Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гептапептида семакс и его аналогов на болевую чувствительность животных: возможные механизмы действия

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гептапептида семакс и его аналогов на болевую чувствительность животных: возможные механизмы действия"

На правах рукописи

Иванова Дарья Михайловна

ВЛИЯНИЕ ГЕПТАПЕПТИДА СЕМАКС И ЕГО АНАЛОГОВ НА БОЛЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЖИВОТНЫХ: ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ

Специальность 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (и.о. заведующего кафедрой - д.б.н., профессор A.A. Каменский).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.Г. Левицкая

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Р.У. Островская кандидат биологических наук И.Ю. Шамакина

Ведущая организация- Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Защита диссертации состоится 22 мая 2006 г. в 1530 часов на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 22 апреля 2006 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук

Б.А. Умарова

*

Ч 1

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Исследования эффектов меланокортинов, проводившиеся на протяжении последних 40 лет, показали, что спектр физиологической активности этих пептидов очень широк. Многочисленные эксперименты, проводившиеся как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что меланокортины, помимо известного гормонального действия, улучшают обучение и внимание; влияют на мотивационные процессы; ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе; оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС; воздействуют на развитие нервной системы; моделируют половое поведение; оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; взаимодействуют с опиоидной системой; влияют на болевую чувствительность и сердечнососудистую систему; вызывают снижение потребления пищи и веса тела; влияют на функционирование экзокринных желез. Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов, открытие семейства меланокортиновых рецепторов и разработка синтетических агонистов и антагонистов этих рецепторов предоставили новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях.

Препятствием для использования природных меланокортинов в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении. Для создания лекарственных препаратов на основе АКТГ-подобных пептидов необходимо было разработать их стабилизированные аналоги, лишенные гормональных эффектов. В результате многолетних исследований был разработан аналог АКТГ(4-10) пролонгированного действия - семакс. Клинические исследования показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений. Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении

инсульта. В настоящее время семакс ус щнир , медицине в

БИБЛИОТЕКА ( С. Петербург > О» И^«^/ ,

качестве ноотропного и нейропротекторного препарата Однако, несмотря на то, что семакс уже более 10 лет используется в клинической практике, исследования эффектов этого пептида, направленные на определение спектра физиологической активности препарата и на выяснение механизмов его нейротропного действия, продолжаются.

В ходе клинических исследований семакса было отмечено анальгетическое действие этого препарата при ряде болевых синдромов. Однако изучения влияния семакса на болевую чувствительность в экспериментах на животных не проводилось, не исследовалось взаимодействие семакса с опиоидной системой мозга. Поэтому актуальной задачей является оценка ноцицептивных эффектов семакса в норме и на фоне изменения активности медиаторных систем мозга.

Цели и задачи исследования. Целью представленной работы явилось изучение влияния семакса и ряда других синтетических меланокортинов на болевую чувствительность животных, а также оценка эффектов этого пептида на фоне изменения активности медиаторных систем организма.

Перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследование анальгетических эффектов семакса в различных экспериментальных моделях.

2. Изучение зависимости анальгетических эффектов ряда синтетических меланокортинов от структуры.

3. Исследование возможных механизмов влияния семакса на болевую чувствительность животных.

4. Исследование влияния семакса на развитие стресс-вызванной анальгезии и анальгезию, вызванную введением экзогенных опиоидов.

Научная новизна. В представленной работе впервые исследовано анальгетическое действие гептапептида семакс в экспериментах на животных. Проведено сопоставление влияния семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях, которое позволяет говорить об участии семакса в регуляции супраспинальных механизмов ноцицепции Показано, что для сохранения анальгетической активности синтетических меланокортинов - аналогов семакса необходимо наличие в их

структуре N-концевых аминокислотных остатков. При этом аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептидов - аналогов семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности анальгетических эффектов. При исследовании механизмов влияния семакса на болевую чувствительность животных впервые было показано, что в реализацию анальгетических эффектов семакса вовлечены серотонинергическая и опиоидная системы. Продемонстрированы антиопиоидные свойства семакса, которые были отмечены как на фоне активации эндогенной опиоидной системы, так и при введении экзогенных опиоидов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что меланокоротины участвуют в регуляции болевой чувствительности, однако механизмы ноцицептивного действия этих пептидов до настоящего времени не выяснены. Полученные в представленной работе результаты способствуют выяснению механизмов анальгетических эффектов меланокортинов и определению роли различных структурных элементов молекулы в сохранении антиноцицептивной активности пептидов этого класса. Изучение взаимодействия семакса с опиоидной системой подтверждает антиопиоидные свойства меланокортинов. Полученные результаты будут способствовать определению спектра физиологической активности семакса, выяснению механизмов его действия и расширению клинического применения лекарственного препарата семакс, в частности, в наркологической практике.

Апробация работы. Результаты работы были изложены на 17-ом и 18-ом Конгрессах Европейского общества нейропсихофармакологов (Стокгольм, 2004; Амстердам, 2005), на III Всероссийском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на I и II Российском симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), на XVIII и XIX съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004), на съезде Интернационального общества нейропсихофармакологов (Брно, 2004), на школе для молодых ученых Европейского общества нейропсихофармакологов (Ницца, 2004, 2006), на I съезде физиологов СНГ

(Сочи, 2005).

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 36 рисунков и 14 таблиц Список литературы включает 274 источника

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие препараты:

- семакс - Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (MEHFPGP),

- АКТГ(4-10) - Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (MEHFRWG) (фирма Serva)

- аналоги семакса, укороченные с N-конца,:

Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (EHFPGP), His-Phe-Pro-Gly-Pro (HFPGP),

- аналог АКТГ(5-7): Glu-Arg-Pro (ERP),

- аналоги семакса с заменой N-концевого аминокислотного остатка:

Lys-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (KEHFPGP), Gly-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (GEHFPGP), rMet-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (rMEHFPGP), где г - остаток глюконовой кислоты, Все синтетические меланокортины синтезированы в Секторе регуляторных пептидов Института Молекулярной генетики РАН. Пептиды вводили внутрибрюшинно в дозах 0.015, 0 05 и 0.5 мг/кг. Выбранные дозы препарата соответствуют рекомендованным для однократного введения дозам препарата "Семакс", который выпускается в виде 0.1% и 1% растворов.

- налоксон (naloxone, фирма Sigma) - блокатор опиоидных рецепторов. Крысам препарат вводили в дозах 1 и 5 мг/кг, мышам - в дозе 5 мг/кг.

- морфин - агонист ц- опиатных рецепторов (5 мг/кг).

- ципрогептадин (cyproheptadin, фирма Sigma) - неселективный блокатор серотониновых рецепторов. Препарат вводили в дозе 1 мг/кг.

- галоперидол (Гедеон Рихтер А.О., Венгрия)- неселективный блокатор рецепторов дофамина (Д1 и Д2) Препарат вводили в дозе 0.1 мг/кг

- клебоприд (clebopride, фирма Sigma) - блокатор Д2 рецепторов. Препарат вводили в дозе 0.2 мг/кг.

Все исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно, в водном растворе в объеме 1 мл/кг. Контрольные животные получали инъекцию растворителя в эквивалентном объеме в соответствующие сроки.

Методы определения болевой чувствительности животных

Для оценки болевой чувствительности животных использовали следующие тесты - тест "отдергивание хвоста", тест "сдавливание задней лапы", тест "горячая пластина" и модель висцеральных болей - метод "корчи".

1. ТЕСТ 'ОТДЕРГИВАНИЕ ХВОСТА"

Болевое раздражение крысе наносили путем погружения хвоста на 4 см в горячую воду с температурой 56° С. Уровень болевой чувствительности определяли по латентному периоду одергивания хвоста.

2. ТЕСТ "СДАВЛИВАНИЕ ЗАДНЕЙ ЛАПЫ"

Уровень болевой чувствительности в данном тесте определяли по величине критического давления на заднюю лапу крысы (ВКД). Измерение проводилось с помощью анальгезиметра фирмы "Ugo Basile". Задняя лапа крысы помещалась на маленькую подставку-диск. Сверху к лапе (в центре стопы) прикасался пластиковый конус, жестко связанный с направляющим стержнем прибора. На стержень нанесены деления, служащие для измерения ВКД После включения прибора по направляющему стержню начинает перемещаться грузик (скорость 1 деление/сек); давление вершины конуса на поверхность лапы равномерно нарастает. В момент возникновения болевых ощущений крыса отдергивает лапу. При этом регистрируется расстояние, пройденное грузиком по стержню. 1 условная единица длины соответствует увеличению давящей нагрузки на 20 г. Данные представлены в усл.ед. прибора.

3. ТЕСТ "ГОРЯЧАЯ ПЛАСТИНА"

В тесте "горячая пластина" (Ugo Basile, Italy) животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53° С. Регистрировали латентный период поведенческой реакции на болевой раздражитель - время от момента посадки до первого облизывания задней лапы.

4. Модель висцеральных болей - метод "КОРЧИ"

Исследование болевой чувствительности методом "корчи" проводили на мышах. Животным, предварительно получившим инъекцию семакса или растворителя, внутрибрюшинно вводили 0.6% раствор уксусной кислоты в объеме 0.1 мл/10 г. Затем мышей помещали в индивидуальные прозрачные пластиковые камеры и через 5 минут после введения кислоты подсчитывали количество корчей в течение 20 мин.

Исследование анальгезии, вызванной стрессом.

В качестве стрессогенного воздействия использовали метод "принудительного плавания", метод "иммобилизации" и метод "электроболевого раздражения". Эксперименты проводили на нелинейных крысах и мышах.

"Принудительное плавание"

Принудительное плавание проводили в цилиндрической емкости объемом 25 л на 2/3 заполненной водой с t=28-29°C. Животные опытных групп на 10 минут помещались в воду. После плавания животных сушили с помощью полотенца и сажали в отдельные клетки, обдуваемые теплым воздухом с помощью вентилятора. Контрольные животные на 10 минут помещались в отсадку.

'Иммобилизаиия"

Экспериментальные животные помещались в проветривающиеся плексигласовые цилиндры, препятствующие движению. В различных экспериментальных сериях длительность иммобилизации составляла 2 или 12 часов. Контрольные животные на такое же время помещались в отсадку, в

которой могли свободно перемещаться. Семакс вводили через 5 мин после окончания иммобилизации.

"Электро-болевое раздражение"

Животные помещались в экспериментальную камеру. Камеру устанавливали на решетчатый пол, соединенный с электростимулятором ЭСЛ-1. Электрическое раздражение наносили в течение 10 мин при частоте 200 Гц и длительности 0.5 мсек по 15 сек в течение каждой минуты. Напряжение варьировалось от 60 до 100 В. Семакс вводили через 5 мин после окончания воздействия.

Статистическая обработка данных

При статистической обработке данных для каждого животного при каждом измерении вычисляли относительное изменение болевой чувствительности по формуле:

(Р,— Ро)1 {Рта, — Ро)Х 100, где Р, - величина болевого порога при измерении, Р0- фоновая болевая чувствительность, Ртах - максимальная длительность болевого раздражения [АкН, 1975]. Для тестов "горячая пластина" и "отдергивание хвоста" она составляла Ртах=30 сек, для теста "сдавливание задней лапы" -Ртак=25 усл. ед.

Обработка результатов производилась с помощью пакета статистических программ ^айвйса". Вычислялись средние, дисперсии и стандартные статистические отклонения массивов данных. Отличия меяаду группами оценивались с помощью АШ\/А-методов, точного критерия Фишера и критерия х2- Отличие считали достоверным при р<0.05. Данные на графиках представлены в процентах в виде среднее + стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях.

Оценку изменения болевого порога при действии семакса проводили с помощью следующих методов: для термического раздражения: тест

"отдергивание хвоста", тест "горячая пластина"; для химического раздражения - модель висцеральных болей тест "корчи"; для механического - тест "сдавливание задней лапы".

На рис. 1 представлены результаты, полученные в тесте "сдавливание задней лапы". Семакс вводили в дозах 0.015, 0.05 и 0.5 мг/кг. Было показано, что препарат во всех исследованных дозах вызывает увеличение болевого порога, однако в группе животных, получавших семакс в дозе 0.5 мг/кг эффект был наиболее выражен. В этом тесте мы наблюдали дозозависимое развитие анальгетического эффекта.

В эксперименте с использованием теста "горячая пластина" семакс в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг приводит к снижению болевой чувствительности относительно контроля Введение семакса в меньшей дозе вызывало достоверное увеличение болевого порога относительно контроля с 30 по 60 мин, а большей - с 30 по 75 мин после инъекции (рис. 2).

На рис. 3 показаны результаты, полученные с использованием модели висцеральной боли - в тесте корчей, вызванных введением уксусной кислоты Было проведено две серии экспериментов. В первой серии количество корчей регистрировали с 30 по 50 мин, во второй - с 40 по 60 мин после введения пептида. Уксусную кислоту вводили за 5 минут до начала регистрации корчей. Как видно из гистограммы введение семакса в обеих дозах приводит к значимому снижению количества корчей с 30 по 60 мин после введения.

В тесте "отдергивания хвоста" введение семакса в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг не вызывает достоверного изменения болевой чувствительности в течение 120 минут после введения препарата (данные не представлены).

На основании полученных данных можно заключить, что внутрибрюшинное введение семакса в дозах 0.015, 0 05 и 0.5 мг/кг вызывает понижение болевой чувствительности животных в тестах "горячая пластина", "сдавливание задней лапы", "корчи" и не влияет на болевую чувствительность в тесте "отдергивание хвоста". Анальгетические эффекты семакса регистрируются через 15 мин после введения пептида, длительность эффекта составляет 45-90 минут.

Рис 1. Влияние семакса на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливание задней лапы". А- введение семакса в дозе 0 015 мг/кг, Б-в дозе 0.05 мг/кг, В- в дозе 0.5 мг/кг. На графике: по оси абсцисс - время после введения пептида (нулевая точка соответствует моменту введения препарата), по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и *** (р<0 001).

-о-контроль ■ о • семакс 0.5 мг/кг

-о - семакс 0.05 мг/кг -о- семакс 0.015 мг/кг

При исследовании анальгетических эффектов семакса нами использовались болевые раздражители различной природы - термическое (тест "горячая пластина" и тест "отдергивание хвоста"), механическое (тест "сдавливание задней лапы") и химическое (тест "корчи") раздражение. Увеличение болевого порога под действием пептида в тестах "горячая пластина", "сдавливание задней лапы" и "корчи" свидетельствует о том, что анальгетические эффекты семакса не зависят от природы болевого раздражителя.

-30 -15

30 45 60 75 90 105

■ контроль

- ° • семакс 0.5 мг/кг

Рис. 2. Влияние семакса в дозе 0,5 мг/кг на болевую чувствительность крыс в тесте "горячая пластина". На графике, по оси абсцисс - время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному

эффекту. Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и ** (р<0.01).

Реакция на болевой раздражитель, регистрируемая в тесте "отдергивание хвоста", осуществляется за счет двигательного рефлекса, который замыкается на уровне спинного мозга. Регуляция ответов на болевой раздражитель, регистрируемых в остальных тестах, осуществляется на супраспинальном уровне. Сопоставление результатов, полученных нами в различных экспериментальных моделях, позволяет предположить, что воздействие семакса на болевую чувствительность животных осуществляется при участии супраспинальных механизмов ноцицепции.

■ контроль □семакс 0,05 Нсемакс 0,5

Рис 3 Влияние семакса на болевую чувствительность мышей в тесте "корчи" На рисунке представлено среднее количество корчей, зарегистрированное А - с 30 по 50 мин и Б - с 40 по 60 мин после инъекции пептида Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0 05) и ** (р<0.01).

Изучение зависимости анальгетической активности синтетических

меланокортинов от структуры.

При исследовании зависимости анальгетических эффектов меланокортинов от структуры для измерения болевой чувствительности использовали тест "сдавливание задней лапы".

Изучение анальгетической активности АКТГ(4-10) показало, что внутрибрюшинное введение этого пептида в дозе 0.5 мг/кг приводило к повышению болевого порога в различных тестах. На рис. 4 представлены результаты, полученные в тесте "сдавливание задней лапы". Из графика видно, что эффекты АКТГ(4-10) менее выражены по сравнению с семаксом. Снижение дозы препарата приводит к исчезновению анальгетического действия. Сравнение анальгетических эффектов семакса и его природного прототипа свидетельствует о том, что замена трех аминокислотных остатков в АКТГ(4-10) на последовательность Рго-Фу-Рго приводит к увеличению анальгетической активности пептида при периферическом введении.

-конгрош

> -АКЩ4-10) 0,05 мг/кг • * • АКЩ4-10) 0,5 мг/кг

Рис. 4. Влияние АКЩ4-10) в дозах 0.05 и 0.5 мг/кг на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливания задней лапы". На графике: по оси абсцисс - время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному

эффекту Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0 05).

При исследовании анальгетической активности семи меланокортинов нами было показано, что, помимо семакса, анальгетическим действием обладают его аналоги с заменой 1Ч-концевого метионина на лизин и с модификацией (^-концевого метионина, присоединением остатка глюконовой кислоты.

ПЕПТИД ОБУЧЕНИЕ (*) _ Болевая , (

Семакс MEHFPGP т *

rMEHFPGP t ¥

KEHFPGP t +

GEHFPGP - -

EHFPGP t

__HFPGP T

_ERP i

Таблица 1. Влияние семакса и его аналогов на обучение и болевую чувствительность животных.

(*)- АвИтапп е( а1„ 1994; Глазова и др., 2005; Левицкая и др., 2000.

Замена метионина на глицин приводит к исчезновению влияния на болевую чувствительность. Аналоги семакса, укороченные с N-конца - EHFPGP и HFPGP, не оказывают влияния на болевую чувствительность животных. Введение трипептида ERP также не приводило к изменению болевого порога крыс в использованном тесте. В ходе работы было интересно не только выяснить как влияет структура пептидов этого класса на проявление анальгетической активности, но и сравнить полученные результаты с ранее известными данными о влиянии этих пептидов на обучение. Положительно на обучение влияют как укороченные с N-конца аналоги, так и аналоги с модификацией N-концевого метионина присоединением остатка глюконовой кислоты или замены его на лизин. Замена на глицин приводит к потере ноотропной активности, а трипептид ERP ухудшает обучение животных. Следовательно, укороченные с N-конца аналоги семакса воздействуют на обучение, но не влияют на болевую чувствительность. При этом аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептида -аналога семакса, играет важную роль в сохранении как ноотропных, так и анальгетических эффектов. Исследованные нами меланокортины по-разному влияют на обучение и болевую чувствительность. Сопоставляя полученные результаты с данными литературы можно предположить существование различных механизмов, лежащих в основе этих эффектов.

%

тш.

ШШ:

□ контроль

□ ципрогептадин 1 мг/кг

о семакс О 5 мг/кг а ципр / сем

Исследование эффектов семакса на Фоне Фармакологически вызванных изменений состояния различных медиаторных систем мозга

В следующей части работы мы проводили исследование анапьгетических эффектов

семакса на фоне блокады рецепторов серотонина, для этого использовался ципрогептадин, и опиоидных рецепторов - для этого мы использовали две дозы налоксона -1 и 5 мг/кг. Блокаторы вводили внутрибрюшинно за 10 минут до введения семакса. Как видно на рис. 5 введение семакса приводило к достоверному повышению болевого порога во всех экспериментах,

предварительное введение ципрогептадина устраняло

анальгетические эффекты

семакса. Инъекция налоксона в дозе 1 мг/кг не препятствовала влиянию семакса на болевую чувствительность животных. Налоксон в дозе 5 мг/кг устраняет эффекты семакса в указанный на

■ котроль 0 налоксон 1 мг/кг

□ семакс О 5 мг/кг О нал 1 / сем

I □ контроль

а налоксон 5 мг/кг

□ семакс О 5 мг/кг

В нал 5 / сем

Рис. 5. Влияние ципрогептадина (А) и налоксона (6, 8) на проявление анапьгетических эффектов семакса. На гистограммах представлено среднее изменение болевой чувствительности крыс в тесте «сдавливание задней лапы» через 30-60 мин после введения семакса По оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0 05)

гистограммах промежуток времени Известно, что налоксон с большей афинностью связывается с ц-опиоидными рецепторами, а при увеличении дозы он может взаимодействовать и с другими типами опиоидных рецепторов Мы предполагаем, что эффекты семакса не связаны с ц-рецепторами, но могут быть опосредованы другими типами опиоидных рецепторов.

С целью дальнейшего исследования взаимодействия семакса с опиоидной системой нами проводилось изучение влияния пептида на анальгезию, вызванную введением морфина. На рис. 6 представлено изменение болевой чувствительности в тесте "сдавливание задней лапы". Морфин повышал порог болевой чувствительности относительно контроля в течение всего периода регистрации. Введение семакса также вызывало повышение болевого порога. Однако при совместном введении с семаксом анальгетические эффекты морфина были менее выражены, достоверные отличия от группы крыс, получавших морфин, наблюдаются через 60-75 минут после введения семакса. Следовательно, предварительное введение семакса ослабляет анальгезию, вызванную введением морфина.

-30 -15 0 30 45 60 75 90 105 120

—□—контроль - -о- - семакс 0,5 мг/кг

| —♦— морфин 5 мг/кг —е- - семакс / морфин

Рис. 6. Влияние морфина, семакса и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливания задней лапы". На графике по оси абсцисс -время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0 05), отличия между группами «семакс» и «морфин-семакс» - # (р<0.05).

Влияние семакса на стресс-вызванную анальгезию.

В последней части работы для дальнейшего изучения взаимодействия семакса с опиоидной системой мозга мы исследовали влияние семакса на стресс-вызванную анальгезию (СВА). Известно, что стрессогенные воздействия различной природы вызывают понижение болевой чувствительности - развивается стресс-вызванная анальгезия. В первой серии экспериментов в качестве стрессогенного воздействия использовали метод принудительного плавания (10 мин, 28°С).

Эксперименты показали, что у всех животных стрессогенное воздействие вызывает достоверное повышение порога болевой чувствительности. Введение семакса за 15 мин до начала стрессогенного воздействия значимо ослабляло вызванную стрессом анальгезию (рис. 7). Эффект пептида проявлялся через 5 мин после плавания, и наблюдался в

Рис. 7. Влияние семакса в дозе 0.5 мг/кг на анальгезию, вызванную принудительным плаванием Пептид вводили за 15 мин до начала стрессогенного воздействия. На графике: по оси абсцисс - время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. Достоверные отличия опыта от контроля отмечены *** (р<0 005); отличия между опытными группами - # (р<0.05).

Известно, что в зависимости от характера стрессогенного воздействия может развиваться опиоидная или неопиоидная форма стресс-вызванной анальгезии. С целью выяснения природы анальгезии, мы исследовали влияние налоксона на повышение порога болевой чувствительности животных (рис. 8), наблюдаемое в наших условиях эксперимента.

■контроль

■налоксон 1 мг/кг

Рис. 8. Влияние предварительного введения налоксона на анальгезию, вызванную принудительным

плаванием. На графике" по оси абсцисс - время после введения препарата; по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. Достоверные отличия между группами, подвергавшимися

стрессогенному воздействию,

отмечены - # (р<0.05).

Было показано, что предварительное введение налоксона уменьшает выраженность анальгезии, вызванной стрессом, однако не блокирует ее полностью. Следовательно, в данном случае можно говорить о смешанной форме СБА. Таким образом, можно предположить, что семакс ослабляет опиоидную составляющую анальгезии, вызванной стрессом.

В следующей серии экспериментов пептид вводили через 5 мин после окончания принудительного плавания (рис. 9). В группе крыс, получавших инъекцию пептида в дозе 0.5 мг/кг, наблюдалось значимое снижение болевой чувствительности относительно контрольной группы.

100 80

40

55

-стресс-тонтроль - • -оресс-семакс

0,5 мг/кг)

Рис. 9. Влияние семакса на анальгезию, вызванную принудительным плаванием Пептид вводили через 5 мин после окончания стрессогенного воздействия. На графике: по оси абсцисс - время после введения препарата, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. Достоверные отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05), ** (р<0.01); отличия между группами, подвергавшимися стрессогенному воздействию, отмечены - # (р<0.05).

Изменения болевого порога достоверно превышали соответствующие показатели в группе стрессированного контроля через 10 и 25 мин после плавания. Следовательно, инъекция семакса в дозе 0,5 мг/кг через 5 мин после окончания плавания приводит к усилению СБА.

При исследовании влияния семакса на анальгезию, вызванную электроболевым раздражением (продолжительностью 10 мин), было показано, что инъекция пептида в дозе 0.5 мг/кг через 5 мин после воздействия усиливала СБА. Предварительное введение налоксона в этом случае не влияло на развитие анальгезии, т.е. наблюдалась не опиоидная форма СБА (данные не представлены) В случае иммобилизационного стресса (данные не представлены) использовалось длительное стрессогенное воздействие (2 и 12 часов). Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что иммобилизационный стресс приводит к развитию опиоидной формы СВА [Jorgensen et al., 1984; Kavaliers, 1987]. Введение семакса после окончания такого стрессогенного воздействия приводит к снижению, наблюдаемой в этих условиях СВА. На основании полученных данных можно предположить, что введение семакса приводит к ослаблению опиоидной компоненты СВА, но усиливает неопиоидную форму стресс-вызванной анальгезии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований влияния аналога АКТГ(4-10) семакса на болевую чувствительность животных можно заключить, что пептид обладает анальгетической активностью. Антиноцицептивное действие наблюдалось при внутрибрюшинном введении семакса в дозах 0.015 - 0.5 мг/кг. Достоверное увеличение болевого порога зарегистрировано через 15 мин после введения пептида; длительность эффекта составляла 45-90 мин. Сопоставление клинических данных [Королева и др., 1996] и полученных нами результатов позволяет заключить, что дозы и время развития анальгетических эффектов семакса совпадают при введении пептида человеку и животным.

Анализ полученных результатов и сопоставление их с данными литературы [Li et al, 1990; Walker et al, 1980; Walker, 1981] позволяют предположить, что анальгетические эффекты семакса, также как и анальгетические эффекты АКТГ, МСГ и их фрагментов связаны с супраспинальными механизмами регуляции болевой чувствительности.

Исследование механизмов анальгетического действия семакса показало, что эффекты пептида частично снимаются предварительной блокадой опиоидных рецепторов, а также отсутствуют на фоне блокады серотониновых и дофаминовых рецепторов. При действии болевого раздражителя по афферентным нервам передаются импульсы от рецепторов, реагирующих на стимулы "повреждающей" интенсивности. Аксоны афферентных ноцицептивных волокон заканчиваются в столбах заднего рога спинного мозга (рис. 10) Здесь они контактируют с передаточными нейронами спиноталамического пути, по которому болевая импульсация достигает задних ядер тапамуса. Клетки II сегмента заднего рога составляют студенистое вещество (substantia gelatinosa). Согласно "теории ворот" [Wall, Melzack, 1965] составляющие его вставочные нейроны регулируют проведение болевых импульсов от переферических нервных волокон к зрительному бугру. Система "контроля ворот" существует и в таламусе Структуры, относящиеся к этой системе, включают некоторые зоны околоводопроводного серого вещества, покрышки моста, миндалевидного тела, гиппокампа, ядер мозжечка, сетчатой формации. Они оказывают нисходящий контроль афферентного потока, вызывая торможение нейронов спинного мозга [Ивашкин, Шульпекова, 2002]. Медиаторами нисходящих цереброспинальных антиноцицептивных импульсов служат такие медиаторы, как серотонин и норадреналин (НА). Активация этих медиаторных систем приводит к снижению болевой чувствительности. Эндогенные опиоиды действуют как внутренние спинальные медиаторы, главным образом для нисходящих НА-ергических путей и, в меньшей степени, серотонинергических терминалей в дорзальных рогах спинного мозга [Liu et al., 1999]. При этом серотонинергические механизмы связаны в большей степени с к-, но не с ц-опиоидыми рецепторами [Vonvoigtlanderetal., 1984].

Рис. 10 Возможные механизмы анальгетического и антиопиоидного действия гептапептида семакс NA- норадреналин, 5НТ- серотонин, БП-болыше полушария, АЦ- аденилатциклаза, ПН- передаточный нейрон задних рогов спинного мозга, ОСВ- околоводопроводное серое вещество.

При исследовании влияния семакса на различные медиаторные системы мозга было показано, что пептид взаимодействует с серотонинергической и норадренергической системами. Так у крыс было показано увеличение уровня метаболита серотонина в стриатуме после в/б введения семакса в дозах 0.15 и 0.6 мг/кг [Еремин и др, 2004]. Повышение содержания метаболита серотонина свидетельствует об активации серотонинергической системы и ускорении оборота серотонина в мозге животных под действием пептида. В

исследованиях Adán et al было показано, что семакс является антагонистом МС4 рецепторов в экспериментах in vivo (при внутримозговом введении) и in vitro [Adán et al, 1994]. Некоторые авторы предполагают, что антагонисты МС4 рецепторов способны активировать серотонинергическую систему мозга [Chaki et al, 2003]. Исследование анапьгетических эффектов АКТГ на фоне блокады серотониновых рецепторов ципрогептадином показало, что влияние этого гормона на болевую чувствительность также связано с серотониновыми рецепторами [Wu et al., 1999]. При исследовании влияния семакса на НА-ергическую систему было показано, что введение пептида в дозе 0,01 мг на крысу приводило к значительному повышению содержания НА в гипоталамусе животных через 40 мин после инъекции [Гецова и др., 1988]. Известно, что меланокортины ускоряют освобождение норадреналина из депо и оказывают влияние на его метаболизм в мозге [Gold, Delanoy, 1981]. Таким образом, семакс, активируя серотонинергическую и НА-ергическую системы, может усиливать антиноцицептивную нисходящую систему и оказывать обезболивающее действие. Отсутствие анальгетических эффектов семакса на фоне блокады серотониновых рецепторов свидетельствует о важной роли этой медиаторной системы для реализации антиноцицептивного действия пептида. Для выяснения значения НА системы необходимы дополнительные исследования.

Увеличение активности опиоидной системы эндогенными (СБА) или экзогенными опиоидами изменяет направленность эффектов семакса. Так, семакс ослабляет анальгезию, вызванную морфином, и уменьшает СБА, содержащую опиоидный компонент. Таким образом, семакс обладает антиопиоидными свойствами. Механизм антиопиоидных эффектов меланокортинов в настоящее время не выяснен. Ранее было показано, что семакс in vitro не связывается с опиоидными рецепторами [Арефьева, 1992]. г

Кроме того, ослабление опиоидной анальгезии под действием семакса не связано с влиянием пептида на серотонинергическую систему, т.к. показано, что серотонин усиливает действие морфина [Eisenach, 1995], а при блокаде синтеза серотонина снижается стресс-вызванная анальгезия [Korzeniewska, Plaznik, 1995]. Возможно, антиопиоидное действие семакса осуществляется

на внутриклеточном уровне, известно, что опиоиды снижают содержание цАМФ в клетке, а меланокортины - увеличивают [Умрюхин, 2000]. Такое влияние семакса может осуществляться как на уровне ОСВ, так и на уровне задних рогов спинного мозга.

При введении семакса после стрессогенного воздействия пептид способен усиливать неопиоидную составляющую СВА В основе этих эффектов пептида, также как и в случае его собственного анальгетического действия, может лежать усиление активности серотонинергической и норадренергической систем.

Многочисленные исследования свидетельствуют об участии эндогенной МК системы в регуляции болевой чувствительности. Механизмы, которые опосредуют эти эффекты, до настоящего времени не выяснены, предполагается, что в реализации этих эффектов участвует МС4 рецептор [ВеИаэю е1 а1., 2003]. Изучение влияния семакса на болевую чувствительность животных показало, что этот пептид обладает анальгетической активностью и при этом ослабляет анальгетические эффекты эндогенных и экзогенных опиоидов. Следовательно, влияние семакса на ноцицепцию зависит от уровня активации опиоидной системы.

ВЫВОДЫ

1. Внутрибрюшинное введение семакса в дозах 0.015 - 0.5 мг/кг вызывает понижение болевой чувствительности животных в тестах "горячая пластина", "сдавливание задней лапы", "корчи" и не влияет на болевую чувствительность в тесте "отдергивание хвоста". Анальгетические эффекты семакса регистрируются через 15 мин после введения пептида; длительность эффекта составляет 45 - 90 минут.

2. Сопоставление результатов, полученных в разных экспериментальных моделях, позволяет предположить, что семакс оказывает влияние на центральную регуляцию болевой чувствительности.

3. Сравнение анальгетических эффектов семакса и его природного прототипа свидетельствует о том, что замена трех аминокислотных остатков в АКТГ(4-10) на последовательность Pro-Gly-Pro приводит к увеличению анальгетической активности пептида при периферическом введении.

4. Для сохранения анальгетической активности аналогов семакса необходимо наличие в их структуре N-концевых аминокислотных остатков. При этом аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептидов - аналогов семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности анальгетических эффектов.

5. Способность ципрогептадина и налоксона в дозах, не влияющих на болевую чувствительность, устранять действие семакса свидетельствует о том, что в реализацию анальгетических эффектов гептапептида вовлечены серотонинергическая и опиоидная системы.

6. Семакс снижает анальгезию, вызванную как эндогенными (стресс-вызванная анальгезия), так и экзогенными (внутрибрюшинное введение морфина) опиоидами.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванова ДМ., Себенцова Е.А., Левицкая Н.Г., Алфеева Л.Ю, Мясоедов Н.Ф. Исследование анальгетической активности гептапептида семакс // Тезисы докладов XVIII съезда физиологического общества им И.П.Павлова.- Казань.-2001 - с. 100.

2. Иванова ДМ., Виленский Д.А., Левицкая Н Г., Андреева Л.А, Сарычева Н.Ю., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф. Модуляция семаксом анальгезии, вызванной опиоидами // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества - С -Петербург,- 2002 - с 542.

3. Иванова Д М., Левицкая Н.Г, Андреева Л А., Алфеева Л.Ю., Каменский A.A., Мясоедов Н Ф. Влияние семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях // ДАН - 2003 - т 388 - № 3,- с 416-419

4. Иванова Д.М, Виленский ДА., Левицкая Н.Г, Андреева Л А, Каменский А.А Сравнительное исследование анальгетической активности семакса и его

аналога, лишенного N-концевого метионина // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Тезисы стендовых сообщений М , 2003, с 71.

5 Иванова Д М , Левицкая Н Г, Андреева Л А , Каменский А А , Мясоедов Н Ф Исследование механизмов анальгетических эффектов семакса // Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов - Москва-2003,- с.210.

6 Ivanova D М , Vilensky D А , Levitskaya N G , Andreeva L А , Kamensky А А АСТН(4-10) analogue SEMAX attenuates opioid-induces analgesia // J of European College of Neuropsychopharmacology (Abstracts of the ECNP Workshop on Neuropsychopharmacology for Young Scientists in Europe) - Nice - 2004 - v 14 (suppl. 1).-p. S32-S33.

7 Иванова ДМ., Виленский ДА, Левицкая НГ, Андреева ЛА, Каменский АА, Мясоедов Н Ф. Влияние семакса на стресс-вызванные анальгезию и тревожность // Рос физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 65.

8. Иванова Д.М., Виленский Д.А., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. Исследование анальгетических и противовоспалительных свойств аналога фрагмента АКЩ4-10) - гептапептида семакс // Тезисы докладов III Российского Конгресса по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)». 2004. с. 29.

9 Ivanova DM., Vilensky D.A, Levitskaya N.G., Andreeva L.A, Kamensky A A. The ACTH (4-10) analogue SEMAX influence opioid form of stress-induced analgesia II Central /East European C.I.N.P. regional meeting. Brno. 2004. p. 26-27.

10. Ivanova D.M., Vilensky D.A., Levitskaya N.G., Andreeva L.A., Kamensky A A Study of mechanisms of the ACTH(4-10) analogue Semax analgesic activity II The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology.- 2004,- v 14.- supl 3.- p. S395

11. Иванова Д.М., Виленский ДА., Левицкая Н Г., Андреева Л А., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. Влияние модификации N-концевого аминокислотного остатка на выраженность анальгетических эффектов аналогов семакса // II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Тезисы докладов и стендовых сообщений. Санкт-Петербург - 2005 - с 54

12 Иванова ДМ., Виленский ДА, Левицкая НГ, Андреева Л.А, Каменский АА, Мясоедов Н Ф Исследование взаимодействия семакса с опиоидной системой // Научные труды I съезда физиологов СНГ - 2005 - т 1-е 18

13 Vilensky D., Ivanova D.M, Levitskaya NG., Andreeva L.A, Kamensky A.A, Myasoedov N F. Semax influence on swim stress-induced analgesia and anxiety // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology - 2005.- v. 15.- supl. 3.-p. S371.

14 Ivanova D.M., Vilensky D, Levitskaya N.G., Andreeva L.A., Kamensky A.A Study of analgesic effects of semax analogues depends on their structure // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology.- 2005.- v. 15.- supl. 3.- p. S616.

15 Иванова ДМ., Виленский Д.А., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф. Исследование зависимости анальгетической активности аналогов меланокортинов от структуры // Известия Академии Наук, серия Биологическая.- 2006,-т 2 - стр. 162-167

16.Иванова Д.М., Виленский ДА., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А, Мясоедов Н.Ф Влияние семакса на изменения болевой чувствительности и поведения животных, вызванные принудительным плаванием // ДАН,- 2006,- т. 407,- № 2,- с. 275-279.

17.Vilensky D., Ivanova D, Levitskaya N., Andreeva L, Kamensky A., Myasoedov N. Semax effects on ras behavior changes induced by chronic restraint stress // J. of European College of Neuropsychopharmacology (Abstracts of the ECNP Workshop on Neuropsychopharmacology for Young Scientists in Europe).- Nice.- 2006,- v. 16 (suppl. 1).- p. S53.

18. Иванова Д.М., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф. Сравнительное исследование анальгетической активности фрагмента АКТГ(4-10) и его аналога семакса // БЭБиМ.-2006.-(в печати).

Заказ № 67/04/06 Подписано в печать 13 04.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

/П*м\ °°°"ЦИФР°ВИЧ0К" тел (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 V Л www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

p-8024 ¡

I

i

\

i

с

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Дарья Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Природные меланокортины

2. Рецепторы меланокортинов

3. Негормональные эффекты меланокортинов

3.1. Влияние меланокортинов на обучение и память

3.2. Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов

3.3. Действие меланокортинов на двигательную активность

3.4. Действие меланокортинов на эмоциональное состояние животных

3.5. Влияние меланокортинов на сердечно-сосудистую систему

3.6. Влияние меланокортинов на пищевое поведение

3.7. Влияние меланокортинов на половое поведение

3.8. Влияние меланокортинов на иммунную систему

4. Влияние меланокортинов на болевую чувствительность

5. Взаимодействие с опиоидной системой

6. Стресс-вызванная анальгезия

7. Влияние меланокортинов на различные медиаторные системы мозга

8. Синтетические аналоги меланокортинов

9. Аналог АКТГ(4-10) - Семакс

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы определения болевой чувствительности животных

2. Исследование анальгезии, вызванной стрессом

3. Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Исследование анальгетических эффектов семакса в различных экспериментальных моделях

1.1. Изучение эффектов семакса в тесте "отдергивание хвоста"

1.2. Изучение анальгетического действия семакса в тесте "горячая пластина"

1.3. Изучение эффектов семакса в тесте "сдавливания задней лапы"

1.4. Изучение анальгетического действия семакса в тесте "корчи"

Обсуждение результатов

Глава 2. Исследование влияния АКТГ(4-10) на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях

2.1. Изучение анальгетического действия АКТГ(4-10) в тесте горячая пластина"

2.2. Изучение анальгетического действия АКТГ(4-10) в тесте "сдавливания задней лапы"

2.3. Изучение анальгетического действия АКТГ(4-10) в тесте "корчи"

Обсуждение результатов

Глава 3. Зависимость анальгетической активности синтетических меланокортинов от структуры

Обсуждение результатов

Глава 4. Исследование эффектов семакса на фоне фармакологически вызванных изменений состояния различных медиаторных систем мозга

4.1. Изучение анальгетического действия семакса на фоне предварительного введения ципрогептадина

4.2. Изучение анальгетического действия семакса на фоне блокады рецепторов дофамина

4.2.1. Влияние галоперидола на проявление анальгетических эффектов семакса

4.2.2. Влияние клебоприда на проявление анальгетических эффектов семакса

4.3. Изучение анальгетического действия семакса на фоне блокады опиоидных рецепторов налоксоном

4.3.1. Влияние налоксона (1 мг/кг) на проявление анальгетических эффектов семакса

4.3.2. Влияние налоксона (5 мг/кг) на проявление анальгетических эффектов семакса

4.4. Влияние семакса на анальгезию, вызванную введением морфина

4.4.1. Исследование влияния семакса на анальгезию, вызванную введением морфина в тесте "отдергивания хвоста"

4.4.2. Исследование влияния семакса на анальгезию, вызванную введением морфина в тесте "сдавливания задней лапы"

Обсуждение результатов

Глава 5. Влияние семакса на стресс-вызванную анальгезию

5.1. Изучение влияния семакса на развитие стресс-вызванной анальгезии у мышей

5.2. Влияние семакса на развитие стресс-вызванной анальгезии у крыс

5.2.1. Влияние предварительного введения семакса на развитие анальгезии, вызванной методом принудительного плавания

5.2.2. Влияние семакса на развитие стресс-вызванной анальгезии при введении пептида после окончания стрессирующего воздействия

5.2.2.1. Влияние семакса на развитие анальгезии, вызванной принудительным плаванием

5.2.2.2. Влияние семакса на развитие анальгезии, вызванной иммобилизацией животных

5.2.2.3. Влияние семакса на развитие анальгезии, вызванной электро-болевым раздражением

Обсуждение результатов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гептапептида семакс и его аналогов на болевую чувствительность животных: возможные механизмы действия"

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Исследования эффектов меланокортинов, проводившиеся на протяжении последних 40 лет, показали, что спектр физиологической активности этих пептидов очень широк. Многочисленные эксперименты, проводившиеся как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что меланокортины, помимо известного гормонального действия, улучшают обучение и внимание; влияют на мотивационные процессы; ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе; оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС; воздействуют на развитие нервной системы; моделируют половое поведение; оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; взаимодействуют с опиоидной системой; влияют на болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему; вызывают снижение потребления пищи и веса тела; влияют на функционирование экзокринных желез. Использование коротких фрагментов природных гормонов позволило отделить эндокринные свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия. Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов, открытие семейства меланокортиновых рецепторов и разработка синтетических агонистов и антагонистов этих рецепторов предоставили новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях.

Препятствием для использования природных меланокортинов в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении. Для создания лекарственных препаратов на основе АКТГ-подобных пептидов необходимо было разработать их стабилизированные аналоги, лишенные гормональных эффектов. Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы. В ходе этих экспериментов были разработаны аналоги природных меланокортинов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной биологической активностью и высокой устойчивостью к действию протеаз.

В результате многолетних исследований был разработан аналог АКТГ(4-10) пролонгированного действия - семакс. Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическим эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемическиго инсульта. Клинические исследования показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений. Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта. На сегодняшний день этот пептид является единственным широко используемым в клинике лекарственным нейротропным препаратом, разработанным на основе фрагментов АКТГ. Однако, несмотря на то, что семакс уже более 10 лет используется в клинической практике, исследования эффектов этого пептида, направленные на определение спектра физиологической активности препарата и на выяснение механизмов его нейротропного действия, продолжаются.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что меланокоротины участвуют в регуляции болевой чувствительности, однако механизмы ноцицептивного действия этих пептидов до настоящего времени не выяснены. В ходе клинических исследований семакса было отмечено анальгетическое действие этого препарата при ряде болевых синдромов. Однако изучения влияния семакса на болевую чувствительность в экспериментах на животных не проводилось. Представленная работа посвящена изучению влияния семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях, определению зависимости анальгетического действия пептида от структуры, а также исследованию возможных механизмов антиноцицептивных эффектов этого препарата. Кроме того, задачей данного исследования явилась оценка взаимодействия семакса с опиоидной системой организма. Полученные результаты будут способствовать определению спектра физиологической активности семакса, выяснению механизмов его действия и расширению клинического применения лекарственного препарата семакс.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Иванова, Дарья Михайловна

Результаты исследования влияния семакса в дозе 0.5 мг/кг на анальгезию, развивающуюся в ответ на воздействие электрического тока длительностью 10 мин, представлены на рис. 34А. В использованных условиях электро-болевое раздражение приводит к увеличению порога болевой чувствительности через 1025 мин как в контрольной группе (Р(1.23)=3.94; р<0.059), так и в группе животных, получавших инъекцию семакса (Р(1.22)=4.11; р<0.055). При этом в группе крыс, которым вводили семакс, через 10 мин после окончания электроболевого раздражения анальгезия была более выражена, чем в группе стрессированного контроля (р<0.05). Предварительное введение налоксона в дозе 1 мг/кг (рис. 34Б) не влияло развитие анальгезии, вызванной использованным электро-болевым раздражением. Таким образом, введение семакса через 5 мин после электро-болевого раздражения усиливает неопиоидную форму СВА.

Обсуждение результатов

Исследование влияния семакса на стресс-вызванную анальгезию проводили на нелинейных крысах и мышах. При исследовании СВА у мышей нами была предпринята попытка получить у животных опиоидную и неопиоидную формы анальгезии. Согласно литературным данным у нелинейных мышей слабое стрессогенное воздействие вызывает опиоидную форму, а сильное вызывает неопиоидную форму анальгезии [Мо§П, 1999]. В наших условиях эксперимента принудительное плавание в течение 10 мин (Т 28°) приводило к развитию анальгезии, которая не снималась предварительным введением налоксона. Т.е. использованные условия приводили к развитию неопиоидной формы СВА. Введение семакса в данных условиях не только не ослабляло, но и усиливало понижение болевой чувствительности. Плавание животных в течение 3 мин (Т 28°) приводит к развитию анальгезии, которая частично снимается налоксоном. Т.е. была получена смешанная форма СВА, содержащая опиоидный компонент. В этих условиях семакс снижал порог болевой чувствительности. А 45-ти секундное плавание оказалось недостаточным воздействием для развития анальгезии - у мышей в выбранных нами условиях эксперимента не удалось получить понижения болевой чувствительности. Введение семакса в этом случае также приводило к повышению болевого порога мышей. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что введение семакса не ослабляет неопиоидную форму стресс-вызванной анальгезии, причем пептид может усиливать анальгетически эффект. Если СВА содержит опиоидный компонент, то семакс способен уменьшать повышение болевого порога. При отсутствии СВА в экспериментах с мышами наблюдаются собственные анальгетические эффекты семакса.

При исследовании стресс-вызванной анальгезии на крысах было показано, что принудительное плавание в течение 10 мин (Т 28°) вызывает у животных повышение болевого порога в тесте "сдавливания задней лапы". В этих условиях введение семакса в дозе 0.5 мг/кг до стрессогенного воздействия приводит к достоверному снижению анальгезии, вызванной стрессом, уже через 5 мин после плавания (через 30 мин после инъекции). При последующих измерениях обе дозы семакса значимо ослабляли стресс-вызванную анальгезию. Можно отметить, что в группах крыс, получавших семакс в обеих дозах, наблюдается достоверное снижение болевого порога относительно фоновых значений. Но это увеличение болевой чувствительности нельзя назвать гиперальгетическим эффектом семакса в условиях стресс-вызванной анальгезии, поскольку в опытах с использованием теста "сдавливания задней лапы" без стрессогенного воздействия такой характер изменения болевой чувствительности в ходе эксперимента был зарегистрирован в контрольной группе животных.

Предварительное введение налоксона снижало анальгезию, вызванную использованным стрессогенным воздействием, однако не блокировало ее полностью. Следовательно, в данных условиях эксперимента наблюдалась смешанная форма СВА у крыс, опиоидный компонент которой снимался налоксоном. На основании полученных результатов можно заключить, что предварительное введение семакса ослабляет смешанную форму СВА у крыс.

Схожее развитие СВА и эффектов семакса мы наблюдали как при продолжительности плавания 5 мин, так и при 10-ти минутном плавании. Развивающаяся анальгезия снижалась при действии налоксона и ослаблялась предварительным введением семакса. При 5-минутном стрессирующем воздействии обе дозы семакса были одинаково эффективны, а при 10-минутном - эффекты большей доза пептида были более выражены.

При исследовании влияния семакса, введенного после окончания стрессогенного воздействия, использовали несколько моделей: принудительное плавание, иммобилизацию и электро-болевое раздражение. Было показано, что введение семакса в дозе 0.5 мг/кг после окончания 10-минутного принудительного плавания усиливало анальгезию. Как нами ранее было показано, такое использованное воздействие приводит к развитию СВА, содержащей опиоидный компонент. Инъекция семакса после электро-болевого раздражения (продолжительность 10 мин) также усиливало развивающуюся СВА. Предварительное введение налоксона в этом случае не влияло на развитие анальгезии, т.е. наблюдалась не опиоидная форма СВА. В случае иммобилизационного стресса использовалось длительное стрессогенное воздействие (2 и 12 часов). Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что иммобилизационный стресс приводит к развитию опиоидной формы СВА [Hall, Steward, 1983; Jorgensen et al., 1984; Kavaliers, 1987]. Введение семакса после окончания такого стрессогенного воздействия приводит к снижению наблюдаемой в этих условиях СВА.

На основании полученных данных можно предположить, что предварительное введение семакса в использованных дозах приводит к ослаблению опиоидной составляющей анальгезии, вызванной принудительным плаванием. После окончания стрессогенного воздействия введение пептида в дозе 0.05 мг/кг не влияет на СВА, при введении семакса в дозе 0.5 мг/кг направленность его эффекта зависит от длительности воздействия. Инъекция пептида после 10-минутного плавания или электро-болевого раздражения приводит к усилению неопиоидной и смешанной формы СВА. Введение семакса в дозе 0.5 мг/кг после окончания длительного стрессогенного воздействия (иммобилизация) приводит к уменьшению СВА, возможно за счет снижения активности эндогенной опиоидной системы.

Результаты, полученные при исследовании влияния семакса на различные формы стресс-вызванной анальгезии, позволяют предположить, что пептид блокирует только опиоидную форму анальгезии, вызванной стрессом.