром. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Надой молока у крольчих на фойе окситоцина при различных режимах доения

Хг п/п Режим доения Число крольчих Дней' лактации Суточный удой, мл Макс, суточный удой, мл Средний удой за лактацию, мл

1 I раз в сутки без отсадки крольчат 5 29,8 ± 3,7і 23,7 ± 9,4й 103,0 974.4± 332,7*

2 I раз в сутки с отсадкой крольчат на ночь 5 37,2*4,9" 42,2 ±24,1' 125,0 1943,$±345,9"

3 1 раз через 48 часов с отсадкой гнезда на сутки 5 38,8 ± 3,2* 67,4 ± 29,5і 200,0 1464,2 ± 197,9'

"■СР<0,05; "*Р<0,001; "''РсОДН; ''^<0,001; *ЬР<0305;

По показателям среднего удоя за весь период доения максимальный результат был у второй группы крольчих (1943,8 мл), при доении один раз в сутки с отсадкой гнезда на ночь. Продолжительность лактации во второй и третьей группах был приблизительно одинаков (37,2 и 38,8 дня). Однако надой молока от крольчих второй группы был на 479,6 мл больше, чем от крольчих третьей группы. Доение крольчих третьей группы выявило, что хотя средний удой за один раз был больше (67,4 мл), чем во второй группе (42,2 мл), результат не покрывал двухдневного надоя молока от крольчих второй группы. Крольчихи первой группы (без отсадки гнезда) имели укороченную лактацию (29,8 дня) и меньшую продуктивность (974,4 мл молока). Таким образом, при одинаковой величине гнезда (4 крольчонка) в группе с ежедневным доением и отсадкой крольчат на ночь (2-я группа) по сравнению с ежедневным доением без отсадки крольчат на ночь (1-я группа) среднесуточный сбор молока увеличивался почти вдвое, с 23,7 мл до 42,2 мл молока и в такой же степени повышался удой за лактацию, с 974 до 1943,8 мл молока.

Отсадка гнезда на сутки также повышала сбор молока от крольчих по сравнению с режимом доения без отсадки гнезда, но при этом возникают проблемы с необходимостью дополнительной подкормки молоком отсаженных крольчат и опасностью их большого отхода.

3.5. Молочность трансгенных крольчих

Молочность крольчих высчитывали за первые 20 дней. Для этого привес гнезда умножали на перерасчетный коэффициент, который равен количеству молока, дающего привес в 1 г. В нашей работе мы использовали перерасчетный коэффициент равный 2.

В гнезде трансгенных самок мы оставляли по четыре крольчонка. Доение трансгенных самок проходило без отъема гнезда. Молочность в таком случае определяли по количеству надоенного молока за первые 20 дней лактации и молочностью, высчитанной через привес гнезда. Для контроля брали нетрансгенных самок первой-второй лактации (Таблица 8).

Молочность трансгенных крольчих за 20 дней составила 2411,8 мл с учетом 867 мл выдоенного молока. Это на 425,4 мл меньше молочности контрольной группы за такой же период. Уменьшение молочности у транс генных крольчих может быть связано с пониженной секрецией, вследствие изменения генотипа клеток молочной железы, а также и тем, что размер гнезда у трансгенных самок был вдвое меньше (4 крольчонка), чем у нетрансгенных (8,06 крольчат).

Таблица 8

Сравнение молочности за 20 дней

Крольчихи Число самок Число крольчат в гнезде Масса гнезда, гр. Прирост, гр. Перерасчетная молочность, мл Кол-во выдоенного молока, мл Молочность за 20 дней, мл

1-й день 20-й день

Дойные грансгенные 4 4 219,6± 24,7 992±86,3 772,4 1544,8 867±92,4 2411,8±189,1'

Контроль 15 8,06 428,4±62,б 1847± 196,4 1418,6 2837,2 — 2837,2±232,7°

4ЬР>0,01

Нами была исследована динамика величины сбора молока у трансгенных крольчих полактациям (Таблица 9).

Таблица 9

Количество молока полактациям, полученного от трансгенных по гену ГКСФ крольчих, мл

№ крольчихи 1 лактация 2 лактация 3 лактация

Число дней Всего за лактацию В среднем за лень Число дней Всего эа лактацию В среднем за день Число дней Всего за лактацию В среднем за день

148 17 152 8.9 ± 3,3' 31 892 28,8 ± 9,9е 32 1241 38,8 ± 11,8'

565 24 423 17,644,9" 21 769 36,6*11,6" 26 1149 44,2 ± 13,5'

628 22 6S9 29,9±10,5' 26 1231 47,3 ±21.9" 23 1364 48,7 ± 22,3'

329 23 589 25,6*9,7' 27 1044 38,7± 20,6" — —

S77 36 1275 35,4±9,5' 32 1562 48,8±22,Г — -

0,001; Р< 0,01; "СР< 0,001; JcP< 0,001; "J?< 0,001; e'n P< 0,0!; ^ P< 0,001; J,tP< 0,01; '•mP< 0,05.

Мы проследили динамику надоев от пяти крольчих. V всех крольчих среднесуточные удои второй лактации превосходили аналогичные , показатели первой лактации (N¡>148, №565, Р< 0,00); №628, №329, Р< 0,01; №577, Р< 0,05). Надой молока во вторую лактацию у крольчихи №148 был в 5,9 раза больше, чем в первую лактацию, у крольчихи №565 в 1,8 раза, у крольчихи №628 в 1,9 раза, у крольчихи №329 в 1,8 раза и у крольчихи №577 был в 1,2 раза. Рост среднесуточных удоев в 3-ю лактацию достоверно наблюдался только у крольчихи №148 (Р< 0,01). Увеличение среднесуточных удоев двух других крольчих в 3-ю лактацию незначительно. Это сказывается и на общем надое молока за лактацию. Если надой за третью лактацию у крольчихи №148 больше в 1,4 раза, чем надой за вторую лактацию, а у крольчихи № 565 в 1,5 раза, то у крольчихи № 628 этот показатель был выше лишь в 1,1 раза.

3.6. Исследование крови трансгенных кроликов

Поскольку ГКСФ является гемопоэтическим фактором, и он может оказывать влияние на процесс кроветворения, то представляло интерес изучить картину крови у потомков различных исходных трансгенных самцов кроликов. ГКСФ главным образом воздействует на пролиферацию нейтрофилов. При исследовании крови самцов и самок от четырех первичнотрансгенных самцов нами не обнаружена достоверная разница в морфологическом составе крови трансгенных и нетранс генных животных.

Некоторое снижение уровня эритроцитов в крови по сравнению с принятой нормой для этого вида животного может быть связано с частичным гемолизом. Другие показатели соответствовали принятым нормам (Коробов А. В. и др., 1998). Эти наблюдения позволяют заключить, что экспрессия ГКСФ с молоком, по-видимому, не оказывает влияния на картину крови и возможно не сопровождается утечкой этого белка в другие ткани.

3.7, Изучение динам я кн роста в развития транс генных кроликов

При изучении динамики роста и развития нетрансгенных и трансгенных кроликов, нами не были установлены какие-либо значительные различия. Так, при рождении трансгенные крольчата имели живой вес несколько больший, чем у нетрансгенных кроликов. Хотя на 20-й день трансгенные по гену ГКСФ крольчата несколько отставали в росте, что может быть обусловлено тем, что у некоторых л актирующих крольчих мы выдаивали молоко. Отставание в росте затем снижалось и к моменту достижения 90-дневного возраста трансгенные по ГКСФ животные, даже несколько обогнали (2,15 кг против 1,9 кг) в росте и развитии своих нетрансгенных сверстников. Трансгенные по гену ТПА крольчата на всем протяжении исследования не отставали в росте.

3.8, Уровень содержания ГКСФ в молоке трансгенных кроликов

Мы определили уровень экспрессии ГКСФ в молоке у трех трансгенных крольчих (Таблица 10).

Таблица 10

Уровень экспрессии ГКСФ с молоком трансгенных крольчих

Номер кролика В среднем за лактацию Стадия лактации

п мг/л 1-я треть 2-я треть 3-я треть

№565 26 8,80 ± 2,62 9,56 ±2,19 7,20 ± 1,74 9,46 ±3,25

№413 23 14,60 ±6,54 22,89 ± 4,26' 14,14*2,71" 6,72 ± 1,66е

№329 27 22,03 ± 6,37 22,63 ±6,14 22,21 ±8,19 21,25 ±4,65

*■" Р< 0,01; *•' Р< 0,001; " с Р< 0,001

Концентрация ГКСФ в молоке трансгенных крольчих в среднем по лактацням у разных животных колебалась в пределах от 8,8 ± 2,62 мг/л до 22,03 ± 6,37 мг/л. Таким образом, у отдельных особей она увеличивалась по сравнению с минимальным уровнем в 2 и даже 3 раза. Эти наблюдения дают основание предполагать о возможности проведения селекции трансгенных животных по этому показателю. Максимальная концентрация в некоторых пробах доходила до 35 -37 мг/л. Большие индивидуальные различия по концентрациям ГКСФ в молоке трансгенных кроликов обнаружились и по стадиям лактации.

У крольчихи № 413 определено достоверное снижение концентрации ГКСФ в молоке с течением лактации. По мере удлинения срока лактации снижался не только среднесуточный удой, но и концентрация ГКСФ в молоке. Можно предполагать, что понижение секреторной активности молочной железы по мере удлинения лактации уменьшается и синтез ГКСФ клетками молочной железы. Однако такая тенденция была только у крольчихи Ха413, у двух других трансгенных крольчих она не прослеживалась.

3.9. Определение биологической активности ГКСФ в молоке трансгенны* крольчих

Для выявления ростостимулирукнцей активности молока трансгенных кроликов исследовали клетки костного мозга больных из отделений клиники РОНЦ им, Н.Н. Блохина РАМН с различными формами онкологических заболеваний; лимфогранулематоз, лимфосаркома, рак молочной железы и на клеточной линии промнелоцитарного лейкоза МБ-4.

Количественные различия при оценке роста клеток в среде с гранулоцитарным колонне стимулирующим фактором молока и в интактной культуре сохранялись во всех разведениях. Наибольшие различия были при разбавлении 1.100 и 1:1000.

На линии промнелоцитарного лейкоза ЫБ-4, учитывая высокую пролиферативную активность клеток, количественные различия оценивали по их росту в среде КРМ1 1640 в присутствии фактора молока и интактаых клеток. Количественные различия роста клеток в культуре наблюдали при разведении гранулоцитарного колониестимулирующего фактора молока до 1:1000 в обоих образцах (№№ 148 и 628) по отношению к контролю (Рисунок 1),

Проведенные эксперименты показали наличие стимулирующей активности исследуемых образцов молока трансгенных кроликов №№ 148 и 628 на рост гемопоэтических клеток гранулоцитарного ряда. По морфологическим признакам клетки, выращенные 8 культуре с добавлением молока траксгенных кроликов, обладали более высокой степенью дифференцировки, чем клетки контрольных культур.

1 0

1;Ю0

1:ЮОО

1 ¡10000

Разведение

□ Контроль Интахтные клетки ■ Кропи* 628 РКролик 149

Рисунок I: Рост клеток линии N6-4 промиелоцитарного лейкоза в присутствии гранулоцитарного колоннестимулирующего фактора из молока трансгенных кроликов.

4. ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована возможность получения трансгенных кроликов с геном тканевого плазминогенного активатора путем микроинъекции гена в пронуклеус зиготы. Эффективность интеграции гена составила 0,3% от общего числа инъецированных эмбрионов и 1,7% от числа родившихся крольчат. Генная конструкция тканевого плазмнногеиного активатора не оказала заметного влияния на развитие микроинъецированных эмбрионов кроликов вне организма от стадии зиготы до бластоциста.

2. Эффективность наследования чужеродных генов, тканевого плазм иноген ного активатора и гранулоцнтарного колон нестиму л ирукнце го фактора, у кроликов первого поколения примерно одинакова, в среднем 11,1% и 16,6% соответственно, с колебаниями от 9,3% до 22,1%. Низкий уровень интеграции чужеродных генов у кроликов первого поколения объясняется главным образом высокой степенью мозаицизма у исходных трансгенных кроликов.

3. Наблюдались значительные индивидуальные колебания в оплодотворяющей способности у исходных трансгенных самцов с геном гранулоцнтарного колониестимулирующего фактора, у двух самцов на уровне 96,1 - 100%, а у двух других в пределах 66,7 - 73,0%. Большие индивидуальные различия были между отдельными исходными трансгенными самцами и по выживаемости их потомства. Эти наблюдения дают основание считать, что место интеграции одного и того же гена оказывает, по-видимому, значительное влияние на фенотип инее кое проявление их у трансгенных животных.

4. Молочная продуктивность транс генных кроликов с геном грануло цитарно го колониестимулирующего фактора за лактацию незначительно отличается от нетрансгенмых кроликов (2,4 литра против 2,8 литра) и эта разница статистически недостоверна.

5. Апробированы различные режимы доения кроликов, один раз в сутки без отсадки крольчат или с отсадкой крольчат на ночь н один раз за двое суток с отсадкой гнезда на сутки. Наибольший удой молока за лактацию (1943,8±345,9 мл) получен при доении крольчих один раз в сутки с отсадкой крольчат на ночь.

6. Экспрессия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, определяемая иммуноферментным методом, колебалась в среднем у отдельных трансгенных крольчих от 8,8 ± 2,62 мг/л до 22,03 ± 6,37 мг/л молока. Установлена также биологическая активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в молоке на основе определения пролиферации к кол он необразован ия клеток костного мозга человека.

7. Не выявлено заметных отклонений у трансгенных кроликов по показателям роста и развития и морфологической картине крови в сравнении с нетрансгенными кроликами.

5, ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Для получения максимального надоя молока от лактирующих самок ручным способом доения крольчих следует проводить разовое ежедневное доение с отсадкой гнезда с тремя-четырьмя крольчатами на ночь.

2 Для выявления трансгенных крольчих с максимальным содержанием грану лоцитарного колониестнмулирующего фактора в молоке необходимо проводить их отбор не только относительно принадлежности к той или иной линии, но и внутри каждой линии.

6.ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ РАБОТЫ:

1. Елагин В. В., Мезина М. Н., Пинюгина М. В. Разработка оптимального режима доения крольчих / Сб. докл. научи, конф. "ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных" - ВИЖ. - Дубровицы, - 2001. - С. 106-107

2. Прокофьев М. И., Косорукое В. С,, Городецкий С. И,, Мезина М. Н., Юткин Е. В., Елагин В. В., Антипова Т, А. Трансгенные кролики -продуценты человеческого лекарственного белка / Сб. докл. международн. научно-практ. конф. "Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного . пушного звероводства и кролиководства России",- Родники. - ГНУ НИИГОК,- 2002. -С. 118-119

3. Прокофьев М.И., Мезина М. Н., Юткин Е, В., Елагин В, В., Городецкий С. И., Косорукое В, С., Пинюгина М. В, Получение транс генных кроликов с геном тканевого активатора плазминогена // Доклады РАСХН. - 2002. - №5. - С. 32-33

4. Прокофьев М.И., Городецкий С, И„ Косоруков В. С., Мезина М. Н., Юткин Е. В., Елагин В, В., Пинюгина М. В. Получение человеческого грану лоцитарного колониестнмулирующего фактора с молоком трансгенных животных 1Í Российский Биотерапевтический журнал. -2002. -ЖЗ. Т. 1.-С. 49-55

5. Ходорович Ю. М,, Рябова А, В., Юткин Е. В., Елагин В. В., Пинюгина М. В., Прокофьев М. И., Ларионов О. А. Создание трансгенкых кроликов, экспрессирующих бета-интерферон человека в молочной железе / Тезисы научн. докл. 3 съезда биохимического общества. -Санкт-Петербург. 26.06.- 01.07.2002. - С. 55.

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем t.ZS _Зак. 45?_Тираж ЮО

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елагин, Владимир Викторович

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Методы создания трансгенных животных.

2.1.1. Перенос генов посредством микроинъекции ДНК.

2.1.2. Использование ретровирусных векторов.

2.1.3. Пересадка ядер трансфецированных генами.

2.1.4. Использование половых клеток семенников.

2.2. Экспрессия генов.

2.2.1. Экспрессия в кровь.

2.2.2. Экспрессия в молоко.

2.3. Области применения транспорта генов.

2.3.1. Рост и развитие животных.

2.3.2. Получение молока с желаемыми свойствами.

2.3.3. Повышение качества и выхода шерсти у овец.

2.3.4. Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к инфекционным заболеваниям.

2.3.5. Биологическое моделирование патологических состояний человека.

2.3.6. Создание трансгенных животных - доноров органов для трансплантации человеку.

2.4. Выбор вида для получения трансгенных животных.

2.4.1. Кролики, как продуценты рекомбинантных белков.

2.4.1.1. Молочность крольчих.

2.4.2. Кролик, как продуцент гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ).

2.4.3. Биология и методы применения тканевого плазминогенного активатора.

3. Материалы и методы исследования.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Генные конструкции.

3.3. Подбор доноров и реципиентов.

3.4. Схема гормональной подготовки доноров.

3.5. Синхронизация овуляции у реципиентов.

3.6. Методика извлечения зигот у кроликов.

3.7. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена.

3.8. Пересадка микроинъецированных эмбрионов.

3.9. Получение и выращивание крольчат.

3.10. Размножение трансгенных кроликов.

3.11. Молекулярно-генетический анализ.

3.12. Доение и сбор молока.

3.13. Методика определения биологической активности ГКСФ.

3.14. Иммуноферментный анализ.

4. Результаты.

4.1. Влияние микроинъекции гена на развитие эмбрионов кролика.

4.2. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов путем микроинъецирования ТПА в зиготу.

4.3. Наследование трансгена.

4.3.1. Наследование гена ТПА у потомков первого поколения.

4.3.2. Наследование гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ).

4.4. Разработка оптимального режима доения.

4.5. Молочность трансгенных крольчих.

4.6. Определение биологической активности ГКСФ в молоке трансгенных крольчих.

4.7. Уровень содержания ГКСФ в молоке трансгенных кроликов.

4.8. Исследование крови трансгенных кроликов.

4.9. Изучение динамики роста и развития трансгенных кроликов.

5. Обсуждение.

6. Выводы.

7. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов"

Развитие молекулярной генетики, позволяющей целенаправленно нарабатывать ДНК, как носителя генетической информации, открывает новые перспективы в животноводстве. Применение метода генной инженерии связано с надеждами ученых с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, повышения резистентности к болезням и созданием так называемых "генных форм" или трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ, главным образом для медицины. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во включении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского назначения. Преимуществами синтеза рекомбинантных белков являются возможность простого регулирования количества производимых белков путем увеличения или сокращения численности трансгенных животных и экономичность процессов выделения рекомбинантных белков из молока.

С молоком трансгенных животных уже получены целый ряд ценных лекарственных веществ: а-антитрипсин [Archibald et al., (1990)], антитромбин - III [Meade at al. (1997)], ИГФ - 1 [Brem et al., (1994)], протеин С [Velander et al., (1992)] и биологически активных веществ технологического назначения - химозин [Эрнст и др.(1995), Прокофьев М.И., (1999)], лактоферин [Kimpenfort et al. (1991)].

В настоящее время можно получать и ряд других фармацевтических белков. К ним относятся белки: гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) и тканевый плазминогенный активатор (ТПА). ГКСФ регулирует продукцию нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. Препарат широко используется в онкологии для борьбы с нейтропенией у больных, получавших цитостатики по поводу злокачественных опухолевых заболеваний, а также при трансплантации костного мозга. Применение этого препарата позволяет резко уменьшить число опасных для жизни инфекционных осложнений, которые развиваются у больных с нейропенией. ТПА преобразовывает инактивный плазминоген в активный плазмин. Этот процесс обычно наблюдается при рассасывании сгустков крови или струпа, образовавшегося в связи с различными формами процесса заживления раны. ТПА используется для рассасывания тромбов у больных в остром периоде инфаркта миокарда после травм с тромбоэмболией легочной артерии, при различных заболеваниях сосудов. Получение этих белков с помощью технологии рекомбинантной ДНК, он может быть более эффективной формой, а также более дешевой по сравнению с существующими технологиями.

Рентабельность получения лекарственных белков с молоком трансгенных животных в 5-10 раз выше, чем с использованием культуры клеток. Выбор животного продуцента лекарственных белков определяется потребностью и стоимостью создания таких животных. Если потребность лекарственного белка определяется граммами, то можно использовать кролика. При этом сроки получения молока, содержащего этот белок, ограничиваются 7-12 месяцами, тогда как у коров они удлиняются до 54-78 месяцев.

Целью наших исследований было создание трансгенных кроликов -продуцентов лекарственных белков с молоком и изучение интеграции, наследования и экспрессии гена. В задачу исследований входило:

1. Получить трансгенных кроликов путем микроинъекции гена тканевого плазминогенного активатора (ТПА).

4. Изучить экспрессию гена ГКСФ с молоком трансгенных кроликов.

5. Разработать оптимальный режим доения кроликов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Используемая в эксперименте генная конструкция тканевого плазминогенного активатора (ТПА) не оказывает существенного влияния на развитие эмбрионов кроликов вне организма от стадии зиготы до бластоцисты.

2. Продемонстрирована возможность получения трансгенных кроликов путем пересадки микроинъецированных зигот геном тканевого плазминогенного активатора.

3. Наследование чужеродных генов, тканевого плазминогенного активатора (11,1%) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (16,6%) у кроликов первого поколения примерно одинаково, с колебаниями от 9,3% до 22,1%.

4. Различные режимы доения кроликов обеспечивают сбор от 974 до 1943 мл молока от одной крольчихи за лактацию.

5. Молочность трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора за лактацию не значительно ниже, чем у нетрансгенных (2,4 литра против 2,8 литра), но разница между ними статистически недостоверна.

6. Продемонстрирована экспрессия гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с молоком трансгенных кроликов в течение всего периода лактации со значительными колебаниями уровня рекомбинантного белка у различных животных и в течение периода лактации.

Научная новизна работы состоит в том,, что впервые получены трансгенные кроликов с геном тканевого плазминогенного активатора (ТПА) и с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) в первом поколении. Установлен уровень секреции рекомбинантного белка ГКСФ с молоком трансгенных кроликов и выявлены некоторые особенности в динамике его секреции у отдельных трансгенных кроликов.

2,Обзор литературы

В 1987 Lothar Helmighausen и Heiner Westphal из NIH в сотрудничестве с Katy Gordon и ее коллегами из Integrated Genetics совершили мини-революцию, когда сообщили, что фармацевтический препарат может быть произведен в молочной железе трансгенных животных [Gordon et al., (1987)]. Через 5 лет после этого сообщения была сформирована новая промышленность, поддержанная многими предприятиями. Высокая скорость, с которой технология получения трансгенных животных дошла из лабораторий до промышленности свидетельствует об осознанном потенциальном значении этого подхода для создания фармацевтических препаратов [Wall R. J.(1999)].

В настоящее время большой научный и практический интерес представляет получение трансгенных животных с заданными свойствами с целью их дальнейшего использования для нужд человека. Можно выделить основные направления использования трансгенеза в животноводстве и медицине:

-создание трансгенных животных с измененным обменом веществ в направлении повышения качества и эффективности производства продукции, увеличение скорости роста и повышение питательности [Pursel a. Rexroad, (1993)], увеличение выхода и качества производства шерсти [Rogers, (1990); Ward а. Nancarrow, (1991); Bawden et al., (1995)], наделение домашнего скота способностью использовать высоковолоконные диеты [Wells и Petters, (1994)];

-создание генетической устойчивости к ряду инфекционных заболеваний [Lo et al., (1991); Weidle et al., (1991); Brem, (1993); Clements и et al., (1994)];

-создание продуцентов биологически активных белков для медицины и других потребностей человека: животные, производящие человеческие заменители крови [Swanson et al., (1992)], животные, производящие человеческие антитела [Bruggemann et al., (1993); Geller et al., (1994); Wagner et al., (1994)], животные, производящие фармацевтические белки [Brem et al., (1993); Bawden et al., (1995); Maga, Murray, (1995); Janne et al., (1998)];

-создание трансгенных животных - доноров внутренних органов для пересадки человеку (ксенотрансплантация) [Cozzi et al., (1994); Fodor et al., (1994); Martin et al., (1993); Rosengard et al., (1995); Yannoutsos et al., (1995)];

-создание генетических моделей болезни [Mehtali et al., (1992); Breslow, (1993); Fabry, (1993); Fukuchi et al., (1993); Huang, (1993); Rothnagel et al., (1993); Shear et al., (1993); Thompson et al., (1993); Yamamura et al., (1993)].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Елагин, Владимир Викторович

6. Выводы

1. Продемонстрирована возможность получения трансгенных кроликов с геном тканевого плазминогенного активатора путем микроинъекции гена в пронуклеус зиготы. Эффективность интеграции гена составила 0,3% от общего числа инъецированных эмбрионов и 1,7% от числа родившихся крольчат. Генная конструкция тканевого плазминогенного активатора не оказала заметного влияния на развитие микроинъецированных эмбрионов кроликов вне организма от стадии зиготы до бластоцисты.

2. Наследование чужеродных генов, тканевого плазминогенного активатора и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора у кроликов первого поколения примерно одинаково, в среднем 11,1% и 16,6% соответственно, с колебаниями от 9,3% до 22,1%. Низкий уровень интеграции чужеродных генов у кроликов первого поколения объясняется главным образом высокой степенью мозаицизма у исходных трансгенных кроликов.

3. Наблюдались значительные индивидуальные колебания в оплодотворяющей способности у исходных трансгенных самцов с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, у двух самцов на уровне 96,1 - 100%, а у двух других в пределах 66,7 - 73,0%. Большие индивидуальные различия были между отдельными исходными трансгенными самцами и по выживаемости их потомства. Эти наблюдения дают основание считать, что место интеграции одного и того же гена оказывает, по-видимому, значительное влияние на фенотипическое проявление их у трансгенных животных.

4. Молочная продуктивность трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора за лактацию незначительно отличается от нетрансгенных кроликов (2,4 литра против 2,8 литра) и эта разница статистически недостоверна.

5. Апробированы различные режимы доения кроликов, один раз в сутки без отсадки крольчат или с отсадкой крольчат на ночь и один раз за двое суток с отсадкой гнезда на сутки. Наибольший удой молока за лактацию (1943,8±345,9 мл) получен при доении крольчих один раз в сутки с отсадкой крольчат на ночь.

125

6. Экспрессия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, определяемая иммуноферментным методом, колебалась в среднем у отдельных трансгенных крольчих от 8,8 ± 2,62 мг/л до 22,03 ± 6,37 мг/л молока. Установлена также биологическая активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в молоке на основе определения пролиферации и колониеобразования клеток костного мозга человека.

7. Практические предложения

1. Для получения максимального надоя молока от лактирующих самок ручным способом доения крольчих следует проводить разовое ежедневное доение с отсадкой гнезда с тремя-четырьмя крольчатами на ночь.

2. Для выявления трансгенных крольчих с максимальным содержанием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в молоке необходимо проводить их отбор не только относительно принадлежности к той или иной линии, но и внутри каждой линии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елагин, Владимир Викторович, п. Горки Ленинские, Московской обл.

1. Абертс Б., и др. Молекулярная биология клетки, Москва, "Мир", 1994.

2. Амиров А.Р. Определение интеграции трансгенов./ Биотехнология. 1998. №1.

3. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. Россельхозакадемия, 1995

4. Зеленин A.B., Тарасенко О.В., Колесников В.А. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции // Генетика. 1998. - Т.34. - №6. - С.730-736.

5. Зиновьева H.A., Безенфельдер У. Получение яйцеклеток и пересадка микроинъецированных зигот у кроликов. / Онтогенез. 1996. Т.27.№3. с 214-217.

6. Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве, ВИЖ, 2000

7. Зусман Н. С. Кролиководство. Монография. М., Колос, 1975. Стр 104

8. Калугин Ю. А. Молочность крольчих. Кролиководство и звероводство. 1992 ;6 стр 8

9. Ю.Калугин Ю. А. Физиология питания кроликов. Москва.: Колос, 1980, стр 106. П.Кеда Ю.М. Биологические свойства гормона роста человека. Гормон роста человека: Сб.науч.тр. Пущино, 1988. - Т. 12. - С. 17-23.

10. Коробов А. В, Петровский Г. С., Бронштейн В. С., Громова О. В. Методы морфологического и иммуноцитологического исследования крови у животных при внутренней патологии. (Методические указания.), Москва, 1998

11. Кузнецов A.B. Трансгенные животные. Приёмы конструирования // Биотехнология. 1995. - №3-4. - С.3-6.

12. Леонтюк C.B., Дубницкий A.A., Гусев Б.А., Дёмина М.Ф. Болезни кроликов. "Колос", 1974.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование./М. "Мир". 1984.

14. Мусиенко М.И., Макаревич A.B., Эрнст Л.К. и др. Культура клеток из ткани легкого трангенного кролика продуцент гормона роста КРС //Докл. ВАСХНИЛ, 1991. №1. - С.28-32.

15. Прокофьев М. И., Мезина M. Н. И др. Получение человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с молоком трансгенных животных. В печати.

16. Симонян Г.А., Ф.Ф.Хисамутдинов, "Ветеринарная гематология", Москва, "Колос", 1995.

17. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Зиновьева H.A. и др. // Докл. АН. 1995. - Е.45. -С.555-558.

18. Abu-El-Ezz, Z., Hassan, A. And Samak, M. Effect of litter size and mating cycles on lactation in rabbits. Alex. J. Agric. Res. 1981; 24 (1): 75-82.

19. Adams C.E. Egg transfer in the rabbit. Mammalian egg transfer. Beca Ration: CRC Press, 1982.P.29-48.

20. Aigner B, Besenfelder U, Seregi J, Frenyo LV, Sahin-Toth T, Brem G. Expression of murine tipe tyrosinase gene in transgenic rabbits. Transgenic Res 1996; 5:405-411.

21. Anderson G., Gutierrez A., Maga E. et al. The use of transgenes to alter the physical and functional properties of milk. In: Proc. Beltsville Symposia on Agricultural Animals XX. P.3.

22. Aguirre A, Castro-Palomino N, De la Fuente J, Ovidio Castro FO. Expression of human erythropoietin transgenes and of the endogenous WAP gene in the mammary gland of transgenic rabbits during gestation and lactation. Transgenic Res 1998 Jul;7(4):311-7

23. Archer J., Kennan W., Gould M et al.// PNAS USA, 1994;91 (15):6840-6844

24. Archibald A., McClenaghan M., Hornsey V. et al. High-level expression of biologically active human a-l-antitrypsin in the milk of transgenic mice // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990. - Vol.87. - P.5178

25. Auchincloss H.Jr. // Transplantation. 1988,- V.46. - P. 1-20.

26. Bach F.H. Xenogaft 25 / Ed. M. Hardy. New York: Elsevier, 1989. - P. 183-190.

27. Bachiller D., Schellander K., Peli J. et al.// Mol. Reprod.Dev. 1991; 30:194-200

28. Baranyi M., Brignon G., Anglade P., Ribadeau-Dumas B. New data on the protein for altering the properties of milk. Comp Biochem. Physiol. 1995; 11 IB: 407-415

29. Behringer R. R., Ryan T. M., Reilly M. P. Et al. Synthesis of functional hemoglobin in transgenic mice. Science, 1989; 245:971-973

30. Besenfelder U., Muller M., Brem G. Transgenics and modern renroductive technologies // The genetics of the pigs / Eds M. Rothschild and A. Ruvinsky. 1998. -P.345-374.

31. Bickenbach J., Longley M., Budman D. at al. A transgenic mouse model that recapitulates the clinical features of both neonatal and adult forms of the skin disease epidermolytic hyperkeratosis // Differentiation. 1996. Vol.61(2). - P. 129-139.

32. Bishop J. O., Smith P. Mechanism of chromosome integration of microinjected DNA. Mol. Biol. Med, 1989; 6:283-298

33. Bishop J. O. Chromosomal insertion of foreign DNA. Reprod. Develop. 1996; 36:607619

34. Blin, Stafford. A rapid and sensitive method for the quantition of microgram Quantities of protein utilizing.// Anal. Biochem. 1976, №72, p. 248 -254.

35. Bondioli K., Wall R. J.// Theriogenology, 1996; 45: 345 .

36. Brackett B G, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilisation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1971; 68: 353-357

37. Bradley A., Evans M., Kaufinan M. et al. // Nature, 1984; 309:255-256

38. Braunwald. E. 1988. Thrombolytic reperfusion of acute myocardial infarction: Resolved and unresolved issues. J. Am. Coll. Cardiol. 12:85A-92A

39. Brem G., Brenig B., Goodman H. et al. Production of transgenic, mice, rabbits and pigs by microinjection into pronuclei. Zuchthygiene, 1985; 20:251-252

40. Brem G., Brenig B., Salmons B. et al. Unerwartete transgene Expression eines gesaeugespezifischen Wachstumshormor Genkonstruktes in dem Bergman-Gliazellen der Maus. Tierarztl. Prax., 1991a, 19: 1-6.

41. Brem G., Hartl P. High-level expression prochymosin in the milk of transgenic rabbits. In Proc. Frontiers of Biotech. In Agriculture Sea of Galilee, Israel, 1991b. P.22.

42. Brem G. 1993. Inheritance and tissue-specific expression of transgenes in rabbits and pigs. Mol. Reeprod. Dev. 36:242

43. Brem G., Besenfelder U. Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic animals.// Chemicalogy. 1993. №10. P. 21-25.

44. Brem G., Besenfelder U., Castro F. O. and Müller M. Transgenesis in rabbits.// Mammary gland transgenesis: Therapeutic protein production. 1998, 7:107-142.

45. Brem G., Besenfelder U., Hartl P. Production of forign proteins in the mammary gland of transgenic rabbits. ChimiaOggi. 1993; 11: 21-25

46. Brem G., Hartl P, Besenfelder U, Wolf E, Zinovieva N, Pfaller R. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like grown factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits. Gene 1994; 149:351-355.

47. Brem G., Besenfelder U, Zinovieva N, Seregi J, Solti L, Hartl P. Mammary gland -specific expression of chimosin construction in transgenic rabbits. Teriogenology 1995; 43:175.

48. Brem G., Wanke R., Wolf E. et al. Multiple consequences of human growth hormone expression in transgenic mice. Mol. Biol. Med., 1986; 6:531-547

49. Bremel R., Yom H., Bleck G. Alteration of milk composition using molecular genetics //J. Dairy Sei. 1987. - Vol.72. - P.2826.

50. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E. et al. Factors affecting the efficiency of introducting foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82: 4432-4442

51. Brinster R. L„ Allen J. M., Behringer R. R., Gelinas R. E., Palmiter R. D. (1988) Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 836-840

52. Brinster R.L., Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonia transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11303-11307.

53. Brinster R., Ziirrniermann J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11298-11302.

54. Brinster R., Nagano M. //Semin. Cell. Biol., 1998, 9 (4): 401-409

55. Braggemaim, M. , N. P. Davies, and I. R. Rosewell.1993. Designer mice The production of human antibody repertoires in transgenic animals. Year Immunol. 7:33

56. Buerki K., Ullrich A. (1982) Transplantation of the human insulin gene into fertilized mouse eggs., EMBO, 1, 127-131

57. Buhler T.A., Bruyre D., Went G. et al. Rabbit (3-casein promoter directs secretion of human interleukin-2 in to the milk of transgenic rabbits // Bio/Technology. 1990, Vol.8, P. 140-143.

58. Campbell K H S, MeWhir J, Ritchie W A, Wilmut 1. Sheep cloned by nuclear transfer from cultured cell line. Nature 1996a; 380: 6466

59. Campbell K H S, Pasqualino L, Otaegui P J, Wilmut I. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod, 1996b: 1: 40-46

60. Campbell K H S, Wilmut 1. Totipotency or multipotentiality of cultured cells: applications and progress. Theriogenology 1997; 47: 63-72

61. Castro F, Aguirre A, Fuentes P, Ramos B, Rodriguez A, De la Fuente J. Secretion of human erytropoietin by mammary gland explants from lactating transgenic rabbits. Theriogenology 1995; 43:184

62. Castro F.O., J. Jánne. et al. Mammary gland transgenesis: therapeutic protein production. Springer. 1998.

63. Castro F.O., Perez A., Aquilar A. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic mice. Interferon y Biotecnología. 1989; 6:251-257

64. Chan C et al. Mutual exclusivity of DNA binding and nuclear localization signal.// Gene Theraphy. 1998. №5. P. 1204-1212.

65. Choi T., Huang M., Gorman C., Jaenisch R. (1991) A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol. Cell. Biol, 11, 3070-3074

66. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.F., Jerry J., Blackwell F., Ponce de Leon F., Robl JM. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblast. Science, 1998, 280, 1256-1258.

67. Clark A., Bessos H., Bishop J. Et al. Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep //Bio/Technology. 1989b. - Vol.7. - P487-492.

68. Clements, J. E., R. J. Wall, O. Narayan, D. Hauer, R. Schoborg, D. Sheffer, A. Powell, L. M. Carruth, M. C. Zink, and C. E. Rexroad. 1994. Development of transgenic sheep that express the visna virus envelope gene. Virology 200:370

69. Clouthiers D., Avarbock R., Maika S. et al. //Nature, 1996; 381:418-421

70. Collen, D., Topol, E. J., Tiefenbrunn, A. J., Gold, H. K., Weisfield,M. 1. et al. 1984 Coronary thrombolysis with recombimant human tissue-type plasminogen activator: A prospective, randomized, placebo-controlled trial. Circulation 70:1012-1017

71. Cooper D., Rolf L., Zuhdi Jr. The pig as potential organ donor for man. In: Cooper D., Kamp E., Reemsta K. et al. The transplantation of organs and tissue between species. Springer-Verlag, 1991. P.481.

72. Costantini F., Lacy E. (1981) Introduction of a rabbit ß-globin gene into the mouse germ line, Nature, 294, 92-94

73. Cowie, A.T. (1969): Variations in the yield and composition of the milk during lactation in the rabbit and the galactopoetic effect of prolactin. J.Endocr. 44,437:150

74. Cozzi E., G. A. Langford, A. Richards, K. Elsome, Lancaster, P. Chen, N. Yannoutsos and D. J. G. White. Expression of human decay accelerating factor in transgenic pigs. Transplant. Proc. 1994; 26: 1402

75. Cozzi E., Langford G., Wright L. et al. Comparative analysis of human DAF expression in the tissues of transgenic pig and man // Transpl. Proc. 1995. Vol.27. -P. 319-320.

76. Cross B. A. and Harris G. W. The role of the neurohypophysis in the milk-ejection reflex. J. Endocrinol., 1951/2; 8:148-161.

77. DiLella, T. und Zicarelli, L. (1971): Milk production of New Zealand white rabbits.(La produzione attea nelle coniglie di razza Neo-Zelandese) Riv.Zootec. 44,85-97

78. Drohan W.N., Young J.M., Lubon H. et al. Expression of human protein C in the milk transgenic mice and pigs. Thrombosis and Haemostasis, 1991, 65: 465.

79. Duby R., Cunniff M., Belak J., Balise J., Robl J. Effect of milking frequency on collection of milk from nursing New Zealand white rabbits. Anim Biotech., 1993; 4:31-42

80. Ebert K. M, Low M. J., Overstom E. W., Buonomo F. C., Baile C. A., Roberts T. M., Lee A., Mandel G., Goodmann. A Moloney MLV-rat somatotropin fusion gene produces biologically active somatotropin in a transgenic pig. Molec. Endocrinol. 1988;2: 227-283

81. Ebert K.M., Selgrath J.P., Di Tullio P. et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology., 1991, V.9.P.835-838.

82. Ernst L.K., Zaharchenco V.l., Suraeva N.M., Ponomareva T.I., Miroshnichenco O.I., Procofiov M.I., Tihonenco T.I. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targeted at adenovirus H5. Teriogenology, 1991, 35, 16, 1257-1271.

83. Eyestone W H. Challenges and progress in the production of transgenic cattle. Reprod. Fértil. Dev. 1994: 6: 647-52

84. Evans M J, Kaufman M H. Establishment of culture of pluripotent cells from mouse embryos. Nature (Lond.) 1981:292: 154-158

85. Evans R.W. Executive summary // The National Cooperative Transplantation Study. Seattle. WA: BHARC, 1991.

86. Evans R.W. Xenogaft 25 / Ed. M. A. Hardy. New York: Elsevier, 1989. - P.359-371.

87. Fabry, M. E. 1993. Transgenic animal models of sickle cell disease. Experientia 49:28

88. Flegel K.M, Shipley M.J, Rose G. Risk of stroke in nonrheumatic atrial fibrillation. Lancet 1987;1:526-9.

89. Foster P.N., Trejdosiewics L.K. // Clin. Immunol. 1992. - V89. - P.369-373.

90. Fukuchi K.-I, C. E. Ogburn, A. C. Smith, D. D. Kunkel, C. E. Furlong, S. S. Deeb, D. Nochlin, S. M. Sumi and G. M. Martin. Transgenic animal models for Alzheimer's disease. Ann. NY Acad. Sei. 1993; 695:217

91. Gachev, E.P. (Gatschew,E.) 1965. Ein Beilrag zur physiologischen und chemischen Charakteristik der Kaninchenlaktation. BioLZbl. 84, 447-460

92. Gachev, E.P. (Gatschew.E.) (1966a): Neue Angaben über den Hypophysenregulationsmechanismus bei der Laktation. I. Mitteilung Prolaktinregelung der Laktation mittels Laktosesyntheseaktivierang. Endokrinologie 50, 167-173

93. Gachev, E.P. (Gatschew.E.) (1966b): Neue Angaben über den Hypophysenregulationsmechanismus bei der Laktation. 2. Mitteilung: Einfluß der Stimulierung der Milchdruse auf die Prolaktinsekretion. Versuche mit Milchstauung. Endokrinologie 50, 174-178

94. Gachev, E.P. (1968a): The lactation curve as a function of the peripheral stimulation. CRAcad.BuIg.Sci. 21, 577-579

95. Gachev, E.P. (1970b): Comparison of lactation characteristics obtained by different methods of milk evacuation. C.R.Acad.BuIg.Sci. 23, 1167-1170

96. Galili U. Interaction of the natural anti-Gal antibody with alpha-galactosyl epitopes: major obstacle for xenotransplantation in humans // Immunology Today, 1993. Vol.14.-P.480-482.

97. Gallangher D., Schelling C., Groenen M. et al. Confirmation that the casein gene cluster resides on cattle chromosome 6 //Mamm. Genome. 1994. - Vol. 5. - P.524.

98. Gandolfi F., Lavirtano M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. The use of sperm- mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs abstract., J/ Reprod. Fertil. 1989, 4, 10.

99. Geller, S. A., W. S. Nichols, S. Kim, T. Tolmachoff, S. Lee, M. J. Dycaico, K. Felts, and J. A. Sorge. 1994. Histopatological and DNA ploidy studies. Hepatology 19:389

100. Geller R.L., Turman M. A., Dalmasso A. P., et al. // JASN. 1993. - V. 3. -P. 1189-2000.117. Ghazizadeh//1997 (17)

101. Gogelija, A.H. (1966): The milk production of rabbit does and the development of the young. Krolikov.Zverov. 9(6), 24

102. Gordon K., E. Lee, J. A. Vitale, A. E. Smith, H. Westphal, and L. Hennighausen. 1987 Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology 5:1183

103. Gordon J. W., Ruddle R. H. (1981) Intgration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei, Science, 214: 1244-1246

104. Gordon J. W., Scangos G. A., Plotkin D. J., Barbosa A., Ruddle F. H. (1980) Genetic transformation of mouse embryons by microinjection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384

105. Gorodetsky S. I., Tkach T. M. and Kapelinskaya T. V. Isolation and characterization of the Bos taurus |3-casein gene. Gene, 1988; 66:87-96

106. Gossler A., Doetschman T., Kom R. Et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83:9065-9069

107. Grosveld F., Assendelft G. B., Greaves D. R., Kollias G. Position-independent, high-level expression of the human (3-globin gene in transgenic mice. Cell, 1987; 51: 975985

108. Ha J., Kim K. Inhibition of fatty acid synthesis by expression of an acetil-CoA-carboxilase-specific ribozime gene // Proc. Natl. Acid. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. -P.9951.

109. Hammer R. E., Pursel V. G., Rexroad C. E. et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 1985; 315:680-683

110. Harbers K, Kuehn ML, Delius H., Jaenisch R. Insertion of retrovirus into the first intron of an a collagen gene leads to embryonic lethal mutation in mice. PNAS, 1984; 81:1504-1508

111. Haskell E„ Bowen R.// Mol. Reprod. Dev., 1995, 40(3):386-390

112. Hogan B, Constantini F, Lacy P. Manipulation of the mouse embryo: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1996

113. Houdebin L. Production of pharmaceutical proteins from transgenic animals // J. Biotechnology. 1994. - Vol.34. - P.269.

114. Huang M. Gene targeting technology for creating transgenic models of limphopoiesis. Laboratory animal science. 1992. Vol.43. - P. 156-159.

115. Huquet E„ Esponda P. // Mol. Reprod. Dev., 1998; 51: 42-52

116. Hynd P. Effect of nutrition on wool follicle cell kinetics in sheep differing in efficiency of wool production //Aust. J. Agriculture Research. 1989. - Vol.40. - P.409-417.

117. Janne J., Alhonen L., Hyttinth J. et al. // Biotechnol. Annu. Rev., 1998; 4:55-57

118. Jaenish R. Infertion of mouse blastocysts with SV 40 DNA: Normal development of infected embrygos and persistane SV 40 specitic LNA seguences in the adult animals. Cold spring Harpor Symp., 1974, 39, 375-380.

119. Jeanisch R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leucemia virus. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73: 1260.

120. Jeanisch R., Fan H., Croker B. // Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1975; 72: 4008-4012

121. Jeanisch R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1974, 71:1250-1254.

122. Jolivet G., Devinoy E., Fontain M. et al. // Gene, 1992, 113: 257-262

124. Jung Ho Ko, Chul-Sang Lee, Kui Hyun Kim, Myung-Geol Pang et al. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat. Transgenic Research 2000; 9: 215-222,

125. Kalinowski, T. und Rudolph, W. Untersuchungen über die Milchleistung vonWeissen Neuseelander Haesinnen (WN) waehrend 4 Laktationen. Wiss. Zeitschrift, Univ. Rostock. 1975; 24: 291-294

126. Kamar, G.AR, El-Borady, A.M., Kicka, M.A.M., Riad, S.A., El-Tantawy, S.M.T. und Ibrahim, F.A.A. (1985): Some factors affecting production and composition of milk in Giza White rabbits. EgyptJAnim. Prod. 25,207-217

127. Kash'ian SK, Bystrov NS, Boldyreva EF, Poliakova IA, Severtsova IV, Korobko VG. Chemical-enzymatic synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for human granulocyte-colony stimulating factor. Bioorg Khim 1992 Jan; 18(l):71-7.

128. Kato Y., Tani T., Sotomaru Y. et al. // Science, 1998; 282- 2095-2098

129. Kim T, Leibfried-Rutledge M L, First N L. Gene transfer in bovine blastocysts using replication -defective retroviral vectors packaged with gibbon ape leukemia virus envelopes. Mol. Reprod. Dev. 1993; 35: 105-113

130. Kim J.H., Jung-Ha H.S., Lee H.T., Chung K.S. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig. Mol. Reprod. Dev. 1997, 46, 1-12.

131. Koczan G., Hobom G., Seyfert H. // Nucl. Acids. Res., 1991; 19: 5591-5596

132. Kuipers H., Langford G., White D. Analysis of transgene sites in transgenic pigs fluorescence in situ hybridisation // Transgenic. Res. 1997. - Vol.6. - P.253-259.

133. Lacy E. S., Roberts E. P., Evans M. D. Et al. A foreign beta-globin gene in transgenic mice: Integration at abnormal chromosomal positions and expression in inappropriate tissues. Cell, 1983; 34:343-358

134. Langford G., Yannoutsos N., Cozzi E. et al. Production of pigs transgenic for human decay acceleration factor // Transpl. Proc. 1994. Vol.26. - P. 1400-1401.

135. Laurincik J., Kopecny V., Hyttel P. Pronucleus development and DNA synthesis in bovine zygotes in vivo. Theriogenology 1994; 42:1285-1293

136. Lavitrano M., Camaioni A., Frati V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. Sperm Cells as vectors for introduction foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice. Cells 1989, 57, 717-723.

137. Lebas, F. (1968): Mesure Quantitative de la production laitiere chez la lapine. Ann.Zootech. 17, 169-182

138. Lee K., Atice S., Rosen J., Differential regulation of rat ß-casein-chloramphenicol acetyltransferase fusion gene expression in transgenic mice // Molecular Cell Biology. -1989. Vol.9. - P.560-565.

139. Lee S H, de Boer H A. Production of biomedical proteins in the milk of transgenic dairy cows: the state of the art. J. Control. Release 1994; 29: 213-221

140. Lee K.F., Demayo F.J.,Atiee S.H. et al. Tissue-specific expression of the rat |3-casein gene in transgenic mice. Nucl. Acid. Res., 1988, 16: 1027-1041.

141. Leroux C., Mazure N, Martin P. //J. Biol. Chem., 1992; 267: 6147 6157.

142. Lewis-Williams J., Harvey M., Wilburn B. Et al. Analysis of transgenic mosaicism in microinjected mouse embryos using fluorescence in situ hybridization at various developmental time points. Theriogenology 1996; 45:335

143. Limonta JM, Castro FO, Martinez R, Puentes P, Ramos B, Aguilar A, Lleonart RL, de la Fuente J. Transgenic rabbits as bioreactors for the production of human growth hormone. J Biotechnol 1995 May 15;40(l):49-58

144. Lin T. P. (1966) Microinjection of mouse eggs., Science, 151, 333-337

145. Lincoln D. W. Suckling: A time constant in the nursing behavior of rabbit. Applied Behaviour, 1974; 13:711-714

146. Lindenmann J. Inheritance of resistance to influenza virus in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964. 116: 506-509.

147. Lo, D., V. Pursel, P. J. Linton, E. Sandgren, R. Behringer, C. Rexroad, R. D. Paimiter, andR. L. Brinster. 1991. Expression of mouse IgA by transgenic mice, pigs and sheep. Eur. J. Immunol. 21:1001-1006

148. Logan J. S. Transgenic animals: beyond "funny milk". Curr. Opin. Biotech., 1993; 4:591-595

149. Maga E. A., Murray J. D. Mammery gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk. Biotechnology, 1995; 13: 1452-1457

150. Martin G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981; 78:7634-7638

151. Martin L., M. Mora-Worms, C. Lucas, C. Reynolds and T. A. Stewart. An evaluation of mechanisms by which tolerance to organ-specific antigens is lost using a transgenic mouse model. J. Immunol. 1993; 150:1234

152. Massound M., Bischoff R., Dalemans W. Et al. Expression of active human ar antitrypsin in transgenic rabbits. J. Biotech., 1991; 18:193-204

153. McKee C, Gibson A, Dalrymple M, Emslie L, Garner I, Cottingham I Production of biologically active salmon calcitonin in the milk of transgenic rabbits. Nat Biotechnol 1998 Jul; 16(7):647-51

154. McNeish J. D., Scott W. J., Potter S. S. Legless? A nuvel mutation found in PHT1-1 transgenic mice., Science, 1988, V. 241, 837-839

155. Meade H., Gates L., Lacy E. Lonberg N. Bovine aSrcaseinse sequences direct high expression of active human urokinase in mouse milk // Bio/Technology. 1990. -Vol.8-P.443-446.

156. Meade H., Ziomer A. C. Urine as substitute for milk? Nature Biotechnology, 1998, vl6, January, 21-22

157. Mehigh C., Elias V., Mehigh R., et al. Development of recombinant bovine leukemia virus vector for delivery of a sintetic bovine growth hormone-releasing factor gene into bovine cells // J. of animal science. 1993. - Vol.71. - P.687-693.

158. Mehtali, M., M. Munschy, D. Ali-Hadji, and M. P. Kieny. 1992. A novel transgenic mouse model for the in vivo evaluation of anti-human immunodeficiency virus type 1 drugs. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:1959

159. Menck M.C., Mercier Y., Lobo R.B., Heyman Y., Renard J.P., Thompson E.M. Prediction of transgene integration by non-invasive bioluminescent screening of microinjected bovine embryos. Transgenic Res., 1998, 7, 331-341.

160. Morstyn G., Burgess A. Cancer Res., 1988b, 48, 5624.

161. Nakamura A., Okumura J., Muramatsu T.// Mol. Reprod. Dev., 1998; 49: 368-373

162. Niehaus, H. und Kocak, C. (1973): Milchleistungsprufimgen bei Kalifomier-HSssm. ea.Arch. Geßagell:. 3,102-105

163. Nigmatullin. R.M. (1963): Evaluation of milk of rabbits of several breeds. Krolikov.Zverov. 10,13-14

164. Ninomija T., Hoshi V, Miruno A, Nagao V., Yuki A. Selection of mouse preimplantation embryyos canyind exogenous DNA by polymerase chain reaction, mol. Reprod. Dev., 1989, 1, 242-248

165. Palmiter R. D., Brinster R. L. (1986) Germ line transformation of mice Ann. Rev. Genet., 20,465-499

166. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hamm R.E., Trumbauer M.E., Rosenfeld M.G., Birnberg N.C., Evan R.M. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein growth hormone fusion genes. Nature. 1982. 300, 611-615.

167. Palmiter R. D., Sandgren E. P., Avarbock M. R., Allen D. D., Brinster R. L. (1991) Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 478-482

168. Pavlov, M.K. (1963): Evaluation of rabbit breeds by milk yield. Krolikov.Zverov. 4, 4-6

169. Pavlovic J., Arzet H., Herti H. et al. Enhanced virus resistance of transgenic mice expressing the human MxA protein // J. Virol, 1995. Vol.69(7). - P.4506-4510.

170. Perper R.J., Najarian J.S. // Transplantation. 1966. - V.4. - P.377-388.

171. Perry A. C., Wakayama T., Kishikawa H. et al. // Science, 1999; 284: 1180-1183

172. Peura T. Generation of transgenic cattle from microinjected embryos produced in vitro.: Kuopio University Publications C. Natural and Enviromental Sciences 26. 89 p.-Acad. Diss., 1994

173. Piedrachita J., Moore K., Lee C., et al. // J. Reprod. Fertil., 1997; Suppl. 52: 245254

174. Pittius C.W., Hennighausen L., Lee E. et al. A milk protein gene promoter detects the expression of human tissue plasminogen activator cDNA to the mammary gland in transgenic mice. Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 1988, 85: 5874.

175. Piatt J.L., Bach F.H. // Transplantation. 1991a. - V.52. - P.937-947

176. Piatt J., Parker W. Another step towards xenotransplantation //Nature Medicine, 1995.-Vol.1.-P. 1248-1250.

177. Polejaeva I. A., Chen S. H., Vanght T. D., Pag R. L., Mullins J., Ball S., Dai Y., Boone J., Walker S., Ayares P., Colman A., Cambell K. H. Clone pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 2000; 407:86-90

178. Powell D. J., Galli C., Moor R. M. The fate of DNA injected into mammalian oocytes and zygotes at different stages of the cell cycle. J. Reprod. Fertil. 1992; 95:211220

179. Powell B., Roger G. Hard keratin IF and associated proteins. In: Goldman R., Steinert P. Cellularc and Molecular Biology of Intermediate Filament. New York, 1990. -P.267-300.

180. Powell D., Walker S., Bawden C. et al. Transgenic sheep and wool growth: possibilities and current status // Reprod. Fertil. Dev. 1994. - Vol.6. - P.615-623.

181. Prather R., Barnes F., Sims M. et al. // Biol. Reprod., 1987; 37:859-866

182. Prather R„ Sims M., First N. // Biol. Reprod., 1989; 41: 414- 418

183. Prusinere S. Molecular biology of prion diseases // Science. 1991. - Vol.252. -P.1515-1522.

184. Pursel, V. G., and C. E. Rexroad, Jr. 1993 Status of research with transgenic farm animals. J. Anim. Sci. 71 (suppl. 3): 10

185. Pursel V.G., Campbell R.G., Miller K. F., Behringer R.B., Palmiter R.D., Brinster R.L. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene. J. Anim. Sci. 1988, 66, 267.

186. Pursel V. G., Hammer R. E., Bott D. J., Palmiter R. D. And Brinster R. L. Genetic engeneering of swine: Integration, expression and gernline transmission of growth -related genes., J. Reprod. Fert. (suppl.), 1990,V.41, pp 77-83.

187. Ramos B., de Armas R., de la Fuente el al. Activity of simian virus 40 early promoter in rabbit embryos. Theriogenology 1994; 41:281

188. Reis P., Tunks D., Munro S. Effect of infusion of amino acids into The abomasum of sheep, With emphasis on the relative value of metionine, cysteine and homocysteine for wool growth //Agriculture Science. 1990. - Vol. 114 - P.59-68.

189. Robertson E., Bradley A., Kuehn M. et al // Nature, 1986; 323:445-448

190. Rogers, G. E. 1990. Improvement of wool production through genetic engineering. Trends Biotechnol. 8:6

191. Robl J.M. Cloning, genetic modification, and embrionic stem cells in cow// Proceedings. Genetically engineering end cloning animals: science, society&indastry. June 21-23, 1998.

192. Rodriguez A, Castro FO, Aguilar A et al. Expression of active human eritropoetin in the mammary gland of transgenic mice and rabbits. Biol Res 1995; 28:141-153.

193. Roger G. Improvement of wool prodaction through genetic engineering // Trends Cameron E. Recent advances in transgenic technology // Mol. Biotechnol. 1997. -Vol.7. - P.253-265.

194. Roschlau K., Rommel P., Andreeva L. et al.// J. Reprod. Fértil. Suppl., 1989; 38: 153-160

195. Rosengard A., Cary N., Horsley J. et al. Endothelial expression of human decay accelerating factor in transgenic pig tissue: A potential approach for human complement inactivation in discordant xenografts. // Transplant. Proc. 1995. - Vol.27. - P326.

196. Rothnagel J. A., D. A. Greenhalgh, X-J. Wang, K. Sellheyer, J. R. Bickenbach, A. M. Dominey, and D. R. Roop. Transgenic models of skin diseases. Arch. Dermatol. 1993; 129:1430

197. Sahlu T., Fernandez J. Effect of intraperitoneal administration of lisine and metionine on mohair yield and quality in angora goats // J. Animal Scince. 1992. -Vol.70.-P.3188-3193.

198. Saiki R.K. Primer-detected enzymatic amplifications of DNA-polymerase.// Science.№239. 1988. P.487-491.

199. Salmons B., Guenzburg W., Janka I. Et al. // In: Fortschritte in der Tierzucht, Ulmer. 1991; 437-453

200. Salter S.W., E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, A.M. Fadly, R.L. Witter, L.B. Crittenden (1986): Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses. Poultry Sei. 65, 1445.

201. Sandrin M., Fodor W., Mouhtorius E. et al. Enzymatic remodelling of the carbohidrat surfase of a xenogenic cells substantially reduces human antibody binding and complement-mediated cytolysis // Nature Medicine, 1995. Vol. 1. - P. 1261-1267.

202. Sato M., Jwase R., Kasai K. et al. // Anim. Biotechnol., 1994; 5:19-31

203. Schedl A., Beermann F., Thies E., Montoliu L., Kelsey G., Schuetz G. (1992) Transgenic mice generated by pronuclear injection of a yeast artificial chromosome. -Nucl. Acid. Res., 20, 3073-3077

204. Schedl A., Montoliu L., Kelsey G., Schuetz G. , A yeast artificial chromosome covering the tyrosimase gene confers copy number dependent expression in transgenic mice. -Natyre, 362, 258-261

205. Schelander K., Peli J/. Small F. Et al. // Anim. Biotechnol., 1995; 6: 41-50

206. Schnieke A E, Kind A J, Richie W A. et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblast. Science 1997; 278: 21302133

207. Schranner, S. 1993. Untersuchungen zum maschinellen Milchentzug beim Kaninchen als Grundlage zur Bestimmung von Laktationsleistungen und Milchinhaltsstoffen. Inaugural-Dissertation, München

208. Sharma A., Ocabe J., Birch P. et al. Reduction in the level of Gal(al,3)Gal transgenic mice and pigs by the expression of an a(l,2) fructosyltransferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol.93. - P.7190-7195.

209. Shear H. L., E. F. Roth, Jr., M. E. Fabry, F. D. Costantini, A. Pachnis, A. Hood abd R. L. Nagel. Transgenic mice expressing human sickle hemoglobin are partially resistant to rodent malaria. Blood, 1993; 81:222

210. Sivaprasad A., Kuczek T., Bawder C. et al. Coexpression of the cysE and cysM genes of Salmonella typhimurium in mammalian cells: a step towards establishing cysteine biosyntesis in seep by transgenesis // Transgenic Research. 1992. - Vol.1. -P.79-92.

211. Soulier S., Vilotte J.L., Stinnakre M.G. et al. Expression analysis of ruminant a-lactalbumin in transgenic mice; developmental regulation and general location of important cis-regulatory elements. FEBS, 1992, 297:13-18.

212. Stewart C., Vanek M., Wagner E. F. Expression of foreign genes from retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimaeras., EMBO, 1985; 4:3701-3709

213. Stewart C.L., S. Schuetze, M. Vanek, E. Wagner (1987): Expression of retroviral vectors in transgenic mice obtained by embryo infection. EMBO 6, 383-388.

214. Strelchenko N., Betthauser J., Jurgella G., Forsberg E., Damiani P., Golueke P., Pace M.M., Bishop M.D. Use the somatic cells in cloning// Proceedings. Genetically engineering and cloning animals: science, society & industry. June 21-23, 1998

215. Stice S., Robl J. // Biol. Reprod., 1988; 39:657-664

216. Stice S., Strelchenko N. Domestic animal embrionic stem cells: progress toward gene line contribution. In: Biotechnology's role in the genetic improvement og farm animals. 1996. - P. 189-202.

217. Stroke Prevention in Atrial Fibrillation Investigators. The Stroke Prevention in Atrial Fibrillation Study: final results. Circulation 1991;84:527-39.

218. Stroke Prevention in Atrial Fibrillation Investigators. Predictors of thromboembolism in atrial fibrillation. 1. Clinical features of patients at risk. Ann Intern Med 1992;116:1-5.

219. Stromqvist M, Houdebine M, Andersson JO, Edlund A, Johansson T, Viglietta C, Puissant C, Hansson L. Recombinant human extracellular superoxide dismutase produced in milk of transgenic rabbits. Transgenic Res 1997 Jul;6(4):271-8

220. Swanson, M. E., M. J. Martin, J. K. O'Donnel, K. Hoover, W. Lago, V. Huntress, C. T. Parsons, C. A. Pinkert, S. Pilder, and J. S. Logan. 1992. Production of functional human hemoglobin in transgenic swine. Bio/Technology 10:557

221. Tacada T., Iida K., Awaji T., Itoh K., Takahashi R., Shibui A., Yoshida K., Sugano S., Tsuujimoto G. Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker. Nat. Biotechnology 1997, 15, 458-461.

222. Tegtmeyer, M. (1964): Milch- und Saugeleistung des Kaninchens. In: Das Btaue Kaninchenjahrbuch 1965, Verlag Ortel & Sparer, Reutlingen. S. 97-114

223. Thomas K., Capecchi MM Cell, 1987, 51; 503-512.

224. Thompson S., Clark A., Pow A., et. al.// Cell; 1989: 56: 313-321

225. Thompson J., Kalishman J., Golos T., et. al.// Biol. Reprod., 1996; 55:254-259

226. Thompson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.// Science, 1998; 282: 1145-1147

227. Thompson T. C., L. D. Traong, T. L. Timme, D. Kädmon, B. K. McCune, K. C. Flanders, P. T. Scardino and S. H. Park. Transgenic models for the study of prostate cancer. Cancer. 1993; 71 (Suppl. 1): 1165

228. ToyonagaT., Hino O., Sugai S. et al. Chronic active hapatitis in transgenic mice expressing interferon gamma in the liver // Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1994. -Vol.91(2). -P.614-618.

229. Van den Hout JM, Reuser AJ, de Klerk JB, Arts WF, Smeitink JA, Van der Ploeg AT. Enzyme therapy for pompe disease with recombinant human alpha-glucosidase from rabbit milk. J Inherit Metab Dis 2001 Apr;24(2):266-74

230. Van der Putten H„ F.M. Botteri, A.D. Miller, M.G. Resenfeld, H. Fan, R.M. Evans, I.M. Verma (1985): Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6148-6152.

231. Velander W.H., Page R.L., Morcol T. et al. // Ann.N.-Y. Acad. Sei. 1992b. -V.665. - P.391-403

232. Violotte J.-L., Soulier S., Stennakre M. G. et al. Efficient tissue-spesific expression of bovine a-lactalbumin in transgenic mice. Eur. J. Biochem., 1989, 186.

233. Wagner E. F., Covarrabias L., Stewart R. A., Mintz B. Prenatal lethalities in mice homozygous for human growth hormone gene sequences integrated in the germ line. Cell, 1983, V. 35, pp. 647-655

234. Wagner T. E, Hoppe P. C., Jollick J. D. Schole D. R, Hodinka R. L., Gauet J. B. (1981) Microinjection of rabbit ß-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and their offspring, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 6376-6380

235. Wagner, S. D. ,G. T. Williams, T. Larson, M. S. Neuberger, D. Kitamura, K. Rajewsky, J. Xian, and M. Bruggemann. 1994. Antibodies generated from human immunoglobulin miniloci in transgenic mice. Nucleic Acids Res. 22:1389

236. Wakayama T., Perry A, Zuccotti M. Et. al.// Nature, 1998; 394: 369-374.

237. Wall R. J., Pursei V.G., Hammer R.E. at al. Visualization of nuclear structures in one and two cell pig ova and their development after centrifugation. Biol. Reprod. 1985, 32:645-652

238. Wall R. J., Pursei V.G., Shamay A et al. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991; 88:1696-1700

239. Wall R. J., Seidel G. E. Transgenic farm animals. A critical review. Theriogenology 1992; 337-357

240. Wall R. J. Biotechnology for the production of modified and innovative animal products : transgenic livestock bioreactors. Livestock Production Science. 1999, 59: 243255

241. Wall R. J. Transgenic livestock: progress and prospects for the future. Theriogenology 1996; 445:57-68

242. Wall R J, Kerr D E, Bondioli K. R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J. Dairy Sci. 1997; 80: 2213-2224

243. Ward, K. A., and C. D. Nancarrow. 1991. The genetic engineering of production traits in domestic animal. Experientia 47: 913

244. Weidle, U. H., H. Lenz, and G. B. Brem. 1991. Genes encoding a mouse monoclonal antibody are expressed in transgenic mice, rabbit and pigs. Gene 98: 185

245. Weinbach J., Camus A., Barra J. et al. Transgenic mice expressing the Sh ble bleomycin resistance gene are protected against bleomycin-induced pulmonary fibrosis // Cancer Res, 1996. Vol.56(24). -P.5659-5665.

246. Wells, K. D., and R. M. Petters. 1994 Constuction of a vector for the genetic manipulation of digestion . J. Anim. Sci. 72:6

247. White D., Langford G., Cozzi E. et al. Prodaction of pigs transgenic for human DAF strategy for xenotransplantation // Xenotransplantation. 1995. - Vol.2. - P.213-217.

248. Whitelaw C. B. A., Sprringbett A. J., Webster J. The majority of Go transgenic mice are derived from mosaic embryos. Transgenic Res, 1993; 2:29-33

249. Wilkie T.M., Brinster R.L., Palmiter R.D. Germline and somatic mosaicism in tramsgenic mice. Devl.Biol., 1986, 118: 9-18.

250. Willadsen S.// Nature, 1986; 320: 63-65

251. Wilmut I, Clark A J. Basic techniques for transgenesis. J. Reprod. Pert. 1991; Suppi. 43: 265-275

252. Wilmut I., Archibald A., Harris S. Modificatioin of milk composition //J. Reprod. Fertil. Suppl. 1990. - Vol.41. - P. 135.

253. Wilmut I, Schnieke A E, MeWhir J, Kind A J, Campbell K H S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810-813

254. Wolf E. (1990). Expressionsbedingte Veränderungen bei Wachstumshormong-transgenen Mäusen. Diss. Med. Vet., München.

255. Wolf P.A., Abbott R.D., Kannel W.B. Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke: the Framingham Study. Stroke 1991;22:983-8.

256. Wright G, Carver A, Cottom D et al. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology 1991; 9: 830-834

257. Yamamura K., Miyazaki T., Uno M. et al. Transgenic mouse as a tool for the study of autoimmune disease: insulin-dependent diabetes mellitus // J. Immunopharmacol. -1992.-Vol.14.-P.451-455.

258. Yamamura K.„ F. Tashiro, S. Yi, S. Wakasugi, S. Araki, S. Maeda and K. Shimada. Transgenic mouse model for human genetic diseasea. Mol. Reprod. Dev. 1993; 36:248

259. Yamazaki Y., Fujimoto H., Ando H., et. al.// Biol. Reprod., 1998; 59: 1439-1444

260. Yannoutsos N., G A. Langford, E. Cozzi, R. Lancaster, K. Elsome, P. Chen and D. J. G. White. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation. Transplant. 1995; 27: 324

261. Yom H., Bremel R. Genetic engineering of milk composition: Modification of milk components in lactating transgenic animals // J. Clin. Nutr. 1993. - Vol. 58. -P.2995.

Информация о работе

Елагин, Владимир Викторович
кандидата биологических наук
п. Горки Ленинские, Московской обл., 2002
ВАК 03.00.23

Диссертация

Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы