Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур

Гаврилов, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур"

На правах рукописи УДК 576.315.42

003454757

ГАВРИЛОВ Алексей Александрович

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ДОМЕНА а-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003454757

Работа выполнена в лаборатории Структурно-функциональной организации хромосом Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Разин C.B.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Карпов В.Л.

кандидат биологических наук Максименко О.Г.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт белка РАН, Пущино

Защита диссертации состоится 19 ноября 2008 года в 12 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу:

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 17 октября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, л

канд. фарм. наук c^^^cJiTrzH^t^ Грабовская Л.С.

ог.1цая характеристика работы

Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов, контролирующих активацию транскрипции глобиновых генов в эритроидных клетках кур. Домен а-глобиновых генов кур, наряду с доменами глобиновых генов других позвоночных животных, в течение многих лет является моделью для изучения механизмов регуляции транскрипции. В предшествующих работах идентифицирован сложный комплекс регуляторных элементов, контролирующих работу этого геномного домена. Однако до сих пор остается неясным, как эти регуляторные элементы взаимодействуют друг с другом, обеспечивая активацию транскрипции глобиновых генов и переключение их экспрессии по ходу развития организма Довольно давно была предложена гипотеза, постулирующая, что удаленные регуляторные элементы напрямую взаимодействуют с промоторами контролируемых ими генов. К сожалению, до последнего времени отсутствовал экспериментальный подход, позволяющий проверить эту гипотезу. В настоящее время такой подход (метод фиксации конформации хромосомы, ЗС) существует. Мы использовали этот подход для того, чтобы выяснить, каким образом изменяется пространственная конфигурации домена а-глобиновых генов при переходе его в потенциально-активное состояние и, далее, при начале экспрессии глобиновых генов. Полученные результаты расширяют наши знания о механизмах регуляции транскрипции у высших эукариот, что и определяет актуальность настоящей работы. В более узком плане, работа актуальна еще и потому, что раскрывает ряд важных особенностей регуляции экспрессии именно глобиновых генов, нарушения в работе которых вызывают тяжелые заболевания человека и хозяйственно-важных домашних животных.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов активации транскрипции а-глобиновых генов у курицы. Для раскрытия этих механизмов мы решили выяснить, происходит ли пространственное взаимодействие каких-либо регуляторных элементов домена между собой и с промоторами а-глобиновых генов в условиях, когда домен неактивен, и изменяется ли пространственная конфигурация домена при активации транскрипции глобиновых генов. Для ответа на эти вопросы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Отработать систему искусственной дифференцировки культивируемых куриных пре-эритробластов в эритроциты.

2. Используя полученную систему, с помощью метода фиксации конформации хромосомы (ЗС) изучить пространственную организацию домена а-глобиновых генов в клетках до и после активации транскрипции глобиновых генов.

3. Сравнить пространственную организацию домена а-глобиновых генов в культивируемых эритроидных клетках с таковой в нормальных куриных эритроцитах и клетках неэритроидного происхождения.

Научная новизна и практическая ценность работы. Уже более пяти лет метод ЗС (Chromosome Conformation Capture, в переводе с англ. «фиксация коиформации хромосомы») активно применяют во всем мире для изучения пространственных взаимодействий между различными участками генома. В России,однако,-использование-данного-метода-до-последнего-времени-не увенчивалось успехом. В ходе диссертационной работы были преодолены все технические трудности, связанные с проведением экспериментов, поставлены необходимые контроли и получены достоверные, воспроизводимые результаты. В работе рассмотрены теоретические основы метода ЗС с уделением особого внимания проблемам, с которыми сталкивается исследователь при проведении ЗС-анализа, и путям их решения.

Сама работа посвящена изучению пространственной организации домена а-глобиновых генов кур. Хотя подобные исследования уже проводились для некоторых геномных локусов, среди которых и домен а-глобиновых генов мыши, настоящее исследование имеет ряд преимуществ. Так, впервые было осуществлено сравнение пространственной конфигурации домена а-глобиновых генов в нескольких типах клеток, включая культивируемые пре-эритробласты, не экспрессирующие глобиновые гены, и те же клетки после индукции терминальной эритроидной дифференцировки, в ходе которой глобиновые гены начинают активно экспрессироваться. Такое сравнение позволило нам проследить за изменениями в пространственной организации домена, напрямую связанными с активацией транскрипции глобиновых генов, и, таким образом, выявить регуляторные элементы ДНК, контролирующие смену транскрипционного статуса домена. Результаты работы подтверждают важную роль коммуникации между удаленными участками генома в регуляции экспрессии генов.

В нескольких последних публикациях была отмечена эволюционная консервативность организации доменов а-глобиновых генов различных позвоночных животных. В данной работе впервые показано, что ключевые регуляторные события, происходящие на уровне пространственной организации домена а-глобиновых генов при активации транскрипции, различаются для птиц и млекопитающих. Более того, в настоящей работе впервые продемонстрировано избирательное взаимодействие удаленного энхансера только с одним из двух функционально связанных активных промоторов, расположенных поблизости друг от друга.

Диссертационная работа вносит существенный вклад в развитие представлений о стурктурно-функциональной организации эукариотического генома. С другой стороны, несмотря на четко выраженный фундаментальный характер, работа представляет интерес и с практической точки зрения. Новые знания о механизмах, контролирующих экспрессию генов, могут быть использованы в биотехнологии, в частности, при создании трансгенных животных.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 10-ой международной школе-конференции «Биология - наука

XXI века» (Пущино, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на конференциях «Workshop on Protein-nucleic acid interactions of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow» (Суздаль, 2007; Москва, 2008; Гиссен, Германия, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей — 3, тезисов докладов и материалов конференций — 6.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего 260 источников.

Результаты исследований

Клеточная модель для сравнительного ЗС-анализа домена а-глобиновых генов кур. В настоящей работе были использованы культивируемые эритробласты кур (линия HD3). Изначально клетки этой линии были получены путем трансформации куриных пре-эритробластов вирусом птичьего эритробластоза, содержащего онкоген v-erbA и мутантный температуро-чувствительный онкоген v-erbB (Beug et al., 1982). Клетки HD3 бесконечно делятся и не экспрессируют глобиновые гены, однако домен а-глобиновых генов имеет «открытую» хроматиновую конфигурацию и подготовлен к запуску транскрипции (Razin et al., 2004). Онкоген v-erbA может быть инактивирован при повышенных pH, тогда как онкоген v-erbB - при повышенных температурах. При инактивации обоих онкогенов клетки вступают в дифференцировку - прекращают пролиферировать и начинают продуцировать глобины. Для индукции дифференцировки клетки HD3 были инкубированы при pH 8.0 и 42°С в присутствии индуктора iso-H-7 (ингибитор протеинкиназы С, дополнительно способствующий индукции (Nicolas et al., 1991)). После индукции клетки HD3 прекращали пролиферировать (рис. 1 В). Для установления доли клеток, продуцирующих гемоглобин, клетки были окрашены бензидином. Гемоглобин-содержащие (бензидин-позитивные) клетки были обнаружены в небольшом количестве уже в неиндуцированной культуре (< 1%). Увеличение доли бензидин-позитивных клеток наблюдалось между 4-ым и 9-ым часами индукции; на 9-ом часе доля таких клеток составляла 4%, на 14-ом часе - 21% и на 30-ом часе - 62% (рис. 1 Д). Доля живых клеток была определена по результатам окрашивания клеток трипановым синим и составляла 90, 65, 43 и 12% соответственно на 10-ом, 23-ьм, 40-ом и 67-ом часах индукции (рис. 1 Г). Через разное время после начала индукции из клеток была выделена тотальная клеточная РНК и проведена Нозерн-блот гибридизация с использованием проб, узнающих мРНК, кодируемые глобиновыми генами л, aD и аА. Результаты гибридизации ясно показывают, что уровень мРНК «взрослых» глобиновых генов а° и аА начинает расти уже в первые 4 часа после начала индукции, достигает максимума в

ЖяМИМ 1 . '

■ гайв

0,4

20 40

100.

а'

к -О- аА

-О- а°

Ь-- -¿г-л

Рисунок 1. Индукция эритроидной дифференцировки клеток НОЗ. (А) и (Б) Нозерн-блот анализ РНК, изолированной из клеток ПТ40 и НЭЗ через разные итервалы времени после начала индукции. (А) Гель после электрофореза РНК, окрашенный бромистым этидием. М -

маркерная РНК (0 24, 1 35, 2 37, 4 40, 7 46 тн) Для клеток HD3 над дорожками указано время (часы) после начала индукции (Б) Авторадиограмма, показывающая результата гибридизации проб, узнающих мРНК генов л, aD и аА, с блотами, соответствующими обведенным в рамку участкам в секции «А» (В-Д) Изменения в плотности клеточной суспензии (В), доле живых клеток (Г) и доле содержащих гемоглобин клеток (Д) в ходе индукции Линии погрешностей соответствуют стандартному отклонению от величины среднего по трем независимым экспериментам (Е) Относительное количество рРНК (18S + 28S) в образцах (Ж) Относительное количество глобиновой мРНК в образцах (3) Количество глобиновой мРНК, нормализованное по отношению к количеству рРНК

районе 19 часов и далее постепенно падает, таким образом, наглядно демонстрируя, как волна синтеза РНК предшествует волне синтеза белка (рис. 1 Б и Ж). Динамика накопления мРНК генов а° и аА прослеживается яснее после нормализации результатов на количество рРНК в образцах (рис. 1 3), которое постепенно снижается как результат гибели клеток в культуре (рис. 1 А и Е). Эмбриональный а-глобиновый ген л практически не транскрибируется при индукции (рис. 1 Б и Ж). Это кажется закономерным, так как линия клеток HD3 получена из эритробластов взрослых кур. В культивируемых лимфоидных клетках кур (линия DT40) не транскрибируется ни один из а-глобиновых генов (рис. 1 Б).

Какие бы регуляторные механизмы не задействовались в активации генов а° и аА в индуцированных клетках HD3, эти механизмы должны запускаться до начала транскрипции. Белковые комплексы, собирающиеся при активации транскрипции, по всей вероятности, сохраняют свою структуру, пока продолжается транскрипция. Учитывая это, было решено провести сравнительный ЗС-анализ домена а-глобиновый генов в неиндуцированных клетках HD3 и индуцированных клетках HD3 на 12-ом часе индукции. В этот момент общий уровень транскрипции а-глобиновых генов в культуре (судя по скорости аккумуляции мРНК) близок к максимальному, но все еще продолжает расти. Нарастание уровня транскрипции может отражать тот факт, что в популяции присутствуют клетки, которые только начинают транскрипцию глобиновых генов, поскольку индукция дифференцировки не происходит абсолютно синхронно. Кроме того, это может свидетельствовать об интенсификации транскрипции в тех клетках, где она уже идет. Таким образом, на 12-ом часе индукции домен а-глобиновых генов должен иметь пространственную конфигурацию, типичную для клеток, активно транскрибирующих глобиновые гены или начинающих транскрипцию. Принимая во внимание, что биологические процессы, идущие в трансформированных клетках, не всегда отражают таковые в нормальных клетках, пространственная структура домена была проанализирована и в нормальных эритроцитах 10-дневных куриных эмбрионов. Ранее было показано, что в этих клетках экспрессируются «взрослые» глобиновые гены а° и аА и не экспрессируется эмбриональный ген л (Weintraub et al., 1981). Для более точной интерпретации результатов, полученных для эритроидных клеток, в исследование были включены лимфоидные клетки линии DT40, в которых домен а-глобиновых генов не подготовлен для транскрипции.

Количественный ЗС-анализ домена а-глобиновых генов кур: принцип метода и контрольные эксперименты.

Основы метода ЗС. Метод «Chromosome Conformation Capture», или сокращенно ЗС, был разработан для анализа пространственной организации протяженных участков генома в живых клетках. В основе данного метода лежит фиксация ДНК-белковых комплексов формальдегидом in vivo с последующим расщеплением ДНК эндонуклеазами рестрикции и религированием полученных фрагментов при низкой концентрации ДНК. В таких условиях предпочтительно лигируются фрагменты, находящиеся в составе одного ДНК-белкового комплекса, но не случайные фрагменты. Продукты лигирования анализируются и «подсчитываются» с помощью полимеразной цепной реакции (рис. 2). Частота сшивки двух специфических рестриктных фрагментов, оцениваемая количеством соответствующего продукта лигирования, пропорциональна частоте, с которой эти два фрагмента взаимодействуют друг с другом в ядерном пространстве. Таким образом, ЗС анализ предоставляет информацию о пространственной организации изучаемых участков генома in vivo (Dekker et al., 2002; Tolhuis et a!., 2002).

клетки

Г\

лигирование при низкой ... концентрации

41 ДНК

сшивка

очистка

1 формальдегидом ^

\ рестрикция

о —- О 1

лизис клеток и —■* »4 У

удаление непришитых * белков с помощью ПЦР

ЭРЭ

Рисунок 2. Основные этапы ЗС-анализа. Живые клетки обрабатывают формальдегидом и лизируют с помощью БОБ, после чего добавляют тритон Х-100 (не показано) и переваривают ДНК эндонуклеазой рестрикции (тритон повышает эффективность работы фермента в присутствии БОЗ). Фрагменты ДНК религируют при низкой концентрации ДНК. Продукты лигирования очищают и анализируют с помощью ПЦР.

До последнего времени для анализа продуктов лигирования широко применяли методы полуколичественного ПЦР. Однако, достаточно часто необходим более точный подсчет частот лигирования, что возможно лишь с применением техники ПЦР в реальном времени. С другой стороны, одинакого

важным является контроль специфичности ПЦР амплификации. По этим причинам в ЗС-анализе все чаще используют технику ПЦР в реальном времени со специфическими пробами, такими как ТацМап (Уегшттеп е/ а/., 2005).

Праймеры для амплификации подбирают на концах рестриктных фрагментов так, чтобы 3'-конец праймера был обращен к концу фрагмента (рис. 3). Как правило, все праймеры подбирают на одной и той же стороне (левой или правой) фрагментов с тем, чтобы они были направлены в одну сторону. С помощью таких праймеров анализируются продукты лигирования по типу «голова-к-голове» и «хвост-к-хвосту». Однонаправленность праймеров исключает возможность образования ПЦР-продуктов на матрице недорасщепленной ДНК. Один праймер выбирается в качестве «якоря» и поочередно используется для ПЦР со всеми другими праймерами. TaqMan-пробы для ПЦР в реальном времени подбирают ниже якорного праймера на самом конце рестриктного фрагмента. Таким образом, одна и та же ТацМап-проба может быть использована для всех ПЦР с данным якорным праймером.

Данные ЗС-анализа обычно представляют в виде графика зависимости частоты сшивки якорного рестриктного фрагмента с другими фрагментами (эта частота выражается количеством соответствующих продуктов лигирования) от позиции этих других фрагментов в локусе. Повышенная частота сшивки говорит о взаимодействии фрагментов друг с другом (рис. 3).

ТадМап взаимодействие

Позиция (КЬ)

Рисунок 3. Представление и интерпретация данных ЗС-анализа. Разобран гипотетический случай. График отражает зависимость частоты сшивки (ось 0У) якорного рестриктного фрагмента (показан темно-серым) с другими фрагментами (показаны светлосерыми) изучаемой области генома (черная линия в верхней части графика). Вертикальные линии соответствуют позициям рестриктных сайтов. Праймеры и ТачМап-проба, которые могут быть использованы для оценки частот сшивки, показаны над графиком (овалом обозначен якорный праймер). При получении кривой с заполненными точками делается вывод об отсутствии взаимодействия якорного фрагмента с какими-либо фрагментами локуса. При получении кривой с незаполненными точками делается вывод о взаимодействии фрагмента «а» с фрагментами «Ь» и «с». Однако мы все же не можем сказать, одновременное ли это взаимодействие (а+Ь+с) или суперпозиция попарных взаимодейтсвий (а+Ь и а+с).

Подбор рестриктаз, праймеров и ТадМап-проб В первой серии экспериментов по ЗС-анализу домена а-глобиновых генов кур мы использовали комбинацию эндонуклеаз рестрикции В§111 и ВатН1. Эти ферменты узнают различные последовательности (АвАТСТ и вОАТСС), но продуцируют совместимые концы-ДНКгкоторые могут-лигироваться друг^с-другом.-Схема домена а-глобиновых генов кур, демонстрирующая позиции глобиновых генов и важных регуляторных элементов, а также ВатН1/В§1П-рестрикционная карта домена приведены на рис. 5 А. Видно, что такие элементы, как МЯЕ (главный регуляторный элемент), промотор гена домашнего хозяйства ССТНВА, участок начала репликации (оп), промоторы а-глобиновых генов, эритроид-специфичный «downstream»-энxaнcep, локализуются в различных рестриктных фрагментах. Во второй серии экспериментов мы использовали рестриктазу МЬо1. Этот фермент узнает последовательность вАТС, то есть как ВашН1- и В§1П-сайты, так и 14 других гексонуклеотидных последовательностей. В результате домен расщепляется на более мелкие фрагменты. МЬо1-рестрикционная карта домена приведена на рис. 6 А.

Позиции праймеров и ТаяМап-проб, использованных для анализа продуктов лигирования, показаны над рестрикционными картами. Они были подобраны таким образом, чтобы составить два однонаправленных эррея - для анализа локуса а-глобиновых генов и контрольного локуса, соответственно (см. «Контроль качества и количества ДНК в ЗС-образцах»).

Количественный ПЦР-анализ продуктов лигирования Чтобы определять количество ДНК-матрицы по интенсивности ПЦР-сигнала, необходимо учитывать, что с разными праймерами амплификация может проходить с разной эффективностью. Для оценки эффективности праймеров необходима матрица, в которой для каждой пары праймеров было бы одинаковое количество матрицы для амплификации. Для получения такой матрицы мы использовали ДНК искусственной бактериальной хромосомы (ВАС), несущей целый домен а-глобиновых генов с фланкирующими областями. Бакмида была переварена рестриктазами ВатН1 и В§111 или рестриктазой БаиЗА (изошизомер МЬо1, нечувствительный к <Зат-метилированию) и религирована при высокой концентрации ДНК, обеспечивающей эффективное межмолекулярное лигирование. Полученный препарат представлял собой эквимолярную смесь всех возможных продуктов лигирования рестриктных фрагментов исследуемого участка куриного генома и был использован для определения относительного количества продуктов лигирования в ЗС-образцах.

Количественный анализ продуктов лигирования был осуществлен с использованием техники ПЦР в реальном времени с TaqMan-пpoбaми. TaqMan-проба - это олигонуклеотид, отжигающийся между прямым и обратным праймерами и несущий на 5'-конце флуоресентный краситель (в нашем случае РАМ), а на 3'-конце или внутри пробы - гаситель флуоресценции (в нашем случае ВН(2-1). В ходе реакции амплификации полимераза расщепляет пробу, что приводит к разобщению флуорофора и гасителя и наросту флуоресценции

(рис. 4 Г). Данные амплификации выводятся в виде графика зависимости интенсивности флуоресценции от цикла амплификации (рис. 4 А).

Флуоресцентный краситель Гаситель флуоресценции

обратный праймер

Рисунок 4. ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами (А-В) Количественный анализ продуктов лигирования Разобран гипотетический случай (А) и (Б) Нормальная и логарифмическая зависимости интенсивности флуоресценции (ось 0Y) от цикла амплификации (ось ОХ) при использовании в качестве матрицы разведений бакмидного стандарта (тонкие кривые от темного оттенка для неразведенного образца до светлого оттенка для самого разведенного образца) или опытного ЗС-образца (толстая линия) Флпорог - пороговая флуоресценция Стопыт - пороговый цикл для опытного ЗС-образца Участок экспоненциального нароста флуоресценции затенен (В) Калибровочная кривая для определения относительного количества продукта лигирования в ЗС-образце (Г) Принцип метода ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами

Каждая пара праймеров была использована для амплификации ДНК шести последовательных 5-ти кратных разведений эквимолярной смеси продуктов лигирования, приготовленной на основе бакмиды (бакмидный стандарт). Для каждого разведения был определен так называемый «пороговый цикл» (threshold cycle, Ст) - цикл, при котором флуоресценция достигала некого фиксированного значения в пределах экспоненциальной фазы нароста флуоресценции («пороговая флуоресценция») (рис. 4 А). Для удобства мы использовали графики с логарифмичекой шкалой ординат, на которых экспоненциальная фаза видна как участок линейности (рис. 4 Б). По полученным данным была построена калибровочная кривая, отражающая зависимость Ст от количества ДНК-матрицы. Для получения линейной зависимости использовалась логарифмическая шкала количеств ДНК (в отн. ед.); зависимость представляли в обратных координатах (рис. 4 В). В параллели

с бакмидным стандартом реакцию амплификации проводили на ЗС-образцах. Полученные значения Ст (Ст-опыт) были наложены на калибровочную кривую, что позволяло определять относительные количества того или иного (в зависимости от использованной пары праймеров) продукта лигирования в ЗС-образцах.-Для - получения более -точной -калибровочной - кривойгучитывающей вклад всех последовательностей генома в реакцию амплификации, концентрация ДНК в бакмидных разведениях была доведена до концентрации ДНК ЗС-образцов посредством добавления переваренной и религированной куриной геномной ДНК. Все ЗС-образцы тестировались в двух разведениях (как правило, двукратных), с тем чтобы проверить, действительно ли получаемые по калибровке значения различаются во столько же раз, во сколько раз различается количество ДНК в разведениях. Каждая реакция амплификации была выполнена в четырех повторах, и соответствующие результаты усреднялись. Для унификации условий реакций, проводимых в разное время, все компоненты реакции, за исключением 7а<у-полимеразы, были разделены на порции и хранились замороженными непосредственно до постановки реакции. Для проверки воспроизводимости результатов все эксперименты, начиная с манипуляций с живыми клетками, были повторены как минимум дважды.

Контроль специфичности ПЦР-амплификации Для того чтобы убедиться, что праймеры эффективно работают для амплификации только одного, целевого, учаска генома, многие из пар праймеров были протестированы в обычной полимеразной цепной реакции с последующей детекцией продуктов аплификации в агарозном геле. В качестве матрицы для амплификации была использована ДНК ЗС-образцов и, как контроль, ДНК бакмидного стандарта без добавления геномной ДНК (см. «Количественный ПЦР-анализ продуктов лигирования»). Было показано, что праймеры работают достаточно специфично (результаты представленны в диссертации).

Оценка эффективности рестрикции. Поскольку рестрикция осуществляется в присутствии ЗОБ, и переваривается не чистая ДНК, а ДНК, сшитая с белками, эффективность рестрикции может быть невысокой и, кроме того, неодинаковой для разных сайтов изучаемого участка генома, что будет влиять на количество специфических продуктов лигирования. Поэтому необходимо было оценить эффективность рестрикции на различных участках ДНК в пределах изучаемой области генома. С этой целью был использован ПЦР-стоп-анализ. Было показано, что эффективность расщепления ДНК разными рестриктазами, по разным сайтам и в разных типах клеток достаточно схожа и составляет около 80% (то есть из всех сайтов рестрикции около 20% остались нерасщепленными) (результаты представлены в диссертации).

Контроль качества и количества ДНК в ЗС-образцах Еще один важный контроль касается тех случаев, когда необходимо сравнивать результаты ЗС-анализа, полученные для клеток различного типа. Дело в том, что качество и количество ДНК, приготовляемой при ЗС-анализе из исходно равного количества клеток различного типа, может различаться: с самого начала может по-разному пройти фиксация и лизис клеток, могут наблюдаться различия не

только в эффективности рестрикции, но и лигирования. Для нормировки данных необходимо провести ЗС-анализ участка генома, который предположительно имеет одинаковую пространственную организацию во всех типах клеток, используемых в работе. Обычно в качестве таких участков выбирают гены домашнего хозяйства, транскрипционный статус которых не меняется в зависимости от типа клеток. Полученные данные свидетельствуют об успешности экспериментальных процедур и используются для нормировки данных ЗС-анализа изучаемого участка генома для каждого типа клеток (Splinret et al., 2004).

В качестве подобного контроля нами был проведен ЗС-анализ участка куриного генома, расположенного достаточно близко к домену а-глобиновых генов (13-23 Kb выше MRE), но в пределах гена домашнего хозяйства CGTHBA (рис. 5 А и 6 А, «контрольная область»). Мы проанализировали три пары рестриктных фрагментов в случае BamHI/BglII-рестрикции и две пары в случае Mbol-рестрикции (результаты представлены в диссертации). Полученные в каждом случае величины частот лигирования были усреднены и условно приняты за 1.

Хотя нет веских оснований полагать, что ген домашнего хозяйства может иметь различную пространственную организацию в лимфоидных и эритроидных клетках, такая возможность не может быть полностью исключена в связи с близостью гена к ткане-специфичному генному домену. Поэтому мы выполнили ЗС-анализ для другого гена домашнего хозяйства, расположенного на другой хромосоме в окружении повсеместно экспрессирующихся генов (ген ERCC3) (результаты представлены в диссертации). Полученные соотношения частот лигирования были очень схожи с соотношениями, вычисленными на основании ЗС-анализа гена CGTHBA.

Отрицательные контроли. В качестве отрицательного контроля ЗС-анализ был выполнен без добавления формальдегида на стадии фиксации клеток или без добавления лигазы на этапе лигирования. Полученная ДНК была амплифицирована, как в обычном эксперименте. Было показано, что в образцах, приготовленных из клеток, не обработанных формальдегидом, некоторое количество продуктов лигирования все же может быть обнаружено. Вероятнее всего, они образуются в результате межмолекулярного лигирования, которое на низком уровне может проходить в разбавленном растворе. В отсутсвтии лигазы продукты лигирования не детектировались (результаты представлены в диссертации).

Сравнение пространственной организации домена а-глобиновых генов в неэритроидных клетках кур и трансформированных эритроидных клетках кур до и после начала транскрипции глобиновых генов. В течение многих лет домен а-глобиновых генов кур служит моделью для изучения механизмов регуляции транскрипции у высших эукариот (Weintraub et al., 1981; Recillas-Targa and Razin, 2001; Razin and Ioudinkova, 2007). Помимо трех глобиновых генов а-типа (эмбриональный ген л и «взрослые» гены а° и аА) домен содержит ряд регуляторных элементов, расположенных как выше (Flint

—©— индуцированные НйЗ И неиндуцированные НЭЗ А ОТ40

Рисунок 5. ВатН1/1^111-ЗС-анализ домена а-глобиновых генов в неэритроидных и трансформированных эритроидных клетках кур. (А) Схема домена а-глобиновых генов кур (выше) и ВатН1/1^Ш-рестрикционная карта домена (ниже). На схеме: красные

downstream энхансер

MRE

CGTHBA

TaqMan-пробы

праимеры

контрольная область

50 60

Позиция (Kb)

40 50 SO

Позиция(Kb)

50 60

Позиция (Kb)

50 60

Позиция (Kb)

50 60

Позиция(Kb)

50 60

Позиция (Kb)

прямоугольники - а-глобиновые гены, зеленый прямоугольник - ген ССТНВА (белые участки соответствуют экзонам, стрелками показано направление транскрипции); красные овалы - МЯЕ и энхансер; толстая черная стрелка —9КЬ ЭНБ; квадратная рамка - Срв-островок; синяя окружность - участок начала репликации (оп). На карте: короткие насечки -сайты 1^111, длинные насечки - сайты ВашН1; точка «О» соответствует началу последовательности ДНК АУО16020 (йепеВапк), размерность шкалы представлена в т.п.н. Позиции праймеров и TaqMan-пpoб, использованных для ЗС-анализа, отмечены соответственно галочками и черточками над картой. (Б-Ж) Относительные частоты сшивки

между якорными рестриктными фрагментами, несущими (Б) - МЯЕ, (В)--9КЬ ОНв, (Г) -

СрО-островок, (Д) - промотор гена а°, (Е) и (Ж) - ген аА, и другими фрагментами домена. Ось X показывает позиции рестриктных фрагментов в соответствии со шкалой рестрикционной карты. В верхней части каждого графика дана схема домена с такой же символикой, как и в секции «А». Темно-серые прямоугольники на заднем фоне со значком якоря сверху демонстрируют позицию якорного фрагмента, светло-серые прямоугольники -тест-фрагментов. Границы между соседними фрагментами обозначены серыми линиями. Ось У показывает частоты сшивки между анализируемыми фрагментами, нормализованные относительно частот сшивки между фрагментами из контрольной области. Линии погрешностей соответствуют стандартному отклонению от величины среднего по трем независимым экспериментам.

-9. №

downstream . энхансер

TaqMan-пробы праймеры iinini

1 1 1 ш(ии ....... 1 I1" 1 алшад

■ни ц>илиа-ш «и ащцашааац.......

контрольная область

50 60

Позиция (Kb)

индуцированные HD3

неиндуцированные HD3

55 56

Позиция (Kb)

К— DT40

Рисунок 6. МЬо1-ЗС-анализ домена а-глобиновых генов в неэритроидных и трансформированных эритроидных клетках кур. (А) Схема домена а-глобиновых генов кур (выше) и МЬо1-рестрикционная карта домена (ниже). Обозначения на схеме такие же, как на рисунке 5. (Б и В) Относительные частоты сшивки между якорными рестриктными фрагментами, несущими (Б) - промотор гена а°, (В) - промотор гена аА, и другими фрагментами домена. Обозначения на графиках такие же, как на рисунке 5.

et al., 2001; Razin et al., 2000; Razin et al., 1999; Vyas et al., 1995), так и ниже (Knezetic and Felsenfeld, 1989) кластера генов. Подобный области контроля

локуса главный регуляторный элемент (Major Regulatory Element, MRE) домена а-глобиновых генов кур расположен в интроне гена домашнего хозяйства CGTHBA на расстоянии около 20 т.п.н. перед геном я, первым в кластере а-глобиновых генов. Промотор этого гена домашнего хозяйства локализуется внутри CpG-островка на расстоянии около 4 т.п.н. перед геном ж. Внутри гена

CGTHBA-картирован-ряд-эритроид-специфичных-участков

гиперчувствительности к ДНКазе (DHS) (Flint et al., 2001; De Moura Gallo et al., 1992; Razin et al., 1994). Некоторые из них колокализуются с такими регуляторными элементами, как MRE (Flint et al., 2001) и инсуляторы (Valadez-Graham et al., 2004). Значение других до настоящего времени не установлено. На расстоянии около 1 т.п.н. за геном аА (последним геном кластера а-глобиновых генов кур) расположен эритроид-специфичный энхансер (Knezetic and Felsenfeld, 1989). Взаимное расположение всех перечисленных регуляторных элементов представлено на схеме (рис. 5А).

В первом цикле экспериментов мы проанализировали взаимодействие главного регуляторного элемента MRE с нижележащими фрагментами (за исключением очень маленьких фрагментов). Для этого в качестве якорного был использован праймер (с соответствующей TaqMan-пробой), отжигающийся на рестриктном фрагменте, содержащем MRE. В лимфоидных клетках DT40 частота сшивки якорного фрагмента, несущего MRE, с остальными фрагментами резко уменьшалась с увеличением дистанции между тестируемыми фрагментами и далее оставалась достаточно низкой (рис. 5 Б, зеленая кривая с точками треугольной формы). Это типично для участков хроматина, не организованных в петли (Tolhuis et al., 2002). Напротив, уже в пролиферирующих (неиндуцированных) клетках HD3 чатота сшивки якорного фрагмента, несущего MRE, с большинством нижележащих фрагментов домена а-глобиновых генов была значительно выше. В особенности это касалось участка, включающего промотор гена а°, и достаточно протяженной области, перекрывающей CpG-островок и эрироид-специфичный участок гиперчусвтительности к ДНКазе I, расположенный на расстоянии 9 т.п.н. перед геном л (-9Kb DHS) (рис. 5 Б, синяя кривая с квадратными точками). Частота вазимодействия MRE с -9Kb DHS, CpG-островком и промоторой областью гена aD (оцениваемая частотой сшивки соответствующих рестриктных фрагментов) увеличивалась при индукции терминальной эритроидной дифференцировки клеток HD3 (примерно в 3.5, 2 и 4.5 раза для каждого из указанных выше элементов, соответственно) (рис. 5 Б, красная кривая с круглыми точками). Помимо этого в дифференцирующихся (индуцированных) клетках HD3 детектировалось взаимодействие между MRE и эритроид-специфичным энхансером, расположенном за кластером глобиновых генов («downstream»-энхансер). Интересно, что MRE не взаимодействовал с генами я и а4 ни в пролиферирующих, ни в индуцированных клетках HD3. В отношении гена аА это был неожиданный результат, поскольку этот ген активно транскрибируется в клетках HD3 (см. рис. 1 Б, Ж и 3). Для подтверждения этого результата мы проанализировали частоты лигирования для противоположного конца

рестриктного фрагмента, содержащего ген ал. С этой целью был подобран праймер обратной ориентации, отжигающийся на левом конце этого фрагмента (рис. 5 А). Частоты лигирования фрагмента, содержащего MRE, с обоими концами фрагмента, несущего ген аА, практически не отличались.

В следующей серии экспериментов «якорь» был последовательно перенесен на фрагменты, содержащие -9Kb DHS, CpG-островок, промотор гена aD и ген aA. Результаты этих экспериментов, показанные на рис. 5 В-Ж, в целом подтвердили выводы, сделанные из экспериментов с «якорем» на MRE. Кроме того, стало ясно, что в пролиферирующих клетках HD3 -9Kb DHS может образовывать комплекс с MRE, но не с промотором гена aD или энхансером, расположенным за кластером глобиновых генов (рис. 5 В и Д). В дифференциророванных клетках HD3 частота ассоциации между -9Kb DHS и MRE возратала примерно в 3 раза. В то же время этот элемент теперь можно было обнаружить в комплексе с промотором гена aD и нижележащим энхансером (сравнить красную и синюю кривые на рис. 5 В).

ЗС-анализ с «якорем», фиксированным на CpG-островке или промоторе гена aD, показал, что эти элементы взаимодействуют во всех трех клеточных моделях. При этом частота взаимодействия возрастала в следующем порядке: DT40 < пролиферирующие HD3 < дифференцирующиеся HD3 (рис. 5 Г и Д). Однако утверждение о том, что данное взаимодействие реализуется, напрямую зависило от данных, показывающих достаточно низкую степень ассоциации как CpG-островка, так и промотора гена aD с расположенным между ними геном 7t. Для проверки этих данных на левой стороне рестриктных фрагментов, содержащих вышеуказанные элементы, были подобраны праймеры обратной ориентации, и ЗС-анализ был выполнен с «якорем», фиксированным на гене п. Результаты анализа подтвердили вывод о слабой степени ассоциации гена л с CpG-островком и промотором гена aD (рис. 5 Г и Д, точки без линий погрешности).

В соответствии с результатами ЗС-анализа с «якорем», фиксированным на MRE, эксперименты с «якорем» на CpG-островке показали, что частота взаимодейстивия этих двух элементов примерно вдвое выше в дифференцирующихся клетках HD3 по сравнению с пролиферирующими клетками HD3 (рис. 5 Г, сравнить красную и синюю кривые).

Эксперименты с «якорем», фиксированным на правой или левой сторонах рестриктного фрагмента, включающего ген aA (рис. 5 Е и Ж, соответственно), показали, что этот ген не локализуется в непосредственной близости ни с одним из вышележащих регуляторных элементов.

Для повышения разрешения ЗС-анализа эксперименты с «якорем» на промоторе гена aD были провторены на образцах, приготовленных с использованием рестриктазы Mbol. С помощью этой рестриктазы 6 т.п.н. Bglll-Bglll фрагмент, включающий CpG-островок, был расщеплен на более мелкие фрагменты. В результате выяснилось, что промотор гена aD взаимодействует с CpG-островком per se (а точнее с 1 т.п.н. фрагментом, содержащим правую половину CpG-островка, в которой расположен промотор гена домашнего

хозяйства ССШВА) (рис. 6 Б). Частота ассоциации 0.8 т.п.н. фрагмента, несущего промотор гена а°, с 1 т.п.н. фрагментом, содержащим правую часть Срв-островка, была даже более высокой, чем таковая, расчитанная на основании данных по анализу больших по длине ВатН1/1^1П-фрагмептов (рис. -5-Г- и-Д)^Возможно,-В-данном-конкретном-случае-короткие-рестриктные фрагменты позиционируются в ДНК-белковом комплексе более подходящим для лигирования образом. Точно так же, с помощью рестриктазы МЬо1 1 т.п.н. ВатН1-В£Ш-фрагмент, включающий энхансер, расположенный за кластером глобиновых генов, был разделен на два субфрагмента, один из которых содержал основную часть энхансера. Именно это субфрагмент демонстрировал высокую степень ассоциации с промотором гена ав, тогда как второй, «пустой», субфрагмент с промотором не взаимодействовал (рис. 6 Б). Более важным, однако, представляется то, что различия между клетками ОТ40, пролиферирующими клетками НЕ>3 и дифференцирующимися клетками НОЗ, обнаруженные при проведении ЗС-анализа с использованием рестриктаз ВатН1 и В§1Н, хорошо воспроизвелись в экспериментах с МЬо1-рестрикцией. Однако рестриктаза МЬо1 расщепляет участок домена, включающий -9КЬ БНБ, на слишком маленькие фрагменты. Поэтому данный участок проанализировать не удалось. С другой стороны, при рестрикции МЬо1 промотор гена аА выщепляется в составе небольшого (0.35 т.п.н.) рестриктного фрагмента и, таким образом, может быть проанализирован отдельно от всего гена в отличие от ВатШ/В§1П-рестрикции, при которой ген аА целиком попадает в рестриктный фрагмент длиной 1.7 т.п.н. Частоты лигирования коротких рестриктных фрагментов, содержащих промоторы генов аА и а°, снова были достаточно низкими (принимая во мнимание близость рестриктных фрагментов в последовательности ДНК, что само по себе может обеспечивать повышенную частоту лигирования). Более того, при сравнении различных клеточных линий, включая лимфоидные клетки ЭТ40, значительных различий в частоте ассоциации промоторов генов аА и а° не обнаруживается (рис. 6 Б).

Принимая во внимание кажущееся отсутствие взаимодействия промотора гена аА со всеми протестированными вышележащими регуляторными элементами, мы решили проверить, не взаимодействует ли этот промотор с расположенным ниже энхансером. Был выполнен детальный ЗС-анализ 3'-концевой части домена, вкючающей участок от промотора гена аА до энхансера. При МЬо1-рестрикции данный участок расщепляется на серию фрагментов, шесть из которых имеют достаточный размер для того, чтобы их можно было анализировать с помощью метода ЗС. Результаты анализа взаимодействий между якорным рестриктным фрагментом, содержащим промотор гена аА, с остальными пьтью фрагментами показаны на рис. 6 В. Небольшой подъем в частоте сшивки между фрагментом, несущем промотор гена аА, и фрагментом, содержащим основную часть энхансера, был отмечен только в дифференцирующихся клетках НОЗ.

Анализ пространственной организации домена а-глобиновых генов в нормальных эмбриональных эритроцитах кур. Для того чтобы выяснить,

МР!Е =1=

50 60

Позиция(КЬ)

•Ь

-9 КЬ СрС ОНБ островок I

йоу*Т151геат

р. энхансер

50 60

Позиция (КЬ)

50 60

Позиция (КЬ)

эмбриональные эритроциты

Рисунок 7. ЗС-анализ домена а-глобиновых генов в нормальных эритроцитах 10-дневных куриных эмбрионов. (А) Схема домена а-глобиновых генов кур. Черные прямоугольники - а-глобиновые гены, серый прямоугольник - ген ССГНВА (белые участки соответствуют экзонам, стрелками показано направление транскрипции); черные овалы -

МЯЕ и энхансер; толстая черная стрелка--9КЬ БНЗ; квадратная рамка - СрО-островок;

серая окружность - участок начала репликации (оп). (Б-Ж) Относительные частоты сшивки между якорными рестриктными фрагментами, несущими (Б) - МЯЕ, (В) —9КЬ ОНЭ, (Г) -

CpG-островок, (Д) и (Ж) - промотор гена аи, (Е) - ген аА, и другими фрагментами домена (ЗС-анапиз выполнен с использованием (Б-Е) - рестриктаз ВашШ и BglH, (Ж) - рестриктазы Mbol) Обозначения на графиках такие же, как на рис 5

является ли пространственная конфигурация домена а-глобиновых генов похожей б дифференцирующихся клетках HD3 и нормальных эритроидных клетках, мы провели ЗС-анализ домена в эритроцитах 10-дневных куриных эмбрионов. У курицы переключение экспрессии глобиновых генов с эмбрионального на взрослый тип происходит примерно на 5-ый день эмбрионального развития. Таким образом, в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов экспрессируются «взрослые» глобиновые гены aD и аА, тогда как эмбриональный ген % уже неактивен (Weintraub et а!., 1981; Bruns and Ingram, 1973; Knezetic and Felsenfeld, 1993; Singal et al., 2002). Результаты ЗС-анализа, выполненного с использованием рестриктаз BamHI и Bglll, представлены на рис. 7 Б-Е. Можно видеть, что относительные частоты взаимодействия между MRE и нижележащими фрагментами очень похожи в дифференцирующихся клетках HD3 (рис. 5 Б, красная кривая) и нормальных эмбриональных эритроцитах (рис. 7 Б). Особое внимание следует обратить на низкую частоту взаимодействия MRE с генами п и аА в сравнении с частотой взаимодействия этого элемента с -9Kb DHS, промотором гена а° и нежележащим энхансером. ЗС-анализ с «якорем», фиксированным на -9Kb DHS (рис. 7 В) и CpG-островке (рис. 7 Г), также дал результаты, очень схожие с таковыми, полученными для дифференцирующихся клеток HD3 (рис. 5 В и Г, красная кривая). Когда в качестве якорного был использован рестриктный фрагмент, содержащий промотор гена а°, мы выявили достаточно высокую степень ассоциации этого фрагмента с геном аА (рис. 7 Д). Этот результат был подтвержден в экспериментах с «якорем» на гене аА (рис. 7 Е). Более того, по результатам, представленным на рис. 7 Е, можно сделать вывод о некоторой степени ассоциации между геном аА и нижележащим энхансером.

Для проверки этих результатов мы провели ЗС-анализ с ипользованием рестриктазы Mbol и в качестве якорного выбрали праймер, лежащий в рестриктном фрагменте, содержащем промотор гена aD. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в нормальных эмбриональных эритроцитах промотор гена aD действительно может взаимодействовать не только с энхансером, но и с промотором гена аА (рис. 7 Ж).

Обсуждение результатов

Для правильной интерпретации результатов настоящей работы необходимо иметь в виду, что проведенный нами ЗС-анализ позволяет количественно оценить только вероятность взаимодействия между теми или иными фрагментами изучаемого локуса. Следует принимать в расчет возможность чередования короткоживущих конфигураций домена в одних и тех же клетках. Кроме того, пространственная структура домена может отличаться для двух копий гомологичных хромосом в одной клетке, и для различных клеток, представленных в популяции. Для облегчения дискуссии мы

будем рассматривать только наиболее интересные пространственные конфигурации домена, типичные для изученных типов клеток. В то же время мы понимаем, что наиболее сложные конфигурации могут сосуществовать с другими, включая простейшую линейную конфигурацию.

Наиболее очевидный вывод из настоящей работы состоит в том, что пространственная организация домена а-глобиновых генов кур кардинально отличается в эритроидных и неэритроидных клетках. Даже в пролиферирующих клетках HD3, в которых глобиновые гены не экспрессируются, частота взаимодействия MRE с большинством нижележащих фрагментов домена а-глобиновых генов заметно выше по сравнению с таковой в неэритроидных клетках. Исключение представляют области генов зг и аА, а также участок, содержащий несколько CTCF-зависимых инсуляторов, который расположен 11-16 т.п.н. выше гена ж (Valadez-Graham et al, 2004). В дифференцирующихся клетках HD3 и нормальных эмбриональных эритроцитах частота ассоциации MRE со всеми рестриктными фрагментами, за исключением фрагмента, несущего ген ж, увеличена по сравнению с пролиферирующими клетками HD3.

Тщательный анализ частот лигирования различных фрагментов домена а-глобиновых генов кур в эритроидных и неэритроидных клетках позволил нам выделить несколько характерных пространсвенных конфигураций данного локуса. Первая конфигурация типична для лимфоидных клеток DT40 (рис. 8 А). В этих клетках было выявлено единственное взаимодействие — между промотором гена а° и CpG-островком, расположенном на расстоянии около 4 т.п.н. перед кластером а-глобиновых генов и содержащем промотор гена домашнего хозяйства CGTHBA (Flint et al., 2001; Klochkov et al., 2006) и участок начала репликации (Razin et al., 1986; Verbovaia and Razin, 1995). Это взаимодействие кажется нестабильным (короткоживущим), поскольку частота взаимодействия между промотором гена а° и CpG-островком значительно увеличивается в эритроидных клетках (в собенности, продуцирующих глобины). Таким образом, в неэритроидных клетках линейная форма домена а-глобиновых генов существует в равновесии с петлей, образующейся при взаимодействии промотора гена а° и CpG-островка. Этот результат противоречит наблюдениям, сделанным для домена а-глобиновых генов мыши, где промоторы а-глобиновых генов взаимодействуют с CpG-островками, окружающими домен, только в клетках, транскрибирующих глобиновые гены (Zhou et al., 2006). Вероятно, пространственная организация домена а-глобиновых генов в клетках, не экспрессирующих глобины, различна для курицы и мыши. Это может быть связано с различиями в крупномасштабной организации доменов. В самом деле, области консервативной синтении между доменами а-глобиновых генов курицы и мыши захватывают сравнительно небольшие участки генома в сравнении со значительно более протяженными областями консервативной синтении между доменами а-глобиновых генов различных млекопитающих (Tufarelli etal, 2004).

МРЕ

-9 КЬ Срв

ОНЭ остров л а° аАепИ

1 КЬ

неэритроидные клетки (вытянутая форма)

недифференцированные эритроидные клетки ("незрелые" хабы)

дифференциррованные эритроидные клетки (активный хаб)

Рисунок 8. Схематическое представление пространственной организации домена а-глобиновых генов кур в различных типах клеток. (А) Клетки ОТ40. (Б) Пролиферирующие клетки Ш)3. (В) Индуцированные в эритроидную дифференцировку клетки 1-ЮЗ и 10-дневные эмбриональные эритроциты. Схема сверху показывает позиции глобиновых генов и регуляторных элементов домена: МЯЕ - белый шестиугольник, -9КЬ ОШ - треугольник, Срв-островок - черный кружок, ген ж - белый прямоугольник, ген а° -серый прямоугольник, ген аА - черный прямоугольник, энхансер - звездочка. Крупные стрелки символизируют активный транскрипционный статус генов а° и аА.

В пре-эритробластах (пролиферирующие клетки НЭЗ) взаимодействие между промотором гена ас и Срв-островком становится более частым (или происходит в большей доле клеток). Кроме того, различные регуляторные

элементы начинают взаимодействовать друг с другом с образованием «незрелых» комплексов регуляторных элементов («хроматиновых хабов»). Анализ частоты взаимодействий различных рестриктных фрагментов, расположенных ниже MRE, показывает, что наиболее «сложный» хроматиновый хаб на данной стадии клеточной дифференцировки включает MRE, CpG-островок и промотор гена а° (рис. 8, Б). Важно подчеркнуть, что эксперименты с «якорем», фиксированным на различных рестриктных фрагментах, ясно продемонстировали, что все эти элементы взаимодействуют друг с другом. Таким образом, можно предположить, что они действительно формируют хроматиновый хаб. Однако это не исключает возможности, что этот хроматиновый хаб находится в динамическом равновесии с менее сложными ассоциатами указанных регуляторных элементов. Примечательно, что в пролиферирующих клетках HD3 участок гипречувствительности к ДНКазе I -9Kb DHS не входит в состав хроматиновго хаба, образованного с участием промотора гена aD и CpG-островка, однако может формировать независимый комплекс с MRE (рис. 5 В, синяя кривая). Таким образом, в пролиферирующих клетках HD3 домен a-глобиновых генов имеет одну из двух взаимоисключающих пространсвенных конфигураций, обусловленных альтернативным взаимодействием MRE с -9Kb DHS либо с промотором гена aD и CpG-островком (рис. 8 Б).

Любопытно, что в пре-эритробластах мыши активаторные белковые комплексы собраны на регуляторных элементах домена a-глобиновых генов, однако промоторы «взрослых» глобиновых генов не взаимодействуют с этими элементами до индукции дифференцировки (Vernimmen et al., 2007). Напротив, в куриных пре-эриробластах ассоциация между MRE, CpG-островком и промотором гена а ясно детектируется.

После индукции терминальной эритроидной дифференцировки клеток HD3 частота взаимодействия MRE, CpG-острока и промотора гена aD возрастает. Кроме того, к предсуществующему хроматиновому хабу привлекаются -9Kb DHS и энхансер, расположенный за геном аА. Похожая конфигурация домена a-глобиновых генов характерна и для нормальных эмбриональных эритроцитов, продуцирующих aD- и аА-глобиновые цепи. Таким образом, подключение -9Kb DHS и специфического энхансера -характерная особенность «активного» хроматинового хаба домена а-глобиновых генов кур (рис. 8 В). К сожалению, относительно -9Kb DHS не известно ничего особенно примечательного. Этот участок гиперчувствительности к ДНКазе I был картирован достаточно давно. При этом было показано, что он специфичен для эритроидных клеток и колокализуется с MAR-элементом (De Moura Gallo et al., 1992). Хотя общая организация доменов a-глобиновых генов различных позвоночных животных отличается эволюционной консервативностью (Tufarelli et al., 2004; Hughes et al., 2005), -9Kb DHS не локализуется в пределах консервативных между разными видами последовательностей ДНК, и в геноме мыши и человека не существует аналога этому DHS (Hughes et ah, 2005). По-видимому, этот элемент содержит сайты

связывания некоторых эритроид-специфичных транскрипционных факторов, участвующих в сборке «активного» хроматинового хаба, характерного для зрелых эритробластов, продуцирующих глобины. Мы провели компьютерный анализ последовательности ДНК в области -9Kb DHS и обнаружили 4 потенциальных сайта связывания эритроид-специфичных транскрипционных факторов GATAI и GATA2.

Во всех исследованых клеточных линиях мы не выявили взаимодействия эмбрионального а-глобинового гена к с какими-либо регуляторными элементами. Это кажется логичным, поскольку ген я не экспрессируется в дифференцирующихся клетках HD3 и эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов (рис. 1 Б и Ж; Weintraub et al., 1981). Более неожиданным стало наблюдаемое отсутствие ассоциации промотора гена аА с вышележащими регуляторными элементами, и, прежде всего, с MRE. В этой связи необходимо напомнить, что в дифференцирующихся клетках HD3 уровень транскрипции гена аА превышает таковой гена а° (рис. 1 Б, Ж и 3). То же верно и для 10-дневных эмбриональных эритроцитов (Brown and Ingram, 1974). Хотя частота взаимодействия MRE с геном аА в дифференцирующихся клетках HD3 и 10-дневных эмбриональных эритроцитах не достигала нулевого уровня, она была значительно меньше частоты взаимодействия MRE с промотором гена aD (рис. 5 Б и 7 Б). То же наблюдалось и для -9Kb DHS (рис. 5 В и 7 В) и CpG-островка (рис. 5 Г и 7 Г). Принимая во внимание тот факт, что промотор гена аА расположен на расстоянии 3 т.п.н. от промотора гена aD и на расстоянии 1.5 т.п.н. от энхансерного элемента, которые сами по себе взаимодействуют с вышележащими регуляторными элементами, кажется маловероятным, чтобы частота взаимодействия гена аА с вышележащими регуляторными элементами достигала столь же малых величин, как в лимфоидных клетках, даже если в действительности ген аА с этими элементами не взаимодействует. Вместе с тем, мы понимаем, что даже сравнительно маленькая частота сшивки еще не доказывает несущественности взаимодействия, поскольку оно может быть кратковременным и/или редким, но отнюдь не случайным. Тем не менее, вполне определенным кажется, что активности генов aD и аА регулируются с помощью различных механизмов. Иная картина наблюдается в домене ß-глобиновых генов человека, где область контроля локуса (LCR) альтернативно взаимодействует со всеми активными промоторами (Tolhuis et al., 2002; Gribnau et al., 1998; Palstra et al., 2003). Можно было бы предположить, что с промотора гена aD осуществялется синтез бицистронной пре-мРНК, которая впоследствии процессируется с образованием индивидуальных мРНК генов aD и аА. Однако паттерн транскрипции в домене а-глобиновых генов кур на протяжении многих лет служил предметом интенсивных исследований, и следов такой бицистронной пре-мРНК обнаружено не было (Recillas-Targa and Razin, 2001). Более того, промотор гена аА хорошо охарактеризован, и нет оснований полагать, что он не функционирует в живых клетках (Knezetic and Felsenfeld, 1989; Dodgson and Engel, 1983; Lewis et al., 1993).

Нам представляется весьма вероятным, что в домене а-глобиновых генов кур активация гена аА осуществляется эритроид-специфичным энхансером, расположенном в непосредственной близости с этим геном - на расстоянии около 1 т.п.н. за ним (Knezetic and Felsenfeld, 1989). В доменах а-глобиновых генов мыши и человека подобных энхансеров не обнаружено. Однако, происходит ли взаимодействие этого энхансера с промотором гена аА, сложно достоверно установить посредством ЗС-анализа, поскольку эти элементы расположены очень близко. Во всяком случае, некоторые наши результаты допускают возможность такого взаимодействия в эритроцитах 10-дневных эмбрионов (рис. 7 Е) и дифференцирующихся клетках HD3 (рис. 6 В). С другой стороны, вполне возможно, что энхансер, расположенный так близко к подконтрольному промотору, может активировать этот промотор по другому механизму, не связанному с образованием петли ДНК. Наконец, в виде еще одной модели активации транскрипции гена аА, мы можем предположить, что взаимодействие нескольких регуляторных элементов в области перед геном aD может обеспечивать активацию целого «взрослого» субдомена а-глобиновых генов, включающего гены aD и аА. В качестве молекулярного механизма такой активации может быть рассмотрена инактивация сайленсерного элемента, расположенного перед геном aD и активного в отношении обоих взрослых а-глобиновых генов (Lewis et al., 1993).

Выводы

1. Пространственная организация домена a-глобиновых генов кур различается в клетках с различным транскрипционным статусом глобиновых генов.

2. В лимфоидных клетках кур, в которых a-глобиновые гены неактивны, промотор гена aD взаимодейтсвует с CpG-островком домена.

3. В куриных пре-эритробластах, где a-глобиновые гены находятся в подготовленном для транскрипции состоянии, главный регуляторный элемента домена формирует комплекс с промотором гена aD и CpG-островком домена либо, альтернативно, с участком гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенном девятью т.п.н. выше клатера a-глобиновых генов.

4. В дифференцированных эритроидных клетках кур, транскрибирующих «взрослые» глобиновые гены aD и аА, формируется блок регуляторных элементов, включающий в себя главный регуляторный элемент домена, промотор гена aD, CpG-островок домена, участок гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенный девятью т.п.н. выше клатера a-глобиновых генов, и энхансер, локализованный за кластером a-глобиновых генов.

5. Траснкрипционно неактивный куриный эмбриональный a-глобиновый ген л не располагается в непосредственной близости с какими-либо регуляторными элементами домена a-глобиновых генов.

6. Куриный глобиновый ген аА не взаимодействует с расположенными перед кластером a-глобиновых генов регуляторными элементами, однако в

эритроидных клетках, транскрибирующих гены а° и аА, может взаимодействовать с расположенным за геном энхансером.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Gavrilov A. A.. Razin S.V. (2008). Spatial organization of the chicken a-globin gene domain: immature and active chromatin hubs. Nucleic Acids Res. 36: 4629-

2. Klochkov D., Rincon-Arano H., Ioudinkova E.S., Valadez-Graham V., Gavrilov A., Recillas-Targa F., Razin S.V. (2006). A CTCF-dependent silencer located in the differentially methylated area may regulate expression of a housekeeping gene overlapping a tissue-specific gene domain. Mol. Cell. Biol 26: 1589-1597.

3. Гаврилов A.A.. Разин C.B. (2008). Изучение пространственной организации домена а-глобиновых генов кур методом ЗС. Биохимия 73: 1486-1494.

1. Gavrilov А.А., Klochkov D.B., Razin S.V. Mapping chicken ggPRX gene promoter. Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow. Giessen, Germany, March 9-12,2008, abstract book, p. 26.

2. Gavrilov A.A.. Razin S.V. 3C technology: analyzing the spatial organization of genomic loci in vivo. Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow. Moscow, Russia, February 12-15,2008, abstract book, p. 20.

3. Gavrilov A.A.. Razin S.V. Study of spatial organisation of the chicken alpha-globin gene domain by Chromosome Conformation Capture assay. Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow. Suzdal, Russia, June 20-24,2007, abstract book, p. 24.

4. Гаврилов A.A.. Клочков Д.Б., Разин C.B. Картирование промотора гена ggPRX курицы. 10-ая международная школа-конференция «Биология -наука XXI века». Пущино, Россия, 17-21 апреля 2006, сборник тезисов, с. 8.

5. Гаврилов А.А.. Разин С.В. Анализ пространственной организации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных и неэритроидных клетках с использованием метода фиксации конформации хромосом (ЗС). IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008, сборник тезисов, с.ЮО.

6. Гаврилов А.А.. Разин С.В. Изучение пространственной организации геномных локусов методом ЗС. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008, сборник тезисов, с. 123.

4640.

Тезисы конференций:

Подписано в печать 14.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 950 Тираж 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 772633®00 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилов, Алексей Александрович

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Структурно-функциональная организация генома в клеточном ядре.

1.1.1. Ядерные белковые тельца.

1.1.2. Хроматиновые домены.

1.1.3. Транскрипционные фабрики.

1.1.4. Организация хромосом в интерфазном ядре.

1.1.5. Локализация генов внутри хромосомных территорий.

1.1.6. Модификации хроматина.

1.1.7. Подвижность и перемещение генетических локусов.

1.1.8. Ассоциация генов с ядерной периферией и ядерными порами.

1.1.9. Изменение внутриядерной локализации генов в течение клеточной дифференцировки.

1.1.10. Межхромосомные взаимодействия.

1.1.10.1. Гомологичные межхромосомные взаимодействия.

1.1.10.2. Негомологичные межхромосомные взаимодействия.

1.2. Регуляция экспрессии генов с помощью LCR.

1.2.1. LCR как сложный энхансер.

1.2.2. LCR и «открывание» хроматина.

1.2.2.1. Домен Р-глобиновых генов.

1.2.2.2. Домен гена гормона роста.

1.2.3. LCR и петли хроматина.

1.2.3.1. Домен /3-глобиновых генов.

1.2.3.2. Локус Th2.

1.2.4. LCR и межгенная транскрипция.

1.2.5. Границы геномных доменов.

1.2.6. Другие функции LCR.

III. Структурно-функциональная организация домена а-глобиновых генов кур.

1.3.1. Функциональные элементы домена.

1.3.2. Структурные элементы домена.

1.3.3. Межгенная транскрипция.

II. Материалы и методы.

ПЛ. Работа с куриными клетками.

II. 1.1. Ведение клеточных культур.

И. 1.2. Индукция дифференцировки клеток HD3 по эритроидному пути.

II. 1.3. Определение количества мертвых клеток.

И. 1.4. Выявление гемоглобина в клетках.

II. 1.5. Выделение эмбриональных эритроцитов.

II.2. Работа с ДНК и РНК.

11.2.1. Выделение геномной ДНК из культивируемых клеток.

11.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

11.2.3. Выделение тотальной РНК из культивируемых клеток.

11.2.4. Электрофорез РНК в агарозном геле.

11.2.5. Полимеразная цепная реакция.

11.2.6. Приготовление радиоактивных ДНК-зондов для нозерн-блот-гибридизации

II.2.7. Нозерн-блот-гибридизация РНК.

И.2.8. Выделение бакмидной ДНК из клеток E.coli.

II.2.9. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот.

11.3. ЗС-анализ.

И.3.1. Фиксация клеток и изоляция ядер.

11.3.2. Рестрикция и лигирование ДНК.

11.3.3. Очистка продуктов лигирования.

11.3.4. ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами.

11.3.5. Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования.

11.4. Програмное обеспечение.

III. Результаты исследований.

111.1. Клеточная модель для сравнительного ЗС-анализа домена а-глобиновых генов кур.

111.2. Количественный ЗС-анализ домена а-глобиновых генов кур: принцип метода и контрольные эксперименты.

111.2.1. Основы метода ЗС.

111.2.2. Подбор рестриктаз, праймеров и TaqMan-проб.

111.2.3. Количественный ПЦР-анализ продуктов лигирования.

111.2.4. Контроль специфичности ПЦР-амплификации.

111.2.5. Оценка эффективности рестрикции.

111.2.6. Контроль качества и количества ДНК в ЗС-образцах.

111.2.7. Отрицательные контроли.

111.3. Сравнение пространственной организации домена а-глобиновых генов в неэритроидных клетках кур и трансформированных эритроидных клетках кур до и после начала транскрипции глобиновых генов.

111.4. Анализ пространственной организации домена а-глобиновых генов в нормальных эмбриональных эритроцитах кур.

IV. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур"

История изучения глобиновых генов уходит своими корнями в ранние дни молекулярной биологии. Это не удивительно, поскольку глобины - одни из наиболее распространенных молекул крови, а кровь является удобным объектом исследования, поскольку это быстро регенерирующаяся ткань, легко извлекаемая из организма.

Глобиновая мРНК накапливается в эритроцитах в больших количествах, что позволило проводить исследования этой РНК еще до разработки технологии рекомбинантных ДНК.

Гемоглобинопатии - заболевания, связанные с дефектами в продукции глобинов, - это наиболее часто встречающиеся моногенные заболевания, распространенные повсеместно, и поэтому они традиционно служили предметом интенсивных исследований. История изучения глобинов насчитывает немало открытий, определивших представления о геноме, его функции, связи с болезнями. Более полувека назад Полинг обнаружил, что у людей, больных серповидно-клеточной анемией, молекулы глобина по строению отличаются от таковых у здоровых людей, тем самым впервые установив молекулярные основы болезни

Pauling et al., 1949). Восьмью годами позже Ингрем выяснил, что серповидно-клеточная анемия вызывается мутациями в гене глобина, и это явилось первым примером заболевания, для которого была показана связь с генетическими нарушениями (Ingram et al., 1957). В 60-х годах в лаборатории Перуца завершаются исследования по расшифровке трехмерной структуры гемоглобина, начатые еще в конце 30-х годов (Bernal et al., 1938).

В начале 70-х годов глобиновые гены оказываются одними из первых эукариотических генов, для которых установлена первичная последовательность нуклеотидов (Marotta et al., 1974; Poon et al., 1974; Proudfoot and Brownlee, 1974) и которые клонированы в бактериальных векторах (Rougeon et al., 1975). На примере глобиновых генов было продемонстрировано существование интронов в эукариотических генах (Jeffreys and 8

Flavell, 1977; Tilghman el al., 1978), а кроличий Р-глобиновый ген стал первым геном, транскрипция которого, под контролем его собственных c/s-регуляторных последовательностей, была осуществлена в экспериментах по трансфекции эукариотических клеток (Mantei el al., 1979). В 80-е годы исследования на трансгенных мышах с использованием генетических конструктов на основе локуса р-глобиновых генов человека привели к открытию так называемой области контроля локуса (locus control region, LCR) - позитивной регуляторной области ДНК, обеспечивающей тканеспецифичную экспрессию трансгена на том же уровне, что и в эндогенной позиции, вне зависимости от места интеграции в геном и в прямой зависимости от числа копий трансгена (Grosveld et al., 1987). Три года спустя LCR-подобный элемент был обнаружен и в домене а-глобиновых генов человека (Higgs et al., 1990). Интенсивные работы 90-х годов, сфокусированные на анализе экспрессии Р-глобиновых генов в трансгенных мышах и мышах с делегированной областью контроля локуса, содействовали решению вопросов, касающихся регуляции экспрессии генов в развитии, конкуренции генов за регуляторные элементы, функции дистальных регуляторных элементов (Hanscombe et al., 1991; Ellis et al., 1993; Milot et al., 1996; Epner et al., 1998). В последнее десятилетие были разработаны новые методы, позволяющие анализировать пространственную организацию хроматина в клеточном ядре, и вновь пионерские работы в этой области были сделаны на модели Р-глобиновых генов (Tolhuis et al, 2002; Carter et al., 2002). Предметом изучения стала и позиция домена Р-глобиновых генов в ядерном пространстве на разных стадиях развития эритроидных клеток (Ragozcy et al., 2006), а также пространственное взаимодействие доменов а- и р-глобиновых генов (Brown et al., 2006). Ha примере этих же доменов были изучены свойства инсуляторов - особого класса генетических элементов, характеризующихся способностью препятствовать гетерохроматизации и блокировать активирующее воздействие энхансера на промотор при нахождении на цепи ДНК между энхансером и промотором (Bell et al., 1999; Recillas-targa et al., 1999; Valadez-Graham et al.,

2004). Еще одна группа исследований, ведущихся вот уже более 40 лет с момента обнаружения «гиганских» транскриптов домена а-глобиновых генов кур (Scherrer et al., 1966), способствовала выяснению роли межгенной транскрипции (Gribnau et al., 2000; Razin et al, 2004). Наконец, домены а- и р-глобиновых доменов явились моделями для изучения механизмов контроля времени репликации ДНК у эукариот (Simon et al., 2001).

Итак, локусы а- и р-глобиновых генов представляют одни из наиболее изученных областей генома у высших эукариот. Однако с решением одних исследовательских задач неуклонно возникают новые вопросы. Так, до сих пор не установлены точные механизмы переключения транскрипции глобиновых генов с эмбрионального на взрослый тип, не раскрыты принципы работы сайленсеров и инсуляторов домена и не дано однозначного ответа относительно их функции, не выяснено, как в действительности функционирует LCR.

В домене a-глобиновых генов кур за многие годы его исследований были найдены и охарактеризованы группы позитивных и негативных регуляторных элементов, подробно изучена структура транскрипционных единиц, однако до сих пор четкой картины регуляции транкрипции в домене не получено. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов активации транскрипции a-глобиновых генов у курицы. Для раскрытия этих механизмов мы решили выяснить, происходит ли пространственное взаимодействие каких-либо регуляторных элементов домена между собой и с промоторами a-глобиновых генов в условиях, когда домен неактивен, и изменяется ли пространственная конфигурация домена при активации транскрипции глобиновых генов. Для ответа на эти вопросы были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Отработать систему искусственной дифференцировки культивируемых куриных пре-эритробластов в эритроциты.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гаврилов, Алексей Александрович

выводы

1. Пространственная организация домена а-глобиновых генов кур различается в клетках с различным транскрипционным статусом глобиновых генов.

2. В лимфоидных клетках кур, в которых а-глобиновые гены неактивны, промотор гена а° взаимодейтсвует с CpG-островком домена.

3. В куриных пре-эритробластах, где а-глобиновые гены находятся в подготовленном для транскрипции состоянии, главный регуляторный элемента домена формирует комплекс с промотором гена aD и CpG-островком домена либо, альтернативно, с участком гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенном девятью т.п.н. выше клатера a-глобиновых генов.

4. В дифференцированных эритроидных клетках кур, транскрибирующих «взрослые» глобиновые гены aD и aA, формируется блок регуляторных элементов, включающий в себя главный регуляторный элемент домена, промотор гена aD, CpG-островок домена, участок гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенный девятью т.п.н. выше клатера a-глобиновых генов, и энхансер, локализованный за кластером а-глобиновых генов.

5. Траснкрипционно неактивный куриный эмбриональный a-глобиновый ген к не располагается в непосредственной близости с какими-либо регуляторными элементами домена a-глобиновых генов.

6. Куриный глобиновый ген аА не взаимодействует с расположенными перед кластером а-глобиновых генов регуляторными элементами, однако в эритроидных клетках, транскрибирующих гены aD и аА, может взаимодействовать с расположенным за геном энхансером.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилов, Алексей Александрович, Москва

1. Akhtar, A., and Gasser, S.M. (2007). The nuclear envelope and transcriptional control. Nat. Rev. Genet. 8: 507-517.

2. Andrulis, E.D., Neiman, A.M., Zappulla, D.C., and Sternglanz, R. (1998). Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. Nature 394: 592-595.

3. Andrulis, E.D., Zappulla, D.C. Ansari, A., Perrod, S., Laiosa, C.V., Gartenberg, M.R., and Sternglanz, R. (2002). Escl, a nuclear periphery protein required for Sir4-based plasmid anchoring and partitioning. Mol Cell Biol 22: 8292-8301.

4. Anguita, E., Johnson, C.A., Wood, W.G., Turner, B.M., and Higgs, D.R. (2001). Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98: 12114-12119.

5. Ansel, K.M., Lee, D.U., and Rao, A. (2003). An epigenetic view of helper T cell differentiation. Nat. Immunol. 4: 616-623.

6. Ashe, H., Wijgerge, M., Fraser, P., and Proudfoot, N. (1997). Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev. 11: 2494—2509.

7. Azuara, V., Perry, P., Sauer, S., Spivakov, M., Jorgensen, H.F., John, R.M., Gouti, M., Casanova, M., Wames, G., Merkenschlager, M., et al. (2006). Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nat. Cell Biol 8: 532-538.

8. Bacher, C.P., Guggiari, M., Brors, В., Augui, S., Clerc, P., Avner, P., Eils, R., and Heard, E. (2006). Transient colocalization of X-inactivation centres accompanies the initiation of X inactivation. Nat. Cell Biol 8: 293-299.

9. Bannister, A.J. Schneider, R., Myers, F.A., Thorne, A.W., Crane-Robinson, C., and Kouzarides, T. (2005). Spatial distribution of di- and tri-methyl lysine 36 of histone H3 at active genes.J.Biol. Chem. 280: 17732-17736.

10. Bannister. A.J. Zegerman, P., Partridge, J.F., Miska, E.A., Thomas, J.O., Allshire, R.C., and Kouzarides, T. (2001). Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the ИР1 chromo domain. Nature 410: 120-124.

11. Bantignies, F., Grimaud, C., Lavrov, S., Gabut, M., and Cavalli, G. (2003). Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 17: 2406-2420.

12. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., and Zhao, K. (2007). Highresolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129: 823-837.

13. Bartlett, J., Blagojevic, J., Carter, D., Eskiw, C., Fromaget, M., Job, C., Shamsher, M., Trindade, I.F., Xu, M., and Cook, P.R. (2006). Specialized transcription factories. Biochem. Soc. Symp. 2006: 67-75.

14. Bassing, C.H., Swat, W., and Alt, F.W. (2002). The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell 109 (Suppl.): S45-S55.

15. Bell, A.C., West, A.G., and Felscnfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98: 387-396.

16. Bender, M.A., Bulger, M., Close, J., and Groudine, M. (2000). Beta-globin gene switching and DNase I sensitivity of the endogenous beta-globin locus in mice do not require the locus control region. Mol. Cell 5: 387—393.

17. Berger, S.L. (2002). Histone modifications in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 142-148.

18. Bernal, J.D., Fankuchen, I., and Perutz, M.F. (1938). X-ray study of chymotrypsin and hemoglobin. Nature 141: 523-524.

19. Bernstein, B.E., Mikkelsen, T.S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D.J., Cuff, J., Fry, В., Meissner, A., Wemig, M., Plath, K., et al. (2006). A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125: 315-326.

20. Blobel, G. (1985). Gene gating: A hypothesis. Proc. Natl Acad. Sci. 82: 8527-8529.

21. Boggs, B.A., Cheung, P., Heard, E., Spector, D.L., Chinault, A.C., and Allis, C.D. (2002). Differentially methylated forms of histone H3 show unique association patterns with inactive human X chromosomes. Nat. Genet. 30: 73-76.

22. Boggs, B.A., Connors, В., Sobel, R.E., Chinault, A.C., and Allis, C.D. (1996). Reduced levels of histone H3 acetylation on the inactive X chromosome in human females. Chromosoma 105: 303-309.

23. Boisvert, F.M., Cote, J., Boulanger, M.C., Cleroux, P., Bachand, F., Autexier, C., and Richard, S. (2002).Symmetrical dimethylarginine methylation is required for the localization of SMN in Cajal bodies and pre-mRNA splicing. J Cell Biol 159:957-969.

24. Borden, J., and Manuelidis, L. (1988). Movement of the X chromosome in epilepsy. Science 242: 1687-1691.

25. Boyle, S., Gilchrist. S., Bridger, J.M., Mahy, N.L., Ellis, J.A., and Bickmore, W.A. (2001). The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol. Genet. 10: 211-219.

26. Branco, M.R., and Pombo, A. (2006). Intermingling of chromosome territories in interphase suggests role in translocations and transcription-dependent associations. PLoS Biol. 4: el38. doi: 10.1371/journal.pbio.0040138.

27. Bridger, J.M., Boyle, S., Kill, I.R., and Bickmore, W.A. (2000). Re-modelling of nuclear architecture in quiescent and senescent human fibroblasts. Curr. Biol. 10: 149-152.

28. Brown, C.J., Lafreniere, R.G., Powers, V.E., Sebastio, G., Ballabio, A., Pettigrew, A.L., Ledbetter, D.H., Levy, E., Craig, I.W., and Willard, H.F. (1991). Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in Xql3. Nature 349: 82-84.

29. Brown, J.L., and Ingram, V.M. (1974). Structural studies on chick embryonic hemoglobins. J. Biol Chem. 249: 3960-3972.

30. Brown, J.M., Leach, J., Reittie, J.E., Atzberger, A., Lee-Prudhoe, J., Wood, W.G., Higgs, D.R., Iborra, F.J., and Buckle, V.J. (2006). Coregulated human globin genes are frequently in spatial proximity when active. J. Cell Biol 172: 177-187.

31. Brown, K.E., Amoils, S., Horn, J.M., Buckle, V.J., Higgs. D.R., Merkenschlager, M. and Fisher, A.G. (2001). Expression of a- and p-globin genes occurs within different nuclear domains in haemopoietic cells. Nat. Cell Biol. 3: 602-606.

32. Bruns, G.A., and Ingram, V.M. (1973). Erythropoiesis in the developing chick embryo. Dev. Biol. 30: 455-459.

33. Bulger, M., and Groudine, M. (1999). Looping versus linking: toward a model for longdistance gene activation. Genes Dev. 13: 2465-2477.

34. Burmeister, M., Monaco, A.P., Gillard, E.F., van Ommen, G.J., Affara, N.A., Ferguson-Smith, M.A., Kunkel, L.M., and Lehrach, H. (1988). A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 2: 189-202.

35. Cai, S., Han, H.J., and Kohwi-Shigematsu, T. (2003). Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1. Nat. Genet. 34: 42-51.

36. Capelson, M., and Corces, V.G. (2004). Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell 96: 617-629.

37. Carrel, L. (2006). Molecular biology. 'X'-rated chromosomal rendezvous. Science 311: 1107-1109.

38. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C.S., Dai, Y.F., and Fraser, P. (2002). Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nat. Genet. 32: 623-626.

39. Casolari, J.M., Brown, C.R., Komili, S., West, J., Hieronymus, H., and Silver, P.A. (2004). Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples transcriptional status and nuclear organization. Cell 117: 427-439.

40. Chambeyron, S., and Bickmore, W.A. (2004). Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes Dev. 18: 1119— 1130.

41. Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., and Heard, E. (2006). A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20: 2223-2237.

42. Chubb, J.R., Boyle, S., Perry, P., and Bickmore, W.A. (2002). Chromatin motion'is constrained by association with nuclear compartments in human cells. Curr. Biol. 12: 439445.

43. Cook, P.R. (1999). The organization of replication and transcription. Science 284: 17901795.

44. Couture, J.F., and Trievel, R.C. (2006). Histone-modifying enzymes: Encrypting an enigmatic epigenetic code. Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 753- 760.

45. Cremer, M., von Hase, J., Volm, Т., Brero, A., Kreth, G., Walter, J., Fischer, C., Solovei, I., Cremer. C., and Cremer, T. (2001). Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells. Chromosome Res. 9: 541—567.

46. Cremer, Т., Cremer, M., Dietzcl. S., Muller, S., Solovei. I., and Fakan, S. (2006). Chromosome territories A functional nuclear landscape. Curr. Opin. Cell Biol. 18: 307316.

47. Cremer, Т., Lichter, P., Borden, .Т., Ward, D.C., and Manuelidis, L. (1988). Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. Hum. Genet. 80: 235-246.

48. Croft, J.A., Bridger, J.M., Boyle, S., Perry, P., Teague, P., and Bickmore, W.A. (1999). Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. J. Cell Biol. 145: 1119-1131.

49. Czelusniak, J., Goodman, M., Hewett-Emmett, D., Weiss, M.L., Venta, P.J., and Tashian, R.E. (1982). Phylogenetic origins and adaptive evolution of avian and mammalian haemoglobin genes. Nature 298: 297-300.

50. Davie, J.R. (1995). The nuclear matrix and the regulation of chromatin organization and function. Int. Rev. Cytol. 162A: 191-250.

51. Davie, J.R., and Candido, E.P. (1978). Acetylated histone H4 is preferentially associated with template-active chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 3574-3577.

52. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. (2002). Capturing chromosome

53. Dodgson, J.B., and Engel, J.D. (1983). The nucleotide sequence of the adult chicken alpha-globin genes. J. Biol. Chem. 258: 4623-4629.

54. Drissen, R., Palstra, R.J., Gillemans, N., Splinter, E., Grosveld, F., Philipsen, S., and de Laat, W. (2004). The active spatial organization of the beta-globin locus requires the transcription factor EKLF. Genes Dev. 18: 2485-2490.

55. Duncan, I.W. (2002). Transvection effects in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 36: 521-556.

56. Ellis, J., Talbot, D., Dillon, N., and Grosveld, F. (1993). Synthetic human beta-globin 5'HS2 constructs function as locus control regions only in multicopy transgene concatamers. EMBO J. 12: 127-134.

57. Faro-Trindade, 1. and Cook, P.R. (2006). Transcription factories: Structures conserved during differentiation and evolution. Biochem. Soc. Trans. 34: 1133-1137.

58. Farrell, C.M., West, A.G., and Felsenfeld, G. (2002). Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human beta-globin loci. Mol. Cell. Biol. 22: 3820-3831.

59. Feng, Y.Q., Warm, R., Li, Т., Olivier, E., Besse, A., Lobell, A., Fu, H., Lin, C.M., Aladjem, M.I., and Bouhassira, E.E. (2005). The human beta-globin locus control region can silence as well as activate gene expression. Mol. Cell. Biol. 25: 3864-3874.

60. Fields, P.E., Lee, G.R., Kim, S.T., Bartsevich, V.V., and Flavell, R.A. (2004). Th2-specific chromatin remodeling and enhancer activity in the Th2 cytokine locus control region. Immunity 21: 865-876.

61. Forsberg, E.C., Downs, K.M., Christensen, H.M., Im, H., Nuzzi, P.A., and Bresnick, E.H. (2000). Developmentally dynamic histone acetylation pattern of a tissue-specific chromatin domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14494-14499.

62. Foster, S.L., Hargreaves, D.C., and Medzhitov, R. (2007). Genespecific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature 447: 972-978.

63. Fuss, S.H., Omura, M., and Mombaerts, P. (2007). Local and cis effects of the H element on expression of odorant receptor genes in mouse. Cell 130: 373-384.

64. Fuxa, M., Skok, J., Souabni, A. Salvagiotto, G., Roldan, E., and Busslinger, M. (2004). Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18: 411^422.

65. Gadal, O., Lesne, A., Buc, H., Feuerbach-Foumier, F., Olivo-Marin, J.C. Hurt, E.C., et al. (2006). SAGA interacting factors confine sub-diffusion of transcribed genes to the nuclear envelope. Nature 441: 770-773.

66. Gartenberg, M.R., Neumann, F.R., Laroche, Т., Blaszczyk, M., and Gasser, S.M. (2004). Sir-mediated repression can occur independently of chromosomal and subnuclear contexts. Cell 119: 955-967.

67. Gilbert, N., Boyle, S., Fiegler, H., Woodfme, K., Carter, N.P., and Bickmore, W.A. (2004). Chromatin architecture of the human genome: Gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell 118: 555-566.

68. Grewal, S.I., and Moazed, D. (2003), Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 301: 798-802.

69. Gribnau, J., de Boer, E., Trimborn, Т., Wijgerde, M., Milot, E., Grosveld, F, and Fraser, P. (1998). Chromatin interaction mechanism of transcriptional control in vivo. EMBO J. 17: 6020-6027.

70. Gribnau, J., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R., and Fraser, P. (2000). Intergenic transcription and developmental remodeling of chromatin subdomains in the human beta-globin locus. Mol. Cell 5: 377-386.

71. Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U., and Cavalli, G. (2006). RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. Cell 124: 957-971.

72. Grosveld, F., van Assendelft, G.B., Greaves, D.R., and Kollias, G. (1987). Positionindependent, high-level expression of the human beta-globin gene in transgenic mice. Cell 51: 975-985.

73. Guenther, M.G., Levine, S.S., Boyer, L.A., Jaenisch, R., and Young, R.A. (2007). A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell 130: 77-88.

74. Hanscombe, O., Whyatt, D., Fraser, P., Yannoutsos, N., Greaves, D., Dillon, N., and Grosveld, F. (1991). Importance of globin gene order for correct developmental expression. Genes Dev. 5: 1387-1394.

75. Hardison, R.C. (2001). New views of evolution and regulation of vertebrate beta-like globin gene clusters from an orphaned gene in marsupials. Proc Natl Acad Sci USA 98: 1327-1329.

76. Hatzis, P., and Talianidis, I. (2002). Dynamics of enhancer-promoter communication during differentiation-induced gene activation. Mol. Cell 10: 1467-1477.

77. Heard, E., and Bickmore. W. (2007). The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Curr. Opin. Cell. Biol. 19: 311-316.

78. Heard, E., Rougeulle, C., Arnaud, D., Avner, P., Allis, C.D., and Spector, D.L. (2001). Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation. Cell 107: 727-738.

79. Hebbes, T.R., Clayton, A.L., Thorne, A.W., and Crane-Robinson, C. (1994). Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBOJ. 13: 1823-1830.

80. Heun. P. (2007). SUMOrganization of the nucleus. Curr. Opin. Cell Biol. 19: 350-355.

81. Higgs, D.R., Wood, W.G., Jarman, A.P., Sharpe, J., Lida, J., Pretorius, I.M., and Ayyub, H. (1990). A major positive regulatory region located far upstream of the human alpha-globin gene locus. Genes Dev. 4: 1588-1601.

82. Ho, Y., Elefant, F., Cooke, N., and Liebhaber, S. (2002). A defined locus control region determinant links chromatin domain acetylation with long-range gene activation. Mol. Cell 9: 291-302.

83. Ho, Y., Liebhaber, S.A., and Cooke, N.E. (2004). Activation of the human GH gene cluster: roles for targeted chromatin modification. Trends Endocrinol. Metab. 15: 40-45.

84. Hoffmann, F.G., and Storz, J.F. (2007). The alphaD-Globin Gene Originated via Duplication of an Embryonic alpha-Like Globin Gene in the Ancestor of Tetrapod Vertebrates. Mol. Biol. Evol. 24: 1982-1990.

85. Hopmann, R., Duncan, D., and Duncan, I. (1995). Transvection in the iab-5.6,7 region of the bithorax complex of Drosophila: Homology independent interactions in trans. Genetics 139: 815-833.

86. Iborra, F.J., Pombo, A., McManus, J., Jackson. D.A., and Cook, P.R. (1996). The topology of transcription by immobilized polymerases. Exp. Cell Res 229: 167-173.

87. Imaizumi, M.T., Diggelmann, H., and Scherrer, K. (1973). Demonstration of globin messenger sequences in giant nuclear precursors of messenger RNA of avian erythroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 1122-1126.

88. Ingram, V.M. (1957). Gene mutations in human haemoglobin: The chemical difference between normal and sickle cell haemoglobin. Nature 180: 326-328.

89. Ishii, K., Arib, G., Lin, C., Van Houwe. G., and Laemmli, U.K. (2002). Chromatin boundaries in budding yeast: The nuclear pore connection. Cell 109: 551-562.

90. Jackson, D.A. and Cook, P.R. (1985). Transcription occurs at a nucleoskeleton. EMBO J. 4: 919-925.

91. Jackson, D.A., Iborra, F.J., Manders. E.M., and Cook, P.R. (1998). Numbers and organization of RNA polymerases, nascent transcripts, and transcription units in HeLa nuclei. Mol. Biol. Cell 9: 1523-1536.

92. Jeffreys, A.J., and Flavell, R.A. (1977). The rabbit beta-globin gene contains a large insert in the coding sequence. Cell 12: 1097-1108.

93. Jenuwein, Т., and Allis, C.D. (2001). Translating the histone code. Science 293: 10741080.

94. Jeppesen, P., and Turner, B.M. (1993). The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression. Cell 74: 281-289.

95. Johnson, K.D., Christensen, H.M., Zhao, В., and Bresnick, E.H. (2001). Distinct mechanisms control RNA polymerase II recruitment to a tissue- specific locus control region and a downstream promoter. Mol. Cell 8: 465—471.

96. Johnson, K.D., Grass, J.A., Park, C., Im, H., Choi, K., and Bresnick, E.H. (2003). Highly restricted localization of RNA polymerase II within a locus control region of a tissue-specific chromatin domain. Mol. Cell. Biol. 23: 6484-6493.

97. Kim, A., and Dean, A. (2004), Developmental stage differences in chromatin sub-domains of the beta-globin locus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 7028-7033.

98. Kimura, A.P., Liebhaber, S.A., and Cooke, N.E. (2004). Epigenetic modifications at the human growth hormone locus predict distinct roles for histone acetylation and methylation in placental gene activation. Mol. Endocrinol. 18: 1018-1032.

99. Knezetic, J., and Felsenfeld, G. (1993). Mechanism of developmental regulation of a-n, the chicken embryonic a-globin gene. Mol. Cell. Biol. 13: 4632—4639.

100. Knezetic, J.A., and Felsenfeld, G. (1989). Identification and characterization of a chicken a-globin enhancer. Mol. Cell. Biol. 9: 893-901.

101. Kosak, S.T., Skok. J.A., Medina. K.L., Riblet, R. Le Beau. M.M., Fisher, A.G., and Singh, H. (2002). Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science 296: 158-162.

102. Kouzarides, T. (2007). Chromatin modifications and their function. Cell 128: 693-705.

103. Krangel, M.S. (2003). Gene segment selection in V(D)J recombination: accessibility and beyond. Nat. Immunol. 4: 624—630.

104. Kraus, W.L., and Lis, J.T. (2003). PARP goes transcription. Cell 113: 677-683.

105. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea. S., Mechtler, K., and Jenuwein. T. (2001). Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120.

106. Lee, G.R., Fields, P.E., Griffin, T.J., and Flavell, R.A. (2003). Regulation of the Th2 cytokine locus by a locus control region. Immunity 19: 145-153.

107. Lee, G.R., Spilianakis, C.G., and Flavell, R.A. (2005). Hypersensitive site 7 of the TH2 locus control region is essential for expressing TH2 cytokine genes and for longrange intrachromosomal interactions. Nat. Immunol. 6: 42—48.

108. Lee, J.T. (2005). Regulation of X-chromosome counting by Tsix and Xite sequences. Science 309: 768-771.

109. Lee, T.I., Jenner, R.G., Boyer. L.A., Guenther, M.G., Levine, S.S., Kumar, R.M., Chevalier, В. Johnstone, S.E., Cole, M.F., Isono, K., et al. (2006). Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125: 301-313.

110. Lei, E.P., and Corces, V.G. (2006). A long-distance relationship between RNAi and Polycomb. Cell 124: 886-888.

111. Letting, D.L., Rakowski, С., Weiss, M.J., and Blobel, G.A. (2003). Formation of a tissue-specific histone acetylation pattern by the hematopoietic transcription factor GATA-1. Mol. Cell. Biol 23: 1334-1340.

112. Lewis, W., Lee, J.D., and Dodgson, J.B. (1991). Adult chicken alpha-globin gene expression in transfected QT6 quail cells: evidence for a negative regulatory element in the alpha D globin region. Nucleic Acids Res. 19: 5321-5329.

113. Li, Q., Peterson, K.R., Fang, X., and Stamatoyannopoulos, G. (2002). Locus control regions. Blood 100: 3077-3086.

114. Ling, J., Ainol, L., Zhang, L., Yu, X., Pi, W., and Tuan, D. (2004). HS2 enhancer function is blocked by a transcriptional terminator inserted between the enhancer and the promoter. J. Biol. Chem. 279: 51704-51713.

115. Ling, J.Q., Li, Т., Hu, J.F., Vu, Т.Н., Chen, H.L., Qiu, X.W., Cherry. A.M., and Hoffman, A.R. (2006). CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsbl/Nfl. Science 312: 269-272.

116. Litt, M.D., Simpson, M., Gaszner, M., Allis, C.D., and Felsenfeld, G. (2001). Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293: 2453-2455.

117. Litt, M.D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M.N., and Felsenfeld G. (2001). Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBOJ. 20: 2224-2235.

118. Liu, Z., and Garrard, W.T. (2005). Long-range interactions between three transcriptional enhancers, active Vkappa gene promoters, and a 3' boundary sequence spanning 46 kilobases. Mol. Cell Biol 25: 3220-3231.

119. Lomvardas, S., Barnea, G., Pisapia, D.J., Mendelsohn, M., Kirkland, J., and Axel, R. (2006). Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell 126: 403-413.

120. Mahy, N.L., Perry, P.E., and Bickmore, W.A. (2002a). Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. J. Cell Biol. 159: 753-763.

121. Mahy, N.L., Perry, P.E., Gilchrist, S., Baldock, R.A., and Bickmore, W.A. (2002b). Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. J. Cell Biol. 157: 579-589.

122. Mantei, N., Boll, W., and Weissmann, C. (1979). Rabbit beta-globin mRNA production in mouse L cells transformed with cloned rabbit beta-globin chromosomal DNA. Nature 281: 40-46.

123. Marahrens, Y. (1999). X-inactivation by chromosomal pairing events. Genes Dev. 13: 2624-2632.

124. Marotta, C.A., Forget, B.G., Weissman, S.M., Verma, I.M., McCaffrey, R.P., and Baltimore, D. (1974). Nucleotide sequences of human globin messenger RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 2300-2304.

125. Marshall, W.F., Straight, A., Marko, J.F., Swedlow, J., Demburg, A., Belmont. A., Murray, A.W., Agard, D.A., and Sedat. J.W. (1997). Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells. Curr. Biol. 7: 930-939.

126. Masternak, K., Peyraud, N., Krawczyk, M., Barras, E., and Reith, W. (2003). Chromatin remodeling and extragenic transcription at the MHC class II locus control region. Nat. Immunol. 4: 132-137.

127. Mirsky, A.E., and Allfrey, V. (1960). Biochemical activities of the cell nucleus. Dis. Nerv. Syst. 21 (Suppl.): 23-28.

128. Misteli, T. (2007). Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell 128: 787-800.

129. Morey, C., Da Silva, N.R., Perry, P., and Bickmore, W.A. (2007). Nuclear reorganisation and chromatin decondensation are conserved, but distinct, mcchanisms linked to Hox gene activation. Development 134: 909-919.

130. Moss, В., and Tompson, E. (1969). Adult fowl haemoglobin and its acetylation. Biochem BiophisActa 188: 348-350.

131. Muller, W.G., Rieder, D., Karpova, T.S., Jolm, S., Trajanoski, Z., and McNally, J.G. (2007). Organization of chromatin and histone modifications at a transcription site. J. Cell Biol. 177: 957-967.

132. Murrell, A., Heeson, S., and Reik, W. (2004). Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI9 into parentspecific chromatin loops. Nat. Genet. 36: 889-893.

133. Norris, D.P., Brockdorff, N., and Rastan, S. (1991). Methylation status of CpG-rich islands on active and inactive mouse X chromosomes. Mamm. Genome 1: 78-83.

134. Orphanides, G., and Reinberg, D. (2000). RNA polymerase II elongation through chromatin. Nature 407: 471^475.

135. Palstra, R.J., Tolhuis, В., Splinter, E., Nijmeijer, R., Grosveld, F., and de Laat, W. (2003). The beta-globin nuclear compartment in development and erythroid differentiation. Nat. Genet. 35: 190-194.

136. Patrinos, G.P., de Krom, M., de Boer, E., Langeveld, A., Imam, A.M., Strouboulis, J., de Laat, W., and Grosveld, F.G. (2004). Multiple interactions between regulatory regions are required to stabilize an active chromatin hub. Genes Dev. 18: 1495-1509.

137. Pauling, L., Itano, H.A., Singer, S.J., and Wells, I.C. (1949). Sickle cell anemia a molecular disease. Science 110: 543-548.

138. Pickersgill, H., Kalverda, В., de Wit, E„ Talhout, W., Fornerod, M., and van Steensel, B. (2006). Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina. Nat. Genet. 38: 1005-1014.

139. Pirrotta, V. (1999). Transvection and chromosomal trans-interaction effects. Biochim. Biophys. Acta 1424: M1-M8.

140. Plath, K., Fang, J., Mlynarczyk-Evans, S.K., Cao, R., Worringer, K.A., Wang, Ii., de la Cruz, C.C., Otte, A.P., Panning. В., and Zhang, Y. (2003). Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science 300: 131-135.

141. Pombo. A., Jackson, D.A., Hollinshead, M., Wang, Z., Roeder, R.G., and Cook, P.R. (1999). Regional specialization in human nuclei: Visualization of discrete sites of transcription by RNA polymerase III. EMBOJ. 18: 2241-2253.

142. Poon, R., Paddock, G.V., Heindell, H., Whitcome, P., Salser, W., Kacian, D., Bank, A.,Gambino, R., and Ramirez, F. (1974). Nucleotide sequence analysis of RNA synthesized from rabbit globin complementary DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 3502-3506.

143. Proudfoot, N.J., and Brownlee, G.G. (1974). Sequence at the 3' end of globin mRNA shows homology with immunoglobulin light chain mRNA. Nature 252: 359-362.

144. Ragoczy, Т., Bender, M.A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation. Genes Dev. 20:1447-1457.

145. Ragoczy, Т., Telling, A., Sawado, Т., Groudine, M., and Kosak, S.T. (2003). A genetic analysis of chromosome territory looping: diverse roles for distal regulatory elements. Chromosome Res. 11: 513-525.

146. Razin, S., Rynditch, A., Borunova, V., Ioudinkova, E., Smalko, V., and Scherrer, K. (2004). The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J Cell Biochem. 92: 445-457.

147. Razin, S.V., and Ioudinkova, E.S. (2007). Mechanisms controlling activation of the alpha-globin gene domain in chicken erythroid cells. Biochemistry (Mosc) 72: 467-470.

148. Razin, S.V., De Moura Gallo, C.V., and Scherrer, K. (1994). Characterization of the chromatin structure in the upstream area of the chicken a-globin gene domain. Mol. Gen. Genet. 242: 649-652.

149. Razin, S.V., Farrell, C.M., and Recillas-Targa, F. (2003). Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. International Review of Cytology 226: 63-125.

150. Razin, S.V., Iarovaia, O.V., Sjakste, N., Sjakste, Т., Bagdoniene, L., Rynditch, A.V., Eivazova, E.R., Lipinski, M., and Vassetzky, Y.S. (2007). Chromatin domains and regulation of transcription. J Mol Biol. 369: 597-607.

151. Razin, S.V., Ioudinkova, E.S., Trifonov, E.N., and Scherrer, K. (2001). Non-clonability correlates with genomic instability: a case study of a unique DNA region. J. Mol. Biol. 307: 481-486.

152. Razin, S.V., Kekelidze, M.G., Lukanidin, E.M., Scherrer, K., and Georgiev, G.P. (1986). Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucleic Acids Res 14: 8189-8207.

153. Razin, S.V., Rynditch, A., Borunova, V., Ioudinkova, E., Smalko, V., and Scherrer, K. (2004) The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J. Cell. Biochem. 92: 445-457.

154. Razin, S.V., Vassetzky, Y.S., Kvartskhava, A.I., Grinenko, N.F., and Georgiev, G.P. (1991a). Transcriptional enhancer in the vicinity of replication origin within the 5' region of the chicken a-globin gene domain. J. Mol. Biol. 217: 595-598.

155. Recillas Targa, F., De Moura Gallo, C.V., Huesca, M., Scherrer, K., and Marcaud, L. (1993). Silencer and enhancer elements located at the З'-side of the chicken and duck alpha-globin-encoding gene domains. Gene 129: 229-237.

156. Recillas-Targa, F. (2000). The chicken a- and P-globin gene domains and their chromatin organization. Cell. Mol. Biol. Letters 5: 451—467.

157. Recillas-Targa, F., and Razin, S.V. (2001). Chromatin domains and regulation of gene expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Crit. Rev. Eukaryot. GeneExpr. 11:227-242.

158. Recillas-Targa, F., Bell, A.C., and Felsenfeld, G. (1999). Positional enhancer-blocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14354-14359.

159. Rogan, D.F., Cousins, D.J., Santangelo, S., Ioannou, P.A., Antoniou, M., Lee, Т.Н., and Staynov, D.Z. (2004). Analysis of intergenic transcription in the human IL-4/IL-13 gene cluster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 2446-2451.

160. Ronshaugen, M., and Levine, M. (2004). Visualization of /rarahomolog enhancer-promoter interactions at the Abd-B Hox locus in the Drosophila embryo. Dev. Cell 7: 925-932.

161. Rougeon, F., Kourilsky, P., and Mach, B. (1975). Insertion of a rabbit beta-globin gene sequence into an E. coli plasmid. Nucleic Acids Res. 2: 2365-2378.

162. Routledge, S.J., and Proudfoot, N.J. (2002). Definition of transcriptional promoters in the human beta-globin locus control region. J. Mol. Biol. 323: 601-611.

163. Rowley, P.T., Ohlsson-Wilhelm, B.M., and Farley, B.A. (1985). K562 human erythroleukemia cells demonstrate commitment. Blood 65: 862-868.

164. Sawado, Т., Halow, J., Bender, M.A., and Groudine, M. (2003). The beta-globin locus control region (LCR) functions primarily by enhancing the transition from transcription initiation to elongation. Genes Dev. 17: 1009-1018.

165. Sayegh, C., Jhunjhunwala, S., Riblet. R-, and Murre, C. (2005). Visualization of looping involving the immunoglobulin heavy-chain locus in developing В cells. Genes Dev. 19: 322-327.

166. Schirmer, E.C., and Foisner, R. (2007). Proteins that associate with lamins: .Many faces, many functions. Exp. Cell Res. 313: 2167-2179.

167. Schmid, M., Arib, G. Laemmli, C., Nishikawa, J., Durussel, Т., and Laemmli, U.K. (2006). Nup-PI: The nucleopore-promoter interaction of genes in yeast. Mol. Cell 21: 379-391.

168. Schneider, R., and Grosschedl, R. (2007). Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression. Genes Dev. 21: 3027-3043.

169. Schneider, R. Bannister, A.J., and Kouzarides, T. (2002). Unsafe SETs: Histone lysine methyltransferases and cancer. Trends Biochem. Sci. 27: 396^102.

170. Schneider, R., Bannister, A.J., Myers, F.A., Thorne, A.W., Crane-Robinson, C., and Kouzarides, T. (2004). Histone H3 lysine 4 methylation patterns in higher eukaryotic genes. Nat. Cell Biol. 6: 73-77.

171. Schiibeler, D., Groudine, M., and Bender, M.A. (2001). The murine beta-globin locus control region regulates the rate of transcription but not the hyperacetylation of histones at the active genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11432-11437.

172. Schwaiger, M., and Schubeler, D. (2006). A question of timing: Emerging links between transcription and replication. Curr. Opin. Genet. Dev. 16: 177-183.

173. Seeler, J.S., and Dejean, A. (2003). Nuclear and unclear functions of SUMO. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 690-699.

174. Sharpe, J., Chan-Thomas, P., Lida, J., Ayyub, H., Wood, W., and Higgs, D. (1992). Analysis of the human alpha globin upstream regulatory element (HS-40) in transgenic mice. EMBOJ11: 4565-4572.

175. Shewchuck, B.M., and Hardison, R.C. (1997). CpG island from the alpha-globin gene cluster increase gene expression in an integration-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 17: 5856-5866.

176. Shi, Y., Lan, F., Matson, C., Mulligan, P., Whetstine, J.R., Cole, P.A., Casero, R.A., and Shi, Y. (2004). Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953.

177. Simon I., Tenzen Т., Mostoslavsky R., Fibach E., Lande L., Milot E., Gribnau J., Grosveld, F., Fraser, P., and Cedar, H. (2001). Developmental regulation of DNA replication timing at the human beta globin locus. EMBOJ. 20: 6150-6157.

178. Singal, R., van Wert, J.M., and Ferdinand, L. Jr (2002). Methylation of alpha-type embryonic globin gene alpha pi represses transcription in primary erythroid cells. Blood 100: 4217-4222.

179. Skok, J.A., Gisler, R., Novatchkova, M., Farmer, D., de Laat. W., and Busslinger, M. (2007). Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nat. Immunol. 8: 378-387.

180. Spector, D.L. (2003). The dynamics of chromosome organization and gene regulation. Annu. Rev. Biochem. 2: 573-608.

181. Spector, D.L. (2004). Stopping for FISH and chips along the chromatin fiber superhighway. Mol. Cell 15: 844-846.

182. Spilianakis, C.G., and Flavell, R.A. (2004). Long-range intrachromosomal interactions in the T helper type 2 cytokine locus. Nat. Immunol. 5: 1017-1027.

183. Spilianakis, C.G., Lalioti, M.D., Town, Т., Lee, G.R., and Flavell, R.A. (2005). Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature 435: 637-645.

184. Splinter, E., Grosveld, F., and de Laat, W. (2004). 3C technology: analyzing the spatial organization of genomic loci in vivo. Methods Enzymol. 375: 493-507.

185. Splinter, E., Heath, H., Kooren, J„ Palstra, R.J., Klous, P., Grosveld, F., Galjart, N., and De Laat, W. (2006). CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes Dev. 20: 2349-2354.

186. Stalder, J., Larsen, A., Engel, J.D., Dolan, M., Groudine, M., and Weintraub, H. (1980). Tissue-specific DNA cleavage in the globin chromatin domain introduced by DNase I. Cell 20:451-460.

187. Strahl, B.D., and Allis, C.D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41-45.

188. Taddei, A., Maison. C. Roche, D., and Almouzni, G. (2001). Reversible disruption of pericentric heterochromatin and centromere function by inhibiting deacetylases. Nat. Cell Biol. 3: 114-120.

189. The ENCODE Project Consortium. (2007). Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature 447: 799-816.

190. Therwath, A., and Scherrer, K. (1982). Precursors of distinct size for chicken alpha A, alpha D and beta globin mRNA. FEBS Lett. 142: 12-16.

191. Thomson, 1., Gilchrist, S., Bickmore, W.A., and Chubb, J.R. (2004). The radial positioning of chromatin is not inherited through mitosis but is established de novo in early Gl. Curr. Biol. 14: 166-172.

192. Tilghman, S.M., Tiemeier, D.C., Seidman, J.G., Peterlin, B.M., Sullivan, M., Maizel, J.V., and Leder, P. (1978). Intervening sequence of DNA identified in the structural portion of a mouse beta-globin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 725-729.

193. Tolhuis, В., Palstra, R.J., Splinter, E., Grosveld, F., and de Laat, W. (2002). Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol. Cell 10: 1453— 1465.

194. Travers, A. (1999). Chromatin modification by DNA tracking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 13634-13637.

195. Turner, B.M. (1993). Decoding the nucleosome. Cell 75: 5-8.

196. Turner, B.M. (2007). Defining an epigenetic code. Nat. Cell Biol. 9: 2-6.

197. Vakoc, .CR., Letting, D.L., Gheldof, N., Sawado, Т., Bender, M.A., Groudine, M., Weiss, M.J., Dekker, J., and Blobel, G.A. (2005). Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol. Cell 17: 453^162.

198. Valadez-Graham, V., Razin, S.V., and Recillas-Targa, F. (2004). CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain. Nucleic Acids Res. 32: 1354-1362.

199. Vazquez, J., Belmont, A.S., and Sedat, J.W. (2001). Multiple regimes of constrained chromosome motion are regulated in the interphase Drosophila nucleus. Curr. Biol. 11: 1227-1239.

200. Verbovaia, L., and Razin, S.V. (1995). Analysis of the replication direction through the domain of alpha-globin-encoding genes. Gene 166: 255-259.

201. Vernimmen, D., De Gobbi, M., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G., and Higgs, D.R. (2007). Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression. EMBOJ. 26: 2041-2051.

202. Vignali, M., Hassan, A.H., Neely, K.E., and Workman, J.L. (2000). ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol. Cell. Biol. 20: 1899-1910.

203. Vyas, P., Vickers, M.A., Picketts, D.J., and Higgs, D.R. (1995). Conservation of position and sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin regulatory element. Genomics 29: 679-689.

204. Wang, J., Liu, H., Lin, C.M., Aladjem, M.I., and Epner, E.M. (2005). Targeted deletion of the chicken beta-globin regulatory elements reveals a cooperative gene silencing activity. J. Biol. Chem. 280: 23340-23348.

205. Weintraub, H., Larsen, A., and Groudine, M. (1981). Alpha-Globin-gene switching during the development of chicken embryos: expression and chromosome structure. Cell 24: 333— 344.

206. Wen, S.C., Roder, K., Hu, K.Y., Rombel, I., Gavva, N.R., Daftari, P., Kuo, Y.Y., Wang, C., and Shen, C.K. (2000). Loading of DNA-binding factors to an erythroid enhancer. Mol. Cell. Biol. 20:1993-2003.

207. West, A.G., Gaszner, M., and Felsenfeld, G. (2002). Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev. 16: 271-288.

208. Wijgerde, M., Grosveld, F., and Fraser, P. (1995). Transcription complex stability and chromatin dynamics in vivo. Nature 311: 209-213.

209. Wilmut, I. and Campbell. K.H. (1998). Quiescence in nuclear transfer. Science 281: 1611.

210. Wurtele, H., and Chartrand, P. (2006). Genome-wade scanning of HoxBl-associated loci in mouse ES cells using an openended chromosome conformation capture methodology. Chromosome Res. 14: 477-495.

211. Xu, N. Tsai, C.L., and Lee, J.T. (2006). Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science 311: 1149-1152.

212. Yasui, D., Miyano, M., Cai, S., Varga-Weisz, P., and Kohwi-Shigematsu, T. (2002). SATB1 targets chromatin remodelling to regulate genes over long distances. Nature 419: 641-645.

213. Yin, H., Wang, M.D., Svoboda, K., Landick, R., Block, S.M., and Gelles, J. (1995). Transcription against an applied force. Science 270: 1653-1657.

214. Yusufzai, T.M., Tagami, H., Nakatani, Y., and Felsenfeld, G. (2004). CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol. Cell 13: 291-298.

215. Zhang, L.F., Huynli, K.D., and Lee, J.T. (2007). Perinucleolar targeting of the inactive X during S phase: Evidence for a role in the maintenance of silencing. Cell 129: 693-706.

216. Zhao, H., and Dean, A. (2004). An insulator blocks spreading of histone acetylation and interferes with RNA polymerase II transfer between an enhancer and gene. Nucleic Acids Res. 32:4903-4919.

217. Zhou, G.L., Xin, L., Song, W., Di, L.J., Liu, G., Wu, X.S., Liu, D.P., and Liang, C.C. (2006). Active chromatin hub of the mouse alpha-globin locus forms in a transcription factory of clustered housekeeping genes. Mol. Cell. Biol. 26: 5096-5105.

218. Zhou, J., and Levine, M. (1999). A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell 99: 567-575.

219. Zhou, J., Ashe, H., Burks, C., and Levine, M. (1999). Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila. Development 126: 3057-3065.1. БЛАГОДАРНОСТИ

220. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы.

Информация о работе

Гаврилов, Алексей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы