Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтетические пептиды, способные образовывать специфические комплексы с ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтетические пептиды, способные образовывать специфические комплексы с ДНК"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

на правах рукописи

СИДОРОВА Нина Юрьевна

УДК 577.323.23

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, СПОСОБНЫЕ ОБРАЗОВЫВАТЬ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ С ДНК

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории физики биополимеров Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Г.В.Гурский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.Л.Поляновский кандидат физико-математических наук М.В.Михайлов

Ведущая организация - Институт биофизики АН СССР

на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, В-334, ул.Вавилова, л.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР.

Зашита состоится

1991 года

часов

Автореферат разослан

1991 года.

специализированного совета

кандидат химических наук

Ученый секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

На протяжении последнего десятилетия проблема специфического взаимодействия между ДНК и белками привлекала к себе внимание многих лаборатория во всем мире. Наиболее интересным результатом этих исследования является установление того факта, что узнающие участки регуляторных белков могут быть построены на основе различных структурных схем. К обнаруженному ранее узнающему мотиву "спираль-поворот-спираль" бактериальных репрессоров и активаторов транскрипции добавился ряд новых структурных мотивов, используемых различными белками для узнавания специфических нуклеотидных последовательностей. В специфические взаимодействия с ДНК могут быть вовлечены как участки белков в а-спиральной конформации, так и фрагменты деформированного В-слоя и одиночной цепи в деформированной р-конформации. Обнаружены белки, ДНК-связывающие домены которых построены исключительно на основе антипараллельной В-структуры (метиониновый репрессор E.coll, ДНК-связывасший белок II В.stearothermophilus, фактор хозяйской интеграции E.coll, репрессоры arc и trait бактериофага Р22).

Комплексы нуклеиновых кислот с пептидами, входящими в состав биспирального мотива или В-слоя, можно рассматривать в качестве моделей природных ДНК-белковых комплексов. Именно такой подход используется в настоящей работе. Ранее было показано, что сравнительно короткие пептиды, например, трипептид Val-Yal-Val-H2H2Dns, специфически связываются с ДНК. Этот трипептид связывается более прочно с поли( dG ) • поли((1С >, чем с поли(йА) • поли(с1Т) (С.А.Стрельцов и соавт., I960 ). Поиск других пептидов, способных "узнавать" специфические нуклеотидные последовательности на ДНК представляет большой интерес. Он

открывает новые возможности для конструирования и синтеза лигандов пептидной природы, способных "читать" протяженные последовательности AT и GC пар оснований в одной из бороздок ДНК.

Б настоящей работе исследовалось взаимодействие с ДНК линейных пептидов с характерным расположением остатков треонина и валина, а также цистинового пептида. В молекуле последнего два пептидных фрагмента соединены ковалентно с помошьо S-S связи. Выбор этих пептидов был связан с экспериментальной проверкой одной из моделей белково-нуклеинового узнавания, согласно которой NH и СО группы остова двух антипараллельных пептидных цепей могут служить в качестве специфических центров для взаимодействия с функциональными группами пар оснований в узкой бороздке ДНК (Г.В.Гурския и соавт., 1975). Из этой модели следует, что в специфическом комплексе пространственное расположение аминокислотных остатков с инертными боковыми радикалами (Val, Tie, Ala, Phe и др.) коррелирует с положением GC-nap ДНК, п то время как расположение Thr. Ser и некоторых других остатков коррелирует с расположением АТ-пар. Так как имеется большая группа регуляторных белке- , ДНК-связывающие домены которых "содержат две антипараллельных цепи в В-конформации, то исследованные комплексы ДНК с пептидами могут служить в качестве моделей комплексов этих белков с ДНК.

Цель работы состояла в конструировании пептидов, способных избирательно связываться с различными нуклеотидными последовательностями, изучении конформации пептидов и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.

Научная новизна а практическая ценность.

Впервые: - сконструирован и исследован двадцатичленный олигопептид, способный специфически, связываться с операторами 0 1 и 0 2 фага X. Этот пептид не имеет гомологии ни с одним из

известных регуляторных белков. Показано, что при связывании с ЛНК, пептид переходит из беспорядочной в В-подобную конформацип.

- продемонстрировано, что цистин-содержаший пептидный димер связывается с ЛНК специфическим образом. Он конкурирует за связывающие места с антибиотиками дистамицином и сибиромицином, взаимодействующими с ДНК по узкому желобу. Определены термодинамические параметры связывания пептида с ДНК.

Полученные результаты могут быть использованы как при изучении механизмов образования специфических ДНК-белковых комплексов, так и для направленного синтеза других пептидов, способных узнавать спрцифические нуклеотидные последовательности.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 12 работах.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, доложены на симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пупшно, 1985), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1985 1. на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), на Международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1967), на конференции молодых ученых (Тбилиси, 1909), на IV Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых (Рига, 1990 1, на VII Международной конференции по биомолекулярной стереолинамике (г.Олбани. Нью-Йорк, 19911.

Структура и объем рабР-ТЫл. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит

рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В настоящей работе были использованы олигопептиды, синтезированные в лаборатории химии белкового синтеза ИМБ АН СССР С.Л.Гроховским, А.А.Хорлиным, В.А.Николаевым и А.Л.Жузе. Структурные формулы этих соединений представлены на рис.1: дансилгидразид пентапептида Val-Thr-Thr-Val-Val-NH-NH-Dns (соединение I), двадцатичленный пептид Dns-Gly-Ala-Gln-Lys-Leu-Ala-Gly-Lys-Val-Gly-Thr-Lys-Yal-Lys-Val-Gly-Thr-Lys-Thr-Val-OH (соединение II) и цистин-содержаший пептидный димер S,S'-bis( H-Lys-Gly-Val-Cys-Val-NH-NH-Dns) (соединение III). Все олигопептиды содержали флуоресцентную метку дансил, представляющую собой остаток 5-диметиламинонафталин-1-сульфокислоты. Концентрацию пептидов I, II и III определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент молярной экстинкции при 330 нм ej30=4300.

ДНК тимуса теленка (5SS AT, е25д=13300) была получена от фирмы "Sigraa" США. Полинуклеотиды поли!dA ) • поли(dT) < e2= д = 12000 ), поли!d(А-Т I !• поли! d( А-Т ) 1 I е259 = 13500 ), поли[с1( G-C) I-поли! сН G-C I 1 (е2бо = 16в001 были получены от фирмы "P.L.Blochemlcals", США. Поли!d(А-С ) 1 • поли!d(G-T ) 1 (е259=13300 1 был получен от фирмы "Boehringer Manheim", ФРГ. Поли1йС! • поли(0С) (е233 = И600) получали от фирм "P.L.Blochemlcals" и "Boehringer Manheim". Все коэффициенты экстинкции даны в расчете на моль пар основания. ДНК и полинуклеотиды интенсивно диализовались против соответствующего буфера непосредственно перед экспериментом.

Основные эксперименты были выполнены в буфере А (0,001 М Na-какодилатный буфер, pH 7.0), буфере Б (0,001 М Na-какодилатння буфер. 10% !v/v) метанол, pH 7,01, и в буфере В (0,001 М

Na-какодилатный буфер, 20S ТФЗ, pH 7,0,1.

Для регистрации образования комплексов между олигопептидами и ДНК использовались флуориметрические методы. Из кривых флуориметрического титрования рассчитывали изотермы Скэтчарда lr/m(r>). Здесь г - концентрация связанного лиганда, рассчитанная на моль пар оснований ДНК, am- концентрация свободного лиганда. Используя отложение r/m(r>, рассчитывали константу связывания 1К> и размер связывающего места.

Специфичность связывания пептидов исследовалась также с помощью метода футпринтинга (все эксперименты по футпринтингу выполнены С.Л.Гроховским). Для изучения самоассоциации пентапептида, а также процесса компактизаиии ДНК, которую вызывают некоторые пептиды, использовался метод электронной микроскопии. Все электронно-микроскопические данные получены Ю.Ю.Венгеровым и Т.Е.Семеновым.

Вопрос о локализации пептидов в желобе ДНК решался с помощью конкуренции за связывающие места на ДНК с антибиотиками дистамицином А и сибиромицином, связывающимися по узкому желобу. Известно, что свободная ДНК в B-форме в области длин волн 300-400 нм не обладает собственным круговым дихроизмом (КД). Свободный дистамииин А также не обладает в этой области круговым дихроизмом. Однако, при взаимодействии этого антибиотика с ДНК в области 320 нм появляется сигнал КД, величина которого линейно зависит от количества связанного антибиотика. Это свойство позволило нам определять концентрацию связанного дистамицина в экспериментах по конкуренции за связывающие места на поли(с!А) • поли(йТ) между антибиотиком и олигопептидами.

Антибиотик сибиромицин взаимодействует с ДНК, образуя ковалентную связь с 2-аминогруппой гуанина в узкой бороздке ДНК.

б

H-Val-Thr-Thr-l/al-Val-NH-NH-Dns 11 i

(III

Drm-Gly Gin Leu Gly Val Thr Val Val Ttir Thr

Ala Lys Ala Lys Gly Lys Lys Gly Lys Val-OH

H-Lys-Gly-Val-Cys-Val-NH-NH-Dns (III)

I

Dns-NH-Nll-Val-Cys-Val-Gly-Lys-H

Рис.1. Структурные формулы исследованных соединений: пентапептид (I); двадцатичленный пептид (И): цистин-содержащий пептид (III).

Используя это свойгтво, мы применили равновеснып диализ для исследования конкуренции между антибиотиком и олигопептидами за связывавшие места на поли! АС) • поли(с1С I. Свободный сибиромицин удалялся в процессе диализа, а количество ковалентно связанного антибиотика определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции Б3]0=21бОО.

Для ответа на вопрос о конформаиии, принимаемой пептидами, применялся метод К.Д.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПЯТИЧЛЕННОГО ЛИНЕЙНОГО ПЕПТИДА

Пентапептид Уа1-ТЬг-Т1)г-Уа1-Уа1-М2Н2-Рпе состоит из остатков, имевших высокий потенциал к образованию В-структуры. Спектры поглощения, флуоресценции и КД растворов пентапептида

претерпевает сильные изменения в зависимости от концентрации. Это говорит об изменении агрегатного состояния пентапептида в исследуемой области концентраций Г 4 • 10-в - 2 •10~4 М1. При добавлении ЛНК к раствору пентапептида наблюдаются спектральные изменения в полосах поглощения дансила, говорящие об образовании комплекса пентапептида с ДНК. Очень чувствительны к образованию комплекса флуоресцентные измерения - максимум спектра флуоресценции сдвигается с 550 до 515 нм, а квантовый выход увеличивается более, чем на порядок.

Для ответа на вопрос о конформации, принимаемой пептидом в свободном состоянии и в комплексе с ДНК, был использован метод КД. Спектры КД свободного пентапептида имеют отрицательную полосу при 197 нм. Это свидетельствует о том, что значительная часть молекул пептида в растворе имеет хаотическую конформацип. В присутствии ДНК спектр КД существенно меняется: появляется положительная полоса при 192 нм и две отрицательные полосы при 255 и 215 нм. ДНК вносит незначительный вклад в амплитуду КД в области спектра 210-230 нм, а форма спектра КД пентапептида в комплексе с ДНК характерна для антипараллельного р-слоя.

Все вышеизложенное в значительной мере относится и к двум другим исследованным пептидам. Интересной особенностью пентапептида оказалась его высокая склонность к самоассоциации. Измерения поляризации флуоресценции показали, что при концентрации пептида в растворе 3 •10"4 М и выше, степень поляризации флуоресценции достигает 26-30Ж, то есть практически максимального возможного значения. Это свидетельствует об образовании агрегатов большого размера, что подтверждается также данными, полученными с помощью электронной микроскопии. На электронных микрофотографиях отчетливо видно образование агрегатов пептида в отсутствие ДНК. В присутствии ДНК при высоких

заполнениях ДНК пептидом наблюдается образование так называемой двудуплексной структуры, обнаруженной ранее при связывании тривалина на ДНК (В.Л.Макаров, С.А.Стрельцов и соавт., 1983). Пентапептид при связывании также вызывает слипание двух дуплексов ДНК. Полученные результаты говорят о том, что процесс компактиэации ДНК начинается с образования палочкообразных структур, которые постепенно складываются с образованием глобулы.

Для ответа на вопрос о специфичности связывания пентапептида мы использовали метод флуориметрического титрования. На рис.2(а) показаны кривые флуориметрического титрования раствора пентапептида синтетическими полинуклеотидами. Видно, что пептид I предпочтительно связывается с поли!(Ю)• поли!ЙС) полимером. Кроме того, как это показано на рис. 2(6), комплексы пентапептида с различными полинуклеотидами обладаю;- разной устойчивостью по отношению к ионной силе. Наиболее стабилен комплекс с поли 1ЙС ) •поли IЙС).

Для ответа на Еопрос о том, в каком желобе ДНК располагаются связанные молекулы пентапептида, мы провели эксперименты по конкуренции за связывающие места на поли!йАI • поли(ЙТI между йентапептидом и антибиотиком дистамицином А. На рис.3 показана кривая титрования дистамицином комплекса пентапептида с полимером. Видно, что по мере увеличения концентрации добавленного антибиотика, комплекс между пентапептидом и ДНК постепенно разрушается, что проявляется в уменьшении интенсивности Флуоресценции дансильного хромофора. Эти результаты объясняются наиболее просто, если предположить, что пентапептид, так же как и дистамицин А, связывается в узком желоби ДНК.

'520

______в606б

10

/

/1

л

и-'--

у

Ю

[р/г] !0 м

сссс

/5

10

— деле

о ТОТ&

'5га

^ \

, АААА \ СССС

ТТТГ х- \ АСАС --*

Л„/Т1>Т6 АААА

Ч4-^ /ГТТТ

г

_I_

15

0,1 0.2 [N0* ], М

15

а

\

о

3

Рис.2 а - титрование раствора пентапептияа (5-10 М) синтетическими полинуклеотидами: I - поли(йО • поли(йС): 2 -поли(сИА-С) ] • поли(сНС-Т) 1; 3 - поли( (1А ) • поли!ат ). 1Р/2) -концентрация нуклеиновой кислоты, б - устойчивость комплексов пентапептида с синтетическими полинуклеотидами в зависимости от концентрации ионов Иа* в растворе. 2С/Р=0,3б; Р/2=1,37• 10~4 М (пар основания); С - концентрация пентапептида. Флуоресценция возбуждалась светом с длиной волны 360 нм и регистрировалась при 520 нм (щели для возбуждения и эмиссии 4 нм). Условия: буфер Б, Т=20° С.

Рис.3. Вытеснение пентапептида из комплекса при его титровании дистамицином А. I -интенсивность флуоресценции комплекса в отсутствие дистамицина А, I - в присутствии дистамицина А. (2С/Р=0 ,64, Р/2=1,25*104 М). г - отношение молярной концентрации связанного

дистамицина А к концентрации ДНК. Условия см. на рис.2.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ДВАДЦАТИЧЛЕННОГО ЛИНЕЙНОГО ПЕПТИДА

Химическая формула этого олигопептида (соединение II) представлена на рис.1. Расположение остатков валина и треонина в этом пептиде коррелирует с последовательностью AT и GC пар в операторе 0R1 фага X, с которым избирательно связывается CI репрессор фага К. Схема соответствия аминокислотной и нуклеотидноя последовательности представлена на рис.4.

С помощью флуориметрического титрования пептидом различных синтетических полинуклеотидов были подобраны условия, оптимальные для проявления специфического связывания, после чего с помощью метода футпринтинга определяли специфичность пептида к операторным участкам фага Л. Использовали рестриктазный фрагмент, содержащий операторы 0 1 , 0 2 и модифицированный операторный

Фо

1 fr О, В

о,ь о,ч 0,2

\

ч

0,2

0,4

г

Dns Gly

Val Lys Gly Lys Lys Gly Lys Ala Lys Ala W 4/ \ / \ / \ / \/ \ / w \ / Thr Thr Val Val Tlir Val Gly Leu Gin

i

5'T A С С T С Т G G С 3'ATGGAGACCG

Рис.4. Схематическое представление соответствия аминокислотной последовательности пептида II и фрагмента операторного участка 0 1 фага X. Аминокислотные остатки пептида, кодирующие AT- и С,С-пары, подчеркнуты непрерывными и пунктирными линиями соответственно. Вертикальная стрелка указывает положение оси симметрии второго порядка в операторе 0 1.

участок 0к3 фага Были получены футпринты комплексов пептида с рестриктаэным фрагментом с ДНКаэоя I и кислой ДНКазоп из печени минтая. Нуклеотидная последовательность фрагмента приведена на рис.5. Квадратными скобками выделены операторные участки, а стрелками указаны те нуклеотиды, которые защищаются пептидом от действия нуклеазы. Видно, что практически все защищаемые нуклеотиды находятся либо внутри , либо в непосредственной близости от операторов 0К1 и Ок2. Весьма интересным представляется тот факт, что пептид не проявляет заметного сродства к модифицированному оператору 0Л3, в котором заменены четыре пары оснований. Таким образом, пептид II, не обладающий гомологией с аминокислотной последовательностью в двуспиральном мотиве с! репрессора фага связйвается специфическим образом с

окз

г

1 10 | 20 30

I I I I I С С С Г Т Т С С Т С Т Т С А А|С А А Г Г С С С С Д А С С С А Т А А

I__

V

{

А Т А Т

I Т\ Т\ I I

СТА АСАСССТСССЮТТС

I И

А С Т А Т Г

С Т Т С

90 1

С А Т С Т А

С Т

100 110 120 I I I

А АС(; АССТ Т СТ А ТСС А АС А А С СС А Т А АСС ТТС СС

Рис.5. Нуклеотилная последовательность фрагмента ДНК, содержащего операторы 0к1 , Ок2 и часть оператора Ок-3 бактериофага Стрелками указаны основания, защищаемые пептидом от действия ДНКазы I.

операторами и 0к2, с которыми избирательно взаимодействует С1 репрессор.

Для ответа на вопрос о локализации пептида при связывании, проводили эксперименты по вытеснение пептида II из комплекса с поли!йС1 • поли(йС ) антибиотиком сибиромицином. Мы определили, сколько должно связаться сибиромицина, чтобы взаимодействие пептида с поли!йС )• поли!6С ) стало невозможным. Оказалось, что для этого 1 молекула связанного сибиромицина должна приходиться на 5-6 пар оснований ДНК.

Комплексы пептида с ДНК и различными синтетическими полинуклеотидами были изучены с помощью КД спектроскопии. На рис.6 представлены спектры КД, характеризующие комплексы пептида II с различными синтетическими полинуклеотидами. Видно, что спектры полинуклеотидов полило» nonuldCl. поли(йА) • поли((1Т1 и полиId(А-С)]• полиfdf G-T)), снятые в отсутствие пептида, сильно отличаются друг от друга. Сильно отличаются также спектры комплексов пептида с различными полинуклеотидами. Однако, разностные спектры комплексов, полученные в результате вычитания из спектра комплекса спектра свободного полинуклеотида, оказались весьма схожими и подобными спектру, характерному для деформированной антипараллельной ß-структуры.

Таким образом, полученные нами результаты говорят о том, что синтетический двадцатичленныя пептид избирательно связывается на операторах 0R1 и 0R2 или в непосредственной близости от них и не взаимодействует с модифицированным оператором 0R3. Взаимодействие, вероятно, происходит по узкому желобу ДНК и сопровождается (по данным КД спектроскопии) переходом пептида из беспорядочной в 0-подобную конформацию.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ЦИСТИН-СОЛЕРЖАЩЕГО ПЕПТИДНОГО ДИМЕРА III.

Ранее при исследовании взаимодействия ряда линейных пептидов с ДНК мы обнаружили, что димеры пептидов связываются с ДНК специфически, в то время как мономеры такой способностью не обладают (впервые это было показано С.А.Стрельцовым для связывания дансилгидраэида тривалина). Поэтому представилось интересным изучить взаимодействие с ДНК пептида, исходно по своей структуре являющегося димером. Структурная формула такого пептида

Рис.6. Изменения, наблюдаемые в спектрах КД, при взаимодействии пептида II с полинуклеотидами. а - спектр комплекса поли'• поли((1С I с пептидом (1) и спектр свободного поли(с)С >• полисе ) (2). Ь - разностный спектр, полученный вычитанием

из спектра комплекса поли(<Ю1 • поли(йС) с пептидом II спектра свободного поли((Ю> • поли(йС) 11) и спектр свободного пептида в растворе (2). с - спектр комплекса поли< аА )•поли IйТ) с пептидом II (1) и спектр свободного поли(с1А) • поли! (1Т) 12). б - разностный спектр, полученный вычитанием из спектра комплекса пептида II с поли(йА)'Поли(<1Т1 спектра свободного поли((5А )-поли1с1Т1 (1) и спектр свободного пептида II в растворе 12). е - спектр комплекса поли1с1(А-С) 1 • поли((1(С-Т) 1 с пептидом II) и спектр свободного поли Г б (А-С ) I* поли1сИС-Т1 1 12). Г - разностный спектр, полученный вычитанием из спектра комплексп поли!с1(А-С> ) • поли(сНС-Т)1 с пептидом II спектра свободного поли((11А-С) 1 •поли[с1(С~Т)) (1) и спектр свободного пептида в растворе 12). Де - молярный дихроизм, рассчитанный на 1 моль пар оснований. 18 1 - эллиптичность, выраженная в град • с>Р/децимоль аминокислотных остатков. Концентрация пептида равна 2,25 • 10"' М: концентрация полинуклеотидов Р/2=б,7-Ю~3 М. Условия: буфер В, Т=20° С.

представлена на рис.1 (соединение III).

На рис.7 представлены кривые флуориметрического титрования цистиновым пептидом растворов различных синтетических полинуклеотидов. Концентрация полинуклеотидов в этих экспериментах была одинаковой (Р/2=8-10~б М • (пар оснований)). Отчетливо видны различия в связывании пептида с различными полинуклеотидами, особенно ярко проявлявшиеся в области низких концентраций добавленного пептида. Важно отметить, что эти кривые получены в присутствии 0,1 М ЫаС1.

Помимо различий в кривых флуориметрического титрования для цмстинового пептида характерна также совершенно разная устойчивость комплексов с различными полинуклеотидами по

Рис.7. Флуориметрическое титрование различных полинуклеотидов пептидом III: поли(сШ )• поли(с1С ) I О >, поли! dA ) • поли! dl) ( V ), поли Г [1 (G-C ) I" поли! d (G-С > 1 (о ). Пептид в растворе !о>. Концентрация полинуклеотидов в молях пар основания (Г/2) была одинакова и равна б•10~ß М. Условия: буфер А в присутствии 0.1 М NaCl, Т=20° С. Щели для возбуждения и эмиссии равны 10 и 20 нм соответственно.

отношению к ионной силе. Комплекс пептида с поли(dG)•поли!dC) полимером устойчив вплоть до концентрации соли 0,4 М NaCl, в то время как комплекс с поли1йА)-поли(с1Т) разрушается в присутствии 0,2 М NaCl.

Используя кривые Флуориметрического титрования, мы построили изотермы адсорбции пептида III на поли< dC I • поли(йС) и поли! dA) • полиМТ) в отложении Скэтчарда. Из кривой флуориметрического титрования пептидом поли!бС • по ли (dC I мы рассчитали начальный линейный участок изотермы адсорбции цистинового пептида на поли(сЮ) • по ли (dC). Размер связывавшего места, L, можно оценить из размера отрезка парр отсекаемого на горизонтальной^ оси начальным линейным участком изотермы, по формуле n =2L-1 (Заседателев и соавт., 1971). Оказалось, что

а рр

L=4-l . Теоретическая модель, наиболее хорошо описывающая экспериментальные иэотермн, может быть кратко представлена следующим образом: пептид взаимодействует с ДНК в виде мономера (ß-слой) и димера (ß-сэндвич), каждый из которых "накрывает" при связывании 4 пары оснований. Мономеры связываются некооперативно, в то время как связывание димеров представляет собой кооперативный процесс, за который ответственны взаимодействия между 0-сэндвичами, адсорбированными на ближайших соседних связывавших местах. Термодинамические параметры определяли путем минимизации среднеквадратичного отклонения экспериментальных точек от теоретических кривых. На рис.8 представлены теоретические изотермы, наиболее хорошо описывающие экспериментальные данные. Константы связывания цистинового пептида на изолированном связывающем месте оказались равны: 17600 М"1 и 1800 М1 для связывания с поли! dG) • поли! dC) и поли(йА) • поли(йТ) соответственно. Таким образом, константа связывания цистиноеого пептида с nonHldGi«поли!dC) превосходит

константу связывания с поли(йА) • поли(dT) примерно в 10 раз. Параметр кооперативное™ а равен 6 для связывания на поли(с!С> • поли((1С>. Для связывания на ::оли( dA ) • поли( dT ) а'ЮО. Предполагается, что сэндвичи практически отсутствует в свободном растворе (это подтверждается отсутствием перегибов на кривой, представлявшей зависимость флуоресценции свободного пептида в растворе от концентрации добавленного пептида (рис.7)) и образуются при связывании пептида на ДНК. Константа образования сэндвичей из двух мономеров оценена равной 200 независимо от того, связывается ли пептид с поли(йО-поли(ас ) или поли! dA I-поли(dTI.

Вопрос о расположении пептида в желобе ДНК решался с помощью экспериментов по конкуренции за связывающие места с двумя лигандами, взаимодействующими с ДНК по узкому желобу антибиотиками дистамицином А и сибиромицином. На рис.9 показаны кривые флуориметрического титрования пептидом свободного поли(йСЬполи(йС1 и полк(dG )• поли( dC > в комплексе с сибиромицином. Видно, что по мере увеличения концентрации связанного сибиромицина, количество связанного цистинового пептида уменьшается. Если 1 молекула связанного антибиотика приходится на 2-3 пары оснований ДНК. то связывание пептида с полимерам практически отсутствует. Аналогичные результаты получены при титровании антибиотиком дистамицином А комплексов цистинового пептида с поли(dA)• поли!dT ). Из сравнения кривых титрования дистамицином поли( dA )• поли! til) в отсутствие и в присутствии пептида видно, что пептид занимает часть потенциальных связывающих мест для дистамицина на поли(йАЬполи!ат). Эти результаты объясняются наиболее просто, если предположить, что иистиновый пептид, как и антибиотики дистамицин А и сибиромицин, связывается в узкой бороздке ДНК.

г /т *1 О

г /т *10

О 0.25 0.50 0 г

0.25 0.50 г

Рис.0. Сравнение экспериментальных и теоретических изотерм, рассчитанных для связывания цистннового пептида на поли((1С)-поли((1С I и поли( йЛ ) • поли! аТ). г - количество связанного пептида в расчете на моль пар основания, та - концентрация свободного пептида. Теоретические кривые показаны сплошными линиями. Указаны значения константы связывания (К), константы образования б-сэндвичея (ш) и параметра кооперативности (а) и размера связывавшего места (Ы, при которых наблюдается наилучшее соответствие между экспериментальными и теоретическими кривыми. Экспериментальные данные получены при следующих условиях: буфер Л в присутствии 0,1 М ЫаС1, Т=20°С.

Рис.9. Конкуренция пептида III с сибиромииином за места связывания на лоли(йО • поли(с!С1. Флуориметрическое титрование пептидом свободного полимера, а также комплексов поли! dG) • поли( <ЗС) с сибиромицином при различных заполнениях полимера сибиромицином: 1 полимер в отсутствие сибиромицина, 2 - комплекс поли!сЮ) • поли! dC) с сибиромицином, содержащий в среднем 1 молекулу антибиотика на 6-7 пар оснований, 3 -комплекс, содержащий 1 молекулу сибиромицина на 2-3 пары оснований полимера. 4 -свободный пептид в буфере. Концен трация полимера Р/2=б,55* Ю-6 М (пар оснований). Условия: буфер А в присутствии 0,1 М NaCl, Т=20°С.

21 ВЫВОДЫ

1. Показано, что в водных растворах синтетический пентапептид Уа1-ТЬг-Т11г-Уа1-7а1-МН-НН-Пп5 образует ассоциаты, которые находятся в концеитрапионно-зависимом равновесии друг с другом и мономерами.

2. Показано, что пентапептид в В-ассоииированнои форме образует специфические комплексы с ДНК, связываясь более прочно с поли(ЙО • поли!(1С), чем с поли!йА1 • поли(<1Т). Пентапептид конкурирует за связывающие места на ДНК с антибиотиком дистамииином А, который образует специфические связи с основаниями в узкой бороздке ДНК.

3. При высоких уровнях связывания пентапептид способен вызывать комлактизацию ДНК. Согласно данным электронной микроскопии, процесс компактизации происходит в ' два этапа: на первом формируются компактные палочкообразные структуры, а на втором -из палочкообразных фибрилл образуются глобулярные частицы, каждая из которых содержит одну молекулу ДНК.

4. Сконструирован и исследован двадцатичленный линейный пептид, в котором расположение остатков треонмиа и валина коррелирует с расположением АТ и СС пар в левой половине оператора 0К1 , узнаваемого с! репрессором фага Показано, что этот пептид связывается специфически с ДНК и занимает от нуклеазного расщепления операторы 0К1 и 0К2, а также участки ДНК, непосредственно примыкавшие к этим операторам. Он не проявляет заметного сродства к модифицированному оператору , в котором 4 пары основания заменены другими парами.

5. Показано. что разностные спектры КД комплексов двадцатичленного пептида с различными полинуклеотидами, рассчитанные путем вычитания «э спектра комплекса спектра

соответствующего полинуклеотида, имеют сходную форму, несмотря на значительные различия в спектрах КД свободных полинуклеотидов. Форма разностных спектров характерна для спектра КД пептида в деформированной ß-конформации.

6. Для доказательства предположения о том, что именно димерная форма пептида вовлечена в специфические взаимодействия с ДНК, было изучено связывание с ДНК цистин-содержащего пептида S,S'-bis< H-Lys-Gly-Val-Cys-Val-NH-NH-Dns>, в котором два пептидных фрагмента были соединены ковалентно с помошью S-S связи. Показано, что этот пептид образует более прочные комплексы с поли(йО • поли!dC), чем с поли(бА) • поли 1 dT) и nonnldiG-Ci bnoflHttl(G-C) f. Построены изотермы адсорбции пептида и продемонстрировано, что в присутствии 0,1 М NaCl константа связывания пептида с поли1йО • поли(йСI превышает константу связывания с поли!dA )• поли!dT) примерно в 10 раз. Цистиновый пептид конкурирует за связывающие места на ДНК с двумя лигандами, связывавшимися в узком желобе ДНК - антибиотиками сибиромицином и дистамицином А , и, вероятно, также связывается по узкому желобу.

Основные результаты диссертации изложены в публикациях:

1. Сидорова Н.Ю., Семенов Т.Е., Суровая А.Н., Бенгеров Ю.Ю., Стрельцов С.А., Хорлин A.A., Готтих Б.П., Жуэе А.Л., Гурский Г.В. /Взаимодействие синтетического пентапептида с ДНК: специфичность связывания и компактиэация ДНК / Молекуляр, биол., 1987, Т.21, 6, С.1531-1550.

2. Гроховский С.Д., Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю., Вотавова X. , Шпонар Я., Фрич И., Гурский Г.В. /Конструирование и синтез ептидов, способных специфически связываться с ДНК /Молекул, биол., 1980, Т.22, 5, С.1315-1334Г

3.-Vengerov Yu.Yu., Semenov Т.Е., Surovaya A.N., Sldorova N.Yu., Streltsov S.A., Khorlln A.A., Zhuze A.L., Gursky G.V. /Electron microscopic and physico-chemical studies of DNA complexes with synthetic oligopeptides: binding specificity and DMA compact structures/ J. Blomol. Struct, and Dynam., 1988, V.6, 2, P.311-330.

4. Лейнсоо Т.А., Николаев В.А., Гроховский С.Л., Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю. , Стрельцов С.А., Заседателев А.С., Жуэе А.Л., Гурский Г.В. / Синтетические ДНК-связываюнше лиганды, содержащие реакционные центры, специфичные к AT- и GC-парам оснований ЛНК/ Молекул, биол.. 1969, Т.23, 6, С.1616-1637.

5. Сидорова Н.Ю., Николаев В.А., Суровая А.Н., Жуэе А.Л., Гурский Г.В. /Взаимодействие с ДНК цистин-содержатего пептидного димера/ Молекул, биол., 1991, Т.25, 3, С.706-71Т.

6. Gursky G.V., Lelnsoo Т.А. , Hlkolaev V.A.. Sldorova N.Yu., Grokhovsky S.L.. Surovaya A.N., Geldertkh A.v., Streltsov S.A.. Zasedatelev A.S., Zhuze A.L. /Sequence-specific DNA binding molecules containing AT- and GC-speclflc reaction centers/ Physlco-chemlstry of DNA and molecular mechanisms of genome functioning: Abstr. of International Symp., Tbilisi, 198", P.44-4?.

7. Жуэе А.Л., Николаев. В.A., Лейнсоо Т.А.. Сидорова Н.Ю., Гейдрих А.В., Гроховский С.Л., Суровая А.Н.. Стрельцов С.А., Заседателей А.С., Гурский Г.В. /ДНК-специфичные лиганды, обладавшие AT- и GC-специфичными реакционными центрами/ Тез. VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов. Таллин, 1907, С.177-176.

8. Гурский Г.В., Суровая А.Н., Николаев В.А., Сидорова Н.Ю., Лейнсоо Т.А., Жузе А.Л., Гроховский С.Л., Заседателев А. С., Готтих Б.П. /Синтетические олигопептиды, способные узнавать специфические нуклеотидные последовательности на ДНК/ Тез.

докладов симпозиума с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках". Пушино, 1965, С.126.

9. Гурский Г.В., Суровая А.Н., Стрельцов С.А., Хорлин A.A., Николаев В.А., Жузе А.Л., Гроховский С.Л., Лейнсоо Т.А., Сидорова Н.Ю., Венгеров Ю.Ю., Семенов Т.Е., Макаров В.Л., Заседателев A.C., Готтмх Б.Л. /Комплексы ДНК с олигопептидами, способными узнавать специфические нуклеотиднне последовательности на ДНК/ Тез. симпозиальных докладов V Всесоюзного биохимического съезда, М., Наука. 1985, Т.1, С.135.

10. Сидорова Н.Ю.. Суровая А.Н., Николаев В.А., Жузе А. Л., Гурский Г. В. /Взаимодействие с ДНК цистин-содержащего пептидного димера/ Тез. IV Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии". Рига, 1990. С.52.

И. Николаев В.А., Лейнсоо Т.А., Гроховскип С.Л., Суровая А.Н., Сидорова Н.Ю., Стрельцов С.А., Заседателев A.C., Жузе А.Л., Гурский Г.В. /Синтетические ДНК-сЕ;яэываюп'ле лиганды, содержащие реакционные центры, специфичные к AT и GC парам оснований ДНК/ Тез. IV Всесоюзной школы-семинара молодых ученых , Рига, 19Р0. С.53.

12. Sldorova N.Yu., Hlkolaev V.A., Surovaya A.N., Zhuze A.I... Gursky G.V. /Sequence specific DMA binding by a short cystine peptide/ Seventh conversation In blomolectilar stereodynamlcs, 1991, J.Blomolecul. Struct, and Dynam., V.8, 6, P.al99.

В печать 7.08.91 г. Формат 60x84/16 Печ. л. 1,0 Уч.-вдд. 1,0 Изд.Ш п

Заказ * отпечатано в ПОРЫ ка^у ластах. в экземплярах