Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование динамики численности нормальных киллеров аутологических эритроцитов как ответной реакции организма на стресс-воздействие

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование динамики численности нормальных киллеров аутологических эритроцитов как ответной реакции организма на стресс-воздействие"

од

На правах рукописи

Пономаренко Людмила Давидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ЧИСЛЕННОСТИ НОРМАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ЭРИТРОЦИТОВ КАК ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА СТРЕСС-ВОЗДЕЙСТВИЕ

специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск -1997

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН и Красноярской государственной технологической академии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Я.И.Пухова

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Р.Г.Хлебопрос доктор биологических наук, профессор ЛН.Меняйло

Ведущая организация:

Красноярский государственный университет

Защита состоится <уШу> 1997г. в ^^ ч.

на заседании специализированного совета Д 120.45.01 при Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049, Красноярск, проспект Мира 88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета

Автореферат разослан « 1997г.

Ученый секретарь специализированного совета

Д 120.45.01 при Красноярском государственном аграрном университете

доктор сельскохозяйственных наук

Актуальность темы. Общенаучная значимость проблемы экологического равновесия и адаптации выдвигает экологию в разряд интенсивно развивающихся медико-биологических дисциплин. В свою очередь развитие экологии не представляется возможным без познания молекулярно-биологических механизмов ответной реакции организма на изменение экологической обстановки. В связи с этим исключительный интерес представляет возможность экспресс-оценки возникновения в организме стресс - ситуации в ответ на повреждающее воздействие и, если это возможно, ее коррекция.

В связи с бурным развитием цивилизации, связанным с освоением новых мест обитания, необходимостью проживания в больших городах с неполноцешшм составом воздушного питания, трудом на вредных производствах и многими другими факторами урбанизации, современный человек испытывает постоянный стресс. Важнейшей задачей экологии является не только оценка возникновения и наличия в организме стрессовой ситуации, но и определение глубины повреждающего действия стресса на организм, возможности дальнейшего существования организма в новом качестве, его адаптация к новым условиям среды. Сложность этой задачи усугубляется генетическим разнообразием ответных реакций каждого индивидуума, т.к. генотип влияет как на вероятность тех или иных повреждений, так и на степень их компенсации и репарации. Достаточно часто потенциальные генетически детерминированные возможности организма преобразуются в ответ на требования внешней среды.

В процессе эволюции организма человека сформировалась сложная система защитных приспособлений, позволяющих ему без вреда для своего здоровья взаимодействовать с различными факторами внешней среды, в которой он живет и действует. Диапазон безопасных воздействий среды ограничен спецификой вида, задаваемой его генотипом, и нормой адаптации индивида, определяемой его фенотипом. Кроме того, существует индивидуальность каждого человека в пределах его генотипа, а следовательно, собственная норма адаптации. В экстремальных для организма условиях включаются адаптивно-компенсаторные механизмы, обеспечивающие приспособление организма к повышенным нагрузкам с целью сохранения гомеостаза.

В нашей работе мы придерживаемся определения стресса, данного Селье Г. Он указывает на универсальный характер стресса и считает, что стресс - это «состояние, выражающееся синдромом всеобщей адаптации», это «неспецифическая реакция организма на любое предъявленное ему требование».

Иммунная система одной из первых реагирует на изменение экологической ситуации с помощью своих неспецифических и специфических реакций. Система иммунитета является достаточно гибкой системой и может корректировать реакции организма на повреждающие факторы, с которыми человек ранее не встречался. В свою очередь система эритрон, включающая и клетки иммунной системы, является одной из наиболее удобных моделей для понимания механизмов, обуславливающих в конечном итоге процессы разрушения и воспроизводства клеток в ответ на изменения, привносимые внешними или внутренними повреждающими агентами.

В этой связи анализ ответной реакции организма на сресс-воздействие, оценка глубины этого воздействия, наличие универсального экспресс-теста, позволяющего определить возникновение стрессовой ситуации на самом ее начальном этапе развития, является важной и актуальной задачей как с точки зрения экологии как науки, так и для практического применения с целью оценки состояния человека и окружающей его среды.

Целью настоящей работы является исследование динамики численности нормальных киллеров аутологических эритроцитов (НКАЭ) как одного из высокочувствительных информативных тестов оценки в организме стресс-ситуации.

Задачи исследования:

1. Исследовать динамику численности НКАЭ в крови животных в ответ на стресс-воздействия, вызванные кровопотерей, действием солей тяжелых металлов (хлористый кобальт), гипоксической гипоксией.

2. Исследовать свойства НКАЭ.

3. Исследовать механизмы взаимодействия НКАЭ с эритроцитами.

Научная новизна работы. Впервые описана высокочувствительная стереотипная информативная реакция, выражающаяся в увеличении численности

нормальных киллеров аутологических эритроцитов в ответ на стресс-воздействия, которая имеет определенные динамические характеристики.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для оценки экологической ситуации с целью обнаружения в организме человека стрессового состояния, а также в практической медицине для оценки тяжести состояния больного и эффективности проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту. Решение поставленных задач привело к следующим основным принципиально новым результатам, которые имеют важное фундаментальное и практическое значение и выносятся автором на защиту:

1. Предложен количественный метод экспресс-оценки возникновения в организме человека и животных стресс-ситуации по числу нормальных- киллеров аутологических лимфоцитов.

2. Установлена избирательная киллерпая активность НКАЭ в отношении «старых», функционально неполноценных эритроцитов.

3. Показано, что описанная в работе ответная реакция организма на стресс-воздействие, проявляющаяся в увеличении числа НКАЭ в периферической крови, является универсальной адаптационной реакцией организма, направленной на поддержание гомеостаза системы эритрон.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза» (Красноярск, 1996); на VIII Всероссийском симпозиуме «Гомеостаз и окружающая среда» (Красноярск, 1996); на научной конференции, «Проблемы экологии человека на Севере» (Красноярск, 1996); на Всесоюзных научно-практических конференциях «Проблемы химико-лесного комплекса» (Красноярск, 1996,1997).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в десяти печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 130 наименований. Содержание ее изложено на 106 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 16 рисунков и 3 фотографии.

Содержание работы.

Во Введении обосновывается актуальность и теоретическая и практическая значимость рассматриваемой задачи, формулируется цель работы и основные положения, выносимые на защиту, кратко излагается содержание глав.

Первая глава носит обзорный характер. В ней рассматриваются различные теоретические подходы, и накопленный к настоящему времени фактический материал по вопросам ответной реакции организма на стресс-воздействие со стороны внешней среды, а также современные представления о клетках иммунной системы, участвующих в описанной реакции.

Во второй главе приводятся методики, используемые автором в настоящем исследовании.

Исследования проводились с использованием периферической крови и органов животных (линейные мыши СВА или (CBAxC57B16)Fl 2-4 месячного возраста, полученные из питомников «Столбовая» г.Москва и «Рапполово» г.Санкт-Петербург; беспородные кролики, полученные из вивария Института биофизики РАН), а так же периферической крови практически здоровых людей, которую получали со станции переливания крови г.Красноярска. Практически все эксперименты проводились в стерильных условиях бокса. Всего в экспериментах было задействовано 1000 мышей, 45 кроликов и 60 образцов периферической крови практически здоровых людей.

Для выявления популяции нормальных киллеров аутологических эритроцитов был использован метод локального гемолиза Cunningham (1968), используемый для выявления иммунологически активных клеток, который был несколько модифицирован с целью инкубации строго аутологических компонентов. В основе этого метода заложена инкубация суспензии аутологических эритроцитов и лимфоцитов под стеклом. Для приготовления препаратов использовали предметные (76х27)мм и покровные (18х18)мм стекла, предварительно обезжиренные в смеси Никифорова, а затем тщательно промытые водой, протертые спиртом и непосредственно перед приготовлением препарата обоженные на спиртовке в условиях бокса. Все используемые пипетки, посуда, растворы стерилизовались, либо использовались готовые стерильные препараты.

Компоненты препарата наносили на стекло в виде капель с помощью мерных пипеток и тщательно перемешивали тонкой стерильной стеклянной палочкой, а затем накрывали предметное стекло с препаратом покровным стеклом, края которого были смазаны вазелином. Образовывалась камера, содержащая исследуемые компоненты клеток. Приготовленные препараты инкубировали 30-40 мин при 25-27°С, а затем 18-24 часа при 7-10°С. В правой части покровного стекла ставили такую же камеру с добавлением 5% раствора уксусной кислоты для подсчета общего числа вносимых в препарат лимфоцитов. Все компоненты реакции (эритроциты, лимфоциты, комплемент, среда 199) вносили в соотношении 1:1:1:1 в равных объемах в левую и правую камеру, осуществляя необходимую коррекцию средой 199. Относительное содержание клеток-киллеров определяли при подсчете числа зон гемолиза, приходящихся на одно поле зрения в десяти подсчитанных полях в левой камере и сравнивали с относительным количеством лимфоцитов, так же приходящихся на одно поле зрения в сосчитанных десяти полях в правой камере препарата.

Подсчет гематологических показателей проводился по общепринятым методикам.

Морфологические особенности клеток исследовали после окрашивания препаратов методом Романовского-Гимза под микроскопом.

Используемые в работе сыворотки (иммунная сыворотка против мембран эритроцитов, антитимоцитарная сыворотка, иммунная сыворотка против головного мозга мышей) получали сами, методики их получения подробно описаны в данной главе.

Клеточные популяции разделяли центрифугированием в специально задаваемых градиентах, основываясь на разной плотности разных популяций клеток.

При исследовании ответной реакции организма на гипоксическую гипоксию разного уровня мышей содержали в герметичной камере (барокамере). Состояние разряжения достигалось при помощи насоса, который постоянно откачивал воздух. Уровень разряжения контролировался барометром. Мы использовали разряжение равное 0,75 атм. и 0,5 атм. В гипоксической камере мыши находились в клетке с

запасом еды и питья. Рацион питания мышей соответствовал их нормальному рациону в условиях вивария. Замена чистой клетки и пополнение запасов пищи проводилось достаточно быстро, в течение 10-15 мин, и животные находились практически непрерывно в условиях гипоксии весь необходимый для эксперимента срок.

Перед началом любого эксперимента определяли жизнеспособность клеток лимфоидной системы при помощи 0,125% раствора трипанового синего и 4,25% раствора NaCl, которые смешивали в соотношении 4:1 и добавляли к равному объему смеси клеток.

Весь экспериментальный материал был обработан статистически с подсчетом ошибки и оценкой доверительно интервала с использованием критерия Стьюдента.

Глава третья посвящена исследованию морфологической и фенотипической принадлежности изучаемой нами популяции клеток киллеров аутологических эритроцитов.

Исследовалась морфология лимфоцитов-киллеров в фиксированных препаратах у мышей и у людей. Оказалось, что все клетки морфологически практически идентичны и представлены лимфоцитами различных размеров, в основном малыми.

С целью изучения фенотипических характеристик исследуемых нами клеток мы применили стандартные подходы по соотнесению популяции этих клеток с известным типом имму но логически компетентных клеток. При этом была исследована их адгезивная способность, наличие какого-либо специфического антигена - поверхностного маркера, возможность участия рецепторов мембраны клеток в механизмах взаимодействия с другими популяциями клеток, исследование их действия при инкубации клеток с предполагаемыми клетками-мишенями в препаратах in vitro.

Известно, что клетки, имеющие разную поверхностную структуру, обладают разной способностью прикрепляться к какой-либо поверхности, т.е. обладают разной адгезивной способностью. При разделении клеток иммунной системы на колонках с нейлоновой ватой отмечается, что по мере элюирования жидкости с

колонки во фракциях растет число В лимфоцитов, т.е. В лимфоциты обладают наиболее высокой адгезивной способностью. В первых фракциях выделяются Т лимфоциты и их предшественники.

Через колонку с нейлоновой ватой пропускались клетки тимуса, костного мозга и селезенки мышей и выделялись две фракции клеток: не прилипающих к вискозной вате - это первая фракция, и прилипающих к вискозной вате - это вторая фракция. Затем поставили с этими фракциями клеток препараты для обнаружения зон гемолиза. Оказалось, что практически все зоны локального гемолиза концентрируются в препаратах с клетками не прилипающими к вискозной вате (фракция 1). Во фракции клеток, прилипающих к вискозной вате (фракция 2) практически не обнаружены зоны локального гемолиза.

Следовательно, интересующие нас клетки концентрируются во фракции клеток, прилипающих к вате, что полностью исключает их принадлежность к В лимфоцитам, и они могут быть отнесены только к Т лимфоцитам или их предшественникам.

Это предположение подтверждается проведенными исследованиями по обработке клеток костного мозга мышей антитимоцитарной сывороткой (АТС). Обнаружили ингибирование феномена взаимодействия между клетками-киллерами и аутологическими эритроцитами после обработки клеток-киллеров АТС на 52,5% по сравнению с контролем (обработка нормальной сывороткой), что так же позволяет отнести популяцию наших клеток к популяции Т лимфоцитов или их предшественников.

Были проведены эксперименты по возможности участия поверхностных структур лимфоцитов-киллеров в процессе распознавания ими аутологических эритроцитов.

Оказалось, что при инкубации in vitro при 37°С лимфоцитов и эритроцитов в присутствии комплемента (эксперимент проводился как на периферической крови и органах мышей, так и на периферической крови людей) происходило разрушение эритроцитов, пропорциональное количеству инкубируемых с ними лимфоцитов, которое регистрировалось по количеству выделенного гемоглобина (микрометод такой регистрации описан в главе П). Кроме этого, обработка лимфоцитов-

киллеров ферментами, такими как папин и трипсин, дезинтегрирующими поверхностные структуры мембраны лимфоцитов, обнаружила зависимость количества зон гемолиза от ферментативной обработай.

По результатам экспериментов можно предположить, что взаимодействие между эритроцитами и исследуемыми нами клетками протекает по наиболее древнему механизму, свойственному системе иммунитета, механизму киллер-мишень, следовательно, мы можем сузить классовую принадлежность интересующих нас клеток и считать, что они относятся к популяции предшественников Т клеток.

Для дальнейшего исследования фенотшшческих характеристик популяции клеток, образующих зоны гемолиза с аутологическими эритроцитами, мы обрабатывали такие клетки в препаратах костного мозга, как главного иммунологического органа, сывороткой против ТЪу-1 антиген. Анализ полученных данных показывает значительное, на 90,8%, снижение численности зон гемолиза после обработки клеток такой сывороткой по сравнению с контролем (обработка клеток нормальной сывороткой). Это снижение численности зон гемолиза уменьшалось пропорционально увеличению разведений сыворотки. Специфичность ингибирования доказана восстановлением численности зон гемолиза при обработке клеток костного мозга анти-ТЪу-1 сывороткой, специфически истощенной антигенами головного мозга. Такое специфическое ингибирование клеток свидетельствует о том, что клетки костного мозга, образующие зоны гемолиза с аутологическими эритроцитами в качестве антигенного маркера несут на своей поверхности антиген распознающий рецептор, а именно ТЪу-1 -антиген. По этому маркеру можно отличить предшественники Т лимфоцитов и нормальные киллеры.

На основании полученных данных по изучению морфологических и фенотшшческих характеристик исследуемой нами клеточной популяции мы сделали вывод о том, что это популяция клеток, называемых нормальными (естественными, природными) киллерами (НК), которая играет существенную роль в иммунологическом надзоре. Механизм их действия требует непосредственного межклеточного контакта, распознавания определенных антигенных детерминант, а

затем взаимодействия рецепторов мембран клеток, участвующих в данном процессе. В дальнейшем мы будем называть клетки, образующие зоны гемолиза с эритроцитами нормальными киллерами аутологических эритроцитов (НКАЭ).

В главе четвертой, мы исследовали взаимодействие нормальных киллеров с эритроцитами в условиях различных стресс-воздействий на организм: массивная кровопотеря, воздействие токсического агента (кобальтовой соли), гипоксическая гипоксия разного уровня, а так же их взаимодействие с эритроцитами разного возраста.

При исследовании динамики численности НКАЭ, формирующейся после массивной кровопотери, мы обнаружили достоверное увеличение количества этих клеток уже через три часа после стресс-воздействия.

Кровопускание проводили у 18 беспородных кроликов весом от 2,5 до 3,5 кг в количестве 2% от массы тела. Кровь брали из ушной вены, в течение 15-20 мин кролики теряли около 40 % от общего объема крови. Количество НКАЭ достигало максимума на 3 сутки после начала эксперимента (достоверность р<0,001). Затем число этих клеток снижалось.

Количество нормальных киллеров в периферической крови после кровопотери

25

Сутки______ -

%

20 15

10 5

а

Рис. 1

Результаты эксперимента представлены на Рис. 1

В настоящее время значительное внимание уделяется воздействию на организм химических соединений, потенциально опасных для здоровья. Число таких соединений в результате интенсивного развития производства в последнее время резко возросло. К ним относятся самые разнообразные соединения, загрязняющие среду, а также медикаменты, пищевые добавки, моющие и косметическое средства и многие другие вещества. Вызванные такими веществами экзогенные интоксикации занимают одно из первых мест среди заболеваний вообще. Важнейшей задачей наряду с предотвращением заболевания является его распознавание.

Соли тяжелых металлов относятся к классу соединений, оказывающих сильное токсическое воздействие. Они блокируют аминные, карбоксильные, тиоловые группы (ЭН) тем самым снижая почти в два раза биологическую активность ферментов. В результате такого воздействия протеины теряют многие реакционные и биологические свойства, что в конечном итоге приводит к нарушению белкового, углеводного и жирового обмена, разрушает структуру клеточных мембран и, как следствие, усиливает выход из клеток ионов калия и проникновение в них ионов натрия. Результатом в конечном итоге является нарушение равновесия организма с внешней средой, нарушение гомеостаза. Необходимо отметить, что каким бы ни было первичное токсическое повреждение, оно в конечном итоге приводит к нарушению жизненно важных функций организма, среди которых первое место занимает обеспечение обмена кислородом.

Мы исследовали динамику НКАЭ при оценке возникновения стресовой ситуации в организме, обусловленной действием токсического агента (в нашем случае это была соль кобальта). Исследование влияния кобальтовой соли на организм является актуальным в связи с возможностью отравления солями тяжелых металлов, являющимися яркими представителями ядовитых соединений и представляющими угрозу для здоровья человека и животных.

Эксперимент проводили на 10 беспородных кроликах. Кобальт в виде хлористой соли, приготовленной на 0,85% растворе ЫаС1, предварительно перекристаллизованной и высушенной вводили кроликам парентерально. С каждой

такой инъекцией кролики получали по 3 мг соли хлористого кобальта на 1 кг массы тела. Всего было сделано 26 инъекций. Кроликов наблюдали в течение 43 суток.

Анализ экспериментальных данных показывает, что в ответ на инъекции кобальта у кроликов наблюдается достоверное увеличение численности НКАЭ по отношению к фоновым значениям уже через 24 часа после инъекций. После 26 инъекции количество НКАЭ уменьшилось до фонового значения. Результаты эксперимента представлены на Рис.2.

Количество нормальных киллеров при многократных введениях кобальта

Рис.2.

Такое увеличение количества НКАЭ может служить сигналом о возникновении в организме стрессовой ситуации. Наличие подобного теста особенно важно при исследовании токсического стресса в силу того, что он имеет ряд особенностей. Главная особенность состоит в том, что стресс-реакция, особенно в начале интоксикации, часто маскируется типичными для данного яда

симптомами отравления, и только в дальнейшем проявляются общие биохимические и функциональные сдвиги, характерные для соответствующей стадии стресса, как универсальной ответной реакции организма.

Следующим агентом, создающим стресс-ситуацию, была выбрана гипоксическая гипоксия, причем исследования проводились для гипоксии разного уровня с целью оценки глубины стресс-воздействия.

Мы исследовали воздействие гипоксической гипоксии на мышах. Состояние гипоксии вызывали у мышей путем содержания их в барокамерах с пониженным давлением кислорода.

Адаптация к гипоксии является одним из важнейших видов адаптации, поскольку она обеспечивает приспособление организма к существованию при пониженном содержании кислорода или при невозможности утилизации кислорода, имеющегося в достаточном количестве. Она непосредственно связана с функционированием одной из самых важных систем поддержания гомеостаза -системы дыхания.

Мышей-самок линии (СВАхс57В16)Р1, 2-4 месячного возраста подвергали действию непрерывной гипоксии 0,5 атм. и 0,75 атм. В обоих случаях обнаружено достоверное (р<0,0001) возрастание количества НКАЭ по сравнению с фоновыми значениями, как в периферической крови так и в селезенке, костном мозге и тимусе мышей. При гипоксии 0,5 атм. отмечается достоверное увеличение НКАЭ (р<0,01) уже через 10 часов после гипоксического воздействия, и к 10 суткам достоверное (р<0,01) снижение их численности, а при гипоксии 0,75 атм. оказалось, что имеется два пика, соответствующих росту числа НКАЭ по сравнению с фоном. А именно достоверное увеличение (р<0,05) числа НКАЭ через 3 часа после гипоксического воздействия и на 6 сутки после гипоксического воздействия.

Результаты эксперимента представлены на Рис.3.

Количество нормальных киллеров при гипоксической гипоксии разного уровня

Рис.3.

При гипоксической гипоксии, равной 0,5 атм. происходит более быстрое формирование популяции НКАЭ в ранние сроки, а при меньшем уровне гипоксии, соответствующем 0,75 атм., максимум формирования популяции НКАЭ приходится на более поздние сроки.

Независимо от природы индуцирующего фактора, будь то кровопотеря, инъекции кобальтовой соли, или гипоксическая гипоксия, организм отвечал стереотипной реакцией увеличения числа НКАЭ. Причиной, вызывающей такое увеличение во всех случаях явилась гипоксия организма, вызванная в одном случае массивной кровопотерей, в другом интоксикацией, а в третьем нарушением функции дыхания, в результате обеднения воздуха, вдыхаемого животными.

Кинетические характеристики в органах повторяли динамику клеток, характерную для периферической крови.

Одновременно с исследованием динамики численности НКАЭ контролировали следующие гематологические показатели: эритроциты, лейкоциты, ретикулоциты и гематокрит. Рост количества ретикулоцитов всегда наблюдался после пика численности НКАЭ, что вполне согласуется с известной взаимосвязью процессов воспроизводства и разрушения клеток красной крови: В данном случае в ответ на усиленный гемолиз эритроцитов со стороны НКАЭ костный мозг

продуцирует молодые эритроидные клетки (ретикулоциты), происходит запуск важнейшей адаптационной реакции - эритропоэза.

Таким образом, существует ответная реакция организма на разную степень гипоксического воздействия, отражающаяся на динамике формирования популяции нормальных киллеров аутоэритроцитов.

Мы показали, что при различных стрессовых ситуациях, таких как гипобарическая гипоксия, кровопотеря кобальтовая анемия происходит достоверное возрастание количества нормальных киллеров аутологических эритроцитов как в периферической крови так и в центральных органах иммунной системы, причем их число зависит от вида и глубины этого воздействия.

В основе всех этих стереотипных реакций в ответ на стрессовую ситуацию лежит гипоксия организма разной этиологии, и ее степень определяет быстроту воздействия. Кинетика численности НКАЭ является хорошо воспроизводимой при повторных исследованиях. Определение числа нормальных киллеров аутологических эритроцитов может служить тестом для быстрого обнаружения наличия стресс-ситуации в организме человека и животных.

Мы провели серию экспериментов по взаимодействию НКАЭ с аутологическими эритроцитами разного возраста, причем как состарившимися физиологическим путем, так и ускоренно состарившимися.

Активно функционируя в организме, эритроцит проходит ряд стадий от молодого до старого эритроцита, сопровождающихся изменением его физико-химических свойств. Время жизни эритроцитов, детерминированное генетически, может меняться как в результате внутриклеточных нарушений, так и под воздействием внеклеточных факторов самой разной природы.

Нами впервые показано, что НКАЭ по-разному взаимодействуют с разновозрастными популяциями аутологических эритроцитов, и механизм этого взаимодействия зависит от антигенных детерминант мембраны эритроцитов, но не зависит от причин, вызвавших старение эритроцитов, что в конечном счете означает появление антигенной разнокачественности эритроцитов.

Исследовали количество НКАЭ в периферической крови и органах интактных мышей и в периферической крови практически здоровых людей с двумя

фракциями эритроцитов разного возраста: молодые и старые эритроциты. Показано, что количество НКАЭ, взаимодействующих с популяцией старых эритроцитов достоверно (р=0,95) выше их количества с молодыми эритроцитами.

Разделение эритроцитов на возрастные группы и отделение их от кариоцитов проводили по плотности центрифугированием, т.к. с возрастом удельный вес эритроцитов возрастает. Лимфоциты периферической крови людей выделяли в градиенте плотности раствора фикол-верографин.

Количественные характеристики взаимодействия нормальных киллеров с аутологическими эритроцитами в препаратах тимуса, селезенки и костного мозга мышей, а также периферической крови людей.

Рис.4.

Результаты эксперимента представлены на Рис.4.

Антигенную разнокачественность разновозрастных эритроцитов подтверждают также данные по исследованию взаимодействия НКАЭ с молодыми эритроцитами, обработанными сывороткой против их мембраны.

Кроликов иммунизировали препаратами мембран молодых эритроцитов, полученными по стандартной методике с целью получения иммунной сыворотки. Получили сыворотку с цитотоксическим титром 1/50. Молодые эритроциты инкубировали с этой сывороткой, затем отмывали по стандартной методике. В результате как видно из Рис.5 НКАЭ практически перестали различать молодые и

старые эритроциты. Ряд 2 соответствует количеству НКАЭ со старыми эритроцитами, Ряд 3 соответствует количеству НКАЭ с молодыми эритроцитами.

Обработка иммунной сывороткой против мембран молодых эритроцитов очевидно лишала эритроциты возрастной антигенной специфичности в распознавании нормальными киллерами.

Аналогичный результат обнаружен при обработке фракции молодых эритроцитов 0,1% раствором трипсина. Данные представлены на Рис.6.

Исскуственное старение эритроцитов при обработке фракции молодых эритроцитов сывороткой против их мембраны.

0.1 . 0,09 ' 0,08 •■' * 0,07 -2 0,06 К 0,05 | 0,04 ж 0,03 0,02 - ' 0,01 -0*-

1

-Ряд1 Ряд2 РядЗ

3 4

разведения сыворотки

Рис.5

Уменьшение продолжительности жизни эритроцитов и их преждевременное разрушение могут быть результатом ряда различных внешних воздействий на организм в целом, например, попадание токсических веществ, гипоксия, острая кровопотеря. Мы показали, что в таких стрессовых для организма условиях в первую очередь разрушаются старые эритроциты, т.е. экологический стресс может стимулировать изменение времени жизни клеточной популяции, которое можно сравнить с ускоренным старением.

Влияние дезинтеграции гликопротеидов мембраны эритроцитов на активность НК

1.6

1,4

1.2

0.8

амэ ■ сэ

0,6 -

0,4

0,2 -

О

Количество НК в тимусе мышей

Количество НК в костном мозге мышей

Количество НК в периферической крови людей

Рис.6.

В заключении сформулированы основные результаты, полученные в работе.

Нами предложен универсальный метод экспресс-оценки развития стрессовой ситуации в организме человека и животных по количеству нормальных киллеров аутологических эритроцитов (НКАЭ). Увеличение числа НКАЭ в ответ на различные стресс-воздействия является универсальной и стереотипной ответной реакцией организма с целью поддержания его гомеостаза. С помощью этого метода мы можем не только обнаружить начальные стадии формирования стрессовой ситуации, но и проследить за ее развитием, а так же оценить уровень повреждающего воздействия. Информация о количестве НКАЭ в совокупности с другими стандартными гематологическими показателями позволяет предложить методы по коррекции терапии. Область применения этого метода не ограничена какими-то определенными рамками, т.к. он позволяет определить наличие стрессовой ситуации для самых разных повреждающих агентов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Нормальные киллеры аутологических эритроцитов (НКАЭ) представлены лимфоцитами различного диаметра, в основном малыми лифоцитами, не адгезирующимися на нейлоновой вате и имеющими в фенотипе 1Ъу-1 антиген.

2. НКАЭ избирательно взаимодействуют и в первую очередь разрушают «старые» функционально неполноценные эритроциты.

3. Численность НКАЭ в крови при стресс-воздействиях имеет специфическую динамику, временные характеристики которой не зависят от природы стресс-фактора, а зависят от глубины его воздействия.

4. Динамика численности НКАЭ в крови является высокочувствительной информативной стереотипной универсальной адаптационной реакцией организма в ответ на стресс-воздействие, направленной на поддержание гомеостаза системы эритрон.

5. Предложен количественный экспресс-метод идентификации стресс-ситуации в организме по динамике численности НКАЭ в крови (по количеству НКАЭ в крови), который может быть использован для оценки экологической ситуации и в клинической практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 .Пухова Я.И., Гительзон И.И., Терсков И.А., Аникина А.Я., Пономаренко Л.Д. Торможение эритропоэза при угнетении феномена аутоиммунного бляшкообразования // Доклады Академии наук СССР. - 1975. - Том 225, № 4. -С.955-957.

2.Пухова Я.И., Гительзон И.И., Терсков И.А., Аникина А.Я., Пономаренко Л.Д.. Кислородная зависимость кинетики формирования популяции аутоиммунных бляшкообразующих клеток в крови, костном мозге и селезенке // Известия Сибирского отделения Академии наук СССР. -1976. - Серия биологических наук. -Выпуск 1. - С.145-151.

3.Пухова Я.И., Терсков И.А., Пономаренко Л.Д., Аникина А.Я. Механизм взаимодействия АБОК с эритроцитами в аутоиммунном гемолизе in vitro // Механизмы регуляции в системе крови. - Красноярск, 1978. - С.72-73

4.Пухова Я.И., Пономаренко Л.Д. Межклеточное взаимодействие в аутологической системе лимфоцит-эритроцит как модель иммунологических механизмов поддержания стационарного состояния клеточных популяций // Материалы I Всесоюзного биофизического съезда. Тезисы докладов стендовых сообщений. - 1982. Москва. - С. 157.

5.Пухова Я.И., Терсков И.А., Лукьянова Е.Ю., Пономаренко Л.Д. Распознавание эритроцитов различных возрастных групп иммунокомпетентными аутологическими лимфоцитами-киллерами // Гуморальная регуляция эритропоэза. -Красноярск. - 1982. - С.47-51.

6.Пухова, И.А. Терсков, Л.Д.Пономаренко. Нормальные лимфоциты-киллеры в механизме избирательного физиологического распознавания и деструкции старых эритроцитов //Доклады Академии наук СССР. - 1984. - Том.277, № 2. - С.509-512.

7.Пономаренко Л.Д.. Кинетические характеристики кроветворения при фенилгидразиновой анемии у мышей // Коррекция гомеостаза. Материалы VII Всероссийского симпозиума по гомеостазу. Красноярск. - 1996. - С.93-94.

8.Пономаренко Л.Д. Влияние фенилгидразина на кроветворение у мышей // Сборник тезисов докладов Всесоюзной научно-практической конференции «Проблемы химико-лесного комплекса». - 1996. - Красноярск. - С. 134.

9.Пономаренко Л.Д. Ответная реакция организма на гипоксию как фактор стресс-воздействия // Проблемы экологии человека на Севере. Материалы научной конференции, посвященной 20-летию Института медицинских проблем Севера СО РАМН. - 1996. - С.43.

Ю.Пономаренко Л.Д. Количественные характеристики взаимодействия нормальных киллеров с аутологическими эритроцитами разного возраста // -Гомеостаз и окружающая среда. - 1997. - Материалы VTII Всероссийского симпозиума по гомеостазу. - Красноярск. - С. - 78-80.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пономаренко, Людмила Давидовна, Красноярск

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КРАСНОЯРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ \ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

Пономаренко Людмила Давидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ЧИСЛЕННОСТИ НОРМАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ЭРИТРОЦИТОВ КАК ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА СТРЕСС-ВОЗДЕЙСТВИЕ

03.00.16 - экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

Научный руководитель-доктор биологических наук Я.И. Пухова

.. /

Красноярск - 1997

п # !Г

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА I СОВРЕМЕННЫЙ ВЗГЛЯД НА СТРЕСС И ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ 4

НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА.

1.1. Формирование концепции стресса и анализ адаптационных возможностей организма............. 11

1.2. Свойства лимфоцитов-киллеров, участвующих в неспецифической ответной реакции на стресс-воздействие.............................. 21

1.3. Изменения антигенных детерминант эритроцитов в процессе их функционирования ... 27

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Методика определения и подсчета клеток-киллеров в препаратах эритроцитов периферической крови с лимфоцитами периферической крови и органов.......................... 35

2.2. Методы разделения клеток............................... 37

\

2.3.Получение иммунной сыворотки против мембран эритроцитов............................................... 38

2.4. Получение антитимоцитарной сыворотки...... 39

2.5. Получение иммунной сыворотки против

клеток головного мозга мышей............................... 40

2.6. Источники комплемента, используемого в

экспериментах......................................................................................................................40

2.7. Обработка клеток ферментами..................................................41

2.8. Определение гематологических

показателей................................................................................................................................42

2.9. Методы создания гипоксического

состояния......................................................................................................................................43

2.10. Используемые животные и \

экспериментальный материал..................................................................43

2.11 .Обработка экспериментальных данных..................44

ГЛАВА III ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОЦЕССЕ РАСПОЗНАВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

\

3.1. Постановка препаратов в свободной суспензии клеток на стекле для наблюдения зон

локального гемолиза................................................. 45

3.2. Исследование морфологической принадлежности клеток-киллеров аутологических эритроцитов................................... 46

3.3. Исследование адгезивных свойств клеток-киллеров аутологических эритроцитов.................. 50

3.4. Исследование природы рецепторовЧслеток-киллеров, взаимодействующих с аутологическими эритроцитами............................. 52

3.5. Исследование цитотоксического действия лимфоцитов против аутологических 4 эритроцитов........................................................... 60

ГЛАВА IV ФОРМИРОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ НОРМАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ЭРИТРОЦИТОВ В ОТВЕТ НА РАЗЛИЧНЫЕ СТРЕСС-ВОЗДЕЙСТВИЯ.

4.1. Формирование популяции НКАЭ гцэи

массивной кровопотере............................................ " 64

4.2. Формирование популяции НКАЭ при многократных введениях кобальта......................... 67

4.3. Формирование популяции НКАЭ при гипоксической гипоксии разного уровня.............. 72

4.4. Исследование взаимодействия нормальных киллеров с аутологическими эритроцитами

разного возраста..............................................................................................................81

\

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 87

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 92

ЛИТЕРАТУРА 93

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Общенаучная значимость проблемы экологического равновесия и адаптации выдвигают экологию в разряд интенсивно развивающихся медикЬ-биологических дисциплин. В свою очередь развитие экологии не представляется возможным без познания молекулярно-клеточных механизмов ответной реакции организма на изменение экологической ситуации. В связи с этим исключительный интерес представляет возможность экспресс-оценки возникновения в организме стресс ситуации в ответ на повреждающее воздействие и ее коррекция. Сложность этой задачи усугубляется генетическим разнообразием ответных реакций каждого индивидуума. Генотип влияет как на вероятность тех или иных повреждений, так и на степень их компенсации и репарации: Изыскание способов оценки глубины повреждающего действия стресс-фактора и оценки адаптации к нему организма является актуальной проблемой современной экологии, физиологии и медицины. Актуальность этой проблемы усугубляется с ростом урбанизации, связанной с концентрацией населения.

Функциональная нагрузка, вызванная действием факторов внешней среды, тесно связана с изменениями на самом глубоком

V

генетическом уровне. Именно там происходит увеличение синтеза нуклеиновых кислот и белков, и как следствие формирование структурного следа в системах, специфически ответственных за адаптацию организма к данному конкретному фактору среды. Суть системного следа состоит в том, что растет масса мембранных структур, ответственных за восприятие клеткой управляющих

сигналов, ионный транспорт, энергообеспечение и других. Таким образом организм приобретает в ходе адаптации отсутствующую ранее устойчивость к определенному фактору внешней среды и создание условий дальнейшей жизни при изменившихся условиях среды. Потенциальные генетически детерминированные возможности организма преобразуются в ответ на требования внешней среды.

В нашей работе мы придерживаемся определения стресса, данного Се лье Г. Он указывает на универсальный характер стресса и считает, что стресс - это «состояние, выражающееся синдромом всеобщей адаптации», это «неспецифическая реакция организма на любое предъявленное ему требование». Селье полагает, что любое воздействие не организм вызывает стресс, а отсутствие этих воздействий есть смерть.

В процессе эволюции в организме человека сформировалась

сложная система защитных приспособлений, позволяющих ему без

\

вреда для своего здоровья взаимодействовать с различными факторами внешней среды, в которой он живет и действует. Диапазон безопасных воздействий среды ограничен спецификой вида, задаваемой его генотипом и нормой адаптации индивида, определяемой его фенотипом. Кроме того, существует индивидуальность каждого человека в пределах его генотипа, а следовательно собственная норма адаптации. В экстремальных для организма условиях включаются адаптивно-компенсаторные

V

механизмы, обеспечивающие приспособление 4 организма к повышенным нагрузкам с целью сохранения гомеостаза.

Иммунная система одной из первых реагирует на изменение экологической ситуации с помощью своих неспецифических и

специфических реакций. Система иммунитета являётся достаточно гибкой системой, и может корректировать реакции организма на повреждающие факторы появившиеся вновь, с которыми человек ранее не встречался.

В свою очередь система эритрон, включающая и клетки иммунной системы является наиболее чувствительной к стресс-воздействию и, следовательно, удобной моделью для понимания формирования компенсаторных механизмов, обуславливающих в конечном итоге процессы разрушения и воспроизводства клеток в ответ на изменения привносимые внешними или внутренними повреждающими агентами. Результатом любого стресс-воздействия является в конечном счете гипоксия тканей и органов, что в свою очередь, как известно, приводит в системе крови к ускоренному разрушению эритроцитов.

Целью настоящей работы является исследование динамики численности нормальных киллеров аутологических эритроцитов

(НКАЭ) как одного из высокочувствительных информативных тестов

\

оценки в организме стресс-ситуации. Задачи исследования:

1. Исследование свойств НКАЭ.

2. Исследование динамики численности НКАЭ в крови животных в ответ на стресс-воздействия вызванные кровопотерей, действием солей тяжелых металлов (хлористый кобальт) и гипоксической гипоксией.

3. Исследование механизмов взаимодействия НКАЭ с эритроцитами. \

Диссертационная работа состоит из настоящего введения, четырех глав, заключения и выводов.

Первая глава носит обзорный характер. В ней рассматриваются различные теоретические подходы и накопленный к настоящему времени фактический материал по вопросам ответной реакции организма на стресс-воздействие со стороны внешней среды, а также современные представления о клетках иммунной системы, участвующих в описанной нами реакции.

Во второй главе приводятся методики, используемые автором в настоящем исследовании.

Главы третья и четвертая посвящены изучению свойств нормальных киллеров, ответственных за разрушение аутологических эритроцитов, и исследованию динамики численности этих клеток в ответ на стресс-воздействия, а так же исследованию избирательности взаимодействия этих клеток со старыми функционально неполноценными эритроцитами.

В заключении обсуждены основные результаты исследований, полученные в работе, которые сформулированы в разделе выводы.

Новизна и фундаментальность работы. Впервые описана

V

высокочувствительная стереотипная информативная реакция, выражающаяся в увеличении численности нормальных киллеров аутологических эритроцитов в ответ на стресс-воздействия, которая имеет определенные динамические характеристики.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для оценки экологической ситуации с целью обнаружения в организме человека стрессового состояния, а так же в

практической медицине для оценки тяжести состояния больного и эффективности проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту.

Решение поставленных задач привело к следующим основным принципиально новым результатам, которые "имеют важное фундаментальное и практическое значение и выносятся автором на защиту:

1) Предложен количественный метод экспресс оценки возникновения в организме человека и животных стресс-ситуации по количеству в крови нормальных- киллеров аутологических лимфоцитов.

2) Установлена избирательная киллерная активность НКАЭ в отношении «старых» функционально неполноценных эритроцитов.

3) Показано, что описанная в работе ответная реакция организма на стресс-воздействие, проявляющаяся в увеличении числа НКАЭ к периферической крови, является универсальной адаптационной реакцией организма, направленной на поддержание гомеостаза системы эритрон.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в девяти печатных работах.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1989г.); на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза» (Красноярск, 1996г.); на VIII Всероссийском симпозиуме «Гомеостаз и окружающая среда» (Красноярск, 1996г.); «Проблемы экологии человека на Севере» (Красноярск, 1996г.); на Всесоюзных научно-практических конференциях «Проблемы химико-лесного комплекса» (Красноярск, 1996, 1997).

В заключение приношу глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Я.И.Пуховой за постановку задачи и большую помощь в работе, а также коллективу сектора иммунологии Института биофизики РАН, где была выполнена работа.

\

\

\

\

\

\

и

ГЛАВА!

СОВРЕМЕННЫЙ ВЗГЛЯД НА СТРЕСС И ОДИН ИЗ

МЕХАНИЗМОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ОТВЕТЦОЙ РЕАКЦИИ

\

ОРГАНИЗМА

1.1. Формирование концепции стресса и анализ адаптационных

возможностей организма

В настоящее время отмечается значительный интерес к проблемам экологии, что связано с нарастанием антропогенного воздействия на окружающую среду. Общенаучная важность проблемы экологического равновесия и адаптации4 выдвигают эту науку в разряд интенсивно развивающихся медико-биологических дисциплин. Следует отметить комплексный характер экологии как области научных и прикладных исследований. Сейчас не представляется возможным ее развитие без познания клеточных и молекулярных механизмов ответной реакции организма на изменение окружающей среды. Воздействие отрицательных факторов окружающей среды на организм человека обуславливает глубокие нарушения на организменном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях II/. В связи с этим исключительно важным является изыскание информативных тестов, позволяющих в довольно ранние сроки оценить возникновение стресс ситуации в организме человека в ответ на повреждающее воздействие и провести необходимую коррекцию.

Существует достаточно много методов оценки изменения здоровья человека в ответ на нарушение экологического равновесия. Введен термин - состояние здоровья населения, позволяющий оценить изменения на популяционном уровне 121. Но индикатор состояния здоровья населения, который дает хорошие прогностические результаты относительно адаптации человека к тем или иным условиям внешней среды, не позволяет оценить момент появления в организме чрезвычайной стрессовой ситуации, а следовательно, не может быть использован для оперативного управления экологической ситуацией. Кроме того, этот метод дает хорошие результаты для оценки состояния здоровья населения по уровню адаптированности к условиям окружающей среды при анализе достаточно большого числа взаимодействующих параметров /3, 4, 51. Особую актуальность в связи с этим приобретает разработка информативных экспресс тестов индикации стресс-состояния. Кроме того популяционный анализ проблемы адаптации, который дает возможность оценки состояния здоровья населения через состояние антропоэкологического напряжения не дает информации о состоянии отдельного индивида. Такой анализ требует описания и оценки множества признаков и взаимодействующих между собой факторов. Безусловно этот метод, называемый методом корреляционной адаптометрии, является весьма информативным и позволяет делать выводы относительно воздействия множественных ^факторов среды на организм по уровню их скоррелированности, который оказывается значительно выше в самом процессе адаптации, чем в состоянии адаптированности. В качестве меры скоррелированности используется показатель, называемый весом корреляционного графа.

Этот метод удачно применялся, например, для оценки антропоэкологического напряжения при краткосрочной адаптации к условиям Крайнего Севера /3/, исследовании адаптивных изменений секреторной функции желудка, традиционной для европейского и коренного населения Севера, при исследовании раннего постнатального периода /6, 7, 8/.

Возможность быстрой оценки повреждения в системе в ответ на изменение внешних условий неразрывно связана с о^нкой процессов старения организма, если принимать за старение «процессы, делающие индивидуум, по мере того как он становится старше, более чувствительным к различным факторам, внутренним и внешним, которые могут привести к смерти» /4/. Изменения, которые возникают в процессе старения носят неблагоприятный характер, они повышают вероятность гибели животного, в конечном итоге старение ведет к уменьшению способности животных и человека

приспосабливаться к окружающей среде. Факторы среды оказывают

\

влияние на старение как на популяционном уровне, так и на тканевом и органном уровне. Например, в условиях сухости организм будет терять воду, что изменит осмотическое давление и ионный состав жидкостей тела, а это в свою очередь отрицательно скажется на клеточных функциях. На молекулярном уровне внешняя среда будет влиять на характер и частоту молекулярных повреждений и таким образом сокращение жизни /5/. Безусловно, реакция на повреждающие события тесно связана с генотипом индивидуума. Он влияет как на вероятность тех или иных повреждений, так и на степень их компенсации и репарации /9, 10, 11, 12/.

В индустриальном обществе существует реальная опасность

V

загрязнения окружающей среды и соответственна растет число факторов влияющих на жизнь человека и животных и оценка уровня такого воздействия, а также возможности прогнозирования ситуации представляется совершенно необходимой. Именно на молекулярном уровне в первую очередь происходят изменения функций организма и оценка этих изменений предполагает наличие некоторого теста, позволяющего эти изменения оценит количественно.

В целом, вызванный любым фактором среды стресс внешне выглядит как генерализованная реакция мобилизации охватывающая весь организм.

Организм при действии на него различных раздражителей физической или химической природы реагирует появлением неспецифических признаков. На эту особенность первым обратил внимание Г.Селье (1936). Селье выдвинул оригинальную концепцию о возникновении стрессовой ситуации, заставив тем самым обратить внимание и пересмотреть взгляды на вопрос возникновения состояния болезни /13, 14, 15, 16/.

С проблемой стресса человек столкнулся очень давно, .когда обнаружил, что реакции организма на продолжительное непривычное и суровое испытание протека