Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК

Гурский, Георгий Валерианович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК"

1л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. Б ± ЭНГЕЛЬГАРДТА

На -правах рукописи УДК ¿77.323

ГУРСКИЙ Георгий Балерианович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ ПЕПТИДНОЙ г.РИРОДЫ С ДНК

Специальность 03.00.03 - Молекулярн' биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в виде научного доклада

Москва-1992

Работа выполнена в Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:

Н.С. Андреева, доктор физико-математических наук, профессор A.A. Богданов, член-корреспондент РАН, доктор химических нау* профессор

Д.С. Чернавский, доктор физико-математических наук, профессор Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Зашита состоится " £ " {-'ОЧлпЦ 19д2 Г0Да в часов

на заседании специализированного совета Д.002.79.01 Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу. 117984, Москва, В-334, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Доклад разослан " ^ " % ^92 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

/А.М.Крицын/

ктуальность проблемы Наиболее интересным свойством егуляторных белков является их способность "узнавать" ¡уклеотидные последовательности на ДНК. Другие белки и многие 1алые молекулы взаимодействуют с IHK неспецифично или 1бнарудсивают преимущественное сродство лишь к одному типу пар •. 'сновании по сравнению с другим. Примерами могут служить 1НТИ0ИОТИК актиномицин Л. для связывания которого необходимо [аличие GC-nap, краситель Хекст и антибиотики нетропсинового слесса. взаимодействующие избирательно с кластерами АГ-пар на IHK. Важно выяснить, какие структурные особенности регуляторных 5елков отличают их от других лигандов, имевших меньшую степень :пеци(фичности связывания. Для этого, кроме экспериментальных исследовании, полезных» может быть построение адекватных теоретических моделей для описания специфического связывания, в которых неспеиифическое связывание рассматривалось бы в качестве 1редельного случая.

Начав с построения стереохимических моделей для связывания цистамииина А и для встраивания двух антипараллельных пептидных цепей в узкую бороздку ДНК, мы приступили к конструированию новых :пеиифических ДНК-связываюших лигандов, используя синтетические пептиды и аналоги нетропсина в качестве строительных элементов. Основная проблема состояла в том, чтобы сконструировать лиганд, несущий реакционные центры, специфичные к AT- и GC-парам основании и способный узнавать эаданнуо последовательность пар основании ЛНК. Эта общая проблема пока не решена, хотя ее решение открыло бы новые возмо-тности для целенаправленного воздействия на генетический аппарат клетки и создание новых лекарственных средств. Однако, существенный прогресс все же был достигнут. Нам удалось впервые сконструировать соединения, которые обладают большей избирательностью связывания, чем природные антибиотики: Оис-нетропсины. составные лиганды типа нетдопсин-пептии, бис-актиномицин Д. Удалось также создать соединения, способные расщеплять IHK в специфических местах. Теперь, когда обнаружено большое разнообразие структурных мотиеов, используемых белками для узнавания нуклеотидных последовательностей (а-спираль-поворот-а-спираль. р-слои, мотив типа цинковым "палец" и др.) открываются нсвые возможности для моделирования и создания

специфических ДНК-связывавших лигандов.

Цель работы состояла в решении следующих задач:

1. Построение физических моделей для описания связывания регуляторных белков и других специфических лигандов с ДНК.

2. Получение уравнения и разработка алгоритмов для анализа изотерм связывания сиквенс-спецкфичных лигандов на синтетических полинуклеотидах и фрагментах ДНК с известной нуклеотидноя последовательность». Эти уравнения могут быть также применены дл; описания термодинамических свойств более простых систем, таких, например, как комплексы антибиотиков, олигопептидов и олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами.

3. Получение уравнений и разработка алгоритмов для описания кооперативного связывания лигандов на ДНК.

4. Разработка методов определения термодинамических параметров связывания из экспериментальных изотерм адсорбции.

5. Изучение связывания с ДНК синтетических пептидов, способных образовывать ^-структуру в водном растворе.

6. Изучение связывания с ДНК цистинового пептида, состоящего из двух идентичных пептидных фрагментов, связанных Б-Б связью.

7. Построение стереохимическоя модели для встраивания двух антипараллельных пептидных фрагментов в деформированной 0-конформации в узкую бороздку ДНК.

6. Изучение конформационных переходов, индуцируемых в пептидах при связывании с ДНК.

9. Конструирование синтетических лигандов пептидной природы, обладающих высокой избирательность» связывания.

Научная новизна и практическая ценность

Впервые получены уравнения и алгоритмы для анализа изотерм адсорбции сиквенс-специфичных лигандов на синтетических полинуклеотидах и фрагментах ДНК с известной нуклеотидноя последовательностью. Лиганд может связываться с ДНК в одной Фиксированной ориентации или присоединяться в двух альтернативных ориентациях, связанных осью симметрии второго порядка. Учитываются эффекты, обусловленные физическими размерами адсорбированных молекул, а также эффекты, вызванные

заимодеиствиями между ближайшими адсорбированными молекулами. жазано, что изологичные взаимодействия между ближайшими эседними связанными молекулами способствуют образованию зологичных димеров на ДНК, в то время как гетерологичные энтакты способствуют образованию агрегатов произвольного азмера. Большинство уравнений и алгоритмов для описания ооперативного связывания лиганла получено впервые. Рассмотрен акже случай, когда взаимодействие между белком и ДНК сопряжено мономер-димерным равновесием в растворе.

ПроЕедено систематическое исследование связывания -структурных пептидов с ДНК, начиная от трипептила al-Val-Val-NH-NH-Dns и заканчивая 20-членным пептидом

ns-Gly-Ala-Gln-Lys-Leu-Ala-Gly-Lys-Val-Giy-Lys-Val-Cty-ТЛг-t/f-al-Lys-Val-Gly-Thr-Lys-Thr-Val-OH. Впервые изучено связывание с НК цистинового пептида

.S'-bisiH-Lys-Gly-Val-Cys-Val-NH-NH-Dns I, в котором два ептидных фрагмента соединены с помощью S-5 связи, кспериментальные данные согласуются с тем, что этот пептид вязывается с ДНК в форме мономера iB-слой) и е форме димера ¿-сэндвич). Показано, что константа связывания этого пептида на золированном связывающей месте на полиidG)>поли!dC) примерно в есять раз больше, чем константа связывания с поли(dA )•поли(йТ). ептид конкурирует за связывающие места на ДНК с антибиотиками истамииином А и сибиромицином, которые, как известно, вязываются в узкой бороздке ДНК.

Епервые предложена стереохимическая модель для встраивания в зкую бороздку ДНК двух антипараллельных пептидных цепей в сформированной (З-конформации. Согласно этой модели NH- и С0-руппы остова двух антипараллельных пептидных цепей служат оно рами и акцепторами Еодородных связей для взаимодействия с ункциональными группами пар основании в узкой бороздке ДНК. тог структурный мотив впоследствии был обнаружен в ристаллическом комплексе пептидного антибиотика триостина А с амокомплементарным оллгонуклеотидом 5'-CGTACG-3' A. Wang et ai., 1984).

Исследовано взаимодействие с ДНК бис-нетропсина, в молекуле оторого два нетропсиноЕых фрагмента присоединены ковалентно к

пептидам С1у-СуБ-С1у-С1у-С1у-, связанным с помощью Э-Б связи. Показано, что этот бис-нетропсин содержит 6 АТ-специфичных центров и 2 дентра, специфичных к СС- парам ДНК. Анализ профилеР нуклеазного расщепления комплексов этого бис-нетропсина с ДНК показывает, что бис-нетропсин предпочтительно взаимодействует с последовательностью б'-АААССТГТ-З' на ДНК. Вероятно, два нетропсиновых фрагмента взаимодействуют с кластерами из трех ил> более АТ-пар, в то время как цистиновый пептид узнает (КЗ

последовательность в дентре связывающего места для СС

бис-нетропсина.

Сконструирован 20-членныя пептид, способный специфически связываться с операторами 0^1 и 0^2 фага Л. Этот пептид не имеет гомологии ни с одним из известных регуляторных белков. Показано, что при связывании с ДНК этот пептид переходит из беспорядочной в ^-подобную конформацию.

Апробация работы Материалы диссертации докладовались на ряде семинаров и научных конференций ИМБ РАН, на международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1961), на X Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на международном симпозиуме по количественной биологии "Структура ДНК" (Колд Спринг Харбор, 19В2), на 16 конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на симпозиуме с участием стран членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985), на] Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985), на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), на Международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987), на Международной конференции "ДНК как мишень для действия противоракоаых лекарственных средств (Сейлак, Франция, 1987), ш VI Междунарордной конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, 1989), на "Щ Междунарордной конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, 1991), на двустороннем симпозиуме Россия-Германия "Белок-нуклеиновое взаимодействие: структурные и фармакологические аспекты (Санкт-Петербург, 1991), Структура работы Диссертация изложена в форме научного доклада, содержит 25 рисунков. По материалам диссертации опубликовано 24

работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Т. Точные соотношения для расчета связывания регуляторных белков и других специфических лигандов с. ДНК

1.1 Описание модели. Специфичность и стабильность комплекса между регуляторным белком и ДНК является следствием образования большого количества водородных связей и других нековалентных связей между функциональными группами белка и ДНК.

На рис. 1 представлена модель для описания специфических взаимодействий между лигандами и ДНК. Не уменьшая общности, мы будем предполагать, что лиганд имеет реакционные центры двух типов, которые мы будем называть в дальнейшем АТ- и ОС-специфичными реакционными центрами.

-- I --

о о&ААЙАЙААААоо о

Рис.1. Модель для описания специфических взаимодействий между лигандом и ДНК. Молекула лиганда представляется в виде решетки реакционных центров, специфичных к АТ- и СС- парам оснований. Светлые и темные кружки символизирует АТ- и ОС- пары оснований соответственно. АТ- и СС- специфичные центры показаны светлыми и темными вертикальными линиями соответственно.

Пусть п1 и п2 представляют собой числа АТ- и БС- специфичных реакционных центров в лиганде. Реакционные центры могут взаимодействовать с основаниями ДНК как независимо друг от друга, так и кооперативно. Предполагается, что лиганд связан, если хотя бы один его реакционный центр присоединен к паре оснований ДНК. При связывании каждый лиганд накрывает I последовательных пар оснований, вследствие чего эти основания становятся недоступными для связывания других молекул лиганда. Учитываются кооперативные эффекты, вызванные взаимодействием между ближайшими соседними адсорбированными молекулами лиганда. Это взаимодействие

зависит от расстояния между соседними адсорбированными молекулам и включает стерическое отталкивание при связывании лигандов на перекрывавшихся связывающих местах и некоторое взаимодействие Е^ (отталкивание или притяжение) при связывании на неперекрывающихся связывающих местах, которые разделены i свободными звеньями полимера. Область взаимодействия предполагается конечной и распространяется на р-1 пар оснований (Ev =0, если 1>р).

Для изучения равновесного связывания лигандов на полимере достаточно рассмотреть большой канонический ансамбль невзаимодействующих систем, каждая из которых представлена молекулой полимера, состоящего из N звеньев и находящегося в равновесии с молекулами лиганда. Равновесные свойства такого ансамбля полностью определяются, если рассчитана большая каноническая статистическая сумма Н^. Средние значения всех физических величин могут быть рассчитаны из In Е . В частности, среднее число молекул лиганда, рассчитанное на пару оснований, I г), задается следующим образом

r= N

«In

ain m

И )

где.ш - концентрация свободного лиганда. 1.2 Адсорбция полярных лигандов на ДНК

Рассмотрим вначале случаи, когда лиганд адсорбируется в одной ориентации относительно полимера типа поли(йА) поли(йТ) или поли(сЮ) поли( с1С). Чтобы описать адсорбцию на гомополимере, необходимо задать р равновесных констант а.К1"1 10<1<р-1) |Рис. 2). Здесь К1п 1 есть константа связывания лиганда с п-реакционными центрами на изолированном связывающем месте. Мы называем связывающее место изолированным, если оно отстоит от ближаишего связывающего места на расстоянии равном или большем, чем р свободных звеньев полимера. Больцмановскии фактор а^ехр!ЕТ)) учитывает взаимодеистЕие между соседними

адсорбированными молекулами, а^ можно определить как равновесную константу для перемещения лиганда, связанного на изолированном связывающем месте, в такое положение на полимере, где он имеет ближайшего соседа на расстоянии 1. Расстояние между ближайшими соседними адсорбированными молекулами удобно характеризовать числом свободных ( "ненакрытых" лигандом) звеньев полимера, которые отделяют участки полимера "накрытые" молекулами лиганда.

Т=г1 Г

о о о о о о ^ <!!» А

ооооооооооооо ооооооооооооо

1 о/'

0 0 0 0

тт _ _

РгггЗ

о о о о о о о

(П|

а.к

йтйо ойтйсШй

Рис.2. Связывание лиганда в одной фиксированной ориентации относительно ДНК. Предполагается, что р=1. В этом случае равновесие в системе характеризуется тремя константами К " , а;

и а1, из которых одна (КСп> ) описывает взаимодействие между

лигандом и полимером, а две- других (а0 и а1 ) описывают

взаимодействие между ближайшими- соседними адсорбированными молекулами.

В общем случае адсорбции на гетерополимере для расчета мы использовали метод рекуррентных соотношений, применение которого для решения различных адсорбционных задач изложено в работах 16,10,141. Легко показать, что для рассматриваемой проблемы

р-1

2=3 *К(п) ш ■ +К1п> ш 2а,(5 . - 3 . >

М N-1 М-1.-Р >|-Ь*1 I N-1.-1 N-1.-1-1

Это уравнение имеет ясный физический смысл. Предположим, что лиганд не может "свешиваться" на концах полимера и пронумеруем пары основания в полимере от 1 до N. Ясно, что И-я пара оснований может быть либо свободной, либо занята правым концом лиганда. Все состояния в описывающие состояния, когда Ы-я пара оснований свободна, присутствуют также в 3 . Состояния, в которых И-й полимерный остаток занят лигандом описываются 5 - 2 -Аналогично, (0<1<р-1) описывает ситуацию, когда

N-1.-1-3 пара оснований занята правым концом лиганда. Из уравнения 12) следует, что 3 ~3 ^ можно представить в виде суммы статистических весов двух событий, соответствующих некооперативному и кооперативному связыванию лиганда с участком полимера, содержащем пары оснований , Ш.+2,... N. Последнее

реализуется, если лиганд, занимающий Ы-ую пару оснований, находится в пределах области взаимодействия с другим лигандом,

адсорбированным на ближайшем соседнем связывающем месте. Легко видеть, что ш Р2 а. (3 - 3 - сумма

г = 0

статистических весов всех состояний, когда реализуется

кооперативное связывание с константами <0<1<р-1>, в то

время как ш равно сумме статистических весов всех

состояний, соответствующих присоединению лиганда с константой ^ы-ь-и' хаРактеРной для связывания на изолированном связывающем месте. Легко видеть, что если последовательность пар оснований известна и 31, 32#... £21_„р_ 1 заданы, то 3. () можно рассчитать по формуле 12).

В случае некооперативного связывания лиганда на однокомпонентном полимере (К(.П,=К(П> < 1 ¿^-Ь-! ), а.=1 (0<1<р-1>) уравнение (2) упрощается

• * К1 п) ш 3

N-1 Ы-Ь

13 )

и удовлетворяет начальным условиям

К т

J=L

Если взаимодействие мевду абсорбированными молекулами возникает лишь при непосредственном контакте мужцу ними 1а0=а, аг =1 1<1£р-1, ), то из (2) легко найти, что

2=2 К(п,1п5 + аК,л}т (2 - 2 )

n n-1 n-1.-1 n-1. n-1.-1

Начальные условия имеют вид:

1+К1 п5 т (3-1+1 )

(И>21>1 ) 1.<3 <-21

1+К1п> т( 3-1+1) + а(К(п)т)2( 3-21.+1 > 3=21.

(5 )

Для достаточно длинных полимерных цепей 2

Xм и г

т ¿?Х X йга

где X удовлетворяет следующему алгебраическому уравнению:

х1.-1_ хь - - а К1 п)и (Х-1 ) = О

' I б>'

Из уравнения (6) и предельной формы уравнения (1) легко получить следующее уравнение для изотермы адсорбции на гомополимере:

(1 +

г-у

ь (г-у:

)

= К ш

(7)

1-г1.-г+У г П-гЬ-г+у)

где у является положительным корнем квадратного уравнения

у2( 1 -а) + у !1-г И+1-2аЛ - аг2 = 0 (8)

В случае связывания невзаимодействующих лигандов на гомополимере аналогом уравнения (71 является

(1 +

1-гЬ

V < п> г»

К Ш

(9 )

Уравнения <7)-(9), впервые полученные Заседателевым и др. (1),

а впоследствии также Макги и фон Хиппелеы 11974), широко используются при анализе экспериментальных данных по связыванию различных лиганяов на ДНК.

Отметим, что рекуррентные соотношения часто бывают более удобными для практических приложений, чем уравнения адсорбции. Их легко программировать для расчетов на ЭВМ. Их можно использовать для описания специфического связывания лиганда на фрагменте ДНК с известно« нуклеотидной последовательностью. Для этого необходимо учесть, как это было сделано при выводе уравнения (2), что константа связывания лиганда зависит от нуклеотидной последовательности в каждом связывающем месте.

1.3 Константа связывания лиганда на изолированном связывающем месте

Константа связывания лиганда на ¿-м связывающем месте, К(.п) , зависит от последовательности и числа реакционных центров в лиганде и от последовательности пар оснований в 3~м связывавшем месте на ДНК. Пусть реакционные центры образуют непрерывную последовательность длины п= п -|-п2. Реакционные центры могут образовывать связи с основаниями независимо друг от друга или действовать кооперативно. В последнем случае мы будем предполагать, что состояние в котором находится каждый реакционный центр, зависит от состояния его ближайших соседей. Состояние лиганда на полимере полностью определяется, если известно, какие реакционные центры присоединены к парам оснований и какие центры остаются неприсоединенными. Для расчета к'.п> необходимо просуммировать статистические веса для всех адсорбционных состояний лиганда. Другими словами, нам необходимо рассчитать статистическую сумму для конечной дв.ухкомпонентной решетки Изинга. Используя формализм, предложенный ранее Зимом и Брэггом для описания переходов спираль-клубок в полипептидах, легко получить следующее рекуррентное соотношение для расчета К'.п> (6,8,14):

(п> „вз<п> + 5«п> (о-1 ) к'.п-2> -М1+З'.п> , > К'.""1' (10)

1л>3 >

Здесь К'.""1' и К'."-21 представляют собой константы связывания с ,3~м связывающим местом двух, лигандов, отличающихся от лиганда с п реакционными центрами только тем, что в одном из них отсутствует п-й реакционный центр, а в другом отсутствуют п-й и п-1-й реакционные центры одновременно, а - параметр кооперативности. 3'з"п-1 ~ константа стабильности связи, образуемой п-ым реакционным центром с парой оснований Множитель В

учитывает невыгодность образования первой связи между лигандом и ДНК (0<££1). Начальные условия задаются следующим образом:

„( 1> оЧ< 1) . „( 2) 1) „I 2) 1> . „С 2) ,

К. =ез. , к. -ее, з,^ +3,^) (11)

Если реакционные центры действуют независимо друг от друга, то уравнение (10) принимает очень простой вид [8,14]

К(.п'= В1-1+ П П+э' '' . )1 (12)

Отметим, что для большинства реальных систем вклад неспецифических взаимодействий можно учесть, если заменить 0 на , где Й не зависит от нуклеотидноп последовательности.

1.4 Связывание лиганда в_ двух противоположных ориентациях относительно полимера.

Большинство лигандов может связываться в двух ориентациях и и V относительно полинуклеотидноя решетки, связанных осью симметрии второго порядка^ Последовательность пар оснований задает направление в молекуле ДНК. Предполагается, что соседние связанные молекулы лиганда могут взаимодействовать друг с другом. Эти взаимодействия можно разделить на две группы в зависимости от того, адсорбированы ли ближайшие соседние молекулы в одной и той же ориентации относительно полимера или присоединены в противоположных ориентациях и и V . Последний класс можно также разделить на две группы, если различать взаимодействия между соседними лигандами, связанными в ориентации "голова к голове" или "хвост к хвосту". Пусть а^ и а. - константы взаимодействия

для этих двух типов расположений адсорбированных лигандов и пусть а^ -константы взаимодействия для случая, когда ближайшие соседние молекулы присоединены к ДНК в одной ориентациии и или V (1<15 р-1) (Рис. 3). Анализ кооперативных эффектов, обусловленных этими взаимодействиями, содержится в работах 16,10,14,16).

Рис. 3

Связывание лиганда в двух ориентациях и и V относительно полимерной цепи. Указаны статистические веса для комплексов двух лигандов со связывающими местами, разделенными одним свободным звеном полимера, а , а и а^ константы„ описывающие взаимодействие между соседними молекулами лиганда, присоединенными в различных ориентациях относительно полимера.

Белок-Селковые взаимодействия по свойствам симметрии можно разделить на две группы- изологичные и гетерологичные и. Мопой е1. а1. 1965). Изологичные взаимодействия приводят к образованию ассоциатов конечного размера - димеров и тетрамеров, обладающих осью симметрии второго порядка. Гетерологичные взаимодействия не обладают элементами симметрии, так как включают контакты между разными группами атомов в белковых молекулах. Они могут привести к образованию агрегатов произвольного размера. Если белковые молекулы адсорбированы на ДНК, то изологичные взаимодействия возможны только в том случае, если молекулы присоединены на соседних участках ДНК в противоположных ориентациях. Рассмотрен случай, когда мономеры адсорбируются на частично перекрывающихся связывающих местах,- а

оку

Ьтт1оЩтЗ

¿тШоШт^о

5,куку

а,К>2

Шт1оШт1о

также случай, когда они связываются на неперекрывающихся связывающих местах (Рис. 4).

о О Ор п п ^ " п п п п n г» п <-> n «-уо Q 0 О О О Ъ ц цц ц и JKTITÜ^T-VJ ц и v I> «У О О О

О циццциииц Jv nuuuuuuu^OО

Рис. 4. Два типа изологичных димеров, образующихся при связывании мономеров на соседних участках ДНК. а) Мономеры связываются на перекрывающихся связывающих местах и образуют димер, который занимает 1+10 пар основания, б) Мономеры

связываются на неперекрывающихся местах и образуют димер, размер связывающего места для которого в два раза больше, чем размер связывающего места для мономера. Светлые кружки обозначают пары основании.

В этом последнем случае статистическую сумму для термодинамической системы можно рассчитать с помощью рекуррентного соотношения:

2 =Е - (К1П> + К(п> ) т 2 +(а-1> т2 К1 п) К1 п> 2 (13)

n n-1 и V м-и и ^ n-21.

IN>21+1 )

с начальными условиями:

1 + (К( п) +К( л> ) т ( j-L+1 I

u v ^

U + <K(n'*C > т ij-LM) + (а-1) т2 K(vn)

j <;1

1 <J<21 (14) J=2L

Среднее количество связанного лиганда в расчете на мономерное звено полимера, г, в пределе, когда N-» оо , можно рассчитать с помощью следующего уравнения:

(К<п) К(я> } в X1- - На.-И К( п> К* п> т2

и V и V

г = --• 115)

21.-Х21- -121-1 )Х21"~1 -(К<п) + К(п> ) М.Х1-

и V

где X - наибольший положительный корень алгебраического уравнения Х2Ь- Х21-"1 - (К<п) + к'п> ) и X1" - К(п)- К( • т2 - (а-1 ) « 0 (16)

и V и V

Если диыеры образуется в растворе, а с полимером связываются как мономеры, так и димеры, то лля расчета изотерм адсорбции можно использовать уравнения (13)-П6), в которых (а-1) =2К -К

Здесь К2= К2ц= константа связывания димера с гомополимером.

К - константа димеризации. Рекуррентные соотношения для расчета изотерм адсорбции на гетерополимере можно найти в работах (6,10,14 ].

1.5 Кооперативное связывание сэндвичей, каждый из которых состоит из двух молекул лиганда

Рассмотрим случай, когда при связывании лиганда на полимере вместо изологичных димеров образуются димеры другого типа -сэндвичи. В связанном с полимером сэндвиче два мономера неэквивалентны - один из них образует специфические контакты с основаниями ДНК, в то время как другой взаимодействует с первым лигандом и сахарофосфатным остовом ДНК (Рис. 5). Предположим, что мономеры связываются с ДНК некооперативно, в то время как связывание сэндвичей - кооперативный процесс, который зависит от взаимодействия между сэндвичами, адсорбированными на ближайших соседних связывающих местах. Пусть К и К_ -константы связывания мономера и сэндвича на изолированном связывающем месте. Размеры связывающего места для мономера и сэндвича предполагаются равными. Рекуррентное соотношение для расчета имеет вид:

= гм_ГК а + V К2т2 ♦ а* К2-и2 -. 2м_ь"3н-ь-1 > 117 >

где V/ =КяК /1С . т-концентрация свободного мономера. константа димеризации^ а- константа, описывающая взаимодействие между двумя сэндвичами, адсорбированными на ближайших соседних связывающих местах.

|ДМ

Ц=ьу

Шт1оШг1о

аК^гт^

о о

гш1 Ьлт]

Рис. 5. Связывание с полимером сэндвичей, состоящих из двух молекул лиганда. Указаны статистические веса для связывания двух сэндвичей на изолированных связывающих местах, а также для их присоединения к ближайшим соседним связывающим местам, где сэндвичи могут взаимодействовать друг с другом.

Среднее количество связанного лиганда в расчете на мономерное звено однокомпонентного полимера, г, в пределе, когда N ->■<» , дается следующим уравнением:

Кт - 2 \/-К2т21 аХ-а-Ч )/Х _ (18)

И.+ 1)-Хи - Г.-Х1-"1 - Кт-и+аИКт)

где X - наибольший положительный корень уравнения:

хц-1_хь_ Кт.х_ аУ/ к2т2. ( х-1 )- у.К2т2 = 0 (19)

Уравнения (17)-(19) легко обобщить для описания термодинамического равновесия в более сложной системе, в которой лиганд в свободном растворе находится в форме мономера и димера, а сэндвичи образуются в результате взаимодействия двух димеров.

В этом случае

К,т, ¡с'-г'Ч + 2К т + 4ИК;?т? (аХ-а+1)/Х 1 1 2 2 2 2

г= -

с Ц+1) ■ Хь2 - Ц-хЧ^-К^^Ц-Ь^ихЧ-1-! - Кгт2- аш1

(20 )

Здесь т1 и т2 - концентрации свободных мономеров и димеров в растворе. I. и I. - размеры связывающих мест для мономера и димера (или сэндвича). К - константа образования

сэндвича из двух димеров. К], К2 и К - константы связывания с полимером мономера, димера и сэндвича соответственно. X-наибольший положительный корень уравнения:

Х'З- (Х-1)- - К2н2х - » К^ - а1й£п£.(Х-1) = о

(21 )

11.1. Конструирование специфичных ДНК-связываюших пептидов.

Антибиотики дистамицин А и нетропсин можно рассматривать в качестве типичных "решеточных" лигандов, содержащих только АТ-специфичные реакционные центры центры. Это следует из пространственной модели для комплексов этих антибиотиков с ДНК, предложенной Заседателевым и соавторами (1976) и подтвержденной рентгеноструктурными данными, полученными в лабораториях Р. Диккерсона (1984) и А. Рича (1986).

Возникает вопрос о том, можно ли построить структуры такого типа на основе полипептидной цепи. Детальное рассмотрение [3,4] возможных спиральных структур пептидного остова и конформационные расчеты, выполненные В.Г. Туманяном, показали, что стереахимически возможны два типа структур, изогеометричных двойной спирали ДНК. Б каждой из н.чх асимметричная единица содержит два аминокислотных остатка на пару оснований ДНК. В одной из них ИН группы пептидного остова могут образовывать водородные связи с 02 атомами пиримидинов и МЗ атомами пурина, а в другой карбонильные группы пептидного остова могут присоединяться с помощью

водородных связей к 2-аминогруплам гуанина з узкой борзздглз полм(йО поли(dC ). Мы назвали эти два класса спиральных стрултур t м ß-структураки соответственно. Двугранные углы ? и % характеризующие каждую из них, принадлежат болыаой резргя-еяяоя области на карте рамачяняраха. Это обеспечивает их бог.ьт/э пластичность, способность образовать спирали, изогвоиетг"'1"!."' двойным спиралям ДНК я РНК. Ривс и Кяссен C1S90 I обпару—?:; •., -г • белки HMG-1 млекопитаюгах содержат фрагменты полипептк,сн'>:; вгл;п способные взаимодействовать избирательно с мастерами АТ-лар з узкой бороздке ДНК. Они предпологггли, что калоши такой фраткспт принимает при связывания спиральную конформацию с двумя оста-т'А на пару оснований ДНК и что NH-группы пептидного остова слуг:-5 качестве АТ-специфичных цантров. Этот «откв соответстзугт ясз.-л t-структуре. Сузукм (1989) расиирил класс "узнают:«" спиралей. обнаружил, что иоаяо построить изогеометрнчные ДНК спир;?"ч, которые содержат 4 аминокислотных остатка в повтортот^ор «?2У*'М-. с характерной последовательностью серин-пролин-лизин-ди?!'" D этом мотиве также NH группы пептидного остова служат о ^^»ст:-.-; АТ-специфичных реакционных центров.

На рис. 6 представлена стереохииическая модель для встраивания двух антипараллелъных пептидных цепвя з узкую бороздку ДНК. Согласно этой модели две антмпараллельнке пептидна цепи в t- и g- конформациях соединены вместе с поюяьв водородкнх связей и образуют двойную полипептидную спираль, лзогеометричнуэ ДНК. На основе этой модели были сформулированы "правила" ß-структурного узнавания. Мы предположили, что в специфическом комплексе пространственное расположение остатков с инертными боковыми радикалами (Val, Ala, Ile, Leu. Phe и др.) коррелирует с положением GC-nap, в то время как положение остатков Thr» Ser, Asri, Gin , His и Cys коррелирует с расположением АТ-пар. Кодирующие аминокислотные остатки занимают положения 1 и i- 2 з пептидной цепи, где i- номер одного из кодирующих остатков.

В 1975 году, в отсутствие каких-либо данных о структуре регуляторных белков, мы предположили, что этот структурный мотив встречается в ДНК-связываюших доменах регуляторных белков. В свете новых данных, свидетельствующих о разнообразим структурных

мотивов, используемых регуляторными белками для "узнавайия" специфических нуклеотидных последовательностей, существование универсального кода узнавания представляется маловероятным.

Рис.6. Пространственная структура комплекса мейду антибиотиком триостмном А и самокомплементарным олиго^уклеотидом 5'-ССТАСС-З' по данным Вонга и др. (1984) (а) и модель для встраивания двух антипараллельных пептидных цепей в узкую бороздку ДНК (3,41 (Ь>. ЛН и СО группы остова двух пептидных цепей служат в качестве специфических реакционных центров для присоединения к основаниям ДНК. Теоретические и экспериментальные значения двугранных углов ф и ц) для двух остатков в повторяющейся

единице в верхнем пептидной фрагменте равны <р1=-150°(-139° I,

ф1=45°(78°), ф9—60° (-63°) и ч>2=-170°' (177° ). В скобках приведены

вначения углов 5Р и ф для соответствующего фрагмента в

»риостине А. (с), пространственная структура аналога антибиотика триостина А по данным Уоринга и сотр. (1982 К

Теперь мы можем более точно определить область применения для модели, представленной на Рис. 5ö. В 1984 году зтот структурный мотив был обнаружен в кристаллическом комплексе между антибиотиком триостином А и самокомплементарным олигонуклеотидом 5'-CGTACG-3*(Рис. 6а). Депсипептидное кольцо этого антибиотика встраивается в узкую бороздку ДНК. Оно имеет форму прямоугольника, длинные стороны которого состоят из пептидных фрагментов в деформированной ß-конформации (Рис. 6с). NH и СО группы остова этих фрагментов служат донорами и акцепторами водородных связей для взаимодействия с 02 атомом цитозина, N3 атомом гуанина и 2-аминогруппой гуанина соответственно. Таким образом, установлено, что встраивание двух антипараллельных пептидных цепей в узкую бороздку ДНК и узнавание нуклеотидных последовательностей с помощью NH и СО групп пептидного остова является стереохимически возможным. Так как имеется класс регуляторных белков, ДНК-связывающие домены котороых содержат две антипараллельные цепи в 0-конформации,. нам представляется маловероятным, что применимость этого структурного мотива ограничена только комплексами антибиотиков триостинового класса с ДНК. В этой связи следует упомянуть, что фактор хозяйской интеграции Е. coli (IHF), эукариотическия фактор транскрипции TF2D и родственные им белки узнают специфические нуклеотидные последовательности в узкой бороздке ДНК с помощьо двух антипараллельных пептидных цепей в деформированной ß-конформации (С.С. Yang and H.A. Nash, 1989; S.W. White et al., 1989; D.B. Starr and K. Haßley, 1992; D.K. Lee et al.. 1992).

Следует также отметить, что недавно A.K. Суровая обнаружила, что пептиды, входящие в двуспиральныя мотив его репрессора фага 434 и находящиеся в растворе частично в а-спиральной конформации, претерпевают а-0 переход при связывании с ДНК и синтетическим оператором Í241. Можно предположить, что двуспиральный мотив обладает склонностью к a-ß переходу и превращению в ß-шпильку. Это может быть вызвано тем. что пространственная конфигурация остова для 7 остатков (из 21) в двуспиральном мотиве, включая поворот между двумя a-спиралями, совпадает с конфигурацией соответствующего участка в ß-шпильке ингибитора трипсина Í 24 J.

II.2. Общая характеристика пептидов и аналогов нетропсина.

ковалентно связанных с. пептидами

В 1973 году в лаборатории химии белкового синтеза ИМБ РАН, возглавлявшейся Б.П. Готтихом, была создана химическая группа для конструирования и синтеза специфичных ДНК-связывающих лигандов. Она работала в тесном содружестве с нашей группой. Все пептиды, использованные в настоящей работе, были синтезированы С.Л. Гроховским, А.Л. Жузе, A.A. Хорлиным и В.А. Николаевым. Химические формулы пептидов представлены на рис. 7. Выбор именно этих пептидов был связан с экспериментальной проверкой модели для встраивания двух антипараллельных пептидных фрагментов в узкуо бороздку ДНК, а также с проверкой сформулированных выше правил узнавания пептидайи_ в ß-конформации различных последовательностей пар оснований в узкой бороздке ДНК.

H-Val-Val-Val-NH-NH-Dns 11)

H-Val-Thr-TlH—Val-Val-NH-MH-Dns 12 1

H-THr-Val-Thr-Lys-7al-Gly-THr-I.ys-Val-Gly-Thr-Val-Val-HH-NH-Dn£

(3)

Giv Gin Leu Gly Yal ДПг /al ,VaL Jhr ,Thr Dns Ala tys' Ala' 4ys' W 4ys 4ys "Gly 4al-0tt

(41

H-Lys-» Gly-b Valleys-»-Val-» NH-NH-Dns.

J 15)

Dns-MH-HH «-Val-^Cys «-Val «-Gly «-Lys-H

Рис. 7. Химические формулы синтетических пептидов. fins-остаток 5-диметиламино-нафталин-1-сульфокислоты. Стрелками показано направление М-» Са~* С в двух фрагментах цистинового пептида.

Синтез аналогов нетропсина, ковалентно связанных с пептидами Gly-Gly-, Val-fal-yal-Gly-Gly- я Dns-Gly-Val-Yal-yal-GIy-Gly-( Рис. ¡3), был осуществлен под руководством А.Л. -Жузе

С.Л. Гроховским и В.А. Николаевым. Я-ин-

"О"С0МНТ\_ № 9

™ с у— сомн-1сио - с: • с1

сн, !сн,1 2

¿н^ Химические формулы аналогов

нетропсина ], И н ГЦ

(I) И = С1у-01у-(Д) \/а1- Уа1 — Уо1—--(ПТ) Н.0пз-С1у-УаМ/а1-Уа1-С1ГС1у-

Комплексы тривалина и его аналогов с ДНК были исследоааки з основном С.А. Стрельцовым, пентапептида - Н.Ю. Сидоровой, цистинового пептида - А.Н. Суровой и Н.Ю. Сидоровой, более длинных пептидов - А.Н. Суровой, пептидных аналогов кетропсмна-Т.А. Леянсоо. Для нахождения мест преимукгствеииого связывания этих соединений на фрагменте ДНК с известной нуклеотмдноз последовательностью использовался метод футпринтинга. Все диаграммы футпринтинга были получены С.Л. Гроховским.

Взаимодействие пептидов с ДНК часто сопровождается процессом компактизации ДНК. Для исследования компактизаими ДНК использовался метод электронной микроскопии. Все электронномикроскопические данные были получены Ю.Ю. Венгеровым и Т.Е. Семеновым.

Здесь мы попытаемся кратко описать некоторые обиие свойства поведения этих соединений в растворе и их взаимодействия с нуклеиновыми кислотами.

Все исследованные пептиды имели ограниченную растворимость в воде и обладали способностью образовывать ассоциаты различного размера, которые находились в концентрационно-зависимом равновесии друг с другом и мономерами. Наличие ассоциатов в растворе подтверждается тем фактом, что спектры поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма пептидов в растворе были концентрационно-зависимыми. Среди исследованных пептидов пентапептид Уа1-ТЬг-ТЬг-Уа1-Уа1-МН-ИН-Вг13 обладал наибольшей

склонностью к образованию ассоциатов. В растворах этого пептида

-4

при концентрациях выше 2-10 М образовывались агрегаты большого размера, которые можно было регистрировать с помощью метода-поляризованной флуоресценции и электронной микроскопии [16 1.

Равновесие между различными агрегатными формами пептида в водном растворе наиболее полно исследовано для дансилгидразида тривалина' (ДГТВ) и аналогов нетропсина, ковалентно связанных с тривалином и дансилглицилтривалином. Как видно из Рис. 9, спектры поглощения аналога нетропсина, ковалентно связанного с

-7

тривалином, претерпевают изменения в области концентраций 1*10 -1-10 5 М. В отличие от спектров этого соединения, форма спектров

концентрации вплоть до

Рис. 9. Спектры поглощения аналога нетропсина, ковалентно связанного с тривалином, полученные при различных концентрациях (С) аналога. Концентрация аналога И:

1, С=1,6-10"Т_М;

2, С= 7,1-10"' М;

3, С=5,7-10~6 М. На вставке представлена зависимость 1/(Е,-Е > от 1/С . Условия:

1 о.р 1 2

0.001 М Иа- какодилат (рН 7),

-4

2% метанол, 1-10 М ЕБТА.

Это свидетельствует о том, что аналог И образует ассоциаты в водном растворе, в то время как аналог I, не содержании тривалина, находится в мономерной форме 120). При увеличении концентрации аналога Н значительные изменения в спектрах поглощения наблюдаются в области поглощения света амидными связями, в то время как поглощение при 297 нм (где поглощают свет Ы-пропилпирролкарбоксамидные группы нетропсина! не зависит от концентрации. Это отражает тот факт, что именно пептидные Фрагменты участвуют в образовании ассоциатов в водном растворе.

поглощения аналога 2 не зависела от

-з

концентрации 1*10 N [20].

Наличие ассоциатов можно также регистрировать с помошыо гель-хроматографии на колонках с Bio-gel Р4 и Р10 [20 1. Профили элюции аналога нетропсина, связанного с тривалином, свидетельствуют о наличии агрегатных форм, содержащих от 2-х до 4-х молекул аналога нетропсина. Для аналога, несущего Dns-Gly-Val-Val-Val-Gly-Gly-, обнаружено несколько агрегатных форм, содержащих от. 2-х до 12-и молекул олигопептида. При введении в хроматографическую систему метанола (20£ по объему) агрегаты высокого порядка исчезают и остаются низкомолекулярные ассоциаты, состоящие преимущественно из двух молекул пептида [20 ].

Константы димеризации определялись из кривых (Е1-Еар)~1 от 1/См (Рис. 9, вставка). Здесь E¡ -коэффициент молярной экстинкции мономера при 220 нм, Еар-отношение оптической плотности раствора при 220 нм к концентрации аналога, С -

концентрация мономеров. Константы димеризации оказались равны

5—1 5-1

6*10 M и 7*10 M для аналогов, содержащих пептиды

Dns-Gly-Val-Val-Väl-Gly-Gly- и Val-Val-Val-Gly-Gly-

соответственно. В метаноле константы димеризации увеличиваются

примерно в 2 раза. Таким образом, разрушение высокомолекулярных

агрегатов пептида при добавлении метанола, вероятно,

свидетельствует о том, что эти ассоциаты, в отличие от димеров,

стабилизируются за счет гидрофобных взаимодействий £201.

II.3. Оптические и Флуоресцентные характеристики комплексов пептидов с ДНК.

На Рис. 10 и И приведены спектры поглощения, флуоресценции и КД свободного 13-членного пептида в растворе и в комплексе с ДНК из тимуса теленка. Видно, что при добавлении ДНК к раствору олигопептида наблюдаются спектральные изменения в полосах поглощения дансйла7~Флуоресцентные измерения оказались очень чувствительными к образование комплекса пептида с ДНК: максимум спектра флуоресценции сдвигается с 550 до 515 нм, а квантовый выход увеличивается более, чей на порядок.™Аналогичные изменения в спектрах поглощения и флуоресценции наблюдаются при-связывании с ДНК дансилгидразидов тривалина (9,12 1 и пентапептида Í18 1.

300

400 Л.ППГГ

Рис. 10.

Изменения в спектре поглощения (а) и флуоресценции (б) 13-членного пептида при связывании с ДНК. Спектры поглощения и флуоресценции свободного пептида показаны пунктирными линиями. Сплошными линиями показаны спектр флуоресценции пептида в присутствии ДНК и разностный спектр поглощения, полученный путем вычитания из спектра смеси пептида и ДНК спектра поглощения свободной ДНК. Концентрация -5

пептида -5-10 М, концентрация

-4

ДНК - 1-10 М (пар оснований). Условия: 0,001 М Иа-какодилат IрН 7.0), 10 % метанол

Существенные изменения претерпевает и спектр КД (Рис. 11).

д0«103

Рис. 11. Спектры КД свободного 13-членного пептида (- - ) и 13-членного пептида в присутствии ДНК (— ). ДБ-измеренный дихроизм, рассчитанный на 1 см оптического пути. Спектр КД свободной ДНК ("•). X,ПГП концентрация пептида-5-10_5М.

-4

Концентрация ДНК.- 1-10 ^ М (пар оснований). Условия: 0,001 М Ыа-какодилат IрН 7.0) в присутствии 10Ж метанола.

Для свободного 13-членного пептида в растворе наблюдается отрицательная полоса КД при 197 нм. Это свидетельствует о том, что значительная часть молекул пептида в растворе имеет хаотическую конформацию. В присутствии ДНК появляются две отрицательные полосы КД при>220 и 255 нм, а также наблюдается

рост амплитуды КД при 190 нм. Аналогичные изменения имеют место при связывании пентапептида (Рис. 12).

дО*Ю3

Рис. 12.

Спектры КД свободного

пентапептида (—) и

пентапептида в присутствии

ДНК (—). ДБ -измеренный

дихроизм, рассчитанный на

1 см оптического пути. Для

сравнения показан также спектр

.30° КД свободной ДНК Г"), д,от

Концентрация пептида 1-10 М. Концентрация ДНК 1,2-Ю-4 М (пар основании?. Условия: 0,001 N Ыа-какодилат рН ~.0 в присутствии 10% МеОН.

Форма спектра КД пентапептида в комплексе с ДНК характерна для антипараллельного 0-слоя, в то время как спектр КД свободного пептида имеет форму, типичную для неупорядоченной конформации пептида.

Все эти результаты получены для относительно высоких уровней связывания пептида с ДНК, когда связанный пептид находился преимущественно в самоассоциированной форме. В присутствии очень низких концентраций пептида спектры поглощения и флуоресценции практически не меняются, а интенсивности флуоресценции в расчете на моль пептида в отсутствие и в присутствии ДНК практически совпадают, несмотря на то, что пептид по данным равновесного диализа связывается с ДНК. Таким образом, существуют по крайней мере две формы связанного пептида: одна, для которой практически не наблюдается изменений в спектрах поглощения и флуоресценции, и другая, для которой характерны значительные спектральные изменения и увеличение квантового выхода флуоресценции, а также появление характерных полос КД. Этот последний тип комплекса наблюдается при относительно высоких концентрациях пептида и высоких уровнях связывания, в то время как первый тип комплекса присутствует при низких концентрациях пептида, когда в растворе

пептид находится преимущественно в мономерной форме.

II.4. Специфичность связывания пептидов.

Специфичность связывания тривалина с ДНК была продемонстрирована более 10 лет назад С.А. Стрельцовым и соавторами. Была отмечена зависимость связывания пептида от GC-содержания природных ДНК [91, а также тот факт, что форма экспериментальных изотерм адсорбции пептида зависит от состава и нуклеотидной последовательности полимера f12 J.

На Рис. 13 представлены изотермы адсорбции ДГТВ на полиШО-поли(йС) и поли(dA)• поли(dT), полученные С.А. Стрельцовым методом равновесного диализа 1121. Изотермы адсорбции представлены в виде отложения г от 1 и в отложении Скэтчарда (r/m как функция т .г).

<3 "

Рис. 13. Изотермы адсорбции дансилгидразидатривалина (ДГТВ) на поли( йО-полиШС) (о о) и полм(йА)-поли( ¿Т) (• *) в отложении г как функция от о 1а1 и в отложении Скэтчарда (б).

Концентрации полинуклеотидов равны 8-10 М (пар оснований).

Условия: 0.001 N №-какодилат IрН 7.0 ) в присутствии

20% трифторзганола и 5% метанола.

Легко видеть, что после достижения некоторой критической концентрации свободного пептида, когда е растворе присутствовала равновесная смесь димеров и мономеров, начинается кооперативное связывание пептида. Пептид связывается более прочно с поли(йО» поли I йС ), чем с поли(йА )• поли (йТ). Как видно из изотерм Скэтчарда, в пределе очень низких уровней связывания, константы связывания мономеров пептида с полиИО-поли(йС) и поли(йА)-поли1йТ> оказались одинаковыми, т.е. не зависели от нуклеотиднои

последовательности. Кооперативное связывание пептида имеет место, вплоть до достижения насыщающего уровня связывания который

оказался одинаковым для связывания пептида на поли(dG )•поли(dC), поли 1dA )•поли!dT) и ДНК из тимуса теленка <г Х=1,2-1,3 ). Он соответствует связыванию двух димеров пептида, вероятно образующих ß-сэндвич, на три пары оснований. Сильно флуоресцирующий комплекс, образуемый ДГТВ и другими пептидами с ДНК, мы приписываем образованию 0-сэндвича, который встраивается в узкую бороздку ДНК. Структура тетрамера (ß-сэндвича) стабилизируется за счет взаимодействия между двумя ß-слоями, из которых один находится на "дне" узкой бороздки ДНК и взаимодействует специфически с основаниями ДНК, а второй находится на "внешней" поверхности молекулы ДНК и взаимодействует с первым ß-слоем, а также с атомными группами сахарофосфатного остова ДНК. Эта модель согласуется с большим количеством экспериментальных фактов, полученных для связывания ДГТВ и других пептидов с ДНК. Отметим прежде всего, что образование ß-сэндвичей ß-структурными пептидами - это широко распространенное явление. Оно особенно характерно для пептидов, содержащих аминокислотные остатки с массивными неполярными группами (Val, Не, Leu, Phe и др.), что обусловлено тем, что при образовании ß-сэндвича эти группы находятся в контакте с другими неполярными группами и становятся недоступными для взаимодействия с молекулами воды. При встраивании ß-слоя в узкую бороздку и образовании ß-сэндвича не только боковые радикалы аминокислотных остатков двух ß-слоев, но и два ароматических хромофора дансила становятся экранированными от контактов с молекулами растворителя, с чем, вероятно, связаны рост интенсивности флуоресценции и спектральные изменения, наблюдаемые при связывании ДГТВ и других пептидов с ДНК.

Заполнение узкой бороздки ДНК ß-сзндвичами тривалина, пентапептида или тридекапептида изменяет свойства макромолекулы. Молекулы ДНК приобретают способность ассоциировать друг с другом, образуя так называемую двудуплексную структуру [Макаров и др., 1963; 15,17,18, 21). Процесс компактизации ДНК в присутствии 13-членнного пептида протекает в два этапа- вначале формируются компактные палочковидные частицы, а затем- глобулярные частицы, каждая из которых содержит одну молекулу ДНК 117].

С лоыошыо сочетания .метода равновесного диализа и флуоресцентных измерения удалось показать, что интенсивность флуоресценции в расчете на один моль ДГТВ является одинаковой для комплексов с полиШО-полиИЗС) и поли(йА)• поли(йТ) {12 1. Мы уже отмечали, что связывание мономеров не сопровождается значительными изменениями г форме спектров поглощения и флуоресценции пептида. Это относится и к связыванию димеров пептида на изолированных связывающих местах. Для связывания ДГТВ на нуклеиновых кислотах этот вывод был впервые получен С.А. Стрельцовым с помощью сочетания различных физических методов 1С.А. Стрельцов и др., 1991). Он подтверащается также результатами, полученными для связывания цистинового пептида, который исходно является дилером, так как состоит из двух идентичных пептидных фрагментов, связанных друг с другом ковалентно с лоыошыо Б-Б связи [23].

Подобно ДГТВ, другие исследованные пептиды также могут образовывать специфические комплексы с ДНК. На Рис. 14 показаны кривые флуорометрического титрования различных полинуклеотидов 13-членньы пептидом "№г-Уа1-ТЬг-Ьуз-Ч'а1-С1у-ТЬг-Ьуз-Уа1-С1у-ТЬг-Уа1-Уа1-КН-Ш-Бп£з. Видно, что связывание этого пептида зависит от нуклеотидной последовательности полимера.

Рис. 14.

Кривые флуорометрического

титрования 13-членным

пептидом различных

полинуклеотидов.

С- концентрация пептида.

Концентрация всех

полинуклеотидов равна -5

8«10 М (пар оснований). Условия: 0.001 М Ыа-какодилат в присутствии 5-10~4 М М§С12 и 25% метанола.

Пептид в 15-ассоциированной форме обладает большим сродством к поли(сКАС) 1-полиГЙ(СТ) ] и поли(йА1-поли(<ЗТ), чем к

•асас--а4ад-

ж"-тттт-

•осео-"•--сссс-

Х-бсос--сосо

поли1 (Ю) - по ли ((1С) или полиСК СС ) ЬполиСсНСС ) ].

В отличие ог 13-членного пептида, 20-членныя пептид Епз-С1у-А1а-С1п-1уз-1еи-А1а-С1у-1уз-Уа1-С1у-ТПг-1уз-Уа1-1уз-Уа1-С1у-Т1и—1.уз-Т11Г-Уа1-0Н обладает большим сродством к поли! сЮ)»полиIЙС). чем к полиI<ЗА)• поли(сГГ), хотя, подобно 13-членному пептиду, он связывается более слабо с поли!<1 ЮС) ]• поли!¿ИСС) ], чем с поли(йА)-поли(с1Т> (Рис. 15).

Рис. 15.

Кривые флуорометрического титрования 20-членным пептидом поли(ао-поли(йС) (••),

ПОЛИ((1А)-ПОЛИ(с1Т) (о О) И

полиСКСС) 1-поли[(1(СС) 1 (о о). С- конценерация пептида. Концентрация всех полинуклеотидов равна 8-10-6 М (пар основания). Условия: 0.001М Ма-какодилат (рН 7.0) в присутствии 0.02 М ИаС! и 20% трифторэтанола.

с- ю , м

Характерная Б-образная форма кривых титрования, полученных для 20-членного пептида, свидетельствует о кооперативном связывании пептида с ДНК.

0 специфичности связывания пептида с ДНК можно также судить по различии в устойчивости комплексов пептида с синтетическими полинуклеотидами при добавлении ЫаС1. Так, комплекс пентапептида Уа1-ТЬг-Пг-Уа1-Уа1-НН-ИН-Вп5 с поли (ёО-поли! с!С) был устойчив в присутствии 0.2 М НаС1, в то время как комплекс с полиIЙА)*поли(с1Т) полностью разрушался в присутствии 0.05 М МаС1 118). Очевидно, различие-в сродстве пентапептида к поли( сЮ)*поли1с1С) и- поли(с1АЬполи1сГП определяется не электростатическими- взаимодействиями между катионами пептида и фосфатными группами ДН1С, а. ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями между пептидом и основаниями и/или сахарофосфатным остовом ДНК.

II.5. О корреляции между аминокислотной и нуклеотидноя последовательностями в. специфических комплексах.

Изучение специфического взаимодействия между пептидами и нуклеиновыми кислотами представляет большой интерес, так как позволяет установить, имеется ли какая-нибудь корреляция между аминокислотными и нуклеотидными последовательностями в специфических комплексах. В 20-членном пептиде расположение остатков валина и треонина коррелирует с последовательностью АТ-и GC- пар в операторе 0R1, с, которым избирательно связывается

Рис. 16. Соответствие между аминокислотной последовательностью 20-членного пептида и нуклеотидноя последовательностью оператора 0R1 фага К. АТ- и GC- кодирующие аминокислотные остатки подчеркнуты непрерывными линиями и точками соответственно.

С помощью флуорометрическбго титрования пептидом различных синтетических полинуклеотидов были подобраны условия оптимальные для проявления специфического связывания, а затем с помощью Футпринтинга были определены места преимущественного связывания пептида на фрагменте ДНК, нуклеотидная последовательность которого представлена на Рис. 17. Этот фрагмент включает нуклеотиды 37956-38058 ДНК фага А и содержит операторы 0R1 и Or2, а также модифицированный оператор 0R3. Нуклеотиды 1-20 соответствуют фрагменту Cfrl3-EcoEI плазмиды рВН322. Таким образом, в модифициров4нном операторе 0R3 из 17 пар оснований четыре пары были заменены основаниями из плазмиды рВВ322.

Профили расщепления комплексов ДНК с пептидом кислой Днкаэои

CI репрессор фага Л (Рис. 16).

Dn« I

Gly

Me I

Gln lyj

20 'O Leu

tfci Lys Gly Ly» Lys Gly Lys Ala

\/\/\/\/\/\/\[

Ты Thr Vol Va» Thr Vqi Gly f = «к» eco oca «г-» ем I

5' TACCTCTGG 3' ATGGAG ACC

и ДНКаэой I [19 3 свидетельствуют о специфической защите пептидом нуклеотидов в операторах 0к1 и Ок2, а также нуклеотидов, которые

находятся в непосредственной близости от них. Защитный эффект

практически отсутствует в модифицированном операторе С>к3.

а)

А +6 4

4 0 2

10 I

0,3

0„1

СССТТТССТСГТСААСААТТССССААСОЗА 1___

°я3

40 + 1 +

♦

114

60 >1

§ *

I -

ТАААТАТСТААСАСССТСССТСТТСАСТАТ _1 I—-1

* *

♦

во I 4

- 23

А1 -= 50

59 64

|: <80

? " - : 86

Рис. 17. Радиоавтограмма продуктов гидролиза кислой ЛНКазой комплексов 20-членного пептида с фрагментом ДНК, содержащей операторы 0К1 и Оя2 бактериофага Л, а также модифицированный

оператор 0Е3 (а) и нуклеотидная последовательность части этого

фрагмента (Ь). Стрелками указаны нуклеотиды, защищаемые пептидом от действия кислой ДНКазы. Цифрами у каждой дорожки указано отношение концентрации пептида в исследуемом комплексе к концентрации пептида в комплексе, продукты гидролиза которого представлены в дорожке 1. Концентрация пептида в последнем равна

6»10 0 М. О- контроль, продукты расщепления свободной ДНК.

ТТТАССТСТССССаТСАТААТССТТССАТС

1_1

Он1

В связи с наблюдаемой специфичностью связывания 20-членного пептида представляют интерес данные КД спектроскопии о

конформации пептида в комплексе' с ДНК (Рис. 18).

спектры свободного полинуклеотида (2) и полинуклеотида в присутствии 20-членного пептида (1). в, й, Т- спектр свободного 20-членного пептида (2) и разностные спектры, полученные вычитанием из спектра комплекса спектра соответствующего полинуклеотида (1). Приведены спектры, полученные в присутствии поли(йО-поли( ¿С ) (а,в), поли(йА)-поли( йТ ) (с,с1) и поли[сИАС) 1«поли[с1(СТ) I (е.Г). Де -молярный дихроизм, рассчитанный на 1 моль пар оснований. (9!- эллиптичность,

выраженная в град см2/дмоль (аминокислотных остатков).

Концентрация пептида- 2,2 10 " М. Концентрация полинуклеотида-

_ г,

6,7 10 " М (пар оснований). Условия:0,001 М Иа-какодилат (рН 7.0) в присутствии 20% трифторэтанола, 20°С.

Как видно из Рис. 18, спектры КД'свободных полинуклеотидов поли(йО-поли! (1С ), поли(с(А ) .поли((П ) и полиГй! АС) 1-полиШСТ) 1

сильно отличаются ¿фуг от друга, что Отражает различия в их нуклеотидноа составе и конформации. Сильно отличаются также спектры комплексов пептида с различными полинуллеотияами. Однако, разностные спектра КД, полученные путем вычитания из спектра комплекса спектра соответствующего полннуклеотида, оказались практически одинаковыми и подобными спектру, характерному для деформированной 3-структуры. Хороша известно, что для плоского В-слоя характерен Спектр КЛ с примерно равными ампднтудаии положитфшной и отрниателъноя полос при 195 и 229 на. Для 0-сдоя, закрученного в Ирав$0 спираль, по сравнению с плоским В-слоем„ характере смеийние наксинума коротковолновой положительной полосы С, 193 до примерно 200 нм, а также значительный рост ее интенсивности пра охранении амплитуды отрицательное полосы при 220 нм. Уоойу е1а1., 196®). Форма разностных спектров КД напоминает спезтр КД ДЛЯ В-слоя со значительной-^п^^зльной закрутко^. ^

Для с1твета' на вйпрас}о локализации пептида при свйГ^всчии с ДНК, мы гípoвoдйли эксперименты по вытеснению 20-членноГо пептида антибиотиком сибиромицином, который образует ковалентную связь с 2-аминогруппой гуанина (Ю.В Дудник и др., 1978; Ре1гиБек

et а1.,1981). Задача состояла в той, чтобы выяснить, сколько должно связаться сибярймицина, чтобы взаимодействие пептида с поли(сЮ )•поли(йС> стало невозможным. Оказалось, что для этого одна молекула связанного сибиромицина должна приходиться на 5-6 пар оснований ДНК 1191.

Все эти результата согласуются- с предположением о том, что пептид в деформированной В-конформации связывается в узкой бороздке ДНК. Предпочтительное связывание тривалина с поли(с1С)-поли(с1С), а 13-членного пептида с поли(й( АС) ] • поли[сКСГ) 1 согласуются с тем, что валин и треонин являются СС-и АГ- кодирующими остатками соответственно. В 13-членном пептиде остатки валина и треонина, начиная с треонина в третьем положении, образуют чередующуюся последовательность, комплементарную последовательности АТ- и СС-пар в поли!(КАС) 1 «поли(сИСП 1. Более сложная нуклеотидная последовательность узнается 20-членным пептидом. Таким образом, располагая остатки валина и треонина в определенной

последовательности, мо^кно создавать пептиды с различной специфичностью связывания.

III.1. Аналоги нэтропсина. ковалентно связанные с тривалином. содержат реакционные центры, специфичные к AT- и GC-парам ДНК

Один из возможных путей синтеза лигандов, способных "читать" протяженные последовательности AT- и GC-nap оснований в узкой бороздке ДНК состоит в ковалентном присоединении к аналогам АТ-специфичного антибиотика нетропсина пептидов, способных образовывать специфические комплексы с ДНК. Мы исследовали возможность использования в составных лигандах в качестве элементов, узнающих GC-пары оснований, пептидов Val-Val-Val- и Dns-Gly-Val-Val-Val- • Все исследованные соединения содержали два N-пропилпирролкарбоксамидных фрагмента, к N-концу которых были присоединены пептиды Gly-Gly-(аналог Г), Val-Val-Val-Gly-Gly-[тшг %is-Gly-Val-Val-VaL-Gly-Gly- (аналог Щ) (Рис. в).

В годном растворе и метаноле аналоги ГТ и ГП, в отличие от аналога I, образуют ассоциаты, которые находятся в кониектргщконно-зависимом равновесии друг с другом и с ^ономераки. Димерная форма этих соединений возникает за счет взаимодействия пептидных фрагментов, которые сами по себе в водных растворах образуют димеры, построенные на основе антипараллельной (З-структуры.

Наш эксперименты показывают, что аналоги II и ИГ связываются с ДНК специфически. Их сродство к различным нугслеотидиым последовательностям на ДНК зависит от того в ¡«шхерной или в В-ассоииированной форме,они присоединяются к ДНК. Взаимодействие с ДНК N-пропилпирролкарбоксамидных фрагментов V. пептида Dns-Gly-Val-Val-Val- (аналог 171) можно было оьновременно и независимо регистрировать с помошью флуоресцентных л^мереьип и измерений амплитуды КД при 315 нм. Эти эксперименты показали, что при малых уровнях связывания 10<г<0.02) аналог III связывается преимущественно на изолированных связывающих местах (кластерах AT пар) в форме мономера с помошью N-пропилпиррол-карбоксаьмдных фрагментов. Что касается связывания пептидного

фрагмента, то в комплексах с малыми значениями г он практически не взаимодействует с ДНК, о чем свидетельствует отсутствие изменений в форме спектра флуоресценции при образовании комплекса по сравнению со спектром флуоресценции свободного аналога. Резкая рост интенсивности флуоресценции наблюдается лишь тогда, когда в свободном растворе значительная 'часть молекул аналога ГТТ находилась в диыерной форме. В этом случае з спектре КД комплексов в дальней ультрафиолетовой области появлялась отрицательная полоса при 220 ни и наблюдался рост амплитуды КД при 195 нм. Эти спектральные изменения согласуются с тем, что при связывании аналога £П с ДНК пептидные фрагменты частично переходят из беспорядочной конформации в ß-конформацию. Взаимодействие пептидных фрагментов с ДНК проявляется также в увеличении размеров связывавшего места на поли(dA)-поли(dT) для аналога III по сравнению с аналогом I.. Размер связывающего места (L) можно определить из начального хода изотерм лиганда на поли(бА)>поли1(1Т) по формуле 1/n =2L-1. где пар- кажущееся чисхс связывающих мест. Экспериментальные значгёнчя L равны 3-0.5, 4-0.5 и 9- 1 парам оснований для аналогов 7, JI и ГП соответственно. При низкой ионной силе константа связывания аналога _И с поли1йА)-поли1<1Т) примерно в 60 раз больше, чем константа связывания аналога ГП. Для получения изотерм адсорбции аналога П при низкой ионной силе приходилось использовать столь низкие концентрации полимера и лиганда, что в свободном растворе димерная форма аналога П практически отсутствовала. Изотермы адсорбции аналога III получены при более высоких концентрациях, так что в свободном растворе присутствовали димеры и мономеры аналога Гп. Если начальный ход изотерм адсорбции определяется связыванием димеров соединения ТО и мономеров соединений Ти П, то наши оценки для L хорошо согласуются с ван-дер-ваальсовыми размерами адсорбированных молекул. Для наблюдения димерного связывания аналога TT эксперименты приходилось проводить в присутствии 0.3 М NaCl. Это позволило уменьшить константу мономерного связывания примерно в 100 раз и использовать для получения изотерм адсорбции более высокие, чем в экспериментах при низкой ионноя силе, суммарные концентрации аналога JJ, когда

в свободном растворе в равновесной смеси присутствовали Аюно&ьру и димеры аналога JT 120 ].

Взаимодействие пептидных фрагментов с Дпл проявляется в ггл;, что аналоги IIa ГТГ ведут себя как агух£е>&<£>,@кт1ше лигами, имеющие реакционные центры, специфичные ¡л ¡V7- « GC-napa-j основания ДНК. Это установлено на основами "¿гьчзимостей иол:,';.. связывания лиганда (К) на различных природных зПНК и синтез-.-..,-г полинуклеотидах от содержания АТ-пар в полимере, ХАТ.

Предположим, что двухкомпонентшй лиганд содержит п1 АТ-специфичных «енгров и п^ GC-специфичных центров. Значения ns и XI можно определить из наклона экспериментальных кривых 1пК от

от 1пХос в пределе, когда X соответственно {11,14,22 1. Здесь = 1-

52С

1пХ д_ и 1пК

1 и X,

dlnK

= lim

■i dlnX

(22 )

dlnK

n2 = liaj

•. (23 )

X„„->-l dlnX„„ ос ос

Экспериментальные зависимости InK от 1пХАТ для связывания

соединении Т и ГП приведены на Рис. 19.

-1 1пХАт О

Рис. 19

Зависимости 1пК от 1П^АТ> полученные для связывания с различными природными ДНК аналогов нетропсина _Г (® •) и Ш (<г уП . Сплошными линиями показаны теоретические кривые, рассчитанные для связывания однокомпонентного лиганда, который содержит 1, 2 и 3 АТ-специфичных центра.

Видно, что для аналога I зависимость 1пК от

АТ

представляет собой прямую линию, наклон которой равен 3, т.е. молекула аналога I. имеет 3 АТ-специфичных центра. Экспериментальная зависимость. 1пК от 1пХдт , полученная для связывания аналога ГП. имеет иной характер. Она не является линейной, 1пК имеет наибольшее значение при =0.72.

г АТ _

Аналогичная зависимость была получена для связывания аналога II в присутствии 0,3 М МаС1 [20].

Зависимости такого типа свидетельствуют о том, что соединения Д и Ш, кроме АТ-специфичных реакционных центров, содержат еше и центры, которые взаимодействуют специфически е (Х-парами оснований. Аналогичны» результат был недавно получен другой группой исследователей для аналога нетропсина, ковалеитно связанного с триаланином (Р. Debapt а!., 1989).

Изменение в специфичности связывания аналогов нетропсина при ковалентном присоединении пептида можно было также зарегистрировать с помощью метода футпринтинга. Анализ профилей нуклеазного расщепления свободной ДНК и комплексов ДНК с аналогом I показывает, что аналог X взаимодействует преимущественно с кластерами из 4-х и более АГ-пар, которые защищаются от расщепления ДНКазой 1 и кислой ДНКазой из печени минтая [221. Аналоги ГТ и ГП зашишают от нуклеазного расщепления два типа связывающих мест. Один из них включает все сильные связывающие места для аналога Они, вероятно, соответствуют связывании аналогов П. и III в мономерной форме. Другой класс связывающих мест содержит два АТ-богатых участка, разделенных

последовательностью Сй . Мы предположили, что на этих связывающих

СС __ _

местах адсорбируются димеры аналогов 11 и III.

По данным футпринтинга на фрагменте ДНК из плазмиды риС9

(410 пар оснований) имеется четыре сильных связывающих места для

димеров аналога .Некоторые имели одну и ту же последовательность

5'-АААССАТС . В остальных 3-х сильных связывающих местах СС-пара 3 ' -ТТТССТАС

в положении 8 была заменена АТ- парой оснований [22] .

На основании полученных экспериментальных результатов была предложена модель комплекса, образуемого димерами аналога II (или

Щ) с ДНК (Рис. 20).

Рис. 20

Пространственная модель структуры комплекса между димером аналога нетропсина, ковалентно связанного с тривалином, и ДНК. В димере фрагменты тривалина образуют антипараллельный 0-слоя, который встраивается в узкую бороздку ДНК и взаимодействует с двумя СС-парами оснований. Два нетропсиноподобных фрагмента связаны осью симметрии второго порядка. Каждый из них образует специфические водородые связи с тремя АТ-парами.

Согласно этой модели пептидные фрагменты в димерах аналогов II и Ц1 образуют В-слоя, который встраивается в узкую бороздку ДНК и взаимодействует специфически с двумя СС-парами. Поскольку боковые цепи валина инертны, ОС-специфичность связывания пептидных фрагментов, вероятно, обеспечивается за счет образования водородных связей между Ш и СО группами остова двух антипараллельных пептидных цепей и СС-парами оснований.

III.2. Взаимодействие с ДНК бис-нетропсина, в котором пептидные Фрагменты С1'/-Суз-С1у связаны ковалентно с помощью 5-5 связи.

Чтобы доказать стерео химическую модель для комплекса, представленную на Рис. 20, В.А. Николаев. С.Д. Гроховский и А.Л. Жузе синтезировали бис-нетропсин, в молекуле которого два пептидных фрагмента С1у-Су5-С1у-С1у-С1у- , присоединенных к нетропсиноподобным фрагментам, были ковалентно соединены друг с другом с помощью б-б связи (Рис. 21). Были синтезированы также бис-нетропсины с другой взаимной ориентацией нетропсиновых и пептидных фрагментов. Сравнение специфичности связывания различных бис-нетропсинов можно найти в работе (22 1

-IV

Рис. 21. Химическая формула бис-нетропсина, содержащего цистиновый пептидный димер в центральной части молекулы. Стрелками показано направление М-^Са->-С' в пептидных цепях бис-нетропсина.

Исследование связывания бис-нетропсина IV с поли(с!А)•поли(¿ТI показывает, что оба нетропсиновых фрагмента присоединены к ДНК. Это проявляется в том, что молекула бис-нетропсина занимает при связывании на поли(¿А >-поли(йТ) 10-11 пар основании. Это подтверждается также тем, что молярный дихроизм комплекса бис-нетропсина с полиШАЬполиКИ) при 320 нм в 2 раза больше, чем молярный дихроизм соответствующего комплекса с аналогом I.

Экспериментальные зависимости 1пК от 1пХ.„ и 1пК от 1пХ„.

АТ ОС

рассчитанные из изотерм адсорбции бис-нетропсина на .различных природных ДНК и синтетических полмнуклеотидах были использованы для того, чтобы определить количество АТ- и ОС-специфичных реакционных центров в молекуле. Здесь Х,„ и Х„_= -

АТ ОС АТ

содержание АТ- и (Х-пар в полимере соответственно. Оказалось, что начальный наклон кривой, описывающей зависимость 1пК от 1пХдт равен 6, в то время как кривая 1пК от 1пХос при Хас~* 1 имеет наклон, равный 2 (22 1. Таким образом, оис-нетропсин Г£ Еедет себя как дЕухкомпонентным лиганд, который содержит шесть АТ- и два ОС-специфичных центра. Так как Л-пропилпирролкарбоксамидные фрагменты служат в качестве АТ-спеиифичных центров, мы полагаем, что пептидные фрагменты в молекуле бис-нетропсина несут два СС-спеиифичных центра.

Анализ профилей нуклеазного'расщепления комплексов бис-нетропсина с фрагментом ЛИК, нуклеотидная последовательность которого представлена на Рис. 22, показывает, что на этом фрагменте имеется четыре места преимущественного связывания бис-нетропсина.

а Ь

349 С 3370

В"**"" ~

900 А— - -- ' - тш<»г-

8870- •ВгяЗ

880 -871 Б- 8-2-. - _ I1* 11 __ 1

860 А-

ЕИЗ"

837 А-

828 Э- ^чтшШМ

10 0О

АСССССАСССТТССССААСССАСАААСССССАСАССГАТССССТААСССС

САСССТСССААСАССАСАССССАССАСССАССТТССАСХХЗССАААССССТ

17ПI I I • '

ССТАТСТТТАТАСТССТСТССССТТТССССАССССТСАСТТСАСССТССА

£80 8'0

ТТТТТСТСАТССТССТСАСССССССССАСССТАТССАААААССССАССАА

■.■П.ПЩЩЦЦ 820- - 800

I-. I I 1 I

СССССССТТТТТАСССТТССТССССТТТТССТССССТТТТССТСАСАТСТ пппяяппп

1 ""тИ и

Рис. 22. Профили расщепления ДНКазои I комплексов бис-нетропсина IV на фрагменте ДНК из плазмиды риС9 I а) и нуклеотидная последовательность части рестриктазного фрагмента ДНК (б). Показаны места преимущественного связывания бис-нетропсина на этом фрагменте. Концентрация бис-нетропсина в комплексах, продукты гидролиза которых представлены в дорожках 1-3, равны 2,6-10"°, 8,7-10"' и 2,9-10"' М соответственно. О -контроль, продукты расщепления свободной ДНК. Нуклеотиды пронумерованы в направлении С3'-С5' Скобкой отмечены участки полинуклеотиднои цепи, которые защищаются бис-нетропсином от расщепления ДНКазои I.

Наиболее сильное связывающее место, для которого эффект

950

90 0

920

зашиты наблюдается уже в присутствии 3-10-7 М бис-нетропсина, имеет нуклеогидную последовательность 5'-ТАТССААА-З'. Центр тяжести связывающего места, как правило, смешен относительно центра тяжести защищенного участка на радиоавтограмме на три нуклеотида в 5'-направлении.

На основании полученных экспериментальных данных предложена модель комплекса бис-нетропсина с ДНК, согласно которой два нетропсиноподобных фрагмента молекулы бис-нетропсина и цистиновыя пептид связаны водородными связями с основаниями в узкой бороздке ДНК (Рис. 23>.

Рис. 23. Общий план структуры комплекса бис-нетропсина с ДНК (а) и предполагаемая схема водородных связей, образуемых ИН и СО-группами остова двух пептидных фрагментов и ИН группами двух нетропсиновых фрагментов бис-нетропсина IV с основаниями ДНК (б >. Показан вид со стороны узкой бороздки. Указана последовательность пар оснований в самом сильном связывающем месте для бис-нетропсина на рестриктазном фрагменте ДНК. Пунктирными линиями показаны межмолекулярные водородные связи, стабилизирующие структуру комплекса.

Цистиновыя пептид встраивается в узкую бороздку таким образом, что боковой радикал цистина' проектируется на внешнюю

поверхность молекулы ДИК. Направление М-»Са-»-С' в каждом пептидном фрагменте бис-нетропсина совпадает с направлением С3'-С5' в ближайшей полинуклеотидной цепи. МН и СО- группы пептидного остова двух пептидных фрагментов служат в качестве доноров и акцепторов водородных связей для присоединения к двум СС-парам, находящимся в центре связывающего места для бис-нетропсина. 2-аминогруппы гуаниновых оснований служат в качестве доноров водородных связей для взаимодействия с С=0 группами одного из пептидных фрагментов бис-нетропсина, а N3 атомы пурина и 02 атомы пиримидина служат акцепторами водородных связей для взаимодействия с Ш-группами нетропсиновых и пептидных фрагментов.

Наличие ОС-специфичных центров в молекуле бис-нетропсина проявляется в том, что этот синтетический лиганд образует прочный комплекс с полило-полило. Комплекс устойчив в присутствии 0,6 М ЫаС1 [221. Для сравнения отметим, что комплекс нетропсина с поли(сЮ) поли(йС) разрушается в присутствии 0,05 М МаС1.

III.3. Взаимодействие с ДНК цистин-содержащего пептида 5.Э'-Ыэ[Н-Ьуз-С1у-Уа1-Суз-Уа1-НН-НН-Рп5 )

На рис. 24 представлены кривые флуорометрического титрования

пептидом растворов различных синтетических полинуклеотидов.

Рис. 24. Флуорометрическое титрование

цистиновым пептидом

поли(с1С)«поли(с1С) (0 0),

поли(ёА)-поли(йГ! и

поли(сНСС) 1 -поли[с!(СС) 1 (а а).

о), пептид в растворе .

С- концентрация пептида.

Концентрация полинуклеотидов

в этих экспериментах была

одинакова и равна 8-10 6 М

(пар основании). Условия:

0,001 М Ыа-какодилат I рН 7) в

присутствии 0,1 М №С1, 20° С

Пептид связывается более прочно с поли!1С) «поли(6С), чем с

поли! (1А)• поли(йТ) и поли(сКСС) ) •поли[(1(СС) ]. Это согласуется с тем, что комплекс с поли(йО-поли(йС) был устойчив в присутствии 0,4 М КаС1, в то время как комплекс с поли1с!А).поли(сЗТ) разрушался в присутствии 0,2 М ИаС1.

На Рис. 25 представлены изотермы адсорбции пептида с поли(йО»поли(сЗС) и поли(сЗА)«поли( 1ТI.

г /т *10

-4

—4

г/т*10 _

ро!у(<ЗА)-ро1у(сП")

= 4 К = 1800 W= 200 а= 100

0.50 О

0.25

0.50

Рис. 25. Сравнение экспериментальных и теоретических изотерм, рассчитанных для связывания цистинового пептида на поли1<30' поли(йС) и поли(¿А ) -поли(йТ). Теоретические кривые показаны сплошными линиями. Указаны значения константы связывания мономера (К), параметра V, параметра кооперативности (а) и размера связывающего места (Ь), при которых наблюдается наилучшее соответствие между экспериментальными и теоретическими кривыми. Среднеквадратичные отклонения экспериментальных точек от теоретических кривых равны 0,013 ( ро1у(йО>ро1у((1С>) и 0,018 (ро1у(йА)»ро1у(йТ)). Условия указаны в подписи к Рис. 24.

Теоретическую модель, которая хорошо описывает форму экспериментальных изотерм адсорбции, можно кратко описать следующим образом. Пептид взаимодействует с ДНК в виде мономера (0-слой) и димера (В~сэндвич), каждый из которых "накрывает" при связывании 4 пары оснований. Эти две формы комплекса обладают различными флуоресцентными характеристиками. Мономеры связываются некооперативно, в то время как связывание димеров представляет собой кооперативный процесс, за который ответственны взаимодействия между 0-сэндвичами, адсорбированными на соседних связывающих местах. Термодинамические параметры определяли путем минимизации среднеквадратичного отклонения

экспериментальных точек от теоретических кривых. Расчеты изотерм адсорбции проводили по формулам (18) и (19).

Константы связывания цистинового пептида на изолированном связывающем месте оказались равны 17600 М-1 и 1800 М-1 для связывания с поли(dG)-поли(dC) и поли! 4А)-поли(йТ) соответственно. Таким образом, константа связывания пептида с поли(аО-поли!dC ) превосходит константу связывания с полиША)-поли!dT) примерно в 10 раз. Параметр кооперативности равен 6-3 для связывания на поли(йСЬполи^С). Для связывания с поли(йА).поли(йТ) а = 100. Параметр W оценен равным 200 независимо от того, связывается ли пептид с поли^О-поли!йС) или ■ поли(йА)«поли(dT). Наши эксперименты показывают, что сэндвичи практически отсутствуют в свободном растворе. Это подтверждается тем, что в исследуемой области концентраций пептида отсутствуют концентрационно-эависимые изменения формы спектров флуоресценции и поглощения пептида.

Комплексы пептида с поли(dG)• поли(с!С) разрушаются при добавлении антибиотика сибиромицина, образующего ковалентную связь с 2-ашшогруппой гуанина. Пептид практически не взаимодействует с поли(dG )-поли(ЗС), если одна молекула связанного антибиотика приходилась на 2-3 пары оснований [23 1. Эти результаты объясняются наиболее просто, если предположить, что цистиновый пептид, как и сибиромицин, связывается в узкой бороздке ДНК.

Пространственная модель, предложенная для комплекса бис-нетропсина с ДНК, имеет очевидное сходство со структурой кристаллического комплекса антибиотика триостина к с самокомплементарным олигонуклеотидом (A. Wan?, et al., 1984). Депсипептидныи цикл триостина А содержит пептидные фрагменты в В-конформации, связанные с помощью S-S связи (Рис. 6) Однако, в отличие от бис-нетропсина молекула триостина А содержит ароматические хромофоры, которые при образовании комплекса прослаиваются между парами оснований ДНК. В отличие от комплекса с триостином А, взаимодействие нетропсина с ДНК не вызывает ' значительных конформационных изменений в молекуле ДНК. Наличие специфических контактов между пептидными цепями бис-нетропсина и GC-парами оснований указывает на то, что механизм узнавания

нуклеотидных последовательностей в узкой бороздке ДНК с помощью остова двух антипараллельных пептидных цепей имеет общее значение и, вероятно, представляет собой один из фундаментальных механизмов ДНК-белкового узнавания.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены уравнения и рекурентные алгоритмы для расчета изотерм адсорбции регуляторных белков и других специфических лигандов на синтетических полинуклеотидах и фрагментах ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Учитываются эффекты, обусловленные физическим размером адсорбированных молекул, а также эффекты, вызванные взаимодействиями между ближайшими адсорбированными молекулами. Рассмотрен случай, когда лиганд связывается с ДНК в одной фиксированной ориентации, а также случай, когда он присоединяется в двух альтернативных ориентациях, связанных осью симметрии второго порядка.

2. Проведен анализ кооперативных эффектов для широкого класса кооперативных систем. Показано, что изологичные взаимодействия между ближайшими адсорбированными молекулами способствуют образованию изологичных димеров на ДНК, в то время как гетерологичные контакты способствуют образованию агрегатов произвольного размера. Рассмотрен также случай, когда вместо изологичных димеров на ДНК образуются сэндвичи, состоящие из двух адсорбированных молекул. Сэндвичи и мономеры могут связываться на ДНК кооперативно или некооперативно. Рассмотрен случай, когда взаимодействие между лигандом и ДНК сопряжено с мономер-димерным равновесием в растворе.

3. Впервые предложена стереохимическая модель для встраивания в узкую бороздку ДНК двух антипараллельных пептидных цепей в деформированной В-конформации. Согласно этой модели ИН- и СО- . группы остова двух антипараллельных пептидных цепей служат донорами и акцепторами водородных связей для взаимодействия с функциональными группами пар оснований в узкой бороздке ДНК. На основании этой модели сформулированы правила узнавания пептидами в |3-конформации нуклеотидных последовательностей в узкой бороздке

4. Проведено систематическое изучение связывания с ДНК и синтетическими полинуклеотидами пептидов Уа1-Уа1-Уа1-ИН-№-Спв,

Уа1-ТЬг-Т1и—Уа1-Уа1-МН-Ш-Впв и Т11Г-Уа1.-Т11Г-1.уз-Уа1-С1у-ТЬг-1.у5-7а1-С1у-ТЬг-1уз-ТЬг-Уа1-Уа1-НН-МН-Бпз. Показано, что эти пептиды связываются с ДНК в мономерной и ^-ассоциированной формах (£~слой и 0-сэндвич). Связывание сопровождается переходом пептида из беспорядочной в 0-подобнуо конфорыацию. Показано, что специфичность связывания пептидов в ^-ассоциированной форме согласуется с правилами 0-структурного узнавания в узкой бороздке ДНК. Связывание пептидов в мономерной форме не зависит от нуклеотидноя последовательности.

5. Сконструирован 20-членныя линейный пептид, в котором расположение остатков треонина и вапина коррелирует с расположением АТ- и (Х-пар в левой половине оператора Ок1, узнаваемого С1 репрессором фага Показано, что этот пептид в В-ассоциированноя форме связывается специфически с ДНК и защищает от нуклеазного растепления операторы 0К1 и 0^2, а также участки ДНК. непосредственно примыкавшие к этим операторам. Он не проявляет заметного сродства к модифицированному оператору 0К3,

6 котором 4 пары оснований заменены другими парами.

6. Исследовано взаимодействие с ДНК аналогов нетропсина, к М-концу которых с помощью двух остатков глицина присоединены пептиды Уа1-Уа1-Уа1- и Юпз-С1у-Уа1-Уа1-Уа1- . Показано, что в водном растворе и метаноле эти соединения образуют ассоциаты, которые находятся в концентрационно-зависимом равновесии друг с другом и мономерами. Димерная форма аналогов возникает за счет взаимодействия пептидных фрагментов, которые образуют антипараллельную В-структуру. Определены константы димеризации аналогов в водном растворе и метаноле.

Т. Показано, что специфичность связывания этих соединений зависит от их агрегатного состояния. В мономерной форме они обладают такой же специфичностью связывания как и аналоги, не содержащие тривалина. Каждый аналог несет 3 АТ-специфичных реакционных центра. Димеры аналогов содержат, кроме АТ-специфичных центров, еще и центры, взаимодействующие с йС- парами ДНК. Предложена модель комплекса, согласно которой пептидные фрагменты в димере образуют В-слой, взаимодействующий с двумя СС-парами, в то время как каждый нетропсиновый фрагмент образует водородные связи с тремя последовательными АТ-парами ДНК.

8. Для доказательства этой модели был сконструирован бис-нетропсин, в котором два нетропсиноподобных фрагмента присоединены к пептидам С1у-Су5-С1у~, связанным друг с другом с помощью Э-5 связи. Показано, что молекула этого бис-нетропсина содержит 6 АТ-специфичных центров и 2 центра, специфичных к йС-парам ДНК. Это указывает на то, что два нетропсиноподобных фрагмента бис-нетропсина, каждый из которых несет 3-АТ специфичных центра, а также цистиновый пептидный димер связываются с ДНК специфично. Анализ профилей нуклеазного расщепления свободной ДНК с известной нуклеотидной последовательностью и комплексов ДНК с бис-нетропсином показывает, что бис-нетропсин, содержащий в центральной части цистиновый димер, связывается преимущественно с нуклеотидной последовательностью 5'-АААССГТТ-З'. Предложена модель для комплекса бис-нетропсина с ДНК.

9. Показано, что цистиновый димер

Э-Э '-Мг( Н-Ьу5-С1у-Уа1-СуБ-Уа1-Уа1-НН-ЫН-Юпз ), в котором два пептидных фрагмента соединены коваленгно с помощью Б-Э связи, образует более прочные комплексы с поли (сЮ)* поли!¿С), чем с поли! йА )• поли! с1Т ) и поли! К вС) ]*поли[ К СС ) ]. Константа связывания пептида с поли(сЮ )•поли!йС) превышает константу связывания с поли!йА)-поли!(Л) в 10 раз. Форма экспериментальных изотерм адсорбции пептида согласуется с тем, что он связывается с ДНК в форме мономера (6-слой) и димера (р-сэндвич), причем как мономер, так и димер занимают 4 пары оснований при связывании. Связывание В-сэндвичей является кооперативным процессом, в то время как связывание мономеров некооперативно.

10. Получены данные в пользу того, что все исследованные пептиды б В-ассоциироЕанной форме образуют специфические контакты в узкой бороздке ДНК, так как они конкурируют за связывающие места с антибиотиками сибиромииином и дистамииином А, связывающимися в узкой бороздке ДНК. Некоторые из них сохраняют способность специфически связываться с ДНК вместе с аналогом нетропсина, к которому они присоединены ковалентно с помощью очень коротких соединительных цепей. Заполнение узкой бороздки ДНК В~сэндвичами триЕалина, пентапелтида или тридекапептида изменяет физические своиетва макромолекулы. Молекулы ДНК приобретают способность

ассоциировать друг с другом с образованием так называемой двудуплекснои структуры. Процесс .комлактизации ЛИК. в присутствии 1 пентапептида и тридекапептида протекает в два этапа: на первом-формируются компактные палочкообразные структуры, а на втором - ¡ из палочкообразных фибрил образуются тлобулярные частицы, каждая ! из которых содержит одну молекулу ДНК.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Заседателев A.C., Гурский Г.В., Волькенштейн М.В., "Адсорбция малых молекул на гомололимере". Молекулярная биология, 1971, т.5, с.245-251.

2. Гурский Г.В., Заседателев A.C., Волькенштейн М.В. "Адсорбция малых молекул на гетерополимере". Молекулярная биология , 1972, т.6, с.479-490.

3. Гурский Г.В., Туманян В.Г., Заседателев A.C.. ЛСузе А.Л., Гроховский С.Л., Готтих Б.П. "Код, управляющий специфическим связыванием регуляторных белков с ДНК, и структура стереоспецифических участков регуляторных белков". Молекулярная биология, 1975, т.9, с.635-651.

4. Gursky G.Y., Tumanyan V.G., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L., Grokhovsky S.L., Gottikh Б.Р. "A code controlling specific binding of regulatory proteins to'DMA". Molecular Biol. Reports, 1976, v.2, p.413-425.

5. Gursky G.V., Zasedatelev A.S., Tumanyan Y.G., Zhuze A.L., Grokhovsky S.L., Gottikh Б.Р. "Complementarity and recognition code between regulatory proteins and DNA" In: Federation of European Biochemical Societies, 12-th Meeting, Gene Functions 1978, v. 51, p.23-32.

6. Гурский Г.В., Заседателев A.C., "Точные соотношения для расчета связывания регуляторных белков и других решеточных лигандов на двухтяжевых полинуклеотидах". Биофизика, 197Ö, т.5, с.932-946.

7. Нечипуренко Ю.Д., Заседателев A.C., Гурский Г.В. "Теория одномерной адсорбции на гомополимере. Учет различных ориентации молекул лиганда." Биофизика, 1979, т.24, с.351-362.

8. Livshitz М.А., Gursky G.Y. Zasedatelev А.5., Yolkenstein M.V.

"Equilibrium and kinetic aspects of protein-DNA recognition". Nucleic Acids Res., 1979, v.6, p.2217-2236.

9. Стрельцов С.А., Хорлин А.А., Суровая A.H., Гурский Г.В., Заседателев А.С., Яузе А.Л., Готтих Б.П. "Специфическое взаимодействие между олиговалином и нуклеиновыми кислотами". Биофизика, 1980, т.25, с.929-940.

10. Гурский Г.В., Заседателев А.С. "Термодинамические аспекты специфического связывания регуляторных белков и других лигандов с ДНК". Итоги науки и техники , ВИНИТИ, М. т.17, с.190-237, 1982.

11. Михайлов М.В., Заседателев А.С., Гурский Г.В. "Определение числа GC-nap, "узнаваемых" актиномицином Д при связывании с ДНК". Биофизика, 1983, т.27, с.14-16.

12. Gursky, G.V., Zasedatelev, A.S., Zhu2e, A.L.. Khorlin. A.A., Grokhovsky, S.L., Streltsov, S.A., Surovaya, A.N., Nlkltln, S.M., Krylov, A.S., Retchinsky, V.O., Mikhailov, M.V., Beabealaschvllli, R.Sh. and Gottikh, B.P. "Synthetic sequence-specific ligands". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983, v.47, p.367-378.

13. Нечипуренко Ю.Д., Заседателев А.С., Гурский Г.В. "Кооперативные эффекты при связывании протяженных лигандов на ДНК". Молекулярная биология, 1984, т.18, с.789-812

14. Gursky, G.V. and Zasedatelev, A.S., "Thermodynamics and stereochemical aspects of binding interactions between sequence-specific ligands and DNA". Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol. 1984, v.5, p.53-139.

15. Vengerov, Yu.Yu., Semenov, Т.Е., Streltsov, S.A., Makarov, V.L., Khorlin, A.A., Gursky, G.V. "Triple rings: A new type of compact structure of circular DNA". J. Mol. Biol. 1985, v.184, p.251-255.

16. Nechipurenko, Yu.D., Gursky, G.V., "Cooperative effects on binding of proteins to DNA". Biophysical Chemistry, 1986, v. 24, p.195-209.

17. Семенов Т.Е., Венгеров Ю.Ю., Суровая A.H., Сидорова Н.Ю., Стрельцов С.А., Хорлин А.А., Жузе А.Л., Готтих Б.П., Гурский Г.В. "Внутримолекулярные компактные структуры линейной ДНК, формирующиеся при взаимодействии с синтетическим тридекалелтидом". Молекулярная биология, 1986, т.20, с.1422-1431.

18. Сидорова Н.Ю., Семенов Т.Е., Суровая А.Н., Венгеров Ю.Ю., Стрельцов С.А., Хорлин А.А., Готтих Б.П., Жузе А.Л., Гурский Г.В. "Взаимодействие синтетического пентапептида с ДНК: специфичность

связывания и компактизааия ДНК". Молекулярная биология, 1987, т.21, с.1534-1550.

19. Гроховский С.Л., Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю., Вотавова X., Шпонар Я., Фрич И., Гурский Г.В. "Конструирование и синтез пептидов, способных специфически связываться с ДНК". Молекулярная биология 1935, т.22, с.1315-1334.

20. Леинсоо Т.А., Николаев В.А., Гроховский С.Л., Стрельцов С.А., Заседателев А.С., Жузе А.Л., Гурский Г.В. " Присоединение тривалина изменяет специфичность связывания аналога нетропсина с ДНК". Молекулярная биология 1988, т.22, с.159-175.

21. Vengerov, Yu.Yu., Semenov, Т.Е., Surovaya, A.N., Sidorova, N.Yu., Streltsov, S.A., Khorlln, A.A., Zhuze, A.i. and Gursky, G.Y., " Electron microscopic and physicochemical studies of DMA complexes with synthetic oligopeptides: binding specificity and DNA compact structures " J. Biomol. Struct. Dyn. 1986, v.6,

p.311-330.

22. Лейнсоо Т.А., Николаев В.А., Гроховский С.Л., Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю., Стрельцов С.А., Заседателев А.С., Жузе А.Л., Гурский Г.В. " Синтетические ДНК-связываюшие лиганды, содержащие реакционные центры, специфичные к AT- и GC-парам оснований ДНК". Молекулярная биология 1989, т.23, с.1617-1637.

23. Сидорова Н.Ю., Николаев В.А., Суровая А.Н., Жузе А.Л., Гурский Г.В. " Взаимодействие с ДНК цистин-содержашего пептида". Молекулярная биология 1991, т. 25, с.706-717.

24. Grokhovsky, S.L., Surovaya, A.N., Brussov, R.V., Chernov, В.К., Sidorova, N.Yu. and Gursky, G.V., "Design and synthesis of sequence-specific DNA-binding peptides". J. Biomol. Struct. Dyn. 1991, v.8, p.989-1025.

Благодарности

Я глубоко благодарен всем своим соавторам за участие в этих работах.

Информация о работе

Гурский, Георгий Валерианович
доктора физико-математических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие лигандов пептидной природы с ДНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология