Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие с ДНК лигандов пептидной природы, содержащих специфичные реакционные центры к АТ и СС-парам оснований

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие с ДНК лигандов пептидной природы, содержащих специфичные реакционные центры к АТ и СС-парам оснований"

АКАДЕШЯ ШК СССР

институт ашшулйрной биологии

На правах рукописи УДК 577.32

ЛЕЙНСОО Тооыао Аадоевич

f

ВЗАИЮДЕЙСШЕ С ДШ ЛИГАНДОБ ИШтдШИ НН4ЮДЫ, СОДЬВШЩ СПЕЦИФИЧНЫЕ РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ К Й- И СС-ПАРАУ ОСНОВАНИЙ

03.00.03 - молекулярная биология

АВЕОРЕйЕИй диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 19ВВ

Работа выполнена в лаборатории физики биополимеров. Института молекулярной биологии АН СССР.

Научные руководители; член-корр. АН СССР М.В.Волькенштейн кандидат физико-математических наук Г.В.Гурский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.Л.Поляновский доктор физико-математических наук В.И.Полтев

Ведущая организация - Московский государственный универ ситет им. М.В.Ломоносова, Межфакультетская проблемная научно исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского

Защита состоится " 3/" 1988 года в ¿£чюо

на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984» Москва, 4-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'"Актуальность проблемы. Значительный прогресс, достигнутый в --последние года в выяснении молекулярных механизмов узнавания последовательностей пар оснований олигопептидными антибиотиками и пептидами открывает новые возможности для рационального конструирования и синтеза химических соединений с избирательностью связывания, близкой к избирательности связывания бактериальных репрессоров. Основная проблема при синтезе этих соединений состоит в том, чтобы ввести атомные группы, которые мог;т служить в качестве А1'- и бС-специфичных центров, в состав полимерной цепи, способной присоединяться к основаниям в одной из бороздок ДНК. Один из возможных путей синтеза лигандов, способных "Читать" протяженные последовательности А!- и ОС-пар оснований в узкой бороздке ДШ, состоит в ковалектном присоединении к аналогам антибиотика нетропсина пептидов, способных образовывать антипараллельную ^-структуру в растворе, Среди различных пептидов, которые способны специфически взаимодействовать с ДМС. тривалин об- ■ ладает наиболее простой химической структурой, Дчнснлгидразид тривалнка -ассоциированной форме связывается более прочно с полиМ8).полиМС), чем с полз ';\)>поли(<1Т) /Стрельцов и соавт.» 1380/. Поэтому в настоящей ргсотв была исследована возможность использования в составных лкгаидах а качестве ДГ-специфичных элементов аналогов петропсшт, а в качестве ОС-узиапцих элементов - фрагментов тряваякна, глицилтетравалина и некоторых других пептидов. Выяснение механизма узнавания ОС- и АТ-пар этими соединении» может позволить решить проблему направленного синтеза лигандов, способных специфически связываться с заданной поеледо-• вательностью пар. оснований ДШ.

Цель работы состояла в исследовании связывания с различными природными ДШ и синтетическими полинуклеотидами аналогов иетроп-сина, к которым ковалентно присоединены различные пептидные фрагмента. Исходя, из термодинамических параметров связывания различных аналогов, необходимо было оценить вклад различных групп ли-ганда в обеспечение специфичности связывания. Ваяно было выяснить, каким структурным требованиям должен отвечать составной лигавд, чтобы стало возмоянш специфическое связывание нетропси-нового и пептидного фрагментов одновременно.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые исследованы комплексы ДНК с аналогами нетропсина, содер-кащиыи фрагменты V.al-Val-Val-, Dns-Gly-Val-Val-Val- И Gly-Val-Val-Val-Val-. Показано, что эти лиганды образуют ассоциаты в водном растворе и ыетаноле. Специфичность их связывания с ДНК зависит от того, в какой агрегатной форме они находятся в растворе. Выяснено, ,чч'о лиганды и ыонамерной форме обладают такой же специфичностью связывания, как и анодоги^нстропаика, не содержанию ■гривалина или глицилтетравалина, BJJ -ассоциированной форма пептидные аналоги нетропсина содержат, кроме Ж-специфичных реакционных центров, еще и центры, специфичные к GC-парам оснований ДШ. Показано, что пептидные фрагменты образуют небольшойji-сдой и связываются преимущественно с SC-оогатыът участками ДШ, в то вреия как каждый нетропсиновый фрагмент в составе димера образуем специфические связи с «ремя /й'-паращ.

Впервые исследовано взаимодействие с ДНК нового класса бис-нетропсинов, в молекулах которых два нетропекнолодобных фрагмента ковшзнтно присоединены к двум пептидам типа Gly-Cyo-Gly-NHg» связанным друг с другом при помощи S-S связи. Показано, что этот бис-нетропсин содержим АХ- и ^¡-специфичные реакционные центра. Анализ профилей нуклеазного расщепления комплексов бис-нетропсии и аналога нетропсина, ковалентно связанного с тривалином, показывает, что бис-нетролсин и диыерная форма аналога нетропсина предпочтительно взаимодействуют с последовательность?) 5'-AAAG&-ТИ'-З» на ДШ и связываются менее прочно с более широким классом последовательностей, в которых два блока Al'-пар разделены двумя GC-парамн.

Эти результаты имекл1 общее значение, так как они показывают, что олигопептиды в $ -ассоциированной форме образует слецифИ' ческие контакты с основания!.« ДШ в узкой бороздке. Результаты настоящей работы могут быть использованы при конструировании и синтезе других лигандов, способных узнавать различные последовательности $.'- и GC-nup на ДНК. Некоторые из синтезированных лигандов обладаю? высокой избирательностью связывания и могут найти применение как лекарственные средства и как инструменты исследования в различных областях биологии.

Публикации. материалы диссертации опубликованы в 7 работах,

Апробация работы. Результаты работы били доложены на Симпозиуму с участием стран-членов СЭВ и СФНи "Физико-химические

свойства биополимеров в растворе и клетках" Шущино, 1985), на У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на Х1И1 Научно-технической' конференции молодая исследователей ФГИНГ АН УССР (Харьков, 1986), на 9-ой Конференции молодых учених Института органического синтеза АН ЛатвССР "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1987), на международном симпозиуме "Физика-химия А® и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987), на Ш Всесоюзном симпозиум« по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), а также на конкурсе научных работ молодых ученых ИМБ АН СССР (1987).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /V/ страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и рисунков. Список цитируемой литературы содержит 135 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

На рис. I представлены химические формулы аналогов нетроп-сина, ковалентно связанных с различнши пептидами. Все аналоги содержат два и-пропилпирролкарбоксамидных фрагмента, к Н-концу которых ковалентно присоединены Gly-Gly- (аналог I), Val-Val-Val-Gly~Gly-'(аналог Ш, Dns-Gly-Val-Val-Val-Gly-Gly- (аналог Iii) и Gly'-Va 1-Va 1—Va 1-Va 1-Gly-Gly- (аналог Ш. Здесь Баз -остаток Ь-диметиламинонафталин-1-сульфокислоты. В аналогах I—1У последовательность'к-с^-с в пептиде совпадает с направлением K-G^-Cg-C в к-пропилпирролкарбоксамидных фрагментах. В отличив от этих соединений в аналоге У остатки тривалина присоединены к N-пропилпирролкарбоксамидным фрагментам в противоположной ориентации.

Химические формулы бис-нетропсинов У1 и УП представлены на рис. 2. Пептидная часть этих соединений состоит из двух пептидных цепей, ковалентно соединенных между собой через S-S мостик. К Ii-концу каждой пептидной цепи через остаток янтарной кислоты ковалентно присоединены нетропсинойые фрагменты, состояние из двух К-пропилпирролкарбоксамидных единиц. Все соединения были синтезированы В.А.Николаевым, С.Л.Гроховским и А.Л.Шузе в лаборатории ' химии белкового синтеза ИМБ All СССР.

Исследование агрегатных форм лигандов в растворах проводили с помощью гель-хроматографии и спектрофотоыетрических методов.

сн,

- = Н

кн,-сн,-со«н-сн,-а1-й-сн!-сн,-с, ® |

»ЛР. «У: си, см ся Ьн .¿н-ши-сн-сонн-си-

со«н-сн,-сомн-сн1-со-В-сн,-си1-с; в и

и,с£и, н^: сн, нлсн,

(0 У-И,-1«-СНгСйМН

сн -сн сн см-сои-Ы-ажн-Ы-!

сокн-с^-сонн-сн^со-Й-сн^сн,-^ ® ||| кн,

^ и V

Н,-СНГС0Ш-СН-С£*«-СН-С£Ш-СН-С0КИ-СН-С0*Н-СН,

_ А14"!

СО»|-СН,-СО-В-СН1-СН,-С' &

н/усн, Н^Н,

ННгС^.СО-К-СН^-МНСО-С^-МНСО-СН-МНСО-СН-ННСО-СН.КН,

Рис. I. Химические формулы соединений 1-У.

Ь|С

Г-Т-ЧКО'-Л }

Л^.-кнсо-г 3 с

г.—Я~«НСО.СН,.СН,-СО- зЯ

КН,), 'Н1

С",

«^-СО-С^-ЖСО-СН-к^СО-С^-ЫИ- К

в -НН-СН,-СОНН-СК-С£Ж.СИ,-СО-МН,

см, сн, ,

vii

Н^)-С0-СН,-»С0-СН-»<0-СН,-1«- Я

Рис. ¿. Химические формулы соединений У1 и УП.

Исследование связывания аналогов Нвтропсина с ДНК лроводи-ось методом кругового дихроизма (КД) и флуоресцентным методом, вободная ДНК в В-форме и аналоги нетропсина не обладают собст-енным КД в области спектра 300-400 нм, в то время как для комп-ексов этих лигандов с ДЖ наблюдается характерная положительная олоса КД с максимумом при 320 км. Взаимодействие с ДНК пептидных рагментов, содержащих флуоресцентную метку, можно было регист-ировать с помощью флуоресцентного метода.

Константу связывания (К) и кажущееся число связывающих мест hap) можно рассчитать из изотермы адсорбции в отложении Скэтч-рда согласно формулам

..K=gm(P/m) (I)

'■Пар' =•«)

десь г - количество связанных молекул лиганда в рассчете да napiy снований ДНК, и- концентрация свободного лиганда.

Вели лиганд содержит только ДГ-специфичные реакционние центры, то средняя константа связывания лиганда может иыгь рассчита-ia по формуле

К = к;

Sat ХАТ (3)

•дв KQ - константа, характеризующая вклад неепемфических взаимо-1ействий между лигандом и ДОК; s^ - константа стабильности связи шжду одним реакционным центром лиганда и ДГ-пароЙ оснований ДШ;

- доля Я-пар в Д®. Зависимость от 1иХдт представляет ¡обой прямую линию, наклон которой равен числу реакционных цент-юв п . Для общего случая связывания с ДШ двухкомпонентного ли-•айда, содержащего п<| {&-специфичных центров и »2 ©J-специфичнььс центров, значения ^ и п2 можно определить из наклоне - зкеперит «витальных зависимостей 1пк от 1йхд5 и lnr os iuxqq в пределе, согда X^j-vl и Xqq—»1 соответственно.

П. с(6пК

" ЗД (4)

fe жЬ (б)

где Xqc » i - ХАТ>

Основные эксперименты были выполнены в буфере А (0,001 M На-какод!.латный 'буфер, 0,0001 M ЭД1А, рН 7,0), буфере Б (0,005 M Ва-какодилатный буфер, 0,0005 M ЭДГА, рН 7,0) и буфере В (0,05 M На-какодклатный буфер, 0,005 M ЭД'А, рН 7,0).

Образование мешмолекулярных ассоциатсв в водных и метанольных растворах аналогов нстсопеина П-У • С помощью гель-хроматографии на колонках с Bio-Gel Р-4 и Bio-Gel Р-Ю было продемонстрировано, что в водных растворах аналогов П-У наблюдается увеличение кажущейся молекулярной массы аналогов, обусловленное образованием ассоциатов. На рис. 3 представлен профиль элюции аналога Ш в буфере А, а также профили белков и пептидов с известной молекулярной массой, служивших в качестве маркеров. Молекулярная масса аналога 111 равна 1126. Если концентрация аналога, наносимого на колонку с Bio-Gel Р-10, равна I-КГ3 М, то, как видно из рис. 3, в водном растворе находятся агрегатные формы, содержащие от 2 до 12 молекул аналога. При уменьшении концентрации наносимого на колонку аналога в 10 раз, а также при введении в хроматографическую систему метанола (20/Ь по объему), агрегаты высокого порядка исчезают, а остаются только низкомолекулярные ассоциаты, состоящие из 2-4 молекул аналога.

Образование ассоциатов проявляется в том, что в спектрах поглощения аналогов П-У наблюдаются концентрационно-зависимые изменения, в то время как форма спектра поглощения аналога I, не образующего ассоциатов, не изменяется в области концентраций от I.Ю м до МО"3 М. Из рис. 4 видно, что при увеличении концентрации аналога П значительные изменения в спектрах нвблвдаются в области поглощения света амидными связями пептидного фрагмента (200-230 нм), в то время как молярное поглощение при 297 ни практически не зависит от концентрации и совпадает с поглощением аналога 1, не содержащего тривалина. Это отражает тот факт, что именно фрагменты тривалина в молекулах аналога П участвуют в процессе образования ассоциатов. Используя зависимости оптической плотности от концентрации, измеренные для той части спектра, где наблюдаются наибольшие спектральные изменения, можно рассчитать константу дныершации. Рассчет проводился методам последовательных приближений с использованием графического отло&екия

~ £пр)-1 от GÎI (Brealoff and Crothers, 1976). Здесь Cjj -

>ис. 3. Гель-хроматография соединения Ш на колонках с Bio-Gel '-10 я Р-4.

С) Профили элюции лиганда и маркерных белков на колонке Bio-Gel »-10 0,8 х 180 сы в буфере А (свободный объем VQ = 31,3 мл). Е -жтическал плотность при 29? нм элюированного раствора, измерен-¡ая относительно плотности свободного объема. Концентрация яиган-W при нанесении на колонку была равна 2,4» Si. В качестве тркероа использовались: а - мяоглобин лошади (М = 17800 Да); б -ц1Тохрсм с (M = 12300 Да); в - инсулин (M = 600 Да); г - А-цепь шсудина (М = 2530 Да); д - бацитрацян Ш * 1450 Да). !) Профиль элщии соединения Ш на колонке Bio-Gel Р-ГО в зависи-!0сти от молекулярной массы агрегатов. Молекулярные массы предъявлены в логарифмическом масштабе.

О Профиль элюции лтенда на колонке Bio-Gel Р-4 1,0 ■»• 150 см в »уфере А, содержащем 20% (по объему) метанола (свободный объем Г0 =» 5Ь,0 да), в зависимости от молекулярной кассы агрегатов [онцентрация при нанесении на колонку 1,6« ИР* М. I) То ке, но концентрация лигавда равна 1,6* 10 М.

«олярнчя концентрация мономеров, Sj - коэффициент молярной экс-;инщии мономеров, 6ао - поглощение исследуемого раствора в рас-

а -

В

300 X.«

Рис. 4. Спектры молярного поглощения соединения П в метаноле (А) и буфере А, содержащем 2% метанола (В), полученные при , различных концентрациях лиганда; рассчитанные спектры молярного поглощения мономерной (--) и димерной —) формы лиганда,в метаноле (В) и буфере А, содержащем 2$ метанола (Г). Концентрации лиганда (С) равны:

А) I, С

1.79-10 М; 2, С = 7,14-Ю~7

3, С = 5,69- КГ° М.

Б) I, С = 1,15.10~7 Ы; 2, С = 6,89-Ю"7 М; 3, С = 5,47.КГ6 Ы. На вставках представлены экспериментальные зависимости оптической плотности при 220 нм от концентрации аналога, на основании которых были рассчитаны значения константы диыераэации.

счете на моль аналога и I см оптического пути. В таблице I представлены экспериментальные значения константы дамеризации Кс| длг аналогов П-У в водном растворе и метаноле. Видно, что зксперимег талькые значения Кадля аналогов П-У в метаноле.близки друг к ди гу. переходе от метанола к водному раствору Кс( уменьшается I 2-4 раза для каздого из аналогов.

- У -

Таблица I. Константы димеризации соединений П-У в ыетаноле и буфере А, содержащем 2% метанола (по объему).

Соединение V4 | Константа димеризации, К х 10, гГ

Буфер А Метанол

II 6,0 + 1,0 II + 2,0

III 7,0 + 1,0 12 + 2,0

1У . 2,2 + 0,4 Ю.♦ 2,0

У 2,5 + 0,4 8,9 + 1,5

Взаимодействие с ДНК аналогов нетропсина 1-У

Связывание аналогов 1-У сопровождается появлением интенсивной положительной полосы КД с максимумом при 320 нм, которая характерна для комплекса ДНК b нетропсинон. Наличие этой полосы в спектре КД свидетельствует о присоединении и-пропилпирролкарбокс-аыидных фрагментов аналогов нетропсина с ДНК.

Взаимодействие с ДНК фрагментов дансилглицилтривалина и Н~ пропилпирролкарбоксамидных фрагментов,'входящих в состав аналога Ш, моано регистрировать одновременно и независимо с помощью флуоресцентных измерений и измерений амплитуды КД при 315 нм. Эти эксперименты показали, что при малых уровнях связывания (О < г < 0,02) аналог Ш связывается преимущественно на изолированных связывающих местах на ДНК в форме мономера с помощью водородных связей между н-пропилпирролкарбоксамидными фрагментами и AI-парами ДНК. Что касается пептидного фрагмента, то в комплексах с малыми значениями г он практически не взаимодействует с ДНК, о чем свидетельствует отсутствие изменений в форме спектра флуоресценции при образовании комплекса по сравнению со спектром флуоресценции свободного аналога. Резкий рост интенсивности флуоресценции наблюдается при г » 0,05, когда в свободном растворе значительная часть молекул аналога in находилась в димерной форме. Преимущественное связывание димеров аналога Ш с ДНК вызывает смещение равновесия между различными агрегатными формами аналога Ш в растворе в сторону образованияJJ-ассоциированной димерной формы. Это проявляется в том, что в спектре КД комплекса аналога iU с ДЖ при г Pi 0,0а, в отличие от спектра комплекса а аналогом I, появляется отрицательная полоса при 220 нм и наблюдается рост ам-

пллтуды ВД при 195 км. Эти спектральные изменения согласуются с «ей, что при связывании аналога ill с ДШ пептидные фрагменты .час тично переходят из беспорядочной конформации вjb-конформацию.

Взаимодействие пептидных фрагментов аналога 1ь с ДШ-проявляется в увеличении размеров связывающего места для аналога Ш на ДНК по сравнению с размером связывающего места для аналога I Размер связывающего мес-а (Ь) можно определить из начального хо да изотерм адсорбции лиганда на поли(йА)*поли(<ЗТ) по формуле l/n0p = 2L - I, где nflp - кажущееся число связывающих мест. Экс периментальные значения L равны 3 + 0,5, 4 + 0,5 и 9 + 1,0 пара оснований для аналогов 1,_П и Ш соответственно. Если начальный ход изотерм адсорбции определяется связыванием димеров соединения Ш и мономеров соединений I и П, то эти оценки для L хорого согласуются с ван-дер-ваальсовскими размерами связывающихся молекул. Хотя константы димеризации для аналогов П и Ш примерно равны, различие в их поведении объясняется тем, что для получения изотерм адсорбции для соединения П приходилось использовать столь низкие суммарные концентрации лиганда, что димеризация в растворе не имела места. Это вызвано тем, что константа евязыва кия аналога П с поли (dA)«полиСЛ') в 60 раз больше, чем констан та связывания аналога Ш.

Взаимодействие пептидных фрагментов с ДНК проявляется так» в том, что аналог Ш ведет себя как двухкомпонентный лиганд, име ющий реакционные центры, специфичные к АХ- и QC-парам оснований ДШ. Это установлено на основании зависимости средней константъ связывания от содержания Al-nap в ДШ, Х^. Экспериментальные зависимости 1»К от 1пХАТ для соединений I-Ы приведены на рис. £ Видно, что для аналога 1 зависимость 1пК от представляет

собой прямую линию, наклон которой равен 3, т.е. молекула аяал' га I имеет 3 AI-специфичных центра. Экспериментальная зависимое 1пК от 1аХАТ, полученная для связывания аналога |U, имеет иной характер. Она не является линейной. 1лК имеет наибольшее значение при Хдо = 0,72, Зависимость такого типа свидетельствует в пс!ьзу того, что молекула аналога I, кроме AÏ-специфичных центров, имеет еще и центры, которые могут образовывать специфические связи с ОС-парами оснований.

Аналог II в присутствии 0,3 M NaCl, подобно соединению I, ведет себя как двухкомпонентный лиганд. Это проявляется в отклс нении экспериментальной зависимости 1пК от 1пХАТ от прямой линь

-1

А/ ^1

ш з'1 т р 0 ф 1 L

о а

L [

□ □

т

0

1

й

i

g

in X дт О

-1

tnXAT О

Риа. 5. Сравнение зависимостей 1иК от 1пхА^ , полученных для связывания с различными полинуклеотидаыи и природными ДШ аналогов нетропсина I и Ы (А), а также аналогов U и ill (В). А) ^ - экспериментальные значения 1пК, рассчитанные из изотерм адсорбции аналога Ш на поли(^А) .полиЙТ) и различных ДШ. $ - экспериментальные значения InК для связывания аналога 1 на поли(с/А).полиМТ) и различных природных ДШ, полученные при тех же условиях, что и для аналога 111.

X»© - экспериментальные значения 1пК, полученные для связывания на поли/d(A-i')/.поли/d(А-Т)/ аналогов lil и I соответственно.' Б) Ц - экспериментальные значения 1пК, полученные для связывания аналога 11 с поли(с1А)-поли(с1Т) и различными ДШ в буфере А. Ш - значения 1лК, полученные для связывания аналога И в буфере В.

□ - значения Хпк, полученные для связывания аналога П в буфере Б в присутствии 0,3 MNaCl на поли(<Ш-поли(Л') и различных ДНК. Н - то же, но для связывания аналога П на поли/{(А-Т)/• полиАА,-Т>/

О - экспериментальные значения 1пК, полученные для связывания аналога I с полиШЬполиШ) и р юличными природными ДШ в буфере Б в присутствии 0,3 М NaOl.

Однако при низкой .ионной силе зависимость 1пК о* 1яХ-ач! представляет собой прямую линию, наклон которой равен 3. Различие в специфичности связывания аналога П при низкой и высокой ионной силе объясняется тем, что при этих условиях с ДНК взаимодействуют различные агрегатные формы соединения П. Так как средняя константа связывания аналога П уменьшается примерю в 100 раз при переходе от буфера А к буферу Б, содержащему 0,3 (1 КаС1, то оптимальные концентрации ДНК Си лиганда) для получения изотерм адсорбции при этих условиях также различаются приметно в 100 раз. При низкой ионной силе приходилось использовать столь низкие концентрации ДНК и лиганда, что лиганд в свободном растворе находился в моно-ыерной форме. В мономерах аналога П пептидные фрагменты находятся в беспорядочной конформации. Они обладают малым сродством к. ДШ, так как их присоединение к ДНК приводит к уменьшению конфигурационной энтропии пептидного фрагмента. Для получения изотеры адсорбции при высокой ионной силе приходилось использовать высокие концентрации ДШ и лиганда (1-5 х 10 ь!), при которых раствор свободного лиганда содержал значительное количество димеров, пептидные фрагменты которых находились вJ1-конформации. Димеры аналогов П и II содержат, кроме AI1-специфичных центров, еще и центры, взаимодействующие с GC-парами ДШ.

На основании полученных экспериментальных результатов а так-кв литературных данных предложена модель комплекса, образуемого дилерами аналога П (или iL) с ДШ (рис. 6). Согласно этой модели димеры аналога II локализуются при связывании в узкой бороздке

Рис. 6. Пространственная структура комплекса ДШ с димерами аналога нетропсина, ковалентно связанного с олиговалином. В димере пептидные фрагменты образуют антипараллельный $-слой, который взаимодействует специфически с Qu-парами. Каждый нетропсинолодобный фрагмент образует специфические водородные связи с тремя /ü-парами (Засе-дателев и соаьт., 1976; Диккер-сон и др., 1УЬЬ).

ДШ. В димере фрагменты тривалина образуют антипараллельный р-слой, который взаимодействует специфически с двумя СС-ларами. В комплексе Н-пропилпирролкарбоксамидные группы двух нетропсинопо-добных фрагментов связаны друг с другом осью симметрии второго порядка и взаимодействуют преимущественно с тремя последовательными А1'-парами. Пептидные фрагменты в молекулах аналога 1У могут образовывать более протяженный, чем в димере аналога П, ^-слой, который, вероятно, взаимодействует с тремя ОС-парами. (¿-специфичность связывания пептидных фрагментов, вероятно, обеспечивается за счет образования водородных связей между КЬ и СО группами остова двух антипараллельных пептидных цепей и основаниями ДШ. Этот механизм узнавания нуклеотидных последовательностей ДШ пептидным остовом двух антипараллельных цепей (Гурский и соавт., 1975) реализуется также в комплексах олигопептидного антибиотика триостина А с ДШ (Шале ей а1., 1984). В атом комплексе направление В-С^-С» в пептидной цепи совпадает с направлением С5'-С5' в ближайшей полинуклеотидной цепи. Стереоспецифичность связывания пептидных'фрагментов с ДНК может объяснить Тот факт, что аналог У» в котором трявалин присоединен к я-пропилпирролхар-боксамидшзд фрагментам в противоположной ориентации, чем в аналоге П, не обладает способностью узнавать ОС-пары г димерюй форме и содержит только ДГ-специфичные реакционные центры.

Взаимодействие с ДНК бис-нетропсинов» в которых пептидные

фрагменты связаны ковалентно с помощью В-8 связи

Чтобы доказать отереохкмическу» модель комплекса, представленную на рис. б, были синтезированы бис-кетропсины У1 и УП (рис. 2), в молекулах которых пептиды С1у-Суз-01у-НН2 или ВН2 могут образовывать^-сдой, стабилизированный 8-е связью между двумя остатками цистеина. Бяс-нетропсин УП кокет рассматриваться в качестве аналога бис-нетропсина У1, в котором две амид-дае связи в цистиновои димере заменены на в-метиламидные связи.

При образования комплексов бис-нетропсинов У1 и УП с поли-(¿А).полиИТ) оба нетропсииоподобных фрагмента присоединяются к ДШ. Это проявляется в том, что молекула каждого из бис-нетропсинов занимает при связывании на поли(<Ш«полиМТ) ГО-П пар оснований, в то время как молекула аналога I занимает 3-4 пары оснований. Это подтверядается также вен, что молярный дихроизм комплексов бис-нетропсинов о поли М А)» поли МТ) при 320 нм в 2

раза больше, чем молярный дихроизм соответствующих комплексов с аналогом 1. Наклон экспериментальных зависимостей 1вК от 1пХдт, полученных для связывания при низкой ионной силе бис-нетропсинов У1 и У11 с различными ДНК равен 6+1, т.е. молекула бис-нетропси-на содержит 6 АТ-специфичных центров, в то время как мономерный фрагмент имеет только 3 АХ-специфичных центра.

При повышении ионной силы происходит изменелие в специфичности связывания бис-нетропсина У1. В присутствии 0,6 М НаС1 зависимости 1пК от 1пХдт не являются линейными, что указывает на то, что при этих условиях проявляется взаимодействие с ДНК как А1-, так и СС-специфичных центров молекулы бис-нетропсина. Из рис. 7 легко видеть, что наклон кривой, описывающей зависимость 1пК от 1яХдт при хд1>—I равен 3, в «о время как зависимость 1пК от ХпХ(ю при имеет наклон, равный 2. Таким образом, в при-

сутствии 0,6 М КаС1 бис-нетропсин У1 ведет себя как двухкомпонен-тный лиганд, который имеет три ДГ- и два ОС-специфичных центра. Так как Ы-пропилпкрролкарбоксамидные группы служат в качестве АТ-специфичных реакционных центров, то мы приходим к выводу, что цистиновый пептидный димер в молекуле бис-нетропсина содержит два £С-специфичных центра.

Замена двух амидных связей в цистиновом димере на Н-ыетил-амидные связи (бис-нетропсин УП) приводит к потере способности , узнавать СС-пары, хотя бис-нетропсин УП взаимодействует специфически с АТ-парами ДНК.

Важно .ыяснить, с какими нуклеотндндаи последовательностями связывается бис-нетропсин У1 и сравють эти последовательности с кастами преимущественного связывания аналогов I, П к 1У. С этой цель» был проведен анализ на ЭВМ профилей нуклеазного расщепления свободной ДНК (фрагменты А и Б) с известной нуклеотидной последовательность» и комплексов ДШ с аналогами I, П, 1У и У1. Радиоавтографы были получены С.Л.Гроховскиы.

На рис. 8 представлены рассчитанные с помощью ЭВМ профили расщепления комплексов бис-нетропсина У1 и аналога П. Видно, что наблюдается защита от гидролиза ДНКаэой I одних и тех же участков, указанных стрелками на рис. 8. Эти участки, однако, не защищаются от расщепления нуклеазой в комплексах с аналогом I. Очевидно, что детерминанты специфичности связывания у молекул бис-нетропсина У1 и димеров аналога П являются идентичными и отличаются от детерминантов специфичности аналога I. На рис. 9 по-

'ив. 7. Логарифмические зависимости К от Х^ и Х^, полученные уш связывания соединения У1.

ф - экспериментальные значения 1пЕ для связывания соединения У1 т поли Ш) • поли (с!Т), пали(сШ)'Поли(с(С) и различных природных в буфере А.

Э, <& - то же, но для связывания на поли/сЯА-Т )/• поли/с(( А-Т)/ н толи/с{(6~С)/'Поли/о((е-С)/ соответственно.

13 - экспериментальные значения 1пЕ для связывания соединения У1

ПОЛИ(еШ'ПОЛи(с|Т), ПОЛИ(<16)-ПОЛНЫС) и различных породных Щ в буфере Б, содержащем 0,6 МКаС1.

~ то яе» ио ДДя связывания на поли/с< (А-Т)/• поли/п1( А-Т// и толи/с1(0-С)/«поли/с{(6-С)/ соответственно.

с

3

1

9

1

II 3

9

3

VI

9

-1д|А/А0)

I г

т1 1

о Алл.

< I I 1 мН° 1

1450

1500

1550

Рис. й. Проф5Ли нуклеазного расщепления комплексов соединений I, П и У1 с фрагментом А (последовательность нуклеотидов в фрагменте приведена на рис. 9). Расщепление комплекса осуществлялось ДНКазой I в буфере 10 ыЫ трис-НС1, рН 7,5, содержащем I иМ Ыв012, концентрация фермента равна 10 мкг/ил. Радиоактивный фрагмент (5-10.Ю^с^а ) подвергался расщеплению одновременно с немеченой ДНК исходной плаэмиды, концентрация которой была равна 5» Ю-^ и. С - относительная концентрация лиганда - единица соответствует

концентрации 2

кг6 а.

А и А_ - интенсивности пиков на денсито-

ррамме в присутствии и отсутствии лиганда, нормированные на суммарную интенсивность всех пиков. Значения -1е(А/А0) > О соответствуют специфической защите лигандоы участка фрагмента ДНК от действия ДНКазы I. Значения -1в(д/Ао) < О свидетельствуют об усилении гидролиза в присутствии лиганда по сравнении с контролем. Стрелками указаны места, защищаемые от расщепления ДШазой I соединениями П и У1, которые, однако, не защищаются при связывании аналога I. Указано также одно из мест избирательного присоединения мономеров аналогов I и П (Ю, а также ближайшее к нему место присоединения бис~нетропсина (Б).

A "

Tt ititiiiibitiiccuiititiistebiiiti 'ШЦШ

!C1|

T

1500 &

1»!

Г» iliimitilt M0tiiitb00i«in jiicictei siituttuit

" * "I----» >___» » » i

boitimiUm tft t i s a < e i|t a»ei*titoAi tutti Гс}т meoi

il Л T со i T ilt luttuuibmituiluouTctihonim!

*1 .....1 « ? _s s_

isoo iiitiii

citiotoroioi a[t t * a с * * t{a oétiitctotaieaoïactti

1110 4t 1160

110 В I-—ï-3-1

ÎoCiTOTttoiiOOiAAtlllilOAIOtOii Ait »¡8 * t С С С t 0 t|t t 4

Тоще« litibotoi uiiiottamt ni i te о с t с l|i irtooûae

_ _ -

1Î10 ,-* . ,

i 11 о o|t 11 с о à t о iiii«Hj»»«HHbntu!Hliunmi

Рис. 9. Нуклеотидные последовательности фрагментов А и В. Фрагмент А (410 пар нуклеотидов} является продуктом расщепления рес-триктазами Hlhf 1и Bsp Hl плазмиды pUG9; фрагмент В (343 пары нуклеотидов) - продукт, расщепления плазмиды рис9 рестриктазами Eco RI и Sau За. В прямоугольники заключены последовательности нуклеотидов, с которыми избирательно связываются соединения П и У1 (на фрагменте А) и соединение 1У (фрагмент В).

казаны участки нуклеотидной последовательности фрагмента А, с которыми происходит избирательное связывание аналогов II ii У1. Эти аналоги обладают наибольшим сродством к последовательности типа о'-АААОЛТГ-З' и связываются менее прочно с более широким классом последовательностей, состоящих из двух блоков AI-пар, разделенных двумя последовательными GC-парами. Возможна также замена одной, преимущественно концевой Д'-пары на ОС-пару нуклеотидов.

На рис. 9 указаны также последовательности нуклеотидов на фрагменте В, которые избирательно защищаются аналогом 1У. Они содержат 3 ÇC-пары в центре связывающего места.

вывода

I. Исследовано взаимодействие с ДНК аналогов антибиотика не-тропсина, к которым ковалентно присоединены фрагменты Val-Val-Val-Cly-Gly-, Dna-Gly-Val-Val-Val-Gly-Gly-, Gly-Val-Val-Val-Val-

Gly-Gly-, а также аналог, в котором тривалин присоединен к молекуле нетропсчна в противоположной ориентации.

2. Показано, что в водном растворе и метаноле эти аналоги образуют ассоциаты, которые находятся в концентрационно-зависимо; равновесии друг с другом и с мономерами. Димерная форма аналогов возникает за счет взаимодействия пептидных фрагментов, которые, вероятно, образуют антипараллельную /-структуру. Определены константы димеризации аналогов в водном растворе и метаноле.

3. Показано, что специфичность связывания пептидных аналого нетропсина зависит от их агрегатного состояния. В мономерной фор ме аналоги нетропсина обладают такой же специфичностью связывания, как и аналоги, не содержащие фрагментов тривалина или гли-цилтетравалина; каждый аналог несет 3 Я-специфичных реакционных центра. Диыеры аналогов содержат, кроме АХ-специфичных реакционных центров, еше и центры, взаимодействующие с GC-парами ДШ.

4. Предложена модель комплекса, согласно которой фрагменты тривалина в димере образуют Jo-слой,, взаимодействующий с двумя па следовательными бС-парами, в то время как каждый из двух нетро-псиноподобных фрагментов образует специфические водородные связи с тремя последовательными AT-парами ДШ.

5. Для доказательства этой модели было исследовано взаимодействие с ДШ бис-нетропсина, в котором два нетропсиноподобных фрагмента присоединены к пептидам Gly-Cyo-Gly-NH2i связанным др; с другом с помощью Б-s связи. Показано, что молекула этого бис-нетропсина, в центральной части которого может образовываться н« большой J* -слой, содержит 6 АХ-специфичных центров. Это указывав! на то, что два нетропсиноподобных фрагмента, каждый из которых несет 3 АХ-слецифичных центра, связываются с ДШ.

•6. Повышение ионной силы до 0,6 Ы NaCl приводит к тому, чтс аналог У1 связывается с ДШ в среднем с помощью одного из двух нетропсиноподобных фрагментов, а также с помощью пептидных фрагментов. Он содержит 3 АХ- и 2 ОС-специфичных центра. Замена двуэ амидных связей на N-метиламидные в цистиновом димере бис-нетро-псича приводит к потере QO-специфичности связывания.

7. Анализ профилей нуклеазного расщепления свободной ДШ с известной нуклеотидной последовательностью и комплексов с аналогами нетропсина показывает, что аналоги нетропсина, ковалентно связанные с тривалином и бис-нетропсин, содержащий в центрально! части цистиновый димер, связывается преимущественно с нуклеотид-

ной последовательность» типа й'-АМОчШ'-З*. Они также взаимодействуют менее прочно с более широким классом последовательностей, в которых два блока из трех iü'-nsp разделены двумя GC-парама. Аналог нетропсина» содержащий фрагмент Gly-Val-Val-Val~Val-,B ди-мерной форме связывается преимущественно с аналогичными последовательностями, содержащими 3 GG-пары а центре участка связывания.

Основные результаты диссертации изложены а публикациях;

1. Лейнсоо Т.А.» Николаев В.А., Гроховский С.Л., Стрельцов С.А., Заседаеелев A.C., Жузе А.Л., Гурский Г.В. Присоединение трива-дина изменяет специфичность связывания аналога нетропсина с ДЩ. Молекуляр. биол.» 19Ш, т. 22» ff 1, с. I59-I7i.

2. Гурский Г.В., Суровая А.Н., Николаев В.А., Сидорова Н.Ю., Лейнсоо Т.Д., Жузе А.Л.»-Гроховский С.Л., Заседателей A.C., Гсттих Б.П. Синтетические олигопептиды, способные узнавать специфические нукяеотиднце последовательности на ДШ. Теэиси докладов симпозиума с участием стран-членов СЭВ и CiFU "Физико-химические свойства биополимеров в растворе м клетках". Пущина, 1965, с. 128.

3. Гурский Г.В., Суровая А.И., Стрельцов С.А., Хордин A.A., Николаев В.А., Жузе А.Л., Гроховский СЛ., Лейнооо Т.А., Сидорова ri.ü., Бекгеров U.U., Семенов Т.Е., ¡Макаров В.Л., Заседателез A.C., Готтих Д.П. Комплексы ДШ с олигопептидани, способнь&ш узнавать специфические нуклеотидаые последовательности на ДШ. Тезисы симпазиадьных докладов У Всесоюзного биохимического съезда. ¿4., Наука, 1965, т. I, с. 135.

4. Лейнооо Т.А., Гроховский С.Л., Николаев В.А. Синтетические дя-ганды, способные специфически узнавать нуклеотидные последовательности на ДНК, содержащие ÄT и ГЦ пара. Тезисы докладов ХУШ научно-технической конференции молодых исследователей Ш1!2 АН УССР. Харьков, 1986, с. 139-140.

5. Николаев В.А., Лейнсоо Т.а. Аналога нетропсина, несущие A3- и ГЦ-специфические реакционные центры. Тезисы докладов 9-ой конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений". Рига, 1987, с. 55.

6. Музе А.Л., Николаев В.А., Лейнсоо Т.А., Сидорова НД)., Гейде-рих A.B., Гроховский СЛ., Суровая А.Н., Стрельцов-С.А., Засе--дателев A.C., Гурский Г.Б. ДНК-специфичные лиганды, обладающие

AT- и СС-сеиифичными реакционными центрами. Тезисы УП Всесо юзного симпозиума по химии белков и пептидов. Таллин, 1987, с. 177-178.

7. Oursky G.V., Leinsoo Т.А., Nikolaev V.A., Sidorova N.Yu., Grokbovsky S.L., Surovaya A.N., Geiderikh A.V., Streltaov S.. Zaeedatelev A.S., Zhuze A.L. Sequence specific ША binding m lecules containing AT- and GC-specific reaction centers. Ab stracts of International symposium "pLjsico-chemistry of DBA and molecular mechanism of genome functioning". Tbilisi, Met enioreba, 1987, p. 44-45.