Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии генов эритроидных клеток в процессе дифференцировки и при воздействии факторов стресса

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии генов эритроидных клеток в процессе дифференцировки и при воздействии факторов стресса"

?ТБ ОН

\ 6 Российская Академия наук

Институт общей генетики

На правах рукописи УДК 557.214.3:575:57.043

Мавлетова Дилара Анваровна

Изучение экспрессии генов эритроидных клеток в процессе дифференцировки и при воздействии факторов стресса

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов репарации Института общей генетики им. Н. И.Вавилова РАН. Научный руководитель -д. б. н. Г. А. Дворкин

Официальные оппоненты: д. б. н. В. А. Тарасов, д. б. н. Н. И. Дризе. ^ Ведущее учереждение - Институт канцерогенеза ОНЦ РМАН.

Защита диссертации состоится _"_.1995 г.

в_час._ мин. на заседании специализированного ученого совета

при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: Москва, В-333, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН. Автореферат разослан ____1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, к. б.н. /Г. Н. Полухина/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем молекулярной генетики является, как известно, регуляция активности генов в эукарио-тических клетках. Знание механизмов этой регуляции необходимо для понимания процессов дифференцировки, злокачественного роста и других центральных вопросов генетики и молекулярной биологии.

Значительные успехи были достигнуты в изучении регуляции активности глобиновых генов в эритроидных клетках. Было детально изучено тонкое строение этих генов, их регуляторные элементы, взаимодействие этих элементов с регуляторными факторами и др. Эти исследования имеют не только общее значение для понимания организации генов, они важны и с практической точки зрения. Ряд тяжелых заболеваний, таких, например, как талассемия, эригроидные лейкозы, являются следствием нарушения регуляции экспрессии генов. Однако, ряд важных вопросов изучены недостаточно. Среди них - роль в регуляции экспрессии генов негистоновых белков хроматина.

Важным подходом к исследованию экспрессии генов в эритроидных клетках являются модельные эксперименты на культуре этих клеток. Культуры эритроидных клеток, трансформированные вирусами, как индуцибель-ные, так и неиндуцибельные по синтезу гемоглобина, стали распространенными и удобными объектами для изучения клеточной дифференцировки и экспрессии глобиновых генов.

В нашей лаборатории в течение ряда лет проводятся исследования экспрессии глобиновых генов в культуре эритробластов, трансформирован--мх вирусом Раушера. Было установлено, что в этих клетках не синтези-эуется гемоглобин, и блок синтеза осуществляется на уровне транскрипции глобиновых генов.

Цели и задачи исследования. В настоящей работе проведено дапьней-нее более детальное изучение механизма блокирования экспрессии глоби-

новых генов. Нами было исследовано содержание последовательностей гло-биновой мРНК в транскриптах, синтезированных in vitro на хроматине, выделенном из трансформированных и нормальных эритробластов и ретику-лоцитов. В проявлении активности глобиновых генов важную роль играет структура хроматина. Поэтому мы исследовали роль отдельных компонентов хроматина в экспрессии глобиновых генов и, в особенности, роль негис-тоновых белков хроматина.

Основным подходом к решению этой задачи служило проведение диссоциации хроматина и его самосборки из отдельных компонентов (реконструкция хроматина in vitro) и использование реконструированного хроматина в качестве матрицы для синтеза РНК.

В исследуемой культуре эритробластов, как отмечалось, не синтезируется гемоглобин. При этом блок синтеза не снимается распространенными индукторами дифференцировки.- диметилсульфоксидом, актиномицином Д, протеазами, эритропоэтином. В нашей работе мы предприняли попытку активизировать синтез гемоглобина в этих клетках путем воздействия таки> факторов стресса как антибиотик циклогексимид и тепловой шок, поскольку известно, что они активируют экспрессию ряда генов.

Научная новизна и практическая значимость работы.Исследован механизм ранее обнаруженного нарушения экспрессии глобиновых генов в эритроидных клетках мыши, трансформированных вирусом Раушера. Выявлено существенное различие содержания последовательностей глобиновой мРНК i транскриптах, полученных in vitro на хроматине нормальных и трансформированных эритроидных клеток. Исследовано влияние негистоновых белка хроматина (НРБ) на транскрипцию глобиновых генов в нормальных и транс ■ формированных вирусом Раушера эритроидных клетках. Выявлена фракци. НГБ оказывающая максимальный стимулирующий эффект на транскрипцию гло биновых генов. Получены данные, указывающие на то, что в трансформиро ванных вирусом эритроидных клетках нарушается не только транскрипция но и процессинг глобиновой мРНК. Установлено, далее, что при воздейс твии таких факторов клеточного стресса как тепловой шок и циклогекси

мид происходит изменение экспрессии глобиновых генов в сторону ее нормализации. Это выражается в появлении глобиновых последовательностей в мРНК, и в синтезе белков по молекулярной массе, соответствующих глобинам.

Полученные результаты могут быть использованы в изучении роли не-гистоновых белков в регуляции экспрессии генов в клетках животных, а также в выяснении механизма нарушений функций эритроидных клеток при лейкозах.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были доложены на межлабораторном научном семинаре Института, который состоялся 15.06.94.

Публикации. Основные результаты исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в 7 публикациях.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации, состоящий из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, представлен на 116 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 11 рисунков. Библиографический указатель включает 120 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе использовали клональную суспензионную культуру (клон-2) эритроидных клеток, трансформированных вирусом Раушера. В результате пассирования произошла трансформация свойств инфицированных вирусом клеток, при которой дифференцирующиеся клетки превратились в эритропоэтиннезависимые клетки, способные к неограниченному метастазирующему росту in vitro и клеточной трансплантации (Розинова, Ирлин, 1977). Условия культивирования клеток описаны ранее (Ирлин и др., 1977). Соотношение живых и мертвых клеток определяли под микроскопом, окрашивая клетки трипановым синим. Количество живых клеток в культуре составляло 50-70%. Нормальные эритробласты выделяли из селезенки мышей с усиленной при заражении вирусом Раушера пролиферацией клеток (начальная стадия заражения вирусом). Более 50% клеток селезенки были бензидинположительными. Ретикулоциты мыши получали из крови анемизированных мышей, как описано в работе Переслени и соавт. (1982).

Условия проведения экспериментов. Хроматин трансформированных эритробластов, нормальных эритробластов и ретикулоцитов мыши получали в соответствии с методикой, описанной в работе Gllmour и соавт. (1975), с небольшими модификациями.

РНК синтезировали in vitro при высоких концентрациях рибонуклео-зидтрифосфатов в условиях длительной инкубации с РНК-полимеразой Е. coll. (Gllmour et al., 1975). Глобиновую кДНК синтезировали на матрице глобиновой мРНК мыши в условиях, описанных в работе Рыскова и соавт. (1981). Размер кДНК определяли с помощью электрофореза в 1,4%-ной ще-.лочной агарозе. Маркерами служили фрагменты ДНК рВР322, полученные с помощью рестрикгаз HindIII и Alu I. Гибридизацию РНК с глобиновой кДНК проводили, как описано в работе Переслени и соавт. (1982). Фракционирование хроматина на гидроксиапатите проводили по методу Rickwood, MacGillivray (1975). Реконструкцию хроматина проводили, как описано в работе Переслени и соавт. (1985). Электрофоретическое разделение бел-

ков культуры трансформированных эритробластов и ретикулоцитов мыши проводили по методу Laemmli (1970) и по методу O'Farrell (1975). Клетки подвергали тепловому шоку в различных температурных режимах. После теплового шока клетки выдерживали при 37°С в течение 30 мин и выделяли из них РНК. Для обработки клеток цикогексимидом (ЦГИ) его вносили в концентрации 6-10 мкг/мл в течение 5-6 часов, далее клетки помещали в свежую среду, в которую в ряде случаев добавляли актиномицин Д (5 мкг/мл на 1 час при 37°С). В работе использовали плазмиды pCRl и pCRlpMGg, несущую вставку р-глобинового гена мыши. Суммарную и цитоп-лазматическую РНК выделяли с помощью методов описанных в работе Fava-loro и соавт. (1980), . после чего выделяли поли(А) + -РНК на -oligo (dT)-целлюлозе (Ausubel et al., 1988) и полиШЬсефарозе (Переслени и соавт., 1982). Для проведения Нозерн-гибридизации полиШ*-РНК разделяли методом электрофореза в гелях, содержащих формальдегид (Gold-berg6 1980), и осуществляли ее перенос на нитроцеллюлозные фильтры (Smith, Summers, 1980). Нозерн-гибридизацию проводили по методу, описанному Ausubel и соавт. (1988). .. Белки из трансформированных эритробластов выделяли по методу Rutfter-furd, Weatherall (1979), после чего фракционировали на СМ-целлголозе (Clegs et al.. 1966).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Транскрипция глобиновых генов на нативном и реконструированном хроматине эритроидных клеток. Нами было показано, что в трансформированных эритробластах обнаруживается- низкое содержание последовательностей глобиновой мРНК и высказано предположение о том. что основной механизм блокирования синтеза гемоглобина состоит в нарушении транскрипции глобиновых генов и/или процессинга глобиновой мРНК. Для более очного определения уровня на котором происходит нарушение экспрессии■

глобиновых генов нами было исследовано содержание последовательностей глобиновой мРНК в транскриптах, синтезированных с помощью РНК-полиме-разы E.coll на хроматине, выделенном из трансформированных вирусом Ра-ушера эритробластов, нормальных эритробластов и ретикулоцитов мыши (рис.1). Зондом служила кДНК, синтезированная с помощью обратной транскриптазы на глобиновой мРНК мыши. При определении содержания глобиновых последовательностей в составе РНК названных объектов процент гибридизации глобиновой 3Н-кДНК с РНК-продуктом транскрипции хроматина составлял для культуры эритробластов 18%; для РНК нормальных эритробластов и ретикулоцитов обнаруживался значительно более высокий процент гибридизации, соответственно 45% и 9056. Можно заключить поэтому, что нарушение экспрессии глобиновых генов в эритробластах, трансформированных вирусом Раушера, связано с транскрипцией глобиновых генов.

В проявлении активности глобиновых генов важную роль играет структура хроматина, поэтому представлялось важным исследовать роль отдельных компонентов хроматина в экспрессии глобиновых генов. Основным подходом к решению этой задачи служило проведение диссоциации хроматина и его самосборки из отдельных компонентов (реконструкции) In vitro и использование реконструированного хроматина в качестве матрицы для синтеза РНК. При этом хроматин реконструировали как из исходных компонентов ("гомологичная" реконструкция), так и из компонентов хроматина, выделенных из разных, трансформированных и нетрансформирован-ныЯ,. клеток ("гетерологичная" реконструкция). В экспериментах с реконструированным хроматином мы исследовали роль белков хроматина трансформированных клеток в нарушении экспрессии глобиновых генов.

Реконструированный с использованием суммарных негистоновых белков хроматин служил матрицей для синтеза РНК с помощью РНК-полимеразы Е.coll. Для тестирования глобиновых последовательностей очищенную синтезированную РНК гибридизовали с зондом - глобиновой кДНК. В составе РНК. синтезированной на хроматине, реконструированном из ДНК трансформированных эритробластов и суммарных белков хроматина ретикулоцитов, а

I

СО

х

о.

\а ж с-

RMA,

вооо

Рис. 1. Гибридизация. РНК, синтезированной с помощыз РНК-по-лимеразы Е.col1 на хроматине эритробластсв, трансформированных вирусом Раушера (1), нормальных эритробластов селезенки (2), регику-лоцитов (3) с глобиновой кДНК.

особенно - из ДНК и гистонов трансформированных эритробластов и негис-тоновых белков ретикулоцитов, возрастает количество последовательностей глобиновой мРНК. В этих случаях проценты гибридизации достигают соответственно 66% и 8456 по сравнению с 37% для транскрипта с нативного хроматина культуры эритробластов. Эти данные указывают на роль не-гистоновых белков хроматина в регуляции транскрипции глобиновых генов. Суммарные белки и, в особенности, негистоноые белки ретикулоцитов способствуют усилению транскрипции глобиновых генов в трансформированных эрктробластах.

Далее мы выделяли отдельные фракции негистоновых белков ретикуо-цитов и трансформированных эритробластов с целью исследовать влияние этих фракций на экспрессию глобиновых генов в нормальных и трансформированных вирусом эритроидных клетках. На хроматине реконструированном с участием отдельных фракций негистоновых белков также синтезировали РНК-транскрипт и гибридизовали его с глобиновой кДНК. Кривые гибридизации транскриптов с нативного и реконструированного хроматина приведены на рис.2. Видно, что гибридизация глобиновой кДНК с транскриптом с нативного хроматина трансформированных эритробластов находится на уровне фона устойчивости смеси РНК-кДНК к нуклеазе S 1 - не превышает Ш (кривая 1). С транскриптом. синтезированным на хроматине, реконструированном с участием ДНК и белков трансформированных эритробластов, гибридизуется не более 1755 кДНК (кривая 2). Это указывает на то. что реконструкция сама по себе практически не влияет на транскрипцию глобиновых последовательностей In vitro." При гибридизации кДНК с транскриптом с нативного хроматина ретикулоцитов в реакцию вступает до 74% кДНК (кривая 3).

Анализ кривых á, 5, 6 рис.2 показывает, что взаимодействие негистоновых белков ретикулоцитов с ДНК трансформированных эритробластов стимулирует транскрипцию глобиновых генов, не работающих в отсутствие этих белков. Наибольшим стимулирующим.эффектом обладают фракции НГБ 1 и НГБ 3 хроматина ретикулоцитов. С 6 мкг РНК-транскрипта, полученного

4000 8000 12000 РНК/кДНК

Рис.2. Гибридизация РНК-транскриптов, синтезированных на на-тивном и реконструированном хроматине с помощью РНК-полимеразы E.coll, с глобиновой кДНК.

1 - нативный хроматин трансформированных эритробластов;

2 - реконструированный хроматин трансформированных эритробластов; -

3 - нативный хроматин ретикулоцитов;

4-6 - хроматин, реконструированый с участием НГБ 1, НГБ 2, НГБ 3 ретикулоцитов соответственно.

в присутствии НГБ 1 ретикулоцитов (кривая 4) гибридизуется 73%, а с 8 мкг РНК-транскрипта, полученного в присутствии НГБ 3 (кривая 6),- 6755 кДНК. Эффект стимуляции транскрипции не может объясняться наличием примесей РНК, внесенных негистоновыми белками ретикулоцитов, поскольку больше 50% последовательностей РНК, гибридизующихся с кДНК. являются новосинтезированными. Разные фракции негистоновых белков не одинаково стимулируют транскрипцию. Наибольшим стимулирующим эффектом обладала фргкция НГБ 1 хроматина ретикулоцитов. Возможно, в состав этой фракции входят белковые факторы, обусловливающие активацию хроматина в области глобиновых генов.

Анализ негистоновых белков хроматина, участвующих в регуляции транскрипции глобиновых генов эритроидных клеток. При сравнительном изучении белкового состава фракции НГБ 1 хроматина трансформированных эритроидных клеток и соответствующей фракции негистоновых белков хроматина ретикулоцитов были обнаружены значительные различия в белковом спектре (рис.3). Так, число белковых пятен в НГБ 1 хроматина культуры трансформированных клеток, полученное при электрофорезе по О'Фарре-лу, составляет приблизительно 100, а в случае НГБ 1 ретикулоцитов примерно 70-85. В целом, фракция НГБ 1 хроматина трансформированных клеток в сравнении с соответствующей фракцией негистоновых белков хроматина ретикулоцитов характеризовалась большим разнообразием белков.

. Экспрессия глобиновых генов в эритроидных клетках при воздействии факторов клеточного стресса. Несмотря на эритроидный характер клеток, изучаемой нами культуры трансформированных эритробластов, в них наблюдается "жесткий" блок синтеза гемоглобина, который не снимается индукторами дифференцировки. В настоящей работе мы предприняли попытку активировать синтез гемоглобина в этих клетках путем воздействия таких факторов стресса, как антибиотик циклогексимид и тепловой шок, поскольку известно, что они активируют экспрессию ряда генов.

Для предварительной проверки возможности усиления транскрипции глобиновых .последовательностей и синтеза гемоглобина в трансформиро-

- 10 а.-

3. 5- рН —-7, 5

67— 45—'

25— 17.8—

67-

45—

V

25~ <

17.8—

I -

— = : • •• • -Г- Гг*.....- • ---V

V '. - ;--- ■■• ; ■ , у

С"'

■I*

ч* • .

Рис.3. Двумерный электрофорез, белков фракции НГБ 1 хроматина эритробластов, трансформированных вирусом Раушера, и ретикулоцитов.

А - двумерный электрофорез белков фракции НГБ 1 хроматина трансформированных эритробластов;

Б - двумерный электрофорез белков фракции НГБ 1 хроматина ретикулоцитов.

Мг - маркеры молекулярных масс: миоглобин лошади (17,8 кО, химотрипсиноген (25 кО), овальбумин (45 кЭ), бычий сывороточный альбумин (67 кВ).

ванных эритробластах при воздействии факторов стресса, использовался бензидиновый тест. Было показано, что в результате воздействия теплового шока (43°С. 25 мин) и циклогексимида (6-10 мкг/мл) обнаруживается положительная реакция на бензидин. Таким образом, при воздействии факторов стресса в трансформированных эритробластах начинается синтез гемоглобина.

Мы проводили Нозерн-гибридизацию суммарной и цитогшазыатической поли (А)+-РНК трансформированных эритробластов с плазмидой pCRl puGq, содержащей вставку р-глобинового гена мыши. При исследовании поли (А) + -РНК, выделенной из суммарной и цитоплазматической РНК клеток не подвергавшихся воздействии факторов стресса, ее гибридизации с плазмидой pCRl. не содержащей вставки р-глобинового гена, не наблюдаюсь. В отличие от этого происходила гибридизация поли(А)+-РНК с плазмидой pCRlguGg (рис.4). При анализе поли (А)*-РНК, выделенной из суммарной РНК трансформированных эритробластов, обнаруживается довольно широкий спектр РНК, гибридизующихся с плазмидой pCRl^Gg; их размер колеблется примерно от 1500 до 450 нуклеотидов (рис.4).- Среди них. по-видимому.' находится полиаденилированный предшественник глобиновой мРНК размером около 1500 нуклеотидов.

При воздействии факторов стресса на трансформированные эритроб-ласты в них происходили следующие изменения; при тепловом шоке (43°С, 25 мин) спектр синтезируемых в эритробластах поли (А)+-РНК, гибридизующихся с плазмидой pCRlCg, содержащей вставку fl-глобинового гена, сужается и результат этой гибридизации становится сходным с результатом гибридизации поли (А)* -РЖ ретикулоцитов с этой плазмидой (рис. 5.4). Тепловой шок (45°С. 13 мин) вызывает исчезновение РНК. гибридизующейся с плазмидой pCRiPijGg (рис.5.3). При обработке трансформированных эритробластов циклогексимидом в них увеличивается содержание нуклеотидных последовательностей, гибридизующихся с плазмидой pCRlpuGg, что указывает на усиление в них транскрипции глобиновых генов.

После воздействия циклогексимида на трансформированные эритроб-

- Пч-

12 3 12 3

Рис.4. Нозерн-гибридизация поли(А)+-РНК, выделенной на поли Ш)-сефарозе (А) и оНаго(с!Г)-целлюлозе (В) из суммарной РНК трансформированных эритробласгов с рСН15ыСд.

1 - РНК интактных трансформированных эритробласгов;

2 - РНК трансформированных эритробластов после теплового пока (43°С, 25 мин);

3 - РНК ретикулоцитов мыши.

Маркеры - л РэМ-фрагменты ДНК.

- dl5-

bp

- геэв -аэбо

- 24£0

- 2443

- 2X40 . 1986

- 1700

- il3®

- 1OT3

- eoa

- eoo

- 900

UV

ж■ mm

"¡'Ii i i i i I , I

1 2 3 4 Б 13 3

Рис.5. Нозерн-гибридизация поли (А)+-РНК, выделенной на oil-go(dT)-целлюлозе из цитоплазматической РНК трансформированных эритроблартов с pCRlßuGg.

А: 1 - РНК ретикулоцитов мши; 2 - РНК трансформированных эритробластов, обработанных ЦГИ; 3 - РНК трансформированных эритробластов после теплового шока (45°С, 13 мин); 4 - РНК трансформированных эритробластов после теплового шока (43°С. 25 мин); 5 -РНК трансформированных эритробластов.

Б: 1 - РНК трансформированных эритробластов, обработанных ЦГИ; 2 - РНК интактных трансформированных эритробластов; 3 - РНК ретикулоцитов мьши.

Маркеры - X Pstl-фрагменты ДНК.

ласты мы выделяли из этих клеток белки и фракционировали их на СМ-цел-люлозе. Маркерами служили а- и В-цепи гемоглобина человека. Результаты представлены на рис.6. Видно, что в обработанных циклогексимидом клетках (рис.66) по сравнению с интактными клетками (рис.6а) на фоне общего подавления синтеза белка синтезируется новая фракция, занимающая при злюции то же положение, что и В-глобиновые цепи. Индукции й- цепей не наблюдалось.

Из ретикулоцитов и эритробластов, подвергавшихся воздействию теплового шока, мы выделяли белки и проводили их электрофорез в ПААГ. При электрофорезе в градиентном (5-20%) ПААГ белков трансформированных эритробластов. подвергавшихся действию теплового шока при 43°С, 13 мин, наблюдается появление новой фракции в области 27 кй и-нескольких новых фракций в области 14-18 кБ (рис.7). В условиях 25 минутного теплового шока отчетливо видно появление новых фракций с мол. массой менее 20 кБ (рис. 8). Среди гетерогенной фракции низкомолекулярных белков теплового шока (Нэрэ), вероятно, присутствуют истинные Нэрз, характерные для позвоночных, но имеются и полипептиды, по молекулярной массе соответствующие глобиновым цепям.

Таким образом, данные полученные при воздействии циклогексимида и теплового шока на трансформированные эригробласты свидетельствуют об индукции экспрессии глобиновых генов в этих клетках.

•Низкое содержание глобиновых последовательностей в РНК-транскриптах, полученных на хроматине трансформированных эритробластов, по сравнению с нормальными эритроидными клетками, позволяет сделать вывод о нарушении экспрессии глобиновых генов в этих клетках на уровне транскрипции. Однако, эксперименты по Нозерн-гибридизации поли(А)*-РНК из нормальных и трансформированных клеток говорят в пользу Того, что при трансформации вирусом Раушера экспрессия глобиновых генов может нарушаться при процессинге предшественника глобиновой мРНК.

Экспрессия генов теплового шока в эритроидных клетках шли. Мы подвергали трансформированные эритробласты и ретикулоциты воздействии

Рис.6. Фракционирование белков трансформированных эритробластов на СИ-целтлозе.

А - включение [3Н]-лейцина в интактные клетки;

■ В - включение [3Н]-лейцина в клетки, обработанные ЦГИ в течение 5 ч. Клетки инкубировали с [3Н]-лейцином в течение ночи. Местоположение а-.и 6-цепей маркера (гемоглобина человека) указано стрелками.

- 1а в-

Мг х |(Г3

67

ЭТКУЯ

- - ■

„ к"':1* - »»¿«а*

25— р^-г

(7.8-

Рис. 7. Флюорограмма, полученная в результате электрофореза меченых белков лизата культуры зритробластов, трансформированных вирусом Раушера, в градиентном 5-20% ПААГ. Злектрофореграмш белков культуры зритробластов. инкубированных в разном температурном режиме: 1 - 37°С (контроль): 2 - 43°С, 13 мин. Время инкубации с -метиойином - 3 ч. Мг - маркеры молекулярных масс: миоглобин лошади (17.8 кО). химотрипсиноген (25 Ш, овальбумин (45 кО. бычий сывороточный альбумин (67 кО).

-42с-

■ Рис. 8. Ф/юорограша, полученная в результате электрофореза меченых белков лизага культуры эритробластов, трансформированных вирусом Раушера, в градиентном 5-2035 ПААГ. Злектрофореграммы белков культуры эритробластов, инкубированных в разном температурном температурном режиме: 1 - 37°С (контроль); 2 - 43°С, 25 мин; 3 -45° С, 25 мин; 4 - 43° С, 25 мин; 5 - 45° С, 25 мин. Время инкубации с С3681-метионином: 2-1 ч;3-5 - 3 ч. Мг - маркеры молекулярных масс: миоглобин лошади (17,8 к0). химотриасиноген (25 кО), оваль-бумин (45 к0), бычий сывороточный/альбумин (67 кР).

теплового шока и определяли спектр синтезируемых белков1 с помощью электрофореза в ПААГ. Результаты воздействия теплового шока на ретику-лоциты представлены на рис. 9, на котором видно, что на фоне подавления общего синтеза белка отмечается появление типичных Нзрз с мол. массой примерно 110, 90, 70 и 30 кБ. Наиболее отчетливое подавление общего синтеза белка, и усиление синтеза Нврэ наблюдается при более жестких условиях теплового шока - 45°С, 43°С, 45 мин. Гемоглобин, составляющий более 90% всех белков этих клеток, присутствует как до, так и после теплового шока. В трансформированных эритробластах не обнаруживается постоянной индукции некоторых основных Нзрэ - белков с мол.массой 90 и 70. КБ. Характерная особенность реакции трансформированных экритроблас-тов на тепловой шок - стабильное появление низкомолекулярных Нзрз с мол. массой примерно 14-25 М>.

Рис.9. Флюорограмма, полученная в результате электрофореза меченых белков лизата ретикулоцитов в градиентном 5-20% ПААГ. Элоктрофореграммы белков ретикулоцитов, инкубированных в разном температурном режиме: Г- 37° С (контроль); 2 - 41°С, 13 мин; 3 -43°С. 13 мин; 4 - 45°С. 13 мин; 5 - 41°С. 25 мин: 6 - 43°С, 25 мин; 7 - 45° С, 25 мин; 8 т 41° С, 45 мин; 9 - 43° С. 45 мин. Время инкубации с [358)-метионином - 3 ч. Мг - маркеры молекулярных масс: миоглобин лошади (17,8 кБ), химотрипсиноген (25 кБ), оваль-буши (45 кО), бычий сывороточный альбумин (67 кО).

- н -

выводы

1. Исследован механизм ранее обнаруженного нарушения экспрессии глобиновых генов в зритроидных клетках мыши, трансформированных вирусом Раушера. Выявлено существенное различие содержания последовательностей глобиновой мРНК в транскриптах, полученных in vitro на хроматине нормальных и трансформированных зритроидных клеток (процент гибридизации РНК-транскриптов с глобиновой кДНК составляет соответственно 90% и 18%).

2. Методом Нозерн-гибридизации поли(А)+-РНК из трансформированных эритробластов с плазмидой, несущей вставку р-глобиновего гена, обнаружен широкий набор молекул РНК, гибридизующихся с этим зондом. Размер РНК колеблется приблизительно от 1500 до 450 нуклеотидов; среди этих РНК, по-видимому, находится и полиаде-нилированный предшественник глобиновой мРНК размером около 1500 нуклеотидов. Таким образом, в трансформированных вирусом эритроидных клетках, возможно, нарушается на только транскрипция глобиновых генов, но и процессинг глобиновой мРНК.

3. Исследовало влияние негистоновых белков (НГБ) хроматина на ' транскрипцию глобиновых генов в нормальных и трансформированных вирусом Раушера эритроидных клетках. Обнаружена фракция НГБ, оказывающая максимальный стимулирующий эффект на транскрипцию глобиновых генов. '

4. Анализ фракций НГБ 1 хроматина нормальных и трансформированных вирусом Раушера эритроидных клеток обнаруживает существенные различия в белковом спектре. Фракция НГБ 1 хроматина трансформированных клеток содержит больше высокомолекулярных белков и, в сравнении с соответствующей Фракцией негистоновых белков хроматина ретикулоцитов, характеризуется большим разнообразием белкового спектра.

5. При воздействии таких факторов клеточного стресса как тепловой

шок и циклогексимид происходит изменение экспрессии глобиновых генов в сторону ее нормализации. Это выражается в появлении клеток, дающих положительную реакцию на окрашивание бензиди-ном, в синтезе более однородной по молекулярной массе поли (А) + -РНК, гибридизующейся с зондом рСЯ1рмС9, и в синтезе белков, по молекулярной массе соответствующих глобинам.

6. В трансформированных эритробластах при воздействии теплового шока не обнаруживается постоянной индукции синтеза одного из ■ основных белков теплового шока - белка с мол.массой 90 кЭ - и появляются низкомолекулярные белки с мол. массой 14-25 КВ.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Переслени Т. Ю., Мавлетова Д. А., Розинова Э. Н., Дворкин Г. А. Транскрипция глобиновых генов на нативном и реконструированном хроматине эритроидных клеток. ДАН, 1985, т.282, N 5, с. 1267-1271.

2. Переслени Т.Ю., Мавлетова Д.А., Дворкин Г.А. Влияние негисто-новых белков хроматина на транскрипцию глобиновых генов. Молекулярная биология, 1986, т. 20, N6, с. 1472-1477.

3. Переслени Т.Ю., Мавлетова Д.А., Дворкин Г.А. Влияние циклогек-симида на транскрипцию в эукариотических клетках. Биохимия, 1988, т. 53. N 4, с. 695-698.

4. .Мавлетова Д. А., Переслени Т. Ю., Дворкин Г. А. Негистоновые белки хроматина, участвующие в регуляции транскрипции глобиновых генов в эритроидных клетках. ДАН, 1989, т. 307, N 4. с. 1007-1009.

5. Переслени Т. Ю., Мавлетова Д. А., Кузьмина Б. А., Дворкин Г. А. Экспрессия генов теплового шока, в эритроидных клетках мыши. Гематология и трансфузиология, 1991, т. 86, В 6, с. 17-19.

6. Мавлетова Д.А., Переслени Т.Ю.. Дворкин Г.А. Экспрессия глобиновых генов в эритроидных клетках мыши при воздействии факторов стрес-

са. ДАН. 1993, т. 331, N 6. с. 763-766.

7. Переслени Т.Ю.. Мавлетова Д. А., Дворкин Г.А. Экспрессия генов в нормальных и трансформированных вирусом эритроидных клетках и действие факторов стресса. Молекулярная биология, 1994, т. 28, N 1, с. 175-183.

Подписано в печать ¡. <2> 94 Формат 60*84/8 Заказ

Усл. печ. л. ^ Тирах /#С7

Типография Россельхозакадемия 115598, Москва, ул. Ягодная-, 12.