Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные основы АТ-специфичности лигандов, изоспиральных узкой бороздке ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные основы АТ-специфичности лигандов, изоспиральных узкой бороздке ДНК"

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ии. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.323

ЗАСЕДАТЕЛЕ!? Александр Сергеевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ АТ-СПЕЦМИЧНОС7М ЛИГАНДОВ, ИЗОСПИРАЛЬНЬИ УЗКОЙ БОРОЗДКЕ ДНК

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в виде научного доклада

Москва - 1992г.

РаОота виполнена в Институте молекулярной биологии

им. В.А- Энгельгардта РАН (в Лаборатории физики биополимеров,

возглавлявшейся членом-корреспондентом РАН М.В.Волькенштеяном!

Официальные оппоненты:

Георгиев Георгия Павлович, академик РАН, доктор биологических

наук, профессор.

Лазуркин Юрия Семенович, доктор физико-математических наук,

профессор.

Чизиаджев Юрии Александрович, член-корреспондент РАН, доктор

химических наук, профессор.

Ведущая организация:

Институт химической физики ии. Н-Н. Семенова РАН.

Зашита состоится " уека'Ър^ | яд?г. в 3.0 часов на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 по защите докторских диссертация при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва, ул Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана " _XI 1992 г.

Ученый секретарь

:пециализированного совета,

*

сандидат химических наук ' A.M. К.рицын

ОБИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.Актуальность проблемы.

Одной из центральных задач молекулярной биологии является разработка методов направленного воздействия на системы регуляции генной активности. Решение этой задачи можно, в частности, искать на пути создания биологически активных соединения, способных избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК и осуществлять в местах саят-специфичного связывания функции репрессоров, активаторов, рестриктаз и других ДНК-связывающихся белков. Такие соединения могут быть объектами самостоятельного исследования (как модельные аналоги регуляторных белков), использоваться в качестве молекулярных инструментов в работах по изучение функционирования генетического аппарата клетки, а также служить основой создания высокоспецифичных фармакологических препаратов (в частности противоопухолевых), мишенью которых являлись бы строго определенные сайты ДНК в генах.

Выяснение молекулярных основ узнавания АТ пар в ДНК протяженными лигандами, изогеометричными узкой бороздке, (предпринятое нами с использованием в качестве лигандов антибиотиков типа нетропсина и дистаыицина А, а также красителя "Хехст 33258" и их аналогов), явилось первым этапом практического решения сформулированной выше проблемы.

Результатом этоя работы стали новые представления о существующих в природе молекулярных механизмах узнавания нуклеотидных последовательностей в двойной спирали ДНК, а также система методических подходов к конструирование и синтезу соединения, специфичных к любой заданной последовательности пар оснований ДНК, что явилось основой нового научного направления, активно разрабатываемого в настоящее время во многих лабораториях мира.

2. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось выяснение структурных и энергетических факторов, ответственных за секвенс-специфичность связывания с ДНК лигандов, имевших структурные аналогии с олигопирролкарбоксамидными и олигобензимидазольными фрагментами молекул антибиотиков нетропсина, дистаыицина А и красителя "Хехст 33256", проявлявших, как это было известно из предыдущих исследовании, высокую степень избирательности связывания с АТ-богатыми ДНК.

В ходе проведенных исследовании были решены следующие задачи:

1. Осуществлен выбор адекватных модельных представления и создана система экспериментальных процедур, позволяющая определять основные параметры пространственных структур комплексов секвенс-специфичных лигандов с ДНК в растворе.

2. Определены пространственные структуры комплексов с ДНК антибиотиков нетропсина, дистамицина А, а также красителя "Хехст 3325р", выявившие ключевую роль НН-групп в узнавании последовательностей нуклеотидов ДНК.

3. Проведена экспериментальная оценка свободных энергия взаимодействии между пирролкарбоксамидным Фрагментом антибиотиков дистамицинового класса и каждым типом оснований со стороны узкой бороздки ДНК.

4. Разработаны подходы к молекулярному конструированию протяженных секвенс-специфичных лигандов с использованием пирролкарбоксамид-

и бензимидазол-подобных фрагментов.

3. Научная новизна.

Представленные научные результаты имеют приоритетный характер, открыв новое направление исследований.

Разработанная на основе введенных модельных представлении оригинальная комбинация физико-химических процедур позволила установить первые пространственные структуры комплексов ДНК-лиганд (в качестве объекта исследования были выбраны противоопухолевые антибиотики нетропсин и дистамицин А (первые публикации в 1974 и 1976 гг.) а такав флуоресцентный краситель "Хехст 33258" (первая публикация в 1960 г.)). Эти структуры установлены с той степенью детализации, которой оказалось

достаточно для объяснения молекулярных механизмов узнавания в терминах равновесной термодинамики и стереохимии невалентных взаимодействия.

Для случая лигандов, способных узнавать несколько пар оснований, впервые экспериментально идентифицированы химические группы как молекул лигандов, так и основании в составе двойной спирали, взаимодействие между которыми вносит тот дополнительный вклад в общую энергию взаимодействия лигандов с ДНК, который обеспечивает наблюдаемую секвенс-специфичность связывания. Продемонстрировано, что в молекуле лиганда такими группами могут слушть пн-группы пирролкарбоксаиидных или бензиыидазольных Фрагментов. Показано, что эти МН-группы образуют водородные связи с 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов, обеспечивая наблюдаемую АТ-специфичность связывания.

Впервые экспериментально продемонстрирована возможность участия амидных групп молекул лиганда (на примере антибиотиков нетропсина и дистамицина А) в узнавании последовательностей нуклеотидов ДНК.

На основе новых экспериментальных методик были получены первые количественные оценки, характеризующие способность 02 атомов пиримидинов и НЗ атомов пуринов к образование водородной связи с амидной группой, локализованной в узкой бороздке /ШК..

Разработаны в аналитическом виде геометрические критерия, которым должны удовлетворять структуры молекул протяженных лигандов, секвенс-специфичность связывания которых является результатом взаимодействии с функциональными группами основания, выходя-шими в узкую бороздку ДНК. С помошьо этих критериев были найдены новые структурные мотивы, которые могут оказаться перспективными в создании как секвенс-специфичных ДНК-связываюшихся фармакологических препаратов, так и высокоспецифичных молекулярных инструментов для анализа структуры генома.

В результате проведенного исследования была разработана перЕая физическая модель молекулярного механизма узнавания протяженными лигандами последовательностей нуклеотидов со стороны узкой бороздки ДНК.

4. Практическая значимость работы.

Настоящая работа имеет фундаментальный характер. В результате открытия взаимно-комплементарных водородных связей между регулярно расположенными вдоль молекулы лиганда ИН группами и 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов, выходящими в узку| бороздку ДНК,, были развиты ясные и конкретные стереохимические представления об определенном типе молекулярных механизмов узнавания, реализующихся в системе ДНК-лиганд. Эти представления вплоть до настоящего времени служат основой конструирования лигандов, изогеоыетричных узкой бороздке ДНК и обладавших различной секвенс-специфичностыо связывания.

Исследования в этом направлении, вслед за нашей группой в Институте молекулярной биологии РАН (создание серии бис-нетропси-нов с большей избирательностью связывания и различной функциональной направленность» действия, поиск новых стереохимических решений, обеспечивавших секвенс-специфичность связывания», интенсивно проводятся также в лабораториях О.Ф.Гинсбурга и Е.Н.Глибина в Санкт-Петербургском технологическом институте (синтез модельных антибиотиков на основе ковалентно сочлененных фрагментов молекул дистамицина и актиномицина й), в лабораториях П.Дервана (США) (синтез искусственных рестриктаз с использованием Фрагментов дистамицина), Р.Дикерсона (США) (конструирование лек-ситропсинов), Дж. Лоуна (Канада! (синтез серия лекситропсинов на основе фрагментов молекул дистамицина и красителя "Хехст 33256").

Наибольшая значимость представляемой работы состоит в том, что она открывает новые практические возможности для решения одной из важнейших проблем молекулярной фармакологии -направленного синтеза высокоспецифичных лекарственных соединений дас-ориентированного действия.

5. Аппробация работы.

Основные положения моделей найденных нами пространственных структур комплексов с ДНК антибиотиков нетропсина, дистамицина А, а также красителя "Хехст 33258" были подтверждены впоследствии методом рентгеноструктурного анализа, выполненного в группах Р.Дикерсона (1985 и 1987) и А.Рича (1988) (США).

Использование развитых в этой работе представлений позволило

в дальнейшем синтезировать более сложные лиганды, изогеометричные узкол бороздке ДНК, со свойствами, адекватными тем, которые изначально предполагались нами при их конструировании (11, 14).

Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на различных Всесоюзных и Международных симпозиумах и конференциях, в том числе: на IV Международном биофизическом конгрессе (Москва-1972); на VIII, IX И X йенских международных симпозиумах по биофизической химии (йена-1976, Веимар-1930 и Веймар-1994, ГДР); на III Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот (Брно-1977, Чехословакия); на Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин-1981 ); на VI и VIII двухсторонних симпозиумах СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (ЦхалтуСо-1982) и "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" (Москва-1966); на VI Всесоюзном симпозиуме по конфор-мационным изменениям биополимеров в растворах (ТСилиси-1985 I; на VII двухстороннем симпозиуме Германия-СССР "Организация и Функционирование генома эукариотов" (Геидельберг-1907); на Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тбилиси 1967); на VI Международном совещании по биомолекулярноя стереодинамике (Олбани -1939,США); на Международной конференции "ДНК, взаимодействие с белками и малыми лигандами. Новые экспериментальные подходы" (Тбилиси, Москва, Пушино - 1990); на двухстороннем (СССР-ФРГ) симпозиуме "Белково-нуклеиновое взаимодействие: структурные и фармакологические аспекты" (Санкт-Петербург, 1991).

Циклы работ, составивших отдельные этапы этого исследования, заняли высшие места на конкурсах научных работ Института молекулярной биологии РАН в 1977 и 1980 гг. В 1985г. часть представленных в диссертации исследований в комплексе работ, выполненных в составе международного научного коллектива (А.С.Заседателев, Г.В.Гурския, А.Л.Жузе, Ю.М.Евдокимов, К.Циммер и Г.Берг "Физико-химические исследования молекулярных механизмов взаимодействия с ДНК противоопухолевых антибиотиков нетроп-синового и антрациклинового классов") была удостоена премии Президиумов АН СССР И АН ГДР.

Основное содержание диссертации отражено в 20-ти публикациях.

6. Форма представления работы, личный вклад автора, благодарность соавторам за помощь в работе.

Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. Основные результаты получены лично мною или в соавторстве под моим руководством с A.C.Крыловым, М.В.Михайловым и В.Б.Бороду-линым. В этих результатах отражена соответствующая часть -общего направления исследовании, выполненных в неформальном межлабораторном авторском коллективе ИМБ РАН, работающем по фундаментальной проблеме молекулярной биологии - "Белково-нуклеиновое узнавание: конструирование, синтез и изучение взаимодействия с ДНК биологически активных соединений, способных избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями генома".

Сколько-нибудь результативное решение любой из задач в рамках. этой проблемы не было бы возможным без направленного синтеза модельных соединений, который проводился в группе А.Л.Жузе, в Лаборатории химических основ белкового синтеза, руководимой Б.П.Готти-хом, который взял на себя риск создания такой группы и долгие годы оказывал поддержку этому направлению исследования.

Синтез всех соединений, использовавшихся или упомянутых в диссертации, был выполнен С.Л.Гроховским, С.Н.Никитиным, А.А.Хорлиным, и В.А.Николаевым под руководством и при участии А.Л.Жузе.

Первые образцы антибиотиков нетропсина и дистамииина А были любезно предоставлены К.Циммером (ФРГ), а краситель "Хехст 3325Ö" - впервые синтезировавшим его Х.Лоиве (фирма "Хехст", ФРГ).

Я глубоко благодарен своим ближапшим коллегам-соавторам -Г.В.Гурскому, А.Л.Жузе, С.Л.Гроховскому, К.Циммеру (ФРГ), Р.Ш.Бибилашвили, Л.П.Савочкиноя, А.М.Колчинскому, А.Д.Мирзабекову,

B.Г.Туманяну, В.О.Речинскому, А.В.Скамрову, А.С.Крылову,

C.Н Никитину, М.В Михайлову, В.Б.Бородулину, Ю.Д.Нечипуренко, М.Г.Харатишвили, С.А.Стрельцову, А.Н.Суровой, Н.Ю.Сидоровой, Т.Леянсоо, A.A. Хорлину, В.А.Николаеву и Б.П.Готтиху, которые активно участвовали на различных этапах исследований и оказали существенную помощь и поддержку в выполнении этой работы. Особую признательность выражаю Г.В.Гурскому, выдающаяся научная интуиция и настойчивость которого в достижении оригинальных результатов привели в итоге к постановке и исследованию сформулированной выше фундаментальной проблемы молекулярной биологии.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

1. МОДЕЛЬНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИИ ПРОЦЕССА УЗНАВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫМИ ЛИГАНДАМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПАР ОСНОВАНИИ Д11К-

1.1. Выбор физической модели, объясняющей секвенс-специфичность связывания лигандов с ДНК.

Способность к "узнаванию" или к преимущественному связыванию с определенными последовательностями нуклеотидов ДНК является неотъемлемым свойством как белков, участвующих в регуляции активности генома, так и некоторых ДНК-специфичных антибиотиков, красителей и других лигандов. Благодаря каким особенностям молекулярных структур секвенс-специфичных лигандов и ДНК может обеспечиваться функция узнавания? В качестве первого шага в решении этого вопроса нами было предпринято изучение конкретных молекулярных механизмов секвенс-специфичного связывания простейших химических соединений, проявлявших такую Функцию.

К моменту начала наших исследования (1-я половина 70-х годов) к таким соединениям можно было отнести лишь противоопухолевые антибиотики нетропсин IНт) и дистамицин А 1ДМ), а позже флуоресцентный краситель "Хехст 33258" (Хт), которые связывались преимущественно с АТ-богатыми ДНК;

н

нетропсин (Нт)

сн

н

с-ы-сн-сн-а

11 22 чЧ|и

О ин,

2

дистамицин А (ДМ)

Хехст 3325а (ХТ)

н

Важно отметить, что в отличие от некоторой предпочтительности связывания с АТ-богатыми ДНК, обнаруженной у ряда других низкомолекулярных соединений, АТ-специфичность 11т, ДМ и Хт не подавлялась действием высоких ионных сил (вплоть до 1 М NaCl и выше).'

Выбор физической модели, адекватно описывающей молекулярный механизм избирательного связывания лигандов с определенными последовательностями пар оснований ДНК, основывался на комбинации двух представления. Согласно первому, последовательность пар оснований задает локальные вариации структуры двойной спирали (или даже уникальные структуры, наподобие крестообразных) комплементарные конформаииям соответствующих лигандов. Согласно второму представлению, молекула лиганда "узнает" непосредственно последовательность нуклеотидов ДНК, в результате взаимодействия с различными функциональными группами оснований.

Результаты первых экспериментов, проведенных нами по связыванию нетропсина с ДНК, указывали на явную'предпочтительность использования второго типа представлений при построении физической модели. В этих экспериментах было показано (см. рис.1), что ДНК, находящаяся в 78£ этаноле в А форме, претерпевает А-*В переход под действием нетропсина, связываощегося только с В формой ДНК. Этот результат наглядно демонстрировал, что энергия взаимодействия молекул лиганда с ДНК может быть существенно больше энергетических различий между разними формами ДНК и, следовательно, может быть больше тех энергетических различий между локальными вариациями • конформации ДНК, которые задаются последовательностью пар оснований в участках связывания.

Поэтому для описания секвенс-специфичного связывания лигандов с ДНК нами была выбрана модель, представленная схематически на рис-2. Эта модель позволила в дальнейшем ввести существенные структурные и энергетические параметры комплекса, доступные для экспериментальных оценок с помошъю физико-химических методов.

Теоретическое рассмотрение изображенной па рис.2 модели и различных ее модификации составило отдельное направление выполненных ранее работ по теории адсорбции лигандов на ДНК <Г .В.Гурскии,197]-1984) и не является предметом настоящей диссертации, а лишь используется в качестве одного из инструментов исследования. . {

а

р

I

Рис.1. Изменение амплитуды кругового дихроизма (КД) в 256 нм (в расчете на пару оснований ДНК) при титровании нетропсином П1т)

тимуснои ДНК в водно-этанольных растворах, в присутствии 2-Ю-4 М

7Яу1-;™пп!!Н7ЕапЧЯ р/2, 5Ч°,~3 м- титр°ваш<е проводилось в этаноле (о о), переводящем ДНК в А форму, и в 67% этаноле

( + +), в котором ДНК находится в В форме. 2С„Т/Р - концентрация

добавленного нетропсина в расчете на пару оснований. На вставке представлены спектры КД ДНК в 78?. ц> и 678 (2) этаноле а такте спектры комплексов Нт-ДНК в 787. < — ) и 67% ( — > этаноле для значении 2С,(т./р, обозначенных цифрами около кривых.

?^пи1к^;"т,>спектры КД комплексов в 78% и 67% этаноле совпадают Iкривая 4). справа вверху схематически иллюстрирован А В переход ДНК под действием Нт.

-ДЕ/НТ -ДЕ /ГГ -( п • дгАТ + п -ДГ^/КТ к = е = е ° • е АТ АТ ос ос

3.

= к

. < ксс)

сс

и

Ка/К0

-( дг

е

- ДГА*)/11Т

ас

Рис.2. Модельное представление адсорбции на ДНК. молекул протяженных лигандов, содержащих АТ- ( II ) и СС- ( | ) специфичные реакционные центры, способные взаимодействовать с АТ и СС парами основания, а) - связывание на комплементарном участке ДНК; 0) - связывание на участке, содержащем единичную некомплементарность, в результате которой АТ-специфичныя реакционный центр взаимодействует с йС пароя (отмечено стрелкой). К„ и Кя - значения констант связывания на обоих участках,

а О

соответственно. а£ - число пар основании ДНК, накрываемых одной

связанной молекулой лиганда; п и и - числа АТ- и СС-спе-' ат ас

цифичных реакционных центров в молекуле лиганда; ДЕ- изменение

свободной энергии, характеризующее адсорбцию лиганда на полимере

I ДЕ - часть ДЕ, не зависящая от последовательности пар оснований

О

ат ос

в участке связывания); ДГАТ и ~ изменения свободной

энергии, характеризующие взаимодействия каждого АТ-специфичного реакционного центра с АТ парой и СС-специфичного реакционного

центра - с СС парой основании, в составе двойной спирали;

АГ- и -изменения свободной энергии, характеризующие

взаимодействие каждого АТ-специфичного реакционного центра с СС парой и СС-специфичного реакционного центра - с АТ парой оснований, соответственно.

Одним из важных в практическом приложении результатов упомянутой выше теории адсорбции является выражение для константы связывания секвенс-специфичного лиганда с природными ДНК. характеризуемыми обычно долей АТ пар, Хдт, и долеп СС пар, Хос, (Х.„ + X.__=1). Если абстрагироваться к случайному

ат ос

распределению АТ и СС пар в полимере, то константа связывания лиганда, изображенного на рис.2, может быть записана в следующем виде 11,12,15 1:

к = к -<х + * X к^'П°с (1)

о ат ат ас ас ос ос лт ат

Информацию о параметрах, входящих в (1) и характеризующих-модель секвенс-специфичного связывания, модаю получить, анализируя значения К, определенные из экспериментов по связыванию лиганда с природными ДНК различного состава пар оснований. По определению, константа связывания лиганда на полимере

К = lim (r/m) ( 2)

r-Ю

где г - количество связанных молекул лиганда, в расчете на пару оснований ДНК, а m - концентрация свободного лиганда в растворе. Поэтому в эксперименте К определяется по пересечению с осью ординат зависимости r/m от г (отложение Скэтчарда).

Для простоты качественного восприятия рассматриваемой модели предположим, что величина -(ДГЛТ - ДГдт> составляет от 2-х до

' ат сс

3-х ккал/М, что в количественном отношении могло бы соответствовать энергии образования одной водородной связи при взаимодействии АТ-специфичного реакционного центра с АТ-парои (по сравнению со взаимодействием с СС- парой). Тогда представленные на рис.2 простейшие выражения для констант связывания секвенс-специфичного

лиганда с полностью комплементарным участком ДНК и участком, содержащим единичное несоответствие, наглядно демонстрируют, что в первом случае константа связывания примерно на 1-2 порядка выше, чем во втором. Легко показать, что такое различие в константах связывания может оказаться достаточным для проявления эффекта биологического действия ДНК-связывающегося соединения. Очевидным, но важным выводом является и то, что это различие в константах связывания не зависит от числа реакционных центров в молекуле лиганда. Следовательно, даже такая простейшая схема взаимодействия, как представленная на рис.2, может служить в качестве физической модели узнавания секвенс-специфичным лигандом последовательности пар основании в ДНК.

Предположение об образовании водородных связей между реакционными центрами молекулы лиганда и соответствующими Функциональными группами пар оснований лишь тривиально следует известным представлениям о механизме спаривания комплементарных нитей ДНК. Поэтому схема, представленная на рис.2, может рассматриваться в качестве физической модели узнавания, основанной, на принципе одномерной донорно-акцепторной комплементарности.

Очевидно, что этот принцип может быть легче всего реализован при связывании протяженных лигандов в узкой бороздке ДНК. Действительно, различие между функциональными группами СС и АТ пар со стороны узкой бороздки (см. рис-3) состоит в том, что в СС паре имеется потенциальный донор водородной связи, а в АТ паре - лишь только потенциальные акцепторы водородной связи. Это различие может быть использовано при конструировании молекул секвенс-специфичных лигандов таким образом, чтобы СС-специфичный реакционный центр был представлен акцептором водородной связи и взаимодействовал, соответственно, с 2-аминогруппоя гуанина, а АТ-специфичныя реакционный центр был бы представлен донором водородной связи, взаимодействующим, соответственно, с 02 атомом тимина и/или N3 атомом аденина.

Как видно из рассчитанной для В формы ДНК карты стерически разрешенных положений реакционных центров (см. рис.3 1, в плоскости различных пар основании есть обшие области, в которых могут быть помещены соответствующие донорние или акцепторные группы.

Рис.3. Функциональные группы пар основании, выходящие в узкую бороздку В формы ДНК и способные к образованию водородных связей (02 атомы пиримидинов, N3 атомы пуринов и N2 атомы гуанинов). • - атомы азота, о - атомы кислорода. Атомы водорода не показаны, нарисованы только о-связи. Точкой отмечено положение проекции оси двойной спирали. В плоскости пар основании, со стороны узкой бороздки очерчены (с учетом ван-дер-ваальсовскик радиусов атомов и пределов вариаций длин водородных связен, 2,6 +3,0 Я) области возможной локализации центров атомов - потенциальных доноров (белые сегменты, отмеченные значком Л ) и потенциальных акцепторов (заштрихованные сегменты, отмеченные значком М ) водородных связен. Внизу представлена полученная с помощью последовательных наложении суммарная карта возможных локализации реакционных центров в плоскости пар оснований со стороны узкой бороздки, которая для случая В формы ДНК может быть ограничена в пределах 4,8 А < Но< 6,8 Й радиуса йо с центром, совпадающим с

проекцией оси двойной спирали.

1.2. Геометрические соотношения, характеризующие структуру протяхешшх секвенс-специфичних лигандов, мзоспкральних узкой Оороздке ДНК.

Рассмотрим геометрические требования, которым, в соответствии с вышеизложенным принципом одномерной донорно-акцепторнои комплементарности, должна удовлетворять пространственная структура секвенс-спеиифичных лигандов, изоспиральных узкой бороздке ДНК.

Представим протяженную молекулу секвенс-специфичного лиганда состоящей из нескольких повторяющихся объемных элементов, кова-лентно сочлененных гибкими цепочками, как это показано на рис.4.

атомы, являющие потенциальными донорами или акцепторами водородной связ

Рис.4. Основные параметры и модельное представление для двух последовательных объемных элементов протяженного регулярного изоспирального лиганда (справа!, который заполняет свободный объем узкой бороздки ДНК (слева). 4

Центры этих элементов соединены воображаемой ломаной линией, вписанной в соответствующую В ДНК-подобную спираль. Такое представление позволяет ввести простейшие параметры, характеризующие конформацию молекулы лиганда.

Геометрия регулярного изоспирального лиганда, представленного схематически на рис.4, может быть охарактеризована тремя размерами I 3.5 А < э < 6.5 А Ю.Гооп е! а1.,1968 1, (1, £< I > его объемных элементов и параметрами I, х, 11 и а, зависимости которых от обычных спиральобразуюших параметров В, А и ( были получены в следующем виде :

4й231п2 < Х/2 )

(3)

х = 180 - гагсБШ

1 2 п ь + и эш г

Ь2 +■ 41Гз1п2(1:/2)

(4 )

|}> = агс£1п

Г1 * 41Гзт2и/2 1 • з1п г

и2 - я22 1ггг

(5 )

а = агсг£

Й.51П I

(6)

Из 13), М) и 15) следуют два дополнительных соотношения:

х = 180 - 2агсз1п

Ь2Б1П2 1Х/2) + Ь2со521г/2)

( 7 )

¥ = агсз1п

ги-эт г

Ь2з1п21 1/2 I + Г.^СОБ2( г/2 )

(Й )

Графики зависимостей I. к т от й, а также х и Ч; от I. представлены на рис.5 для случая В формы ДНК.

Рис.5. Графики зависимостей для уравнении (3) - а, (4) - б, 17) - в и (3) - г, рассчитанные для случая В формы ДНК 41=3,38 к, г=36° ). Утолщенные участки кривых соответствуют стерически разрешенным значениям переменных. Открытые пунктирные линии внутри заштрихованных областей, соответствующих возможным вариациям йо, 1о и то, определяют средние значения этих

параметров (см. текст I.

Учет стерического отталкивания между реакционными центрами молекулы лнганда и атомами поверхности узкой бороздки ДНК, а также учет интервала возможных значении длин водородных связей ( 2 2,6 + 3,0 А (г. Вегсо^ПсЬ-ГеШп ег а!. ,1983 1) позволяют оценить максимальные пределы возможных значении Ко: 4,3 А < й < 6,3 А (см.рис.3).

о .

Эти ограничения определяют области существования значения £. и то.

которые выделены на рис.5 заштрихованными участками графиков. Приближенное значение И з 8,5 А, характеризующее "полуглубину" узкой бороздки В формы ДНК, отмечено черными пунктирными линиями, которые определяют соответствующие значения остальных зависимых переменных: 1=6,2 А, т=30°, У=20°. Эти значения представляются, в первом приближении, наиболее предпочтительными для соответствующих структур конструируемых молекул изоспиральных лигандов.

Специальное отложение 1о, то в полярных координатах, представленное на рис.ба, может быть использовано в качестве шаблона, определяющего взаимное расположение 3-х соседних реакционных центров в молекуле лиганда. Позиция среднего атома изображена на этом рисунке кружочком, а разрешенные положения центров 2-х соседних атомов находятся в пределах коротких сегментов, изображенных утолщенными линиями.

Очевидно, что проверочные сопоставления следует проводить с соответствующими проекциями изоспиральных структур на плоскость шаблона. Практически, эту процедуру можно упростить, используя плоские изображения молекулярных структур, если принять во внимание, что соответствующие отклонения положений реакционных центров не превосходят по величине 0,1 +0,2 А, поскольку И а 20°, ( см. рис.Эг К

Сопоставление шаблона с олигобензимидазольнои (моделирующей остов Хт) а также с олигопирролкарбоксамиднои структурой (моделирующей остовы Нт и ДМ) представлено на рнс.60,в. Принимая во внимание возможность вращения вокруг одиночных связей, модно заключить, что обе структуры способны к образованию В ДНК-подоб-ноя изоспирали. Однако значения Е. в обоих случаях слегка превышают значение верхнего разрешенного предела. Этим можно объяснить причину наблюдаемого в эксперименте закручивания двойной спирали ДНК на угол порядка 10°, в расчете на одну связанную молекулу антибиотика нетропсина (С.Зпоипои et а1.,1983 1.

Проверка структур двух изолексинов, предложенных Гудселом и Дикерсоном (1986), представлена на рис.7а,о и предсказывает некоторые характерные свойства для каждого из этих лигандов. Так, пир-рол-кетон-подобные остовы (а) могут быть использованы при конструировании лигандов, связывающихся в узкой бороздке ДНК, но характеризуются значениями 1.о, меньшими, чем нижний разрешенный предел. В результате этого, возможно, связывание подобного типа лигандов

4.5 А< 1_ < 5.А А

Ы

N

М

Рис.6. Шаблон (а) и его наложения на остовы красителя "Хехст

33258" (6 1 и антибиотика дистамицина А (в). Нарисованы только

а-свяэи, атомы водорода не показаны. • - атомы азота, о - атомы кислорода.

м

(в).

И

Рис.7. Применение шаблона для проверки возможности использовать молекулы лигандов в качестве секвенс-специфичных соединения, связывающихся в узкой бороздке ДНК. а,б - изолексины, предложенные Гудселом и соавторами (1985); в,г - предлагаемые новые структурные мотивы, демонстрирующие лучшее соответствие с шаблоном. реакционный центр .молекулы лиганда (атом азота

или кислорода). Положения других гетероатомов не детализированы. (См. также подпись к рис-6).

будет сопровождаться некоторым раскручиванием двойной спирали В то же время, пиридин-амин-подобные остовы (б) с очевидность! не соответствуют шаблону и практически не имеют 'перспективы б\ использованными в будущем конструировании ДНК-специфичных лекарственных препаратов.

На рис.7в,г предлагаются новые структурные мотивы, котор! были найдены с помощью описанной выше процедуры. Эти структур! обнаруживают значительно лучшее соответствие с шаблоном и, благодаря этому, обладают большей свободой в необходимой подстройке к существующим в реальности локальным отклонениям ^ Формации двойной спирали от усредненных параметров В формы ДН11 Предложенные структурные мотивы могут также оказаться более пр емлемыми для практического синтеза.

Представленные в настоящем разделе геометрические соотнои ния являются необходимым условием образования секвенс-специфич комплексов и позволяют сразу, без проведения серии трудоемких экспериментов и дорогостоящих синтезов, отсеять целый ряд соединения как бесперспективные. Главным следствием представле ного выше анализа являются впервые введенные для лигандов, изо метричных узкой бороздке ДНК, аналитически связанные параметры г и I. (см. рис.5 и ба) а также оценки их возможных значе

о о с

V Й <26 + и I а (4,9 * к.

о - 3 о -0,4

Для удобства практического применения аналитическая зависимость между I. и то представлена в виде плоского шаблона который может служить эффективным инструментом (возможно, с поыошью соответствующей компьютерной программы) для химиков-органиков, разрабатывающих стратегию синтеза секвенс-специфичн! ДНК-связываюшихся фармакологических соединений.

Аналогичный подход может быть также применен при конструи| вании лигандов, специфичных к А и г формам ДНК или к двухспира; ной РНК.

2. СИСТЕМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПРОЦЕДУР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ СЕКВЕНС-СПЕЦИФИЧНЫХ ЛИГАНДОВ С ДНК В РАСТВОРЕ.

На основе изложенных выше модельных представлений были специальным образом подобраны, а в некоторых случаях модифицированы соответствующие методики физико-химических исследовании, составившие в совокупности систему экспериментальных процедур, достаточную для установления основных структурных и энергетических параметров комплексов секвенс-специфичных лигандов с ДНК. Рутинная последовательность основных этапов исследования такой направленности может быть представлена следующим образом:

- выбор метода регистрации комплексообразования и экспериментальных условия, оптимальных для изучения секвенс-специфичного типа комплекса;

- выяснение конформации участка двойной спирали ДНК, входящего в состав комплекса с молекулой лиганда;

- измерение протяженности участка, занимаемого молекулой лиганда при связывании;

- установление мест локализации связанных молекул лиганда на поверхности двойной спирали ДНК;

- изучение природы связей, вносящих основной вклад в образование секвенс-специфичного комплекса между лигандом и ДНК;

- определение в молекуле лиганда числа и типов реакционных центров, специфичных к определенным парам основания в составе двойной спирали ДНК;

- применение молекулярных моделей и конформационных расчетов для проверки предполагаемых пространственных структур комплексов лиганд-ДНК.

Подробное изложение обозначенной выше системы экспериментальных процедур будет представлено в следующем разделе, посвященном ее практическому применению для определения пространственных структур комплексов с ДНК простеяших секвенс-специфичных лигандов, изученных нами.

Все эксперименты (если это не отмечено особо) проводились в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6.8, Ы0~4 М ЕБТА, Г=20°С.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ СТРУКТУР КОМПЛЕКСОВ АНТИБИОТИКОВ НЕТРОПСИНА, ДИСТАМИЦИНА А И КРАСИТЕЛЯ "ХЕХСТ 3325Й

Из известных к настоящему времени секвенс-специфичных лигандов, удовлетворяющих требованиям, сформулированным в п.1.2

простейшими по своей химической структуре как раз и являются, у: упомянутые в п.1 противоопухолевые антибиотики нетропсин (НТ) и дистамицин А (ДМ), а также флуоресцентный краситель "Хехст 33251 (Хт) (см. стр.7). АТ-специфичность связывания с ДНК этих соедин* нии была впервые продемонстрирована, соответственно, в работах Циммера и соавторов (1970) и Мюллера и Гаутера (1975). Однако ни молекулярный механизм такой АТ-избирательности связывания, ни какие-либо корректные указания на пространственные структуры комплексов этих соединении с ДНК не были известны;

Ниже будут представлены основные этапы наших исследований, в ходе которых с помощью системы процедур, упомянутых в п.2, был установлены молекулярные механизмы узнавания АТ пар в ДНК молекулами антибиотиков нетропсина и дистаыицина А, а также красителя "Хехст 33258" и их аналогов.

3.1. Выбор экспериментальных .условии, оптимальных для изучения АТ-специфичного типа комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК.

Хорошо известно, что низкомолекулярные лиганды образуют, как правило, несколько типов комплексов при связывании с ДНК. Поэтому, нами были проанализированы спектры оптического поглощения, кругового дихроизма и флуоресценции Нт, Дм и Хт в комплексах с ДНК и синтетическими полидезоксирибонуклеотидами и найдены для каждого соединения такие экспериментальные условия, при которых образуется лишь интересующий нас АТ-специфичный тип

+ [молекула лиганда1

I '

комплекса:

Так, по представленным в качестве примера на рис.8 собственным спектрам КД Хт в комплексах с различными полинуклеотидами легко определить и охарактеризовать спектрально условия образования ат-специфичного (спектры заштрихованы толстыми линиями) и неспецифичного (спектры заштрихованы тонкими линиями) типов комплекса:

а(лт)

; Рис.б. Собственные спектры молярного КД Хт в комплексе с полинуклеотидами. 1 - полиШ А-Т) Ьполи(<1( А-Т) 1 <г=0,01); 2 - ДНК тимуса теленка (2а - г=0,01, 20 - г=0,5>; 3 - полиСсК 1-С) !• • поли(<1(1-С) ] г=0,01); 4 - поли!й(С-С)]«поли(с1(й-С) 1 (г=0,01); 5 - ДНК тимуса теленка, находящаяся в А форме (г=0,1);

6 - двухспиральная РНК (г=0,05 ). А форма ДНК получена в растворе, содержащем 70Х этанола и 5.10"4 М ИаС1, по методу В.И.Иванова и'соавторов (1973).

Из экспериментальных условий, необходимых для образования АТ-специфичного типа комплекса, следует отметить наличие АТ или 1С пар в полимере, относительно низкую'степень заполнения полимера связанными молекулами лиганда (тем ниже, чем меньше АТ-состав ДНК) а также достаточно высокие значения ионной силы растворов (I№01*0,25 М для Хт и (№С11?0,06 М для Нт и ДМ, см.рис.9е ).

3.2 Доказательство наличия В-подоОнои конфориации участков ДНК, входящих в состав комплексов Нт-ДНК, ДМ-ДНК и Хт-ДНК.

При выяснении пространственной структуры комплексов низкомолекулярных соединений с ДНК первостепенную важность приобретают сведения о конформации участков ДНК, входящих в соста комплексов. Поэтому существенным шагом, упростившим задачу отыскания структур комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК, явился вывод о том, что участки двойной спирали ДНК в местах связывания молекул этих лигандов имеет В-подобную конформацию:

Это заключение вытекает из следующих экспериментальных данных:

1) Нт, ДМ и Хт не образуют АТ-специфичных типов комплексов с двойной спиралью РНК (Zimmer,1971; 13), существующей лишь в А конформации. При связывании этих лигандов с ДНК в 78Z этаноле, стабилизирующем А форму ДНК, наблюдается переход из А-конформации в В (как это показано, например, на рис.1 для случая связывания Нт).

2) Спектры кругового дихроизма (КД) комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК

I ? I

и различными синтетическими полидезоксирибонуклеотидаии могут быть представлены в виде аддитивных сумм спектров связанных форм лигандов и соответствующих спектров нуклеиновых кислот в отсутствии лиганда, как это показано, в частности, на рис.9 и рис.10 на примере связывания Нт и Хт. Использование ДНК и полиде-зоксирибонуклеотидов, имеющих различные формы спектров КД, с целью определения собственных спектров КД связанных молекул лигандов, а также для демонстрации отсутствия значительных конформационных изменения участка ДНК, входящего в состав комплекса, оказалось достаточно эффективным и нашло результативное применение в работах по изучению связывания с ДНК других лигандов, и, в частности - синтетических пептидов (Гурския и соавт. 19в8-91).

Рис.9. (а-д> - Спектры КД комплексов Нт с ДНК и синтетическими

полидезоксирибонуклеотидами. (-) - рассчитанные на моль пар

основании спектры КД полинуклеотидов (1) и их комплексов с Нт (2). (—) - разностные спектры КД, полученные вычитанием спектров (1) из спектров (2). (е) - действие различных концентрация ИаС1 на

относительную величину амплитуды КД в 320 нм. - амплитуда КД

-3 -5

при [ИаС1 ]=10 М. Концентрация полинуклеотидов - 10 М пар основании, г=0,13. (а-г) - 0,4хЗЗС буфер, рН 6,5, 20°С; <д-е) - 0,01x630 буфер, рН 6,5, 20°С £21.

л а

1 ^ .1 ¥

-1-1-!_

250

300 351

250

300 350 Л им

Рис.10. Спектры КД свободных полинуклеотидов 11! и после добавления Хт С 2 ): а - поли(сК А-Т) 1 • полиШ А-Т) 1, б - поли(йА)•поли(йТ), в - ДНК тимуса теленка. 3 - спектры КД, полученные путем вычитания спектров 1 из спектров 2.

-4

Концентрация ДНК, Р/2 =» 1-10 4 М, г = 0,07.

3) Нт, ДМ и Хт не раскручивают суперкоилдную кольцевую ДНК при связывании (М.\^аг1пг, 1973).

»

3.3. Определение размеров участков ДНК, занимаемых связанными молекулами Нт, ДМ и Хт.

Важным обстоятельством, обеспечившим определение структур комплексов, явились полученные нами данные, (подобные тем, что представлены на рис.9 и рис.10), указывающие на то, что основные оптические характеристики, а следовательно и общий характер структур АТ-специфичного типа комплексов лиганд-ДНК не зависят в первом приближении от последовательностей пар основания в участках связывания. Это дало возможность определить стехиометрик комплексов из однозначно интерпретируемых данных по связыванию лигандов с гомополимером поли(¿А )-поли(с1Т). Соответствующие титрующие зависимости представлены на рис.11 и рис.12 для Нт и Хт.

Рис.11. Рис.12.

Рис-11. Зависимость амплитуды КД в 305 нм (в расчете на пару основания) при титровании поли(бАЬполи(с1Т) нетропсином. На вставке представлены соответствующие спектры КД. Цифрами около кривых обозначены значения 2С^Т/Р.

Рис.12. Титрование полинуклеотидов красителем Хт. Величина КД при 360 нм отложена в зависимости от концентрации добавленного Хт, в расчете на пару основания, 2С/ХтР. ( • • ) - поли(с1АЬполи(с1Т);

(оо)- поли(сКА-Т)]«поли!й<А-Т)); ( + + ) - ДНК тимуса теленка; ( ■ ■ ) - ДНК фага Т6; ( п о I - поли1й( 1-С) 1.поли1<Ш-С>); ( л ) - ДНК тимуса теленка, насыщенная дистамицином А в соотношении: одна молекула на 6 пар основания. Р/2 = 1-10 И.

Значения насыщающих уровней связывания, отмеченных на рис.11 и рис.12 пунктирными линиями, позволяют рассчитать стехиометрию комплексов, выраженную в числах, X. пар основании ДНК, накрываемых одной связанной молекулой лиганда (для Нт и ДМ <2 =9, для Хт £=4>:

\й\

I ^

л

Ш]!«

пар □снований

Эти оценки хорошо коррелируют с ван-дер-ваальсовскими размерами Нт, ДМ и Хт и не противоречат (к настоящему моменту данного

изложения) предположению о возможной локализации связанных молекул этих лигандов в одной из бороздок ДНК.

3.4. Доказательство локализации связанных молекул Нт, ДМ и Хт в узкой бороздке ДНК.

Дальнейшее уточнение геометрии комплексов было осуществлено на основании следующих экспериментальных данных, установивших факт локализации связанных молекул Нт» ДМ и Хт в узкой бороздке ДНК:

з'

5

.....

У*

пар □снований

3'

1) наличие остатков глюкозы в широкой бороздке ДНК фагов Т2 и Тб не влияет на связывание Нт, ДМ и Хт ;

2) Нт, ДМ и Хт связываются с поли(с!1) .поли(с1С) и с поли(сН 1-С) ]• •поли[<И 1-С) 1 практически также, как и с полиНА) «полиКИ) и поли(<НА-Т) Ьполи1(НА-Т) 1 (см. например рис.8 и рис.12), но не образуют сильного типа комплекса с полидезоксирибонуклеотидами, состоящими из СС пар основания. Однако единственное различие между полимерами, состоящими из СС пар и полимерами, состоящими из 1С пар, заключается в том, что у последних в положении 2 пуриновых колец отсутствуют аминогруппы, выходящие в

узкую бороздку.

3) последуощие эксперименты по метилированию показали, что антибиотики ДМ и Нт действительно экранируют от метилирования диметилсульфатом N3 атомы аденинов, выходящие в узкую бороздку, в то время как уровень метилирования N7 атомов гуанинов, выходящих в широкую бороздку ДНК не изменяется.

4) при связывании Хт с комплексом ДМ-ДНК происходит конкурентное вытеснение молекул ДМ (см. рис.12). Следовательно, оба лиганда занимают одни и те же места связывания на ДНК и вывод о связывании одного из них в узкой бороздке указывает на то, что

и другой тоже локализуется при связывании в узкой бороздке ДНК.

Представленные выше доказательства локализации связанных молекул Нт, ДМ и Хт в узкой бороздке В формы ДНК позволили, с учетом стехиометрических и стерических ограничения, осуществить моделирование структур комплексов и межмолекулярных взаимодействии, которое завершилось построением молекулярных моделей, удовлетворяющих представленным ниже схемам:

СВЯЗЫВАНИЯ нт, ДМ И Хт с АТ ПАРАМИ ДНК-

4-1. Роль водородных связей в образовании АТ-специфичных типов комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК.

Для выяснения природы связей, стабилизирующих АГ-специфичный тип комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК, было исследовано влияние

различных агентов на стабильность этих комплексов. На рис.13 .на примере связывания Хт с ДНК представлена зависимость доли недиссоциированного комплекса от концентрации различных ионов и мочевины.

1,0

0,5

Рис.13. Устойчивость комплекса Хт с ДНК тимуса теленка к действию различных концентраций НаС1 (•), 1.1С1 <□), мочевины (о) и гуанидинхлорида (»1. С л и Сь - концентрации добавленного и

связанного Хт, соответственно. Концентрация ДНК, Р/2 = 2-10"5 М.

Как следует из этого рисунка, даже насыщающие концентрации НаС1 и в М 1.1С1 не приводят к существенному уменьшению константы связывания, т.е. стабильность комплекса обеспечивается не только ионными взаимодействиями. В то же время комплекс диссоциирует под действием 4,5 М гуанидинхлорида - агента, специфически разрушающего водородные связи. Этот факт дает весомые указания на существенную роль водородных связей в стабилизации комплекса Хт с ДНК.

Устойчивость комплекса к воздействию больших концентрации мочевины (до 8 М) связана, по-видимому, с дополнительной стабилизацией комплекса Хт-ДНК за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных групп в молекуле красителя и отрицательно заряженного сахарофосфатного остова. Действие мочевины, как незаряженного разобщителя водородных связей (в отличие от положительно заряженного гуанидина) не компенсирует это взаимодействие.

Аналогичные зависимости были получены также и для Нт и ДМ,

что приводит к выводу о наличии и ключевой роли водородных связей при образовании АТ-специфичных комплексов этих лигандов с ДНК.

4.2. Определение числа реакционных центров, являющихся нуклеотид-спеиифн'пшмн функциональными группами в молекуле лиганда. Отождествление АТ-специфичных реакционных центров с НН-групнаии, регулярно расположенными вдоль остова молекул Нт, ДМ и Хт.

В п.1.2, анализируя возможность образования спиралей, изо-геометричных В форме ДНК и построенных на основе олигопирролкар-боксамидных и олигобензимидазольных структур, мы пришли к выводу о том, что МП-группы, регулярно расположенные вдоль молекулярных остовов молекул Нт, ДМ и Хт, могут служить в качестве доноров водородных связей при взаимодействии с 02 атомами пиримидинов и/или НЗ атомами пуринов. Рассмотренные к настоящему моменту экспериментальные данные, формирующие представление о природе взаимодействия и общем характере структуры комплексов этих соединения с ДНК, подтверждают такую возмозлость. Однако для однозначного отождествления конкретных химических групп в молекуле лиганда с АТ-специфичными реакционными центрами оказалось необходимым'разработать дополнительный подход, основанный на сопоставлении химической структуры лиганда с его феноменологической моделью, характеризуемой определенным числом реакционных центров.

Для молекул лигандов, проявляющих лишь АТ-специфичность связывания, модельное представление, изображенное на рис.2, упрощается (см. рис.14), а выражение (1) для константы связывания на природных ДНК (в предположении случайного распределения АТ и й»

GC пар) переписывается следующим образом:

к = К -<Х + X К**>"АТ (9)

о АГ AT ОС ОС

Поскольку связывание Нт, ДМ и Хт с полимерами, состоящими только из GC пар, не выявляется в рутинных экспериментах (из-за низкой константы связывания) то можно считать, что » К**. Это

AT ОС

позволяет свести (9) к предельно упрошенному виду:

.„ п - AF /RT д„ - At*l/RТ

К = V(Xat-K£) ' где: ко= е ° • кат= е 1101

Логарифмирование (10) дает линейную зависимость In К от In Хдт с тангенсом угла наклона, равным пАТ:

Irl К =( In К + (1 .In КА*) + п ,-1п Х.„ (11)

о AT AT AT AT

Более строгое рассмотрение, изложенное в 112 1, приводит к аналогичному результату: 1 In К

п = Ни --(12 1

Т ^АТ*1 * 10 ХАТ Таким образом, число, пдт, реакционных центров в молекуле лиганда, можно определить по начальному наклону зависимости In К от In ХАТ, которую легко получить из изотерм адсорбции лиганда на ДНК с различным составом пар оснований. В качестве примера на рис.15 приводятся серии соответствующих изотерм адсорбции в отложении Скэтчарда для Нт (а-б) и Хт (в-д). Значения констант связывания определялись из пересечения изотерм с осями ординат.

Как следует из данных, представленных•на рис.16, сопоставление теоретических зависимостей, построенных согласно (11), с аналогичными отложениями, построенными экспериментально, позволяет определить величину пдг, которая оказалась равной 3-м для обоих лигандов. Таким образом, молекулы Нт и Хт имеют по 3 АТ-специфичных реакционных центра (или, строго говоря, для связывания каждого из них с наибольшей энергией взаимодействия необходимо по 3 AT пары в составе двойной спирали ДНК). Аналогичный результат: пдт = 3, был получен также и для различных аналогов ДМ, содержащих 2 пирролкарбоксамидных фрагмента.

- 6

г/гп хЮ

-'—г

0.5

(а)

о

- о

о

л 0 л о д

, до • й

••■jo

■ " '_I_L.

poly(dA-dT) • poly(dA-dT)

73% AT

58% AT

6 гх10'

г/m * 10

0 2 4 6 гхЮ'

-!-1-г"

о-С.perl а-срагП »-Calf. thym. \ *'£.coti '

о

h \

Рис. 15. Изотермы адсорбции Нт < a - б ) и Хт I в - д ) на синтетических полидезоксирибонуклеотидах и природных ДНК с различным составом пар основании: ДНК М. lysodelktlcus (25%. AT); ДНК Thermus species Т 135,6%. AT); ДНК E. coll 150» AT); ДНК тимуса теленка I 56% AT); ДНК фага Тб (63% AT); ДНК Cl.perfrlngen-

се (72% AT). 0,05 М фосф.буфер, рН 6.3, 5.10"4 М ЕДТА, t=20°C. (а-б) - 0,3 М NaCl, 1в-д) - 0,2 М NaCl.

ßn XAT 0

6, xA7 0

HjN

■ ho

NH;

CHa

■ Л <" ' I I I lli I

Рис.16. Сопоставление экспериментальных ( • ) и теоретических (■

зависимостей In К от In X

для Нт (а) и Хт (01. Наклоны

теоретических зависимостей соответствуют схематически изображенным моделям как неспецифичных молекул, так и молекул, содержащих от 1-го до 4-х АТ-специфичных реакционных центров. Внизу представлено сопоставление удовлетворяющих эксперименту феноменологических моделей с химическими формулами молекул лигандов.

На рис.16 (внизу) приводится сопоставление феноменологических моделей лигандов с химическими формулами, в результате которого можно отождествить реакционные центры с конкретными химическими группами молекул лигандов. Для молекул типа Нт, ДМ и Хт такими центрами являются МН-группы пирролкарбоксамидных или бензимийоль-ных фрагментов, которые могут образовывать водородные связи с 02 атомами тимииов и/или с N3 атомами адеиинов при локализации лигандов в узкой бороздке ДНК.

Для демонстрации эффективности применения метода логарифмических отложений, на рис-17 и рис.18 приводятся аналогичные сопоставления, выполненные нами с другими лигандами, исследование которых не является предметом настоящей диссертации. На рис.17 представлена оценка числа ОС-специфичных реакционных центров в

молекулах актиномицииа О и его аналогов (п„ =1), а также в молеку-

ос

лах Сис-актиномицинов (пос=2). На рис-18 представлена оценка числа АТ-специфичных реакционных центров в молекулах аналога нетропсина (пат=3 1 и бис-нетропсина (пдтг=6).

Линейный характер экспериментальных зависимостей свидетельствует также об адекватности выбранной нами физической модели (рис.2 и рмс.14, формула (ИМ реальным молекулярным механизмам секвенс-специфичного связывания.

Рис.17. Сопоставления экспериментальных («,д, □ , д ) и теоретических (-1 зависимостей lri К от In Х„ , выполненные для

ос

зктиномицина D (AMD) и его аналогов, AMD-1 и AMD-2 (отличающихся заместителями в 7-ом положении феноксазонового хромофора, отмеченном волнистом линиии), а также для бис-актиномишшов, bis-AMD-l и bls-AMD-2 (отличавшихся длиной соединительной цепочки). Тангенсы углов наклона прямых линия для AMD и его аналогов равны единице, а для каждого бис-актиномицина - двум. Следовательно, молекула AMD специфична к одной GC паре (п =1), а молекула бис-AMD - к двум GC парам In =2). (М.В.Михаилов и соавт., 1961).

-15 -1 0 -0-5 0 -1 0 -0 5 0

Рис.18. Сопоставление экспериментальных (•) и теоретических 1-)

зависимостей 1п К от 1п Хдг для бис-нетропсина (а) и аналога

нетропсина (б), химические формулы которых изображены внизу рисунка. Тангенсы углов наклона прямых линии, обозначенные числами от I до б, равны числам, п , АТ-специфичных реакционных центров, в соответствии с ФормулойЛП 1 I. В правых ни:*них углах графиков черным цветом схематически изображены феноменологические модели молекул лигандов, удовлетворяющие эксперименту. Из представленных на этом рисунке данных можно заключить, что удвоение числа амидных групп, присоединенных к М-пропилпиррольным фрагментам, приводит, в первом приближении, к удвоению числа, п АТ-специфичных реакционных центров: с 3-х до 6-ти. АТ

4.3. Пространственные модели и молекулярные механизмы

АТ-спешфичности связмвания Нт, ДМ и Хт с ДНК.

Совокупность данных, представленных в 3.1-3.6, в сочетании с проверочными построениями на молекулярных моделях, позволили предложить пространственные модели структур комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК. Более того, возмо.-шость удовлетворить при этом всем экспериментальным данным, исключает перспективу существенных вариации в представлениях как о структуре комплексов, так и об основных факторах, определяющих природу АТ-специфичности связывания этих лигандов.

На рис.19 представлены экспериментально подтвержденные положения схематически изображенных моделей комплексов ДМ (модель для Нт аналогична) и Хт с ДНК. Согласно этим моделям, молекулы ДМ и Хт локализуются при связывании в узкой бороздке В формы ДНК, занимая 5 пар и 4 пари основании, соответственно (см. 3-1-3.4). Олигопирролкарбоксамидныи и олигобензимидазольные остовы молекул ДМ и Хт образуют спирали, изогеометричные В форме ДНК (см. 1.2). АТ-специфичность связывания обеспечивается за счет образования водородных связей между молекулами лигандов и ДНК (см. 3.5-3.6). При этом донорами водородных связей являются НН-группы, регулярно расположенные вдоль олигопирролкарбоксамидного остова ДМ или олигобензимидазольного (связанного с протонированным И-метилпиперазином) остова Хт. Акцепторами водородных связей являются 02 атомы тиминов и/или N3 атомы аденинов, выходящие в узкую бороздку ДНК. Этот вывод находится в полном соответствии с результатами, согласно которым высокой константой связывания характеризуется взаимодействие обоих лигандов лишь с такими синтетическими полидезоксирибонуклеотидами, в которых 02 атомы пиримидинов не вовлечены в образование водородных связей с комплементарными основаниями, а N3 атомы пуринов не экранированы 2-аминогруппой со стороны узкой бороздки.

Как легко видеть из сопоставления олигопирролкарбоксамидной и олигобензимидазолыгой структур (рис.19), основой АТ-специфичности является наличие регулярно располо.тенмых НН-групп, разделенных цепочкой из пяти о-связеи, две из которых входят в состав пятичленного ароматического гетероцикла.

АТ-специфичние реакционные центр« иолекул лигандов

X X

4 НН-груипи 3 НН-группы

Рис-19. Экспериментально подтвержденные положения моделей комплексов с ДНК антибиотика Дистамишша А (слева) и красителя "Хехст 33258" (справа). I - атомы азота, о - атомы кислорода. Внизу дано сопоставление олигопирролкарбоксамидных и олигобенз-имидазольных фрагментов и выделена стереохимическая аналогия, обеспечивающая образование водородных связей с 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов.

Э. ОЦЕНКА СВОБОДНЫХ ЭНЕРГИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ НН-ГРУПИАМИ ПИРРОЛКАРБОКСАМИДНОГО ОСТОВА АНТИБИОТИКОВ ДИСТАМИШШОВОГО КЛАССА И-ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ ПАР ОСНОВАНИИ, ВЫХОДЯЩИМИ В УЗКУЮ БОРОЗДКУ ЛПК.

Выяснение структур комплексов Нт и ДМ с ДНК стимулировзло разработку экспериментального метода количественной оценки способности функциональных групп основания образовывать водородные связи с амидной группой со стороны узкой бороздки ДНК. С этой целью серия производных ДМ, отличавшаяся числом пирролкарбоксамидных фрагментов, была синтезирована С.Л.Грохов-ским для выяснения вклада этих фрагментов во взаимодействие с различными основаниями в составе двойной спирали ДНК. Каждое из этих соединений содержало флуоресцентную дансильную группу, позволявшую проводить измерения констант связывания в широкой области изменения концентраций связанной и свободной форм лиганда. Константы связывания определялись из изотерм адсорбции, полученных для каждого лиганда с различными синтетическими полидезокси-рибонуклеотидами и природными ДНК. (Типичный вид изотерм для случая связывания с поли(бАЬполи(<1Т) представлен на рис.20).

Рис.20. Изотермы адсорбции флуоресцентных аналогов ДМ на поли<бАЬполШ сП), в отложении Скэтчарда. Константы связывания, определенные из пересечения изотеры с осями ординат, равны:

А - Дансил-гли-ДМ-З,

К= ( 5 ,5 - о.аыо7 М"1 ;

Б - Дансил-гли-ДМ-2, К=(2,0 0,2 I • 106 М~ 1 ;

В - Да не и л- г л м- ДМ- 1 . К=(6,0 0 . 5 I • 10 4 М~1

На рис.21 представлено отложение зависимости НТ-1п К от числа амидных групп, присоединенных к пиррольныи циклам.

на поли(йА)-поли!с1Т) - (• •) и поли! (1с i -поли i (1С ) - (■ ■).

Рис.21. Зависимость свободной энергии связывания аналогов ЛМ от числа аыидных групп в молекуле. Значения НТ.1п К были

рассчитаны из изотерм адсорбции

2

15^5 Числа СОМН-г/зулпг

Как следует из этого рисунка, удлинение молекулы лиганда на один пирролкарбоксамидныя фрагмент приводит к увеличению свободной энергии взаимодействия с поли(ЦА)>поли( с1Т) - на 2 ккал/М, а с поли(йО-поли(йС) - на 1 ккал/М. Этот результат позволил дать объяснение природы наблюдаемой АТ-специфичности связывания в терминах, характеризующих изменение свободной энергии при взаимодействии каждого пирролкарбоксамидного фрагмента с определенным типом основания в узкой бороздке ДНК. Действительно, как следует из представленных данных, изменение свободной энергии связывания ДМ с участками ДНК, состоящими лишь из АТ пар, на 4 ккал/М больше, чем изменение свободной энергии при связывании с участком, состоящим только из СС пар. Легко видеть, что соответствующие этим двум крайним случаям константы связывания ДМ (молекулы которого содержат 4 змидных группы) различаются примерно на 2-3 порядка, следствием чего и является наблюдаемая А'Г-специфичность связывания. Важно отметить, что адсорбция этих антибиотиков на участках, состоящих из СС пар, происходит всегда, но обычно (в условиях

большинства экспериментов) такое связывание практически не выявляется на фоне связывания с участками ДНК, состоящими из АТ пар.

Интересно отметить, что константа связывания производных ДМ с альтернирующим полимером поли[с1(С-С) 1-поли(сИС-С) ] (в отличие от поли(с1С) *поли( с1С I столь мала, что соответствующее взаимодействие вообще не удается зарегистрировать. По-Еидиному, альтернирующее положение 2-аминогруппы гуанина стерически препятствует локализации пирролкарбоксамидного остова ДМ в узкой бороздке.

Аналогичные представленным на рис.21 зависимости были получены также для случаев связывания производных ДМ с другими синтетическими полидезоксирибонуклеотидами и различными природными ДНК. Рассчитывая соответствующие изменения свободных энергии по простеишеи аддитивной схеме (см. рис.22) и сопоставляя

Рис.22. Иллюстрация основных представлении,, использованных при расчете величин энергетических вкладов взаимодействии пиррол-карбоксамидных фрагментов с каждым типом основании в составе двойной стирали ДНК 114 1. Для простоты изображена лишь одна из нитей двойном спирали. Суммарное изменение свободной энергии при связывании с изображенной последовательностью 15'-САТС- 3') можно записать следующим образом:

ДК = Д1" Д1 +- ДГ + А1 +• ДГ о С Л т О

результаты расчетов с экспериментом, мы оценили возможные значения энергетических вкладов взаимодействии амиднои группы с каждым типом оснований со стороны узкой бороздки ДНК 114, 18).

Ввиду определенной идеализации представления, изображенного на рис.22, рассчитанные значения ЛГт> ЛГд, ДГС и ДГ0 следует рассматривать лишь в качестве первого приближения в оценке измеряемых величин (14).

Таким образом, взаимодействие одного пирролкарбоксамидного фрагмента с аденином или тимином 1в составе двойной спирали ДНК) характеризуется изменением свободной энергии порядка -(1+2) ккал/М, что сопоставимо с энергией образования водородной связи. Разумеется, значение этой величины определяется не только энергией образования водородной связи, но и обшим балансом всех взаимодействий, обусловленных выходом пирролкарбоксамидного Фрагмента из водного окружения и локализацией его в узкой бороздке ДНК (при этом из узкой бороздки выходит в раствор несколько молекул воды). Однако полученные нами оценки хорошо согласуются с представлением об образовании водородных связей между атомами азота амидных групп антибиотиков Нт и ДМ и 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов (а также, вероятно, с 02 атомами цитозинов ), выходящими в узкую бороздку ДНК.

Следует особо отметить, что представленные выше значения величин свободных энергия явились первыми экспериментальными оценками способности 02 атомов пиримидинов и N3 атомов пуринов к образованию водородной связи с амиднои группой, локализованной в узкой бороздке ДНК.

6. Сопоставление основных структурных параметров комплексов 11т, ДМ и Хт с ДНК, установленных в результате физико-химических исследования в растворе, с данными, полученными впоследствии методой рентгеноструктурного анализа, выполненного в группах Дикерсона и Рима (США).

Как следует из рис.23 и 24, основные структурные параметры комплексов Нт, ДМ и Хт с ДНК, определенные нами в результате физико-химических исследовании в растворе, полностью соответствуют полученным несколько лет спустя в группах Дикерсона и Рича (США) данным рентгеноструктурного анализа кристаллов комплексов этих соединения с двухспиральными олигодезоксирибонуклеотидами. Молекулы Нт, ДМ и Хт, действительно, практически не возмущают структуру ДНК при связывании, локализуясь в узкой бороздке В формы двойной спирали и накрывая, соответственно, 5, 5 и 4 пары оснований.

Предсказанные нами водородные связи между регулярно расположенными Ш группами лигандов и 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов также были обнаружены при рентгеноструктурном анализе кристаллов комплексов. Независимые подтверждения образования таких водородных связей в комплексах Нт и ДМ с ДНК были получены также и методом ЯМР IВ.Ра1е1,1979>.

Следует отметить, что в случае Хт, закристаллизованного в комплексе с двухспиральным олигодезоксирибонуклеотидом 5'-ССССААТТСССй-З', в разных группах были получены структурные решения, различающиеся смещением связанной молекулы лиганда на одну пару оснований вдоль узкой бороздки (см. рис.24). Авторы даже не обнаружили различий в условиях кристаллизации, однако таковые несомненно были и привели к образованию различающихся комплексов. Этот результат весьма поучителен, так как наглядно демонстрирует, что нельзя полностью полагаться на однозначность данных, полученных с помощью метода рентгеноструктурного анализа. Влияние упаковки, наполнителей (спермин и другие противоионы) могут вызвать значительные отличия структуры комплекса от той, которая существует в растворе. Как следует из рис.24, структура комплекса Хт-ДНК, полученная в группе А. Рича (М.Теп^ег а1. , 1933 ) более соответствует структуре, определенной ранее' нами.

л л

Рис.23. Сопоставление основных структурных параметров, характеризующих взаимодействие пирролкарбоксаыидного остова ДМ I данные для Нт аналогичны) с ДНК и полученных о поиошьв физико-химических исследования в растворе (слева), с результатом рентгеноструктур-ного анализа комплекса Нт с двухспиральньи' олигодеэсжсириОонуклео-тидом 5'-ССССААТТСССС-З' (справа). Справа вверху, показан срединный фрагмент структуры закристаллизованного комплекса. На схеме справа внизу, сплошными и пунктирными линиями показаны водородные связи.

NH-группы карооксамкдних сияэеи в качестве АТ-специфичних реакционных центров

образование воюродних связей

локализация в узкой бороздке ДНК

лнганд накрывает 5 пар основании

В-подобная конфориация ДНК

A.S.Zasedatelev, A.L. Zhuze et al.. (1976) DokI. Akad. Nauk SSSR 231. 1006 - 1009.

H.L. Kopka, C. Yoon, D. Goodsell, P. PJura Í R.E. Dlckerson, (1985) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 82, 1376 - 1380.

Р*с.2Л- Сопоставление, основных структурных параметров комплекса Хт-ДНК, установленных в результате физико-химических исследования в растворе 1 слева), с данными ^ентгеноструктуриого анализа, выполненного в двух различных группах (справа). На схемах справа пунктирными линиями показаны водородные связи.

1.8. газеЛа£е1еу, К.V. Ш.1Ла11оу, А.Б. й а.Т. ОигаКу (1960) ПоП. Лкяа. Ыаик ЗБЗИ 225, ?5в - 750.

¡Шт0""

Г.Е. РЛига, К. Еггеакоихак & н.Е. МскегБоп (1987) а. Ио1. В1о1. 122, 257 - 271.

М. Твид, N. Цвшап, СЬ.4. УгеаегАск & А.Н.-а. Иап£ (1988) Нис1. ксгйэ Нее. 16, £671 - 2690.

выводы

1. На основе введенных модельных представлений развита система Физико-химических процедур, позволяющая определять основные параметры комплексов секвенс-специфичных лигандов с ДНК в растворе.

2. Впервые установлены параметры пространственных структур комплексов с ДНК секвенс-специфичных лигандов ненуклеотидной природы -противоопухолевых антибиотиков нетропсина (Нт) и дистамицина А (ДМ), а также флуоресцентного красителя "Хехст 33258" (Хт). Показано,

что молекулы этих соединений локализуются при связывании в узкой бороздке ДНК, занимая, соответственно, 5, 5 и 4 пар основания и образуя спираль, изогеометричную В форме ДНК.

3. Впервые экспериментально идентифицированы взаимнокомплемен-тарные, изоспнрально скоординированные в пространстве химические группы как молекул лигандов, так и оснований в составе двойной спирали, взаимодействие между которыми вносит тот дополнительный вклад в обшую энергию взаимодействия лигандов с ДНК, который обеспечивает наблюдаемую секвсгнс-специфичность связывания.

Установлено, что в молекулах Нт, ДМ и Хт такими группами являются НН-группи пирролкарбоксамидных и бензимидазольных (а также протонированного М-метил-пиперазинового ) фрагментов. Показано, что эти МН-группы образуют водородные связи с 02 атомами тиминов и/или ИЗ атомами аденинов, обеспечивая наблюдаемую АТ-специсричность связывания.

Основные положения моделей найденных нами пространственных структур комплексов с ДНК антибиотиков нетропсина и дистамицина А, а также красителя "Хехст 33258" были подтверждены впоследствии методом рентгеноструктурного анализа, выполненного в группах Дикерсона и Рича I США).

4. Получены экспериментально первые количественные оценки способности 02 атомов пиримидинов и МЗ атомов аденинов (в составе двойной спирали) к образо^-ванию водородных связей с НН-группами лигандов, адсорбирующихся в узкой бороздке ДНК.

В случае производных ДМ рассчитанные значения изменений свободных энергий, характеризующих образование таких связей, оказались в пределах -(1+2) ккал/М ИН-групп, что дало удовлетворительное объяснение природы узнавания подобными лигандами АТ пар ДНК в терминах равновесной термодинамики и стереохимии невалентных взаимодействия.

5. Впервые экспериментально продемонстрирована возможность участия аиидных групп в узнавании последовательностей нуклеотидов ДНК, что послужило впоследствии основой модельного подхода к конструированию и синтезу различных "бис-нетропсинов", а также соединения олигопептидной природы, способных избирательно связываться с последовательностями ДНК, содержащими определенные комбинации АТ

и йС пар.

6. разработаны в аналитическом виде геометрические критерии, которым должны удовлетворять структуры молекул протятенных лигандов, секвенс-специфичность связывания которых является результатом взаимодействий с' функциональными группами основании, выходящими в узкую бороздку ДНК.

С помощью этих критериев был проанализирован ряд химических соединении и предложены для практического синтеза новые структурные мотивы, которые могут оказаться перспективными в создании как секвенс-специфичных ДНК-связываюшхся фармакологических препаратов, так и высокоспецифичиых молекулярных инструментов для анализа структуры генома.

Список работ, опубликованных по. теме диссертации:

1. Zasedatelev, A.S., Gursky, G.Y., Volkensteln, M.Y. "Binding Isotherms of small molecules to DNA". Stadia biophyslca, 1973, B.40 S.79-62.

2. Zasedatelev, A.S., Gursky, G.Y., Zlmmer, Ch., Thrum, H. "Binding of netropsln to DNA and synthetic polynucleotides". Molecular Biol. Reports, 1974, v.l, p.337-342.

3. Колчинския A.M., Мирзабеков А.Д., Заседателев А.С., Гурскии Г.В. Гроховския C.JI., Жузе А.Л., Готтих Б,П. "О структуре комплексов антибиотиков дистамицинового типа и актиномицина D с ДНК: новые экспериментальные данные о локализации антибиотиков в узкой бороздк( ДНК". Молекулярная биология, 1975, т.9, с.19-27.

4. Заседателев А.С., Жузе А.Л., Циммер К., Гроховския С.Л., Туманян В.Г., Гурскии Г.В., Готтих Б.П. "Стереохимическая модель молекулярного механизма "узнавания" АТ-пар при связывании с ДНК антибиотиков дистамицина и нетропсина". Докл. АН СССР, 1976, т.231 с.1006-1009.

5. Gursky, G.V., Tumanyan, V.G., Zasedatelev, А.5., Zhuze, A.L., Grokhovsky, S.I., Gottlkh, B.P. "A code controlling specific binding of proteins to double helical DNA and ENA". In:

M.J.Vogel,Ed. Nucleic Acid-Protein Hecognltlon, Academ.Press Inc.,N-Y,San-Franclsco, Lond., 1977, p.169-217.

6. Zasedatelev, A.S., Zhuze, A.L., Zlmmer, Ch., Grokhovsky, S.L., Tumanyan, V.G., Gursky, G.7., Gottlkh, B.P. "A stereochemical model for molecular mechanism of AT-palr recognition exhibited .by binding of dlstamycln A and netropsln to DNA". Studia biophyslca, 1973, B.67, p.47-40.

7. Крылов А.С., Гроховския С.Л., Заседателев А.С., Жузе А.Л., Гурския Г.В., Готтих Б.П. "Количественная оценка вклада пирролкарбоксамидных групп антибиотика дистамицина А в обеспечение специфичности его связывания с АТ-парами ДНК". Докл. АН СССР, 1976, т.239, с.732-735.

3. Крылов А.С., Гроховския С.Л., Заседателев А.С., Жузе А.Л., Гурскии Г.В., Готтих Б.П. "Взаимодействие флуоресцентно-меченных аналогов антибиотика дистамицина А с синтетическими полидезоксирибонуклеотидами". Биофизика, 1979, т.24, с.181-186.

9. Krylov, A.S., Grokhovsky, S.L., Zasedatelev, A.S., Zhuze, A.L., Gursky, G.V., Gottlkh, B.P. "Quantitative estimation of the contribution of pyrrolcarboxamlde groups of the antibiotic dlstamycln A Into specificity of Its binding to DNA AT pairs". Nucleic Acids Res., 1979, v.6, p.289-304.

10. Заседателев А.С., Михаилов M.B., Крылов А.С., Гурския Г.В. "Механизм "узнавания" АТ-пар в ДНК молекулами красителя "Хехст 33256"". Доклады АН СССР. 1980, т.255, с.756-760.

11. Khorlin, A.A., Krylov, A.S., Grokhovsky, S.L., Zhuze, A.L., Zasedatalev, A.5., Gursky, G.Y. and Gottlkh, B.P. "A new type of AT-speciflc Ugand constructed of two netropsln-llke molecules". FEBS Letters, 1980, v.118, p.311-314.

12. Михайлов M.B., Заседателев А.С., Крылов А.С., Гурския Г.В. "Механизм "узнавания" АТ-пар в ДНК молекулами красителя "Хехст 33258"". Молекулярная биология, 1981, т.15, с.690-704.

13. Zasedatelev, A.S., Mikhailov, МЛ., Krylov, A.S., Gursky, G.V. "Ligand-DNA recognition: molecular mechanism of AT-speciric binding of dye "Hoechst 33258" to DNA". Studla blophyslca, 1982, v.37,

p.197-198.

14. Gursky, G.V., Zasedatelev, A.5., Zhuze, A.L., Khorlin, A.A.. Grokhovsky, 5.L., Streltsov, S.A., Surovaya, A.N., Nlkltln, S.M., Krylov, A.S., Retchlnsky, 7.0., Mikhailov, M.V., Beabealaschvllll, R.Sh. and Gottlkh, B.P. "Synthetic sequence-specific llgands". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983, v.47, p.367-378.

15. Gursky, G.y. and Zasedatelev, A.S., "Thermodynamic and stereochemical aspects of binding interactions between sequence-specific llgands and DNA". Sov. Scl. Rev. D. Physicochem. Biol. 1984, v.5, p.53-139. ,

16. Нечипуренко Ю.Д., Гурския Г.В., Крылов А.С., Заседателев А.С. "Взаимодействие между аналогами антибиотика дистамицина А, адсорбированными на ДНК". Молекулярная биология 1984, т.18, 332-342.

17. Бородулин В.Б., Заседателев А.С., Гурския Г.В., Гроховския С.Л., Готтих Б.П., Жузе А.Л. "Взаимодействие лиганда бис-нетропсинового типа с поли(бАI-поли!dT>: оптические, структурные и энергетические характеристики АТ-специфичного связывания". Молекулярная биология, 1986, т.20, с.1144-1149.

16. Гроховския С.Л., Никитин С.М., Хорлин А.А., Жузе А.Л., Крылов А.С., Михайлов М.В., Заседателев А.С., Гурския Г.В., Готтих Б.П. "Перспективы синтеза производных антибиотиков, узнавших определенны последовательности пар основании ДНК". В книге "Механизмы биосинтез антибиотиков". Москва: Наука, 1966. с.202-217.

19. Бородулин В.Б., Заседателев А.С., Гурскии Г.В., Гроховския С.Л. Готтих Б.П., Жузе А.Л. "Взаимодействие лекситропсина с ДНК: отрицательный результат попытки обнаружения сложной AT/GC-специфичности связывания". Доклады АН СССР, 1967, т.294,

с.1243-1247.

20. Zasedatelev A.S. "Geometrical correlations useful for deslgn'of sequence-speciric DNA narrow groove binding llgands". FEBS Letters, 1991, v.2S1, p.209-211.