Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейротропные эффекты β-казоморфина-7 при хроническом и остром введении детенышам белых крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малиновская, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ рЖАЗОМОРФИНА

ДЕТЕНЫШАМ БЕЛЫХ КРЫС РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ

1.1. Влияние введения (З-казоморфинав 1-14 дни после рождения на поведение детенышей крыс в тесте "открытое поле" и тестах на тревожность.

1.2. Влияние введения (З-казоморфинав 1-14 дни после рождения на обучение детенышей крыс.

1.3. Влияние введения (З-казоморфинав 1-14 дни после рождения на поведение детенышей крыс в тестах на тревожность и депрессию.

1.4. Влияние введения (З-казоморфинав 10-23 дни после рождения на поведение детенышей крыс в тесте "открытое поле" и тестах на тревожность.

1.5. Обсуждение результатов, представленных в разделах 1.1-1.4.

2. ЭФФЕКТЫ ОДНОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ (5-КАЗОМОРФИНА-7 ДЕТЕНЫШАМ БЕЛЫХ КРЫС РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ

2.1. Результаты экспериментов.

2.2. Обсуждение результатов.

3. ХРОНИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ АНАЛОГОВ р-КАЗОМОРФИНА-7 И СЕМАКСА ДЕТЕНЫШАМ БЕЛЫХ КРЫС

3.1. Влияние введения р-казоморфина-5 в 1-14 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

3.2. Влияние введения (5-казоморфина-6 в 1-14 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

3.3. Влияние введения (5-казоморфина-4 в 1-14 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

3.4. Влияние введения гептапептида семакс в 1-14 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

3.5. Обсуждение результатов.

4. ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ МОРФИНА И НАЛОКСОНА ДЕТЕНЫШАМ БЕЛЫХ КРЫС РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ.

4.1 . Влияние введения морфина в 1-14 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

4.2 . Влияние введения морфина в 21-34 дни после рождения на поведение детенышей белых крыс.

4.3. Влияние введения налоксона в 21-34 дни после рождения на поведение детенышей крыс в тесте "открытое поле" и тестах на тревожность.

4.4. Влияние введения налоксона в 21-34 дни после рождения на поведение детенышей крыс в тесте "открытое поле" и тестах на тревожность.

4.5 Обсуждение результатов.

5. НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВВЕДЕНИЯ (5-КАЗОМОРФИ1IA-7 И НАЛОКСОНА ДЕТЕНЫШАМ БЕЛЫХ КРЫС

5.1. Влияние препаратов на содержание серотонина в мозге крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нейротропные эффекты β-казоморфина-7 при хроническом и остром введении детенышам белых крыс"

Известно, что пептидные регуляторы - это, как правило, вещества эндогенного происхождения. Они чаще всего образуются прямо в тех структурах, на которые затем оказывают действие (например, в нервной системе), но могут также переноситься кровью и другими жидкими средами, выполняя гормональную функцию (Розен, 1994; Ашмарин, Каразеева, 1999). Однако есть и другой путь появления регуляторных пептидов в организме - а именно, проникновение через ЖКТ. Показано, что даже в норме ди- и трипептиды способны проходить из полости кишечника в кровь. При повреждениях слизистой в результате заболеваний либо сильного стресса в плазму попадают уже гораздо более длинные молекулы.

Но особенно характерно проникновение внутрь организма пептидов и даже белков пищевого происхождения для новорожденных млекопитающих (Зуфаров, 1998). Для каждого из таких пептидов существует вероятность, что попавшая в кровь последовательность аминокислот проявит регуляторные свойства - то есть будет влиять на те или иные органы и их системы. Особенно важно учитывать такую возможность, когда речь идет о белках, самой природой предназначенных для питания - а именно, о казеинах молока.

В настоящее время показано, что в результате ферментативной деградации молекул а-, (3- и к-казеинов могут образовываться десятки фрагментов, проявляющих иммуномодулирующую, нейротропную, антитромботическую, антигипертензивную и другие виды физиологической активности (Lemieux, Amiot, 1990; Meisel, 1997). Наиболее известными из них являются опиоидные пептиды -так называемые казоморфины (Teschemacher et al., 1997), а среди казоморфинов -[З-казоморфины (фрагменты р-казеина). Последние отличаются высокой устойчивостью к ферментативной деградации и наибольшим среди пептидов пищевого происхождения сродством к опиоидным рецепторам (в первую очередь, ц-типа).

Именно в случае (3-казоморфинов исследователи приходят к выводу о том, что их аминокислотная последовательность не просто "случайно совпадает" с первичной структурой энкефалинов и, особенно, эндоморфинов. По-видимому, она является результатом эволюционного процесса, и Р-казоморфины способны регулировать деятельность и созревание различных систем организма новорожденного, питающегося материнским молоком (Teschemacher, Koch, 1990; Meisel, 1997).

Все сказанное служит предпосылкой для изучения структурно-конформационных, биохимических и физиологических свойств (3-казоморфинов. В настоящее время доступная библиография по этой проблеме составляет более 300 статей. Однако, почти все эти исследования проведены на взрослых животных, а также на культурах тканей и in vitro. И такой важнейший вопрос, как влияние Р-казоморфинов на целостный организм детенышей млекопитающих, остается практически не изученным. Опубликованы лишь данные, касающиеся обнаружения p-казоморфинов в организме (в том числе и мозге) новорожденных (Umbach et al., 1985; Pasi et al., 1993), а также несколько работ, касающихся воздействия однократно вводимых p-казоморфинов на болевую чувствительность и поведение детенышей крыс (Blass, Blom, 1996, Cuomo et al., 1988, Taira et al., 1990).

В 1995 году на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ была начата серия экспериментов, направленных на анализ нейротропных эффектов P-казоморфинов, хронически вводимых новорожденным животным. При этом анализировались поведенческие изменения, сохранявшиеся через несколько недель после последней инъекции препаратов. Выбор основного исследованного вещества - гексапептида YPFPGPI (т.н. Р-казоморфина-7), дозы и способа его применения (1 мг/кг, внутрибрюшинно) был основан на предыдущих опытах, в которых анализировались поведенческие эффекты Р-казоморфинов, однократно вводимых взрослым белым крысам (Дубынин с соавт., 1992, Маклакова, 1996). Было показано, что ежедневневные инъекции пептида (21-34 дни после рождения) приводят к достоверным изменениям тревожности и исследовательской активности экспериментальных животных (Маклакова с соавт., 1996). Эти изменения сохранялись по крайней мере до возраста 56 дней и носили зависимый от пола характер.

Таким образом, для системно вводимого р-казоморфина-7 была доказана принципиальная возможность отставленного влияния на поведение детенышей млекопитающих и, видимо, на процессы созревания их мозга в раннем постнатальном периоде. Соответственно, была предложена программа дальнейших более детальных и систематических исследований данного эффекта, результатом выполнения которой и является представленная работа.

В ходе проведения экспериментальных серий нами изучались отставленные нейротропные эффекты:

- во-первых, самого [З-казоморфина-7, хронически вводимого в более ранние периоды - 1-14 и 10-23 дни после рождения; при этом двухнедельный интервал инъекций был сохранен, а набор поведенческих тестов существенно дополнен методиками обучения с использованием положительного и отрицательного подкрепления;

- во-вторых, укороченных как с N-, так и с С-конца аналогов р-казоморфина-7 с целью определения зависимости наблюдаемых поведенческих изменений от первичной структуры пептида;

- в-третьих, относительно низких доз морфина и налоксона, как классических агониста и антагониста опиоидных рецепторов, служивших в нашей работе веществами сравнения.

Совокупность полученных данных позволила впервые с достаточной убедительностью доказать факт существования отставленных нейротропных эффектов опиоидных фрагментов (3-казеина молока, что подтверждено патентом на изобретение Российского агенства по патентам и товарным знакам № 2161500 от 10 января 2001 г. Охарактеризована зависимость наблюдаемых изменений от возраста животных, их пола, а также первичной структуры вводимого пептида.

Анализ и обсуждение полученных результатов потребовали привлечения данных, относящихся к большому числу областей физиологии мозга. Так, оказалось необходимым составить представление о современном уровне изученности опиоидной системы мозга, свойств ее рецепторов и эндогенных лигандов, а также механизмов взаимодействия с другими нейромедиаторными системами. Эта информация приведена в первой части раздела "Обзор литературы". Вторая его часть посвящена краткой сводке работ, выполненных с p-казоморфинами как за

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Препараты опиумного мака Papaver somniferum использовались человечеством для облегчения боли с давних времен (Соломзес с соавт., 1998). В 1803 году был выделен кристаллический образец их основного алкалоида -морфина; позже был открыт и описан кодеин. Эти соединения и их производные в настоящее время относят к группе т.н. наркотических анальгетиков. Они характеризуются, с одной стороны, мощной анальгетической активностью; с другой - способностью вызывать эйфорическое состояние, а при повторном применении -физическую и психическую зависимость (Машковский, 1998.). Другими эффектами опиоидов являются снотворное действие, угнетение дыхательного и кашлевого центров, повышение тонуса гладкой мускулатуры внутренних органов (в т.ч. тонкого и толстого кишечника, что ведет к ослаблению перистальтики). Основной обмен и температура тела, как правило, понижаются.

1. Опиоидные рецепторы и их свойства

Модификации молекулы морфина, создание его искусственных производных (промедол, фентанил и др.) показали, что для обеспечения анальгетического эффекта морфиноподобных соединений необходимо наличие у них четких структурных и стереохимических свойств. В свою очередь, это привело к гипотезе о существовании специфических рецепторов, способных к селективному связыванию опиоидов (Beckett, Casey, 1954). Прямые доказательства их существования были получены в 1972-1973 годах сразу тремя независимыми исследовательскими группами (Terenius, 1972; Pert, Snyder, 1973; Simon et al., 1973). Параллельно развивалась концепция, предполагающая существование более чем одного типа опиоидных рецепторов. Она возникла для объяснения свойств налорфина, который, блокируя эффекты морфина, имел, однако, собственную анальгетическую активность. Martin (1967) заключил, что подобное действие налорфина опосредуется с помощью рецепторов, которые отличаются от мест связывания морфина. Опиоидные рецепторы с такими свойствами позже были отнесены к к-типу, а морфин-чувствительные рецепторы - к ji-типу.

Существование 8-рецепторов было предположено для объяснения наблюдаемого in vitro профиля активности энкефалинов. Была также показана и относительная неселективность налоксона, обращающего вызванное эндогенными опиоидами ингибирование сокращений vas deferens мыши (Lord et al., 1977). Большое количество доказательств множественности опиоидных рецепторов появилось в результате описания фармакологической активности кетазоцина и N-аллилнорметазоцина (SKF 10047) (Martin et al., 1976).

Существование 3-х "классических" типов опиоидных рецепторов (р-, к-, и 5-) позднее было подтверждено с помощью радиолиганд-связывающих исследований с использованием гомогенатов мозга. В настоящее время клонированы гены, кодирующие эти рецепторы (Evans et al, 1992, Kieffer et al., 1992; 1993; Minami et al., 1993). Кроме этого, дополнительно определена последовательность ДНК, несущая информацию о т.н. орфановых рецепторах, которые имеют высокую степень гомологии с классическими опиоидными рецепторами (Mollereau et al., 1994).

В 1981 году Pasternak с соавт. предложили дополнительное разделение р-рецепторов на pi и р2 подтипы на основе 2-х фазного связывания меченых р-радиолигандов. In vivo исследования показали, что напоксазин (в дальнейшем был определен как селективный блокатор р(-рецепторов) устраняет морфин-индуцированную антиноцицепцию, но не блокирует вызванную морфином депрессию дыхания, а также развитие морфиновой зависимости (Ling et al., 1985). Для клонированного гена MOR-1, кодирующего р-рецепторы, показана 50-70 % гомология с генами, кодирующими к- (KOR-1), 8- (DOR-1) и орфановые (ORL0 рецепторы. Были клонированы 2 варианта MOR-1 гена, отличающиеся только по присутствию или отсутствию 8-ми С-концевых аминокислот. Однако, соответствие этих вариантов pi и р2-рецепторам не доказано. Выяснено, что у MOR-1 нокаутных мышей морфин не индуцирует антиноцицепцию. Следовательно, по крайней мере у этих животных морфиновая анальгезия не опосредуется через к-, или 8-опиоидные рецепторы (Matthes et al. 1996). Кроме того, морфин не проявил способности индуцировать физическую зависимость в отсутствии MOR-1 гена.

Для 5-рецепторов на сегодняшний день также клонирован единственный ген

- D0R-1. Тем не менее, на основе in vivo и in vitro фармакологических экспериментов, предполагается существование двух подтипов - 5, и 62. Показано, что у грызунов супраспинальная антиноцицептивная активность DPDPE (D-Pen(2)-Б-Реп(5)-энкефалин) - может селективно отменяться BNTX (7-бензилиденналтрексон) или DALCE (0-А1а-0-Ьеи-энкефалил-Су8) (Jiang et al., 1991; Sofuoglu et ah, 1993), тогда как антиноцицептивное действие [D-Ala]-дельторфина II может быть обращено только налтрибеном или налтриндолом (Sofuoglu et ah, 1991). Доказательством существования подтипов 5-рецепторов в in vitro экспериментах является ингибирование аденилатциклазной активности мембраны мозга крыс (Buzas et ah, 1994; Noble, Сох, 1995) и повышение уровня внеклеточного Са в ND8-47 клеточной линии, опосредованные 8-опиоидными рецепторами (Tang et ah, 1994). При этом показано, что BNTX служит селективным антагонистом DPDPE, а налтрибен - селективным антагонистом дельторфина II. Фармакологические свойства клонированного DOR-1 опиоидного рецептора распределяются между двумя вышеописанными подтипами 5-рецепторов.

В случае к-опиоидных рецепторов еще использование [Hj-этилкетоциклазоцина (ЕКС) указало на существование в спинном мозге морских свинок негомогенной популяции высокоаффинных связывающих сайтов (предположительно, Ki и к2), отличающихся по чувствительности к DADLE (Kosterlitz et ah, 1981; Attali et ah, 1982). Позднее применение селективного агониста к-опиоидных рецепторов U-50,488 и его аналогов (U-69,593, PD 117302 и др.) сделало более доступной задачу определения предполагаемых подтипов. Так, прямое сравнение связывания [3Н]-ЕКС у различных видов грызунов (на фоне подавления связывания ц- и 5-сайтов) указало на существование высокоаффинного Kj-сайта, преобладающего в мозге морских свинок и обладающего селективной чувствительностью к U-69,593; а также и низкоаффинного, нечувствительного к U-69,593 к2-сайта, преобладающего в мозге крыс (Zukin et ah, 1988). В целом, имеющиеся фармакологические доказательства существования подтипов к-опиоидных рецепторов расцениваются как пока недостаточные из-за отсутствия специфических агонистов.

Орфановые рецепторы (ORLj) были идентифицированы у крыс, мышей и человека со степенью взаимного сходства более 90% (Meunieret al., 1995; Henderson, McKnight, 1997). В настоящее время ORLj причислен к семейству опиоидных рецепторов на основе структурной гомологии с классическими типами. Однако, соответствующая фармакологическая гомология не наблюдается. Даже неселективные лиганды, которые обладают единообразно высоким сродством к ц-, к-, и 8-рецепторам, связываются с низкой аффинностью с ORL, рецепторами. Кроме того, имеются сайты около вершины каждого трансмембранного региона, консервативные для |>, к-, и 8-рецепторов, но изменяющиеся у ORL|. Вопрос о наличии подтипов ORLj рецепторов и их селективных агонисто в/антагонистов остается пока открытым.

В дополнение к рассмотренным выше, некоторые авторы описывают и другие типов опиоидных рецепторов: A,-, i-, е-, и С,-. Однако они очень скудно охарактеризованы и само их наличие требует дальнейшего экспериментального доказательства, в частности, идентификации их кДНК. Описанный в качестве опиоидного т.н. а-рецептор таковым, как было в дальнейшем выявлено, не является и служит мишенью для другого класса веществ - фенциклидина и его аналогов (Sethetal., 1998).

Опиоидные рецепторы широко распостранены в мозге и периферических тканях всех животных, хотя паттерн встречаемости различных их типов отличен у разных видов и в разных анатомических регионах. В основном, опиоидные рецепторы находятся в соматосенсорной и экстрапирамидальной системах, лимбических регионах (Sharif, Hughes, 1989; Reiner et al., 1989; Mansour et al., 1995). Этот вопрос довольно подробно рассмотрен в обзоре Девойно, Ильюченок (1993). Авторы отмечают, что сравнительно большое количество ц-рецепторов имеется в стриатуме, бледном шаре, габенуле, таламусе, спинном мозге, фронтальных прелимбичесих и цингулярнх областях мозга, меньше в миндалине, мамиллярных телах, соматосенсорной и зрительной коре, сером веществе среднего мозга. Высокоаффинные (i-рецепторы представлены в сером веществе среднего мозга и некоторых ядрах таламуса. р- и 8-рецепторы имеются в неостриатуме, в гиппокампе, в голубом пятне. Наличие 8-рецепторов выявлено в неостриатуме, коре, обонятельных бугорках и обонятельных луковицах, миндалине, таламусе,

13 спинном мозге. В коре мозга крыс ц-рецепторы распределены неоднородно, с наибольшей плотностью происходит связывание лигандов в лимбической кортикальной зоне, моторной коре, первичной сенсорной коре. 5-рецепторы распределены более равномерно. Показано, что распределение рецепторов опиоидных пептидов подчиняется следующим отношениям: в коре - к > 8 > ц; в стриатуме: 8 > к > ц; в стволе мозга: ju > 8 > к; в спинном мозге: jli > 5 > к.

В гипоталамусе и таламусе количество ц-опиоидных рецепторов регулируется нейроэндокринными механизмами под контролем эстрогенов (Martini et al., 1989), и уменьшение числа этих рецепторов находится в соответствии с различными нейродегенеративными симптомами (Rinne, 1993).

2. Молекулярная структура опиоидных рецепторов

Все известные опиоидные рецепторы имеют одинаковую основную структуру. Они состоят из N-концевой и С-коцевой областей, 7-ми трансмембранных доменов и соединяющих их экстра- и внутриклеточных петель. В качестве примера ниже приведена структура рецептора |1-типа (http://www.opioid.umn.edu).

Рисунок 1. Структура /ы-опиоидного рецептора

За связывание с лигандом отвечают как трансмембранные домены, так и экстраклеточные петли. Для первых показана высокая степень консервативности. Соответственно, связывания с трансмембранными участками (в первую очередь, III и VII), по-видимому, достаточно для проявления активности неселективных лигандов (Lavecchia et al., 2000; Subramanian et al., 2000). Причина этого, лежит, вероятно, в общности эволюционного происхождения по крайней мере "классических" типов опиоидных рецепторов. Существует представление, что еще у амфибий разделение опиоидных рецепторов на типы отсутствует и возникает лишь при переходе к амниотическим позвоночным (см. базу данных http//osu.com.okstate.edu).

Взаимное расположение трансмембранных доменов и свойства экстраклеточных петель, по-видимому, определяют специфичность конкретного рецептора. Так, например, для 8-типа показана важность наличия в 3-ей экстраклеточной петле гидрофобной области, заканчивающейся лейцином-300, а также аргинина в позиции 291. Замена любой из этих аминокислот приводили к практически полной блокаде присоединения 5-селективных лигандов (Pepin et al., 1997).

Отметим, что проблема докинга (от англ. "doking" - установление взаимодействия лиганда и активного центра) для опиоидных рецепторов и их агонистов/антагонистов разработана сущетсвенно слабее, чем, например докинг глутаминовой кислоты, ацетилхолина и др. Это объясняется значительно большей конформационной сложностью молекул морфиноподобных соединений и, особенно, пептидных лигандов. В последнем случае особые сложности возникают из-за высокой подвижности, гибкости пептидных молекул, что приводит к необходимости рассмотрения десятков возможных пространственных конфигураций. При этом совершенно не обязательно, что наиболее вероятные конфигурации окажутся наиболее активными в смысле связывания с рецептором (Wilkes, Schiller, 1990).

16

3. Внутриклеточные последствия активации опиоидных рецепторов

Основная функция опиоидных рецепторов определяется как пресинаптическое торможение передачи сигнала в различных нейромедиаторных системах. Соответственно, опиоиды, как правило, оказывают ингибирующее действие на высвобождение нейротрансмиттеров.

Известно, что все клонированные подтипы опиоидных рецепторов сопряжены с Gi/o-белками, чувствительными к пертуссин-токсину. Также предполагается, что они не соединены прямо с Gs- или с Gq-белками; для орфановых рецепторов показано взаимодействие с Gz и G16 - белками, нечувствительными к пертуссин-токсину (Tso et al., 2000). В свою очередь, Gi-белки реализуют свое действие через подавление активности аденилатциклазы, что приводит к снижению количества цАМФ, Са2+-проводимости пресинаптической мембраны и уменьшению количества высвобождаемого нейротрансмиттера (Дамбинова, 1999). Именно этот механизм был описан первым в качестве способа, с помощью которого опиоиды влияют на работу синапса в нейронах, передающих боль, и ингибируют выброс вещества Р (Gale et al., 1978). В дальнейшем была показана способность Gi/о-белков влиять на К+-проводимость (как пре-, так и постсинаптическую). В пресинаптических окончаниях дополнительное открывание К+-каналов повышает скорость реполяризации, ограничивая, таким образом, Са2+-ток и высвобождение нейротрансмиттеров (Simmons, Chavkin 1996). При этом особую роль играет подключение фосфотидилинозитольных механизмов (Беспалов, Звартау, 2000).

Рисунок 2. Схема развития эффектов ц-опиатного рецептора. Обозначения: ц - опиатный рецептор, АЦ - аденилатциклаза; ФЛА2 -фосфолипазаА2; ПК - протеинкиназы; ФП - фосфопротеины (по Беспалов, Звартау, 2000, стр. 154).

Наконец, третьим путем реализации влияний опиоидных рецепторов является наложение вызываемых ими изменений в концентрации вторичных посредников на аналогичные эффекты других G-белок связанных рецепторов (см., например, базу данных по адресу http://www.sander.embl-heidelberg.de/7tm/ligand). Подробнее этот вопрос будет рассмотрен в следующем разделе обзора, посвященном взаимодействию опиоидной системы с другими нейромедиаторными системами.

Однако, все перечисленные процессы относятся к ситуации однократного введения опиоидов. При их многократном (хроническом) применении, как правило, эффекты меняются на противоположные, что приводит к развитию толерантности и зависимости. Так, в нейронах голубого пятна продемонстрировано увеличение уровня аденилатциклазы и активности цАМФ-зависимой протеинкиназы A (Lane Laddetal., 1997).

4. Влияние опиоидной системы на нейромедиаторные системы

Влияние опиоидов на различные медиаторные системы продемонстрировано многими исследователями, однако, большинство накопленного материала касается лишь описательных, фармакологических аспектов этой проблемы. В последние годы с появлением новых методов молекулярной и клеточной физиологии был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов взаимодействия опиоидной и других медиаторных систем. Кратко рассмотрим эти механизмы, ограничиваясь лишь наиболее распространенными из медиаторных систем.

Глутаматергическая система

Глутамат является основным возбуждающим медиатором мозга. Его эффекты осуществляются через специфические рецепторы, которые классифицируют на основе способности взаимодействия с избирательными агонистами К-метил-Б-аспартатом (NMDA), каиновой кислотой и др. (Беспалов, Звартау, 2000).

Взаимодействие опиоидной и глутаматергической систем, осуществляется, вероятно, на нескольких уровнях. Во-первых, возможно прямое пресинаптическое торможение выброса глутамата. Оно наблюдается, например, при введении морфина (Martin et al., 1999). Способны осуществлять регуляцию Са2+-зависимого уровня глутамата также и агонисты 5- и к-рецепторов (Sumiya et al., 1995, Waldmeier et al., 2000).

Во-вторых, показана возможность солокализации опиоидных и глутаматных рецепторов и их совместное участие в регуляции пресинаптического высвобождения нейротрансмиттеров (Kavaliers et al., 1997). При этом в случае метаботропных рецепторов могут происходить внутриклеточные изменения в системе вторичных посредников - фосфотидилинозитола и/или цАМФ, с которыми эти подтипы рецепторов связаны (Fundytus , Coderre, 1994).

В случае ионотропных (NMDA, AMP А, каинатных) рецепторов, кроме того, не исключен вариант прямого рецепторного взаимодействия (Мао, 1999). Действительно, недавно (Tang et al., 1999) были получены данные о существовании прямого взаимодействия дез-тирозинового аналога динорфина А (2-17) с NMDA рецепторами. Эффекты пептида носили неопиоидную природу и блокировались МК-801. Связывание неопиоидного аналога динорфина А происходило с NMDA рецепторами, причем предпочтительно находящимися в инактивированном (наличие иона Mg2+) состоянии.

Гораздо большее число работ посвящено обратной проблеме: влиянию глутаматергической системы на функционирование опиоидных рецепторов, ноцицептивные/антиноцицептивные процессы и развитие опиоидной толерантности. Было показано (Fundytus, Coderre, 1994), что активация синтеза фосфотидилинозитола и цАМФ, вызванная метаботропными рецепторами к глутаминовой кислоте, вовлечена в формирование опиоидной зависимости. NMDA рецепторы, индуцируя синтез оксида азота через активацию NO-синтазы, также могут способствовать развитию опиоидной толерантности (Liaw et al., 1996, ). Напротив, антагонисты NMDA-рецепторов предотвращают развитие морфиновой зависимости (Popik, Skolnick, 1996,), что, возможно, опосредуется через активацию протеинкиназы С (Liaw et al., 1996).

Более подробно этот вопрос рассматривается в недавно вышедшей монографии А.Ю.Беспалова и Э.Э.Звартау "Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов" (2000).

ГАМК-ергическая система

ГАМК - основной тормозным медиатор в ЦНС, широко распространенный во многих нервных окончаниях. Высокие концентрации ГАМК найдены в коре больших полушарий, нейронах стриатума, мозжечка, задних рогах спинного мозга.

Известно, что опиоидные пептиды могут осуществять модуляцию ГАМК-ергической трансмиссии. Показано, что они гиперполяризуют нейроны вентрального бледного шара и подавляют их спонтанную активность, регулируя передачу информации от базальных ганглиев к структурам-мишеням. Следствием опиоидных влияний на ГАМК-нейроны nucleus accumbens является потенциация активности глутамата в коре и миндалине (Napier, Mitrovic, 1999).

Другим примером может служить деятельность опиоидных пептидов в центральном сером веществе среднего мозга, которое является одним из центров регуляции болевой чувствительности (Jolas et al., 2000). Показано, что анальгетические эффекты опиоидов в этом случае реализуются путем подавления ингибирующего влияния ГАМК на нейроны (в т.ч. серотонинергические), формирующие часть нисходящего антиноцицептивного потока. Опиоиды ослабляют тормозную синаптическую передачу и уменьшают возможность выделения ГАМК, контролируя пресинаптическую потенциал-зависимую К+-проводимость. Показано, что в процесс передачи сигнала от опиоидных рецепторов на К+-каналы вовлечены фосфолипаза А2, арахидоновая кислота и 12-липоксигеназа (Vaughan et al., 1997). Ингибирование нейронов, содержащих ГАМК, видимо, лежит в основе некоторых возбуждающих эффектов морфина в ЦНС (de Groat, 1998).

Указывается также на возможность прямого взаимодействия между опиоидными пептидами и ГАМК-А-ионофорным комплексом и роль этого явления в модуляции процессов памяти (Dubrovina. Ilyutchenok, 1995).

Методами электронной микроскопии показано, что в одних аксонных терминалях могут сосуществовать энкефалины и ГАМК (либо глутамат). Так, в locus coeruleus мозга крыс ГАМК и энкефалины могут действовать сообща, высвобождаясь из общего окончания либо через различные участки афферентов, сходясь на близких участках плазмалеммы нейрона-мишени (Van Bockstaele, Chan, 1997). Дериваты продинорфина и препроэнкефалина обнаружены в ГАМК-ергических проекциях нейронов стриатума. И с другой стороны, показано, что ГАМК способна оказывать ингибиторное влияние на экспрессию генов опиоидных пептидов (Reimer, Hullt 1991).

Известно, что активность мозговых моноаминергических систем в значительной степени регулируется эндогенными опиоидами. Вопрос этот интересует исследователей давно, и накопилось множество работ, касающихся обсуждения данного взаимодействия. В целом можно заключить, что агонисты опиоидных рецепторов, как правило, налоксончувствительным образом снижают катехоламиновую трансмиссию (Versteeg et al., 1991, Simmons et al. 1992), тогда как в случае серотонина чаще регистрируются противоположные эффекты.

Дофаминергическая система

Высокий уровень связывания 5-, к- и, особенно, р-лигандов показан в различных областях черной субстанции, вентральной тегментапьной области и других зонах, содержащий терминали дофаминергических нейронов (Speciale et al., 1993). Однако, окончательные представления, через какой из подтипов рецепторов осуществляется взаимодействие опиоидов с дофаминегической системой, еще не сформированы. Разными авторами сообщается о модулирующем действии опиодов, которое может происходить только через определенный тип рецепторов.

Так, Heijna с соавт. (1992) показали, что активация р-, 5-, но не к-опиоидных рецепторов в nucleus accumbens и обонятельных бугорках ингибирует стимулированную дофамином продукцию цАМФ. При этом ими не найдено влияние опиоидов на дофамин-чувствительную аденилатциклазу во фронтальной коре и медиобазальном гипоталамусе (Heijna et al., 1992). С другой стороны, по данным Manzanares с соавт. (1991) активация к-рецепторов ингибирует все дофаминовые нейрональные системы мозга, хотя эффект обычно проявляется только после активации соответствующих нейронов. Все три классических подтипа опиоидных рецепторов могут осуществлять ингибиторных контроль выхода дофамина в стриатуме через пресинаптические механизмы (Schlosser et al., 1995).

Увеличение внутриклеточного уровня Са2+, опосредованное пресинаптическими Са2+-каналами приводит при хроническом введении опиоидов к уменьшению внеклеточного уровня дофамина и его метаболитов. Эффекты наиболее выражены в тех областях мозга, которые вовлечены в экспрессию синдрома отмены (Tokuyama S, 1996)

Показано (De Vries et al., 1993), что хроническая экспозиция морфина, не меняя чувствительность р-опиоидных рецепторов, вызывает увеличение Dr стимулированной продукции цАМФ. Напротив, снижение этой продукции наблюдалось после хронического введения налтрексона (De Vries et al., 1991).

Норадренергическая система

Как известно, уровень активности норадренергических синапсов в значительной мере регулируется пресинаптическими ауторецепторами.

Соответственно, высвобождение норадреналина эффективно модулируется опиоидами через норадреналин- чувствительную аценилатциклазу (Van Vliet et al., 1991). Так, острое и хроническое действие морфина изменяет активность норадреналин-индуцированной цАМФ; при этом эффект обращается налоксоном (Mehta, Strada, 1994). В работах последних лет уточняется, что подавление норадренергической трансмиссии происходит при активации и- и к-типов опиоидных рецепторов (Yilmaz, Gilmore 1999). Острое введение морфина снижает экстранейрональный уровень норадреналина, тогда как хроническое его действие приводит к увеличению высвобождения данного медиатора в различных областях мозга. Также при хроническом введении наблюдаются изменения чувствительности и плотности а2- и (3-адренорецепторов; возможно, как следствие снижения пресинаптической активности (Maldonado, 1997).

Для недавно открытого эндогенного лиганда орфановых рецепторов ноцицептина (орфанина FQ) также показано ингибирование выхода норадреналина (Schlicker et al., 1998). Эффект этот опосредуется через локализованные пресинаптически на норадреналинергических терминалях ORLr рецепторы и является налоксон- и бензоилгидразон-чувствительным (Werthwein et al., 1999).

Серотонинергическая система

Еще в 1985 году было установлено, что морфин и пентазоцин существенно увеличивают оборот серотонина в стриатуме (Niwa et al., 1985). Позже Но и Takemori (1990) показали то же для высокоселективного к-агониста U 50,488Н. Используя метод микродиализа Matos с соавт. (1992) установили, что анальгетический эффект опиоидов может опосредоваться через повышение выхода серотонина в дорзальных рогах спинного мозга. Морфин дозозависимо и налтрексон-зависимо увеличивал внеклеточный уровень серотонина в промежуточном мозге (Grauer et al., 1992). Трамадол способен ингибировать обратный захват норадреналина и индуцировать синаптический выброс серотонина (Driessen, Reimann, 1992; Bono, Cuffari, 1997).

Регуляция выхода серотонина является, видимо, важным компонентом развития опиоидной толерантности/зависимости (Tao et al., 1998). При хроническом введении крысам морфина на фоне выраженной анальгезии эти авторы уже в первые сутки эксперимента обнаружили значительное (около 50%) увеличение уровня серотонина в дорзальном ядре шва. Введение налтрексона крысам, хронически получавшим морфин, индуцировало признаки абстинентного синдрома и вызывало снижение уровня серотонина.

Ацетилхолинергическая система

Воздействие опиоидов на холинергическую систему также состоит в угнетении высвобождения ацетилхолина из пресинаптических окончаний. Контроль осуществляется опиоидами через стимуляцию соответствующих рецепторов, локализованных на холинергических аксонных терминалях, и дополняет тонический дофаминовый контроль (Sandor et al., 1992). По-видимому, в различных мозговых структурах опиоиды влияют на холинергическую трансмиссию через различные подтипы рецепторов. По данным Arenas с соавт. (1990) ц- и 5-, но не к-опиоидные агонисты подавляют активность холинергических интернейронов (Arenas et al., 1990). Однако, по мнению (Kojima Y et al., 1994), к-рецепторы вполне способны модулировать выход ацетилхолина, ингибируя потенциал-зависимые Са2+ каналы. В неокортексе этот процесс опосредуется, видимо, 5- и к-, но не ц-опиоидными рецепторами (Feuerstein et al., 1996). В стриатуме к снижению выхода ацетилхолина приводит активация 8-рецепторов (Ruzicka, Jhamandas, 1988).

Кроме того, может происходить взаимодействие эффектов пресинаптически локализованных опиоидных и никотиновых рецепторов, что продемонстрировано для таламо-кортикальных волокон (Sahin et al., 1992). Взаимодействие с эффектами связанных с G-белками мускариновых холинорецепторов, по-видимому, распространено значительно шире и показано для нейронов базальных ганглиев, коры, обонятельной луковицы (Sahin et al., 1992; Olianas, Onali, 1993, Olianas, Onali, 1994).

Наконец, в одной из последних работ сообщается (Itoh et al., 2000), что динорфин А (1-17), эндогенный агонист к-опиоидных рецепторов, может изменять активность нейрональных никотиновых рецепторов ацетилхолина, не связываясь с опиоидными рецепторами и не влияя на G-белки. Угнетающее действие динорфина

5. Синтетические и эндогенные лиганды опиоидных рецепторов

Исторически сложилось так, что вначале было синтезировано и охарактеризовано большое количество непептидных лигандов опиоидных рецепторов, и лишь затем открыты эндорфины и энкефалины. При этом уже в 70-е годы был определен набор критериев, которым должно было удовлетворять вещество для того, чтобы вызывать анальгетические и наркотические эффекты. Приведем его: (Аничков, 1982): (1) молекула должна содержать четвертичный атом углерода, т.е. атом, ни одна из валентностей которого не замещена водородом; (2) к этому атому присоединено фенильное кольцо; (3) молекула содержит третичный атом азота, присоединенный к четвертичному углероду цепочкой, состоящей из двух углеродных атомов; (4) по меньшей мере одна из присоединенных к азоту групп должна быть коротким алкильным радикалом (предпочтительно метальным). Всем этим критериям удовлетворяют не только морфин, кодеин и их производные (метилморфин, оксиморфии и т.п.), но и синтетические препараты, такие как промедол, лидол и другие.

С другой стороны, перечисленные структурные особенности в весьма слабой мере присущи эндогенным пептидным лигандам опиоидных рецепторов. Для последних отмечается необходимость наличия (Mosberg et al., 1994; Brandt et al.,

1996): (1) N-концевого тирозина; (2) расположенного в 3-м или 4-м положении фенилаланина; (3) некоторого оптимального расстояния между ароматическими кольцами данных аминокислот. Все это еще раз подчеркивает сложность процесса лиганд-рецепторного взаимодействия в опиоидной системе, а также наличие у опиоидных рецепторов значительного количества мест связывания, "срабатывание" даже части которых может, видимо, приводить к активации рецептора (Spivak et al.,

1997).

Специфичность присоединения пептидов к различным подтипам опиоидных рецепторов определяется широким кругом их химических и конформационных особенностей, в частности наличием т.н. Р-поворота, образованного взаимодействием остатков Туг1 и Phe3, (Tancredi et al., 1991) повышающего сродство лиганда к р-рецептору, а также пространственной ориентацией радикала фенилаланина, которая, в свою очередь, может зависеть от свойств следующей за ней аминокислоты (Mosberg et al., 1996; Fiori et al., 1999; Riand et al., 1999). Таким образом, N-конец опиоидных пептидов ответственен за активацию как ju-, так и 8-рецепторов, различия же в С-концевой части этих пептидов обуславливают избирательное сродство к ц- или 8-рецепторам (Ersramer et al., 1989; Nairn et al., 1996).

У млекопитающих эндогенные опиоидные пептиды главным образом происходят от 4-х предшественников: проопио-меланокортина, проэнкефалина, продинорфина и проноцицептин/орфанина FQ (Nakanishi et al., 1979; Kakidani et al., 1982; Noda et al., 1982; Meunier et al., 1995). Произодные первых 3-х прекурсоров содержат на N-конце последовательность YGGFM/L. Такие пептиды отличаются сродством к (I-, к-, и 8-рецепторам, и имеют незначительное сродство к ORLr рецепторам (Eppler et al., 1993). Однако, каждый из них способен связываться с более чем одним типом опиоидных рецепторов. Так, p-эндорфин имеет одинаковое сродство к ц-, и 5-рецепторам, и гораздо менее эффективно взаимодействует с к-рецепторами. (Kosterlitz and Paterson 1995; Akil et al., 1981).

Met- и Ьеи-энкефалины высокоаффинны к 8-рецепторам; в 10 раз менее эффективно связываются с ц-рецепторами, и практически не связываются с к-рецепторами. Другие продукты процессинга проэнкефалинов, которые имеют N-концевые вставки Met-энквфалина, менее предпочтительно связываются с 8-рецепторами и обнаруживают наибольшее сродство к ц-рецепторам.

Опиоидные фрагменты продинорфина, в частности, динорфин А и динорфин В, имеют высокое сродство к к-рецепторам, но также обладают значительной аффинностью к ц-, и 8-рецепторам (Corbett et al., 1993).

Недавно открытые амидированные тетрапептиды эндоморфин-1 (YPWF-NH2) и эндоморфин-2 (YPFF-NH2), видимо, функционируют в мозге как эндогенные лиганды для (i-рецепторов, к которым они высокоселективны (Zadina et al., 1997). Эндоморфины являются производными еще неидентифицированных прекурсоров и структурно не связаны с другими эндогенными опиоидными пептидами. Хотя изучение клеточной локализации этих пептидов находится в начальной стадии, эндоморфин-2 найден в дискретных регионах мозга крыс, для ряда из которых известно, что они содержат ц-рецепторы в высокой концентрации (Schreff et al.,

1998). Эндоморфин-2 также присутствует в первичных сенсорных нейронах и дорсальных корешках спинного мозга, которые функционируют как модуляторы болевой передачи (Martin-Schild et al., 1997).

Ноцицептин/орфанин FQ происходит от проноцицептин/орфанина FQ, обладает низким сродством к р.-, к-, и 6-рецепторам и является эндогенным лигандом для ORLi рецептора (Meunier et al., 1995; Reinscheid et al., 1995). Его аминокислотная последовательность (Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln) имеет гомологию с другими опиоидными пептидами, особенно с фрагментом продинорфина динорфином А Предположительно, существует тесная эволюционная связь между этими прекурсорами. Ноцицептин/орфанин FQ характеризуется, однако, наличием N-концевого фенилаланина.

Большая часть эндогенных опиоидов образуются из своих предшественников в результате ферментативной деятельности во-первых, трипсин-подобного фермента, который гидролизует связи основных аминокислот, и во-вторых, карбоксипептидазы В, которая отщепляет остатки основных аминокислот с С-конца пептидной молекулы. Пары Lys-Lys, Lys-Arg являются наиболее специфическими мишенями для действия таких ферментов .

В дополнение к относительно неселективным (за исключением эндоморфинов) опиоидными пептидами млекопитающих, в коже амфибий найдено еще 2 семейства пептидов, содержащих D-аминокислоты. Дерморфины (Tyr-d-Ala

Phe-Glu-Tyr-.) являются ^.-селективными пептидами с низкой аффинностью к 5и к-рецепторам; дельторфины (Tyr-d-Met-Phe-.) селективны к 8- рецепторам (Amiche et al., 1988; Erspamer et al., 1989, Lazarus et al., 1996).

6. Экзорфины. Общая характеристика класса

Кроме опиоидных пептидов, синтезируемых внутри нервных, нейроэндокринных и т.п. клеток, существует целый класс опиоидов, являющихся фрагментами белков пищевого происхождения. Они, следовательно, поступают в организм извне, за что и названы экзорфинами. К ним относят пептиды, выделенные из гидролизата пшеничного глютена - экзорфины А4, А5 ,В4, В5 (Zioudrou et al., 1979) и гидролизатов казеинов молока - казоморфины (Brantl et al.,

1979). Сюда же примыкают пептиды, образующиеся в ходе внутриклеточной энзиматической деградации (3-цепи гемоглобина - геморфины (Brantl et al., 1986) и цитохрома С - цитохрофины (Liedmann et al., 1989; Freeman, Young, 2000).

Геморфины и цитохрофины имеют первичную структуру, весьма сходную с эндоморфинами (например, геморфин-4 - YPWT и цитохрофин-4 - YPFT). В большей мере изучены геморфины, для которых показана способность связываться с р- и 5-рецепторами (Liebmann et al., 1989; Zadina et al., 1996). Геморфины в заметном количестве присутствуют в спинномозговой жидкости больных цереброваскулярным кровотечением (Glamsta et al., 1992). Показано их тормозящее действие на нейроны голубого пятна (Yang et al., 1999). При этом активность геморфина-4 оказалась ниже, чем у эндоморфина-1 (YPWF-NH2), но выше, чем у Tyr-W-MIF-1 (YPWG-NH2). Физиологическую роль геморфинов связывают с их налоксон-зависимым ингибирующим влиянием на острые и хронические воспалительные процессы (Sanderson et al., 1998).

Из производных глютена пшеницы наибольшая опиоидная активность обнаружена у т.н. экзорфина В5 (YGGWL). При этом для всех экзорфинов глютенового происхождения показана относительно высокая способность к связыванию с рецепторами 5-типа (Fukudome, Yoshikawa, 1992). Часть из них имеет в третьем положении аминокислоту не с ароматическим, а с гидрофобным радикалом, что ослабляет, но не устраняет связывания с опиоидными рецепторами (пример - т.н. экзорфин С - YPISL) (Fukudome, Yoshikawa, 1993). Показана способность данных пептидов выщепляться при пепсин-трипсин-химотрипсиновом либо совместном пепсиновом и бактериальном переваривании белков пшеницы. Но, еще не зная этого, диетологи уже довольно давно обратили внимание на возможность развития не всегда благоприятных нейротропных эффектов глютенов (например, Dohan, 1988; http://www.panix.com).

Наиболее активно изучаемая группа экзорфинов - фрагменты казеина молока. Казенны являются одной из важнейших групп белков, входящих в питание человека, что и обуславливает значительный интерес к анализу особенностей их структуры и метаболизма. По природе своей казенны -фосфопротеины и составляют 80 % молочных белков; а-, Р- и к-казеины встречаются в соотношении 49:38:13, соответственно. Показано, что в результате гидролиза молочных протеинов может образовываться более двухсот различных пептидов (Lemieux, Amiot, 1990). Некоторые из них при системном (имитирующем питание) введении способны вызывать разнообразные физиологические эффекты. Например, дипептид (23-24), образующийся при гидролизе а-казеина, обладает антигипертензивным действием, а олигопептид (106-119) выступает в качестве переносчика минеральных веществ. Фрагменты к-казеина (106-116). (106-112), (113-116) обладают антитромбозными свойствами; фрагменты Р-казеина (49-68), (59-68) и (191-193) являются модуляторами деятельности иммунной системы. Фрагмент р-казеина (177-183) способен активировать синтез ДНК (Hagaune et al., 1989).

Исследование фракций гидролизатов казеина, имеющих опиоидную активность, показало, что активным началом в них являются пептиды, отвечающие следующим требованиям: 1) наличие N-концевого тирозина; 2) присутствие гидрофобного "хвоста" из 3-х и более аминокислот; 3) устойчивость к действию протеолитических ферментов. Последний критерий имеет особую важность, поскольку для того, чтобы быть перенесенным от места введения к рецепторам, пептид должен существовать в организме достаточно длительное время. В наибольшей степени всем перечисленным условиям удовлетворяют опиоидоподобные фрагменты р-казеина, названные Р-казоморфинами.

7. Особенности строения и свойства р-казоморфинов

Выделение p-казоморфинов впервые было произведено из коммерческого казеинового пептона (Brantl et al., 1979; Henschen et al., 1979; Lottspeich et al., 1980). Авторами осуществлялась многоэтапная чистка активной фракции с тестированием опиоидного действия на каждом шаге (оценивалось ингибирующее влияние на сократимость подвздошной кишки морской свинки при электростимуляции). Если в исходном пептоне было около 50 веществ, то после процедуры HPLC получили практически однокомпонентную активную фракцию. При структурном анализе было установлено присутствие в ней гептапептида Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile (т.н. Р-казоморфина-7; Р-К-7). Его опиоидная активность подавлялась налоксоном; эффективно действующие концентрации составляли 5-30 мкМ/мл. В дальнейшем

З-К-7 был идентифицирован как фрагмент (60-66) (3-казеина коровьего молока.

В ходе анализа зависимости опиоидной активности [З-К-7 и его более коротких фрагментов от первичной структуры было показано, что пентапептид Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly (Р-казоморфин-5 - (З-К-5) оказывает наиболее выраженное действие на препарат подвздошной кишки; далее в порядке убывания следуют (3-К-4 (Tyr-Pro-Phe-Pro), р-К-6 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro) и собственно (З-К-7. Трипептид Tyr-Pro-Phe и дипептид Туг-Рго были практически неактивны (Henshen et al., 1979; Brantl et al., 1981).

После определения первичной структуры (3-казеинов овцы (Richardson and Mercier, 1979) и буйвола (Petrilli et al., 1983) оказалось, что они содержат соответствующие (З-К-7 последовательности в том же положении, что и (3-казеин коровы. В 1984 году Greenberg с соавт. опубликовали структуру (3-казеина человека, в котором в 51-57 положении располагается аминокислотная последовательность Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-Pro-Ile, получившая название человеческого (З-казоморфина-7. Проведенные эксперименты подтвердили наличие опиоидной активности у данного пептида (Brantl, 1984; Yoskikawa et al. 1984).

Начинающиеся с Tyr-Pro-Phe- и обогащенные пролином последова-тельности аминокислот присутствуют также в казеинах верблюда, антилопы, свиньи, тапира, кенгуру (Alexander et al., 1992; Kappeler et al., 1998). В составе белков молока грызунов (крысы, мыши) таких фрагментов не обнаружено. Вместе с тем (3-казеин морских свинок содержит последовательность Tyr-Pro-Phe-Arg-Arg-Trp-Tyr-Tyr-Gly-Pro (Hall et al., 1984).

Анальгетические эффекты (3-казоморфинов связаны с воздействием, прежде всего, на опиатные рецепторы (i-типа (Brantl et al., 1981). Tyr-Pro-Phe-часть так же, как в случае эндоморфинов, обеспечивает присоединение к данному рецептору. Вместе с тем, продемонстрирована способность (3-казоморфинов (в более слабой форме) взаимодействовать с 8-рецепторами; влияние на к-рецепторы у природных пептидов практически не выражено (Koch, Brantl, 1990). При этом важное значение имеют характеристики гидрофобного "хвоста" пептида, что приводит к заметным отличиям активности, например, (З-К-5 и (З-К-7 (первый является более специфическим агонистом ^.-рецепторов).

Механизмы распада р-К-7 и его производных в гомогенатах различных тканей были детально изучены в работе Stark с соавт. (1987). По их данным, время полураспада природных p-казоморфинов в мозге составляет около 5 минут, в печени - меньше одной минуты. Замена природных 1-аминокислот на их d-стереоизомеры повышает стабильность p-казоморфинов, причем устойчивость к биодеградации зависит от положения d-аминокислоты в молекуле пептида. Наиболее устойчивыми оказались (З-казоморфины с d-аминокислотными остатками во втором и третьем положениях.

Еще более стабильны d-производные p-казоморфинов, лишенные N-концевого тирозина (иначе, дез-Туг-аналоги). Однако, делеция терминального тирозина одновременно приводит к потере опиоидной активности, и дез-Туг-казоморфины анальгетическими свойствами не обладают. Напротив, амидирование и введение в состав молекул d-аминокислот вместо 1- приводят к увеличению опиоидной активности P-казоморфинов в несколько раз (Grecksch et al., 1981; Matthies et al., 1982; Matthies et al., 1984).

Весьма детально проанализированы физиологические эффекты dPro4-p-K-5 (т.н. депролорфина) и его амидированного фрагмента Tyr-Pro-Phe-dPro-NH2 (Kammerer et al., 1985). Оба вещества продемонстрировали высокое сродство к периферическим р-рецепторам и стойкое анальгетическое действие, которое может быть снято введением налоксона или налтрексона. В больших дозах dPro4-p-K-5, оказывал каталептическое действие, характерное для многих опиоидов. Rauca и Matthies (1986) отмечают, что, подобно апоморфину, такие производные р-К-5 как dPro4-P-K-5 и dPhe3-P-K-5 при односторонней микроинъекции в стриатум вызывают контралатеральную ротацию. Эффект может быть ослаблен предварительным введением налоксона. Характерно, что лишенные тирозина производные этих пептидов вызывают ипсилатеральную ротацию по тому же типу, что и галоперидол. Вопрос о механизмах действия препаратов в данном случае остается открытым. В другой работе вызванное апоморфином зевание полностью снималось введением dPro4-p-K-5 и dPhe3-P-K-5. Соответствующие дез-Туг-аналоги также уменьшали зевание, но не более, чем на 50 % (Ruthrich et al., 1992а). Аналогичные результаты получены и при анализе действия тех же пептидов на вызванную апоморфином гиперлокомоцию (Ruthrich et al., 1993а).

Синтез циклических аналогов Р-К-5 был проведен путем замены Pro2 на d-Lys либо d-Orn с последующим замыканием кольца (между аминогруппой боковой цепи во 2-ом положении и -СООН группой глицина). Для таких пептидов показано резкое повышение опиоидной активности, и их анальгетическое действие оказывается в 100-1000 раз, эффективнее, чем у морфина (Ruthrich et al., 1992b). В ходе дальнейших работ удалось создать циклические аналоги р-К-5, сохраняющие свойства ц-агонистов и одновременно являющиеся чрезвычайно высоко селективными антагонистами рецепторов 8-типа (Schmidt et al., 1996; Shiller et al., 2000).

Р-казоморфины способны оказывать действие и на периферические системы и органы. Показано, что они налоксон-зависимо увеличивают выделение инсулина и соматостатина (в т.ч. и при введении в желудок) (Schusdziarra et al., 1983ab). Описано активирующее действие (З-К-7 на высвобождение гистамина периферическими лейкоцитами (Kurek et al., 1992). Под действием (3-казоморфинов у крыс снижается частота сердечных сокращений (Соханенкова с соавт, 1998),. а также сократительная способность желудочно-кишечного тракта (Daniel et al., 1990). Последнее, вероятно, является причиной успешного применения (3-казоморфинов при лечении диарреи (Schusdziarra et al., 1990).

Известно, что в ранний постнатальный период диаррея является основной причиной смерти детенышей крупного рогатого скота. Если же больным телятам в течение 3-х дней дважды в день в молоко добавляли 500 мг амидированного Р-К-4, то к концу курса лечения в 87.5 % случаев симптомы болезни исчезли (Mansfeld et al., 1990). Сходные результаты были получены и на людях, которые практически излечивались после 10-тидневного приема богатой казеином диетической пищи (Charlin et al., 1992). В числе прочего, эти данные свидетельствуют о способности поступающих с пищей P-казоморфинов, во-первых, "вырезаться" в полости кишечника из белка-предшественника, и, во-вторых, проникать через кишечный эпителий и связываться с локализованными в серозной (подслизистой) оболочке опиатными рецепторами.

Действительно, инкубация in vitro р-казеина с комплексом протеолитических ферментов приводит к появлению P-казоморфинов на уровне "щеточной каемки" кишечника (Petrilli et al., 1984). Svedberg с соавт. (1985) продемонстрировали наличие р-К-7 в кишечнике человека при питье молока. При поедании казеина определил в кишечнике свиньи образуется т.н. (З-К-11, опиоидная активность которого находится на уровне (З-К-5 (Meisel. 1986). Еще более длинный предшественник [3-казоморфинов, соответствующий 58-93 фрагменту, (5-казеина был обнаружен в желудке телят через 3.5 часа после питья молока (Scanff et al., 1992).

Для натурального Р-К-5 Mahe с соавт. (1990) не обнаружили транспорта интактных молекул; показано, что они слишком быстро подвергаются деградации в просвете кишечника. С другой стороны, продемонстрировано, что амидированный dAla2'4-p-K-5 способен к транспорту в неповрежденном состоянии сквозь кишечную стенку в кровь и, следовательно, поступает к местам локализации опиоидных рецепторов (Tome et al., 1987). Транспорт (З-К-5 в неповрежденном состоянии наблюдали только при добавлении в систему специального ингибитора протеаз.

Однако, возможен иной путь попадания Р-казоморфинов в кровь: всасывание неактивных длинных пептидов, которые расщепляются до (3-казоморфинов уже в крови. Данная гипотеза впервые высказана в работе Umbach с соавт. (1985), обнаружившими (3-казоморфин-иммунореактивный предшественник в плазме новорожденных телят после первого приема молока. К этой точке зрения присоединяются и другие авторы (Caporale et al., 1985; Brantl, Neubert, 1986), заключая, что крупные фрагменты казеинов (т.н. проказоморфины) могут распадаться до активных составляющих прямо в мозге.

Вместе с тем, возможность проникновения (3-казоморфинов через гемато-энцефалический барьер пока совершенно не исследована. Она может быть допущена, исходя из гидрофобной природы С-конца молекул p-казоморфинов и общих соображений по относительной проницаемости ГЭБ для пролин-содержащих пептидов (в т.ч. гептапептида семакс; Potoman et al., 1991). Прохождение через ГЭБ доказано для таких родственных казоморфинам веществ, как энкефалины и эндорфины (Banks, Kastin, 1990). Показана также возможность л проникновении через ГЭБ дез-Tyr-dPhe -Р-К-5 (работа выполнена на культуре бычьих цереброваскулярных эндотелиальных клеток; Stark et al., 1992). Еще в одном исследовании p-K-8-иммунореактивный материал был обнаружен в 19-ти различных зонах среднего мозга, моста и продолговатого мозга новорожденных детей, что дало авторам право высказать предположение о участии (3-казоморфинов в центральной регуляции физиологических процессов (Pasi et al., 1993).

В самом деле, в случае новорожденных мы имеем дело со значительной слабостью как кишечного, так и гемато-энцефалического барьера. Первый вопрос подробно рассматривается в обзоре Зуфарова (1998), где показано, что пищеварение новорожденных рассчитано на захват и перенос в кровь пептидов и белков молока, способных участвовать в регуляции различных функций организма. На этом механизме основано, в частности, явление пассивного иммунитета (проникновение материнских альбуминов в кровоток детеныша). В случае (3-казоморфинов Read с соавт. (1990) показали, что (З-К-7 и амидированный (З-К-4 легко проходят через стенку тонкого кишечника новорожденных ягнят и поросят. Наблюдается интенсивный, длящийся 10-15 минут транспорт пептидов в кровь. Однако, по мнению авторов, реальное физиологическое значение имеют более крупные фрагменты (3-казеина (например, Val-(З-К-7), способные относительно длительное время противостоять ферментативной деградации.

ГЭБ новорожденных отличается от такового у взрослых млекопитающих большей проницаемостью к широкому кругу соединений, в частности, к опиоидам. Landymore с соавт. (1990) специально исследовали изменение способности последних проникать в ЦНС крыс. Оценка концентрации вводимой центрально и затем связываемой метки показывала, что в случае [3H]DAGO она остается низкой до 10-дневного возраста, после чего наблюдается прогрессивное увеличение связывания до уровня взрослых в возрасте 15 дней. Если предварительно системно вводить синтетический пептидный антагонист опиоидных рецепторов FK 33-824, то он индуцирует снижение связывания DAGO в медиобазальном гипоталамусе до 15-дневного возраста. FK 33-824 у более взрослых крыс не влияет на связывание DAGO (признак завершения формирования ГЭБ). Сходным образом FK 33-824 снижает связывание DAGO в срединном возвышении и области аркуатного ядра до 30 дня после рождения.

Продемонстрировано также успешное проникновение через ГЭБ сходного с опиоидами тетрапептида Tyr-MIF-1 по крайней мере до 21 дня жизни новорожденных крыс (Harrison et al., 1993). Эти же авторы описывают наличие специальной транспортной системы, переносящей из крови в мозг Туг-MIF-l и мет-энкефалин (Banks et al., 1996).

Косвенным доказательством проникновения (3-казоморфинов через ГЭБ служит развитие различных нейротропных эффектов при их системном введении. Эффекты эти весьма подробно изучались на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ, начиная с 1991 г. В первой же работе (Дубынин с соавт., 1992) было показано, что доза 20 мг/кг внутрибрюшинно значимо увеличивает у крыс латентный период реакции избавления в тесте "отдергивание хвоста". Доза 5 мг/кг была неэффективна, доза 10 мг/кг обладала пограничными свойствами. Полученные данные находятся в хорошем соответствии с результатами анализа анальгетической активности других опиоидов. Например, эффективно действующие при системном введении дозы для p-эндорфина составляют 8-28 мг/кг, морфина - 1-10 мг/кг (Winters et al., 1986; Hendrie et al., 1989; Millan, 1989), дерморфина - 5 мг/кг (Батурина, 1989). Эффект снижения болевой чувствительности под влиянием Р-казоморфина-7 блокировался предварительным введением налоксона. Дез-Tyr аналоги не влияли на болевую чувствительность, что подтверждает имеющиеся представления о необходимости N-концевого тирозина для присоединения к классическим опиоидным рецепторам (Rauca, Matthies, 1986).

В следующей серии работ (Маклакова с соавт., 1993) было показано, что Р-казоморфин-7 в дозе 20 мг/кг вызывает заметное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности. Это согласуется с известным угнетающим влиянием высоких доз эндорфинов на параметры локомоторной активности (Olson et al., 1990). Дозы Р-К-7 1 и 5 мг/кг на спонтанную двигательную активность практически не влияли, однако их эффект проявился в более стрессогенных условиях ("открытое поле" при смене освещенности с яркого света на красный). При этом наблюдалось снижение тревожности и увеличение исследовательской активности (Дубынин с соавт., 1998). В максимально стрессогенных условиях Р-К-7 в тех же дозах снижал долю крыс, проявлявших реакции затаивания и панического бега (Маклакова с соавт., 1993). На основе полученных данных был сделан вывод о способности анальгетически неэффективных доз р-К-7 снижать уровень оборонительной мотивации экспериментальных животных. Сходное заключение можно найти и в работе Dinzburg с соавт. (1995), где стресс-протекторное действие P-казоморфинов было испытано на обезьянах, подвергавшихся иммобилизации.

При изучении способности Р-К-7 (1 и 5 мг/кг) влиять на обучение было показано, что пептид разнонаправленно воздействует на разные его типы и, ухудшая обучение с отрицательным болевым подкреплением, улучшает выработку пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте (Маклакова с соавт., 1995). Такая "диссоциация" эффектов также была объяснена снижением под действием пептида уровня оборонительной мотивации и тревожности (высокий уровень последних, как известно, мешает обучению с положительным подкреплением и способствует выработке навыков избегания и избавления). Интересно также то, что влияние лишенных тирозина аналогов Р-казоморфина-7 на уровень тревожности и обучение хотя и более слабой степени, но также имело место и по направленности совпадало с эффектами прототипа.

Итак, ситуация, складывающаяся вокруг P-казоморфинов такова, что подавляющее большинство исследований по изучению их активности проводились и проводятся на взрослых животных. Кроме того, имеется ряд работ, в которых эффекты P-казоморфинов анализируются на клеточно-тканевом уровне: влияние на функции лимфоцитов (Kayser, Meisel, 1996), пролиферацию клеточных культур (Hatzoglou et al., 1996; Kampa et al., 1997), свойства цитоскелета (Papakonstanti et al., 1998) и т.п. Однако, когда мы обращаемся к ситуации, существующей в природе, становится совершенно ясно, что если у P-казоморфинов и имеется реальная физиологическая функция - то она должна проявлять себя в раннем постнатальном периоде, когда детеныши млекопитающих потребляют в качестве пищи исключительно молоко. Так, существуют представления о возможном отрицательном воздействии P-казоморфинов на организм детенышей. У новорожденных кроликов они частично угнетают дыхание (Hedner and Hedner, 1987), а апноэ, вызываемое этими пептидами, в одной из работ рассматривается как возможная причина синдрома "внезапной смерти новорожденных" (Ramabadran,

Bansinath, 1988). Однако, еще Volterra с соавторами (1986) было сформулировано представление о том, что p-казоморфины, вероятно, могут оказывать положительное влияние на становление и развитие ЦНС и играть определенную роль в процессах индивидуального развития. Это представление было поддержано в дальнейшем немецкими учеными, которым принадлежит наибольше количество исследований активности Р-казоморфинов (Teschemaher et al., 1990).

Несмотря на сказанное, работ, в которых проводилось изучение непосредственного влияния p-казоморфинов на организм детенышей очень мало. Так, показано, что анальгетическое действие p-казоморфинов регистрируется не ранее 10-го дня после рождения крыс (Blass, Blom, 1996), влияние на уровень тревожности (Cuomo et al., 1988) и сон (Taira et al., 1990) в первую неделю жизни практически отсутствует.

На кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ действие хронически вводимого р-казоморфина-7 (1 мг/кг внутрибрюшинно, 21-34 дни после рождения) на поведение детенышей белых крыс начало изучаться 6 лет назад. Уже тогда была доказана принципиальная способность Р-К-7 приводить к длящимся в течение нескольких недель изменениям исследовательской активности экспериментальных животных. Этот факт и послужил основой для планирования исследований, составляющих основное содержание представленной диссертации работы. Было предложено:

1) исследовать отставленные эффекты Р-казоморфина-7 при его введении в более ранние возрастные периоды (1-14 и 10-23 дни после рождения);

2) исследовать возможные эффекты хронически вводимых укороченных с Си N-концов аналогов Р-К-7;

3) исследовать эффекты хронически вводимых морфина и налоксона -классических агониста и антагониста опиоидных рецепторов.

При этом если в исходной работе (Маклакова с соавт., 1996) основное внимание уделялось исследовательской активности и тревожности экспериментальных животных, то в нашем случае набор применяемых подходов был расширен за счет привлечения методик обучения с положительным и отрицательным подкреплением. Кроме того, отдельными разделами работы стали определение содержания серотонина в различных областях головного мозга экспериментальных животных, а также выяснение поведенческих эффектов (3-казоморфина-7 при его однократном введении детенышам различных возрастов.

Итак, история исследования (З-казоморфинов насчитывает уже 20 лет. Однако, хотя в каталоги различных фирм входит нередко до 20-30 аналогов и производных p-казоморфинов, большинство исследований в этом направлении ограничиваются либо вопросами лиганд-рецепторных взаимодействий, либо выяснением влияний данных веществ на желудочно-кишечный тракт и систему болевой чувствительности (обычно на препаратах различных органов), культуры различных тканей. Действие (3-казоморфинов на ЦНС изучено очень слабо, хотя чувствительность опиоидных рецепторов к этим пептидам выше, чем к морфинам, и нет никакого веского повода отрицать, что Р-казоморфины, как и все опиоиды, могут влиять на различные функции мозга. Вполне вероятно, что в случае Р-казоморфинов мы имеем дело с особым типом гормонов - так называемыми "пищевыми гормонами" (Umbach et al., 1985), попадание которых в организм детенышей в раннем постнатальном периоде является желательным (и даже необходимым) фактором правильной реализации и становления нервных процессов.

Простой расчет показывает, что казенны молока содержат в "скрытом виде" 1-3 % фрагментов с опиоидными свойствами. Следовательно, при поедании 10-15 г молочных белков (необходимое ежедневное количество) в организме грудного ребенка могут образовываться десятки миллиграммов проказоморфинов и казоморфинов. Более того, показано, что и из а- и к-казеинов способны вырезаться пептиды с опиоидными свойствами (хотя и менее стойкие к ферментативной деградации) (Kampa et al., 1996; Teschemacher et al., 1997).

Все сказанное обуславливает актуальность исследования эффектов системного введения Р-казоморфинов, которые, судя по всему, могут играть немаловажную роль в деятельности нервной системы в неонатальный период при питании исключительно молоком, а также в некоторых других случаях (например, у самок в период беременности и лактации).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на детенышах нелинейных белых крыс обоих полов, выращенных в виварии кафедры физиологии человека и животных. Всего в работе использовано 1275 животных.

Процедура выращивания заключалась в следующем. Беременные самки содержались по 5-6 особей в пластиковых непрозрачных клетках размером 35x56x19 см. Перед родами самок помещали в отдельные клетки. День родов принимали за нулевой день жизни крысят. При достижении крысятами возраста 2830 дней кормящую самку отсаживали и далее детеныши содержались в условиях свободного доступа к воде и корму.

Использованные препараты и их дозы

Пептиды, применявшиеся в работе, были синтезированы в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН. Исследовались:

- гептапептид (З-казоморфин-7 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile);

- укороченный с N-конца гексапептид Р-казоморфин-6 (Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile);

- укороченный с С-конца пентапептид (З-казоморфин-5 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly);

- укороченный с С- и N-концов тетрапептид р-казоморфин-4 (Phe-Pro-Gly-Pro);

- гептапептид семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro).

Кроме того применялись неспецифический антагонист опиоидных рецепторов налоксон (производство фирмы "SIGMA", США) и агонист р-опиоидных рецепторов морфин.

Все препараты вводились внутрибрюшинно. В случае хронической процедуры инъекции продолжались в течение 2-х недель; дозы вводимых (З-казоморфинов и налоксона составляли 1 мг/кг; морфина - 0.1 мг/кг, семакса - 0.05 мг/кг.

В случае однократных инъекций использовались дозы Р-казоморфина-7, равные 5 и 20 мг/кг.

Вещества вводились в водном растворе в из расчета 2 мл/кг веса крысы; контрольные животные получали эквивалентные объемы дистиллированной воды.

В возрасте 21 день детеныши тестировались в "открытом поле" в течение 2-х минут при красном свете. Открытое поле представляет собой круглую арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга. Арена окружена стенкой высотой 40 см. При тестировании животное помещали в центр арены и визуально поминутно регистрировали следующие показатели:

- горизонтальную двигательную активность (число пройденных сегментов);

- вертикальную двигательную активность (число подъемов на задние лапы);

- груминг (число касаний морды лапами);

- отходы от стенки арены и выходы в центр (число радиальных перемещений с пересечением внешней и внутренней окружностей, соответственно).

В возрасте 35 и 49 дней тестирование поведения в "открытом поле" проводилось в течение 5-ти минут со сменой освещенности. При этом первые 3 минуты был включен яркий свет (лампа, мощностью 200 Вт, размещенная на высоте 80 см над ареной). Затем освещенность резко меняли и вместо яркой лампы на 60 с включали красную, после чего на 60 сек восстанавливали исходный уровень освещенности. Регистрировали те же показатели, что и в предыдущем случае.

Наконец, в возрасте 56 дней использовалась стрессогенная модификация "открытого поля": 2-хминутное тестирование при включенных яркой лампе и звонке.

В дополнение к этому в соответствии с методикой, предложенной Родиной и соавт. (1993), определялись:

- латентный период спуска с высоты: детеныша помещали на верхнюю площадку пластикового параллелепипеда, 11x8x7 см (возраст 21 день) либо 14x14x15 см, установленного в центр ярко освещенного "открытого поля", и фиксировали время, за которое животное спускалось с параллелепипеда;

- латентный период прохождения через отверстие: в условиях комнатной освещенности детеныша помещали в одно из двух отделений челночной камеры (22x20x32 см) и фиксировали время, за которое он переходил в другое отделение через отверстие в разделяющей камеру перегородке;

- латентный период выхода из "домика": детеныша помещали внутрь параллелепипеда из прозрачного пластика (14x14x15 см), закрывали дверцу и устанавливали "домик" в центр ярко освещенного "открытого поля": через 15 сек после помещения в поле открывали боковую дверцу и фиксировали время, за которое крыса выходила из "домика".

Во всех случаях если животное не выполняло соответствующего действия за 180 сек, тестирование заканчивали.

В отдельной серии экспериментов поведение животных в возрасте около 3-х месяцев оценивалось в "приподнятом лабиринте" и тесте принудительного плавания.

В первом случае экспериментальная камера представляла собой крестообразный лабиринт (длина рукавов 35 см; высота стенок 20 см). Два противоположных рукава были затемнены и закрыты с боков и торцов стенками; два других - освещены и открыты. Камеру устанавливали на высоте 50 сантиметров от пола. Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 3-х минут регистрировали следующие показатели:

- латентный период захода в закрытый отсек;

- общее время нахождения на свету;

- количество стоек, выполненных в темном и светлом отсеках;

- количество умываний (груминг);

- количество выглядываний из темных отсеков камеры;

- количество переходов из темных отсеков в темные и из светлых в светлые;

- количество свешиваний со светлых рукавов лабиринта;

- количество выходов в светлые отсеки камеры и в концы светлых отсеков.

Тест принудительного плавания проводился в цилиндрической емкости объемом 25 л на 2/3 заполненной водой с t=27-28°C. Животное на срок 10 минут помещалось в воду и регистрировалась общая длительность:

- активного плавания (крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости);

- пассивного плавания (крыса производит редкие одиночные движения конечностями и хвостом с целью удержания головы над поверхностью воды);

- иммобилизации (животное полностью неподвижно, над поверхностью воды выступает только нос).

Методики обучения животных, использованные для оценки последствий хронического введения препаратов

В отдельных сериях экспериментов анализировались изменения способности к обучению с положительным и отрицательным подкреплением, возникающие у экспериментальных животных вследствие хронических инъекций препаратов.

В возрасте 43-48 дней осуществлялась выработка условной реакции пассивного избегания болевого раздражителя (УРПИ). Реакцию вырабатывали в камере (размер 30x22x35 см), разделенной на два равных отсека перегородкой с отверстием. Один отсек ярко освещался, второй был затемнен. Камеру устанавливали на решетчатый пол, соединенный с электростимулятором ЭСЛ-1. В первый день эксперимента животное помещали в освещенную часть камеры и регистрировали время перехода в затемненный отсек. После этого отверстие в перегородке закрывали и на пол в течение 3-х сек подавали прямоугольные импульсы тока напряжением 90 В длительностью 10 мсек, следующие с частотой 50 Гц. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 секунд. Через 4 дня животное вновь помещали в светлый отсек камеры и регистрировали время перехода в затемненный отсек, а также общее время нахождения в темноте в течение 3-х минут наблюдений.

Выработку условной пищедобывательной реакции на место проводили в т.н. "сложном лабиринте". Сложный лабиринт представляет собой квадратную камеру (размер 60x60x25 см), разделенную пятью прозрачными перегородками на 6 коридоров. В каждой перегородке имеется прямоугольное отверстие (см. рисунок).

Перед экспериментом животных подвергали 24-часовой пищевой депривации. Затем проводилась адаптация крыс к условиям эксперимента. При этом их на 15 минут помещали в лабиринт с равномерно разбросанными по отсекам кусочками хлеба с целью угашения избыточной ориентировочно-исследовательской реакции и снижения тревожности, а также формирования первичной ассоциации между условиями эксперимента и получением пищевого подкрепления.

В последующие 3 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х минут. В качестве подкрепления использовались хлебные шарики.

Крысу переносили в стартовый отсек (ближайший к экспериментатору коридор), после чего визуально регистрировали следующие показатели:

- латентный период выхода их стартового отсека (перехода во второй коридор);

- время реакции (латентный период взятия подкрепления);

- число выполненных реакций (число случаев, когда животное находило подкрепление в течение 3-х минут пребывания в лабиринте);

- количество ошибок (число отклонений от оптимальной правильной траектории движения, когда крыса после прохода очередного отверстия в перегородке сворачивает в "неверную" сторону);

В дни опыта животных кормили один раз в сутки непосредственно после эксперимента.

Методы, использованные для оценки последствий однократного введения (3казоморфина-7

Еще незрячие детеныши в возрасте 7 и 14 дней тестировались с применением установки "горячая пластина" ("Ugo Basile", Италия). При этом животные помещались на поверхность с t=28°C (температурные условия гнезда) либо 48°С слабое болевое воздействие). В первом случае регистрировался латентный период выползания из круга диаметром 5 см для оценки двигательной активности. При t=48°C определяли момент выхода за пределы круга диаметром 5 см (возраст 7 дней) либо 10 см (возраст 14 дней) хотя бы одной конечности для оценки болевой чувствительности. Регистрация проводилась через 15, 45 и 75 мин после инъекции веществ. Измерение болевой чувствительности крысят в возрасте 21 день также проводилось на "горячей пластине" (56°С); регистрировался латентный период первого лизания задней лапы.

Исследование двигательной активности в возрасте 21 и 28 дней осуществлялась при помощи актометра "Opto-Varimex" ("Columbus Instrum.", США), который позволяет регистрировать горизонтальную и вертикальную компоненту двигательной активности при помощи встроенных фотодатчиков. Размер камеры составляет 40x40x25 см. Наблюдение начиналось через 10 минут после введения воды либо раствора пептида. Регистрацию осуществляли в тишине и темноте, длительность тестирования составляла 9 минут. Оценку двигательной активности производили в условных единицах прибора.

Кроме того, в возрасте 28 дней нами для определения физической выносливости и координации движений использовался тест удержания на вертикальном неподвижном и горизонтальном качающемся стержнях ("качели"). Установка "качели" представляет собой подвижный деревянный стержень длиной 11 см и диаметром 7 мм, расположенный горизонтально на высоте 22 см и имеющий возможность свободно качаться в нескольких направлениях. Вертикальный стержень с шероховатой поверхностью (диаметр 9 мм. длина 15 см) укреплялся на высоте 28 см. Животное помещали на стержень таким образом, чтобы оно было лишено иной опоры, и регистрировали латентный период падения. Время наблюдений ограничивали тремя минутами.

Нейрохимический анализ

В специальных сериях экспериментов животные в возрасте 63 дня декапитировались, после чего с помощью стандартных методов (Miller, Maikel, 1970) проводился анализ содержания серотонина в мозжечке, стволе, промежуточном мозге и коре.

Взвешивали пробы (не более 100 мг) ткани. Каждую пробу растирали в ступе с добавлением 4 мл дистиллированной воды. Встряхивали пробы в течение 5 минут. Гомогенат переносили в делительные воронки с 6 мл хлороформа и добавляли по 1 мл 0.25 N NaOH. Затем помещали пробы в пластиковые пробирки и центрифугировали 15 минут при 8000 об/мин. Хлороформную фазу сливали. В воронки помещали 0.5 мл 1.2 N НС1, 1.5 мл пробы, 10 мл этилацетата (этилацетат очищали обычным способом от примесей уксусной кислоты и этилового спирта) и встряхивали в течение 5 мин. Сливали нижнюю кислотую фазу. К 1.5 мл пробы добавляли 0.9 мл 15 мМ% ортофталевого альдегида (15 мг в 100 мл концентрированной НС1) и кипятили 10 мин. В "слепые" пробы ортофталевый альдегид добавляли после кипячения и охлаждения. Определяли количество серотонина на спектрофлюориметре Hitachi 850. Флуоресценцию измеряли при Х=470 нм и возбуждающем свете с А,=360 нм. Количество серотонина рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в мкг/г ткани.

Статистическая обработка результатов

При обработке результатов использовали стандартные пакеты статистических программ STATGRAPHICS 2.1 и STATISTICA 4.5. Вычисляли средние, стандартные отклонения, ошибки средних массивов данных. При сравнении характеристик массивов применяли параметрические критерии Стьюдента и непараметрические Манна-Уитни и точный критерий Фишера. Использовались также методы ANOVA-анализа с последующим "post hock" сравнением и методы корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Малиновская, Ирина Владимировна

Выводы:

1. Доказана способность хронически вводимого в раннем постнатальном периоде гептапептида Р-казоморфина-7 (YPFPGPI; 1 мг/кг, в/б) вызывать у детенышей белых крыс длительные поведенческие и нейрохимические изменения.

2. Поведенческие эффекты Р-казоморфина-7, прослеженые до возраста 3 месяца, носили характер увеличения исследовательской активности и снижения тревожности; их конкретные проявления зависели от пола животных, их возраста и сроков введения препарата.

3. Действие укороченных аналогов Р-казоморфина-7 было менее выражено и лишь частично совпадало с эффектами прототипа; наибольшая степень соответствия показана для тетрапептида Р-казоморфина-4 (FPGP); влияние пентапептида Р-казоморфина-5 (YPFPG) было сходно с эффектами малых доз морфина.

4. Действие однократно вводимого Р-казоморфина-7 зарегистрировано при использовании более высокой (по сравнению с хроническим введением) дозы 20 мг/кг; при этом анальгетические эффекты проявились на 14-й день жизни детенышей, изменения двигательной активности - на 28 день.

5. После хронического введения Р-казоморфина-7 отмечены снижение содержания серотонина в мозжечке и тенденция к повышению содержания - в коре больших полушарий; в стволе и промежуточном мозге отличия от контроля отсутствовали.

6. Полученные результаты позволяют рассматривать опиоидоподобные фрагменты казеинов молока в качестве возможных факторов гормонального импринтинга, происходящего в нервной системе млекопитающих в раннем постнатальном периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первая диссертационная работа, выполненная на кафедре физиологии человека и животных с Р-казоморфинами, была посвящена достаточно стандартному скринингу их свойств (Маклакова, 1996). В этом и дальнейших исследованиях была проанализирована способность p-казоморфинов в случае системного введения белым крысам влиять на болевую чувствительность, двигательную активность, тревожность (в том числе на ее электрокардиографические корреляты), способность к обучению, судорожную готовность и др. Полученные данные позволили охарактеризовать наиболее известного представителя этого семейства пептидов - Р-казоморфин-7 - как соединение со смешанными опиоидными и не-опиоидными свойствами, поскольку только часть его эффектов блокировалась предварительным введением налоксона. Как опиоидное соединение Р-казоморфин-7 трудно назвать высокоактивным. Его анальгетически эффективная при внутрибрюшинной инъекции доза (20 мг/кг) почти на порядок выше, чем в случае морфина или, например, дерморфина. Однако, проявляющие анксиолитическое действие (и при этом - не снижающие уровень двигательной активности) дозы Р-казоморфина-7 оказались ниже - 1-5 мг/кг. Такие количества уже вполне сопоставимы с "порциями" Р-казоморфинов, потребляемыми, например, новорожденным ребенком, который, съедая в сутки 1015 г казеинов (500-700 мл молока), тем самым вводит в организм не менее 100 мг опиоидных пептидов.

Игнорировать этот факт, считая, что наличие p-казоморфинов в составе молока - лишь игра случая, и для организма - это только набор незаменимых аминокислот, было бы достаточно странно. Следовательно, возникла необходимость попытаться исследовать эффекты Р-казоморфинов. вводимых в раннем постнатальном периоде, причем оценить как острые, так и отставленные изменения поведения. При этом на раннем этапе работы было совершенно неизвестно, какие из них окажутся более выраженными. Исходя из данных литературы, предполагалось, что первые - но это не подтвердилось в дальнейшем.

Достаточно быстро выяснилось, что хроническое введение даже относительно небольшого количества пептида (1 мг/кг) вызывает устойчивые анксиолитические эффекты. Этот факт был показан сначала А.С.Маклаковой (введение пептида в 21-34 дни жизни), а затем подтвержден для более раннего срока инъекций (1-14 дни жизни) в 3-х независимых сериях экспериментов (раздел "Результаты и обсуждение"; главы 1.1, 1.2 и 1.3, соответственно). Эффекты разового введения наблюдались только при использовании максимальной дозы препарата - 20 мг/кг, начиная со второй декады жизни - что, очевидно, связано с процессом созревания рецепторной составляющей опиоидной системы.

По сравнению с крысой, опиоидная система ребенка к моменту рождения уже практически полностью сформирована. Поэтому можно ожидать, что (3-казоморфины находят в этом случае заметно больше возможностей для проявления своей активности.

Почему (3-казоморфины есть в коровьем и человеческом молоке и их нет в молоке крысы, мыши, кролика ? По-видимому, Р-казоморфины. как опиоиды экзогенного, пищевого происхождения необходимы для "поддержки" деятельности тех систем мозга, которые отвечают за активность взаимодействия с внешней средой - в первую очередь, регулирующих уровень исследовательской активности и тревожности. Действительно, складывается впечатление, что казоморфины более присущи молоку, "выводковых" млекопитающих, рождающих детенышей с открытыми глазами, развитым слухом и т.п. (среди грызунов - морские свинки). В этом случае полезность функции "смягчения" стрессогенног о влияния окружающей среды и настройки нервной системы на более экстравергный уровень функционирования оказывается достаточно очевидной.

Использование онтогенетического подхода оказалось очень информативным и, став основой нашей работы, позволило затронуть широкий круг чрезвычайно интересных проблем, таких как:

1). Возможность программирующего (вероятно, прямого или опосредованного нейротрофического) влияния P-казоморфинов на деятельность различных систем мозга. Данному явлению, по нашему мнению, соответствует в литературе понятие "гормонального импринтинга". Оно, хотя и не употребляется обычно по отношению к опиоидам, в данном случае достаточно точно характеризует специфику наблюдаемых эффектов - длительно сохраняющиеся (ослабления эффектов пептида с возрастом не обнаружено) последствия некоторого перинатального воздействия нейрохимически активного соединения. Явление это дополняет классический сенсорный импринтинг и обеспечивает вместе с ним, адаптацию мозга детеныша к некоторым жизненно важным факторам среды (как внешней, так и внутренней - но все равно остающейся внешней по отношению к ЦНС).

2). Наложение наблюдаемых эффектов на онтогенез опиоидной системы и процессы половой дифференцировки. Здесь следует отметить проблемы, связанные с существованием очень небольшого количества имеющейся по этому вопросу литературы. Так, например, совершенно не изучена возможность полового диморфизма опиоидной системы у человека. Без этих данных достаточно очевидное предположение о большей значимости (З-казоморфинов для формирующегося женского организма (поскольку часть обнаруженных эффектов регистрировалась только у самок) остается неподкрепленным.

3) Структурно-функциональный анализ активности (3-казоморфинов. Действительно, уникальное сочетание опиоидного N-конца и энзиматической (благодаря 3-м пролиновым остаткам) стабильности еще не исчерпывает присущего этим пептидам списка эволюционных "заготовок", р-казоморфины (вернее - различные фрагменты их молекул), по всей видимости, способны взаимодействовать с достаточно широким кругом мест связывания, упоминавшихся выше (орфановые рецепторы, рецепторы к Туг-МIF, недавно открытые "нейротрофические" опиоидные рецепторы и т.д.). В нашем случае чрезвычайно характерным оказалось существование отставленных (впервые регистрируемых не через одну, а через три недели после последнего введения) эффектов тетрапептида Phe-Pro-Gly-Pro, не обладающего какой-либо выраженной способностью к присоединению к "классическим" опиоидным рецепторам.

С другой стороны, также существуют (и даже достаточно распространены) представления о некотором вредоносном действии опиоидов в раннем постнатальном периоде, в рамках которых Р-казоморфины могут рассматриваться как патогенные факторы. Перечислим их.

Во-первых, это уже упоминавшаяся гипотеза о развитии детского аутизма. Она, однако, "конкурирует" с большим числом аналогичных (и значительно более популярных) гипотез о роли моноаминергических систем в генезе той же патологии.

Во-вторых, это указание на возможную роль опиоидов в синдроме внезапной смерти (остановка дыхания) младенцев. В этом случае предполагается как некоторая повышенная чувствительность дыхательного центра к тормозящему действию опиоидов, так и патологическая проницаемость ГЭЬ (в т.ч. для экзорфинов).

В-третьих, это диетологические исследования, касающиеся анксиогенной роли глютенов и, возможно, казоморфинов, у взрослых с ненормальной проницаемостью слизистой кишечника (язвы, гастриты и т.п.). Паши данные показали, что системное введение глютенов крысам действительно у величивает их тревожность, однако распространять этот эффект на казоморфины было бы совершенно неверно (Дубынин с соавт., 1998).

Наконец, в-четвертых, это представление о вероятной роли казоморфинов в генезе постродового психоза. Данная гипотеза представляется нам наиболее интересной, поскольку основывается на реальных измерениях содержания (5-казоморфинов в плазме кормящих матерей с соответствующим диагнозом. В этом случае Р-казоморфины образуются как результат дисфункции молочных желез и далее всасываются в кровь. Известно, что введение морфина подавляет материнское поведение и, следовательно, можно предположить то же действие для опиоидных пептидов.

Отметим, однако, даже в последнем случае речь идет не о типичной ситуации, а о варианте достаточно редкой патологии. Наше же исследование направлено на описание и анализ именно стандартного положения, в котором оказывается нервная система каждого новорожденного питающегося молоком с опиоид-содержащими казеинами, либо, напротив, не получающая такого молока, хотя ее онтогенез рассчитан на поступление экзогенной опиоидной "поддержки". Последняя ситуация, видимо, возникает при питании детей, например, соевыми заменителями молока. Последствия таких казоморфиновых деприваций совершенно не изучены.

Конечно, было бы наивно предлагать добавление необходимой порции опиоидов в пищу не получающих казоморфины новорожденных. По уже само

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малиновская, Ирина Владимировна, Москва

1. Аничков С.В. Нейрофармакология. // Медицина. J1. - 1982. - 384 е.

2. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейропептиды. // В кн. Биохимия мозга // Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова, Н.Д. Ещенко. СПб.: Издательство С.-Петербургского университета. - 1999. - с. 232-266.

3. Батурина Е.Ю. Физиологические эффекты дерморфина. // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М. - 1989.

4. Беспалов А.Ю., Э.Э.Звартау Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов. // Спб. 2000. - 297 с.

5. Биохимия мозга // Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова. Н.Д. Ещенко. -СПб.: Издательство С.-Петербургского университета. 1999. - 328 с.

6. Дамбинова С.А. Синаптические мембранные рецепторы, ионные каналы. // Биохимия мозга // Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова. Н.Д. Ещенко. -СПб.: Издательство С.-Петербургского университета. 1999. - с. 205-231.

7. Девойно JI.B., Ильюченок Р.Ю. Нейромедиаторные системы в пси-хонейроиммуномодуляции. // ЦЭРИС, Новосибирск. 1993. - 240 с.

8. Дубынин В.А., Маклакова А.С., Алфеева Л.Ю., Незавибатько В.Н. Каменский

9. A.А., Ашмарин И.П. Действие бета-казоморфина-7 на ноцицепцию крыс при системном введении. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1992. № 9. - с. 284-286.

10. Дубынин В.А., Асмакова Л.С., Соханенкова Н.И., Беспалова Ж.Д. Незавибатько

11. Королева С.В., Ашмарин И.П. Нейропептид Y: многообразие и кажущаяся противоречивость функций. Анализ возможных опосредованных эффектов. // Успехи физиологических наук. 2000. - т. 31. - № 1. - с. 31-46.

12. Маклакова А.С. Нейротропные эффекты фрагмента (3-казеина молока -гептапептида Р-казоморфина-7. // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. -М,- 1996.

13. Маклакова А.С., Дубынин В.А., Левицкая Н.Г., Незавибатько В.П., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Поведенческие эффекты бета-казоморфина-7 и его дез-Tyr -аналогов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1993. - № 8. - с. 155-158.

14. Маклакова А.С., Назаренко И.В., Дубынин В.А., Незавибатько В.П., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А. Влияние Р-казоморфина-7 на уровень пищевой и оборонительной мотивации при различных видах обучения. // Журнал ВНД им И.П. Павлова. 1995. - № 6. - с.1143-1150.

15. Машковский М.Д. Лекарства XX века. // М. 1998. - 320 с.

16. Розен В.Б. Основы эндокринологии. // М. Высш. шк. - 1994. - 336 с.

17. Соломзес Д. А., Чеурсон В. Соколовский Г. Наркотики и общество. // М. -"Иллойн".- 1998.- 192 с.

18. Сохаиеикова Н.Ю., Дубынин В.А., Каменский А.А., Андреева JI.A. Мясоедов Н.Ф. Влияние опиоидных пептидов пищевого происхождения на кардиотропные компоненты стресса. // Доклады РАН. 1998. - т. 363. - № 6. - с. 839-842.

19. Шишелова А.Ю. Роль сенсорного притока в формировании ранних поведенческих реакций и способности к обучению. // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М. - 2000.

20. Ahtee L Chronic morphine administration decreases 5-hydroxytryptamine and 2-hydroxyindoleacetic acid content in the brain of rats. // Med Biol. 1980. - v. 58(1). -p. 38-44.

21. Akil H., Young E., Watson S.J., Coy D.H. Opiate binding properties of naturally occurring N- and C-terminus modified beta-endorphins. // Peptides. 1981. - v. 2(3). -p. 289-292.

22. Alexander L.J., Das Gupta N.A., Beattie C.W. The sequence of porcine alpha s2-casein cDNA. // Anim. Genet. 1992. - v.23. - p. 365-367.

23. Amiche M., Sagan S., Мог A., Delfour A., Nicolas P. Characterization о С the receptor binding profile of (3H)-dermorphin in the rat brain. // Int. J. Pept. Protein Res. 1988. -v. 32(6).-p. 506-511.

24. Asakawa A; Inui A; Momose K; Ueno N; Fujino MA Kasuga M Endomorphins have orexigenic and anxiolytic activities in mice. // Neuroreport. 1998. \. 13. - p. 22652267.

25. Attali B, Gouarderes C, Mazarguil H, Audigier Y, Cros J Evidence for multiple "Kappa" binding sites by use of opioid peptides in the guinea-pig lumbo-sacral spinal cord. //Neuropeptides. 1982. - v. 3(1). - p. 53-64.

26. Banks W.A., Kastin A.J. Peptide transport systems for opiates across the blood-brain barrier. //Am. J. Physiol. 1990. - v. 259. - p. 1-10.

27. Banks WA, Kastin AJ, Harrison LM, Zadina JE Perinatal treatment of rats with opiates affects the development of the blood-brain barrier transport system PTS-1. // Neurotoxic^ Teratol. 1996. - v. 18(6). - p. 711-715.

28. Вагг GA, Goodwin GA Precipitated morphine withdrawal induces a conditioned aversion in the preweaning rat. // Pharmacol Biochem Behav. 1997. - v. 57(4). - p. 779-783.

29. Barr GA, Paredes W, Erickson KL, Zukin RS Kappa opioid receptor-mediated analgesia in the developing rat. // Brain Res. 1986. - v. 394(2). - p. 145-152.

30. Becker A, Grecksch G dTyr-D-Phe3 (Pro-D-Phe-Pro-Gly) interacts specifically with amygdaloid-kindled seizures and is capable of preventing the learning deficit occurring after kindling. // Peptides. 1992. - v. 13(1). - p. 73-76.

31. Becker A, Grecksch G, Pionnigs В Ostner С Effects of the peptide BCH-325 upon the efficacy of common antiepileptic drugs. // Peptides. 1994. - v. 15(7). - p. 12851288.

32. Beckett A.H., CaseyA.F. Synthetic analgesics: Stereochemical considerations. // J Pharm. Pharmacol. 1954. - v. 6. - p. 986-1001.

33. Becu-Villalobos D, Gonzalez Iglesias A, Diaz-Torga G Hockl P, Libertun C. Brain sexual differentiation and gonadotropins secretion in the rat. // Cell Mol. Neurobiol. -1997.-v. 17(6).-p. 699-715.

34. Bennett-Clarke С A; Lane RD; Rhoades RW Fenfluramine depletes serotonin from the developing cortex and alters thalamocortical organization. // Brain Res. 1995. - v. 702(1-2).-p. 255-260.

35. Blass E.M.; Blom J. Beta-casomorphin causes hypoalgesia in 10-day-old rats: evidence for central mediation. // Pediatr. Res. 1996. - v. 39(2). - p. 199-203.

36. Bono A.V., Cuffari S. Effectiveness and tolerance of tramadol in cancer pain. A comparative study with respect to buprenorphine. // Drugs. 1997. v. 53. - Suppl. 2.-p. 40-49.

37. Brantl V. Novel opioid peptides derived from human beta-casein: human beta-casomorphins. // Eur. J. Pharmacol. 1984. - v. 106( 1). - p. 213-214.

38. Brantl V., Teschemacher H., Blasig J., Henschen A., Lottspeich F. Opioid activities of beta-casomorphins. //Life Sci. 1981. - v. 28(17). - 1903-1909.

39. Brantl V., Neubert K. Opioid peprides derived from food proteins // UPS. 1986. -v. 7. — p. 6-7.

40. Brantl V., Teschemacher H., Henschen A., Lottspeich F. Novel opioid peptides derived from casein (beta-casomorphins). I. Isolation from bovine casein peptone. // Hoppe Seylers. Z. Physiol. Chem. 1979. - v. 360(9). - p. 1211-1216.

41. Brantl V., Teschemacher H., Henschen A., Lottsreich F. Novel opioid peptides derived from casein ((3-casomorphins). I. Isolation from bovine casein peptone. // Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem. 1979. - v. 360. - p. 1211-1216.

42. Buwalda B, Nyakas C, Koolhaas JM, Bohus B. Effects of neonatal administration of vasopressin on cardiac and behavioral responses to emotional stress in adult male rats. // Physiol Behav. 1991. - v. 50(5). - 929-932.

43. Buzas B, Izenwasser S, Portoghese PS, Cox BM Evidence for delta opioid receptor subtypes regulating adenylyl cyclase activity in rat brain. // Life Sci. 1994. - v. 54(7). -PL101-106.

44. Candido J., Lutfy K., Billings В., Sierra V., Duttaroy A., Inturrisi CH. Yoburn ВС. Effect of adrenal and sex hormones on opioid analgesia and opioid receptor regulation. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1992. - v. 42(4). - p. 685-692.

45. Capasso A, Sorrentino L, Di Giannuario A, Pieretti S, Loizzo A Effect of des-tyrosine-gamma-endorphin on neocortical spike-and-wave spindling in DBA/2J mice. // Eur J Pharmacol. 1994. - v. 261(1-2). - p. 209-212.

46. Chalmers DV, Levine S The development of heart rate responses to w eak and strong shock in the preweaning rat. // Dev. Psychobiol. 1974. - v. 7(6). - p. 519-527.

47. Charlin V., Defilippi С., Vargas V., Borghesi L., Gomez E. Treatment of acute secretory diarrhea with casein: an effect of beta-casomorphins? // Rev. Med. Chil. -1992. v. 120(6) - p. 666-669.

48. Corbett A.D., Gillan M.G., Kosterlitz H.W., McKnight A.T., Paterson S.J., Robson L.E. Selectivities of opioid peptide analogues as agonists and antagonists at the delta-receptor. // Br. J. Pharmacol. 1984. - v. 83(1). - p. 271-279.

49. Daniel H., Vohwinkel M., Rehner G. Effect of casein and beta-casomorphins on gastrointestinal motility in rats. // J. Nutr. 1990. - v. 120(3). - 252-257.

50. Davila-Garcia M.I., Azmitia E.C. Neuropeptides as positive or negative neuronal growth regulatory factors: effects of ACTH and leu-enkephalin on cultured serotonergic neurons. // Adv. Exp. Med. Biol. 1990. - v. 265. - p. 75-92.

51. Dinzburg A.L., Chirkov A.M., Chirkova S.K. Stress-protective effect of neuropeptides in monkeys. // Patol. Fiziol. Eksp. Ter. 1995. - v. 1. - p. 19-21.

52. Driessen В., Reimann W. Interaction of the central analgesic, tramadol, with the uptake and release of 5-hydroxytryptamine in the rat brain in vitro. // Br. J. Pharmacol. 1992.-v. 105(1).-p. 147-151.

53. Dubrovina N.I., Ilyutchenok R.Yu. Effect of Leu-enkephalin on the memory reactivation produced by blockade of the benzodiazepine/GABA-chloride ionophore receptor complex. // Brain Res. 1995. - v.30. - p. 347-350.

54. Eppler C.M., Hulmes J.D., Wang J.B., Johnson В., Corbett M„ Luthin D.R., Uhl G.R., Linden J. Purification and partial amino acid sequence of a mu opioid receptor from rat brain. // J. Biol. Chem. 1993. - v. 268(35). - p. 26447-26451.

55. Evans C.J., Keith D.E. Jr., Morrison H., Magendzo K., Edwards R.H. Cloning of a delta opioid receptor by functional expression. // Science. 1992. - v. 18. - p. 19521955.

56. Ferrer I., Serrano Т., Soriano E. Naturally occurring cell death in the subicular complex and hippocampus in the rat during development. П Neurosci. Res. 1990. -v. 8(1).-p. 60-66.

57. Feuerstein T.J.; Gleichauf O., Peckys D. Landwehrmeyer G.B. Scheremet R., Jackisch. Opioid receptor-mediated control of acetylcholine release in human neocortex tissue. // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1996. v. 354(5). - p. 586-592.

58. Fiori S., Renner C., Cramer J., Pegoraro S., Moroder L. Preferred conformation of endomorphin-1 in aqueous and membrane-mimetic environments. // J. Mol. Biol. -1999.-v. 291(1).-p. 163-1675.

59. Freeman F.M., Young I.G. Inhibition of passive-avoidance memory formation in the day-old chick by the opioid cytochrophin-4. // Learn. Mem. 2000. v. 7(4). - p. 213-219.

60. Fukudome S., Yoshikawa M. Gluten exorphin C. A novel opioid peptide derived from wheat gluten. // FEBS Lett. 1993.- v. 316(1). -p. 17-19.

61. Fukudome S., Yoshikawa M. Opioid peptides derived from wheat gluten: their isolation and characterization. // FEBS Lett. 1992. - v. 296(1). - p. 107- 111.

62. Fundytus M.E., Coderre T.J. Effect of activity at metabotropic. as well as ionotropic (NMDA), glutamate receptors on morphine dependence. // Br. J. Pharmacol. 1994. -v. 113(4).-p. 1215-1220.

63. Gale J.S., Bird E.D., Spoke E.G., Ivejsen L.L., Jessel T. Human brain substance P: distribution in controls and Huntington's chorea. // J. Neurochem. 1978. - v. 30(3). -p. 633-634.

64. Gantz I., Miwa H., Konda Y., Shimoto Y., Tashiro Т., Watson S.J. DelValle J., Yamada T. Molecular cloning, expression, and gene localization of a fourth melanocortin receptor. // J. Biol. Chem. 1993. - v. 268(20). - p. 15174-15179.

65. Georges F., Normand E., Bloch В., Le Moine C. Opioid receptor gene expression in the rat brain during ontogeny, with special reference to the mesostriatal system: an in situ hybridization study. // Brain Res. Dev. 1998. - v. 109(2). - p. 187-199.

66. Glamsta E.L., Meyerson В., Silberring J., Terenius L., Nyberg F. Isolation of a hemoglobin-derived opioid peptide from cerebrospinal fluid of patients with cerebrovascular bleedings. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - v. 184(2). -p. 1060-1066.

67. Gorio A., Malosio M.L., Vergani L., Di Giulio A.M. Exposure to perinatal morphine promotes developmental changes in rat striatum. // Int. J. Dev. Neurosci. 1996. - v. 14(4). p. 471-479.

68. Grauer S.M., Tao R., Auerbach S.B. Morphine induces an increase in extracellular serotonin in the rat diencephalon. // Brain Res. 1992. - v. 25. - p. 277-282.

69. Grecksch G., Becker A., Matthies H. Threshold to elicit seizures by picrotoxin is lowered in pentylenetetrazol-kindled mice. // Neuropharmacology. 1990. -v. 29(11).-p. 1073-1074.

70. Grecksch G., Schweigert C., Matthies H. Evidence for analgesic activity of beta-casomorphin in rats. // Neurosci Lett. 1981.-v. 27(3).-p. 325-328.

71. Greenberg R., Groves M.L., Dower H.J. Human beta-casein. Amino acid sequence and identification of phosphorylation sites. // J. Biol. Chem. 1984. v. 259(8). - p. 5132-5138.

72. Griebel G., Perrault G., Sanger D.J. Orphanin FQ, a novel neuropeptide with anti-stress-like activity. //BrainRes. 1999. - v. 836(1-2). - p. 221- 224.

73. Gulati A., Bhargava H.N. Cerebral cortical 5-HT1 and 5-HT2 receptors of morphine tolerant-dependent rats. //Neuropharmacology. 1988. - v. 27(12). - p. 1231-1237.

74. Gutierrez M., Menendez L., Hidalgo A., Baamonde A. Study of the density of opioid receptors in yhe male mouse brain at different stages of sexual maturation. // Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1999. - v. 21(7). - p. 459-462.

75. Hagaune S., Azuma N., Ishino J., Mori H., Kaminogawa S., Yamanchi K. DNA-synthesis stimulating peptide from bovine beta-casein. //Agricul. and Biolog. Chem. -1989.-v. 53.-p. 3275-3278.

76. Hall L., Laird J.E., Craig R.K. Nucleotide sequence determination of guinea-pig casein В mRNA reveals homology with bovine and rat alpha si caseins and conservation of the non-coding regions of the mRNA. // Biochem. J. 1984. v. 222. -p. 561-570.

77. Hammer R. The sex hormone-dependent development of opiate receptors in the rat medial preoptic area. // Brain Res. 1985. - v. 360(1-2). - p. 65-74.

78. Harnad S. A role for ovarian hormones in sexual differentiation of the brain. // Psycoloquy. 1995. - v. 6. (in http://www.ai.univie.ac.at/archives/ /0014.html.)

79. Harrison L.M., Zadina J.E., Banks W.A., Kastin A.J. Effects of neonatal treatment with Tyr-MIF-1, morphiceptin, and morphine on development, tail flick, and blood-brain barrier transport. // Brain Res. Dev. Brain Res. 1993. - v. 75(2). - p. 207-212.

80. Hatanaka К., Yatsugi S., Yamaguchi T. Effect of acute treatment w ith YM992 on extracellular norepinephrine levels in the rat frontal cortex. // Eur. J. Pharmacol. -2000.-v. 395(1).-p. 31-36.

81. Hatzoglou A., Bakogeorgou E., Hatzoglou C., Martin P.M. Castanas E. Antiproliferative and receptor binding properties of alpha- and beta-casoinorphins in the T47D human breast cancer cell line. // Eur. J. Pharmacol. 1996. v. 310(2-3). -p. 217-223.

82. Hedner J., Hedner T. beta-Casomorphins induce apnea and irregular breathing in adult rats and newborn rabbits. // Life Sci. 1987. - v. 41(20). - p. 2303-2312.

83. Heinricher M.M. McGaraughty S. Grandy D.K. Circuitry underlying antiopioid actions of orphanin FQ in the rostral ventromedial medulla. // J. Neurophysiol. 1997. -v. 78(6).-p. 3351-3358.

84. Henderson G., McKnight A.T., The orphan opioid receptor and its endogenous ligand—nociceptin/orphanin FQ. // Trends. Pharmacol. Sci. 1997. - 18(8). - p. 293300.

85. Henschen A., Lottspeich F., Brantl V., Teschemacher H. Novel opioid peptides derived from casein (beta-casomorphins). II. Structure of active components from bovine casein peptone. // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1979. v. 360(9). - p. 1217-1224.

86. Hill L.M., Kleinberg F. Effects of drugs and chemicals on the fetus and newborn (2). // Mayo Clin. Proc. 1984. - v. 59(11). - p. 755-765.

87. Ho B.Y., Takemori А.Е. Release by U-50,488H of 3H.serotonin from brain slices and spinal cord synaptosomes of U-50,488H-tolerant and nontolerant mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990. - v. 254(1). - p. 8-12.

88. Hofer M.A., Fisher A., Shair H. Effects of infraorbital nerve section on survival, growth, and suckling behaviors of developing rats. // J. Сотр. Physiol. Psychol. -1981.-v. 95(1).-p. 123-133.

89. Jagadeesh S.P., Subhash M.N. Effect of antidepressants on intracellular Ca++ mobilization in human frontal cortex. // Biol. Psychiatry. 1998. - v. 44(7). - p. 617621.

90. Jiang Q., Takemori A.E., Sultana M., Portoghese P.S., Bowen W.D. Mosberg H.I.,

91. Porreca F. Differential antagonism of opioid delta antinociception by D-«

92. Ala2,Leu5,Cys6.enkephalin and naltrindole 5'-isothiocyanate: evidence for delta receptor subtypes. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. - v. 257(3). - p. 1069-1075.

93. Jolas Т., Nestler E.J., Aghajanian G.K. Chronic morphine increases GABA tone on serotonergic neurons of the dorsal raphe nucleus: association with an up-regulation of the cyclic AMP pathway. // Neuroscience. 2000. - v. 95 (2). - p. 433-443.

94. Jones K.L., Barr G.A. Ontogeny of morphine withdrawal in the rat. // Behav. Neurosci.- 1995,-v. 109(6).-p. 1189-1198.

95. Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Morimoto Y., Hirose Т., Asai M., Inayama S., Nakanishi S., Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-endoфhin/dynorphin precursor. //Nature. 1982. v 298(5871). -p. 245-249.

96. Kamei J., Zushida K., Ohsawa M., Nagase H. The antinociceptive effects of endomorphin-1 and endomorphin-2 in diabetic mice. // Eur. J. Pharmacol. 2000. -v. 391(1-2).-p. 91-96.

97. Kammerer E., Koch S., Leon Roque D.M. Action of (D-Pro4)-beta-casomorphinl-5 on processes of synaptic transmission. // Biomed. Biochim. Acta. 1985. - v. 44(9). -p. 1379-1387.

98. Kappeler S., Farah Z., Puhan Z. Sequence analysis of Camelus dromedarius milk casein. // J. Dairy Res. 1998. - v. 65. - p. 209-222.

99. Kavaliers M., Choleris E., Saucier D.M. The NMDA receptor antagonist, NPC 12626, reduces the pronociceptive effects of orphanin FQ and kappa opiate antinociception in the land snail, Cepaea nemoralis. // Peptides. 1997. - v. 18(7). -p. 943-947.

100. Kayser H., Meisel H. Stimulation of human peripheral blood lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milk proteins. // FEBS Lett. 1996. - v. 383(1-2).-p. 18-20.

101. Kieffer B.L., Befort K., Gaveriaux Ruff C., Hirth C.G. The delta-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - v. 89(24). -p. 12048-12052.

102. Kinney H.C., Ottoson C.K., White W.F. Three-dimensional distribution of 3H-naloxone binding to opiate receptors in the human fetal and infant brainstem. // J. Сотр. Neurol. 1990. - 291(1). - p. 55-78.

103. Kirby M.L., Holtzmann S.G. Effects of chronic opiate administration of spontaneous activity of fetal rats. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1982. - v. 16(2). p. 263-269.

104. Kistler-Heer V., Lauber M.E., Lichtensteiger W. Different developmental patterns of melanocortin MC3 and MC4 receptor mRNA: predominance of Mc4 in fetal rat nervous system. // J. Neuroendocrinol. 1998. - v. 10(2). - p. 133-146.

105. Koch G., Brantl V. Binging of beta-casomorphins to opioid receptors. // In: Beta-Casomorphins and Related Peptides (Nyberg F. and Brantl V., ads.). 1 uris-Tryck AB, Uppsala, Sweden. 1990. - p.43-52.

106. Kohler U„ Rauca C. Effects of BCH 325 (Pro-D-Phe-Pro-Gly) on open field behavior after chronic stress procedure. // Peptides. 1992. - v. 13(1). - p. 141-144.

107. Kong L.Y., Jeohn G., Hudson P.M., Du L., Liu В., Hong J.S. Reduction of lipopolysaccharide-induced neurotoxicity in mouse mixed cortical neuron/glia cultures by ultralow concentrations of dynorphins. // J. Biomed. Sci. 2000. -v. 7(3). - p. 241247.

108. Kosterlitz H.W., Paterson S.J. Types of opioid receptors: relation to antinociception. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1985. - v. 19. - suppl. - 308(1136). - p. 291-297.

109. Kosterlitz H.W., Paterson S.J., Robson L.E. Characterization of the kappa-subtype of the opiate receptor in the guinea-pig brain. // Br. J. Pharmacol. 1981.- v. 73(4). - p. 939-949.

110. Kozlova M., Kalentchuk V. Stimulatory effect of opioid peptides and naloxone on rat spinal cord cells in primary dissociated culture. // Int. J. Dev. Neurosci. -1994. -v. 12(5). -p. 507-515.

111. Kurek M., Przybilla В., Hermann K., Ring J. A naturally occurring opioid peptide from cow's milk, beta-casomorphine-7, is a direct histamine releaser in man. // Int. Arch. Allergy. Immunol. 1992. - v. 97(2). - p. 115-120.

112. Lazarus L.H., Bryant S.D., Salvadori S., Attila M., Sargent Jones L. Opioid infidelity: // Trends. Neurosci. 1996. - v. 19(1). - p. 31-35.

113. Leboyer M., Bouvard M.P., Launay J.M., Recasens C., Plumet M.H. Waller-Perotte D., Tabuteau F., Bondoux D., Dugas M. Opiate hypothesis in infantile autism? Therapeutic trials with naltrexone. //Encephale. 1993. - v. 19(2). - p. 95-102.

114. Lee Y.S., Wurster R.D. Differential effects of methionine enkephalin on the growth of brain tumor cells.//J. Neurooncol. 1994. - v. 19(1).-p. 11-15.

115. Lemieux L., Amiot J. High-performance liquid chromatography of casein hydrolysates phosphorylated and dephosphorylated. I. Peptide mapping. // J. Chromatogr. 1990. - v. 2. - p. 299-321.

116. Liaw W.J., Ho S.T., Wang J.J., Wong C.S., Lee H.K. Cellular mechanism of opioid tolerance. // Acta Anaesthesiol. Sin. 1996. - v. 34(4). - p. 221-234.

117. Liebmann C., Schrader U., Brantl V. Opioid receptor affinities of the blood-derived tetrapeptides hemorphin and cytochrophin. // Eur. J. Pharmacol. 1989. v. 166(3). -p. 523-526.

118. Lindner G., Grosse G., Wenzel M., Jentzsch K.D., Forner K., Oehme P. The effect of methionine enkephalin, leucine enkephalin and the hexapeptide. dalargin on the morphology of cultured neurons. // Hirnforsch. 1988. - v. 29(5). - p. 547-556.

119. Ling G.S., Spiegel K., Lockhart S.H., Pasternak G.W. Separation of opioid analgesia from respiratory depression: evidence for different receptor mechanisms. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1985. - v. 232(1). - p. 149-155.

120. Lord J., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: Multiple agonists and peceptors. //Nature. 1977. -v. 267. - p. 495-499.

121. Maggi R., Limonta P., Dondi D., Piva F. Modulation of the binding characteristics og hypotalamic mu opioid receptors in the rats by gonadal steroids. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1991- v. 1-3.-p. 113-121.

122. Mahe S., Dumontier A.-M., Tome D. Intestinal action and absorbtion of beta-casomorphins. In: Beta-Casomorphins and Related Peptides (Nyberg F. and Brantl V., ads.), Furis-Tryck AB, Uppsala, Sweden. 1990. - p. 79-85.

123. Maldonado R. Participation of noradrenergic pathways in the expression of opiate withdrawal: biochemical and pharmacological evidence. //Neurosci. Biobehav. Rev. -1997.-v. 21(1).-p. 91-104.

124. Mansour A., Watson S.J., Akil H. Opioid receptors: past, present and future. // Trends Neurosci. 1995. - v. 18(2). - p. 69-70.

125. Mao J. NMDA and opioid receptors: their interactions in antinociception, tolerance and neuroplasticity. // Brain Res. Rev. 1999. - v. 30(3). - p. 289-304.

126. Martin W.R. Opioid antagonists. // Pharmacol. Rev. 1967. - v. 19. p. 463-521.

127. Martin W.R., Eades C.G., Thomson J .A., Gilbert P.E. The effects of morphine- and nalorphine-like drugs in the nondependant and morphine-dependant chronic spinal dog. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1976. - v. 197. - p. 517-532.

128. Martini L., Dondi D., Limonta P., Maggi R., Piva F. Modulation by sex steroids of brain opioid receptors: implications for the control of gonadotropins and prolactin secretion. // J. Steroid Biochem. 1989. - v. 33(4B). -p. 673-681.

129. Martin-Schild S., Zadina J.E., Gerall A.A., Vigh S., Kastin A.J. Localization of endomorphin-2-like immunoreactivity in the rat medulla and spinal cord. // Peptides. -1997.-v. 18(10).-p. 1641-1649.

130. Mateo A.R., Hijazi M., Hammer R.P. Dynamic patterns of medial preoptic mu-opiate receptor regulation by gonadal steroid hormons. // Neuroendocrinology. 1992. -v. 55 (l).-p. 51-58.

131. Matos F.F., Rollema H., Basbaum A.I. Simultaneous measurement of extracellular morphine and serotonin in brain tissue and CSF by microdialysis in awake rats. // J. Neurochem. 1992. - v. 58(5). - p. 1773-1781.

132. Matthies H., Ruthrich H.L., Stark H., Barth A., Neubert K„ Hartrodt B. Deproceptin, Tyr-Pro-Phe-D-Pro-NH2, another casomorphin with remarkable analgesic action. // Acta Biol. Med.Ger. 1982. - v. 41(9). - p. K39-42.

133. Matthies H., Stark H., Hartrodt В., Ruethrich H.L., Spieler H.T., Barth A. Neubert K. Derivatives of beta-casomorphins with high analgesic potency. // Peptides. 1984. -v. 5(3).-p. 463-470.

134. McDowell J., Kitchen I. Ontogenesis of delta-opioid receptors in rat brain using 3H.[D-Pen2,D-Pen5]enkephalin as a binding ligand. //Eur. J. Pharmacol. 1986. -v. 128(3).-p. 287-289.

135. Mehta C.S., Strada S. Effects of acute and continuous administration of morphine on the cyclic AMP response induced by norepinephrine in rat brain slices. /7 Life Sci. -1994.-v. 55(1).-p. 35-42.

136. Meisel H. Chemical characterization and opioid activity of an exorphin isolated from in vivo digests of casein. // FEBS Lett. 1986. - v. 196(2). - p. 223-227.

137. Meisel H. Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins. // Biopolymers. 1997. - v. 43(2).-p. 119-128.

138. Meyerson B.J., Berg M., Johansson B. Neonatal naltrexone treatment: effects on sexual and exploratory behavior in male and female rats. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1988. - v. 31(1). - p. 63-67.

139. Millan M.J., Czlonkowski A., Lipkowski A., Herz A. Kappa-opioid receptor-mediated antinociception in the rat. II. Supraspinal in addition to spinal sites of action. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989. - v. 251(1). - p. 342-350.

140. Miller J.H., Azmitia E.C. Growth inhibitory effects of a mu opioid on cultured cholinergic neurons from fetal rat ventral forebrain, brainstem, and spinal cord. // Brain Res. Dev. Brain Res. 1999. - v. 114(1). - p. 69-77.

141. Minami M., Hosoi Y., Toya Т., Katao Y., Maekawa K., Katsumata S. Yabuuchi K., Onogi Т., Satoh M. In situ hybridization study of kappa-opioid receptor mRNA in the rat brain. //Neurosci. Lett. 1993.- 12.-p. 161-164.

142. Mollereau C., Parmentier M., Mailleux P., Butour J.L., Moisand C. Chalon P., Caput D., Vassart G., Meunier J.C. ORL1, a novel member of the opioid receptorfamily. Cloning, functional expression and localization. // FEBS Lett. 1994. v. 14. -p. 33-38.

143. Nairn M., Nicolas P., Baron D. Folded conformations of the delta-selective opioid dermenkephalin with head-to-tail interactions. A stimulated annealing stugy through NMR restraints. // Int. J. Pept. Protein Res. 1996. - v. 47 (5). - p. 27-3 1.

144. Najam N., Panksepp J. Effect of chronic neonatal morphine and naloxone on sensorimotor and social development of young rats. // Pharmacol. Biochem. Behav. -1989.-v. 33(3). -p. 539-544.

145. Nakanishi S., Inoue A., Kita Т., Nakamura M., Chang A.C., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor. //Nature. 1979. - v. 278(5703). - p. 423-427.

146. Nakazawa Т., Ikeda M., Kaneko Т., Yamatsu K., Kitagawa K., Kiso Y. Bestatin potentiates the antinociception but not the motor dysfunction induced by intracerebrally administered dynorphin-B in mice. // Neuropeptides. 1989. - v. 13(4).-p. 277-283.

147. Napier T.C., Mitrovic I. Opioid modulation of ventral pallidal inputs. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. - v. 877. - p. 176-201.

148. Niwa M., Nose Т., Nozaki M., Tzurumi К., Fujimura H. Effects of Ьи1офЬапо1 and its metabolites on the levels of monoamines and their metabolites in the rat brain. // Jpn. J. Pharmacol. 1985. - v. 39(4). - p. 515-528.

149. Noble F., Cox B.M. Differential desensitization of mu- and delta- opioid receptors in selected neural pathways following chronic morphine treatment. // Br. J. Pharmacol. -1996.-v. 117(1).-p. 161-169.

150. Noble F., Cox B.M. Differential regulation of D1 dopamine receptor- and of A2a adenosine receptor-stimulated adenylyl cyclase by mu-, delta 1-, and delta 2-opioid agonists in rat caudate putamen. // J. Neurochem. 1995. - v. 65( 1). -p. 125-133.

151. Noda M., Teranishi Y., Takahashi H., Toyosato M., Notake M., Nakanishi S., Numa S. Isolation and structural organization of the human preproenkephalin gene. // Nature. 1982. - v. 297(5865). - 431-434.

152. Nyakas C., Levay G., Viltsek J., Endroczi E. Effects of neonatal ACTH4-10 administration on adult adaptive behavior and brain tyrosine hydroxylase activity. // Dev. Neurosci. 1981. - v. 4(3). -p. 225-232.

153. Olianas M.C.; Onali P. Activation of opioid and muscarinic receptors stimulates basal adenylyl cyclase but inhibits Ca2+/calmodulin- and forskolin-stimulated enzyme activities in rat olfactory bulb. // J. Neurochem. 1994. - v. 63(1). - p. 161-168.

154. Olianas M.C., Onali P. Synergistic interaction of muscarinic and opioid receptors with GS-linked neurotransmitter receptors to stimulate adenylyl cyclase activity of rat olfactory bulb. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1988. - v. 66(12). - p. 1487-1492.

155. Olson G.A., Olson R.D., Kastin A.J. Endogenous opiates: 1989. // Peptides. 1990. -v. 11(6).-p. 1277-1304.

156. Panigrahy A., Sleeper L.A., Assmann S., Rava L.A., White W.I . Kinney H.C. Developmental changes in heterogeneous patterns of neurotransmitter receptor binding in the human interpeduncular nucleus. // J. Сотр. Neurol. 1998. - v. 390(3). -p. 322-332.

157. Papakonstanti E.A., Bakogeorgou E., Castanas E., Emmanouel D.S. Hartig R., Stournaras C. Early alterations of actin cytoskeleton in OK cells by opioids. // J. Cell Biochem. 1998. - v. 70(1). - p. 60-69.

158. Pasi A., Mahler H., Lansel N., Bernasconi C., Messiha F.S. beta-Casomorphin-immunoreactivity in the brain stem of the human infant. // Res. C'ommun. Chem. Pathol. Pharmacol. 1993. - 80(3). - p. 305-322.

159. Pepin M.C., Yue S.Y., Roberts E., Wahlestedt C., Walker P. Novel "restoration of function" mutagenesis strategy to identify amino acids of the delta-opioid receptor involved in ligand binding. // J. Biol. Chem. 1997,- v. 4. - p. 9260-9267.

160. Pert C.B., Snyder S.H. Opiate receptor: Demonstration in nervous tissue.// Science. 1973.-v. 179. - p. 1011-1014.

161. Petrilli P., Picone D., Caporale C., Addeo F., Auricchio S., Marino G. Does casomorphin have a functional role? // FEBS Lett. 1984. - v. 169(1). - p. 53-56.

162. Petrilli P., Addeo F., Chianese L. Primary structure of water buffalo beta-casein tryptic and CNBr peptides. // Ital. J. Biochem. 1983. - v. 32(5). - p. 336-344.

163. Petri По P., Tavani A., Verotta D., Robson L.E., Kosterlitz H.W. Differential postnatal development of mu-, delta- and kappa-opioid binding sites in rat brain. // Brain Res.- 1987. v. 428(1). -p. 53-58.

164. Popik P., Skolnick P. The NMDA antagonist memantine blocks the expression and maintenance of morphine dependence. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1996. - v. 53(4).-p. 791-797.

165. Potaman V. N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A. Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. Entry of the synthesic ACTH (4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection. II Neurosci. Lett. -1991. v. 127. -p. 133-136.

166. Przewlocki R., Labuz D., Mika J., Przewlocka В., Tomboly C\. l oth G. Pain inhibition by endomorphins. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. - v. 897. p. 154-164.

167. Ramabadran К., Bansinath M. Opioid peptides from milk as a possible cause of sudden infant death syndrome. // Med. Hypotheses. 1988. - v. 27(3). p. 181-187.

168. Rauca C., Matthies H. Effects of intrastriatal microinjection of beta-casomorphins and its Des-tyrosine derivatives on rat motor behaviour. // Biomed. Biochim. Acta. -1986.-v. 45(8).-p. 1083-1091.

169. Read L.C., Lord A.P., Brantl V., Koch G. Absorption of beta-casomorphins from autoperfused lamb and piglet small intestine. // Am. J. Physiol. 1990. - v. 259. - p. 443-452.

170. Reimer S., Hollt V. GABAergic regulation of striatal opioid gene expression. // Brain Res. Mol. 1991. - v. 10(1). - p. 49-54.

171. Reiner A., Brauth SE, Kitt CA, Quirion R Distribution of mu. delta, and kappa opiate receptor types in the forebrain and midbrain of pigeons. // J. Сотр. Neurol. -1989.-v. 15.-p. 359-382.

172. Rhoades R.W., Bennett-Clarke C.A., Shi M.Y., Mooney R.D. Effects of 5-HT on thalamocortical synaptic transmission in the developing rat. // J. Neurophysiol. 1994. -v. 72(5).-p. 2438-2450.

173. Richardson B.C., Mercier J.C. The primary structure of the ovine beta-caseins. // Eur. J. Biochem. 1979. - v. 99(2). - p. 285-297.

174. Rinne J.O., Lonnberg P., Marjamaki P., Molsa P., Sako E. Paljarvi L. Brain methionine- and leucine-enkephalin receptors in patients with dementia. // Neurosci. Lett. 1993,-v. 14.-p. 77-80.

175. Robertson B.C., Hommer D.W., Skirboll L.R. Electrophysiological evidence for a non-opioid interaction between dynorphin and GABA in the substantia nigra of the rat. //Neuroscience. 1987. - v. 23(2). - p. 483-490.

176. Robinson S.E., Maher J.R., Wallace M.J., Kunko P.M. Perinatal methadone exposure affects dopamine, norepinephrine, and serotonin in the weanling rat. // Neurotoxicol. Teratol. 1997. - v. 19(4). - p. 295-303.

177. Rochford J., Henry J.L. Intrathecal administration of delta receptor agonists in the urethane anesthetized rat provokes an increase in arterial pressure via a non-opioid mechanism. // Brain Res. 1990. - v. 512(2). - p. 259-268.

178. Rossi G.C., Leventhal L., Bolan E., Pasternak G.W. Pharmacological characterization of orphanin FQ/nociceptin and its fragments. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. - v. 282(2). - p. 858-865.

179. Ruthrich H.L., Grecksch G., Matthies H. Influence of beta-casomorphins on apomorphine-induced hyperlocomotion. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1993a. - v. 44(1).-p. 227-231.

180. Ruthrich H.L., Grecksch G., Matthies H. Influence of modified casomorphins on yawning behavior of rats. // Peptides. 1992a. - v. 13(1). - p. 69-72.

181. Ruthrich H.L., Grecksch G., Schmidt R., Neubert K. Linear and cyclic beta-casomorphin analogues with high analgesic activity. // Peptides. 1992b. - v. 13(3). -p. 483-485.

182. Ruthrich H.L., Grecksch G., Schmidt R. Phel-substituted beta-casomorphin-5 analogues with analgesic activity. // Peptides. 1994. - v. 15(3). - p. 457-460.

183. Ruzicka B.B., Jhamandas. Depression of potassium-evoked striatal acetylcholine release by delta-receptor activation: inhibition by cholinoactive agents. // Can J. Physiol. Pharmacol. 1988. - v. 66(12). - p. 1487-1492.

184. Sahin M., Bowen W.D., Donoghue J.P. Location of nicotinic and muscarinic cholinergic and mu-opiate receptors in rat cerebral neocortex: evidence from thalamic and cortical lesions. // Brain Res. 1992. - v. 579(1). - p. 135-1347.

185. Sakaguchi M., Fujimori Т., Satoh Т., Satoh M., Takeuchi M., Matsumura E. Effects of opioids on neuronal survival in culture of embryonic chick dorsal root ganglion neurons. // Neurosci. Lett. 1999. - v. 262(1). - p. 17-20.

186. Sakaguchi M., Murayama K., Yabe K., Satoh M., Takeuchi M., Matsumura E. Beta-casomorphin-5 stimulates neurite outgrowth in a mouse neuroblastoma cell line (Neuro-2a). //Neurosci Lett. 1998. - v. 251(2). - p. 97-100.

187. Sales N., Charnay Y., Zajac J.M., Dubois P.M., Roques B.P. Ontogeny of mu and delta opioid receptors and of neutral endopeptidase in human spinal cord: an autoradiographic study. // J. Chem. Neuroanat. 1989. - v. 2(4). - p. 179-188.

188. Sanderson K., Nyberg F., Khalil Z. Modulation of peripheral inflammation by locally administered hemorphin-7. // Inflamm. Res. 1998. - v. 47(2). p. 49-55.

189. Sandor N.T., Lendvai В., Vizi E.S. Effect of selective opiate antagonists on striatal acetylcholine and dopamine release. // Brain Res. Bull. 1992. - v. 29(3-4). - p. 369373.

190. Scanff., Yvon M., Thirouin S., Pelissier J.P. Characterization and kinetics of gastric emptying of peptides derived from milk proteins in the preruminant calf. // J. Dairy Res. 1992. - v. 59(4). - p. 437-447.

191. Schlicker E., Werthwein S., Kathmann M., Bauer U. Nociceptin inhibits noradrenaline release in the mouse brain cortex via presynaptic OR LI receptors. // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1998. - v. 358(4). - p. 418-422.

192. Schlosser В., Kudernatsch M.B., Sutor В., ten Bruggencate G.A. Delta, mu and kappa opioid receptor agonists inhibit dopamine overflow in rat neostriatal slices. // Neurosci Lett. 1995.-v. 191(1-2).-p. 126-130.

193. Schreff М., Schulz S., Wiborny D., Hollt V. Immunofluorescent identification of endomorphin-2-containing nerve fibers and terminals in the rat brain and spinal cord. //Neuroreport. 1998.-v. 9(6).-p. 1031-1034.

194. Schusdziarra V., Schick A., de la Fuente A., Specht J., Klier M., Brantl V. Pfeiffer E.F. Effect of beta-casomorphins and analogs on insulin release in dogs. // Endocrinology. 1983a. - v. 112(3). - p. 885-889.

195. Schusdziarra V., Schick R., de la Fuente A., Holland A., Brantl V. Pfeiffer E.F. Effect of beta-casomorphins on somatostatin release in dogs. // Endocrinology. -1983b.-v. 112(6).-p. 1948-1951.

196. Seeman P. Drug dissociation constants for neuroreceptors and transporters. // Receptor Tables. 1993. - v. 2. (in http://www.sander.embl-heidelberg.de/7tm/ligand)

197. Seth P., Fei Y.J., Li H.W., Huang W., Leibach F.H., Ganapathy V. Cloning and functional characterization of a sigma receptor from rat brain. // J. Neurochem. -1998.-v. 70(3).-p. 922-931.

198. Sharif N.A., Hughes J., Discrete mapping of brain Mu and delta opioid receptors using selective peptides: quantitative autoradiography, species differences and comparison with kappa receptors. // Peptides. 1989. - v. 10(3). - p. 499-522.

199. Simmons M.L. Wagner J.J., Caudle R.M., Chavkin C. Endogenous opioid regulation of norepinephrine release in guinea pig hippocampus. // Neurosci Lett. 1992. - v. 141(1).-p. 84-88.

200. Simmons M.L., Chavkin C. k-Opioid receptor activation of a dendrotoxin-sensitive potassium channel mediates presynaptic inhibition of mossy fiber neurotransmitter release. //Mol. Pharmacol. 1996. - v. 50(1). - p. 80-85.

201. SimonEJ., Hiller J.M., Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic 3H.etorphin to rat brain homogenate. proc. // Natl. Acad. Sci. IJSA. 1973. -v. 70.-p. 1947-1949.

202. Sofuoglu M., Portoghese P.S., Takemori A.E. 7-Benzylidenenaltrexone (BNTX): a selective delta 1 opioid receptor antagonist in the mouse spinal cord. /V Life Sci. -1993.-v. 52(8).-p. 769-775.

203. Spain J.W., Roth B.L., Coscia C.J. Differential ontogeny of multiple opioid receptors (mu, delta, and kappa). // J. Neurosci. 1985. - v. 5(3). - p. 584-588.

204. Speciale S.G., Manaye K.F., Sadeq M., German D.C. Opioid receptors in midbrain dopaminergic regions of the rat. II. Kappa and delta receptor autoradiography. // J. Neural. Transm. Gen. Sect. 1993. - v. 91(1). - p. 53-66.

205. Stark H., Lossner В., Matthies H. Metabolism of beta-casomorphin and its derivatives in rat brain and liver homogenates. // Biomed. Biochim. Acta. 1987. - v. 46(10).-p. 687-694.

206. Stark H., Van Bree J.B., de Boer A.G., Jaehde U., Breimer D.D. In vitro penetration of des-tyrosinel-D-phenylalanine3-beta-casomorphin across the blood-brain barrier. // Peptides. 1992,- v. 13(1).-p. 47-51.

207. Stinus L., Koob G.F., Ling N., Bloom F.E., Le Moal M. Locomotor activation induced by infusion of endorphins into the ventral tegmental area: evidence for opiate-dopamine interactions. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980. . v. 77(4). - p. 2323-2327.

208. Strand F.L., Rose K.J., King J.A., Segarra A.C., Zuccarelli L.A. AC 111 modulation of nerve development and regeneration. // Prog. Neurobiol. 1989. -\. 33(1). - p. 4585.

209. Subramanian G., Paterlini M.G., Portoghese P.S., Ferguson D.M. Molecular docking reveals a novel binding site model for fentanyl at the mu-opioid receptor. // J. Med. Chem. -2000.-v. 10.-p. 381-391.

210. Sudha S., Lakshmana M.K., Pradhan N. Changes in learning and memory, acetylcholinesterase activity and monoamines in brain after chronic carbamazepine administration in rats. // Epilepsia. 1995. - v. 36(4). - p. 416-422.

211. Sugimoto-Watanabe A., Kubota K., Fujibayashi K., Saito K. Antinociceptive effect and enzymatic degradation of endomorphin-1 in newborn rat spinal cord. // Jpn. J. Pharmacol. 1999. - v. 81(3). - p. 264-270.

212. Sumiya E., Kawakita K. Inhibitory effects of acupuncture manipulation and focal electrical stimulation of the nucleus submedius on a viscerosomatic reflex in anesthetized rats. // Jpn. J. Physiol. 1997. - v. 47(1). - 121-130.

213. Taira Т., Hilakivi L.A., Aalto J., Hilakivi I. Effect of beta-casomorphin on neonatal sleep in rats. // Peptides. 1990. - v. 11(1). - p. 1-4.

214. Tang L, Todd RD, O'Malley KL Dopamine D2 and D3 receptors inhibit dopamine release. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. - v. 270(2). - p. 475-479.

215. Tang Q., Gandhoke R., Burritt A., Hruby V.J., Porreca F., Lai J. High-affinity interaction of (des-Tyrosyl)dynorphin A(2- 17) with NMDA receptors. // J. Pharmacol. Exp Ther. 1999. - v. 291(2). - p. 760-765.

216. Tao R., Ma Z., Auerbach S.B. Alteration in regulation of serotonin release in rat dorsal raphe nucleus after prolonged exposure to morphine. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. - v. 286(1). - 481-488.

217. Tavani A., Robson L.E., Kosterlitz H.W. Differential postnatal development of mu-, delta-and chi-opioid binding sites in mouse brain. // Brain Res. 1985. - v. 355(2). -p. 306-309.

218. Tenconi В., Lesma E., DiGiulio A.M., Gorio A. High opioid doses inhibit whereas low doses enhance neuritogenesis in PC 12 cells. // Brain Res. Dev. Brain Res. 1996. -v. 94(2).-p. 175-181.

219. Terenius L. Specific uptake of narcotic analgesics by subcellular fractions on the guinea pig ileum. // Acta Pharmacol. Toxicol. 1972. - v. 31. - p. 50.

220. Teschemacher H., Koch G., Brantl V. Milk protein-derived opioid receptor ligands. // Biopolymers. 1997. - v. 43(2). - p. 99-117.

221. Teschemacher H., Koch G., Scheffler H., Hildebrand A., Brantl V. Opioid peptides. Immunological significance? // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1990. - v. 594. - p. 66-77.

222. Theiss P., Papeschi R., Herz A. Effects of morphine on the turnover of brain catecholamines and serotonin in rats-chronic morphine administration. // Eur. J. Pharmacol. 1975. - v. 34(2). - p. 263-271.

223. Tokuyama S., Ho I.K. Effects of diltiazem, a Ca2+ channel blocker, on naloxone-precipitated changes in dopamine and its metabolites in the brains of opioid-dependent rats. // Psychopharmacology (Berl). 1996. - v. 125(2). -p. 135-140.

224. Tome D., Dumontier A.M., Hautefeuille M., Desjeux J.F. Opiate activity and transepithelial passage of intact beta-casomorphins in rabbit ileum. /7 Am. J. Physiol. 1987. - v. 253(6 Pt 1). - p. 737-744.

225. Tseng L.F., Narita M., Suganuma C., Mizoguchi H., Ohsawa M. Nagase H., Kampine J.P. Differential antinociceptive effects of endomorphin-1 and endomorphin-2 in the mouse. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. - v. 292(2). - p. 576-583.

226. Tso P.H., Yung L.Y., Wong Y.H. Regulation of adenylyl cyclase. ERK1/2, and CREB by Gz following acute and chronic activation of the delta-opioid receptor. // J. Neurochem. 2000. - v. 74(4).-p. 1685-1693.

227. Tsushima H., Mori M., Matsuda Т. Microinjection of dynorphin into the supraoptic and paraventricular nuclei produces antidiuretic effects through vasopressin release. // Jpn. J. Pharmacol. 1993. - v. 63(4). - p. 461-468.

228. Turlejski K., Djavadian R.L., Kossut M. Neonatal serotonin depletion modifies development but not plasticity in rat barrel cortex. // Neuroreport. 1997. - v. 8(8). -p. 1823-1828.

229. Umbach M., Teschemacher H., Praetorius K., Hirschhauser R. Bostedt H. Demonstration of a beta-casomorphin immunoreactive material in the plasma of newborn calves after milk intake. // Regul. Pept. 1985. - v. 7. - p. 223-230.

230. Van Bockstaele E.J., Chan J. Electron microscopic evidence for coexistence of leucine5-enkephalin and gamma-aminobutyric acid in a subpopulation of axon terminals in the rat locus coeruleus region. // Brain Res. 1997. - v. 746 (1-2). - p. 171-182.

231. Van Praag H., Falcon M., Guendelman D., Frenk H. The development of analgetic, pro- and anti-convulsant opiate effects in the rat. // Ann. 1st. Super. Sanita. 1993. - v. 29(3).-p. 419-429.

232. Van Vliet B.J., Ruuls S.R., Drukarch В., Mulder A.H., Schoffelmeer A.N. Beta-adrenoceptor-sensitive adenylate cyclase is inhibited by activation of mu-opioid receptors in rat striatal neurons. // Eur. J. Pharmacol. 1991. - v. 195(2). - p. 295300.

233. Vathy I., Rimanoczy A., Eaton R.C., Katay L. Sex dimorphic alterations in postnatal brain catecholamines after gestational morphine. // Brain Res. Bull. 1995. - v. 36(2). -p. 185-193.

234. Vaughan C.W., Ingram S.L., Connor M., Christie M.J. How opioids inhibit GABA-mediated neurotransmission. // Nature. 1997. - v. 390. - p. 611-614.

235. Versteeg D.H., Csikys Т., Spierenburg H. Stimulus-evoked release of tritiated monoamines from rat periaqueductal gray slices in vitro and its receptor-mediated modulation. //Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1991. - v. 343(6). - p. 595602.

236. Vito C.C., Fox Т.О. Androgen and estrogen receptors in embryonic and neonatal rat brain. // Brain Res. 1981. - v. 254 (1). - p. 97-110.

237. Volterra A., Restani P., Brunello N., Galli C.L., Racagni G. Interaction of beta-casomorphins with multiple opioid receptors: in vitro and in vivo studies in the newborn rat brain. // Brain Res. 1986. - v. 395(1). - p. 25-30.

238. Volterra A., Brunello N., Restani P., Galli C.L., Racagni G. Ontogenetic studies on mu, delta and kappa opioid receptors in rat brain. // Pharmacol. Res. Commun. -1986.-v. 18(10).-p. 979-990.

239. Weinberger S.B., Martinez J.L. Jr. Differential effects on active avoidance performance and locomotor activity of two major enkephalin metabolites, tyr-gly-gly and des-tyr-leu.enkephalin. // Life Sci. 1988. - v. 43(9). - p. 769-776.

240. Werthwein S., Bauer U., Nakazi M., Kathmann M., Schlicker E. Further characterization of the ORL1 receptor-mediated inhibition of noradrenaline release in the mouse brain in vitro. // Br. J. Pharm. 1999. - v. 127(1). - p. 300-308.

241. Wilkes B.C., Schiller P.W.,Conformation-activity relationships of cyclic dermorphin analogues. // Biopolymers. 1990 -v. 29(1). - p. 89-95.

242. Winters W.D., Hance A.J., Cadd G.C., Lakin M.L. Seasonal and sex influences on ketamine-induced analgesia and catalepsy in the rat; a possible role for melatonin. // Neuropharmacology. 1986. - v. 25(10). - p. 1095-1101.

243. Wohltmann M., Roth B.L., Coscia C.J. Differential postnatal development of mu and delta opiate receptors. // Brain Res. 1982. - v. 255(4). - p. 679-684.

244. Yang Y.R.; Chiu Т.Н.; Chen C.L. Structure-activity relationships of naturally occurring and synthetic opioid tetrapeptides acting on locus coeruleus neurons. // Eur. J. Pharmacol. 1999. - v. 372(3). - p. 229-236.

245. Yilmaz В., Gilmore D.P. Effects of mu, kappa, and delta opioid receptor agonists and antagonists on rat hypothalamic noradrenergic neurotransmission. // Brain Res. Bull. 1999,-v. 48(5).-p. 491-495.

246. Yoskikawa M., Yoshimura Т., Chiba H. Opioid peptides from human (3-casein. // Agric. Biol. Chem. 1984. - v. 48. - p. 3185-3187.

247. Zadina J.E., Hackler L., Ge L.J., Kastin A.J. A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. // Nature. 1997. - v. 3. - suppl. 386(6624). - p. 499-502.

248. Zadina J.E., Paul D., Gergen K.A., Ge L.J., Hackler L„ Kastin A.J. Binding of Tyr-W-MIF-1 (Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2) and related peptides to mu 1 and mu 2 opiate receptors. // Neurosci Lett. 1996. - v. 215(1). - p. 65-69.

249. Zadina J.E., Kastin A.J., Ge L.J., Brantl V. Hemorphins, cytochrophins. and human beta-casomorphins bind to antiopiate (TYR-MIE-1) as well as opiate binding sites in rat brain. // Life Sci. 1990. - v. 47(8). - p. PL25-30.

250. Zadina J.E., Martin-Schild S., Gerall A.A., Kastin A.J., Hackler L. Ge L.J., Zhang X. Endomorphins: novel endogenous mu-opiate receptor agonists in regions of high mu-opiate receptor density. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. -v. 897. - p. 136-144.

251. Zagon I.S. Endogenous opioid systems and neural cancer: transmission and scanning electron microscopic studies of murine neuroblastoma in tissue culture. // Brain Res. Bull.- 1988.-v. 21(5). -p. 777-784.

252. Zagon I.S.; Verderame M.F.,; Allen S.S., McLaughlin P.J. Cloning, sequencing, chromosomal location, and function of cDNAs encoding an opioid growth factor receptor (OGFr) in humans. // Brain Res. 2000. - v. 21. - p. 75-83.186

253. Zioudrou С., Streaty R.A., Klee W.A. Opioid peptides derived from food proteins. The exorphins. // J. Biol. Chem. 1979. - v. 254(7). - p. 2446-2449.