Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли нормальных киллеров аутологических эритроцитов в компенсаторных механизмах при стресс-воздействиях

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли нормальных киллеров аутологических эритроцитов в компенсаторных механизмах при стресс-воздействиях"

^О Л Мшшстерство сельского хозяйства и продовольствия х Российской Федерации

<<> Красноярский государственный аграрный }'ниверситет

На правах рукописи

МАКАРСКАЯ ГАЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ НОРМАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ЭРИТРОЦИТОВ В КОМПЕНСАТОРНЫХ МЕХАНИЗМАХ ПРИ СТРЕСС-ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.00.16-Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск 1997

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН (г. Красноярск)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Пухова Я.И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Юшкацкая Л.Г.

доктор биологических наук, профессор Мешшга Л.Н.

Ведущая организация: Красноярский государственный университет

Защита диссертации состойся 7 си^-и^л- 1995 г. £ 9• ОО на -заседании диссертационного совета Д 120. 45. 01 при Красноярском государственном аграрном .университете по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира 88, КрасГАУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан ср 199<? г.

Ученый секретарь

диссертационного совета д.с.-х.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Более полувека продолжавшаяся гонка ядерного вооружения, широкое использование атомной энергии, аварийные ситуации на предприятиях атомной энергетики привели к накоплению огромных объемов радиоактивных отходов в биосфере, на специальных предприятиях по переработке и хранению отработавшего радиоактивного топлива. Эти обстоятельства являются причиной повышения радиационного фона, серьезного ухудшения экологической ситуации особенно в районах аварий и действующих ядерных объектов. К числу таких экологически неблагополучных зон по радиационному фону относится и Красноярский край, на территории которого действуют хранилище радиоактивных отходов, горно-химический комбинат, ядерный реактор, долгое время сбрасывающий охлаждающие воды в реку Енисей.

Ранние биологические эффекты воздействия ионизирующих излучений на биоструктуры включают повреждение ДНК, мРНК, мембран клеток. В их основе лежат молекулярно-биохимические механизмы, приводящие к развитию таких радиационных эффектов как повреждение генетического материала, гибель клеток и канцерогенез (Коггл, 1986).

В конечном итоге радиация в сочетании с промышленными токсикантами, сельскохозяйственными химикатами, социальными стрессами и т.д. оказывают прямое поражающее действие на клетки иммунной системы и системы кроветворения, а также процессы их созревания и взаимодействия, что проявляется высоким уровнем заболеваемости и смертности живых организмов, нарастанием миграционных процессов населения и падением трудового потенциала в экологически неблагоприятных регионах. В связи с этим ранняя диагностика и коррекция патологических изменений в живом организме является одной из актуальных задач современной экологии, физиологии и медицины.

В настоящее время накоплены убедительные доказательства тому, что наиболее тонким и чувствительным индикатором экологического влияния на организм человека является состояние иммунного гомеостаза. Прямая регистрация ранних радиационных эффектов возможна по количественным параметрам системы гемо- и иммунопоэза (Петров, Зарецкая, 1965; Романенко, 1991).

Субпопуляция клеток системы иммуногенеза - нормальных киллеров аутологических эритроцитов (НКАЭ) ответственна за процесс распознавания и разрушения старых функционально неполноценных эритроцитов, динамика ее численности зависит от уровня стресс-воздействия (Крупина и др., 1977; Пухова, 1979). Увеличение численности НКАЭ в крови при стресс-воздействиях сопровождалось усилением процессов диереза, эритропоэза и являлось индикатором стрессового состояния (Клемпарская , 1982; Трофимович, 1982).

Механизмы участия НКАЭ в гемопоэзе связаны с первичным процессом деструкции эритроцитов, заканчивающимся процессингом их в макрофагах, которые, как известно, являются продуцентами эритропоэзстимулирующего фактора (Rich, 1982). Действие его на стволовую кроветворную клетку приводит к активизации процессов пролиферации и дифференцировки последней в эритроидном направлении, конечным этапом которых является формирование функционально полноценных эритроцитов. Стволовые кроветворные клетки (СКК) и НКАЭ относятся к числу наиболее чувствительных клеток к стресс-воздействию (Переверзев, 1986; Пухова и др., 1979) и их поражение является угрожающим для жизнедеятельности организма.

Таким образом, очевидным становится предположение о том, что в замкнутой цепи процессов регуляции гомеостаза эритроцитарного звена нормального кроветворения субпопуляция НКАЭ играет не только роль клеток-киллеров на конечном этапе существования и функционирования эритроцита, но является и одним из регуляторных факторов эритропоэза.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании роли одного из ведущих факторов адаптации - субпопуляции НКАЭ в механизмах пролиферации и дифференцировки стволовой кроветворной клетки в эритроидном направлении.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- исследовать природу субпопуляции НКАЭ;

- определить на экспериментальной модели Тилла и МакКуллоха количественные закономерности зависимости активности колониеобразования в селезенке от численности популяции НКАЭ в трансплантируемой суспензии клеток костного мозга;

- изучить закономерности динамики численности субпопуляции НКАЭ центральных и периферических органов иммунитета, взаимодействующей с разновозрастными клетками эритроидного ряда при колониеобразовании в селезенке.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Субпопуляция НКАЭ принадлежит к популяции ранних предшественников Т-лимфоцитов с 5С-1+ТЬу-1+ фенотипом.

2. Содержание НКАЭ в трансплантате и динамика численности НКАЭ в крови и органах в организме летально облученных мышей-реципиентов предопределяют активность колониеобразования в селезенке и динамику ретикулоцитарной активности.

3. Субпопуляция НКАЭ является регуляторным звеном в клеточных кооперативных взаимодействиях, обеспечивающих эритроидный путь дифференцировки СКК при стрессорных воздействиях на организм.

Научная новизна работы:

- впервые показано, что НКАЭ полностью локализуются в неприлипающей фракции клеток костного мозга и представлены в основной массе БС-1+Т11у-1+ клетками, что позволяет отнести их к ранним предшественникам Т-лимфоцитов; это подтверждено наличием у НКАЭ, выделенных из мононуклеаров периферической крови человека, рецептора ИКО-Ю,

определяемого МКА ИКО-Ю, который выявляется и на ранних предшественниках Т-лимфоцитов;

- впервые получены количественные характеристики взаимосвязи НКАЭ со стволовой кроветворной клеткой на уровне колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс), обеспечивающая регенерацию эритроидного ростка кроветворения;

- впервые изучены закономерности динамики численности НКАЭ в периферической крови, тимусе, костном мозге и селезенке летально облученных животных без или с последующей трансплантацией им клеток костного мозга с присутствием или отсутствием в них НКАЭ.

Научная значимость работы; Результаты исследований обнаружили закономерное поведение популяции НКАЭ в период образования колоний в селезенке и восстановления гемопоэза. Выявлено, что активность процессов колониеобразования и эритропоэза зависит от численности НКАЭ, которая, судя по временным характеристикам динамики, является предопределяющей в этих процессах. Выявленные закономерности подтверждают, что субпопуляция НКАЭ, ответственная за деструкцию старых, функционально неполноценных эритроцитов, обладает хелперным действием на стволовую кроветворную клетку, опосредованным через продукты взаимодействия со старыми эритроцитами, процессированными макрофагами, и играет важную роль в формировании физиологических механизмов адаптации.

Практическая значимость работы. Результаты работы представляются значимыми для фундаментальных исследований закономерностей функционирования компенсаторных механизмов организма в условиях воздействия экологических стресс-факторов, разработки методов ранней диагностики, контроля и регуляции продукции клеток эритроидного ряда для компенсации потребностей организма в норме и при патологии. Результаты исследований роли субпопуляции НКАЭ в процессе регуляции

эритроидного направления пролиферации и дифференцировки СКК используются в материалах лекционного курса "Иммунология", читаемом в Красноярском государственном университете.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и представлены на Первом съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1986), Всесоюзной конференции с международным участием "Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии" (Новосибирск, 1988), Первом Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), Всесоюзной школе "Молекулярно-клеточные механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы математического моделирования" (Шушенское, 1990), на научной конференции "Механизмы адаптации организма" (Томск, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, включенных в прилагаемый перечень.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитированной литературы.

Объем диссертации составляет 131 машинописную страницу,включая 2 таблицы, 29 рисунков. Список цитируемой литературы насчитывает 142 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении сформулированы цель и задачи исследований, приведены основные результаты работы.

В первой главе рассмотрено современное состояние проблемы формирования иммунологических механизмов адаптогенеза, включающих многочисленные факторы клеточной и гуморальной природы,

обусловливающие процессы стимуляции или подавления пролиферации и. дифференцировки стволовых кроветворных клеток в определенном направлении в соответствие с потребностями организма для поддержания гомеостаза при воздействии стресс-факторов. Обосновывается выбор исследования роли субпопуляции НКАЭ в компенсаторных реакциях адаптогенеза, обусловливающих пролиферацию и дифференцировку ПСКК в эритроидном направлении, что в свою очередь обеспечивает в условиях стресс-воздействия повышенный энергетический запрос организма.

Вторая глава содержит описание объектов и основных методов исследования, включающее современные иммунобиологические, гематологические, гистологические и статистические методы. При исследовании закономерностей участия субпопуляции НКАЭ в клеточной кооперации со стволовой кроветворной клеткой была выбрана экспериментальная модель Тилла и МакКуллоха (Till J.E., McCulloch Е.А., 1961), позволяющая количественно оценить параметры клеточных популяций, участвующих в процессе регенерации кроветворения, включая ранние предшественники стволовой клетки, у летально облученных животных после трансплантации им клеток сингенного костного мозга. Для количественной оценки численности субпопуляции НКАЭ использовали метод бляшкообразования по Cunningham в модификации Н.Н.Клемпарской (Клемпарская H.H., 1969). В качестве объектов исследования были использованы мыши линий СВА и (CBAxC57Bl6)Fi 2- 4 месячного возраста, полученные из питомников лабораторных животных «Рапполово» и «Столбовая» АМН СССР, а также беспородные кролики. Ряд экспериментальных данных получен при использовании свежеполученной крови практически здоровых доноров.

Третья глава посвящена изучению природы НКАЭ и экспериментальному обоснованию роли НКАЭ в компенсаторных механизмах регуляции гемопоэза, в частности, эритропоэза после

воздействия на организм летальных доз рентгеновского облучения без или с последующей трансплантацией клеток сингенного костного мозга.

Исследование адгезивных свойств НКАЭ костного мозга показало, что эти клетки являются неприлипающими, концентрирующимися во фракции Т-лимфоцитов, что исключает их принадлежность к макрофагальному ряду и позволяет получать концентрированную по НКАЭ суспензию клеток костного мозга.

Исследование фенотипических характеристик популяции НКАЭ тимуса и костного мозга выявило, что характерным для этих клеток является наличие таких антигенных детерминант как SC-1, Thy-1, ИКО-Ю, ИКО-11. При этом преобладающее большинство НКАЭ костного мозга маркированы одновременно двумя антигенами SC-1, Thy-1, поскольку иммунная сыворотка, содержащая антитела к этим двум антигенам, ингибировала 87,7% НКАЭ, в то время как сыворотки, специфические в отношении только одного из них, оказывали ингибирующее воздействие лишь на 32-47% костномозговых НКАЭ. Более детальные исследования с помощью МКА ИКО-Ю (к Thy-1.2 антигену) показали, что в фенотипе НКАЭ костного мозга Thy-1.2 антиген представлен на 43% этих клеток. Поскольку в костном мозге клетки, несущие только Thy-1 антиген, практически отсутствуют, то, очевидно, при воздействии МКА к Thy- 1.2 антигену (МКА ИКО-Ю) элиминировались- SC-1+, Thy-1+ НКАЭ. Таким образом, в популяции НКАЭ костного мозга представлены клетки, находящиеся на ранних этапах дифференцировки в направлении Т-ряда и по своим фенотипическим свойствам и функциональной активности в отношении КОЕс, как показали дальнейшие исследования, относящиеся к ранним предшественникам Т-лимфоцитов (ПТЛ).

Экспериментальные данные показали наличие у 52% мононуклеаров периферической крови человека рецептора к МКА ИКО-11, под действием которых в отсутствие комплемента блокируется НК-клеточная активность, реакция бласттрансформации на ФГА и активность ЦТЛ (Барышников и

др., 1987). Эхо позволяет говорить о том, что на части НКАЭ периферической крови людей экспрессирован антиген, играющий важную роль в начальной распознающе-адгезивной фазе взаимодействия НКАЭ с аутологичными и сингенными эритроцитами. Таким образом, в фенотипе НКАЭ периферической крови человека представлены два антигена Thy-1 и ИКО-11, которые, по-видимому, несут ответственность за функцию распознавания и взаимодействия с аутологичными эритроцитами, однако, каждый антиген представлен на своей субпопуляции НКАЭ, очевидно, отличающихся степенью зрелости.

Экспериментальные данные по исследованию численности НКАЭ, КОЕс, ретикулоцитов и эритроцитов при гемопоэзе на экспериментальной модели Тилла и МакКуллоха показали наличие определенной закономерной зависимости между динамикой численности этих популяций. Известные данные (Пухова, 1979), свидетельствующие о том, что изменение относительного содержания НКАЭ в крови и органах экспериментальных животных влечет за собой не только изменение численности популяции эритроцитов, но и закономерное корреляционно связанное изменение активности эритропоэза (по количеству ретикулоцитов в периферической крови), позволили предположить, что именно популяции НКАЭ принадлежит роль регулирующего звена эритропоэза.

В исследованиях колониеобразующей активности и направления дифференцировки ПСКК при элиминации из трансплантируемой суспензии клеток костного мозга субпопуляции НКАЭ цитотоксическими сыворотками (сыворотка против головного мозга мышей - СШ ММ, сыворотка против лимфоцитов тимуса мышей - СПЛТМ) продемонстрирована прямая зависимость (коэфф. корреляции г=0.72, N=3) между количеством НКАЭ в трансплантате и количеством макроколоний на селезенке, регистрируемых на 9-е сутки после трансплантации (рис. 1). Также отмечается четкая зависимость и в направлении дифференцировки микроколоний в селезенке (рис. 2), что ярко проявляется на эритроидном ростке (г=0.95, N=3), и подтверждает

1.2 т 1 0.8

0.6 0.4 0.2 0

□ 1 □ 2 □ 3

Рис. 1. Содержание НКАЭ и КО Ее в суспензии клеток костного мозга после обработки СПГММ (1), СПГММ, истощенной специфическим антигеном, (2) и нормальной кроличьей сывороткой (3).

25-

о Ц

о

И

о о. а X

г

0

01

в

о У

е; о

20

15

10

□ 11 □2; □ з

о « о. л

З' о

5.1

Рис. 2. Содержание микроколоний, морфологически различных микроколоний в селезенке летально облученных мышей-реципиентов клеток костного мозга после обработки их СПГММ (1), СПГММ, истощенной специфическим антигеном, (2) и нормальной кроличьей сывороткой (3).

5

гипотезу о регулирующем влиянии НКАЭ избирательно на эритроидное направление гемопоэза. При элиминации НКАЭ отмечается уменьшение количества КОЕс и эритроидных микроколоний, которое вновь восстанавливается при восстановлении количественного содержания НКАЭ в трансплантируемой суспензии клеток костного мозга, а количество гранулоцитарных микроколоний при этом достоверных изменений не претерпевает. Это указывает на существование количественной зависимости между эритроидным направлением дифференцировки и пролиферации ПСКК, эритроиднокоммитировашшх предшественников и НКАЭ.

Аналогичная зависимость проявлялась при трансплантации клеток костного мозга с увеличенным посредством пропускания через вискозное волокно содержанием НКАЭ, Концентрация НКАЭ в 2,2 раза обусловливала увеличение числа КОЕс от 13,6 ±4,3 до 31,0±7,6 на селезенку у реципиентов неприлипающих клеток костного мозга (рис. 8). Это может свидетельствовать о том, что увеличение числа киллеров при одинаковом количестве для них антигенного стимула индуцирует увеличение количества образующегося в результате взаимодействия НКАЭ с эритроцитами эритропоэзстимулирующего фактора, что проявляется в увеличении и числа макроколоний и числа эритроидных микроколоний (рис. 3, 4).

Таким образом, колониеобразующая и пролиферативно-дифференцировочная активность ПСКК костного мозга зависит от количественного содержания в трансплантируемых клетках костного мозга НКАЭ.

То, что такая зависимость не является случайной, или, как утверждает Е.8.0о1иЬ (Оо1иЬ, 1972), следствием элиминации СПГММ непосредственно самих ПСКК, несущих БС-1 антиген, продемонстрировали экспериментальные данные, полученные при замещении утраченных при обработке СПГММ НКАЭ костного мозга, аналогичными им по функциональной активности НКАЭ тимуса. Как известно, среди клеток тимуса не содержится гемопоэтических

а 40

35

О о

е 30 о

<в у

5 О

25 20 15

10 5 0

* 1

_-0.9 А

£0.8 т о 0.7 х

|о.6 -5 0-5

0.3 0.2 -0.1 -0

□ 1 Ш2

из

Рис. 3. Количество КОЕс и ретикулоцитов в периферической крови летально облученных мышей после трансплантации клеток сингенного костного мозга (1), клеток обогащенной НКАЭ фракции костного мозга (2) и клеток обогащенной НКАЭ фракции костного мозга, обработанных СПГММ (3).

14

12

10

= 8 -

6 х

2 -

0.5 0.45 + 0.4

0.35 -г 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 + 0.05 0

□ 1 Е321

□ з'

эритроидиые

гранулоцйт арные

мегакариоц итврныв

4

Рис. 4. Количество микроколоний и направление дифференцировки микроколоний кроветворных клеток в селезенке летально облученных мышей после трансплантации клеток сингенного костного мозга (1), клеток обогащенной НКАЭ фракции костного мозга (2) и клеток обогащенной НКАЭ фракции костного мозга, обработанных СПГММ (3).

кроветворных клеток, у летально облученных мышей доза в 2x107 клеток образует лишь 0,2 - 0,3 колонии на селезенку (Семина и др., 1978). Таким образом, восстановление утраченной в описанных случаях гемопоэтической активности костного мозга может происходить не за счет добавления кроветворных клеток из тимуса, которые в нем отсутствуют, а только за счет восполнения лимфоидных клеток с киллерной функцией. Замещение субпопуляции НКАЭ костного мозга, содержание которых в трансплантируемой суспензии клеток после обработки СПГММ составляло (0,54 ± 0,13)%, клетками тимуса с содержанием НКАЭ (1,23± 0,24)% приводило к восстановлению активности колониеобразования с 4,0± 0,24 колоний до 16,0± 2,2 колоний. Обработка же клеток тимуса СПГММ приводила не только к снижению содержания в них НКАЭ по сравнению с обработкой НС в 3,5 раза, но и отменяла способность клеток тимуса восстанавливать активность колониеобразования (рис. 5).

й? 1.8 -

¡1.4 + 1.2 т

1 -0.80.6 -0.40.2 0 1

о ш О

О

О 14

20 -18 -16

н о ш т 5

£

12 10 т 8 + 6 -4 2 0

гЬ:

г? 6-

д н

5

а о с

5 щ

о.

3 -

1 --

н

■ Н2 |В4

Рис. 5. Влияние содержания НКАЭ в интактных (2), обработанных СПГММ (3) или НС (4) клетках тимуса, трансплантированных совместно с обработанными СПГММ клетками костного мозга (1), на количество КОЕс и ретикулоцитов в крови летально облученных мышей на 9-е сутки после облучения и трансплантации.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что популяция НКАЭ является обязательным звеном механизма клеточной кооперации при пролиферации и дифференцировке ПСКК именно в эритроидном направлении. Исключение этого звена из цепи кооперативных клеточных взаимодействий при элиминации НКАЭ цитотоксическими сыворотками приводит к нарушению работы данного механизма, что и проявляется в снижении и гемолитической активности НКАЗ^и активности колониеобразования и эритропоэза.

Исследования восстановления гемопоэза у летально облученных мышей после трансплантации им клеток сингенного костного мозга также выявили наличие закономерной динамики относительного и абсолютного количества НКАЭ в крови и органах сингенных мышей-реципиентов, имеющей характерные для каждого органа достоверные максимумы в первые 5 суток после облучения и трансплантации на фоне резко сокращающегося общего количества клеток в этих органах в тот же период времени (рис.6, 7, 8).

При этом пики относительной и абсолютной численности НКАЭ в исследуемых органах не всегда совпадали: вначале пик НКАЭ обнаруживался в крови и селезенке (первые сутки), затем в тимусе (третьи сутки) и костном мозге (пятые сутки), что можно объяснить миграцией НКАЭ из крови и последующим заселением их в органы. При этом максимумы численности НКАЭ в исследуемых органах предшествовали резкому увеличению эритропоэтической активности, регистрируемой по количеству ретикулоцитов в периферической крови, на 7-е сутки после трансплантации (рис.8). Очевидно, в селезенке в результате максимального накопления в ней продуктов взаимодействия НКАЭ с эритроцитами и высокого содержания макрофагов (Нормальное кроветворение, 1976), процессирующих их с образованием эритропоэзстимулирующего фактора (Rich, 1982, Fagg, 1986, Пухова и др. 1989), создаются благоприятные условия (микроокружение), способствующие активному

° у

I 100 я

сутки

Рис. 6. Динамика численности ядросодержащих клеток (левая ось ординат) и абсолютной численности НКАЭ (правая ось) в крови и органах летально облученных мышей после трансплантации им клеток сингенного костного мозга.

е;

0 и

03

1

*4

« _

& 3

2

I- 2

СО

2 1

X

О Г

я" «

О £ н и о а

т

й х

Рис. 7. Динамика НКАЭ в крови и органах иммунитета мышей после летального облучения (2) или летального облучения и трансплантации клеток сингенного костного мозга (1).

сутки

Рис. 8. Динамика численности ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови мышей, летально облученных без (1) или после трансплантации клеток сингенного костного мозга (2).

. 0.25 т

О

й X

0.2

0.15 и

0.1 • О

0.05 ШШт ¡¡¡¡¡I

|1р|

□ 1 Е32 ИЗ □ 4

Рис. 9. Содержание НКАЭ в интактных (1, 3) и облученных in vitro (2, 4) клетках костного мозга, определяемых в эффекте аутобляшкообразования с интактными и облученными эритроцитами соответственно.

функционированию заселивших этот орган ПСКК (пролиферация и дифференцировка, именно в эритроидном направлении). На седьмые же сутки во всех исследуемых органах происходит сокращение численности НКАЭ при увеличении общего количества лейкоцитарных клеток в этих органах. Это сокращение определяется уменьшением антигенного стимула для НКАЭ: уменьшением численности клеток-мишеней - старых эритроцитов при омоложении популяции красных клеток за счет выброса ретикулоцитов в кровяное русло при созревании клеток красного ряда в колониях, которые образуются на 5-е сутки после трансплантации из наиболее дифференцированных предшественников. Эти данные указывают на то, что, очевидно, продукты взаимодействия НКАЭ с эритроцитами воздействуют на более коммитированные КОЕ-э.

В облученном организме без последующей трансплантации клеток костного мозга динамика относительной численности НКАЭ носила иной характер.

Относительная численность НКАЭ крови и органов иммунитета на протяжении девяти суток достоверно не отличалась от фоновых значений, но, в селезенке, основном кроворазрушающем органе, на 3-5 сутки наблюдалось увеличение относительного содержания НКАЭ, а в тимусе динамика НКАЭ имела те же временные параметры максимумов, что и у защищенных мышей, однако, их амплитуда не была так выражена и достоверно не превышала фоновых значений (рис.7). Очевидно, что НКАЭ при летальном облучении не теряют своей киллерной способности в отношении эритроцитов, что было подтверждено исследованиями in vitro (рис.9), однако, способность к генерации у них утрачивается. При одновременной утрате организмом ПСКК при облучении даже тот эритропоэзстимулирующий фактор, который образуется в результате взаимодействия НКАЭ с эритроцитами, остается не востребованным. Этим, по-видимому, объясняется тот факт, что ретикулоциты в крови незащищенных костным мозгом мышей на 7-е сутки практически не

обнаруживаются, в то время как у защищенных трансплантацией костного мозга мышей в тот же срок содержание ретикулоцитов в периферической крови превышало фоновое значение в 2,2 раза.

Значение активности субпопуляции НКАЭ в посттрансплантационный период для колониеобразования и эритропоэза в летально облученном организме подтверждено исследованиями динамики НКАЭ и ретикулоцитов у летально облученных мышей после трансплантации им клеток костного мозга, обработанных СГОПМ, цитотоксической в отношении НКАЭ. Динамика НКАЭ в крови и органах мышей-реципиентов обработанных СПЛТМ клеток костного мозга была практически идентична динамике НКАЭ у летально облученных мышей без трансплантации костного мозга (рис.7,10). Несмотря на то, что в трансплантате присутствовали ПСКК, динамика относительной численности ретикулоцитов полностью совпадала с таковой у летально облученных мышей без последующей трансплантации им клеток костного мозга (рис.8,11), и количество КОЕс составляло 3,6 ± 0,9 против 13,7 +1,7 у летально облученных реципиентов клеток интактного костного мозга. Очевидно, только при наличии активного взаимодействия НКАЭ с эритроцитами в первые 5 суток после облучения обеспечивается активация эритроидного колониеобразования и эритропоэза к 7-м суткам после облучения и трансплантации.

Закономерное увеличение численности НКАЭ в иммунокомпетентных органах в период, предшествующий всплеску эритропоэтической активности, свидетельствует о том, что участие этой популяции в процессах эритропоэза не является случайным, оно обязательно.

Таким образом, анализ полученных экспериментальных данных показывает, что популяция нормальных киллеров аутологических эритроцитов, ответственная в норме и стрессовом состоянии за деструкцию старых, функционально неполноценных эритроцитов, обладает хелперным опосредованным действием на стволовую кроветворную клетку и играет

2.5 т

9 сутки

Рис. 10. Динамика относительной численности НКАЭ в крови и органах летально облученных мышей после трансплантации им клеток сингенного костного мозга, обработанных СПЛТМ (1) или НС (2).

0 13 5 7 9 СУТКИ

Рис. 11. Динамика численности ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови летально облученных мышей после трансплантации им клеток сингенного костного мозга, обработанных СПЛТМ(1) или НС (2).

важную роль в формировании физиологических компенсаторных механизмов адаптации.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что НКАЭ являются популяцией радиорезистентных клеток, сохраняющих функциональную активность в отношении аутологических эритроцитов после летальных доз облучения in vitro и in vivo. НКАЭ могут служить индикаторной популяцией клеток

состояния организма при воздействии экологически неблагоприятных факторов.

2. Показана прямая пропорциональная зависимость количества КОЕс, микроколоний эритроидного ряда от количества НКАЭ, трансплантируемых с клетками костного мозга. Специфическая элиминация популяции НКАЭ из трансплантируемых клеток костного мозга приводит к снижению количества КОЕс и к сокращению числа эритроидных микроколоний в селезенке, концентрирование клеток популяции НКАЭ в костномозговом трансплантате приводит к увеличению численности КОЕс и эритроидных микроколоний в селезенке.

3. На экспериментальной модели летального облучения показано наличие закономерной динамики абсолютной и относительной численности НКАЭ в крови и органах мышей, максимумы которой предшествуют по времени максимуму относительной численности ретикулоцитов в периферической крови летально облученных мышей без трансплантации и после трансплантации клеток сингенного костного мозга в период колониеобразования в селезенке. Специфическая элиминация НКАЭ из трансплантируемых клеток костного мозга СПЛТМ приводит к изменению характера динамики этих клеток в крови и органах в период колониеобразования в селезенке и опосредованно к снижению ретикулоцитарной и колониеобразующей активности.

4. С помощью моноклональных антител панели ИКО, антигенспецифических сывороток (СПГММ и СПЛТМ) показано, что субпопуляция НКАЭ принадлежит к популяции ранних предшественников Т-лимфоцитов и характеризуется SC-l+Thy-l + фенотипом.

5. Показано, что участие субпопуляции НКАЭ в компенсаторных реакциях адаптогенеза реализуется на уровне 8-ми суточных КОЕс,

обусловливая их пролиферацию и дифференцировку в эритроидном направлении, что в свою очередь обеспечивает в условиях стресс-воздействия повышенный энергетический запрос организма.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ:

1. Пухова Я.И., Терсков ИА., Макарская Г.В. Нормальные киллеры в механизмах клеточной кооперации при колониеобразовании и эритропоэзе //Докл. АН СССР. - 1985. - т.282. - № 6. -с. 1478-1482.

2. Пухова Я.И., Макарская Г.В. Исследование роли нормальных киллеров в механизмах клеточной кооперации при колониеобразовании и эритропоэзе //Тезисы докл. 2-й Всероссийской конф. гематологов и трансфузиологов, Челябинск, 1986. - с.246-247.

3. Пухова Я.И., Макарская Г.В. Нормальные киллеры как физиологический механизм поддержания гомеостаза системы эритрон //Сб. "Актуальные проблемы физиологических и структурно-функциональных основ жизнедеятельности". Новосибирск, 1987. - с.159.

4. Pukhova Ya.I., Makarskaya G.V. Homeostasis of normal hemopoiesis erythrocyte link regulated by subpopulation of normal killers //J. periodicum biologorum. - 1987. - v.89. -suppl.l. -p.81.

5. Пухова Я.И., Макарская Г.В. Фенотипические характеристики нормальных киллеров аутологических эритроцитов и их участие в регуляции эритропоэза //Тезисы науч. конф. "Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны", Красноярск, 1988. -с.107.

6. Пухова Я.И., Терсков И.А., Корнеева Н.Л., Макарская Г.В. О природе клеток с хелперной функцией в отношение эритроидного направления пролиферации и дифференцировки стволовой кроветворной клетки //Докл. АН СССР. - 1988. -т.ЗОЗ. - № 4,- с.980-983.

7. Pukhova Ya.I., Makarskaya G.V. Elimination of senescent autologous erythrocytes and regulation of erythropoiesis by normal killers //Abstract of 9th European Immunology meeting , September 14-17, 1988. - p.124.

8. Пухова Я.И., Макарская Г.В., Кригер Н.В. Исследование фенотипических характеристик популяции нормальных киллеров аутологических эритроцитов //Бюлл. эксперим. биол. и медицины. -1989. -№ 1. -с.62-64.

9. Пухова Я.И., Макарская Г.В., Елсукова Е.И., Пухов К.И., Корнеева H.JI. Экспериментально-теоретическая модель идиотип-антиидиотипически обусловленных клеточных взаимодействий при пролиферации и дифференцировке стволовой кроветворной клетки (СКК) в эритроидном направлении //Тез. докл. 1-го Всесоюзн. съезда иммунологов. М., 1989. -т.1. - с.90.

10. Пухова Я.И., Макарская Г.В. Функционально-структурные исследования популяции нормальных киллеров аутологических эритроцитов //Тезисы докл. Всесоюзн. школы "Молекулярно-клеточные механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы математического моделирования", Красноярск, 1990. - с. 75-79.

11. Макарская Г.В. Анализ межклеточных взаимодействий в системе нормальный киллер-эритроцит-ретикулоцит при колониеобразовании в селезенке //Там же. - с.88-90.

12. Макарская Г.В. Участие нормальных киллеров аутологических эритроцитов в компенсаторном механизме регуляции эритропоэза //Материалы науч. конф. "Механизмы адаптации организма", посвященной памяти и 90-летию В.А.Пегеля, Томск, 1996. - с.25-26.