Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоконверсия окрашенных белков из коралловых полипов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фотоконверсия окрашенных белков из коралловых полипов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Чудаков Дмитрий Михайлович

ФОТОКОНВЕРСИЯ ОКРАШЕННЫХ БЕЛКОВ ИЗ КОРАЛЛОВЫХ ПОЛИПОВ

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории, генов регенерации Инсппуга биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю^.Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Лукьянов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, Л.И. Корочкин

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник, Г.В. Шпаковский

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики

Защита состоится 11 июня 2003 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002-019.01 при Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16-10.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Инсппуга биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 4 мая 2003 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

В.А. Несмеянов

Q_oo3-А S>Síí

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) из гидромедузы Aequorea victoria в 1992 году открыло широкие возможности для мечения белков, органелл и клеток m vivo. Сегодня количество опубликованных работ в области биологии и медицины, выполненных с использованием GFP и GFP-подобных белков, уже превысило десять тысяч. В 1999 году палитра GFP-подобных белков была значительно расширена - в нашей лаборатории были клонированы гены флуоресцентных белков и нефлуоресцентных окрашенных белков (хромобелков) из кишечнополостных организмов класса Artthozoa. Один из этих белков - asulCP - оказался способен к уникальной фотоконверсии из нефлуоресцентной в ярко флуоресцентную форму. До нашей работы не существовало объяснения явлению фотоактивации флуоресценции asulCP. Также это явление не находило практического применения в биотехнологии, в первую очередь ввиду короткого времени жизни активированного флуоресцентного состояния белка. Достигнутое в ходе работы понимание процессов, стоящих за фотоактивацией флуоресценции asulCP, позволило значительно продвинуться в изучении GFP-подобных флуоресцентных белков и хромобелков. Кроме того, наша работа сделала возможным направленное создание фотоактивируемых флуоресцентных белков (ФАФБ) с заданными свойствами. Полученные в ходе работы ФАФБ открывают возможности для прицельного флуоресцентного мечения и слежения за перемещением клеток, органелл и белков in vivo.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целями данной работы было изучение механизмов, лежащих в основе фотоактивации флуоресценции белка asulCP, а также разработка фотоактивируемых

_ 1JJ1. 'I._____

маркеров для прицельного флуоресцентного фотомечения объектов ш vivo.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения и экспериментальной части, а также выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах и содержит 24 иллюстрации и 108 ссылок на литературные источники.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые предложено объяснение явлению фотоактивации флуоресценции, а также тому, как структурные различия в микроокружении хромофора определяют свойства флуоресцентных белков и хромобелков кишечнополостных.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С Петербург

ОЭ Ш

шк,

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана группа фотоактивируемых флуоресцентных маркеров, имеющих большой потенциал применения в биотехнологии. Появление таких фотоактивируемых маркеров открывает возможности для прицельного введения флуоресцентного сигнала в выбранную группу клеток, единичную живую клетку, ей органеллу или участок. Становится доступным прямое флуоресцентное мечение и непосредственное слежение за перемещением объектов in vivo.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации "были доложены на международных конференциях: Русско-Малазийский семинар по биоорганической химии в Институте биоорганической химии (Москва, 2002 год), Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 год), 12-ый Международный Симпозиум «Bioluminescence & Chemiluminescence» (Великобритания, Кембридж, 2002 год), на симпозиуме INTAS «Chemical probes in biology» (Греция, Спетцес, 2002 год).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ. Морской анемон Anemonia sulcata встречается на скалистых берегах Атлантического океана и Средиземного моря. Настоящая работа посвящена изучению свойств фотоактивируемого белка asulCP, ген которого был клонирован из Anemonia sulcata в нашей лаборатории, и объяснению уникального явления фотоактивации флуоресценции этого белка. На базе asulCP и других GFP-подобных белков были разработаны фотоактивируемые флуоресцентные маркеры.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ФОТОАКТИВАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Спектры действия света фотоактивации и фотоинактивации флуоресценции

Исследуемый в работе нефлуоресцентный окрашенный белок asulCP становится ярко флуоресцентным в красной области спектра (фотоактивируется или «разгорается») в ответ на облучение зеленым светом и фотоинактивируется («тушится») при облучении синим светом. Используя различные источники освещения, мы установили расположение пиков спектров действия фотоактивирующего и фотоинактивирующего света. Облучение asulCP на длинах волн 532 нм, 543 нм и 546 нм вызывало выраженную фотоактивацию флуоресценции. В то же время, облучение светом 514 нм приводило лишь к незначительной фотоактивации и тушило предварительно разожженный asulCP, что указывает на перекрывание двух спектров действия - фотоактивации и фотоинактивации - в районе 514 нм. Облучение синим светом на длинах волн 458 нм, 430-490 нм и 460-490 нм не вызывало фотоактивации флуоресценции и мгновенно тушило разожженный asulCP. Точный спектр действия фотоинактивирующего света был снят для мупштного белка asulCP-A148G (см. Рис. 1С).

- Анализ окружения хромофора в GFP-подобных белках

К началу настоящей работы методом рентгеноструктурного анализа были разрешены структуры двух GFP-подобных белков - собственно GFP медузы Aequorea victoria, и красного флуоресцентного белка DsRed кораллового полипа. Согласно известной структуре, фенольный остаток Тугбб (центральной аминокислоты хромофора) в GFP стабилизирован Thr203 и HisI48, и образует с последним водородную связь.

Аминокислотный остаток в позиции 148 строго различается для флуоресцентных белков (ФБ) и нефлуоресцентных хромобелков (ХБ) коралловых полипов, аминокислотные последовательности которых известны на сегодняшний день (таблица 1). Известные ФБ (их более 20) содержат Serl48. Причем, подобно GFP, кристаллическая структура белка DsRed показывает, что фенольный остаток Тугбб хромофора стабилизирован за счет аминокислотного остатка 148, и, вероятно, в большинстве ФБ консервативный Ser 148 вовлечен в стабилизацию хромофора во флуоресцентном состоянии. В ХБ, за исключением исследуемого нами белка asulCP, остаток 148 это Cis либо Asn, в то время как asulCP содержит исключительный А1а148. Одновременно, asulCP проявляет и исключительные свойства, будучи способен находиться как в нефлуоресцентном окрашенном (хромо) так и во флуоресцентном состояниях.

Таблица 1, Аминокислотные остатки в позициях 148, 165 н 203 в белках Aequorea victoria GFP, хромобелхах н флуоресцентных белках коралловых полипов.

Белок хромофор 148 165 203

GFP

cgigCP hcriCP

aaspCP gtenCP

asulCP

hcriGFP asulGFP cgigGFP dstrGFP DsRed dis2RFP rfloGFP dis3GFP clavGFP dendGFP mcavRFP rfloRFP nnueGFP pfflGFP scubGFP scubGFP amajGFP zoanYFP zoanGFP mcavGFP

Aequorea victoria SYG H Anthozoa

Хромобелки AYG С AYG С EYG С QYG N QYG N Фотоактивируемый белок MYG A S Флуоресцентные белки

I

RYG QYG QYG QYG QYG QYG QYG QYG QYG HYG HYG HYG QYG QYG - QYG QYG " KYG KYG NYG DYG

D D R

V

V

V

V

V

V

V

V

V

L L I R R

H

L L L T S S H H H H H H H H H H H H H H

Единственная замена X148S делает любой ХБ и asulCP флуоресцентным, с параметрами возбуждения/эмиссии флуоресценции, соответствующими их исходным пикам поглощения. Вероятно, конфигурация

флуоресцентного хромофора и его взаимодействие с аминокислотным окружением в мутантах X148S хромобелков сходно с таковым у флуоресцентных белков. Позиция 203 не различается так четко для флуоресцентных и окрашенных белков, хотя большинство флуоресцентных белков содержат His203. Для дальнейших рассуждений важно, что, подобно Alal48, Serl65 также является исключительной аминокислотой asulCP (таблица 1). Как прешло, позиция 165 во флуоресцентных белках занята большими гидрофобными остатками (Ile, Val). Напротив, хромобелки содержат гидрофильный AsnlóS.

Мутагенез asutCP ■ свойства полученных мутантов

Мы исследовали способность к фотоактивации я фото инактивации белков asulCP, мутантных по положению 148, в комбинации либо с Ser 165 дикого типа, либо с мутацией S165V. His203 также был подвергнут мутагенезу, В таблице 2 представлены свойства полученных мутаятов.

Среди полученных исчерпывающим (по всем 20 вариантам аминокислот) мутагенезом Alai48 б asirfCP-мутангные белки с Gly, Ser, Cys, Asmi Thrl48 созревали в К cotí. Все эти мутанты были интенсивно окрашены, за исключением слабо созревающего А148Т. Мутанты

A148C.N потеряли способность к фотоактивации и оставались нефлуоресцентными, мутант A148G в целом сохранил свойства белка дикого типа, мутанты A148S.T стали флуоресцентными и сохранили способность к фотоактивации, хотя А148Т полностью потерял способность к фотоинактивации в синем свете.

Таким образом, изменения в позиции 148 существенно повлияли на флуоресценцию asulCP и его способность к фотоактивации, что объясняется важностью остатка Serl48 для стабилизации хромофора во ФБ. Удивительно, что изменения в этой позиции не привели к значительным изменениям в окраске (поглощении) белка.

Мутант asulCP-S165V обладал яркой красной флуоресценцией и полностью потерял способность к фотоакгивации и фотоинактивации. Более того, оказалось, что эта мутация делает белок asulCP флуоресцентным независимо от того, какая аминокислота занимает важнейшую позицию 148. Так, мутанты asulCP A148G,S,C,N/S165V оказались ярко флуоресцентными, и не способными ни к фотоинакгивации, ни к дополнительной фотоакгивации флуоресценции (мутант A148T/S165V плохо сворачивался). В то же время, все мутанты, содержащие замену S165V, были очень слабо окрашены по сравнению с диким типом asulCP или его мутантами А148Х.

Мутация His203 также влияла на способность asulCP к фотоакгивации. Мутант asulCP-A148S/H203S ярко флуоресцировал с максимумом эмиссии на 590 нм, и, в отличие от мутанта A148S, оказался неспособен к фотоакгивации и фотоинакгивации флуоресценции.

Модель фотоактивации asulCP

Можно предложить два объяснения явлению обратимого переключения asulCP из нефлуоресценгного окрашенного ("хромо") во флуоресцентное состояние - либо происходит изменение заряда хромофора, либо изменение касается его структуры и окружения. Известно, что нейтральная и анионная формы хромофора GFP имеют четко различаемые спектры возбуждения флуоресценции, с пиками при 3% и 476 нм, соответственно, но с близкими пиками эмиссии флуоресценции - при 508 и 503 нм. Необратимая фотоактивация GFP связана именно с изменением соотношения двух этих форм хромофора - наблюдается уменьшение интегральной интенсивности пика возбуждения при 3% нм и возрастание интегральной интенсивности пика возбуждения при 476 нм. В то же время, спектр возбуждения флуоресценции разожженного белка asulCP практически совпадает со спектром поглощения белка до фотоакгивации (Рис. 1 А).

Таблица 2. Свойства полученных мутантов белка аздЮР.

Отношение к Исходная

Фотоапх- Фотоиня- Предполагаемый

Мутация (и) другим белкам флуоресценция вацняв зеленом свете ктивация в синем свете

Дикий тип (А1а148, вег1б5) - Не флуоресцирует + +

А1488 Характерна дляФБ Флуоресцирует, 600 нм Дополнительное +

А148С Характерна для ХБ Не флуоресцирует - -

А148.М Характерна дляХБ Нет Не флуоресцирует Почти не - -

А148С известных примеров Нет флуоресцирует Слабо + +

А148Т известных примеров флуоресцирует слабая -

Я165У Характерна для ФБ Флуоресцирует, 620 нм - -

А148в, в165У Характерно для ФБ Нет Флуоресцирует, 615 нм Флуорес- - -

А148С, в165У известных примеров Нет цирует, 605 нм Флуорес-

А1481Ч, в1«У известных примеров Нет цирует, 605 нм Флуорес-

А1480, вКЙУ известных примеров цирует, 610 нм - -

гт203 с165

н я

в

с

н «^..в »V

Н

/

в

н в

т

Н-^,-8

А

"Vе-'

б

Из вышесказанного следует, что новое состояние, в которое попадает хромофор азиГСР после фотоахтявации, не может быть объяснено изменением заряда и скорее всего вызвано структурными изменениями. Существенное влияние температуры на время релаксации фсггоаггивированного азиГСР (немедленное охлаждение разожженной пробы белка на -70°С многократно продлевало время жизни активированного состояния) указывает на то, что процесс фотоактивации связан с информационными изменениями белка. Суммировав настоящие рассуждения и свойства полученных мутантов аэтЮР, мы предложили модель фотоактивации азиЮР, согласно которой фотоакгивация связана с транс-цис изомеризацией возбужденного хромофора (Рис. 2).

Рис. 1. Изменения > спектрах поглощения и возбуждения флуоресценции при ^»ишдирт» А. НЬрншзаншой спеггр поглощения вт1СР до фогошпивацин (сплошная линия) к спеетр возбуждения флуоресценции после фотоакпвации (прерывиста« явная). В. Разность спгпров полющего! разожженного и асходного бела аяч1СР-А1480. Основной пик поглощения при 56? им падает, в то же время наблюдается рост поглощения е питом при 445 им. С Относительное падение яркости флуоресценции мутантного белжа мСР-А1480 после облучения светом различной длины

i:

Так как Ser 148 (консервативный среди ФБ) делает asulCP флуоресцентным (после мутагенеза A148S), мы предположили, что в фотоактивированном состоянии конфигурация хромофора asulCP совпадает с таковой во флуоресцентных белках коралловых полипов и в GFP (Рис. 2С). Далее, если эффект фотоаксивации связан с транс-цис изомеризацией хромофора, то до фотоактивации фенольный остаток хромофора asulCP должен контактировать с Ser 165 (Рис. 2В). Это следует из известной структуры белка DsRed, где Пе165 локализован в плоскости хромофора и непосредственно контактирует с февольным остатком Тутбб (Рис. 2А). Такая организация окружения хромофора должна стеркчески препятствовать его цис-транс изомеризации в DsRed. Отсюда, мы предположили, что менее объемный Ser 165 в диком типе asulCP (в отличие от Ие165 в DsRed) стерически разрешает Е-

конфигурацию хромофора и, возможно, стабилизирует хромофор в этой конфигурации, соответствующей состоянию "хромо" (Рис. 2В). Мы предполагаем, что исходно в asuICP хромофор преимущественно находится именно в Е-конфигурации. В то же время, в возбужденном состоянии хромофор может претерпевать транс-цис изомеризацию, попадая во флуоресцентное состояние, близкое к таковому у GFP и DsRed (Рис. 2В,С). Именно замена SI65V делает asuICP флуоресцентным белком, и приводит к потере интенсивной окраски и способности к фотоактивашш/фотоииакгивации флуоресценции, свойственных белку дикого типа. Логично предположить, что "хромо" состояние хромофора (Е-конфигурация) блокировано в этом мутантном белке Vall65. Так как для GFP известно, что Thr203 принимает участие в стабилизации положения хромофора, a asuICP содержит His203, присутствующий в большинстве ФБ (Таблица 1), выглядит вероятным, что после фотоакгивации His203 принимает участие во временной стабилизации хромофора asuICP в Z-конфигурации.

Рис. 2. Окружение хромофора DsRed и модель фотоактивации asuICP. А. схематическое стереоизображение хромофора DsRed и выборочных аминокислотных остатков из микроокружения. А

В,С модель транс-цис изомеризации хромофора, приводящей к фотоакта нации asuICP. Схематическое изображение хромофора (известного для DsRed) и выборочных аминокислотных остатков из его микроокружения в "хромо" (В - до фотоактивации) и во флуоресцентном (С - после фотоакгивации) состояниях белка asuICP. Атомы углерода показаны серым, азота -синим, кислорода - красным Изображение получено с помощью программы Rasmol 2 6. Компьютерное моделирование для белка asuICP произвели с помогаью программ Swiss-Pdb Viewer и HyperChem 5.01, на базе известной структуры белка DsRed.

Предложенная модель хорошо объясняет свойства мутантов asuICP (Таблица 2). Так, мутантный белок asulCP-A148S обладает яркой флуоресценцией, и также может бьггь дополнительно фотоакгивирован зеленым или потушен синим светом. В течение нескольких минут после фотоактивации или фотоинамгивации, этот белок восстанавливает исходный уровень яркости флуоресценции. В рамках предложенной модели свойства мутанта A148S можно объяснить следующим образом: Serl48 стабилизирует хромофор во флуоресцентном

состоянии ^-конфигурация), подобно тому, как это происходит во ФБ. В то же время, некоторая равновесная доля хромофора остается стабилизированной 8ег165 в "хромо" состоянии (Е-конфигурация), что делает белок способным к дополнительной фотоактивации. В свою очередь, хромофор, находящийся во флуоресцентном состоянии может быть потушен — переведен в разрешенное состояние "хромо".

Мутанты ази1СР-А148С и ази1СР-А148М (оба варианта характерны для хромобелков) не способны к фотоактивации и остаются нефлуоресцентными, хотя и интенсивно окрашенными, с максимумами поглощения, близкими к дикому типу аядЮР. Мы предполагаем, что мутация А148СД*1 делает энергетически невыгодной флуоресцентную Ъ-конфигурацию хромофора, удерживая его в состоянии "хромо". Тем не менее, мутанты ази1СР-А148С,К с добавлением замены 8165У становятся ярко флуоресцентными и также не способны ни к дополнительной фотоактивации, ни к фотоинактивации флуоресценции, что может говорить о том, что все хромофоры блокированы во флуоресцентной г-конфигурации, которая оставалась неконкурентной в присутствии 8ег165.

Интересно, что цис-транс фотоизомеризация хромофора уже предлагалась ранее, в качестве возможного объяснения эффекта переключения СБР из флуоресцентного в долгоживущее "темновое" состояние. Вычисления показали, что вероятность цис-транс изомеризации для возбужденного хромофора вРР высока. Распространяя нашу модель на другие СРР-подобные белки, мы предположили, что две возможных конфигурации хромофора являются общими для вРР-подобных флуоресцентных, фотоактивируемых и хромобелков. Мы суммировали эту гипотезу в таблице 3, принимая начальную Ъ-конфигурацию хромофора ОБР как "цис", а темновое состояние как "транс". Уже в ходе написания настоящей работы (март 2003) это предположение в значительной степени подтвердилось - впервые были опубликованы данные о трехмерной структуре хромобелка и показано, что в хромобелке хромофор действительно цис-транс изомеризован относительно его состояния в белках вРР и ОзЯес!.

Таблица 3. Вероятные конфигурации хромофора в GFP-подобных белках.

Белок (белки) Z-конфигурацня хромофора (цвс-юомер) Е-конфигурация хромофора (транс-изомер)

GFP Исходное флуоресцентное состояние Темно вое состояние

Флуоресцентные белки коралловых полипов Исходное флуоресцентное состояние -

Хромобелки коралловых полипов - Исходное, "хромо" состояние

asulCP Фотоактивированное, флуоресцентное состояние Исходное, "хромо" состояние

Измерение параметров фотоактивации мутаитного белка asuICP-A148G

Свойства asulCP-A148G близки к таковым белка дикого типа. Это почти не флуоресцентный белок, способный к выраженной фотоактивации флуоресценции в зеленом и фотоинактивации в синем свете. Однако, время полужизни фотоактивированного состояния мутанта A148G составляет около 50 секунд, что в несколько раз дольше, чем для белка дикого типа. Это свойство позволило нам измерить и сравнить спектры поглощения белка до и после обратимой фотоактивации. Мы обнаружили, что интегральная интенсивность пика поглощения при 568 им значительно снизилась в ходе фотоактивации флуоресценции мутанта A148G (Рис. 1В, ЗА), и одновременно рост поглощения наблюдали в другой области, с пиком при 445 нм (Рис. 1В). В то же время, максимум возбуждения флуоресценции фотоактивированного asulCP-A148G находится при 575 нм (Рис. 1А), и значит, в разожженном белке хромофор поглощает свет на этой длине волны. Таким образом, существует по меньшей мере два возможных состояния хромофора в разожженном белке. В первом хромофор является флуоресцентным, с пиком возбуждения при 575 нм, а во втором поглощает свет с пиком при 445 нм. В этом втором состоянии Тугбб вероятно находится в протонированной форме, так как близкий максимум поглощения был ранее зарегистрирован для asulCP, денатурированного в кислой среде. Мы сняли спектр действия фотоинактивирутощего света, измерив падение яркости слабой исходной флуоресценции asulCP-A148G при различных длинах волн (Рис. 1С). Было показано, что оптимум тушения флуоресценции практически совпадает с пиком поглощения, возрастание которого можно наблюдать после фотоактивации asulCP-A148G (Рис. 1В). Таким образом, существование

протонированной формы хромофора в разожженном белке обусловливает эффект фотоинактивации флуоресценции, при облучении разожженного белка синим светом.

Перенос явления фотоактнвации на другие хромобелки

В подтверждение значения позиций 165, 148 и 203 для явления фотоактивации, а также с целью разработки новых вариантов фотоактивируемых флуоресцентных белков (ФАФБ), мы провели сайт-направленный мутагенез двух не способных к фотоактивации, нефлуоресцентных хромобелков коралловых полипов: hcriCP (из Heteractis crispa) и cgigCP (из Condilactis gigantea). В результате нам удалось перенести способность к фотоактивации флуоресценции на оба эти белка.

Дикий тип cgigCP содержит Cysl48, Asnl65 и Leu203 (Таблица 1). Единичная замена C148S делает этот белок флуоресцентным, с максимумом эмиссии при 620 нм, и также способным к дополнительной фотоактивации при облучении зеленым светом. Двойная замена cgigCP-C148S/N165S дала мутантный белок, который практически не обладал флуоресценцией и оказался способен к выраженной фотоактивации в зеленом свете. Мы также сделали несколько мутантных белков hcriCP, комбинируя замены аминокислотных позиций вокруг хромофора: Cysl48, Asnl65 и Пе203. Среди полученных мутантов, hcriCP-C148S/N165S/I203H и hcriCP-C148A/N165G/I203H обладали выраженной способностью к фотоактивации флуоресценции. Оба эти мутантных белка обладают очень слабой исходной флуоресценцией и ярко разгораются при облучении зеленым светом.

Новый тип фотоактивации

Новый тип фотоактивации был обнаружен в двух мутантах hcriCP, содержащих единственную замену в позиции 165: N165A и N165G. В отличие от описанных выше, эти нефлуоресцентные хромобелки фотоактивируются при облучении синим светом. В разожженной форме оба мутанта флуоресцируют с максимумом эмиссии около 620 нм. Спектр действия фотоакгивирукяцего света для белка hcriCP-N165A показан на рисунке 4А. Как и для спектра действия света, фотоинактивирующего asulCP-A148G, можно сделать вывод, что этот спектр отражает поглощение света протонированной формой хромофора. В целом белок hcriCP-N165A сохраняет пурпурную окраску, поглощая главным образом в области пика с максимумом при 578 нм (Рис. 4В). В противоположность другим полученным разгорающимся белкам, эти два мутанта фотоактивируются синим светом, отличным от возбуждающего флуоресценцию зеленого света. Это свойство может оказаться полезным для биотехнологических применений, так как не происходит возрастания фона флуоресценции

и

во время наблюдения за фотомеченным объектом. Кроме того, становится возможным одновременное мечение объектов двумя красными флуоресцентными маркерами (Рис. ЗВ).

Рве. 3. Фотоактивация в колониях Е. coli. А. "Хромо"-флуоресценгное переключение на примере мутанта asulCP-A148G. Участок колонии £ coli, экспрессируюшей мутант &sulCP-AM8(i, облучали интенсивньш зеленым светом в течение одной минуты. Этот участок колонии ярко флуоресцировал, а его поглощение снизилось. Через несколько минут белок релаксировал к нефлуоресцентному состоянию, поглощение восстановилось. В. Двойное флуоресцентное мечение с использованием двух ФАФБ. Колонии Е. coli, экспрессирующие мутанты hcriCP-N165A и asulCP-A148G были выращены на одной чашке Петри. После облучения синим светом колонии, экспрессирующие hcriCP-N165A, стали ярко флуоресцентными. Через две минуты облучения зеленым светом hcriCP-N165A релаксировал к нефлуоресцентному состоянию, в то время как asulCP-A148G разгорелся и экспрессирующие его колонии стали ярко флуоресцентными. Такое переключение можно было повторять множество раз, без видимых потерь в контрастах яркости флуоресценции.

Ппыишут

Пастобкучмм Пминцвцч—

Рис. 4. Спектральные свойства мутанта ЬспСР-Ы165А. А. Спектр действия фогоакгавирующего света для ЬспСР-М65А. В. Спектр поглощения 1иа4СР-Ы165А. Стрелкой показано плечо пика поглощения, соответствующее

максимуму спектра действия фогоакгавирующего света.

А В

Необратимая фотоактивация

Большинство полученных мутантных фотоактивируемых белков (но не дикий тип авиГСР) при облучении светом большой интенсивности фотоактивируются необратимо. Например, необратимо фотоактивированный мутант а$и1СР-А148С становится стабильным красным флуоресцентным белком, с яркостью флуоресценции достигающей 50% от яркости после обратимой фотоактивации и в 30-40 раз превышающей исходный фоновый уровень флуоресценции. Яркость флуоресценции необратимо разожженного ави1СР-А1480 не падала в течение года. Для понимания механизмов, стоящих за эффектом необратимой фотоактивации флуоресценции, требуются дальнейшие исследования.

ПРИМЕНЕНИЕ ФАФБ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Белок ФАФБ1

Среди множества фотоактивируемых вариантов, полученных в ходе настоящей работы, как наиболее контрастный и яркий можно выделить мутантный белок asulCP-A148G, с дополнительными заменами F7L, Y26C, T30I, А142 V (далее ФАФБ 1) Чтобы предотвратить агрегацию ФАФБ1, свойственную многим GFP-подобным белкам коралловых полипов, мы также внесли две дополнительные мутации К9Т, К10Е. Полученный мутант сохранил спектральные свойства исходного варианта и тетрамерную природу, однако дальнейшей олигомеризашга белка не происходило. В зависимости от интенсивности облучения, ФАФБ1 способен претерпевать как обратимую, так и необратимую фотоконверсию из нефлуоресцентной в ярко флуоресцирующую форму и может быть использован для прицельного фотомечения, делая возможным слежение за перемещением клеток, клеточных органелл и белков in vivo. Необратимо разожженный ФАФБ1 практически не подвержен тушению в синем свете - происходит лишь частичное тушение сигнала с последующим восстановлением яркости флуоресценции

0 о

1 •

А-

Время, минуты

Время, минут»

Длила волны, им

Рнс. 5. Фотоактивация и релаксация белка дикого типа ашГСР и его мутанта ФАФБ1. А. Обратимая фшоактивация и релаксация дикого типа агиЮР (синяя линия) и ФАФБ1 (красная линия). Нулевое время соответствует началу облучения фогоактивирующим светом (532 им лазер, 2% мощности). Облучение прекратили через две минуты. В. Необратимая фотоактивация ФАФЕ1 (красная линия). Фотоактивапия и релаксация азпГСР (синяя линия). Нулевое время соответствует началу облучения фогоактивирующим светом (532 нм лазер, 20% мощности). Облучение прекратили через двадцать минут. С Спектры флуоресценции необратимо разожженного (красная линия) и исходного (синяя линия) ФАФБ1 и контраст яркости.

Коэффициент молярной эксгинкции ФАФБ1 до фотоактивации составляет 123,000 М~'см"\ После фотоактивации этот коэффициент падает более чем в 2 раза, в то же время квантовый выход флуоресценции возрастает более чем в 70 раз. В результате яркость

флуоресценции возрастает при необратимой фотоактивации более чем в 30 раз (Таблица 4). Время полусозревания ФАФБ1 составляет около 5 часов, и такая скорость должна быть достаточна для большинства экспериментов ш vivo.

Таблица 4. Спектральные свойства ФАФБ1.

Название белка Коэффициент Квантовый выход Отшхяггепьная Максимум

молярной экствнхцни флуоресценции яркость* эмиссии, им

EGFP 55,000 0.6 1 509

МЫ 71500 0.68 1.49 583

ФАФБ1 (исх.) 123,000 <0.001 <0.004 600

ФАФБ1 (актив.) 59,000 0.07 0.13 600

"По сравнению с яркостью (коэффициент молярной экстинкция, перемноженный на квантовый выход флуоресценции) коммерческого бета ШКР (ОотесЬ).

Облучение ФАФБ1 зеленым светом низкой интенсивности не вызывает фотоактивации и может быть использовано в качестве возбуждающего флуоресценцию света при наблюдении за объектом, уже помеченным активированным белком. Таким образом, можно отслеживать перемещение меченых объектов в течение продолжительного периода времени без потерь в контрасте изображения.

Возможности ФАФБ в биотехнологических применениях мы продемонстрировали на нескольких примерах. Так, мы осуществили фотомечение клеток и проследили за их миграцией в развивающемся эмбрионе шпорцевой лягушки Хепориз 1аеуи: Мы также провели прицельное фотомечение митохондрий и отследили их перемещение в эукариотической клетке. Кроме того, нам удалось пронаблюдать диффузию разожженного ФАФБ в эукариотической клетке.

Применение ФАФБ1 для слежения за перемещением клеток в живых тканях

Мы использовали ФАФБ1, чтобы проследить за миграцией клеток в ходе развития нервной пластинки эмбриона Хепориз. Как было показано ранее, туловищная часть нервной пластинки существенно вытягивается в продольном направлении в ходе нейруляции за счет дорсальной конвергенции клеток в этом районе.

До начала дробления мРНК ФАФБ1 инъецировали в эмбрионы Хепорга. в анималькый полюс. Через 15 часов инкубации при комнатной температуре, на стадии ранней

нейрулы, ФАФБ1 в небольшой группе клеток в пределах нервной пластинки эмбриона фотоакгивировали интенсивным облучением (Рис. 6А). Облученные клетки стали ярко флуоресцентными и затем их наблюдали в развивающемся эмбрионе. Продольное вытягивание в результате дорсальной конвергенции помеченных клеток можно было наблюдать уже через два часа инкубации (Рис. 6В). К концу нейруляции флуоресцентные клетки сформировали узкую полоску на поверхности левого нервного валика (Рис. 6Щ

Этот эксперимент показывает, что ФАФБ1 может быть использован для прицельного флуоресцентного фотомечения клеток и их отслеживания в развивающемся эмбрионе. Примененный подход может быть использован в различных исследованиях, в которых флуоресцентные красители сегодня используются для слежения за миграцией клеток: в исследованиях морфогенеза, воспалительных процессов и мегастазирования.

Рис. б. Слежение за клетками в эмбриогенезе Хетюриз Эмбрион показан с дорсальной стороны, передним концом влево. Левая колонка: белый свет, правая колонка: флуоресценция (ТЫТС фильтры); средняя колонка: наложение двух изображений. Группа клеток в пределах нервной пластинки была облучена интенсивным зеленым светом (ТМТС фильтры, 40х объектив). В результате белок в облученных клетках был необратимо фотоактивирован. Эмбрион фотографировали на последовательных стадиях нейруляции. А. Эмбрион на стадии ранней нейрулы (стадия 13) сразу после фотоаюивации в пределах нервной пластинки. В. На стадии 13.5 наблюдали передне-заднее растяжение флуоресцентного пятна. С На стадии средней нейрулы (стадия 15) можно было видеть дальнейшее растяжение красного пятна в пределах нервной пластинки. Б. В конце нейруляции (стадия 18) фотомеченные клетки выглядели уже как тонкая полоска на поверхности левого нервного валика.

Применение ФАФБ1 дли слежения за подвижностью объектов в живой клетке

Мы использовали ФАФБ1 для слежения за перемещением митохондрий в эукариотической клетке линии РС12. Клетки трансфецировали плазмидой, кодирующей ФАФБ1 в одной рамке считывания с сигналом митохондриальной локализации. Через 25 часов инкубации митохондрии оставались нефлуоресцентными при облучении 1% мощности света зеленого лазера (1 мВ, 543 нм). После непродолжительного облучения светом 5% мощности, митохондрии становились ярко флуоресцентными и их можно было наблюдать с использованием 1% мощности лазера в течение нескольких минут, за счет флуоресценции обратимо фотоакгивированного ФАФБ1 (Рис. 7А). Короткое облучение (около 20 секунд)

светом 30% мощности вызывало необратимую фотоакгивацию ФАФБ1 в облученных митохондриях. Эти митохондрии оставались ярко флуоресцентными и могли наблюдаться с использованием 1% мощности лазера в качестве источника возбуждающего флуоресценцию света (Рис. 7В-0). Облучение синим светом (458 нм) вызывало мгновенное тушение флуоресценции обратимо разожженного ФАФБ1. В то же время, необратимо фотоакгивированный ФАФБ1 был в меньшей степени подвержен тушению в синем свете (можно сравнить рисунки 7А и 7В). Описанная здесь технология позволяет осуществлять прицельное фотомечение и слежение за перемещением отдельных органелл в клетке.

На рисунке 8 приведен эксперимент, в котором прослежена диффузия фотоакгивированного ФАФБ1 в пределах эукариотической клетки. Этот эксперимент показывает, что ФАФБ1 может успешно применяться для слежения за подвижностью белков в живой клетке, в том случае, если не возникает проблем, связанных с тетрамерной природой ФАФБ1.

Ряс. 7. Фотомечение митохондрий я слежение за их перемещением в эукариотической клетке. А. Все видимое поле (часть клетки) облучили зеленым светом (5% мощности от 1 мВ, 543 нм), что привело к обратимой фотоактивации ФАФБ1 во всех митохондриях. Две митохондрии (показаны стрелками) были дополнительно облучены зеленым свеюм (30% мощности), что привело к необратимой фотоакгавации ФАФБ1 в этих митохондриях. Затей, облучение синим светом (458 нм) использовали для того, чтобы потушить обратимо разожженные митохондрии (сравните А и В). В-О. Фотомеченные митохондрии наблюдали, используя 1% мощности зеленого лазера я качестве возбуждающего света флуоресценции.

Рис. 8. Диффузия фотоактивированного ФАФБ1 в эукариотической клетке. Последовательность кадров показывает, как ФАФБ1 может быть фогоактивирован и отслежен в клетке. Через 24 часа инкубации трансфецированные клетки наблюдали в конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510. При облучении светом 1% мощности (от lmW 543 нм лазера) можно было наблюдать лишь очень слабую флуоресценцию. Область в верхней части клетки коротко (менее 10 секунд) облучили лазером 100% мощности, что привело к фотоактивации ФАФБ1. Начиная с момента фотоактивации, снимали диффузию активированного белка с использованием 1% мощности лазера в качестве источника света возбуждения флуоресценции.

Конкурентные технологии

Ранее уже было предложено несколько технологий, позволяющих прицельно вводить флуоресцентный сигнал in vivo. Так, в 1996 году Йоко и Мейер предложили использовать необратимые изменения, происходящие в спектре возбуждения флуоресценции GFP при облучении УФ светом, для отслеживания динамики белков в живой клетке. Однако, эта технология позволяла в лучшем случае достичь лишь трехкратного контраста яркости флуоресценции между облученной и необлученной фракциями, и, кроме того, подразумевала использование жесткого УФ облучения. Несколько позже, фотоконверсия GFP из зеленой в красную флуоресцентную форму была обнаружена Еловитц, но такая фотоконверсия требовала анаэробных условий. Недавно была также предложена технология фотомечения, основанная на обесцвечивании красной составляющей флуоресценции белка DsRed (DsRed "greening"). Эта технология использует интенсивный трех-фотонный лазер для обесцвечивания красной флуоресцентной формы DsRed, что приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции зеленой флуоресцентной формы из-за уменьшения эффекта FRET. Другая технология, FLAP, использует двойное флуоресцентное мечение CFP и YFP. В некоторых случаях, та или иная из предложенных технологий может быть использована для in vivo флуоресцентного фотомечения и слежения за подвижностью объектов, однако широкого распространения они не получили.

Незадолго до выхода в свет нашей работы, описывающей потенциал применения ФАФБ в биотехнологии, были опубликованы ещё две современные технологии, позволяющие активировать флуоресцентный сигнал в GFP-подобных белках. Патгерсон и Липпинкотт-Шварц описали фотоактивируемый синим светом мутант PA-GFP. Фотоактивация PA-GFP основана на тех же изменениях в спектре возбуждения, что и фотоактивация GFP, но позволяет добиться значительно лучшего контраста яркости флуоресценции до и после фотоактивации, достигающего 100 крат. Появление PA-GFP дает исследователям новую мощную технологию фотомечения, использующую мономерный фотоактивируемый GFP, позволяющий следить за перемещением белков в живой клетке. Вторая технология основана на клонированном недавно белке Каеде (в переводе с японского - «кленовый лист»), чей зеленый хромофор необратимо фотоконвертируется в красный при облучении УФ светом. Эта технология позволяет активировать исключительно контрастный флуоресцентный сигнал, хотя и имеет свои недостатки, такие как агрессивное УФ облучение, необходимое для фотоактивации, и тетрамерная природа белка Kaede.

Однако, ни одна из предложенных технологий не позволяет обратимо активировать флуоресцентный сигнал, что необходимо для многих приложений, в частности для

отслеживания быстрых процессов. Обратимая фотоактивация позволяет также многократно работать с одним и тем же выбранным объектом (так, последовательность кадров на рисунке 8 является четвертой, из отснятых именно на этой клетке). На сегодняшний день только использование ФАФБ позволяет обратимо фотоактивировать и фотоинакгивировать флуоресцентный сигнал за доли секунды. Кроме того, фотоактивация, например, ФАФБ1 происходит под воздействием зеленого света, значительно более щадящего по отношению к живым клеткам по сравнению с УФ или синим облучением. ФАФБ могут быть использованы с другими флуоресцентными маркерами одновременно и независимо, позволяя осуществлять многоцветное мечение и расширяя возможности FRET технологий. Некоторые приложения могут быть основаны на одновременном применении фотоактивируемого PA-GFP и ФАФБ1, используя преимущества, которое дают четкие различия как света, необходимого для фотоактивации (синий и зеленый), так и длин волны эмиссии флуоресценции этих двух белков (зеленая и красная флуоресценции).

выводы

1. С помощью направленного мутагенеза аминокислотных остатков в окружении хромофора белка asuICP сконструирован ряд мутантных белков, обладающих широким спектром свойств: способных и не способных к фотоактивации и фотоинактивации, исходно флуоресцентных и не флуоресцентных, интенсивно и слабо окрашенных.

2. На основании свойств полученных мутантных белков была предложена модель, объясняющая эффект обратимой фотоактивации флуоресценции asuICP транс-цис изомеризацией хромофора. Предложенная модель подтвержаена переносом свойств фотоактивации и фото инактивации флуоресценции на нефотоактивируемые, нефлуоресцентные хромобелки коралловых полипов hcriCP и cgigCP.

3. Согласно полученным данным, два состояния хромофора - конфигурации Z и Е -присущи GFP-подобным флуоресцентным белкам и хромобелкам соответственно. Таким образом, различия между двумя этими группами сводятся к микроокружению и конфигурации хромофора.

4. Было охарактеризовано новое явление необратимой фотоактивации флуоресценции мутантных фотоактивируемых белков при облучении активирующим светом высокой интенсивности.

5. Разработанные нами фотоакгивируемые флуоресцентные белки открывают новые возможности для прицельного фотомечения клеток, органелл и белков in vivo. Эти возможности мы продемонстрировали в экспериментах по слежению за перемещением клеток в живых тканях, перемещением митохондрий и диффузией белка в эукариотической клетке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Chudakov DM., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov ICA. (2003) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J. Biol. Chem.. 278,7215-7219.

2 Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2003) Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature Biotech., 21,191-194.

3 Bulina ME Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M., Lukyanov K.A. (2003) Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J., 371,109-141.

4 Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., Lukyanov K.A. (2002) Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem., 3:7.

Тезисы докладов на конференциях

1 Chudakov D.M., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Kindling Fluorescent Proteins: A Novel Tool for in vivo Cell' Organelle, and Protein Tracking. Russian-Malaysian seminar on bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry, Russia, Moscow, 2002.

2 Чудаков Д.М., Белоусов B.B., Зарайский А.Г., Староверов Д.Б., Лукьянов С.А., Лукьянов КА Фотоактивируемые флуоресцентные белки: новый инструмент для слежения за клетками, клеточными органеллами и белками in vivo. Международный конгресс "Биотехнология - состояние и перспективы развития ". Россия, Москва, 2002.

3 Chudakov D., Belousov V., Zaraysky A., Novoselov V., Staroverov D., Lukyanov S., Lukyanov K. Cell and organelle tracking using novel Kindling Fluorescent Proteins. INTAS Symposium. Chemical probes in biology. Greece, Spetces, 2002.

4 Chudakov D.M., Lukyanov KA., Lukyanov S.A. Light-induced fluorescence kindling in GFP-like chromoproteins can be switched on/off and modified by mutagenesis. 12th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence. United Kingdom, Cambridge, 2002.

5 Bulina M E, Chudakov D.M., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. 12th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence. United Kingdom, Cambridge, 2002.

Отпечатано в коппцектре «Учебна* полиграфия» Москва, Воробьевы горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. w» storint.ru e-mail: zakaz@stprinl.nl. тел 939-3338 Заказ Л» 328, тираж 100 экз. Подписано в печать 28.04.2003

2c

85 11

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чудаков, Дмитрий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Флуоресцентные и окрашенные GFP-подобные белки кишечнополостных

1.2. Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Механизм фотоактивации флуоресценции белка asulCP

2.2. Применение фотоактивируемых флуоресцентных белков в биотехнологии

2.3. Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотоконверсия окрашенных белков из коралловых полипов"

Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein - GFP) в 1992 году не только позволило осуществлять флуоресцентное мечение клеток, органелл и белков in vivo, но и положило начало целой области исследований, связанной с GFP и многими близкими к нему белками, гены которых были клонированы позднее. Сегодня можно очертить эту область перечислением следующих основных направлений:

Изучение строения GFP и GFP-подобных белков. Расшифровка хромофоров различных GFP-подобных белков и механизмов автокаталитического формирования этих хромофоров. Изучение различий в микроокружении хромофоров, определяющих спектр поглощения, коэффициент молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции белка. Исследование функции (или, что вероятнее, множества функций) GFP и GFP-подобных белков в организмах классов Hydrozoa и Anthozoa. Поиск GFP-подобных белков в других таксономических группах. Эволюционные построения на основании различий в GFP-подобных белках разных групп.

Наконец, к этой же области можно отнести и разработку биотехнологических инструментов, позволяющих осуществлять многоцветное флуоресцентное мечение, регистрировать скорость перемещения и взаимодействие белков, отслеживать перемещение органелл и клеток, измерять по изменениям флуоресцентных свойств такие параметры как рН, мембранный потенциал, концентрация ионов Са2+ и многое другое. Широкий арсенал таких инструментов уже разработан сегодня на основе свойств флуоресценции, обесцвечивания и фотоконверсии GFP-подобных белков, а также резонансного переноса энергии между GFP-подобными белками, и сегодня это направление продолжает интенсивно развиваться. Эти инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях, и в перспективе могут также найти свои применения в практической медицине.

Целью данной работы было изучение механизмов, лежащих в основе явления обратимой фотоактивации флуоресценции GFP-подобного белка asulCP, который определяет окраску кончиков щупальцев кораллового полипа Anemonia sulcata. Этот нефлуоресцентный окрашенный белок (хромобелок) при облучении интенсивным зеленым светом претерпевает обратимую фотоконверсию, в результате которой значительно (более чем в 70 раз) возрастает яркость флуоресценции белка. В течение нескольких минут после фотоактивации, белок возвращается к нефлуоресцентному состоянию, или же может быть мгновенно фотоинактивирован облучением синим светом.

В ходе работы были изучены свойства природного белка, а также свойства полученных мутантных белков asulCP, содержащих аминокислотные замены в выбранных позициях из микроокружения хромофора.

Свойства полученных мутантов, в совокупности с анализом микроокружения хромофора в GFP-подобных белках, позволили предложить модель фотоактивации флуоресценции, согласно которой хромофор asulCP исходно цис-транс изомеризован относительно известного хромофора GFP, и претерпевает транс-цис изомеризацию в ходе фотоактивации флуоресценции, и цис-транс изомеризацию в ходе фотоинактивации или релаксации фотоактивированного белка. Для подтверждения предложенной модели была также проведена работа по переносу свойства фотоактивации на GFP-подобные нефлуоресцентные окрашенные белки (хромобелки) коралловых полипов hcriCP и cgigCP.

Большинство полученных мутантных фотоактивируемых белков проявили способность к необратимой фотоактивации при облучении фотоактивирующим светом большой интенсивности. Во второй части работы, один из наиболее контрастных фотоактивируемых мутантных вариантов asulCP был использован в экспериментах in vivo, в качестве фотоактивируемого флуоресцентного маркера для прицельного фотомечения клеток в развивающемся эмбрионе шпорцевой лягушки Xenopus laevis, и митохондрий в эукариотической клетке. В эукариотической клетке была также отслежена диффузия фотоактивированного белка.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чудаков, Дмитрий Михайлович

выводы

1. С помощью направленного мутагенеза аминокислотных остатков в окружении хромофора белка asulCP сконструирован ряд мутантных белков, обладающих широким спектром свойств: способных и не способных к фотоактивации и фотоинактивации, исходно флуоресцентных и не флуоресцентных, интенсивно и слабо окрашенных.

2. На основании свойств полученных мутантных белков была предложена модель, объясняющая эффект обратимой фотоактивации флуоресценции asulCP транс-цис изомеризацией хромофора. Предложенная модель подтверждена переносом свойств фотоактивации и фотоинактивации флуоресценции на нефотоактивируемые, нефлуоресцентные хромобелки коралловых полипов hcriCP и cgigCP.

3. Согласно полученным данным, два состояния хромофора - конфигурации * Z и Е - присущи GFP-подобным флуоресцентным белкам и хромобелкам соответственно. Таким образом, различия между двумя этими группами сводятся к микроокружению и конфигурации хромофора.

4. Было охарактеризовано новое явление необратимой фотоактивации флуоресценции мутантных фотоактивируемых белков при облучении активирующим светом высокой интенсивности.

5. Разработанные нами фотоактивируемые флуоресцентные белки открывают новые возможности для прицельного фотомечения клеток, органелл и белков in vivo. Эти возможности мы продемонстрировали в экспериментах по слежению за перемещением клеток в живых тканях, перемещением митохондрий и диффузией белка в эукариотической клетке.

2.4. Заключение

В работе были исследованы спектроскопические свойства природного фотоактивируемого белка asulCP, а также полученных мутантов этого белка, микроокружение хромофора в которых было изменено. Также был проведен сравнительный анализ микроокружения хромофора в GFP-подобных флуоресцентных белках и хромобелках.

По совокупности полученных данных, стало возможным сформулировать модель фотоактивации флуоресценции белка. Согласно предложенной модели, хромофор asulCP исходно цис-транс изомеризован относительно его состояния, известного для флуоресцентных белков GFP и DsRed. Фотоактивация связана с изомеризацией возбужденного хромофора, в результате которой хромофор восстанавливает состояние, известное для флуоресцентных белков. Основываясь на предложенной модели, мы успешно перенесли свойство фотоактивации на два нефлуоресцентных, нефотоактивируемых хромобелка, тем самым в значительной степени подтвердив её справедливость.

Обобщая полученные результаты, мы также предположили, что два состояния хромофора - изомеры Z и Е - присущи соответственно GFP-подобным флуоресцентным белкам и хромобелкам. Уже в ходе написания настоящей работы, это предположение также в значительной степени подтвердилось - впервые были опубликованы данные о трехмерной структуре хромобелка (Prescott et al., 2003) и показано, что в хромобелке хромофор действительно цис-транс изомеризован относительно его состояния в белках GFP и DsRed.

В ходе работы была получена группа фотоактивируемых маркеров, имеющих большой потенциал применения в биотехнологии. Появление этого инструмента позволяет прицельно фотоактивировать флуоресцентный сигнал в клетках живых тканей и в пределах живой клетки. Возможности ФАФБ в биотехнологических применениях мы показали на примерах слежения за перемещением клеток в развивающемся эмбрионе шпорцевой лягушки Xenopus laevis, а также на примерах слежения за перемещением митохондрий в живой клетке и за диффузией белка.

Достигнутое понимание механизмов, стоящих за явлением фотоактивации флуоресценции, позволяет в ближайшей перспективе использовать полученные данные для целенаправленной разработки ФАФБ с заданными свойствами.

В заключение хочется поблагодарить всех сотрудников лаборатории Генов регенерации ИБХ РАН, а особенно Дмитрия Староверова, Аркадия Фрадкова, Надежду Гурскую, Катю Барсову, Юрия Янушевича, Севу Белоусова, Марию Булину, заведующего лабораторией Сергея Лукьянова и, главным образом, научного руководителя Константина Лукьянова за обучение, помощь и всестороннюю поддержку во всем.

Существенную помощь в работе оказали: зав. группой Молекулярных основ эмбриогенеза Андрей Григорьевич Зарайский и его сотрудник Владимир Новоселов (ИБХ), зав. лаб. Спектрального анализа Алексей Валерьевич Феофанов и его сотрудники (ИБХ), зав. лаб. Структуры и функции митохондрий Дмитрий Борисович Зоров (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ).

Отдельно хочется поблагодарить Михаила Матца, а также Юлия Александровича Лабаса - за консультации и полезные беседы по теме диссертации.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и оборудование Оборудование

Центрифуга CentraMP4R (IEC, США); настольные центрифуги Micromax (IEC, США), MiniSpin (Eppendorf, Германия); водяные термостаты: Г8 (MLW, Венгрия); термостатируемый шейкер Orbit (lab-line, США); шейкер Shaker S3 (ELMI, Россия); ламинарный шкаф (FluFrance, Франция); сушильный шкаф КС-65 (СССР); лабораторный рН-метр ОР-211/1 (Radelkis, Венгрия), источники питания постоянного тока: Macrodrive 15 (LKB, Швеция), PS500X (HSI, США), EPS250 (C.B.S., США), EPS500/400 (Pharmacia, Швеция); приборы для горизонтального гель-электрофореза: GNA-200, Hoefer НЕЗЗ (Pharmacia, Швеция), Minicell ЕС370М (Е-С Apparatus Corp., США); весы: WA33 (Польша), 33/200 (Chirana, Чехословакия), JP2-300 (Anselma-Industrie, Германия); автоматические пипетки (Gilson, Франция); УФ-трансиллюминатор TF-20M (Франция); амплификаторы: DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cetus, США), Omnigene (Hybaid, США), PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research, США), Mastercycler gradient (Eppendorf,

Германия); анализатор изображения Alpha Imager 2000 (Alpha Innotech Inc., США); автоматический секвенатор CEQ2000 (Beckman, США); предметные и покровные стекла Super Frost Plus (Menzel-Glaser, Германия); предметные стекла с лунками (GEM, Россия); бинокулярный стереомикроскоп SZX12 (Olympus, Япония); световой микроскоп с фотонасадкой Optiphot (Nikon, Япония).

Реактивы

Использовали следующие реактивы отечественного производства (квалификация "хч" и "осч"): мочевину, этиловый спирт, уксусную кислоту, изоамиловый спирт, перегнанный один раз фенол квалификации "чда", медицинский хлороформ, бутанол-1, парафин, ацетат натрия, ацетон.

В работе использовали следующие импортные реактивы: 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты, p-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин (Bio-Rad, США); агароза, бромфеноловый синий, трис-гидроксилметиламинометан (Трис), дитиотрейтол (ДТТ), динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), бромистый этидий, бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт (Difco, США);

•

В работе были использованы следующие ферментные препараты: смесь термостабильных ДНК полимераз Advantage Mix (Clontech Lab. Inc, США). Эндонуклеазы рестрикции, ДНК- лигаза фага Т4 (Boehringer Manheim, ФРГ).

Буферные растворы

Буфер "ТЕ" (для растворения и хранения препаратов ДНЮ: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.0); 0,1 мМ EDTA.

Буфер "ТАЕ"(для электрофореза ДНК в агарозном геле): 50 мМ Трис-ацетат (рН 8.0); 20 мМ ацетат натрия;

2 мМ EDTA.

Буфер PBS (Phosphate buffered saline): 120 мМ NaCl; 7 мМ Na2HP04;

3 мМ NaH2P04; 2,7 мМ КС1

Микробиологические среды

Среда "LB" (для выращивания клеток E.coli):

1% триптон; 0.5% дрожжевой экстракт; 0,1% NaCl; 0,01 мМ Трис-HCl (рН 8.0).

Среду автоклавировали 45 мин. при 1 атм. и хранили при комнатной температуре. При необходимости добавляли ампициллин до концентрации 100 мкг/мл.

LB-arap"- перед автоклавированием в среду дополнительно добавлен агар (Difco) до концентрации 1.5 %.

3.2. Методы исследования Амплификация ДНК

На стадиях направленного мутагенеза, клонирования и тестирования полученных конструкций применяли стандартную ПЦР, с использованием смеси полимераз Advantage Mix (Clontech). Амплификацию проводили на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reserch). Продукты амплификации анализировали в 1.5% агарозном геле, содержавшем 0.5 мкг/мл бромистого этидия.

Мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием технологии «пересхлопывания» продуктов ПЦР, используя праймеры, содержащие соответствующие точечные замены, однозначные либо вырожденные, согласно методике, описанной подробно в Но et al., 1989. Также проводили случайный мутагенез с использованием набора для случайного мутагенеза (Clontech).

Клонирование, наработка и очистка белков

Для гетерологической экспрессии как дикого типа белка asulCP, так и мутантных белков, полноразмерные кодирующие участки клонировали в экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen), содержащий 6 кодонов гистидинов в той же рамке считывания, на 5'-конце гена. Полученные конструкции трансформировали в компетентные клетки E.coli (штаммы ТОРО 10 и XL1 Blue) методом теплового шока (Sambrook et al., 1989) и экспрессировали, получая интересующие белки, содержащие N-концевой олигогистидиновый участок. Для дальнейшего исследования белки очищали с использованием металл-афинной смолы TALON (Clontech).

Трансформация компетентных клеток Е. coli

К 50 мкл компетентных клеток, предварительно размороженных на льду в течение 30 минут, добавляли 5 мкл лигазной смеси. Инкубировали на льду в течение 40 минут, затем проводили тепловой шок при +42°С в течение 45 сек., после чего помещали пробирку снова в лед на 10 минут. Добавляли 3 объема среды "LB" без антибиотика и инкубировали при 37°С в воздушном термостатируемом шейкере при 150 об/мин. в течение одного часа. Затем клетки высевали на чашку Петри с 1,5% бактоагаром на среде "LB", содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Чашки помещали в термостат при 37°С на ночь.

Аналитическое и препаративное выделение плазмидной ДНК

Клетки E.coli для аналитического выделения плазмидной ДНК выращивали в 5 мл среды LB с ампициллином до стационарной фазы при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, и плазмидную ДНК выделяли следующим методом. Клетки суспендировали в 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl рН 8.0 и 4 мг/мл раствора лизоцима, выдерживали 5 мин. при комнатной температуре. Пробирки опускали в лед и раскапывали по 400 мкл раствора, содержащего 0,2 н. NaOH и 1% SDS, после перемешивания выдерживали во льду 5 мин. и добавляли 300 мкл раствора раствора ацетата калия и держали во льду еще 5 мин. Центрифугировали 10 мин. при 14000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в новые пробирки. ДНК высаживали центрифугированием в течение 10 мин. при 14000 об/мин. после добавления 180 мкл изопропанола. Осадок ДНК дважды промывали 80% этанолом, сушили и растворяли в 50-60 мкл буфера "ТЕ". Препаративное выделение осуществляли аналогично, выращивая клетки в 100-200 мл "LB".

Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Нуклеотидные последовательности ДНК были определены с помощью автоматического секвенатора CEQ 2000 DNA Analysis (Beckman). Использовали праймеры к плазмиде pQE30, позволяющие с двух встречных направлений уверенно прочесть участок в 700 н.п., содержащий ген мутантного белка. Сиквенсы были проанализированы с использованием програмного обеспечения Blast. Множественное выравнивание было осуществлено при помощи пакета программ Clustal X с последующей оптимизацией.

Первичная оценка поведения мутантных белков

Колонии бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, наблюдали во флуоресцентном микроскопе Nikon Optiphot и флуоресцентном стереомикроскопе Olympus US SZX12. Фотографии были сделаны с использованием фотокамеры Olympus DP50.

Спектроскопия

Спектры поглощения были сняты с использованием спектрофотометра Beckman DU520 UV/VIS. Флуоресцентный спектрофотометр Varian Сагу Eclipse использовали для измерения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции, а также в качестве источника света для определения спектров действия света, фотоинактивирующего флуоресценцию мутанта asulCP-A148G и фотоактивирующего флуоресценцию мутанта hcriCP-N165A. Использовали также следующие внешние источники света:

-458 нм (линия Аг лазера), 430-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 460-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 514 нм (линия Аг лазера), 532 нм (линия Nd лазера), 543 нм (линия HeNe лазера), 546+/-14 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для определения оптимумов фотоактивации и фотоинактивации белка asulCP;

- 430-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 460-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для фотоинактивации белка asulCP и мутантных форм asulCP, а также в качестве источника света для фотоактивации мутантных белков hcriCP-N165G и hcriCP-N165A.

-532 нм (линия Nd лазера), 546+/-14 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для фотоактивации белка asulCP, его мутантных форм, а также для тех мутантных белков cgigCP и hcriCP, которые оказались способны к фотоактивации при облучении зеленым светом.

Выбор оптимального фотоактивируемого мутанта

Первичную оценку спектроскопических свойств мутантных белков проводили скринированием колоний бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Optiphot (FITC и TRITC фильтры). Для необратимой фотоактивации и наблюдения разожженного сигнала использовали 20-кратный и 5-кратный объективы соответственно. Выбирали наиболее контрастные и яркие варианты ФАФБ.

Измерение кинетики фотоактивации и релаксации

Белки, содержащие на N-конце последовательность из шести гиситидинов, нарабатывали в бактериях Е. coli и очищали с использованием метал-афинной смолы TALON (Clontech). Кинетика релаксации (рис. 2.2.1.А,В)> так же как и спектры флуоресценции (рис. 2.2.1.С) были измерены с использованием флуоресцентного спектрофотометра Varian Сагу Eclipse. К образцу очищенного белка asulCP либо ФАФБ1 при измерениии кинетик добавляли легкоплавкую агарозу (до концентрации 0.5%), для предотвращения неравномерного перемешивания пробы во время снятия кинетики - такое перемешивание приводило к артефактным локальным скачкам в измеряемой яркости флуоресценции образца. Внешний Nd лазер (532 нм, 100 мВ) использовали в качестве источника света для обратимой фотоактивации (1% мощности — около 1 ватт/см , 2 минтуты облучения) и для необратимой фотоактивации (20% мощности - около 20 ватт/см2, 20 минут облучения) пробы белка.

Фотомечение клеток Xenopus laevis и слежение за их перемещением ФАФБ1 кДНК клонировали в плазмиду р35Т. Полученную конструкцию рестрицировали ферментом ЕсоШ. Синтетическую мРНК транскрибировали по стандартному протоколу с использованием набора SP6 Message Machine (Ambion). мРНК очищали по стандартному протоколу на колонках RNeasy (Qiagen) и микроинъецировали в эмбрионы (1 нг на бластомер). Стадии эмбриона устанавливали по таблице, опубликованной в книге Nieuwkoop and Faber, 1967. ФАФБ1 разжигали в течение 15 минут с использованием TRITC филльтров на микроскопе Polyvar (Reihert-Jung), через 40-кратный объектив с частично закрытой диафрагмой. Эмбрион фотографировали на флуоресцентном микроскопе Leica MZIII, с использованием TRITC фильтров.

Фотомечение митохондрий и отслеживание их перемещения

ФАФБ1 кДНК клонировали взамен кДНК белка ECFP в вектор pECFP-Mito (Clontech), содержащий сигнал митохондриальной локализации, полученнный из предшественника субъединицы VIII цитохром С оксидазы человека. Клеточную линию PC-12 трансфецировали по стандартному протоколу полученной конструкцией с использованием набора для кальциево-фосфатной трансфекции (Gibco). Конфокальный флуоресцентный микроскоп Carl Zeiss Confocal Laser Scanning Microscope LSM 510 (Zeiss) использовали для фотоактивации, фотоинактивации, и отслеживания флуоресценции ФАФБ1. Линия HeNe лазера (543 нм, 1 мВ) была задействована в качестве источника света для обратимой фотоактивации (5% мощности), необратимой фотоакивации (30% мощности) и в качестве возбуждающего света наблюдаемой флуоресценции (1% мощности). Линия Аг лазера (458 нм, 40 мВ, 1% мощности) была использована в качестве источника фотоинактивирующего света.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чудаков, Дмитрий Михайлович, Москва

1. Верхуша В.В., Аковбян Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., и Вржещ П.В. (2001) Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. Биохимия (Москва), 66, 13421351.

2. Янушевич Ю.Г., Булина М.Е., Гурская Н.Г., Савицкий А.П., и Лукьянов К.А. (2002) Выявление ключевых аминокислотных остатков, определяющих цвет зеленого и желтого флуоресцентных белков из кораллового полипа Zoanthus. Биоорганическая Химия, 28, 303-307.

3. Ando R., Наша Н., Yamamoto-Hino М., Mizuno Н., and Miyawaki А. (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656.

4. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96, 11241-11246.

5. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97, 11984-11989.

6. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M. and Lukyanov K.A. (2003) Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J., 371, 109141.

7. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., and Lukyanov K.A. (2002) Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem., 3:7 (online only).

8. Bokman S.H., and Ward W.W. (1981) Renaturation of Aequorea green-fluorescent protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 101, 1372-1380.

9. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (2002) A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882.

10. ChalfIe M. and Kain S. (1998) Preface. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols, M. Chalfie, and S. Kain, eds. (New York: Wiley-Liss), vii-ix.

11. Chalfie ML, Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. (1994) Green fluorescent proteins as a marker for gene expression. Science, 263, 802-805.

12. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. (1996) Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 8362-8367.

13. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. (2003) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J. Biol. Chem., 278, 7215-7219.

14. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. (2003) Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature Biotech. 21, 191194.

15. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., and Ward W.W. (1993) Cheimcal structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent protein. Biochemistry, 32, 1212-1218.

16. Condeelis J.S., Wyckoff J., Segall J.E. (2000) Imaging of cancer invasion and metastasis using green fluorescent protein. Eur. J. Cancer, 36, 1671-1680.

17. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. (1996) FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 173, 33-38.

18. Cormier M. J., Hori K., Karkhanis Y. D., Anderson J. M., Wampler J. E., Morin J. G., and Hastings J. W. (1973) Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence amoung the Coelenterates. J. Cell Physiol, 81, 291-298.

19. Cormier M.J., Hori K., and Anderson J.M. (1974) Bioluminescence in coelenterates. Biochim. Biophys. Acta, 364, 137-164.

20. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci., 20,448-455.

21. Davenport D., Nicol J.A.C. (1955) Luminescence in hydromedusae Proc. R. Soc. London, Ser. В., 144, 399-411.

22. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M, Yang M.M., and Youvan D.C. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein, Bio Technology, 13,151-154.

23. Dunn G.A., Dobbie I.M., Monypenny J., Holt M.R., Zicha D. (2002) Fluorescence localization after photobleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells. J. Microsc. Jan., 205, 109-112.

24. Dove S.G., Hoegh-Guldberg O., Ranganathan S. (2001) Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins. Coral Reefs, 19, 197-204.

25. Dopf J., Horiagon T.M. (1996) Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Gene, 173, 39-44.

26. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., and Leibler S. (1997) Photoactivation turns green fluorescent protein red. Curr. Biol. Oct., 7, 809812.

27. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J.B., and Leibler S. (1999) Protein mobility in the cytoplasm of Escherichia coli. J. Bacteriol., 181, 197203.

28. Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry, 38, 5296-5301.

29. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., and Lukyanov S.A. (2000) Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence. FEBSLett., 18, 127-130.

30. Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. (2002) Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem. J., 368, 17-21.

31. Gaietta G., Deerinck T.J., Adams S.R., Bouwer J., Tour O., Laird D.W., Sosinsky G.E., Tsien R.Y., and Ellisman M.H. (2002) Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science, 19, 503-507.

32. Garcia-Parajo M.F., Koopman M., van Dijk E.M., Subramaniam V., and van Hulst N.F. (2001) The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 14392-14397.

33. Gavin P., Devenish R.J., and Prescott M. (2002) An approach for reducing unwanted oligomerisation of DsRed fusion proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 298,707-713.

34. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., and Tsien R.Y. (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11990-11995.

35. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2001a) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett., 507, 1620.

36. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., and Lukyanov K.A. (2001b) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem., 2:6 (online only).

37. Hastings, J. W., and Morin, J. G. (1969) Comparative biochemistry of calcium-activated photoproteins from the Ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea, Obelia, Pelagia and Renilla. Biol. Bull., 137, 402.

38. He X., Bell A.F., and Tonge P J. (2002) Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org. Lett., 4, 1523-1526.

39. Heikal A.A., Hess S.T., Baird S.G., Tsien R.Y., and Webb W.W. (2000) Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins:105coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 1199612001.

40. Heim R., Prasher D.C., and Tsien R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12501-12504.

41. Heim R., Cubitt A.B., and Tsien R.Y. (1995) Improved green fluorescence (letter). Nature, 373, 663-664.

42. Heim R., and Tsien R.Y. (1996) Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr. Biol., 6, 178-182.

43. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., and Pease L.R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 11, 51-59.

44. Kahana J. and Silver P. (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel F. et al., Editors. Green and Wiley: NY. p. 9.7.22-9.7-28.

45. Keller R., Davidson L., Edlund A., Elul Т., Ezin M., Shook D., and Skoglund P. (2000) Mechanisms of convergence and extension by cell intercalation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci., 355, 897-922.

46. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. and Matz M.V. (2002) Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4256-4261.

47. Lauf U, Lopez P, and Falk M.M. (2001) Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. FEBSLett., 498, 11-15.

48. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., and Kenworthy, A. (2001) Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2, 444-456.

49. Llopis J, McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G., and Tsien R.Y. (1998) Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 6803-6808.

50. Marchant J.S., Stutzmann G.E., Leissring M.A., LaFerla F.M., and Parker I.2001) Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19, 645-649.

51. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., and Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotech, 17, 969-973.

52. Matz M.V., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2002) Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow. Bioessays, 24, 953-959.

53. McAnaney T.B., Park E.S., Hanson G.T., Remington S.J., and Boxer S.G.2002) Green Fluorescent Protein Variants as Ratiometric Dual Emission pH Sensors. 2. Excited-State Dynamics. Biochemistry, 41, 15489-15494.

54. Miesenbock G., De Angelis D.A., and Rothman J.E. (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 394, 192-195.

55. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., and Tsien R.Y. (1997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature, 28, 882-887.

56. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., and Miyawaki A. (2001) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry, 40, 2502-2510.

57. Morin J.G., and Hastings J.W. (1971a) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol., 77, 313-318.

58. Morin J.G., and Hastings J.W. (1971b). Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.

59. Nagai Т., Sawano A., Park E.S., and Miyawaki A. (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3197-3202.

60. Nieuwkoop P. D., and Faber J. (1967) Normal Table of Xenopus Iaevis (Daudin). North-Holland, Amsterdam.

61. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M., and Tsuji F.I. (1997) Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13617-22.

62. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., and Remington S.J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273, 1392-1395.

63. Parish C. R. (1999) Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol., 77, 499-508.

64. Patterson G., Day R.N., and Piston D. (2001) Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci., 114, 837-838.

65. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., and Piston D.W. (1997) Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J., 73, 2782-2790.

66. Patterson G.H., and Lippincott-Schwartz J. (2002) A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 13, 1873-1877.

67. Perozzo M.A., Ward K.B., Thompson R.B., and Ward W.W. (1988) X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. J. Biol. Chem., 263, 7713-7716.

68. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., and Rossjohn J. (2003) The 2.2 a crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure (Camb), 11,275-284.

69. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., and Cormier M.J. (1992) Primary structure of the Aeqourea victoria green fluorescent protein. Gene, 111, 229-233.

70. Reits E.A., and Neefjes J.J. (2001) From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat. Cell Biol., 3, 145-147.

71. Remington S.J. (2000) Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein. Meth. Enzymol., 305, 196-211.

72. Salih A., Larkum A., Cox G., Kuhl M., and Hoegh-Guldberg O. (2000) Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature, 408, 850-853.

73. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

74. Sawin K.E., and Nurse P. (1997) Photoactivation of green fluorescent protein. Curr. Biol., 1, 606-607.

75. Shimomura O., Johnson F.H., and Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Сотр. Physiol., 59, 223-239.

76. Shimomura O. (1979) Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBSLett., 104, 220-222.

77. Siegel M.S., Isacoff E.Y. (1997) A genetically encoded optical probe of membrane voltage. Neuron, 19, 735-741.

78. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., and Siebert P. (2000) "Fluorescent Timer": Protein that changes color with time. Science, 290, 15851588.

79. Tsien R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem., 67, 509544.

80. Tsien R., and Prasher D. (1998) Molecular Biology and Mutation of Green Fluorescent Protein. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols. Chalfie M., and Kain, S. Eds., Wiley-Liss, New York, 97-118.

81. Vajkoczy P., Ullrich A., and Menger M. D. (2002) Intravital fluorescence videomicroscopy to study tumor angiogenesis and microcirculation. Neoplasia, 2, 53-61.

82. Vrzheshch P.V., Akovbian N.A., Varfolomeyev S.D. and Verkhusha V.V. (2000) Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett., 487, 203-208.109

83. Wall M.A., Socolich M., and Ranganathan R. (2000) The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138.

84. Wampler J.E., Hori K., Lee J.W., and Cormier M.J. (1971). Structured bioluminescence. Two emitters during both the in vitro and the in vivo bioluminescence of the sea pansy, Renilla. Biochemistry, 10, 2903-2909.

85. Wampler J.E., Karkhanis Y.D., Morin J.G., and Cormier M.J. (1973) Similarities in the bioluminescence from the Pennatulacea. Biochim. Biophys. Acta, 314, 104-109.

86. Ward W.W. (1979) Energy transfer processes in bioluminescence. Photochem. Photobiol., 4, 1-57.

87. Ward W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols, M. Chalfie, and S. Kain, eds. (New York: Wiley-Liss), 45-75.

88. Ward W.W., and Cormier M.J. (1979) An energy transfer protein in Coelenterate bioluminescence: characterization of the Renilla green-fluorescent protein. J. Biol. Chem., 254, 781-788.

89. Ward W.W. and Bokman S.H. (1982) Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry, 21, 4535-4540.

90. Ward W., Prentice H., Roth A., Cody C. and Reeves S. (1982) Spectral perturbations of the Aequoria green fluorescent protein. Photochem. Photobiol., 35, 803-808.

91. Weber W., Helms V., McCammon J.A., and Langhoff P.W. (1999) Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 25, 6177-6182.

92. White J., and Stelzer E. (1999) Photobleaching GFP reveals protein dynamics inside live cells. Trends. Cell. Biol., 9, 61-65.

93. Wiedenmann J., Elke C., Spindler K.D., and Funke W. (2000) Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14091-14096.

94. Wiehler J., von Hummel J., and Steipe B. (2001) Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. FEBS Lett., 487, 384-389.

95. Wilson. Т., and Hastings J.W. (1998) Bioluminescence. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 14, 197-230.

96. Yang F., Moss L.G., and Phillips G.N. (1996) The molecular structure of green fluorescent protein. Nat. Biotechnol., 14, 1246-1251.

97. Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Savitsky A.P., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Bulina M.E., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2002) A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett., 511, 11-14.

98. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., and Remington S.J. (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0 A resolution. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 462-467.

99. Yokoe H., and Meyer T. (1996) Spatial dynamics of GFP-tagged proteins investigated by local fluorescence enhancement. Nat. Biotechnol, 14, 12521256.