Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов

Пахомов, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов"

Российская академия наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи УДК 577 112, 577 336

Пахомов Алексей Александрович

Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов

специальность 03.00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□03065419

Москва - 2007

003065419

Работа выполнена в группе химии хромопротеинов Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель*

Кандидат химических наук

В. И Мартынов

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор

Л. Д Румш

Кандидат химических наук

Е. В. Бабаев

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится 10 октября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан 7 сентября 2007 г

Заместитель председателя

диссертационного совета

член-корр РАН, доктор химических наук

В М Липкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его гомологи нашли широкое применение в современной молекулярной и клеточной биологии благодаря уникальному свойству образовывать хромофор из собственных аминокислот без участия внешних кофакторов за исключением молекулярного кислорода Таким образом, цвет флуоресцентного белка кодируется его геном Эта особенность позволяет использовать GFP-подобные белки для решения таких задач, как мечение белков, слежение за экспрессией генов, исследование транспорта и взаимодействий белков в живой клетке Помимо этого, варианты GFP-подобных белков могут быть использованы как внутриклеточные биосенсоры pH, окислительно-восстановительного потенциала, ионов Са2+ и др

К настоящему времени цветовая палитра, образуемая флуоресцентными белками перекрывает видимую область спектра от синего до дальне-красного Такое цветовое разнообразие определяется в основном структурой хромофора В природных GFP-подобных белках хромофор формируется путем циклизации аминокислот X-Tyr-Gly полипептидной цепи белка, сопровождающейся дегидратацией и дегидрогенированием В результате образуется хромофор, 4-(и-гидроксибензилиден)-5-имидазолон, характеризующийся флуоресценцией с максимумом эмиссии при ~ 500 нм Такой "зеленый" хромофор может претерпевать различные модификации, в результате которых происходит расширение его л-системы, что в свою очередь приводит к батохромному сдвигу в спектрах белка

В большинстве белков, характеризующихся поглощением и эмиссией света в красной и дальне-красной области спектра (550 — 650 нм), расширение я-системы "зеленого" хромофора осуществляется за счет ацилиминной группы Красные флуоресцентные белки (RFP) представляют значительный интерес для современной клеточной биологии и биотехнологии, поскольку они, во-первых, расширяют спектральный диапазон, перекрываемый флуоресцентными белками, что позволяет одновременно вводить разноцветные флуоресцентные метки в различные белки-мишени Во-вторых, в отличие от GFP, при работе с красными флуоресцентными белками вклад автофлуоресценции клетки минимален Стоит также отметить, что ткани животных наиболее прозрачны в дальне-красном и инфракрасном диапазоне (650 — 900 нм), поэтому белки, обладающие эмиссией в этой области спектра, позволили бы изучать процессы в рамках целого организма Очевидно, что информация о структуре хромофора красных флуоресцентных белков и механизме постгрансляционных модификаций, приводящих к батохромному сдвигу, имеет большое значение как для создания новых генетически кодируемых внутриклеточных флуоресцентных меток, так и для улучшения свойств уже существующих

Цели исследования

Основной целью данной работы являлось изучение структурных основ спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов рода Zoanthus, а также изучение механизма образования хромофоров в этих белках

Научная новизна и практическая значимость работы

В исследованных к настоящему времени белках GFP-семейства способность к флуоресценции в красном диапазоне является результатом дополнительного окисления GFP-хромофора Эта реакция приводит к расширению л-электронной системы GFP-хромофора за счет образования C=N-C=0 заместителя В данной работе обнаружена новая посттрансляционная модификация хромофора, приводящая к смещению флуоресценции в красную область спектра Показано, что при созревании красного флуоресцентного белка из Zoanthus sp 2 (z2FP574) происходит реакция окислительного декарбоксилирования остатка аспаргиновой кислоты хромофоробразующей последовательности Asp-Tyr-Gly При изучении механизма этой батохромной модификации Z2FP574 было обнаружено, что на промежуточной стадии образуется зеленая флуоресцентная форма белка, содержащая хромофор GFP-типа Показано, что в ходе дальнейшего сопряженного окисления-декарбоксилирования происходит образование ацилиминной группы и, как результат, расширение я-системы хромофора Предложен механизм образования хромофора в z2FP574, который отличается от такового во всех других известных RFP

Полученная в данной работе информация о механизме образования "красного" хромофора в z2FP574 потенциально может быть использована для увеличения цветового разнообразия флуоресцентных белков, а также для улучшения их спектральных свойств Кроме того, z2FP574 является уникальным белком, поскольку в ходе его созревания сначала образуется зеленая флуоресцентная форма, превращающаяся со временем в красную Таким образом, Z2FP574 является флуоресцентным таймером Флуоресцентные метки на основе мономерного варианта z2FP574 можно было бы использовать для слежения одновременно за перемещением, локализацией и возрастом целевого белка

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на международных конференциях VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва — Пущино, 2006), 30-й FEBS конгресс — 9-я IUBMB конференция "Мир белков Белки и пептиды структура, функции и организация" (Венгрия, Будапешт, 2005), Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова (Москва, 2004), а также на XVI зимней молодежной научной школе

"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ

Структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 107 страницах и содержит 36 рисунков, 7 таблиц и 126 ссылок на литературные источники

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение структуры хромофора Z2FP574

Красный флуоресцентный белок из Zoanthus sp2 (z2FP574) характеризуется поглощением света в видимой области с максимумом при 552 нм и эмиссией при 574 нм, что характерно для большинства известных красных флуоресцентных белков Для изучения структуры его хромофора из полноразмерного белка был выделен небольшой пептид, содержащий хромофорную группировку (хромопептид) Протеолиз вели с использованием химотрипсина при рН 7,8 Белок предварительно денатурировали защелачиванием до рН 12 и затем быстро нейтрализовали добавленную щелочь Важно, что в этих условиях исключалась реакция гидролиза лабильной ацилиминной группы, присутствующей во всех известных красных флуоресцентных и хромобелках Полученный в результате протеолитического расщепления гидролизат разделяли при помощи ВЭЖХ Основную фракцию, содержащую очищенный хромопептид, использовали для дальнейших исследований

Для детального изучения структуры хромопептида были сняты его MALDI-TOF и ESI масс-спектры Исходя из первичной структуры Z2FP574 и известной специфичности химотрипсина, хромофорсодержащий пептид предположительно должен был иметь последовательность Ser^-Ala-Ala-Phe-Ayp-T^r-G/ji-Asn-Arg-Leu-Phe72, где Asp66-Tyr-Gly -хромофоробразующие ако Масса выделенного пептида составила 1193,6 Да (1194,6 m/z) Данное значение массы на 66 Да меньше, чем расчетная масса немодифицированного пептида, приведенного выше (1259,6 Да) В ходе созревания большинства красных белков образование хромофора происходит в результате одной стадии дегидратации (-18 Да) и двух стадий дегидрогенирования (-4 Да), что в результате дает потерю в массе относительно

^модифицированного пептида в 22 Да В г2РР574 молекулярная масса хромопептида уменьшена еще на 44 Да, что совпадает с дополнительной потерей С02 Для установления точной локализации модификаций хромопептида был снят тандемный масс-спектр хромопептида

; ^

Рис 1 Структура хромопептида z2FP574, полученного в результате расщепления белка химотрипсином Скобками обозначены наиболее важные ионы, образующиеся в ходе фрагментации при MS/MS анализе

В нем удалось обнаружить присутствие пика, соответствующего полноразмерному пептиду, а также всех возможных пиков, соответствующих фрагментации по пептидным связям (рис 1), что подтверждает первичную структуру хромопептида Однако анализ фрагментации в области хромофора показал, что Asp66 дегидрогенирован и дополнительно декарбоксилирован, те вместо Asp66 в хромофоре находится дегидроаланин Интересна также локализация двойной связи, возникшей при дополнительном окислении хромофора - в боковой цепи, хотя известно, что в нативных белках она локализована в основной цепи в составе ацилимина Данный эффект можно объяснить таутомеризацией ацилимина в енамид Очевидно, что разорвать двойную C=N связь существенно сложнее, чем одинарную, в результате чего в MS/MS спектрах видна только фрагментация енамида

Такой же эффект наблюдается в белке cgCP В нем хромофор образован из А1абз-Туг-Gly трипептида и содержит ацилимин в качестве батохромной модификации При установлении структуры его хромофора, в масс-спектрах двойная связь детектировалось также в боковой цепи Однако при замене А1а63 на Gly, у которого боковая цепь отсутствует, в cgCP происходило образование красной формы белка с максимумом поглощения близким к cgCP-WT Данный факт свидетельствует о том, что в нативном белке дополнительная двойная связь находится именно в составе ацилимина В Z2FP574 положение двойной связи в составе ацилимина, а также декарбоксилирование Asp66 в нативном белке позже было подтверждено кристаллографическими исследованиями (Pletneva et al, 2006)

Таким образом, при образовании хромофора х2¥Р51А происходит формирование ацилиминной группы, как и в большинстве других хромо- и красных флуоресцентных белков Однако этот процесс сопряжен также с декарбоксилированием, что отличает г2РР574 от других "красных" белков (рис 2)

2. Кинетические особенности созревания "красного" хромофора в

Для изучения механизма образования красного хромофора в Z2FP574 был проведен кинетический анализ процесса созревания белка Для этого свежетрансформированные клетки Е coli выращивали в жидкой среде, содержащей ампициллин, при 37°С в течение ночи Затем наработанный в Ecoli белок быстро выделяли при помощи металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA Полученный образец не имел поглощения в видимой области спектра, что свидетельствовало об отсутствии синтезированного хромофора За кинетикой созревания следили по изменению спектров поглощения во времени (рис 3)

Из спектров следует, что на ранних стадиях формирования хромофора образуется преимущественно зеленая форма с максимумом поглощения при 505 нм, тогда как со временем доминирующим становится поглощение красной формы с максимумом при 552 нм Были построены кинетические кривые по поглощению при 552 и 505 нм (рис 3, вставка) Анализ кривых показывает, что изменение концентрации красной формы имеет сигмовидный характер, что свидетельствует о существовании промежуточного продукта, предшествующего образованию "красного" хромофора С другой стороны, рост поглощения при 505 нм не может отражать кинетику образования "зеленого" хромофора, так как и зеленая, и красная формы белка поглощают при этой длине волны Так как полностью созревший белок не содержит зеленой формы, спектры поглощения белка, несущего "зеленый" хромофор, получали путем вычитания нормированных при 552 нм спектров поглощения красной формы из суммарного спектра белка Изменение концентрации зеленой формы, полученное после вычитания спектров, представлено на вставке рис 3 Видно, что в случае Z2FP574 именно зеленая форма является промежуточной при образовании красной

-Phe6/

Рис 2 Схема образования хромофора в z2FP574

Z2FP574

Это отличает г2БР574 от другого красного флуоресцентного белка ЬэЛеё, для которого также характерно образование зеленой формы хромофора, однако она не способна превращаться в красную

[

00-

400

500

600

Длина волны, нм

Рис 3 Кинетика созревания z2FP574 Изменение спектров поглощения z2FP574 в ходе созревания, на вставке показаны изменение поглощения во времени при 552 нм (а) и 505 нм (о), а также расчетное изменение поглощения зеленой формы при 505 нм (А)

3. Сравнительный мутагенез белков Z2FP574 и zFP506

Важной особенностью флуоресцентных белков из Zoanthus sp является присутствие представителей трех цветовых групп зеленой, желтой и красной, причем степень гомологии между ними составляет более 80% В нашей группе недавно была установлена кристаллическая структура z2FP574 (Pletneva et al, 2006) На основании данной структуры и гомологичного выравнивания (рис 4а) была построена модель ZFP506 (гомологичное моделирование, рис 46, в) Оказалось, что большинство отличающихся ако находятся на внешней поверхности белка, внутри же отличия минимальны, за исключением хромофора Хромофор zFP506 образован из Asn66-Tyr-Gly последовательности, тогда как в Z2FP574 он образован из Asp66-Tyr-Gly Поскольку окружение хромофора практически идентично в обоих белках, очевидно, что ключевую роль в его образовании играет первый хромофоробразующий ако Поэтому мы получили мутантные варианты zFP506 и z2FP574 с заменами в 66-й позиции

а)

мжклсуг ндЯзкис^

¿-■^ ^и чу еи /и ей

Езср.«:|#4'IРЛЕа:ида ¿1 гтЕУЕЯ: V =2Г£-:.-м

ОУ ЕКЯ БС рас; ГГМЯа.Т р| ЕЕЕЖЛУС1СИАШ Гч'|

ОТГРКЯЗС РАОУТиЬз щя^едус I С§№Т ту

теб^вг^ руикк^Иик ы е >с л?:: гр|

'НЕ£|.Г V £УМ РРЛ 0<?&УМК ВмЛиКЕРЗС ЕН;Г

1 (и ; си 11ги ¿ди ду ¿¿и

ьки-и ."чму ^пгЛу -ЧдкИь® г-и«: ¿г" кг ;! к Т1р Е ов £ а ^г г; ^ к ¡.чМ^вы н а л

Г.~Р51>Й

б)

В)

) (I -■■

у <

1вр/у ^

120Ш

(Т-

573/А

17ВУЛ.

Рис. 4. Структурное сравнение бея кон ¿2РР574 и %РР506. (а) Гомологичное выравнивание

первичных последовательностей г2РР5?4. и -ГР506. Отличающиеся а. к.о. выделены соответствующих! белку цветом, хромофоробразующая поспедоватепьноат, выделена прямоугольником: расположение всех отличающихся а,к.о. (б) на пространственной структуре оелка. (в) находящихся внутри р-бочки.

3.1. Свойства мутантиого белка гРР506 N660

Первым был получен мутангный вариант гРР506 с заменой Азпбб на Акр. Поскольку именно Акр находится в 66-й позиции г2РР574, а окружение хромофора в обоих белках практически идентично, следовало ожидать, что в гРР506 будет образовываться "красный" хромофор. После введения мутации красная форма белка действительно образовывалась, однако было обнаружено несколько существенных отличий от г2РР.>74.

Изучение кинетических особенностей образования "красного"хромофора я гРР50б N661) Образование красной формы оказалось существенно замедленным, по сравнению с г2РР574. Свежев ьще ленный белок содержал небольшое количество красной формы, однако со временем ее содержание увеличивались. При этом в спектрах поглощении в ходе Образования красной формы (максимум при им) наблюдалось падение поглощения зеленой (максимум при 496 им) (рис. 5а.). Таким образом, результаты, полученные на

мутанте 7ГР506 N661). подтверждают существование зеленой формы в качестве предшественника при образовании '"краснагя"

Следует отметить, что процесс зелено-красного превращения белка к значительной степени зависит от температуры. Так, при 4°С белок не обнаруживает Практически никакой конверсии в течение месяцев, тогда как при ?5°С для максимальной конверсии требуется менее 15 мин.

Для дальнейших исследований был получен белок в исходном ««конвертированном состоянии. Для -этого свежетрансформированпые клетки В. со:{ высеивали на чашки Петри с твердой питательной средой и выращивали в течение ночи при 37°С, После .этого белок созревал в течение нескольких дней при 4°С в клетках и затем был выделен на №-1МТА.

Чтобы Проследить кинетику образования красного хромофора. Полученный препарат белка ппкубирова.тн при 50°С и с интервалом в I ч снимали спектры поглощения (рис, 5а), Следует отмстить наличие изобестической точки в спектрам превращения белка из зеленой формы (496 нм) в красную (555 им). Такая особенность свидетельствует об отсутствии лол гожи су щнх промежуточных форм в ходе Конверсии.

Исследование зелено-красного превращения гРР506 N660 при помощи масс-спектр ОСКО пни

Для изучения структурных основ превращения белка из зеленого состояния в красное были проведены исследования белка на разных стадиях конверсии, С этой целью бьш проведен масс-спектром етри ч ее к и й анализ хромофор содержащих пептидов до и после конверсии белка. Для этого белок денатурировали и подвергали протеоли гпчес кому расщеплению химотрипсилом. Затем получившиеся хромопептиды разделяли при помощи ВЭЖХ аналогично разделению гидролизата 72ГР574. Выделенные хромопептиды анализировали масс-сцектрометрически.

Длина волны,нм

б)

1 У 1

Рис. 5. Изменение спектральных свойств 2ГИ506 N660 в ходе превращения его из зеленого в красный (а) Изменение спектров поглощения при 50°С, спектры записывали с интервалом в I ч; (б) изменение цвета белка, превращение остановлено при разных степенях конверсии.

Было выделено два хромопептида с m/z в масс-спектрах 1180,6 и 1226,6 Пик 1180,6 m/z соответствует пептиду Ser-Ala-Ala-Phe-^sp-Tyr-G/y-Asn-Arg-Val-Phe (1245,6 Да) за вычетом 66 Да Эти результаты соответствуют массе пептида, содержащего хромофор после циклизации-дегидратации (-Н20, 18 Да), двух стадий окисления (-4Н, 4 Да) и декарбоксилирования (-СОг, 44 Да) Таким образом, по структуре хромофор идентичен таковому в Z2FP574 и представляет красную форму белка Пик с 1226,6 m/z соответствует тому же пептиду, однако подвергшемуся только циклизации и единичному окислению (в сумме -20 Да) То есть, этот хромофор имеет структуру GFP-типа и соответствует зеленой форме белка

Для подтверждения структур выделенных хромопептидов были сняты тандемные масс-спектры обеих форм На основании результатов тандемной масс-спектрометрии пик с 1226,6 m/z действительно соответствует хромопептиду, содержащему хромофор GFP-типа, а в хромопептиде с 1180,6 m/z хромофор дополнительно окислен и декарбоксилирован, как и в случае с z2FP574 Для обоих образцов проводили сравнение а-,Ь-,с- и х-,у-,г-ионов в тандемных масс-спектрах Ионы, содержащие концевые фрагменты имели практически одинаковые значения m/z (в пределах ошибки масс-спектрометра), однако, между фрагментами, содержащими хромофоробразующий Asp, наблюдалась разница в 46 m/z Такое сравнение наглядно указывает на локализацию и характер протекающих модификаций - окисление и декарбоксилирование Asp66

Значительная зависимость скорости превращения zFP506 N66D от температуры позволила исследовать промежуточные продукты, образующиеся в ходе зелено-красного превращения белка Индуцированное нагреванием превращение можно остановить в любой момент охлаждением до 4°С (рис 56) "Замороженные" таким образом промежуточные продукты можно в дальнейшем исследовать различными методами

Для изучения промежуточных продуктов zFP506 N66D нагревали до 65°С и образцы белка отбирали через определенные интервалы времени Далее белок денатурировали и подвергали протеолитическому расщеплению химотрипсином, как описано выше, однако разделение хромопептидов при промощи ВЭЖХ не проводили Полученный таким образом химотриптический гидролизат сразу исследовали масс-спектрометрически, чтобы проанализировать все формы хромофора, возникающие в ходе конверсии белка (рис 6)

В исходном образце был обнаружен пик с m/z 1226,6, соответствующий, как было показано выше, пептиду, несущему хромофор GFP-типа В образцах, подвергшихся нагреванию, возникает дополнительный пик с m/z 1180,6, что соответствует дополнительно дегидрогенированному и декарбоксилированному хромопептиду (-46 Да) С увеличением времени инкубации белка при повышенных температурах увеличивается и относительное содержание дополнительно модифицированного хромопептида (1180,6 m/z)

Таким образом, при термоиндуцированной конверсии мутанта zFP506 N66D, так же как и в Z2FP574-WT, происходит превращение белка из зеленого в красный, причем данный процесс вызван дополнительным окислением и декарбоксилированием исходного хромофора GFP-типа В результате, как и в DsRed, но по другому механизму образуется ацилиминая группа, расширяющая я-систему хромофора Как следствие, происходит батохромный сдвиг в спектрах поглощения и флуоресценции

Также следует отметить, что в ходе масс-спектрометрических исследований на промежуточных стадиях превращения не было обнаружено только окисленной (-2 Да) или только декарбоксилированной (-44 Да) форм хромофора Данный факт, а также наличие изобестической точки в спектрах превращения белка (рис 5а) свидетельствует о том, что переход происходит без промежуточных продуктов Таким образом, можно говорить о сопряженном окислении-декарбоксилировании хромофора

Рис б Изменения в масс-спектре химотриптического гидролизата в ходе конверсии zFPSOö N66D (сверху вниз неконвертированный образец, после 40 и 250 мин при 65°С), а также структуры хромопептидов, соответствующие указанным значениям m/z

3.2 Проверка механизма Кольбе

Из литературных данных известно, что при фотоиндуцируемой конверсии GFP происходит окислительное декарбоксилирование Декарбоксилированию подвергается Glu222, находящийся в непосредственной близости от хромофора, но не входящий в его состав Предполагается, что данный процесс происходит по механизму Кольбе Мы проверили возможность декарбоксилирования по механизму Кольбе в белках из Zoanthus sp

Поскольку для декарбоксилирования по Кольбе в GFP необходим свет, была проверена зависимость от света процесса образования "красного" хромофора в Z2FP574 Для этого биосинтез белка проводили в темноте и выделяли его при тусклом свете красной лампы Затем Z2FP574 денатурировали и подвергали протеолитическому расщеплению

120-1

80-

<0 40 Ч

£ 01 ® 1160

1180,6 Ii.»

1160 12080-

1180

1180,6 I

Ii. Iii.

1180

1200

1226,6 #

1220

1240 m/z

1226 6 4

1220

1240 m/z

"120-, О

1160

НО.

1180,6 I

Ii. Mi,

1180

HO-^JpvA,

FAAS®

1225,6 Da

1200

NRVF72

1226,6 #

1220

1240 m/z

14 I и

FAAS®

1179,6 Da

NRVF72

химотрипсином, как описано выше В МАЬБ1-ТОР масс-спектре полученного гидролизата был обнаружен пик, соответствующий декарбоксилированному хромопептиду Других форм хромопептида обнаружено не было В спектрах поглощения и флуоресценции г2РР574 имел одинаковые характеристики вне зависимости от того, как он созревал в темноте, или на свету Таким образом, декарбоксилирование не зависит от света

Известно, что декарбоксилирование по Кольбе протекает по радикальному механизму, поэтому были сняты также ЭПР спектры гРР506 N660 в ходе его зелено-красного превращения ЭПР спектры снимали после осаждения белка 4М сульфатом аммония Для того чтобы исключить влияние воды, образец перед съемкой спектра замораживали в жидком азоте (высушенный образец был неспособен к конверсии) Нужно отметить, что большинство радикалов при температуре жидкого азота стабилизируется, что позволяет определить их g-фaктop В нашем случае радикалы, которые теоретически могли возникать при конверсии, также должны были бы стабилизироваться

Конверсию запускали нагреванием белка до 80°С Снятый спектр образца практически не отличался от такового для исходного белка Таким образом, в ходе конверсии радикалы либо не образуются вообще, либо их стационарная концентрация слишком мала для регистрации в данных условиях Полученные результаты указывают на то, что механизм Кольбе в данном случае маловероятен

3 3 Влияние декарбоксилирования на окисление хромофора

Исходя из приведенных выше результатов, образование "красного" хромофора во флуоресцентных белках из 7оап1кш яр протекает по механизму, значительно отличающемуся от других ОРР-подобных белков Целью дальнейших исследований стало изучение факторов, влияющих на образование красного хромофора белков из 1оапЛих яр, а также выяснение механизма этого процесса Прежде всего, мы проверили, будет ли происходить дополнительное окисление хромофора и образование красной формы белка после "выключения" реакции декарбоксилирования Для этого был получен ряд мутантных вариантов 22РР574 с заменой в 66-й позиции

Свойства мутантного белка 7.2ГР574 ОббА

Алании является декарбоксилированным вариантом аспаргиновой кислоты Заменой

ОббА в белке г2РР574, мы имитировали процесс декарбоксилирования до начала синтеза

хромофора и далее проверяли, будет ли осуществляться дополнительное окисление

Выделенный белок имел зеленую окраску и в спектрах поглощения имел один максимум в

видимой области при 491 нм Также красная форма не обнаруживалась и в спектрах

флуоресценции белка При возбуждении светом 490 нм наблюдалась интенсивная эмиссия с

максимумом при 506 нм, однако в области 570 нм флуоресценция не детектировалась Таким

образом, в z2FP574 D66A присутствует только зеленая форма, и "красный" хромофор не синтезируется

z2FP574 D66A денатурировали закислением уксусной кислотой до рН~3 После денатурации белок подвергали протеолитическому расщеплению пепсином Выделенный при помощи ВЭЖХ хромопептид исследовали масс-спектрометрически Масса хромопептида оказалась равна 1048,5 Да (1049,5 m/z) Это значение на 20 Да меньше массы немодифицированного пептида Ser-Ala-Ala-Phe-zi/a-Zj-r-G/y-Asn-Arg-Leu (1068,5 Да), что соответствует одной стадии дегидратации и одной стадии дегидрирования (хромофор GFP-типа, рис 7а) Таким образом, предварительное "удаление" карбоксильной группы приводит к образованию хромофора GFP-типа, который не подвергается последующему окислению

Рис 7 Установленные структуры хромофоров мутантных вариантов z2FP574

Свойства мутантного белка z2FP574 D66N

Так как в мутанте Z2FP574 D66N карбоксильная группа Asp66 замещена на амидную, декарбоксилирование не должно происходить Эту замену мы также использовали для изучения влияния декарбоксилирования на окисление

Полученный мутантный белок z2FP574 D66N характеризовался поглощением с максимумом при 492 нм и флуоресценцией с максимумом эмиссии при 506 нм, что характерно для зеленых флуоресцентных белков Никаких следов красной формы, как и в случае с z2FP574 D66A, обнаружено не было В масс-спектрах выделенного хромопептида был обнаружен пик с m/z 1092,5, что соответствует массе пептида Ser-Ala-Ala-Phe-//.?«-Туг-G(y-Asn-Arg-Leu за вычетом 20 Да То есть, при образовании хромофора происходит одна стадия дегидратации и одна стадия дегидрирования, как и случае с другими белками, имеющими хромофор GFP-типа Таким образом, при замене карбоксильной группы на амидную, дополнительного окисления хромофора не происходит (рис 76)

Кроме того, был изучен хромофор ZFP506, который также содержит остаток Asn в 66-й позиции Этот белок характеризуется поглощением при 494 нм и эмиссией при 506 нм, и является типичным зеленым флуоресцентным белком Для установления структуры

Зеленая форма

Красная форма

Z2FP574 D66A

Z2FP574 D66N

Z2FP574 D66E

хромофора, из белка zFP506 был выделен хромопептид, который далее анализировали при помощи масс-спектрометрии Хромопептид имел m/z 1225,6, что соответствует пептиду Ser-Ala-Ala-Phe-/4™-7>r-G/y-Asn-Arg-Val-Phe (1244,6 Да) за вычетом 20 Да Таким образом, при образовании хромофора zFP506 происходят те же модификации, что и в других исследованных зеленых флуоресцентных белках Полная структура хромопептида была подтверждена при помощи тандемной масс-спектрометрии

Свойства мутантного белка z2FP574 D66E

Далее был получен вариант Z2FP574 с заменой D66E В этом мутанте, как и в Z2FP574-WT, первый хромофоробразующий заместитель содержит карбоксильную группу, однако она изолирована от участка окисления дополнительной метиленовой группой В результате, потенциально возможные процессы окисления и декарбоксилирования не должны влиять друг на друга С помощью этой мутации мы хотели разобщить эти два процесса, чтобы проверить могут ли они протекать независимо друг от друга, а также установить, какая из двух реакций является первичной

Рис 8 Спектральные свойства мутантного белка z2FPS74 D66E а) Спектр поглощения (пунктирная линия - спектр белка с 5-кратной концентрацией), б) Спектры возбуждения (—) и эмиссии (—) флуоресценции красной формы

Полученный белок имел ярко выраженное поглощение в зеленой области спектра с максимумом при 491 им, однако в спектре поглощения был обнаружен небольшой пик с максимумом при 552 нм (рис 8а), то есть образовывалась и красная форма белка Однако выход красной формы был очень низким по сравнению с зеленой Первоначально красную форму удалось детектировать только в спектрах флуоресценции при возбуждении на 550 нм, с максимумом эмиссии при 570 нм (рис 86) Нагревание образца не приводило к увеличению ее содержания

Для изучения структуры хромофора обеих форм, белок подвергали протеолитическому расщеплению пепсином, как и в случае с другими мутантными вариантами Z2FP574 С помощью ВЭЖХ удалось разделить хромопептиды, представляющие

зеленую и красную формы (36 и 38 % ацетонитрила соответственно) Оба выделенных хромопептида были проанализированы масс-спектрометрически

В масс-спектре основной фракции был обнаружен пик с m/z 1107,5, что соответствует пептиду Ser-Ala-Ala-Phe-G/w-7>r-Gfy-Asn-Arg-Leu (1126,5 Да) с массой уменьшенной на 20 Да (хромофор GFP-типа, рис 7в) В масс-спектре второй фракции был обнаружен пик с m/z 1105,5, то есть GFP-хромофор дополнительно окислен, но не декарбоксилирован (рис 7г) Для уточнения модификаций, возникших в ходе образования хромофоров, были сняты тандемные масс-спектры, при помощи которых была подтверждена первичная структура хромопептидов, а также структуры хромофоров

Таблица 1 Свойства изученных мутантных и исходных белков из Zoanthus sp

Белок "AbSmax, МП 2)ЕХп,ах, ПШ 3)Emmax, nm Модификации GFP-хромофора

Зел Краен Зел Краен Зел Краен Зел Краен

Z2FP574 (D66) 505* 552 505* 552 521* 574 —2Н, -С02

z2FP574 D66A 491 491 506 0

z2FP574 D66N 492 492 506 0

z2FP574 D66E 491 552** 491 552" 506 570** 0 -2Н

zFP506 (N66) 494 494 506 0

zFP506 N66D 496 555 496 555 510 585 0 —2Н, -С02

1) максимум поглощения,

2) максимум возбуждения флуоресценции,

3) максимум эмиссии флуоресценции,

Зеленая форма со временем исчезает,

**Выход красной формы был довольно низким

Таким образом, при образовании красной формы г2РР574 Л66Е окисление хромофора не сопровождается декарбоксилированием Однако, выход реакции окисления в этом случае значительно ниже по сравнению с белками, содержащими остаток аспаргиновой кислоты в составе хромофора Свойства исходных и мутантных белков суммированы в таблице 1

На основании сравнительного мутагенеза белков г2РР574 и гРР506 можно сделать ряд выводов Во-первых, анализ мутанта гР'Р506 N660 показал, что при образовании красной формы белка происходит сопряженное окисление-декарбоксилирование хромофора, приводящее к образованию ацилиминной группировки Во-вторых, было установлено, что именно зеленая ионизованная форма хромофора является предшественником красной, что хорошо видно на спектрах превращения гРР506 N660 (рис 5а) В других известных красных

флуоресцентных и хромобелках хромофор образуется из нейтральной "синей" (максимум поглощения при ~ 400 нм) формы, тогда как образующаяся "зеленая" не способна к превращению в "красную" В-третьих, "выключение" реакции декарбоксилирования путем удаления или замены карбоксильной группы приводит к исчезновению красной формы, либо к существенному снижению ее выхода в случае Z2FP574 D66E мутанта Таким образом, во флуоресцентных белках из Zoanthus sp реакция декарбоксилирование существенно влияет на дополнительное окисление хромофора GFP-типа

4. Инициация Z2FP574 механизма в других белках. Влияние окисления на декарбоксилирование хромофора

При изучении окисления-декарбоксилирования хромофора в белках из Zoanthus sp было обнаружено, что обе реакции, окисление и декарбоксилирование, проходят с хорошим выходом только в том случае, если первым хромофоробразующим остатком является остаток аспарагиновой кислоты Замена Asp66 на другие заместители, приводит к выключению реакции декарбоксилирования, и как результат, к уменьшению выхода красной формы, либо к полному ее отсутствию

Влияние окисления на декарбоксилирование исследовали путем введения Asp в хромофоробразукяцую последовательность белков, способных образовывать красную форму, и белков, у которых нет каталитической системы, отвечающей за дополнительное окисление GFP-хромофора (во всех известных к настоящему времени красных флуоресцентных белках хромофор дополнительно окислен по сравнению с хромофором GFP)

4.1. Введение Asp в хромофор зеленых белков

В зеленых флуоресцентных белках отсутствует каталитическая система, отвечающая за дополнительное окисление хромофора Было важно проверить, будет ли осуществляться декарбоксилирование аспартата в составе хромофора белков, в которых реакция дополнительного окисления протекать не может В качестве целевого белка изначально был выбран GFP Однако после введения аспартата вместо серина в позицию первого хромофоробразующего остатка (мутация S65D) белок терял способность к образованию зрелого хромофора Выделенный после мутагенеза белок не имел поглощения в видимой области спектра Такую особенность можно объяснить изменением локального окружения хромофора, в результате чего может меняться ориентация, как каталитических групп, отвечающих за синтез хромофора, так и самой хромофоробразующей последовательности Хотя введение аспартата в хромофоробразующую последовательность GFP оказалось неудачным, Asp удалось ввести в хромофор флуоресцентного белка из кораллового полипа

Dendronephthya sp (DendFP) Введение мутации не влияло на его способность к синтезу "зеленого" хромофора

DendFP интересен тем, что при освещении УФ-светом меняет цвет флуоресценции с зеленого на красный Мы провели структурные исследования этого процесса Оказалось, что в ходе конверсии белок фрагментируется в области хромофора, образованного из His62-Tyr-Gly трипептида При помощи масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР спектроскопии короткого хромофорсодержащего пептида конвертированного белка было показано, что фрагментация сопровождается образованием дополнительной двойной связи Са=Ср в боковой цепи His62 При этом происходит расширение я-системы хромофора за счет имидазольной группы His62 Такой же процесс фотоконверсии происходит в белке Kaede, а также ряде других белков, хромофор которых образован из His-Tyr-Gly трипептида (Mizuno et al, 2003, Nienhaus et al, 2005) Предполагается, что образование новой двойной связи при фотоконверсии происходит по механизму элиминирования, не связанному с окислением Таким образом, в DendFP может происходить образование красного хромофора, однако в ходе данного процесса не протекает никаких окислительно-восстановительных реакций, а конверсия белка из зеленого состояния в красное обусловлена наличием His62 и требует интенсивного облучения УФ-светом

Мутант DendFP с заменой H62D оказался способен к синтезу хромофора и имел ярко выраженное поглощение в зеленой области спектра с максимум при 493 нм В целом спектр поглощения мутанта практически ничем не отличался от белка дикого типа (рис 9а) Красная форма не была обнаружена ни в исходном состоянии, ни при облучении белка УФ-светом, ни при нагревании

Несмотря на отсутствие в белке красной формы, необходимо было проверить, произошло ли декарбоксилирование Asp62 Для этого детатурированный DendFP H62D подвергали протеолитическому расщеплению с использованием пепсина при рН~3 Полученный гидролизат анализировали масс-спектрометрически В полученном масс-спектре был обнаружен основной пик с m/z 1236,5, который соответствует массе на 20 Да

а)

300 400 500 600 V .—и

Длина волны, нм

Рис 9 Спектры поглощения DendFP-WT и DendFP H62D (а), а также структура хромофора DendFP H62D (б)

меньшей, чем для немодифицированного пептида Thr-Thr-Ala-Leu-^.sp-7>r-G/y-Asn-Arg-Val-Phe, аналогично другим хромопептидам, содержащим хромофор GFP-типа (рис 96)

Таким образом, GFP-хромофор, образованный из Asp-Tyr-Gly трипептида, не декарбоксилируется, если реакция дополнительного окисления не проходит Чтобы проверить, насколько важно окисление для дальнейшего декарбоксилирования аспартата хромофора, был получен мутантный вариант хромобелка cgCP A66D

4.2. Мутагенез сдСР

Хромобелок из Condylactis gigantea (cgCP) является типичным дальне-красным белком и имеет максимум поглощения в видимой области спектра при 571 нм Его хромофор образован из Ala63-Tyr-Gly последовательности Этот белок интересен тем, что дополнительное окисление и образование красного хромофора в нем может происходить практически независимо от характера первого хромофоробразующего остатка

Нами были получены мутантные варианты cgCP с заменами A63Q, A63N, А63Е, А63Н, A63G Во всех белках происходило образование красной формы, даже при отсутствии боковой цепи 63-го остатка в случае A63G мутанта Такое поведение cgCP отличает его от белков из Zoanthus sp, в которых первый хромофоробразующий остаток играет ключевую роль при образовании красного хромофора

Структурные исследования хромофора cgCP при помощи масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР спектроскопии показали, что в ходе посттрансляционных модификаций белка образуется хромофор GFP-типа, расширенный ацилиминной группой, аналогично хорошо изученному красному флуоресцентному белку DsRed Таким образом, при образовании красной формы происходит дополнительное окисление GFP-хромофора Для того, чтобы проверить, будет ли дополнительное окисление хромофора приводить к декарбоксилированию первого хромофоробразующего остатка, был получен мутант cgCP A63D

После введения мутации образовывалась только красная форма, правда, для созревания мутанта требовалось больше времени, чем для белка дикого типа В спектре поглощения присутствует ярко выраженный пик с максимумом при 571 нм — как и в случае с cgCP-WT (рис 10а) Очевидно, что введение мутации не влияло на способность белка к формированию красного хромофора

Для установления структуры хромофора белок денатурировали закислением до рН~3 и подвергали протеолитическому расщеплению пепсином После разделения гидролизата с помощью ВЭЖХ была получена одна основная фракция, поглощающая при 385 нм Выделенный таким образом хромопептид был проанализирован масс-спектрометрически В

масс-спектре был обнаружен пик с m/z 994,3 Данное значение соответствует пептиду Ser-Vro-Cys-Cys-Asp-Tyr-Gly-Ser-Lys-Jhr за вычетом 66 Да, как и в случае с Z2FP574

Таким образом, при созревании cgCP A63D GFP-хромофор дополнительно окисляется и декарбоксилируется, а Asp63 превращается в дегидроаланин В результате, хромофор мутанта имеет такую же структуру, как и cgCP-WT, у которого он образован из Ala-Tyr-Gly последовательности (рис 106)

Рис 10 Спектры поглощения cgCP-WT и cgCP A63D (а), а также структура хромофора

Выше было показано, что дополнительное окисление, приводящее к образованию красного хромофора, в белках из Zoanthus sp может эффективно протекать только в том случае, если этот процесс сопряжен с декарбоксилированием Исследования мутантных вариантов других белков с заменой первого хромофоробразующего а к о на Asp показали, что окисление также имеет большое влияние на декарбоксилирование, и если стадия дополнительного окисления в белке проходить не может, то декарбоксилирование также не протекает Таким образом, реакции окисления и декарбоксилирования взаимосвязаны

5. Механизм декарбоксилирования в Z2FP574

Полученные данные позволяют предложить механизм, по которому происходит окислительное декарбоксилирование в белках из Zoanthus sp Выше было показано, что при синтезе в белке "красного" хромофора сначала образуется зеленая форма, содержащая ионизированный хромофор GFP-типа Образование "красного" хромофора происходит в результате последующего окисления-декарбоксилирования первого хромофоробразующего остатка — Asp66 Протекающие реакции окисления и декарбоксилирования Asp66 приводят к образованию ацилиминной группировки, расширяющей я-систему хромофора

Несмотря на то, что обе реакции взаимосвязаны, очевидно, что окисление играет основную роль, так как после "выключения" реакции декарбоксилирования дополнительное окисление может протекать, хоть и со значительно меньшим выходом (в мутанте z2FP574 D66E) С другой стороны, если "выключена" реакция окисления, то декарбоксилирование протекать не может То есть, дополнительное окисление хромофора

cgCP A63D (б)

является ключевой реакцией Можно предположить, что в ходе дополнительных модификаций GFP-хромофора сначала происходит его окисление (рис 11а, б)

Однако следует отметить, что окислению подвергается 'зеленая" депротонированная форма хромофора, и это, по-видимому, играет ключевую роль при декарбоксилировании Asp66, так как сильно влияет на распределение зарядов в хромофоре До окисления C-N связи ее амидный атом азота связан с атомом водорода, а свободная электронная пара находится в сопряжении с л-системой карбонильного кислорода (обычная пептидная связь, рис 11а) После окисления образуется двойная C=N связь, которая находится в сопряжении с я-системой хромофора и карбонильным кислородом (рис 116), свободная электронная пара азота в этой структуре будет располагаться перпендикулярно общей я-системе, в результате чего она может выступать в роли основания и акцептировать протон от карбоксильной группы (рис 11в) Акцептированию протона будет способствовать также общий отрицательный заряд я-системы, так как хромофор, как отмечалось выше, депротонирован Отрицательный и положительный заряды будут нейтрализовываться, приводя к образованию незаряженной я-системы (рис 11г) Образующаяся при этом ионизованная карбоксильная группа Asp66 должна далее эффективно декарбоксилироваться

Известно, что для органических соединений довольно легко проходит декарбоксилирование р-кето карбоновых кислот, к примеру - ацетилацетата р-кето группа стабилизирует промежуточно образующийся карбанион, возникающий сразу после высвобождения СОг, и облегчает тем самым протекание реакции Также известно, что в ферментативных реакциях декарбоксилирование облегчается за счет стабилизации промежуточного карбаниона

В г2БР574 образующийся после декарбоксилирования карбанион может эффективно стабилизироваться я-системой хромофора (рис Пд) По сути, возникающая на р-углероде неподеленная электронная пара будет расширять исходную л-систему, а отрицательный заряд перераспределится в основном на фенольный атом кислорода (рис 11е) Образующийся таким образом енамид может таутомерно изомеризоваться в энергетически более выгодный ацилимин (рис 11ж) Равновесие последней стадии сильно сдвинуто в сторону ацилимина также за счет дополнительного сопряжения С=Ы связи с соседней С=0 связью (РЬе65)

Таким образом, исходное депротонированное состояние имеет существенное значение при декарбоксилировании Аврбб Во-первых, оно повышает основность атома азота в составе ацилимина, способствуя тем самым депротонированию карбоксильной группы Аярбб Во-вторых, формирующаяся после депротонирования Аэрбб тг-система является эффективным стабилизатором образующегося карбоаниона (рис 11д), отрицательный заряд которого будет сразу же переноситься на фенольный атом кислорода

Предложенный механизм объясняет протекание декарбоксилирования при образовании хромофора в г2РР574, однако не понятно, каким образом происходит дополнительное окисление, которое играет ключевую роль в ходе батохромной модификации В других известных красных флуоресцентных и хромобелках хромофор образуется из промежуточной синей формы (поглощение ~ 400 нм), которая предположительно является протонированным ОРР-хромофором (УегЫнкЬа с1 а!, 2004) Эта синяя форма может дополнительно окисляться, превращаясь в конечную красную (депротонированный ОРР-хромофор. расширенный ацилиминной группировкой) Однако, если синяя форма депротонируется, то образуется зеленая форма, неспособная к дополнительному окислению (депротонированный ОБР-хромофор) Данный процесс, к примеру, происходит в белке ОзРес1

В г2РР574 ситуация сильно отличается, и именно зеленая депротонированная форма, имеющая хромофор ОРР-типа, способна к дополнительному окислению Более того, окисление в 22РР574 только тогда эффективно проходит, когда оно сопряжено с декарбоксилированием Таким образом, механизм образования красного хромофора в г2РР574 принципиально отличается от такового в других флуоресцентных белках подсемейства DsR.ec! На их различие указывает также тот факт, что остатки 8ег68 и вег/ТИг! 12 (нумерация по ОРР), консервативные во всех других красных белках, в 22РР574 замещены на Аэп и Не соответственно Предполагается, что они имеют каталитическую роль при образовании хромофора в белках ОвКес^подсемейства, о чем свидетельствует ряд экспериментов по мутагенезу этих белков (Оигекауа е1 а1, 2001)

Отсутствие каталитических остатков, участвующих в образовании ацшшмина неизбежно должно компенсироваться включением другого механизма, облегчающего дополнительное окисление По-видимому, в г2¥?51Л таким альтернативным механизмом является сопряженное окисление-декарбоксилирование Ранее отмечалось, что протеканию химических реакций может способствовать стабилизация промежуточных продуктов В БэЛес! образующийся ацилимин является конечным продуктом Поскольку хромофор г2БР574 депротонирован, его первый хромофоробразующий остаток Аэрбб может легко декарбоксилироваться Образованию ацилимина, являющегося промежуточным продуктом, вероятно, будет способствовать эффективно проходящее последующее декарбоксилирование

6. Перспективы использования процесса сопряженного окисления-декарбоксилирования флуоресцентных белков в биотехнологии

К настоящему времени в литературе отсутствует достоверная информация о том, каким образом происходит дополнительное окисление ОРР-хромофора во флуоресцентных белках Исследование этой проблемы особенно актуально, так как на данном этапе развития биотехнологии существует огромное число внутриклеточных зондов на основе ОРР-подобных белков Однако многие из этих белков имеют существенные недостатки, такие как побочная рН-чувствительность и фотонестабильность Следует отметить, что красные и особенно дальне-красные флуоресцентные белки имеют низкую яркость по сравнению с зелеными

Для биотехнологии в настоящее время значительный интерес представляют белки способные к эмиссии в дальне-красной и инфракрасной (650 - 900 нм) области спектра Эти белки позволили бы изучать процессы в рамках всего организма, так как ткани животных в данном диапазоне наиболее прозрачны Таким образом, расширение ряда представителей флуоресцентных белков с улучшенными свойствами представляет значительный интерес для современной биохимии и клеточной биологии

Полученная в данной работе информация о механизме образования "красного" хромофора в г2РР574 может быть использована для увеличения цветового разнообразия флуоресцентных белков за счет включения описанного механизма в белках, где изначально он протекать не может В этой работе путем мутагенеза удалось инициировать окислительное декарбоксилирование хромофора в зеленом флуоресцентном белке гРР506 и в результате превратить его из зеленого в красный Дальнейшие работы в направлении модификации вРР-хромофора по пути окислительного декарбоксилирования, могли бы привести к созданию новых красных флуоресцентных белков на основе существующих

зеленых, с сохранением их свойств (мономерность, рН-стабильность, фотостабильность либо других)

Кроме этого, Z2FP574 является также уникальным, поскольку в ходе созревания белка сначала образуется зеленая форма хромофора, которая потом превращается в красную и проявляет, таким образом, свойства флуоресцентного таймера Ранее на основе DsRed путем направленного мутагенеза был создан белок способный менять свой цвет с зеленого на красный во времени (Е5) (Terskikh et al, 2000) Этот белок получил название флуоресцентного таймера, так как позволяет следить за возрастом продукта экспрессии на основе соотношения между зеленой и красной флуоресценцией Однако в Е5 зелено-красное превращение осуществляется за счет FRET между мономерами в составе тетрамерного комплекса Изменение цвета Е5 происходило за счет того, что скорость образования зеленого хромофора больше чем красного, и на начальных стадиях созревания доминирует зеленая флуоресценция Однако, как только накапливается красная форма, происходит относительно быстрый рост эмиссии в красной области спектра за счет FRET, а интенсивность зеленой флуоресценции падает Надо отметить, что при этом образовавшийся "зеленый" хромофор неспособен к превращению в "красный"

В случае с Z2FP574 также наблюдается зелено-красное превращение белка, однако оно происходит быстрее, чем в случае с Е5 и позволяет изучать более быстрые процессы Наиболее же важным отличием Z2FP574 от Е5 является способность именно хромофора белка к превращению из зеленой формы в красную Эта особенность позволила бы получить на основе Z2FP574 мономерный таймер Очевидно, что после мономеризации Е5 потеряет способность к зелено-красной конверсии Мономеризация z2FP574 не приведет к потере его способности к конверсии Таким образом, Z2FP574 является истинным флуоресцентным таймером Мономерные метки на его основе существенно расширили бы область применения флуоресцентных таймеров и позволили бы одновременно следить за перемещением, локализацией и возрастом целевого белка

выводы

1 Установлено, что в красном флуоресцентном белке из ХоапЛт яр 2 (г2РР574) батохромный сдвиг осуществляется за счет расширения я-системы хромофора СИР-типа ацилиминной группой

2 Изучена кинетика образования хромофора в белках из ХоамЬш Показано, что в отличие от других известных ОБР-подобных белков на промежуточной стадии образуется зеленая флуоресцентная форма, которая затем превращается в красную

3 Исследованы структурные основы зелено-красного превращения флуоресцентных белков в ходе их созревания Показано, что исходная зеленая форма содержит хромофор ОРР-типа, тогда как при образовании красной формы происходит дополнительное окисление и декарбоксилирование хромофора

4 Показано, что реакции окисления и декарбоксилирования взаимосвязаны и в значительной степени зависят от природы первого хромофоробразующего аминокислотного остатка

5 Предложен механизм окислительного декарбоксилирования в процессе синтеза "красного" хромофора, согласно которому образующийся на промежуточной стадии карбанион стабилизирован л-электронной системой хромофора

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 A A Pakhomov, N V Pletneva, Т A Balashova, V I Martynov Structure and Reactivity of the Chromophore of a GFP-like Chromoprotem from Condylactis gigantea // Biochemistry, 2006 Vol 45, No 23, P 7256-7264

2 А А Пахомов, H Ю Мартынова, H Г Гурская, Т А Балашова, В И Мартынов Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp // Биохимия, 2004, том 69, вып 8, с 1108-1117

3 V I Martynov, В I Maksimov, N Y Martynova, A A Pakhomov, N G Gurskaya, S A Lukyanov A Purple-blue Chromoprotem from Goniopora tenuidens Belongs to the DsRed Subfamily of GFP-like Protems // The Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol 278, No 47, P 46288-46292

4 A A Pakhomov, N V Pletneva, V I Martynov The molecular basis for the green to red conversion of the fluorescent protem from Dendronephthya sp // 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary 2nd-7th July, 2005, FEBS Journal, 2005, Vol 272, Supplement 1, P 384

5 А А Пахомов, В И Мартынов Новая посттрансляционная модификация хромофора белка GFP-семейства Исследование механизма декарбоксилирования белка Z2FP574 из Zoanthus sp 2 // Международная конференция VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва - Пущино, 25-27 октября 2006, тезисы докладов, с 15

6 А А Пахомов, В И Мартынов Превращения хромофора GFP-подобного белка из Condylactis gigantea // XVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии", Москва, 9-12 февраля, 2004, тезисы докладов, с 36

7 А А Пахомов, Т А Балашова, В И Мартынов Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp // Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова, Москва, 4-7 октября 2004, тезисы докладов, с 48

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН Москва, ул Миклухо-Маклая 16/10, тел (495) 336-47-22 Заказ № 415, тираж 100 экз Уел пл 1,5 Подписано в печать 03 09 2007

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Пахомов, Алексей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Пространственная структура GFP-подобных белков.

1.2. Влияние структуры хромофора на спектральные свойства.

1.2.1. Хромофор GFP-типа.

1.2.2. "Красный" хромофор DsRed-типа.

1.2.3. Варианты расширения я-системы GFP-хромофора, сопровождающиеся фрагментацией белка.

1.2.4. Замена ароматического заместителя в хромофоре GFP.

1.3. Окружение хромофора: тюнинг цвета в GFP-подобных белках.

1.3.1. Стекинг-взаимодействия с хромофором.

1.3.2. Ионизация хромофора.

1.3.3. Конформационное состояние хромофора определяет безизлучательное хромо), либо флуоресцентное состояние белка.

1.3.4. Влияние других аминокислотных остатков в окружении хромофора.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Штаммы.

2.1.3. Питательные среды для роста бактерий.

2.1.4. Синтетические олигонуклеотиды.

2.2. Биосинтез и выделение белка.

2.2.1. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток штамма JM109.

2.2.1.2. Приготовление компетентных клеток штамма XL 1-Blue.

2.2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК.

2.2.2. Экспрессия генов рекомбинантных белков.

2.2.3. Выделение рекомбинантных белков.

2.3. Мутагенез.

2.3.1. Сайт-направленный мутагенез.

2.3.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

2.3.4. Количественные определения препаратов ДНК.

2.3.5. Секвенирование ДНК.

2.4. Денатурация и протеолиз белка.

2.4.1. Денатурация в кислых условиях и протеолиз белка пепсином.

2.4.2. Денатурация в щелочных условиях и протеолиз белка химотрипсином.

2.5. Выделение хромопептидов.

2.6. УФ-видимая спектрофотометрия и флуорометрия.

2.7. ЭПР-спектрометрия.

2.8. Масс-спектрометрия.

2.9. Компьютерное моделирование пространственной структуры белка.

2.10. Кинетический анализ созревания белка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение структуры хромофора Z2FP574.

3.1.1. Биосинтез и выделение белка Z2FP574.

3.1.2. Денатурация и протеолиз белка Z2FP574.

3.1.3. Выделение хромопептида.

3.1.4. Масс-спектрометрические исследования хромопептида.

3.1.5. Зависимость синтеза хромофора z2FP574 от света.

3.2. Кинетические особенности созревания "красного" хромофора в Z2FP574.

3.3. Сравнительный мутагенез белков Z2FP574 и zFP506.

3.3.1. Мутагенез, экспрессия генов мутантных форм белка, их выделение и очистка.

3.3.2. Свойства мутантного белкаzFP506 N66D.

3.3.2.1. Изучение кинетических особенностей образования "красного" хромофора в zFP506 N66D.

3.3.2.2. Исследование зелено-красного превращения zFP506 N66D при помощи масс-спектроскопии.

3.3.2.3. Изучение механизма конверсии zFP506 N66D с помощью ЭПР.

3.3.3. Влияние декарбоксилирования на окисление хромофора.

3.3.3.1. Свойства мутантного белка z2FP574 D66A.

3.3.3.2. Свойства мутантного белка z2FP574 D66N.

3.3.3.3. Свойства мутантного белка z2FP574 D66E.

3.4. Инициация Z2FP574 механизма в других белках. Влияние окисления на декарбоксилирование хромофора.

3.4.1. Введение Asp в хромофор зеленых белков.

3.4.2. Мутагенез cgCP.

3.5. Механизм декарбоксилирования хромофора Z2FP574.

3.6. Перспективы использования процесса сопряженного окисления-декарбоксилирования флуоресцентных белков в биотехнологии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов"

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его гомологи нашли широкое применение в современной молекулярной и клеточной биологии благодаря уникальному свойству образовывать хромофор из собственных аминокислот без участия внешних кофакторов за исключением молекулярного кислорода [1,2, 3, 4, 5, 6]. Таким образом, цвет флуоресцентного белка кодируется его геном. Эта особенность находит применение в in vivo мечении клеточных объектов и позволяет использовать GFP-подобные белки для решения таких задач, как мечение белков [7], слежение за экспрессией генов [8], исследование транспорта и взаимодействий белков [9]. Помимо этого, варианты GFP-подобных белков, могут быть использованы как внутриклеточные биосенсоры рН [10], окислительно-восстановительного потенциала [11], ионов Са [12] и др.

К настоящему времени цветовая палитра, образуемая известными флуоресцентными белками, перекрывает видимую область спектра от синего до дальне-красного [13, 14, 15, 16]. Такое цветовое разнообразие определяется в основном структурой хромофора. В природных GFP-подобных белках хромофор формируется путем циклизации аминокислот X-Tyr-Gly полипептидной цепи белка, сопровождающейся дегидратацией и дегидрогенированием [17]. В результате образуется хромофор, 4-(л-гидроксибензилиден)-5-имидазолон [18], характеризующийся флуоресценцией с максимумом эмиссии .при -500 нм. Такой "зеленый" хромофор может претерпевать различные модификации, в результате которых происходит расширение его я-системы, что в свою очередь приводит к батохромному сдвигу в спектрах белка [19]. В большинстве белков, характеризующихся поглощением и эмиссией света в красной и дальне-красной области спектра (550 - 650 нм), расширение л-системы "зеленого" хромофора осуществляется за счёт ацилиминной группы [20].

Красные флуоресцентные белки (RFP) представляют значительный интерес для современной клеточной биологии и биотехнологии, поскольку вместе с голубыми, зелеными и жёлтыми позволяют одновременно вводить разноцветные флуоресцентные метки в различные белки-мишени. Кроме того, в отличие от прочих GFP-подобных белков, при работе с красными флуоресцентными белками вклад автофлуоресценции клетки минимален. Также стоит отметить, что ткани животных наиболее прозрачны в дальне-красном и инфракрасном диапазоне (650 - 900 нм), поэтому белки, обладающие эмиссией в этой области спектра, позволили бы изучать процессы в рамках целого организма [2]. Очевидно, что информация о структуре хромофора красных флуоресцентных белков и механизме посттрансляционных модификаций, приводящих к батохромному сдвигу, имеет большое значение как для создания новых генетически кодируемых внутриклеточных флуоресцентных меток, так и для улучшения свойств уже существующих.

Среди всех известных красных флуоресцентных белков, особый фундаментальный интерес представляет красный флуоресцентный белок из Zoanthus sp.2 (z2FP574). Во-первых, следует отметить, что среди флуоресцентных белков из кораллового полипа рода Zoanthus встречаются представители трех цветовых групп: зеленой, желтой и красной, причем степень гомологии между ними составляет более 80%. Во-вторых, принадлежность к той или иной спектральной группе жестко связана с характером первого а.к.о. хромофоробразующей X-Tyr-Gly последовательности. Так в желтом флуоресцентном белке необходимым требованием является присутствие Lys в позиции X. В красном же белке из Zoanthus sp.2 в этой позиции необходим остаток аспарагиновой кислоты. Интересно, что в этом белке на промежуточной стадии созревания образуется зеленая флуоресцентная форма [21].

В настоящей работе проведено изучение химических основ спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов рода Zoanthus. При исследовании структуры хромофора Z2FP574 была обнаружена новая посттрансляционная модификация, приводящяя к образованию красной флуоресцентной формы белка. С помощью мутагенеза удалось замедлить реакции синтеза хромофора и изучить промежуточные продукты. Структурный анализ хромофоров промежуточных форм, а также ряда мутантов флуоресцентных белков из коралловых полипов позволили предложить механизм, по которому происходит превращение из зеленого флуоресцентного состояния в красное.

1. Обзор литературы

Флуоресцентные белки: зависимость спектральных свойств от структуры хромофора и его окружения

GFP был выделен из люминесцентной медузы Aequorea victoria ещё в 1962 г. [22]. Однако в то время белок не вызывал особого интереса у ученых. Настоящий переворот произошел после клонирования гена белка в 1992 г. [23], когда стало возможным использование GFP в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки. Впервые GFP был использован в качестве маркера генной экспрессии в 1994 г. [8]. За несколько последующих лет область применения GFP существенно расширилась. На основе GFP были получены различные варианты, с эмиссией от синего до желтого света [13], что позволило использовать флуоресцентные белки для изучения взаимодействий биомолекул с использованием безизлучательного переноса энергии между флуоресцентными метками (FRET - fluorescence resonance energy transfer) [24,25].

Открытие GFP-подобных белков из коралловых полипов класса Anthozoa в 1999 г [26] позволило существенно расширить палитру флуоресцентных белков. Эти белки имеют степень гомологии с GFP около 30%, а один из клонированных белков - DsRed имел яркую флуоресценцию в красной области спектра (583 нм). Позже число GFP-подобных белков расширилось до нескольких десятков [27]. Некоторые из белков коралловых полипов обладали уникальными свойствами, нехарактерными для GFP. В частности, asCP оказался способным к обратимой фотоактивации из хромо- (нефлуоресцентного) состояния во флуоресцентное [28], а ряд белков (mcavFP, rfloFP, DendFP, Kaede, EosFP) оказались способными к необратимой фотоконверсии из зеленой формы в красную [27, 29]. Такая особенность новых белков позволила получить генетически кодируемые флуоресцентные метки для прицельного фотомечения белков in vivo [30, 31]. Недавно были клонированы гены GFP-подобных белков из медуз класса Hydrozoa, а также из морских рачков класса Copepoda [32]. На основе хромобелка anm2CP в дальнейшем удалось получить фототоксический флуоресцентный белок KillerRed, который при освещении зеленым светом генерировал активные формы кислорода, вызывая при этом в зависимости от условий гибель клетки либо инактивацию целевого белка [33]. Такое разнообразие свойств и применений GFP-подобных белков обусловлено их необычной структурой и, в особенности, структурой хромофора и его физико-химическими свойствами. Данный обзор посвящен анализу влияния структуры хромофора и его окружения на спекральные свойства белков семейства GFP.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пахомов, Алексей Александрович

Выводы

1. Установлено, что в красном флуоресцентном белке из Zoanthus sp.2 (z2FP574) батохромный сдвиг осуществляется за счёт расширения л-системы хромофора GFP-типа ацилиминной группой.

2. Изучена кинетика образования хромофора в белках из Zoanthus. Показано, что в отличие от других известных GFP-подобных белков на промежуточной стадии образуется зеленая флуоресцентная форма, которая затем превращается в красную.

3. Исследованы структурные основы зелено-красного превращения флуоресцентных белков в ходе их созревания. Показано, что исходная зеленая форма содержит хромофор GFP-типа, тогда как при образовании красной формы происходит дополнительное окисление и декарбоксилирование хромофора.

4. Показано, что реакции окисления и декарбоксилирования взаимосвязаны и в значительной степени зависят от природы первого хромофоробразующего аминокислотного остатка.

5. Предложен механизм окислительного декарбоксилирования в процессе синтеза "красного" хромофора, согласно которому образующийся на промежуточной стадии карбанион стабилизирован л-электронной системой хромофора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Пахомов, Алексей Александрович, Москва

1. Zhang J., Campbell R. E., Ting A. Y., Tsien R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. II Nat RevMol Cell Biol, 2002, Vol. 3, N. 12, P. 906-918.

2. Verkhusha V. V., Lukyanov K. A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. // Nat Biotechnol, 2004, Vol. 22, N. 3, P. 289-296.

3. Chudakov D. M., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. // Trends Biotechnol, 2005, Vol. 23, N. 12, P. 605-613.

4. Dixit R., Cyr R., Gilroy S. Using intrinsically fluorescent proteins for plant cell imaging. II Plant J, 2006, Vol. 45, N. 4, P. 599-615.

5. Tsien R. Y. Breeding and building molecules to spy on cells and tumors. // Keio J Med, 2006, Vol. 55, N. 4, P. 127-140.

6. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. II Nat Methods, 2005, Vol. 2, N. 12, P. 905-909.

7. Fradkov A. F., Verkhusha V. V., Staroverov D. В., Bulina M. E., Yanushevich Y. G., Martynov V. I., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Far-red fluorescent tag for protein labelling. // Biochem J, 2002, Vol. 368, N. Pt 1, P. 17-21.

8. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Prasher D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. // Science, 1994, Vol. 263, N. 5148, P. 802-805.

9. Wouters F. S., Verveer P. J., Bastiaens P. I. Imaging biochemistry inside cells. // Trends Cell Biol, 2001, Vol. 11, N. 5, P. 203-211.

10. Miesenbock G., De Angelis D. A., Rothman J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. II Nature, 1998, Vol. 394, N. 6689, P. 192-195.

11. Ostergaard H., Henriksen A., Hansen F. G., Winther J. R. Shedding light on disulfide bond formation: engineering a redox switch in green fluorescent protein. // Embo J, 2001, Vol. 20, N. 21, P. 5853-5862.

12. Miyawaki A., Griesbeck 0., Heim R., Tsien R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. // Proc Natl Acad Sci USA, 1999, Vol. 96, N. 5, P. 2135-2140.

13. Tsien R. Y. The green fluorescent protein. // Annu Rev Biochem, 1998, Vol. 67, N. P. 509-544.

14. Matz M. V., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A. Family of the green fluorescent protein: journey to the end of the rainbow. // Bioessays, 2002, Vol. 24, N. 10, P. 953-959.

15. Wang L., Jackson W. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. // Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, Vol. 101, N. 48, P. 16745-16749.

16. Wachter R. M. Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein. // Acc Chem Res, 2007, Vol. 40, N. 2, P. 120-127.

17. Cody C. W., Prasher D. C., Westler W. M., Prendergast F. G., Ward W. W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. II Biochemistry, 1993, Vol. 32, N. 5, P. 1212-1218.

18. Remington S. J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. // Curr Opin Struct Biol, 2006, Vol. 16, N. 6, P. 714-721.

19. Prescott M., Battad J. M., Wilmann P. G., Rossjohn J., Devenish R. J. Recent advances in all-protein chromophore technology. // Biotechnol Annu Rev, 2006, Vol. 12, N. P. 31-66.

20. Янушевич Ю. Г., Гурская H. Г., Староверов Д. Б., Лукьянов С. А., Лукьянов К. А. Природный флуоресцентный белок, изменяющий цвет флуоресценции в ходе созревания. // Биоорганическая химия, 2003, Vol. 29, N. 4, Р. 356-360.

21. Shimomura О., Johnson F. Н., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. // J Cell Comp Physiol, 1962, Vol. 59, N. P. 223-239.

22. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. // Gene, 1992, Vol. 111,N. 2, P. 229-233.

23. Miyawaki A., Tsien R. Y. Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. II Methods Enzymol, 2000, Vol. 327, N. P. 472-500.

24. Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., Lukyanov S. A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. II Nat Biotechnol, 1999, Vol. 17, N. 10, P. 969-973.

25. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., Matz M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. II Proc Natl Acad Sci USA, 2002, Vol. 99, N. 7, P. 4256-4261.

26. Chudakov D. M., Feofanov A. V., Mudrik N. N., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. // J Biol Chem, 2003, Vol. 278, N. 9, P. 7215-7219.

27. Miyawaki A. Green fluorescent protein-like proteins in reef Anthozoa animals. // Cell Struct Fund, 2002, Vol. 27, N. 5, P. 343-347.

28. Henderson J. N., Remington S. J. The kindling fluorescent protein: a transient photoswitchable marker. II Physiology (Bethesda), 2006, Vol. 21, N. P. 162-170.

29. Miyawaki A. Fluorescent proteins in a new light. // Nat Biotechnol, 2004, Vol. 22, N. 11, P. 1374-1376.

30. Bulina M. E., Chudakov D. M., Britanova О. V., Yanushevich Y. G., Staroverov D. В., Chepurnykh Т. V., Merzlyak E. M., Shkrob M. A., Lukyanov S., Lukyanov K. A. A genetically encoded photosensitizer. // Nat Biotechnol, 2006, Vol. 24, N. 1, P. 95-99.

31. Ormo M., Cubitt А. В., Kallio K., Gross L. A., Tsien R. Y., Remington S. J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Science, 1996, Vol. 273, N. 5280, P. 1392-1395.

32. Yarbrough D., Wachter R. M., Kallio K., Matz M. V., Remington S. J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. // Proc Natl Acad Sci USA, 2001, Vol. 98, N. 2, P. 462-467.

33. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A. J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R. J., Rossjohn J. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigmentreveals a nonplanar chromophore conformation. // Structure, 2003, Vol. 11, N. 3, P. 275-284.

34. Yang F., Moss L. G., Phillips G. N., Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. // Nat Biotechnol, 1996, Vol. 14, N. 10, P. 1246-1251.

35. Ward W. W., Cody C. W., Hart R. C., Cormier M. J. Spectrophotometry identity of the energy transfer chromophores in Renilla and Aequorea green-fluorescent proteins. // Photochem Photobiol, 1980, Vol. 31, N. 6, P. 611-615.

36. Ward W. W., Prentice H. J., Roth A. F., Cody C. W., Reeves S. C. Spectral perturbations of the Aequorea green-fluorescent protein. // Photochem Photobiol, 1982, Vol. 35, N. 6, P. 803-808.

37. Ward W. W., Cormier M. J. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. IIJ Biol Chem, 1979, Vol. 254, N. 3, P. 781-788.

38. Morise H., Shimomura O., Johnson F. H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. // Biochemistry, 1974, Vol. 13, N. 12, P. 2656-2662.

39. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. // Proc Natl Acad Sci USA, 1999, Vol. 96, N. 20, P. 11241-11246.

40. Nagai Т., Sawano A., Park E. S., Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. // Proc Natl Acad Sci USA, 2001, Vol. 98, N. 6, P. 3197-3202.

41. McAnaney Т. В., Park E. S., Hanson G. Т., Remington S. J., Boxer S. G. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 2. Excited-state dynamics. II Biochemistry, 2002, Vol. 41, N. 52, P. 15489-15494.

42. McAnaney Т. В., Shi X., Abbyad P., Jung H., Remington S. J., Boxer S. G. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. // Biochemistry, 2005, Vol. 44, N. 24, P. 8701-8711.

43. Wachter R. M., Remington S. J. Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate. // Curr Biol, 1999, Vol. 9, N. 17, P. R628-629.

44. Jayaraman S., Haggie P., Wachter R. M., Remington S. J., Verkman A. S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. IIJ Biol Chem, 2000, Vol. 275, N. 9, P. 6047-6050.

45. Bulina M. E., Chudakov D. M., Mudrik N. N., Lukyanov K. A. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. // BMC Biochem, 2002, Vol. 3, N. P. 7.

46. Phillips G. N., Jr. Structure and dynamics of green fluorescent protein. // Curr Opin Struct Biol, 1997, Vol. 7, N. 6, P. 821-827.

47. Zacharias D. A., Violin J. D., Newton A. C., Tsien R. Y. Partitioning of lipid-modified monomelic GFPs into membrane microdomains of live cells. // Science, 2002, Vol. 296, N. 5569, P. 913-916.

48. Campbell R. E., Tour 0., Palmer A. E., Steinbach P. A., Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. A monomelic red fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA, 2002, Vol. 99, N. 12, P. 7877-7882.

49. Karasawa S., Araki Т., Yamamoto-Hino M., Miyawaki A. A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomelic version for use in fluorescent labeling. IIJ Biol Chem, 2003, Vol. 278, N. 36, P. 34167-34171.

50. Karasawa S., Araki Т., Nagai Т., Mizuno H., Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. II Biochem J, 2004, Vol. 381, N. Pt 1, P. 307-312.

51. Gurskaya N. G., Fradkov A. F., Terskikh A., Matz M. V., Labas Y. A., Martynov V. I., Yanushevich Y. G., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. // FEBS Lett, 2001, Vol. 507, N. 1,P. 16-20.

52. Reid B. G., Flynn G. C. Chromophore formation in green fluorescent protein. // Biochemistry, 1997, Vol. 36, N. 22, P. 6786-6791.

53. Heim R., Prasher D. C., Tsien R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA, 1994, Vol. 91, N. 26, P. 12501-12504.

54. Wachter R. M., Elsliger M. A., Kallio K., Hanson G. Т., Remington S. J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. II Structure, 1998, Vol. 6, N. 10, P. 1267-1277.

55. Miyawaki A., Nagai Т., Mizuno H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. // Curr Opin Chem Biol, 2003, Vol. 7, N. 5, P. 557-562.

56. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A. V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. // Science, 2000, Vol. 290, N. 5496, P. 15851588.

57. Verkhusha V. V., Chudakov D. M., Gurskaya N. G., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. // Chem Biol, 2004, Vol. 11, N. 6, P. 845-854.

58. Gross L. A., Baird G. S., Hoffman R. C., Baldridge К. K., Tsien R. Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci USA, 2000, Vol. 97, N. 22, P. 11990-11995.

59. Wall M. A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. // Nat Struct Biol, 2000, Vol. 7, N. 12, P. 1133-1138.

60. Shu X., Shaner N. C., Yarbrough C. A., Tsien R. Y., Remington S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. // Biochemistry, 2006, Vol. 45, N. 32, P. 9639-9647.

61. Mizuno H., Mai Т. K., Tong К. I., Ando R., Furuta Т., Ikura M., Miyawaki A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. IIMol Cell, 2003, Vol. 12, N. 4, P. 1051-1058.

62. Nienhaus K., Nienhaus G. U., Wiedenmann J., Nar H. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. II Proc Natl Acad Sci USA, 2005, Vol. 102, N. 26, P. 9156-9159.

63. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. II Proc Natl Acad Sci USA, 2002, Vol. 99, N. 20, P. 12651-12656.

64. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. // EMBO Rep, 2005, Vol. 6, N. 3, P. 233-238.

65. Remington S. J., Wachter R. M., Yarbrough D. K., Branchaud В., Anderson D. C., Kallio K., Lukyanov K. A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. // Biochemistry, 2005, Vol. 44, N. 1, P. 202-212.

66. Quillin M. L., Anstrom D. M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D. M., Remington S. J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. II Biochemistry, 2005, Vol. 44, N. 15, P. 5774-5787.

67. Tretyakova Y. A., Pakhomov A. A., Martynov V. I. Chromophore Structure of the Kindling Fluorescent Protein asFP595 from Anemonia sulcata. // J Am Chem Soc, 2007, Vol. 129, N. 25, P. 7748-7749.

68. Yampolsky I. V., Remington S. J., Martynov V. I., Potapov V. K., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistry, 2005, Vol. 44, N. 15, P. 5788-5793.

69. Heim R., Tsien R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. // Curr Biol, 1996, Vol. 6, N. 2, P. 178-182.

70. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J. M., Adams J. A., Ikura M., Tsien R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. IINature, 1997, Vol. 388, N. 6645, P. 882-887.

71. Violin J. D., Zhang J., Tsien R. Y., Newton A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. // J Cell Biol, 2003, Vol. 161, N. 5, P. 899-909.

72. Palm G. J., Zdanov A., Gaitanaris G. A., Stauber R., Pavlakis G. N., Wlodawer A. The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein. // Nat Struct Biol, 1997, Vol. 4, N. 5, P. 361-365.

73. Rizzuto R., Brini M., De Giorgi F., Rossi R., Heim R., Tsien R. Y., Pozzan T. Double labelling of subcellular structures with organelle-targeted GFP mutants in vivo. // Curr Biol, 1996, Vol. 6, N. 2, P. 183-188.

74. Cubitt А. В., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. // Trends Biochem Sci, 1995, Vol. 20, N. 11, P. 448-455.

75. Sniegowski J. A., Lappe J. W., Patel H. N., Huffman H. A., Wachter R. M. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. IIJ Biol Chem, 2005, Vol. 280, N. 28, P. 26248-26255.

76. Pletneva N., Pletnev S., Tikhonova Т., Popov V., Martynov V., Pletnev V. Structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2006, Vol. 62, N. Pt 5, P. 527-532.

77. Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. // Science, 2004, Vol. 306, N. 5700, P. 1370-1373.

78. Wilmann P. G., Turcic K., Battad J. M., Wilce M. C., Devenish R. J., Prescott M., Rossjohn J. The 1.7 A crystal structure of Dronpa: a photoswitchable green fluorescent protein. IIJMolBiol, 2006, Vol. 364, N. 2, P. 213-224.

79. Habuchi S., Ando R., Dedecker P., Verheijen W., Mizuno H., Miyawaki A., Hofkens J. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. /I Proc Natl Acad Sci USA, 2005, Vol. 102, N. 27, P. 9511-9516.

80. Chudakov D. M., Verkhusha V. V., Staroverov D. В., Souslova E. A., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. // Nat Biotechnol, 2004, Vol. 22, N. 11, P. 1435-1439.

81. Chudakov D. M., Belousov V. V., Zaraisky A. G., Novoselov V. V., Staroverov D. В., Zorov D. В., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. II Nat Biotechnol, 2003, Vol. 21, N. 2, P. 191-194.

82. Gurskaya N. G., Savitsky A. P., Yanushevich Y. G., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. // BMC Biochem, 2001, Vol. 2, N. P. 6.

83. Terskikh A. V., Fradkov A. F., Zaraisky A. G., Kajava A. V., Angres B. Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. // J Biol Chem, 2002, Vol. 277, N. 10, P. 7633-7636.

84. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci USA, 2000, Vol. 97, N. 22, P. 11984-11989.

85. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. // Gene, 1985, Vol. 33, N. 1,P. 103-119.

86. Bullock W. O., Fernande J. M., Sort J. M. XLl-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. // Biotechniques, 1987, Vol. 5, N. 4, P. 376-378.

87. Guex N. Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis, 1997, Vol. 18, N. 15, P. 2714-2723.

88. Hoops S., Sahle S., Gauges R., Lee C., Pahle J., Simus N., Singhal M., Xu L., Mendes P., Kummer U. COPASI~a COmplex PAthway Simulator. // Bioinformatics, 2006, Vol. 22, N. 24, P. 3067-3074.

89. Пшежецкий С. Я., Котов А. Г., Милинчук В. К., Рогинский В. А., Тупиков В. И. (1972) ЭПР свободных радикалов в радиационной химии, Химия, Москва.

90. Роберте Д., Касерио М. (1978) Основы органической химии, 2т., Издание 2-е, дополненое, "Мир", Москва.

91. Highbarger L. A., Gerlt J. A., Kenyon G. L. Mechanism of the reaction catalyzed by acetoacetate decarboxylase. Importance of lysine 116 in determining the pKa of active-site lysine 115.// Biochemistry, 1996, Vol. 35, N. 1, P. 41-46.

92. Tao X., Yang Z., Tong L. Crystal structures of substrate complexes of malic enzyme and insights into the catalytic mechanism. // Structure, 2003, Vol. 11, N. 9, P. 1141-1150.

93. Chang G. G., Tong L. Structure and function of malic enzymes, a new class of oxidative decarboxylases. II Biochemistry, 2003, Vol. 42, N. 44, P. 12721-12733.

Информация о работе

Пахомов, Алексей Александрович
кандидата химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы