Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами

Шкроб, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

ШКРОБ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМОБЕЛКОВ МОРСКИХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ С НОВЫМИ СВОЙСТВАМИ

специальность 03.00.03 — Молекулярная биология

на правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009 г.

003466186

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Константин Анатольевич Лукьянов Официальные оппоненты:

Зарайский Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии РАН

Савицкий Александр Павлович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физической биохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

Защита состоится «22» апреля 2009 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, В-47, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан «20» марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прогресс молекулярной биологии тесно связан с развитием её методологии. Доскональное изучение молекулярных основ процессов, происходящих в живой клетке, требует разработки и внедрения новых подходов исследования. Важнейшие сведения для молекулярной биологии позволяют получить различные методики визуализации. Особый интерес при этом представляет возможность непосредственного наблюдения за живой клеткой, изучение происходящих в ней процессов в динамике.

Благодаря способности образовывать хромофор без привлечения дополнительных кофакторов за исключением кислорода, флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea Victoria (green fluorescent protein, GFP) активно используются в молекулярной биологии для мечения различных объектов, для наблюдения за взаимодействием целевых молекул и конформационных изменений белков, в качестве индикаторов различных физиологических параметров клеток. Нефлуоресцентные или хромобелки, также входящие в состав семейства, обладают рядом особенностей, позволяющих использовать их в качестве основы для создания новых инструментов молекулярной биологии.

Ввиду уникальности биохимических и биофизических свойств белков семейства GFP, а также их большой практической значимости, изучение GFP-подобных белков и создание новых флуоресцентных белков представляется высоко актуальной проблемой.

Цели и задачи работы. Целью работы было получение новых флуоресцентных белков с необычными, важными для практического использования свойствами на основе хромобелков семейства GFP, исследование их свойств и возможностей применения в молекулярной и клеточной биологии. В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной

области спектра.

2. Создание фототоксичного флуоресцентного белка.

Научная новизна и практическая ценность работы. Исследована природа окраски пурпурной актинии Actinia equina, найден новый синий хромобелок. Этот хромобелок послужил основой для создания

флуоресцентных белков, чьи максимумы эмиссии наиболее сдвинуты в дальне-красную область видимого спектра по сравнению со всеми опубликованными на сегодняшний день GFP-подобными белками. Описан уникальный тип спектральных превращений, происходящих с течением времени и при нагревании. Показана применимость полученного белка с эмиссией в дальне-красной обрасти спектра в качестве флуоресцентного маркера для мечения in vivo.

Впервые был проведен направленный поиск фототоксичных флуоресцентных белков, что позволило найти и охарактеризовать первый высоко фототоксичный флуоресцентный белок, получивший название KillerRed. Показана возможность использования KillerRed в качестве генетически кодируемого фотосенсибилизатора для светозависимой инактивации ферментов, а также направленного уничтожения бактериальных и эукариотических клеток.

Перспективы использования фототоксичного белка KillerRed, позволяющего с помощью света в нужный момент инактивировать определенный белок в живой клетке или запускать в эукариотических клетках программу апоптоза, широки. KillerRed может быть использован для изучения функций белков, их роли на различных стадиях жизни клетки, роли отдельных клеток в эмбриогенезе. Фотосенсибилизаторы находят применение не только области научных исследований, но и в медицине, например, фотодинамической терапии рака.

Апробация полученных данных и публикации. Работа прошла апробацию на международном симпозиуме «Advances in Science for Drug Discovery» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-Петербург, Россия, 2005), и международной летней школе «Molecular Imaging» (Гейдельберг, Германия, 2006). По результатам работы опубликованы три статьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 121 ссылку. Диссертация содержит 36 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе синего хромобелка актинии Actinia equina

Поскольку пигменты, содержащиеся в тканях животных, практически не поглощают свет в дальне-красной области спектра, использование флуоресцентных белков с эмиссией в этом диапазоне длин волн удобно для визуализации клеток внутри модельных животных и толстых срезов тканей. Одним из подходов к созданию таких белков является мутагенез природных хромобелков, чей спектр поглощения сдвинут в красную область относительно флуоресцентных белков. Такие хромобелки имеют синее окрашивание, поэтому поиск основы для создания белка с эмиссией в дальне-красной области спектра был проведен среди морских кишечнополостных, имеющих синюю окраску тела. Образец со спектром поглощения, наиболее сдвинутым в красную область, принадлежал пурпурной актинии Actinia equina, имеющей яркую синюю полосу на крае ножного диска (рис. 1).

Клонирование гена, кодирующего синий хромобелок Actinia equina. В библиотеке кДНК, экспрессируемых в ножном диске пурпурной актинии Actinia equina, была найдена последовательность, кодирующая синий хромобелок с максимумом поглощения при 597 нм, названный аеСР597. Нуклеотидная последовательность гена была определена методом автоматического секвенирвования. Длина кодирующей последовательности аеСР597 — 696 пар нуклеотидов, что соответствует белку, состоящему из 231 аминокислотных остатков. Последовательность кДНК, кодирующей аеСР597, была помещена в базу данных GenBank с присвоением номера DQ159069.

Сравнение аминокислотной последовательности аеСР597 с последовательностями, содержащимися в банке NCBI (National Center for Biotechnology Information) выявило высокую степень гомологии аеСР597 с представителями семейства GFP-подобных белков. Ближайшим гомологом аеСР597 является фотоактивируемый белок asFP595 морского анемона

Рис. 1. Пурпурная актиния, Actinia equina. Стрелкой показан край ножного диска, имеющий синюю окраску.

вГР

аеСР597

А014

А0143

апт2СР

КШегНес!

ЭЗ-2

БЗ-1

32-17

32-12

32-10

32-2

вГР

аеСР597

А(214

А0143

апш2СР

КШегИеа

ЭЗ-2

33-1

Э2-17

32-12

32-10

32-2

вРР

аеСР597

А(514

А0143

ашп2СР

КШегИес!

33-2

33-1

Э2-17

Э2-12

эг-ю

Э2-2

вРР

аеСР597

А014

А0143

апш2СР

КШегИес!

вЗ-2

ЭЗ-1

32-17

Э2-12

эг-ю

Э2-2

10 20 30 40 50

MSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGD-ATYGKI,TLKFICTTGKL^VPWPT 59 МАЗЬУТЕВМСХКШМЕОТтаОННРКСТвЕеЕСКРЕЕеТ0УЕК1К1ТЕСОР1,РЕАУВ1 5 7 МАЗЬУТЕБМСХКМТМЕОТУМОННРКСУвЕеЕОКРЕЕСТОУЕКХКИЕееРЬРЕАУПХ 5 7 MAELVTEDMCIKMTMEGTEЗNGHHFKCVGEGEGKPFEGTQVEKIRITEGGPLPFAYI)X 57 №66РАЬ#03РМТРК1Е1РСУУЖ10КГТ11ЙР535К-ЕРН6Р8ТтоАУСЕТ6КШЕШ| 59 МЕССРАЬРОЗВМТГКХГХВ! МЕССРАЬРОЗВМТРЮТХВ! МЕООРАЬЕОЗВМТРКХРХВ! МЕООРАЬРОЗВМТРКХРХВ! МЕСОРАЪЕОЗВМТРКХГХВ! МЕСОРАЬР03ВМТЕК1Р1В1

ЖдКРиЯАОбЗЗК-ЕРНОБГЫУНАУСЕТвКЪРМЗИКР 59 ЖОКЕТХЙАБбЗЗК-ЕРНвРЕКУНАУСЕТСКЬРМЗИКР 5 9 ®КРТ1^еЗЗК-ЕРН6ВРОТЩСТСЕТСКЪРМЗИКР 59 ЯЁОКЯХЙАюаЗвК-ЕРНОРРЫУНАУСЕТа ХЙДП|

_______________________ВЛОГИЦЙОЙв^-ЕРНвОШУНАУСЕТа

МЕ6вРА1^23РМТРК&;тИШ)01^т|1|вЗз|к-ЕРН|р|отн|^ЕТС]

59 Я 59 В 59

60 70 80 90 100 110

ЬУТТР ^УОСЕЗКУРОНЖСНПЕЕКЗАМРЕвГУСЕЕТХРЕКБООКХКТКАЕдаЕЕвОТЬ 119

1АРСС 'мTSKTFXKHVSGIP--DYFKESEPEGFTWERTQIFEDGGYI,TIHQDISLQGNNE 115

ХСНЫ? Тг ЕРРЕАКУРНОХЗ--НРА0ЕСЕРЕвЬТ1ВКттагЕШадТМТ8ННТХЕ1ВСТОТ 117

1СНИ?Й?ЕРЕРА

5те2с13-

^N013-

1СНЫ.««сЕРЕЕА

ршеаж'

ХСНЫЖ! ЕРГРД

-НРАОЕСРРЕвХ,

^УРЫв!Э--ЙЕАОЕСЕРЕСТ

ЯХВНТТКРЕЫВСТМТЗНН'ПГЕЬВВТОТ 117

НГАОЕСРРЕетйхРКтекгЕКБОТМТЗННТУЕЬОетсУ 117 ПХВКТТКРЕНВбТМТЗННтаЕЬВОТОТ 117

„ ........, . _ , .

1СНЫ EPFFAKYPNGIS--HFAQECFPEGI.TIDRTVRFENBGTMTSHHTYELBGTCV 117 ХСНЫ Я? ЕРГРАГЗуРШ13--НРА2ЕСРРЕСЬТ1ВКТУНРЕтСТМТЗННТУЕ1,ВвТСУ 117 ХСНЫ ?|рИтаВШЮ18--НРАЙЕСРРЕвЬТ&й^ртбТЩтНф^СТС! 117

120 130 140 150 160 170

VtaIELKGIDFKEDGNlLGHKLEYN|NSHNVYIMADKQKNGIKVN|кXlШNIEDGSVQLA 179 I ЕюлгеМАОТРАЫбРУмокктА- вт Р&ГЕМЁУР - •к1)суьсбдзтл/лкст:)ук;".т8 172 1РКУ^1вАКРРАЫСРУМ0ККТА-6ЙГЕРЙУЕП^Р--ЮСУЬС605ьМАЬКСТОСКНЬТЗ 172 1РКУОТ1САНЕРАНвР7М0ККТА-СдаЕдУЕЗ&Р--РБвУЬСвед1№ХЖСТСоЗнЬТ8 172 13Р1ТУЫС0СР0РО6РХМКО2ЪУ-ВХЪРТЕТн|!гР-НвЗКА^КЙьеУ1ОРТТАРСОЬММ8 175 Ц$Е1ТТОСРСЕ2РРСР1МКР0ЬУ-о|ьв|ЕТНЙРР-Н0^А,теСгь2а1СЕТТАС6СЬММ^ 175

Язрхттосрсроросрхмкроьу-ОШРРВ!!"—Я— — - --------------' ---

ЯяRTTVЫCDGFOPnЯPTMKnOf.V-ni;т,P^;

ЬттСгЬЩКРТТАВССШМЗ 175

:тн№р-н( :тнй?р-в фр-Н1

:т

¡ТЩи-р-НЦвКХУКЩвХ ШЬ®1ТАСеОЫФШ 17&

ЙЗЕ1ТУЫСР6Роросрхмкроьу-в|ЬР^ТН]&Р-НС^АУНОЬ!Зз1СРттабосьммз 175 ЯsRlTVЫCDGF^PDGPXMKD^X,V-DlLpJETнiFP-HGgNAVR( ЙЗРХТтеСОСРОРВСРХМКВОЬУ-В^ЬрЯЕТН^Р-НСЗНАте^!.

^СЕТТАООвЬММЗ 175 ¡УХСРТТАБСвШМв 175

180 190 200 210 220 230

ВНУ02ЫТР1О-ССРУЪЬРВШУЬЗТОЗАХ,ЗКСРгаКРВНдаЬЬЕР\тШ31ТНС№Е1,УК 238 НЬРТТУКЗНКРЗ^УЫМРЕГНРСВНКХЕХИСА—EQGKFУEQУESAVARУCEAAPSKLGH 229 HLRTTYRSRKPSNAVNMPEFHFGBHRIEILKA--EQGKБfEЙYESAVARYCEAAPSKLGH 229 НХД*ТТУРЗРКРЗЫАУММРЕГНР6В1ШХЕХЬКА—ЕОЛКРХКОУЕ.-Л'/ДНУСК/иЛРУКЬЗН 229 HFBSKLTFNG-SRAIKIPGPHFVTVIXKQMKBTSDKRBH^?CQREVTYiнSVPRITSAI 232 HFBSNSтFNG-SRA^gIPGPHFVтПITK^MRDTSBKRBHVCQREV^2YKнSVPRITSAI 232 HFDS№TFNG-SRAIKIPGPHFVTПITKQMKDTSBKRBHVCQREVTY|HSVPRITSAI 232 HFDSI®TFNG-SRAIKIPGPHFVTЯITKQMKDTSDKRDHVCQREVTYIHSVPRITSAI 232 HFBSKlgTFNG-SRAIKIPGPHFVтЙITKQMKBTSDKRBHVCQREVTYiнSVPRITSAI 231 HFBS№TFNG-SRAIKIPGPHFVтЯITKQMKBTSDKRBHVCQREVTY|i[нSVPRITSAI 232 НРВЗК^СТГЫС-ЗРАХКХРбРНГУтйхТкдмКВТЗБгаШНУС^НЕУТУ&ЗУРНХТЗАХ 232 HFBSKÍ1TFNG-SRAIKIPGPHFVTУITK^MKBTSBKRBHVCQREVTY|HSVPRITSAI 232

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей йЯР, хромобелков, использованных в работе, и мутантов на их основе. Необходимые для построения разрывы отмечены «-». Темно-серым показаны остатки, боковые цепи которых погружены в белковую глобулу. Внесенные мутации показаны на черном фоне.

597

Anemoriia sulcata (гомология между этими белками составляет 68%). На хромофоробразующих позициях в аеСР597 находятся остатки метионина, тирозина и глицина: Met63-Tyr64-Gly65 (здесь и далее нумерация аминокислотных остатков приводится по выравниванию с аминокислотной последовательностью GFP медузы Aequorea victoria (Рис. 2). В позициях 148 и 165 в аеСР597 расположены характерные для GFP-подобных хромобелков остатки цистеина и серина соответственно. Аминокислоты, находящиеся на этих позициях, располагаются в нативном белке вблизи хромофора и оказывают важнейшее влияние на флуоресцентные свойства белка.

Свойства аеСР597. Ген аеСР597 был экспрессирован в Е. coli, кодируемый им белок был выделен и проанализирован. Максимум поглощения аеСР597 достигается при 597 нм, что почти на 20 нм больше, чем у большинства описанных

хромобелков. Спектр поглощения аеСР597 смещен в

длинноволновую область и Рис.3. Спектр поглощения белка аеСР597 совпадает со спектром

400

Т—•—Г т*"!

500 600 700 Длина волны, нм

поглощения образца тканей

(показан сплошной линией) и образца тканей края ножного диска актинии Actinia equina (показан пунктиром). актинии, из которого была

получена его кодирующая последовательность (рис. 3), из чего можно заключить, что синяя окраска края ножного диска этого животного определяется именно наличием белка аеСР597.

Были измерены спектры поглощения аеСР597 после щелочной и кислотной денатурации белка. При денатурации спектральные свойства определяются исключительно структурой самого хромофора, так как влияние белкового окружения исчезает. Спектр поглощения аеСР597 в денатурирующих условиях совпадал со спектром поглощения хромофора белка DsRed кораллового полипа Discosoma sp. Это позволяет косвенно судить о том, что аеСР597 имеет такую же структуру хромофора. Сдвиг максимума поглощения DsRed-подобного хромофора в аеСР597 на 42 нм по сравнению с DsRed очевидно объясняется особенностями белкового окружения хромофора в нативном аеСР597.

Для определения склонности аеСР597 к тетрамеризации, характерной для подавляющего большинства GFP-подобных белков, был проведен анализ подвижности денатурированного и неденатурированного аеСР597 в полиакриламидном геле. Нативный белок аеСР597 двигался в геле одной полосой, с подвижностью, соответствующей размеру частицы более чем 100 кДа. Денатурированный аеСР597 двигался одной полосой с подвижностью, соответствующей размеру 27 кДа. Полученные данные свидетельствуют о том, что, как и большинство GFP-подобных белков, аеСР597 в нативном состоянии образует тетрамеры, которые разрушаются при денатурации пробы. Большая часть денатурированного белка двигалась в геле одной полосой, соответствующей по длине аеСР597 с добавлением гексагистидинового пептида. Из этого следует, что при образовании хромофора аеСР597 не происходит расщепления полипептидной цепи. Это также подтверждает наше предположение о том, что аеСР597 имеет DsRed-подобный хромофор, так как все другие известные на сегодняшний день красные хромофоры образуются с расщеплением полипептидной цепи белка (как, например, в случае asFP595 — белка, обладающего наибольшей степенью гомологии с аеСР597). Известно, что важную роль в этом процессе играют следующие остатки: Thr16, Cys64, Ser68. В отличие от asFP595, у аеСР597 в позиции 16 находится остаток метионина, который, по-видимому, блокирует разрезание полипептидной цепи.

Получение белков с эмиссией в дальне-красной области спектра.

Спектр поглощения аеСР597 смещен в длинноволновую область относительно всех опубликованных на момент исследования хромобелков. Можно предположить, что спектр эмиссии флуоресцентного белка, полученного на основе аеСР597, будет значительно смещен в дальне-красную область спектра. Для получения флуоресцентных белков с дальне-красной эмиссией был проведен мутагенез аеСР597 по позициям 148 и 165, находящимся вблизи хромофора. Получившиеся последовательности, содержащие все возможные комбинации нуклеотидов в позициях, соответствующих 148-ой и 165-ой аминокислотам, были затем подвергнуты мутагенезу со случайными заменами. Полученные на этом этапе последовательности были экспрессированы в Е. coli. Спектры эмиссии отдельных колоний были измерены с помощью прибора SMS2Vis через 4 дня после трансформации. В результате первого раунда мутагенеза удалось получить флуоресцентные формы с максимумами эмиссии 633, 637, 640 и 646 нм. Последовательности, кодирующие флуоресцентные белки с

§8 X

1.0.

590 663

максимумом эмиссии при 646 нм, были использованы в качестве матрицы для второго раунда мутагенеза со случайными заменами.

Последовательности, полученные в результате второго раунда мутагенеза, были также

экспрессированы в Е. coli. На втором этапе был получен белок AQ14, имеющий максимумы возбуждения при 595 нм и эмиссии при 663 нм (рис. 4). Таким образом, белок AQ14 обладает максимумом флуоресценции, наиболее

° ® 0.5 § i

<3 « р

х g о.о

300

—I— 600

—1— 700

400 500

Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры возбуждения и эмиссии сдвинутым в дальне-красную область (при возбуждении 590 нм)А014. п0 сравнению со всеми

опубликованными на данный момент вРР-подобными белками.

1.0 •

510

588

\>-.62—-.,Ч\

__'••..183.

—I-1-1-1-1---1---

400 S00

Длина волны,нм

Рис. 5. Спектры поглощения AQ14,

Серьезнейшим недостатком этого белка является крайняя

чувствительность его эмиссии к облучению и температуре. Даже при коротком облучении происходит сдвиг пика эмиссии в синюю область и падение яркости флуоресценции. При хранении А014 в темноте при температуре 30°С его спектральные свойства значительно изменяются: происходит падение пика поглощения выделения и через 21, 62 и 183 часа при 588 нм с одновременным после выделения белка. увеличением пика при 510 нм (рис. 5).

С помощью электофореза в полиакриламидном геле было показано, что изменение спектральных свойств не связано с расщеплением полипептидной цепи белка. По всей видимости, изменение поглощения при хранении объясняется гидратацией С=Ы связи ацилиминной группы хромофора, происходящей с участием молекулы воды.

Была определена рН-чувствительность флуоресценции А014 в диапазоне рН 4.0-10.5. Были измерены спектры эмиссии при возбуждении 485 и 585 нм. Форма спектра флуоресценции АС514 в зеленой области, измеренного при возбуждении 495 нм, не зависит от рН в исследованном

диапазоне (рН 4.0-7.5). При рН ниже 5.0 наблюдается падение флуоресценции, причем степень падения флуоресценции постепенно нарастает с уменьшением рН. Причиной этого явления, описанного для множества флуоресцентных белков Anthozoa, по всей видимости, является протонирование хромофорной группы и частичная денатурация белка в условиях низких рН.

Форма спектра флуоресценции AQ14 в красной области, измеренного при возбуждении 590 нм, не зависит от рН в исследованном диапазоне. Было показано, что яркость флуоресценции максимальна в слабощелочных растворах (рН 7.6-8.0).

Были определены нуклеотидные последовательности, кодирующие пять полученных на втором этапе мутагенеза белков с наибольшей длиной волны эмиссии. Оказалось, что последовательности всех отобранных белков содержат замены Cys148Ser и Metí 51 Не, также произошли замены в 165-ой позиции (Ser165Cys или Ser165Ala). У всех белков, кроме AQ14, произошла замена Asp171Gly. Интересно, что именно Gly стоит в этой позиции в единственном известном природном белке с эмиссией в дальне-красной области спектра — eqFP611 четырехцветной актинии, Entacmaea quadricolor. Выравнивание AQ14 относительно исходного белка представлено на рис. 2.

Ключевыми заменами, оказавшими влияние на флуоресцентные свойства полученных мутантов, являются замены по 148-ой и 165-ой позициям. Низкий квантовый выход исходного белка аеСР597, вероятно, определяется транс-конформацией хромофора, как было показано для других хромоболков. Внесение замен, стабилизирующих цис-изомер и дестабилизирующих транс-изомер, привело к многократному увеличению квантового выхода: остаток Ser148, присутствующий во всех отобранных белках, вероятно, взаимодействует с фенильным кислородом хромофора в цис-конформации, стабилизируя ее; замена серина на цистеин или аланин в 165-ой позиции способствовала дестабилизации транс-состояния хромофора. По аналогии со структурами GFP-подобных белков, гомологичных аеСР597, можно заключить, что остальные измененные позиции находятся на большом расстоянии от хромофора и, скорее всего, не влияют напрямую на спектральные свойства белка.

AQ14 имеет спектральные свойства, значительно отличающиеся от существующих на данный момент белков с дальне-красной эмиссией, но при этом он менее стабилен. Был проведен следующий раунд случайного мутагенеза с целью получить лучшие варианты на основе AQ14.

<U "1.0-

¡1 го m m s 8 ш

S i 0.6

ro tu

s 5

i«

Получение стабильного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра. Ген AQ14 был взят в качестве матрицы для третьего раунда мутагенеза со случайными заменами. Мутантные последовательности были экспрессированы в Е. coli, были отобраны 10 колоний с наиболее яркой флуоресценцией. Плазмиды, содержащиеся в них, были использованы для четвертого раунда мутагенеза со случайными заменами с отбором на скорость

созревания и устойчивость флуоресценции к воздействию света. Чашки Петри с колониями бактерий, экспрессирующих мутантные последовательности, были подвержены облучению солнечным светом. Через двое суток удалось отобрать белок, сохраняющий свои спектральные свойства после длительного облучения, — AQ143. Максимум эмиссии AQ143 в красной области составляет 655 нм (рис. 6), причем в диапазоне длин волн Рис. 6. Спектры возбуждения и 653-659 нм значения флуоресценции близки эмиссии (при возбуждении 590 нм) к максимальному (значение эмиссии при 659 AQ143 нм составляет 99,5% максимальной).

Максимальное возбуждение флуоресценции с длиной волны 655 нм достигается при возбуждении светом с длиной волны 590 нм. Максимальное поглощение AQ143 приходится на длины волн 508 и 586 нм. Квантовый выход флуоресценции AQ143 составляет 0.04, коэффициент молярного поглощения — 90000 М'1см"1.

Аминокислотная последовательность AQ143 содержит три замены относительно AQ14: Ser3Pro, Val22lle, Asn173Asp (рис. 2). По-видимому, эти замены, расположенные в нативном белке далеко от хромофора, влияют на сворачивание и стабильность белка.

300 400 500 600

Длина волны, нм

700

Рис. 7. 1) Клетка линии Не1_а, продуцирующая А0143; 2) спектр эмиссии красной флуоресценции А0143, снятый с клетки (возбуждение светом с длиной волны 543 нм).

5 0.5

X 560 580 600 620 640 660 680 700 720

Длина волны, нм

Ген AQ143 был успешно экспрессирован в эукариотических клетках линии HeLa (рис. 7). Максимум эмиссии AQ143 в эукариотических клетках совпадает с

максимумом эмиссии в бактериальных клетках. Таким образом, AQ143 может быть использован в качестве дополнительного флуоресцентного маркера для исследований in vivo.

2. Получение красного флуоресцентного белка на основе хромобелка anm2CP антомедузы

Ранее в нашей лаборатории был охарактеризован пурпурный хромобелок anm2CP неидентифицированной антомедузы (последовательность AY485336 в банке данных GenBank). Гомология amn2CP с GFP составляет 24%. На позициях, соответствующих хромофору, в anm2CP расположена последовательность аминокислот Gln-Tyr-Gly. Позиции 148, 165 и 203 заняты остатками треонина, цистеина и валина соответственно. Такая комбинация остатков не была ранее описана для GFP-подобных белков.

Максимум поглощения апт2СР приходится на длину волны 568 нм. В пробах с высокой концентрацией белка (более 0.5 мг/мл) удавалось детектировать слабую красную флуоресценцию с максимальным возбуждением при 568 нм и максимумом эмиссии при 597 нм.

Хромобелок anm2CP был взят за основу для получения красного флуоресцентного белка. На первом этапе был проведен мутагенез остатков, занимающих позиции вблизи хромофора, 148, 165 и 203. Продукты направленного мутагенеза были использованы в качестве основы для мутагенеза со случайными заменами. Мутантные последовательности были экспрессированы в Е. coli, рост колоний происходил при 30°С. Отбор флуоресцентных колоний проводился с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Было найдено несколько колоний, продуцирующих красные флуоресцентные белки.

Плазмиды, содержавшие вставки генов, кодирующих наиболее яркие красные флуоресцентные белки (S2-2, S2-10, S2-12 и S2-17), были выделены. Последовательности, кодирующие гены флуоресцентных белков, были определены с помощью автоматического секвенатора.

В позициях, окружающих хромофорную группу, произошли замены аминокислот, характерных для хромобелков, на характерные для флуоресцентных представителей семейства GFP-подобных белков (выравнивание аминокислотных последовательностей полученных белков относительно anm2CP приводится на рис. 2.

Плазмида, кодирующая наиболее яркий красный флуоресцентный белок, была использована в качестве матрицы для мутагенеза со случайными

заменами. Были отобраны две колонии, продуцирующие белки с быстрым образованием хромофора, обладающие яркой флуоресценцией: БЗ-1 и 33-2.

Ген, кодирующий белок 33-2, был использован для нового раунда мутагенеза со случайными заменами, в результате которого был отобран флуоресцентный белок, получивший впоследствии название КШегЯеё, обладающий еще большей скоростью созревания и яркостью флуоресценции. Нуклеотидная последовательность КШегРес! была размещена в базе СепВапк с присвоением номера АУ969116.

КШегРес! является красным флуоресцентным белком. Максимум его эмиссии приходится на длину волны 610 нм, максимальное возбуждение флуоресценции происходит при длине волны 585 нм. Квантовый выход флуоресценции КШегРес! составляет 0.25, коэффициент молярного поглощения — 45000 М'1см"1.

Поиск фототоксичного СРР-подобного белка. Ряд методических подходов основан на использовании фотосенсибилизаторов — красителей, способных производить активные формы кислорода (АФК) при облучении светом. В целом, флуоресцентные белки обладают низкой, по сравнению с химическими красителями, фототоксичностью. Это является безусловным преимуществом для их использования в качестве прижизненной флуоресцентной метки, но ограничивает

го а. 1000

ы"

га 100

а> s 10

а>

го

С 1

тпп

пппп

1 23456789 10 11

Рис. 8. Снижение числа КОЕ после облучения суспензии бактерий, применение флуоресцентных белков в качестве

продуцирующих GFP-подобные фотосенсибилизаторов. Поэтому создание

фогоа кти в и руе м ьпГ' бело^н^атай Фототоксичного флуоресцентного белка

актинии (Anemonia sulcata) — представляется важной задачей.

asCP595; 4) EGFP; 5) мутантный в процессе поиска фототоксичных белков белок asulCP W94F; 6) г * г>гтг>

фотопереключаемый белок DendGFP мь| протестировали разнообразные GFP-

мягкого коралла Dendronephtia sp.; 7) подобные белки из нашей коллекции,

хромобелок gtenCP коралла характеризующиеся различными

Goniopora tenuidens; 8) мутант,

полученный на основе AcGFPI с спектральными свойствами и происхождением делецией аминокислотных остатков в (рис. 8). В ходе эксперимента суспензию позициях 144-148; 9) anm2CP; 10) бактерий (одна колония ресуспендировалась в

KillerRed; 11) ZFP506-Y66A — GFP-подобный белок, в котором не 1 мл PBS), экспрессирующих гены GFP-

образуется хромофор подобных белков, облучали белым светом

(1 Вт/см2) в течение часа и затем высевали на

чашку Петри. На следующий день после облучения проводился подсчет и сравнение числа колоний (т.е. числа колонию образующих единиц, КОЕ), выросших при рассевании облученных и необлученных образцов. Были протестированы представители различных групп ОРР-подобных белков: флуоресцентные белки с эмиссией в разных областях спектра: голубые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки, природные хромобелки, фотоактивируемые и фотопереключаемые белки.

Результаты проверки говорят о том, что в целом вРР-подобные белки характеризуются низкой фототоксичностью. Токсичность большинства белков незначительно отличалась от использованного в качестве контроля белка гРР506-У66А, в котором не происходит образования хромофора. Только два белка показали наличие свойств фототоксичности: ази1СР-УУ94Р и КШегКес), причем фототоксичность КШегИес! на два порядка превосходила фототоксичность ази1СР-\/У94Р.

Исследование свойств фототоксичности КШегПес). Белок КШегЯес! оказался единственным белком в нашей коллекции, проявляющим ярко выраженную

фототоксичность. Для того, чтобы выяснить

зависимость эффективности действия КШегРес!

^о.-И

- ш

0.2

гРР506-У66А

от времени облучения, суспензию бактерий 0 разделили на несколько образцов, которые ^ облучали белым светом с мощностью 1 Вт/см2. о ю 20 30 40 50 60

В качестве контроля использовалась вРемя облучения, мин

необлученная суспензия. Образцы высевались Рис- 9- Сн^ние количества кое в 1 1 г суспензии бактерии, продуцирующих

на чашку Петри со средой 1.В и выращивались кшегКес} в зависимости от времени в течение ночи. На следующий день облучения, в качестве контроля

.................„„-„лпли,,,-, использовались белки ОэКес! и

производился подсчет колонии. 2РР506-У66А, СРР-подобный белок,

Число КОЕ в образце снижалось с не образующий хромофора, увеличением времени облучения (рис. 9). Так, за 10 мин в облучаемом образце количество КОЕ падало на 96%, а за 20 мин — в 103-104 раз по сравнению с необлученным контролем.

С целью установить зависимость эффективности действия КШегИес! от длины волны света, используемого для возбуждения флуоресценции, проводился следующий эксперимент: образцы суспензии бактерий, продуцирующих КШегНес1, облучались светом различных длин волн с одной мощностью света, после чего

о;

о 10 s

I» ® -

m S

S V 0.5

2 g-

х g о.о

21.2 585 нм

610 нм

суспензия высевалась на чашки Петри, и на следующий день проводился подсчет колоний. Наибольшее фототоксичное действие КШег!Чес1 оказывал в случае облучения зеленым светом. Количество колоний, выросших после облучения синим светом, практически совпадало с контрольным образцом, не

700 подвергавшимся облучению. Число КОЕ в образце после облучения зеленым светом

400 450 500 550 600 650

Длина волны, нм

Рис. 10. Спектр возбуждения (показан было в 21 раз меньше, чем в случае чёрным) и эмиссии (показан серым) белка синего света. Таким образом, для лучшего KillerRed. Столбиками показана ,

относительная токсичность KillerRed при проявления фототоксичных свойств облучении светом соответствующего необходимо использовать для облучения диапазона (460-490 нм и 540-580 нм). зеленый свет. Можно предположить, что

это связано с тем, что флуоресценция KillerRed возбуждается именно зеленым светом (рис. 10).

Наличие у KillerRed фототоксичных свойств объясняется, по всей видимости, тем, что при облучении хромофор KillerRed образует АФК с высокой реакционной способностью — синглетный кислород (102) или супероксид анион радикал (О*-).

Белок KillerRed был получен в результате нескольких раундов мутагенеза последовательности гена anm2CP. Ряд полученных мутантов, а также исходный хромобелок, были проверены на фототоксичность (рис. 11). Были использованы мутанты, полученные после направленного мутагенеза позиций, находящихся вблизи хромофора, и одного раунда мутагенеза со случайными заменами (S2-1, S2-2, S2-3, S2-8, S2-10, S2-12, S2-13, S2-16, S2-17), а также мутанты S3-1 и S3-2, полученные после еще одного раунда мутагенеза со случайными заменами. Процедура тестирования

си

1 1

о j 0.8 С а>

g0.6 о

о 0.4 ■ л н и

2 0.2

о н

МЛ1

52-2 32-10 32-13 Э2-17 53-2 апт2СР Э2-8 Б2-12 52-16 63-1 КШегЯес!

Рис. 11. Сравнение фототоксичности фототоксичности проводилась, как описано хромобелка апт2СР и мутантов, выше. Облучение длилось 5 мин, время, полученных на его основе, с белком

КШегРес!.

недостаточное для инактивации всех бактериальных клеток (число КОЕ снижается примерно на 70%).

Исходный хромобелок, апт2СР, даже при длительном и интенсивном облучении апт2СР не являлся токсичным для бактериальных клеток: количество КОЕ совпадало в опыте и в контроле.

Последовательности протестированных белков были проанализированы, чтобы определить остатки, являющиеся ключевыми для фототоксичности. Так, мутант 52-2, имеющий минимальное количество замен относительно исходного хромобелка (Абп148ТЬг, А1а165Суэ, 1_уз73Агд), фототоксичен. Важнейшими заменами в Э2-2 являются замены в позициях 148 и 165, из чего можно сделать вывод, что наличие флуоресценции является необходимым условием для фототоксичности.

Образцы КШегЯес!, необлученные и облученные белым светом, были нанесены на полиакриламидный гель. При длительном облучении образца белка происходила его агрегация. Облучение свыше 30 мин вызывало образование видимых глазом агрегатов белка, выпадающих в осадок, который не разрушался при денатурации.

Рис. 12. Возрастание степени агрегации КШегРес! в зависимости от длительности облучения. Электрофорез белков в полиакриламидном геле, окраска Кумасси бриллиантовым синим. Обл. — время облучения образца белым светом с мощностью 1 Вт/см2. Часть образцов была денатурирована перед нанесением (отмечено знаком + в графе Ден. (денатурация).

При менее длительном облучении видимых глазом агрегатов не образовывалось, однако, на электрофореграмме видны полосы,; соответствующие разной степени агрегации КШегРес! (рис. 12). С увеличением длительности облучения степень агрегации возрастает, суммарное количество белка, видимого на электрофореграмме, падает в связи с тем, что сильно агрегировавшая фракция белка задерживается в лунке. Заметная доля агрегатов не денатурирует. По-видимому, это свидетельствует об образовании ковалентных сшивок между молекулами белка в составе агрегатов.

Обл. 0 МИН 10 мин 20 мин 25 мин

Ден. + + + +

* . Г * '

55 кДа -- АКа» — ,

тт

30 кДа - -Г*:..:..-.. ЧНВг' в! т

20 кДа --

Для изучения фототоксичности КШегЯес! в отношение эукариотических клеток мы получили конструкцию для экспрессии гена КШегЯес! в клетках млекопитающих. Полученная конструкция была трансфецирована в клетки линии НЕК293Т (клетки эмбриональной человеческой почки). При интенсивном облучении происходит заметное снижение интенсивности флуоресценции КШег1Чес), поэтому для отслеживания судьбы клеток после облучения необходимо использовать дополнительный флуоресцентный сигнал. Была проведена котрансфекция конструкциями, содержащими КШегИес! и ЕСРР. В качестве контроля был использован красный флуоресцентный белок ОвРес) в составе аналогичных конструкций.

Клетки, продуцирующие белки КШегРес! и ОзЯес], подвергались облучению зеленым светом в течение 10 мин. Был использован фильтр возбуждения 535-575 нм, мощность света 5,8 Вт/см2. После 10 мин облучения наблюдалась гибель около 50% клеток.

Изменение морфологии облученных клеток происходило уже через 15 мин после облучения (рис. 13). Спустя 90 мин после облучения, в клетке можно было наблюдать классические признаки апоптоза, в то время как соседние клетки, продуцировавшие меньшее количество фототоксичного белка, не меняли своей морфологии.

5 6 7 8

Рис. 13. Клетки линии 293Т, продуцирующие КШегРес! и ЕСРР, подвергнутые облучению зеленым светом в течение 10 мин (фильтр возбуждения 535-575 нм, мощность света 5.8 Вт/см2).

1) флуоресценция белка КШегКес) до облучения клеток (фильтр ТИТС, объектив ЮОх); 2-8) флуоресценция белка ЕСРР: снимки сделаны с интервалом 15 мин, начиная с момента облучения (фильтр Р1ТС, объектив ЮОх).

Известно, что локализация фототоксичных красителей имеет большое значение: наибольшей эффективностью обладают, как правило, фотосенсибилизаторы, накапливающиеся в мембране или митохондриях. Облучение фотосенсибилизатора, локализованного в клеточных митохондриях, приводит к запуску в клетке программы апоптоза.

Для направления KillerRed в митохондрии был использован сигнал митохондриальной локализации из белка предшественника субъединицы VIII человеческой цитохром с оксидазы. На основе экспрессионного вектора pEGFP-mito (Clontech) была создана конструкция, в составе которой с N-конца KillerRed находилось подряд два сигнала митохондриальной локализации. Полученная конструкция была трансфецирована в клетки линии В16. В этом случае накопление флуоресцентного сигнала происходило именно в митохондриях.

Облучение клеток, продуцирующих KillerRed в митохондриях, производилось зеленым светом (фильтр возбуждения 535-575 нм) мощностью 3,3 Вт/см2 (ниже, чем использованная в эксперименте с KillerRed в цитоплазме). Длительность облучения составляла 15 мин. В течение 45 мин происходила гибель всех облученных клеток, продуцировавших KillerRed. Таким образом, даже при меньшей дозе света эффективность KillerRed, локализованного в митохондриях клеток, выше, чем в случае его цитоппазматической локализации. После облучения клеток, продуцирующих KillerRed с митохондриальной локализацией, можно было наблюдать морфологические признаки, характерные для апоптоза: клетки принимали форму шара, сжимались, происходило изменение формы плазматической мембраны. Для того, чтобы доказать, что в данном случае KillerRed вызывает именно развитие апоптоза, мы провели опыт с добавлением к клеткам ингибитора каспаз — zVAD-fmk.

В начале эксперимента клетки линии В16, продуцировавшие одновременно KillerRed и EGFP, были инкубированы в 10 рМ растворе zVAD-fmk, затем, как и в предыдущем опыте, были подвергнуты облучению в течение 15 мин зеленым светом с мощностью 3,3 Вт/см2. В течение последующих 90 мин наблюдения, морфология клеток не менялась, никаких признаков апоптоза не наблюдалось. Таким образом, изменения в морфологии клеток, происходящие при облучении KillerRed, являются результатом активации каспаз, белков-эффекторов апоптоза, и при гибели клетки имеет место апоптоз.

Активация апоптоза может быть вызвана KillerRed и при меньших дозах облучения. Мы проводили облучение смеси клеток, часть которых продуцировала KillerRed, в то время, как другая часть продуцировала EGFP, в течение 45 минут зеленым светом с мощностью 115 мВт/см2. Через 16 ч после

облучения выжили только клетки, красную флуоресценцию не удалось.

продуцировавшие EGFP, детектировать

15 20 25 Время облучения лизата, мин

Рис. 14. Падение величины ОЫР при 420 нм в зависимости от времени проводилось

Использование KillerRed в CALI. В целях проверки возможности использования белка KillerRed для светоиндуцироемой инактивации целевых молекул (CALI — chromophore-assisted light inactivation) была создана экспрессионная конструкция, кодирующая KillerRed и a-фрагмент ß-галактозидазы. Данной конструкцией трансформировали клетки Е. coli. Лизаты, содержащие химерный белок KillerRed-ß-gal, были подвержены облучению белым светом с мощностью 1 Вт/см2. Измерение ферментативной активности ß-поглощения галактозидазы в эксперименте

с использованием облучения лизата, содержащего химерный _

белок, состоящий из ß-галактозидазь, и хромогенного субстрата - орто-KillerRed. нитрофенил-О^-галактопиранозида. В

результате реакции, катализируемой ß-галактозидазой, происходит образование окрашенного продукта (орто-нитрофенола, ONP), чье поглощение может быть измерено с помощью спектрофотометра. Добавление субстрата ß-галактозидазы и измерение ее активности и проводилось после облучения светом.

Измерение количества продукта реакции показало, что с увеличением времени облучения происходило снижение активности ß-галактозидазы в растворе (рис. 14). За первые 5 мин облучения происходило снижение активности ß-галактозидазы на 50% по сравнению с контролем. За 20 мин облучения активность ß-галактозидазы снижалась более, чем на 99%. В то же время, в контроле, лизате клеток, продуцировавших только a-фрагмент ß-галактозидазы, активность фермента не зависела от времени облучения.

В качестве дополнительного контроля была использована смесь ß-галактозидазы и KillerRed, не соединенных в одну химерную конструкцию. Активность ß-галактозидазы при этом не снижалась, что свидетельствует о том, что радиус действия KillerRed ограничен и его действие распространяется только на белки в составе химерной конструкции, что согласуется с предполагаемым механизмом действия — образованием АФК.

Потенциально, генетически кодируемый фотосенсибилизатор может быть использован для широкого круга задач экспериментальной биологии -эмбриологии, молекулярной и клеточной биологии. В отличие от химических фотосенсибилизаторов фототоксичный флуоресцентный белок может быть направлен в клетки определенного типа либо в определенный компартмент клетки. Развитие методов адресной доставки генов в раковые клетки может в будущем позволить использовать фототоксичные флуоресцентные белки для фотодинамической терапии опухолей.

выводы

1. Показано, что окраска края ножного диска пурпурной актинии Actinia equina определяется синим GFP-подобным хромобелком, названным аеСР597, с максимумом поглощения при 597 нм.

2. Путем мутагенеза хромобелка аеСР597 получены флуоресцентные белки, чьи максимумы эмиссии (655-663 нм) наиболее сдвинуты в дальне-красную область видимого спектра по сравнению со всеми опубликованными на сегодняшний день GFP-подобными белками. Показана применимость одного из этих белков в качестве флуоресцентного маркера для мечения in vivo.

3. Путем мутагенеза природного хромобелка anm2CP гидромедузы был получен первый GFP-подобный фототоксичный белок, названный KillerRed, фототоксичность которого по крайней мере в 1000 раз выше, чем у других представителей этого семейства.

4. Показано, что белок KillerRed может быть использован в качестве генетически кодируемого фотосенсибилизатора для светоиндуцируемого уничтожения бактериальных и эукариотических клеток и инактивации целевых белков.

5. Продемонстрировано, что GFP-подобные хромобелки являются перспективной основой для создания флуоресцентных белков с уникальными свойствами, не встречающимися среди природных флуоресцентных белков.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Shkrob М.А., Yanushevich Y.G., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Labas Y.A., Poponov S.Y., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina // Biochem. J. — 2005. — 392. — p. 649-654.

2. Bulina M.E., Chudakov D.M., Britanova O.V., Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Chepurnykh T.V., Merzlyak E.M., Shkrob M.A., Lukyanov S., Lukyanov K.A. A genetically encoded photosensitizer // Nature Biotechnol. — 2006. — 24. — p. 95-99.

3. Шкроб M.A., Мишин A.C., Чудаков Д.М., Лабас Ю.А., Лукьянов K.A. Хромобелки семейства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение II Биоорг. химия. — 2008. —34. — С. 581-590.

<Щог

Заказ № 120/03/09 Подписано в печать 19.03.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ni; е-таМ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шкроб, Мария Александровна

Используемые сокращения.

1.Введение.

П.Обзор литературы.

TI.1 GFP-подобные белки.

IIЛ Л Зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria (GFP).

II. 1.2 GFP-подобные белки коралловых полипов Anthozoa.

Структура GFP-подобных белков.

Структура хромофора DsRed.

Влияние конформации хромофора на флуоресцентные свойства.

Функции GFP-подобных белков небиолюминесцентных кораллов.

Распространение GFP-подобных белков.

Эволюция семейства GFP/G2FP.

Структурные особенности GFP-подобных хромобелков.

IIЛ.3 Методы использования GFP-подобных хромобелков.

Фотоактивируемые хромобелки.

Хромобелки как акцепторы для резонансного переноса энергии.

Использование мутантных вариантов хромобелков в двухцветовой флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии.

Использование хромобелков для создания псевдо-мономерных меток.

Флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-красной области спектра.

II.2 Фотосенсибилизаторы и их использование.

Флуоресцентные белки в качестве генетически-кодируемых фотосенсибилизаторов.

Фотодинамическая терапия (ФДТ).

III. Экспериментальная часть.

IV. Результаты и обсуждение.

Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе хромобелка из Actinia equina.

Получение фототоксичного белка на основе хромобелка медузы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шкроб, Мария Александровна

выводы

3. Путем мутагенеза природного хромобелка апш2СР гидромедузы был получен первый GFP-подобный фототоксичный белок, названный KillerRed, фототоксичность которого по крайней мере в 1000 раз выше, чем у других представителей этого семейства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе была показана возможность использования GFP-подобных хромобелков для создания флуоресцентных белков, обладающих уникальными свойствами, которые могут найти применение в молекулярной биологии.

Из пурпурной актинии (.Actinia equina) была получена последовательность, кодирующая хромобелок синего цвета, названный аеСР597. Мы показали, что спектр поглощения аеСР597 совпадает со спектром поглощения, измеренным непосредственно с образца тканей актинии. Это дает основания полагать, что именно этот белок определяет синюю окраску ножного диска этого животного.

Мы предполагаем, что аеСР597 имеет DsRed-подобный хромофор, что подтверждается измерениями спектра поглощения в денатурирующих условиях и данными электорфореза в в полиакриламидном геле.

Пик поглощения аеСР597 сдвинут в длинноволновую область по сравнению с большинством опубликованных на сегодняшний день GFP-подобных белков. Исходя из этого, мы предположили, что флуоресцентные белки, полученные на основе аеСР597 путем мутагенеза, должны обладать эмиссией в дальне-красной области спектра.

С использованием мутагенеза последовательности аеСР597 нам удалось создать флуоресцентные белки, чьи максимумы эмиссии находились в дальне-красной области спектра. Полученный флуоресцентный белок AQ14 обладает максимумом эмиссии наиболее сдвинутым в дальне-красную область (максимум эмиссии при 663 нм) по сравнению со всеми опубликованными на сегодняшний день GFP-подобными белками и мутантами на их основе. Так положение максимума эмиссии AQ14 отличается от такового красного флуоресцентного белка DsRed на 80 нм. Это демонстрирует насколько важную роль играет белковое окружение в определении не только квантового выхода, но и спектра эмиссии.

На примере AQ14 нами был описан уникальный для GFP-подобных белков тип спектральных превращений. При длительном облучении и хранении происходит падение пика красой флуоресценции и его смещение в сторону меньших длин волн. Одновременно возрастает пик зеленой флуоресценции и меняется соотношение пиков поглощения. Мы показали, что эти процессы не связаны с расщеплением полипептидной цепи AQ14. Предположительно, изменение спектральных свойств происходит из-за гидратации C=N связи ацилиминной группы хромофора, происходящей с участием молекулы воды.

Изменение спектральных свойств AQ14 при облучении ограничивает возможности его практического применения. С помощью мутагенеза последовательности AQ14 нам удалось получить более стабильный вариант AQ14, названный AQ143. Максимум эмиссии AQ143 достигается при длине волны 655 нм. В отличие от AQ14, флуоресценция AQ143 не чувствительна к продолжительному облучению. Таким образом, AQ143 может быть использован для флуоресцентного мечения эукариотических клеток, что и было доказано в эксперименте с экспрессией последовательности AQ143 в клетках линии HeLa.

Полученные нами флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-краен ой области видимого спектра представляют интерес и с фундаментальной, и с практической точки зрения. Благодаря уникальным спектральным свойствам AQ143 в будущем может быть использован в биотехнологии:

• Пик эмиссии AQ143 приходится на область спектра, в которой животные ткани практически не поглощают свет, что увеличивает эффективность детекции флуоресценции.

• Разница между максимумами эмиссии белков AQ143 и DsRed составляет более 70 нм, что позволяет одновременно использовать эти белки для многоцветового мечения.

• Для возбуждения AQ143 можно использовать лазер 600 нм, что позволяет использовать новый канал для многоцветовой проточной цитометрии.

Недостатком AQ143 для использования в качестве маркера является его склонность к тетрамеризации и наличие зеленого пика эмиссии.

В результате мутагенеза хромобелка anm2CP нами был получен красный флуоресцентный белок KillerRed. В ходе тестирования большого количества образцов из коллекции лаборатории молекулярных технологий ИБХ РАН выяснилось, что KillerRed обладает уникальными фототоксичными свойствами.

Мы установили, что эффективность KillerRed зависит от времени облучения и от длины волны возбуждающего света. Было показано, что наибольшей эффективности в экспериментах с KillerRed можно достичь, используя для возбуждения зеленый свет, что объясняется тем, что возбуждение флуоресценции KillerRed происходит именно в этом диапазоне длин волн.

Мы обнаружили, что при облучении выделенного KillerRed происходит заметная агрегация белка. Образующиеся агрегаты не разрушаются при денатурации, что можно объяснить образованием ковалентных сшивок между отдельными молекулами KillerRed.

Было показано, что KillerRed проявляет фототоксичность не только в отношение бактериальных клеток, но и в отношение клеток эукариот. При этом степень воздействия KillerRed на клетку при облучении существеннно зависит от внутриклеточной локализации фототоксичного белка. Направление KillerRed в митохондрии клетки позволяет вызвать гибель клетки, используя меньший интервал облучения и свет меньшей мощности.

Морфологических изменений, просходящих с клеткой, продуцирующей KillerRed, после облучения не происходило, если клетки были предварительно обработаны ингибитором каспаз, что свидетельствует о том, что механизмом действия KillerRed в эукариотических клетках является запуск апоптоза.

KillerRed является уникальным генетически-кодируемым фотосенсибилизатором, который потенциально может быть использован для широкого круга задач экспериментальной биологии - эмбриологии, молекулярной и клеточной биологии. В отличие от химических фотосенсибилизаторов фототоксичный флуоресцентный белок может быть направлен в клетки определенного типа либо в определенный компартмент клетки. Развитие методов адресной доставки генов в раковые клетки может в будущем позволить использовать фототоксичные флуоресцентные белки для фотодинамической терапии опухолей.

В заключение автор выражает глубокую благодарность коллективу лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии РАН и сотрудников компании «Евроген» за профессиональную и дружескую поддержку, в особенности Юрия Янушевича, Татьяну Чепурных, Надежду Гурскую, Марию Булину, а также заведующего лабораторией, Сергея Лукьянова.

Особую признательность хочется выразить научному руководителю, Константину Лукьянову, за чуткое руководство, помощь в освоении новых методов исследований и всесторонюю поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шкроб, Мария Александровна, Москва

1. Agostinis P., Vantieghem A., Merlevede W., De Witte P.A. Hypericin in cancer treatment: more light on the way // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2002. - V.34(3). - P. 221-241.

2. Almeida R.D., Manadas B.J., Carvalho A.P., Duarte C.B. Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta. 2004. -V. 1704(2).-P. 59-86.

3. Beermann A.E., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of cellular proteins // Methods Cell. Biol. 1994. - V.44- P. 715-732.

4. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., Lukyanov K.A. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis // BMC Biochem. 2002. - V.3- P. 7.

5. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M., Lukyanov K.A. Hetero-oligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins // Biochem. J. 2003. - V.371(Pt 1). - P. 109-114.

6. Burr A.Ii., Hunt P., Wagar D.R., Dewilde S., Blaxter M.L., Vanfleteren J.R., Moens L. A hemoglobin with an optical function // J. Biol. Chem. 2000. -V.275(7).-P. 4810-4815.

7. Buytaert E., Dewaele M., Agostinis P. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta. 2007. -V. 1776(1).-P. 86-107.

8. Calzavara-Pinton P.G., Venturini M., Sala R. Photodynamic therapy: update 2006. Part 1: Photochemistry and photobiology II J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. -2007.-V.21(3). — P. 293-302.

9. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. - V.263(5148). - P. 802805.

10. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling H Nat. Biotechnol. 2003. - V.21(2). - P. 191-194.

11. Chudakov D.M., Chepurnykh T.V., Belousov V.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation // Traffic. 2006. - V.7(10). - P. 1304-1310.

12. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle // J. Biol. Chem. 2003. - V.278(9). - P. 7215-7219.

13. Chudakov D.M., Lukyanov K.A. Use of green fluorescent protein (GFP) and its homologs for in vivo protein motility studies // Biochemistry (Mosc). 2003. — V.68(9). - P. 952-957.

14. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2 // Nat. Protoc. 2007. - V.2(8). - P. 2024-2032.

15. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement II Biotechniques. 2007. -V.42(5). - P. 553-557.

16. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein II Biochemistry. 1993. - V.32(5). - P. 1212-1218.

17. Dedecker P., Hotta J., Ando R., Miyawaki A., Engelborghs Y., Hofkens J. Fast and reversible photoswitching of the fluorescent protein dronpa as evidenced by fluorescence correlation spectroscopy // Biophys. J. 2006. - V.91(5). - P. 45-47.

18. Deheyn D.D., Kubokawa K., McCarthy J.K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G.W., Holland N.D. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus // Biol. Bull. — 2007. V.213(2). - P. 95-100.

19. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein // Biotechnology> (NY). 1995. -V. 13(2).-P. 151-154.

20. Dolmans D.E., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer // Nat. Rev. Cancer. ~ 2003. V.3(5). - P. 380-387.

21. Dougherty T.J., Gomel* C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy II J. Natl. Cancer. Inst. 1998. - V.90(12). -P. 889-905.

22. Eustace B.K., Buchstaller A., Jay D.G. Adapting chromophore-assisted laser inactivation for high throughput functional proteomics // Brief Funct. Genomic Proteomic. 2002. - V.l(3). - P. 257-265.

23. Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Far-red fluorescent tag for protein labelling // Biochem. J. 2002. - V.368(Pt 1). - P. 17-21.

24. Goldstein J.C., Munoz-Pinedo C., Ricci J.E., Adams S.R., Kelekar A., Schuler M., Tsien R.Y., Green D.R. Cytochrome с is released in a single step during apoptosis // Cell Death Differ. 2005. - V. 12(5). - P. 453-462.

25. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis // Science. 1998. -V.281(5381). -P. 1309-1312.

26. Green H.M., Alberola-Ila J. Development of ERK Activity Sensor, an in vitro, FRET-based sensor of Extracellular Regulated Kinase activity // BMC Chem. Biol. -2005. V.5-R1.

27. Griffin B.A., Adams S.R., Jones J., Tsien R.Y. Fluorescent labeling of recombinant proteins in living cells with FlAsH // Methods Enzymol. — 2000. -V.327- P. 565-578.

28. Griffin B.A., Adams S.R., Tsien R.Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells II Science. 1998. -V.281(5374). -P.269-272.

29. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97(22). - P. 11990-11995.

30. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins // FEBS Lett. 2001. - V.507(l). - P. 16-20.

31. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis // BMC Biochem. 2001. - V.2- P. 6.

32. Hastings J.W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review // Gene. — 1996. — V. 173(1 Spec No).-P. 5-11.

33. Haustein E., Schwille P. Single-molecule spectroscopic methods // Curr. Opin. Struct. Biol. -2004. V.14(5). - P. 531-540.

34. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. -V.91(26). — P. 12501-12504.

35. Henderson J.N., Ai H.W., Campbell R.E., Remington SJ. Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2007. -V. 104(16). -P. 6672-6677.

36. Henderson J.N., Remington S.J. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V.102(36). - P. 12712-12717.

37. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. — 1989. V.77(l). - P. 51-59.

38. Hoffman-Kim D., Diefenbach T.J., Eustace B.K., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation // Methods Cell Biol. 2007. - V.82- P. 335-354.

39. Hofmann M., Eggeling C., Jakobs S., Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102(49). - P. 17565-17569.

40. Hopf M., Gohring W., Ries A., Timpl R., Hohenester E. Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1 // Nat. Struct. Biol. 2001. - V.8(7). - P. 634-640.

41. Jay D.G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85(15). - P. 5454-5458.

42. Jay D.G., Keshishian H. Laser inactivation of fasciclin I disrupts axon adhesion of grasshopper pioneer neurons // Nature. 1990. - V.348(6301). - P. 548-550.

43. Jay D.G., Sakurai T. Chromophore-assisted laser inactivation (CALI) to elucidate cellular mechanisms of cancer // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1424(2-3).-P. M39-48.

44. Jimenez-Banzo A., Nonell S., Hofkens J., Flors C. Singlet oxygen photosensitization by EGFP and its chromophore HBDI // Biophys. J. 2008. -V.94(l). - P. 168-172.

45. Kessel D., Luo Y. Photodynamic therapy: a mitochondrial inducer of apoptosis // Cell Death Differ. 1999. - V.6(l). - P. 28-35.

46. Kessel D., Luo Y., Deng Y., Chang C.K. The role of subcellular localization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 1997. -V.65(3). - P. 422-426.

47. Kessel D., Oleinick N.L. Initiation of autophagy by photodynamic therapy // Methods Enzymol. 2009. - V.453- P. 1-16.

48. Kessel D., Reiners J.J. Jr. Apoptosis and autophagy after mitochondrial or endoplasmic reticulum photodamage // Photochem. Photobiol. 2007. - V.83(5). -P. 1024-1028.

49. Konig K. Multiphoton microscopy in life sciences // J. Microsc. — 2000. — V.200(Pt 2).-P. 83-104.

50. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99(7). - P. 4256-4261.

51. Liao J.C., Berg L.J., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of subunits of the T-cell receptor in living cells is spatially restricted // Photochem. Photobiol. 1995. - V.62(5). - P. 923-929.

52. Liao J.C., Roider J., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of proteins is mediated by the photogeneration of free radicals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V.91(7). - P. 2659-2663.

53. Linden K.G., Liao J.C., Jay D.G. Spatial specificity of chromophore assisted laser inactivation of protein function // Biophys. J. 1992. - V.61(4). - P.956-962.

54. Marcinkowska A., Malarska A., Saczko J., Chwilkowska A., Wysocka Т., Drag-Zalesinska M., Banas T. Photofrin—factor of photodynamic therapy induces apoptosis and necrosis // Folia Histochem. Cytobiol. 2001. - V.39 Suppl 2- P. 177-178.

55. Martynov V.I., Maksimov B.I., Martynova N.Y., Pakhomov A.A., Gurskaya N.G., Lukyanov S.A. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins // J. Biol. Chem. 2003. -V.278(47). - P. 46288-46292.

56. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species IINat. Biotechnol. 1999. -V. 17(10). -P. 969-973.

57. Miyawalci A. Green fluorescent protein-like proteins in reef Anthozoa animals // Cell Struct. Funct. 2002. - V.27(5). - P. 343-347.

58. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin II Nature. 1997. - V.388(6645). - P. 882-887.

59. Nagai Т., Miyawaki A. A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2004. -V.319(l). P. 72-77.

60. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M., Tsuji F.I. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93(24). - P. 13617-13622.

61. Ormo M., Cubitt A.B., ICallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science. 1996. -V.273(5280). - P. 1392-1395.

62. Palmer A.E., Tsien R.Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators // Nat. Protoc. 2006. - V.l(3). - P. 1057-1065.

63. Plaetzer K., Kiesslich Т., Oberdanner C.B., Krammer B. Apoptosis following photodynamic tumor therapy: induction, mechanisms and detection // Curr. Pharm. Des. 2005. - V.l 1(9). - P. 1151-1165.

64. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. -1992. V.lll(2). -P. 229-233.

65. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., Rossjohn J. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation // Structure. 2003. - V. 11(3). - P. 275-284.

66. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M., Remington S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution // Biochemistry. 2005. - V.44(l 5). - P.5774-5787.

67. Raj fur Z., Roy P., Otey C., Romer L., Jacobson K. Dissecting the link between stress fibres and focal adhesions by CALI with EGFP fusion proteins // Nat. Cell. Biol. 2002. - V.4(4). - P. 286-293.

68. Sasnauskiene A., Kadziauskas J., Vezelyte N., Jonusiene V., Kirveliene V. Apoptosis, autophagy and cell cycle arrest following photodamage to mitochondrial interior II Apoptosis. 2009. - V.14(3). - P. 276-286.

69. Schroder R., Jay D.G., Tautz D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped // Mech. Dev. 2000. - V.90(2). - P. 329.

70. Schwentker M.A., Bock H., Hofmann M., Jakobs S., Bewersdorf J., Eggeling C., Hell S.W. Wide-field subdiffraction RESOLFT microscopy using fluorescent protein photoswitching // Microsc. Res. Tech. 2007. - V.70(3). - P. 269-280.

71. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell Сотр. Physiol. 1962. - V.59-P. 223-239.

72. Shimozono S., Miyawaki A. Engineering FRET constructs using CFP and YFP // Methods Cell Biol. 2008. - V.85- P. 381-393.

73. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits // Biochemistry. 2006. -V.45(32).- P. 9639-9647.

74. Tanabe Т., Oyamada M., Fujita K., Dai P., Tanaka H., Takamatsu T. Multiphoton excitation-evoked chromophore-assisted laser inactivation using green fluorescent protein // Nat. Methods. 2005. - V.2(7). - P. 503-505.

75. Ting A.Y., Kain K.H., Klemke R.L., Tsien R.Y. Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98(26). - P. 15003-15008.

76. Tour О., Meijer R.M., Zacharias D.A., Adams S.R., Tsien R.Y. Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation // Nat. Biotechnol. — 2003. -V.21(12). P. 1505-1508.

77. Tsien R.Y. The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67-P. 509-544.

78. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins // Chem. Biol. 2004. - V. 11(6). - P. 845-854.

79. Verkhusha V.V., Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins // Nat. Biotechnol. — 2004. — V.22(3). P. 289-296.

80. Vitriol E.A., Uetrecht A.C., Shen F., Jacobson K., Bear J.E. Enhanced EGFP-chromophore-assisted laser inactivation using deficient cells rescued with functional EGFP-fusion proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V.104(16). - P. 67026707.

81. Wang C.L., Yang D.C., Wabl M. Directed molecular evolution by somatic hypermutation II Protein Eng. Des. Sel. 2004. - V.17(9). - P. 659-664.

82. Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101 (48). - P. 16745-16749.

83. Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging // Nat. Biotechnol. 2001. -V. 19(4).-P. 316-317.

84. Wiedenmann J., Elke C., Spindler K.D., Funke W. Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria) // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 2000. - V.97(26). - P. 14091-14096.

85. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata // Biochemistry. — 2005. V.44(15). — P. 5788-5793.

86. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.- V.98(2). P. 462-467.

87. Dove S.G. H.-G.O., Ranganathan S. . Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins // Coral Reefs. 2001. - V.19- P. 197-204.

88. Kawaguti S. The effect of green fluorescent pigment on the productivity of the reef corals // Micronesica. 1969. - V.5- P. 313.

89. Mazel C.H. Green-fluorescent proteins in Caribbean corals // Limnol. Oceanogr. 2003. - V.48- P. 402-411.

90. Salih A., Larkum, A., Cox, G., Kiihl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective // Nature. 2000. - V.408- P. 850-853.

91. Зубова H. H., Булавина А. Ю., Савицкий А. П. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков // Успехи б иол. химии. — 2003. —Т. 43. — С. 163-224.

92. Красновский А.А. Фотодинамическое действие и синглетный кислород // Биофизика. 2004. - Т.49(2). - С. 305-321.

Информация о работе

Шкроб, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы