Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейротропные эффекты фрагмента бета-казеина молока - гептапептида бета-казоморфина-7

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Нейротропные эффекты фрагмента бета-казеина молока - гептапептида бета-казоморфина-7"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

11а правах рукописи МАКЛАКОВА Анастасия Сергеевна

НЕЙРОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ ФРАГМЕНТА ¡3-КАЗЕИНА МОЛОКА - ГЕПТАПЕПТИДА

8-КА30М0РФИНА-?

05.00,13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в Институте Молекулярной генетики РАН (директор института - член-корреспондент РАН Е.Д.Свердлов) и на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МРУ им. М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой -академик РАМН И.П.Ашмарин).

Научные руководители:

кандидат химических наук В.Н.Незавибатько доктор биологических наук А.А.Каменский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.А.Титов кандидат биологических наук И.Ю.Шамакина

Ведущее учреждение - Институт Фармакологии РАМН

Защита диссертации состоится " с?&саЗ£л 1996 г.

ус-за /7

в 1° часов на заседании Специализированного Совета Д.053.05.35.

биологического факультета Московского Государственного

Университета им.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские

горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ,9 " 1996 г.

/

Ученый секретарь

Специализированного Совета ^^

кандидат биологических наук ^/Г^/ Б.А.Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Пептидные регуляторы

физиологических функций организма привлекают в настоящее время пристальное внимание многих исследователей. Существование

многочисленных семейств регуляторных пептидов обеспечивает разностороннюю модуляцию физиологических процессов и адаптацию организма к различным условиям внешней среды.

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидов являются опиоиды, которые, как было установлено, играют важную роль в контроле болевой чувствительности, поведенческих реакций, механизмах обучения и памяти, формировании эмоционального статуса, в патогенезе ряда заболеваний. Среди функциональных аналогов эндогенных опиовдов есть и вещества экзогенного происхождения. Они взаимодействуют с опиатными рецепторами и обладают опиоидной активностью так же, как эндорфины, но поступают в организм извне, являясь, как правило, фрагментами пищевых белков. Особый интерес в этом классе опиоидов вызывают фрагменты молочного белка в-казеина -казоморфины, которые в связи с особенностями первичной структуры обладают повышенной устойчивостью к действию протеолитических ферментов (Вгап1Л е1 а1., 1979). Известно, что казоморфины модулируют деятельность желудочно-кишечного тракта и обладают анальгетическими свойствами. Однако, данные о воздействии казоморфинов на деятельность центральной нервной системы, поведение, обучение либо отсутствуют, либо очень фрагментарны. Следовательно, физиологическое значение этих веществ для организма взрослых и, особенно, новорожденных млекопитающих остается не до конца ясным. Вместе с тем, подробное изучение физиологических эффектов казоморфинов может быть интересно для понимания их роли в модуляции различных функций организма, так как они являются одним из важных компонентов пищи.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование нейротропных эффектов фрагмента (60-65) бычьего ц-казеина - в-казоморфина-7 и некоторых его аналогов при системном введении. В соответствии с целью в работе были поставлены следующие основные задачи:

- исследовать зависимость анальгетической активности З-казоморфина-7 и его лишенных концевого тирозина аналогов от дозы;

- изучить характер воздействия различных доз В-казоморфина-7 и его аналогов на свободное поведение экспериментальных животных;

- определить характер влияния в-казоморфина-7 и его аналогов на обучение экспериментальных животных с положительным и отрицательным подкреплением;

- оценить действие хронического введения а-казоморфина-7 на поведение детенышей белых крыс;

- исследовать влияние в-казоморфина-7 на поведение экспериментальных животных в условиях его фармакологического нарушения, а также возможность коррекции этих нарушений с помощью в-казоморфина-7.

Научная новизна. Впервые систематически исследованы нейротропные свойства фрагмента бычьего в-казеина гептапептида В-казоморфина-7 и его аналогов, лишенных Ы-концевого тирозина. Сделано заключение о возможных механизмах их физиологических эффектов и вероятной роли этих пептидов в формировании индивидуальных поведенческих реакций и их эмоционального обеспечения на ранних стадиях постнатального развития.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные позволяют сделать вывод о направленности и силе эффектов в-казоморфина-7, определяющих поведение животных, которые зависят как от дозы и сроков введения, так и от пола животного. Это дает возможность предложить в-казоморфин-7 и некоторые его аналоги в качестве основы для создания новых нейротропных лекарственных средств нейролептической

направленности.

Апробация работы. Результаты работы были изложены на Российской научной конференции "Создание новых лекарственных средств" (Москва, 1992), на научной конференции "Организованный мозг" (Москва, 1993), на XXXII конгрессе международного Объединения Физиологических Дисциплин (Глазго, 1993), на 1-ой конференции Российской Ассоциации Боли "Патофизиология и фармакология боли" (Москва, 1993), на международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы деятельности мозга" (Санкт-Петербург, 1994), на международной научной конференции "Традиционная медицина и питание" (Москва, 1994), на 1-ом Европейском Фармакологическом конгрессе (Милан, 1995), на 1-ом съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград,

- 3 -

1995), на 1-ом конгрессе Немецкого Общества Нейронаук (Берлин,

1996), на 2-ом съезде Европейской Ассоциации Нейронаук (Страсбург, 1996).--------- - ------

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, еыводов и списка литературы. Работа изложена на /// страницах, содержит 33 рисунка и 20 таблиц. Список литературы включает 2'<f источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть работы выполнена на половозрелых самцах нелинейных белых крыс весом 180-230 г. В одном из разделов работы были использованы детеныши нелинейных белых крыс обоих полов в возрасте 3-8 недель. Всего в работе использовано 2847 взрослых животных и 89 детенышей.

В экспериментах применяли следующие препараты:

- гептапептид Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-île - ß-казоморфин--? (ß-K-7) к его аналоги: гексапептид Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile -З-казсморфин-6 (ß-K-6); тетрапептид Phe-Pro-Gly-Pro ¡з-казоморфин-4 (ß-K-4). Все исследованные пептиды синтезированы в лаборатории регуляторных пептидов Института Молекулярной генетики РАН.

- налоксон ("SERVA", Германия), галоперидол (Laboratoire le brun, Франция), аминазин и фенамин отечественного производства.

Все препараты вводили внутрибрюшинно, в водном растворе из расчета 1 мл/кг веса животного. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы дистиллированной воды. Размер экспериментальных групп составлял 10-25 животных в зависимости от теста.

Для определения болевой чувствительности животных использовали следующие методы:

1) метод "отдергивания хвоста" - регистрировали латентный период избавления от болевого раздражителя при погружении хвоста в горячую воду температурой 56+1°С. Измерения проводили в течение 1 часа до и 1.5-2-х часов после введения препарата (в контрольной группе - воды) с интервалами 10 минут.

Для оценки двигательной и ориентировочно-исследовательской

активности животных использовали следующие приборы и методы:

1) актометры "0р1о-Уаг1глех" и "РОДЭО-2" - раздельно фиксируют горизонтальную и вертикальную компоненты двигательной активности, а "РОДЭО-2" - также число обследованных отверстий в полу камеры.

2) метод "открытое поде" - в течение 2-х минут регистрировали латентный период выхода из центра поля, величину горизонтальной и вертикальной двигательной активности, количество отходов от стенки и выходов в центр поля, груминг. Исследования проводили в двух модификациях - "бесстрессорной (в тишине и при свете красной лампы) и "стрессогенной" (при действии сенсорных раздражителей).

3) метод "норковая камера" - в течение 2-х минут в тишине и при свете красной лампы регистрировали величину горизонтальной и вертикальной двигательной активности, количество обследованных отверстий, груминг.

Выработку условных рефлексов исследовали при помощи следующих моделей обучения:

1) выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте - обучение проводили в течение 4-х дней, помещая животных в лабиринт по 5 раз ежедневно. Регистрировали число выполненных реакций (ЧВР), величину латентного периода выхода из стартовой камеры (ЛП), время реакции (ВР), число ошибок (40).

2) выработка условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проводилась в экспериментальной камере, меньший отсек которой ярко освещен, а больший затемнен. В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек и после его перехода в темный отсек подвергали неизбегаемому удару током в течение 3 с. Через 7 дней животных снова помещали в освещенный отсек камеры и проверяли сохранение навыка.

3) выработка условного рефлекса активного избегания (УРАИ) проводилась в камере с угловой полкой на высоте 25 см. Условным раздражителем служил звук звонка длительностью 3 с, безусловным - удар током через 2 с после выключения звонка. Условной реакцией считали прыжок на полку, выполненный в ответ на условный сигнал до включения тока. В работе использовали четырех- и двухдневную модели выработки УРАИ. В первом случае обучение проводили в течение 4-х дней, предъявляя каждому

животному по 10 сочетаний ежедневно, во втором - в течение 2-х дней, предъявляя по 15 сочетаний. Регистрировали следующие показатели: число выполненных реакций (ЧВР) - прыжков на полку з ответ на условный сигнал до включения тока, число коротколатентных реакций (KJIP) - прыжков на полку через 1-2 с после включения тока, число межсигнальных реакций (МСР) -прыжков на полку в период между подачей раздражителей.

Комплексную оценку тревожно-фобических состояний у крыс проводили по методу, предложенному Родиной и соавторами (1993), который включает:

1) Определение двигательной и_ориентировочно-

исследовательской активности животных в открытом поле в течение 5-ти минут. Через 180 с после помещения животного в поле освещенность резко меняли: вместо яркой лампы на 60 с включали красную, после чего восстанавливали исходный уровень освещенности. Регистрировали те же показатели, что описаны выше.

2) Тест I - определение латентного периода спуска с высоты при помещении животного на верхнюю площадку пластикового параллелепипеда, установленного в центр ярко освещенного открытого поля.

Тест 11 - определение латентного периода прохождения через отверстие. В условиях комнатной освещенности животное помешали в одно из двух отделений челночной камеры и фиксировали время перехода в другое.

Тест 111 - определение латентного периода выхода из "домика". Животное помещали внутрь параллелепипеда из прозрачного органического стекла, закрывали дверцу и устанавливали "домик" в центр ярко освещенного открытого поля. Через 15 с после помещения в поле открывали боковую дверцу и фиксировали время выхода из "домика".

В работе также исследовали другие параметры физиологического состояния организма животных: статическую физическую выносливость (тест "вертикальная сетка"), динамическую физическую выносливость и способность к координации движений и сохранению равновесия в условиях вызванной двигательной активности (тест "вращающийся стержень"), уровень пищевой мотивации, частоту сердечных сокращений (регистрация ЭКГ), электросудорожную готовность мозга (электросудорожный шок).

При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа. Применялись пакеты статистических и графических программ STATGRAF и STADIA, а также программно-регистрационный комплекс CONAN.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние о-казоморфина-7 и его аналогов на болевую чувствительность экспериментальных животных.

Исследование методом "отдергивания хвоста" показало, что ß-K-7 в дозе 5 мг/кг практически не влиял на болевую чувствительность животных. В более высоких дозах, 10 и 20 мг/кг, пептид вызывал значимое увеличение времени избавления от болевого стимула на 20-30 % по сравнению с контролем (рис.1). Появляясь через 10-20 минут после введения вещества, данный эффект оставался достоверным в течение 30 и 70 минут для групп, получивших 10 и 20 мг/кг ß-K-7, соответственно. Максимальный эффект наблюдался через 40-50 минут после инъекции. Проведение дисперсионного анализа подтвердило дозозависимый характер анальгезии в течение часа после введения о-К-7 (р< 0.05).

При проведении регрессионного анализа была обнаружена положительная корреляция между выраженностью анальгезии и исходной болевой чувствительностью животных. Эта связь регистрируется в группе, получившей 20 мг/кг ß-K-7, уже через 10 минут , а в группе, получившей 10 мг/кг, - через 30 минут после инъекции. Данное корреляционное отношение характеризуется высоким уровнем значимости (р< 0.05-0.01) и сохраняется в течение 2-х часов регистрации.

Описанные анальгетические эффекты ß-K-7 могут быть заблокированы предварительным введением 1 мг/кг налоксона. Время избавления от болевого стимула в группе с совместным введением налоксона и пептида в дозе 20 мг/кг превышало контрольные значения не более чем на 25 %, что является незначимым.

Введение лишенных тирозина ß-K-б и ß-K-4 не вызывало значимых отличий от контроля ни в дозе 5, ни в дозе 20 мг/кг.

На основании полученных нами данных можно заключить, что действие относительно высоких (10 и 20 мг/кг) доз ß-K-7 на болевую чувствительность животных характеризуется четкой анальгетической направленностью. Учитывая литературные данные и

Г4

- г -

результаты наших опытов с налоксоном, антиноцицептивное

Рис.1. Влияние различных доз 0-Н-7 на болевую

чувствительность экспериментамных животных в тесте отдергивания хвоста. По оси X — время после введения, мин. По оси У — изменение времена реакции, с. Значимые отлитая от изменений в контроле » р < 0.05, ** р < 0.01.

действие ц-К-7 опосредуется, вероятнее всего, через опиоидные рецепторы преимущественно р.-типа, расположенные в различных отделах ЦНС. Отсутствие анальгетического действия дез-Туг аналогов 8-К-7 еще раз подтверждает существующее представление о необходимости тирозина в 1-м положении для присоединения молекулы пептида к опиатным рецепторам р.-типа.

2. Влияние в-казоморфина-7 и его аналогов на двигательную активность экспериментальных животных в условиях свободного поведения.

Введение в-К-7 в дозах 1 и 5 мг/кг за 5 минут до начала наблюдений не оказывало влияния на спонтанное поведение экспериментальных животных ни в одном из использованных тестов.

При тестировании в открытом поле и норковой камере наибольшие из исследованных доз о-К-7, 10 и 20 мг/кг, соответственно, также оказались неэффективны.

При введении О-К-7 в дозе 20 мг/кг в приборе "Р0ДЭ0-2" было зарегистрировано значимое снижение как горизонтальной, так и вертикальной компонент двигательной активности на 6-10 минутах регистрации на 26 и 34 I, соответственно. Как следствие, суммарные значения этих показателей также достоверно снижены на 16 и 22 % по сравнению с контролем.

Аналогично при исследовании в приборе "Ор^-Уагмех" В-К-7 в дозе 20 мг/кг вызывал значимое уменьшение величин горизонтальной активности (ГА) на 49 % и вертикальной

- 3 -

активности (ВА) на 48 % на 6-10 минутах наблюдений (рис.2). В этом случае суммарные значения также были ниже контрольных на 22 и 19 %.

Предварительное введение 1 мг/кг налоксона не только не блокировало, но даже потенциировало эффекты в-К-7 в течение всего периода регистрации. В группах, получивших совместно налоксон и В-К-7, снижение горизонтальной и вертикальной компонент двигательной активности было более выражено, чем в группах, получивших отдельно налоксон либо гептапептид. Так, суммарные значения ГА и ВА после совместного введения налоксона и 5 мг/кг в-К-7 составляли 65 и 67 %, соответственно, от таковых для животных с введением только пептида (р< 0.01 и р= 0.09). Еще заметнее данный эффект проявлялся в группе, получившей налоксон и 20 мг/кг в-К-7: суммарные значения ГА и ВА были снижены до соответственно 50 и 61 % относительно пептидной группы (р< 0.01 и р< 0.05; рис.3).

Несколько иной характер воздействия на локомоторную активность и ориентировочно-исследовательское поведение продемонстрировали дез-Туг аналоги в-К-7.

Введение в-К-6 и в-К-4 в дозе 1 мг/кг практически не оказало влияния на двигательную активность крыс при тестировании в норковой камере, а в дозе 5 мг/кг - привело к некоторому усилению локомоторной активности и увеличению числа обследованных отверстий. Те же эффекты были зарегистрированы для 1 и 5 мг/кг в-К-6 в приборе "Р0ДЭ0-2". Наконец, инъекция В-К-6 в дозе 20 мг/кг привела к незначительному падению ГА на 15 % и достоверному снижению ВА на 40 % по сравнению с контролем на 6-10 минутах регистрации в "Р0ДЭ0-2". Кроме того, число обследованных отверстий в опытной группе было достоверно ниже соответствующих контрольных величин в течение всего периода наблюдений. Что касается в-К-4, во всех исследованных дозах он в разной степени вызывал снижение обеих составляющих двигательной активности, а также числа обследованных отверстий при тестировании с помощью актометра "Р0ДЭ0-2".

Интересно также, что влияние обоих исследованных дез-Туг аналогов в-К-7 на вертикальную составляющую двигательной активности было более выражено, чем на горизонтальную.

Анализируя полученные данные, можно констатировать, что в отсутствии стресса введение в-К-7 в дозах 1, 5 и 10 мг/кг

практически не оказывало влияния на параметры двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных. Следовательно, известное каталептическое действие опиоидов при

таком количестве вводимого экзорфина еще не проявляется. Лишь в

аэоо л1'А 2000 15001000 -500-

О

контроль ""fi-K—7

Рис.2. Влияние р-К-7 в дозе 20 иг/кг на

горизонтальную (ГА) и вертикальную (ВА) двигательную активность животных в приборе "Opto-Varimex". Значимые отличия от контроля

** р < 0.01.

эооо

2000

1000

о I

|СЗ контроль ЕИЗ нллоксон ВЩ?-к-7 Ийнлл+^-к-7

Рис.З. Влияние предварительного введения 1 мг/кг налоксона на эффекты (З-К-7 в дозе 20 мг/кг в приборе "ОрЮЛ/аптех". Значимые отличия от контроля * р < 0.05 ** р < 0.01.

дозе 20 мг/кг гептапептид вызывал заметное снижение обеих компонент двигательной активности, что является весьма характерным для типичного опиоида (Olson et al., 1990).

Сложнее и разнообразнее действие дез-Туг аналогов в-К-7 на локомоторную активность и ориентировочно-исследовательское поведение экспериментальных животных. В отличие от прототипа, они влияют на двигательную активность животных уже в относительно низкой дозе, 5 мг/кг, и воздействуют на видоспецифичный компонент поведения экспериментальных животных (обследование норок).

Итак, анальгетически неактивные дез-Туг аналоги обладают в то же время определенными нейротропными эффектами, что дает возможность предположить их не ц-опиоидную природу. Потенциация угнетающего действия в-К-7 на двигательную активность крыс на фоне блокатора опиоидных рецепторов надоксона, который хотя и является неспецифическим, но более избирательно блокирует рецепторы ц,-типа, также позволяет предположить, что наблюдаемое влияние в-К-7 опосредуется не только через ii-опиатные рецепторы. Такое предположение вполне правомочно, учитывая данные Brantl и соавторов (1981; 1982) о связывании казоморфинов с опиоидными рецепторами 8- и ж-типов.

3. Влияние в-казоморфина-7 и его аналогов на различные виды обучения экспериментальных животных.

В Т-образном лабиринте в-К-7 в количествах, не влиявших на болевую чувствительность и двигательную активность, увеличивал число выполненных реакций (ЧВР) во второй и третий дни зксперимента. Так, на второй день обучения введение 1 и 5 мг/кг В-К-7 за 5 минут до начала обучения значимо увеличивало ЧВР соответственно на 35 и 39 % по сравнению с контролем. На третий день ЧВР в опытных группах, получивших 1 и 5 мг/кг в-К-7, превышало контрольные значения на 15 и 23 %, соответственно. В последний день обучения крысы всех групп по показателю ЧВР не различались (рис.4а).

Что касается других параметров обучения, то латентный период выхода из стартовой камеры (ЛП) 5 время реакции (BP) и число ошибок (40) не изменились под влиянием в-К-7.

После введения 20 мг/кг в-К-7 ЧВР в опытной группе было достоверно ниже, чем в контроле, на протяжении всех 4-ех дней

обучения (рис.4а). Кроме того, ЛП и ВР были выше контрольных значений в течение всего эксперимента, хотя эти изменения были менее выражены, чем изменения ЧВР. По 40 группы не различались.

Введение ß-K-7 ео всех исследованных дозах сразу после сеансов обучения оказалось неэффективным.

Совместное введение 5 мг/кг ß-K-7 и налоксона приводило к снижению ЧВР в течение всех 4-ех дней обучения на 16, 29, 28 и 34 Z, соответственно, по отношению к группе с введением одного гептапептида. Таким образом, налоксон препятствовал проявлению облегчающего действия ß-K-7 на обучение животных.

Облегчающее влияние дез-Tyr аналогов ß-K-7 на обучение крыс в Т-образном лабиринте выражено значительно слабее, его специфика и сроки отличаются от таковых для ß-K-7, хотя эффекты и совпадают по направленности.

При выработке УРПМ за критерий плохой обученности был принят переход в темный отсек камеры при повторной посадке в течение 30 с. В группах, получивших ß-K-7 в дозах 1 и 5 мг/кг за 5 минут до начала обучения, увеличилось количество плохо обучившихся животных (рис.46). Введение обеих доз ß-K-7 сразу после сеанса обучения было неэффективно.

При выработке УРАИ по четырехдневной модели инъекция ß-K-7 в дозе 1 мг/кг за 5 минут до начала обучения приводила к снижению ЧВР по сравнению с контролем, начиная со второго дня обучения, на 27, 20 и 22 % (рис.4в). Также в опытной группе было достоверно увеличено число коротколатентных реакций (КЛР) на 68 7с и уменьшено число межсигнальных реакций (MCP) на 76 Z на четвертый день обучения. Эффекты дозы 5 мг/кг имели ту же направленность, но были менее выражены. Доза 20 мг/кг оказалась неэффективной.

Что касается ß-К-б и ß-K-4, то введение обоих аналогов в исследованных дозах не выявило достоверных отличий опытных групп от контрольной ни в первый, ни в последующие дни обучения.

Таким образом, ß-K-7, с одной стороны, облегчает выработку рефлекса с положительным подкреплением, с другой - препятствует выработке навыка при использовании тестов с отрицательным подкреплением. Примечательно, что и облегчающее, и ухудшающее воздействие приблизительно совпадают по времени и приходятся на 2-3 сутки обучения. Разнонаправленность эффектов ß-K-7, по нашему мнению, делает маловероятной возможность его

непосредственного влияния на системы восприятия и внимания. Воздействие в-К-7 на обучение, по-видимому, не затрагивает процессы консолидации памятного следа, так как введение пептида сразу после сеанса обучения во всех использованных тестах неэффективно.

.51

А

В

г з дня обучение

двв обучвюц

1 шуЬг

5 иг/кг

) иг/кг

Б

*

/ /1

о IV ,

¿¿7

Рис.4. Влияние различных доз р-К-7 на выработку у животных А - условного пищедобыватель — ного рефлекса в Т-образном лабиринте Б - условного рефлекса пассивного избегания В - условного рефлекса активного избегания

Значимые отличия от контроля * р < 0.05., ** р < 0.01.

контроль 1 иг/хг 5 иг/кг

Мы предполагаем, что поведенческие эффекты 0-К-7 связаны с его влиянием на мотивационно-эмоциональные функции мозга. Судя по полученным результатам, вводимый пептид воздействует на баланс различных мотиваций: оборонительной, исследовательской и пищевой. При этом воздействие осуществляется путем частичного "торможения", в первую очередь, пассивно-оборонительных компонентов поведенческой активности.

4. Эффекты в-казоморфина-7 на фоне фармакологического нарушения функционирования системы биогенных аминов мозга.

Известно, что важная роль в реализации сложных форм поведения принадлежит системе биогенных аминов мозга. С другой стороны, множество литературных данных свидетельствуют о модулирующем влиянии опиоидных пептидов на эту систему. Исследование возможности коррекции с помощью в-К-7 поведенческих нарушений, вызванных изменением функционирования системы биогенных аминов, позволит сделать предположения о механизмах действия гептапептида. В экспериментах использовали следующие препараты: фенамин (1 мг/кг, за 15 минут до начала тестирования), аминазин (2.5 мг/кг, за 15 мин) и галоперидол (0.3 мг/кг, за 20 мин). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Эффекты Р-К-7 в норме и на фоне нарушения функционирования системы биогенных аминов мозга (% от контроля).

Двигательная активность Обучение

Opto-Varimex Hole board УРШТ УРЛИ

ГА В А ГА ВА ЛП2 ЧВР

ß-K-7, 5 мг/кг 94 91 112 95 96 65

фенамин, 1 мг/кг 155* 154* 128 92 131 100

фенамин + ß-K-7 117 94 93 57* 70* 115®

галоперидол, 0,3 мг/кг 49** 56** 28** 35** 95 24**

галоперидол + ß-K-7 32** 34**@ 22**@ 19**@ 162 45

аминазин, 2,5 мг/кг 77* 77 54** 49** 112 40*

аминазин + ß-K-7 66** 79?. 60**а 149 58

Достоверные отличия от контроля; * р< 0.05; **р<0.01; от пептида @ р< 0.05; от фармакологического агента # р< 0.05.

На основании полученных данных можно заключить, что в-К-7 не способен нормализовать двигательную активность животных, нарушенную введением всех использованных фармакологических агентов, независимо от "знака" их воздействия. Однако, гепталептид способен частично компенсировать нарушения обучения животных, вызванные блокадой Дг~дофаминовых рецепторов галоперидолом либо всех типов дофаминовых рецепторов аминазином.

Таким образом, учитывая литературные сведения и полученные результаты, можно предположить, что эффекты в-К-7 осуществляются путем модуляции функций дофаминергической системы.

5. Влияние хронического введения в-казоморфина-7 на поведение детенышей белых крыс.

Физиологическая роль В-К-7 в организме остается до конца неясной, хотя большинство исследователей склоняется к представлению об исключительной его важности в раннем онтогенезе и постнатальном периоде, когда молоко является основным продуктом питания новорожденных млекопитающих. После попадания в кровь мишенью для действия казоморфинов могут быть любые ткани и органы новорожденных, элементы иммунной (Miglio-re-Samour and Jolies, 1988) и, что представляет особый интерес, нервной системы (Ermisch et al., 1983). Взаимодействуя с соответствующими структурами мозга детенышей, казоморфины в состоянии оказывать модулирующий эффект на его развитие (Volterra et al., 1986) и, таким образом, играть важную роль в процессах индивидуального онтогенеза.

Первую инъекцию в-К-7 в дозе 1 мг/кг делали животным в возрасте трех недель. Далее инъекции проводили в течение 14 дней ежедневно. До первой инъекции в "бесстрессорной" модификации открытого поля оценивали спонтанную двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение крысят. Через сутки после завершения инъекций проводили комплексную оценку тревожно-фобического уровня экспериментальных животных по методу Родиной и соавторов (1993). Наконец, через три недели после последней инъекции fl-K-7 животных тестировали еще раз с применением "стрессорной" модификации открытого поля и тестов I— III комплексного метода.

Предварительное тестирование животных в открытом поле не

выявило значимых отличий в поведении детенышей независимо от пола и принадлежности (в будущем) к опытным либо контрольным группам.

5.1. Эффект хронического введения й-казоморфина-7, зарегистрированные через 1 день после последней инъекции.

У самцов хроническое введение е-К-7 практически не оказывало влияния на латентный период выхода из центра поля (ЛП), суммарные величины горизонтальной (ГА) и вертикальной (ВА) двигательной активности, а также их динамику по сравнению с контролем. В то же время количество отходов от стенки и выходов в центр было достоверно снижено соответственно на 30 и 36 %, а количество умываний, напротив, достоверно повышено на 53 % относительно контроля. У опытных крысят было отмечено увеличение латентных периодов спуска с высоты, прохождения через отверстие и выхода из "домика" на 37 , 72 и 32 %, соответственно (рис.5).

После длительного введения е-К-7 самкам ЛП, пробег, а также количество отходов от стенки и выходов в центр по сравнению с контролем значимо не изменились. В отличие от самцов, ВА у опытных самок оказалась на 20 % выше, а количество умываний на 13 % ниже, чем у контрольных. Время выполнения заданий в тестах 1-111 меньше соответствующих контрольных величин на 25, 68 и 22 % (рис.5).

САМЦЫ

1

д.

САМКИ

1 А

I 1 КОНТРОЛЬ

I I КОНТРОЛЬ ЕЩг-к-т

Рис.5. Влияние хронического введения р — К-7 на выполнение детенышами крыс тестов |-||| через 1 день после окончания серии инъекций. Значимые отличия от контроля * р < 0.05.

Сравнение контрольных самцов с самками не выявило значимых отличий ни по одному из регистрируемых показателей. В то же время среди животных, получавших в течение 2-х недель ß-K-7, у самцов суммарная ГА оказалась достоверно ниже, а латентный период прохождения через отверстие - достоверно выше, чем у самок. По другим поведенческим параметрам опытные самцы и самки значимо не отличались друг от друга.

5.2. Эффект хронического введения в-казоморфина-7, зарегистрированные через 21 день после последней инъекции.

При тестировании детенышей в стрессогенной модификации открытого поля у самцов после хронического введения ß-K-7 было обнаружено достоверное увеличение ЛП на 63 % по сравнению с контролем. Остальные показатели, а также латентные периоды в тестах I—III значимо не отличались от контрольных величин.

У самок, которым инъецировали В-К-7, суммарные ГА и ВА были достоверно выше контрольных соответственно на 23 и 31 %, а остальные поведенческие параметры практически не изменились. Анализируя динамику двигательной активности, интересно, что в обоих случаях наиболее заметные отличия от контроля наблюдались на 2-й минуте регистрации (рис.6). Что касается выполнения тестов I-III, то у самок было зафиксировано снижение латентных периодов спуска с высоты на 55 % и выхода из "домика" на 64 % по сравнению с контрольными животными.

При сравнении самцов с самками в контроле и опыте оказалось, что контрольные животные практически не отличаются друг от друга ни по поведению в открытом поле, ни по времени выполнения тестов I—III. Напротив, у животных, которым в течение 2-х недель вводили ß-K-7, достоверные отличия между самцами и самками были зарегистрированы для ЛП, суммарных ГА и ВА и количества отходов от стенки (рис.7). При сравнении латентных периодов в тестах 1-1II самцы достоверно отличались от самок по времени спуска с высоты; по времени прохождения через отверстие и выхода из "домика" отличия были также весьма заметны (р= 0.14-0.16).

Полученные в обеих сериях экспериментов результаты свидетельствуют, на наш взгляд, о преимущественном воздействии ß-K-7 на эмоционально-мотивационную составляющую поведения детенышей крыс. У самцов хроническое введение ß-K-7 приводит к

преобладанию пассивно-оборонительного поведения, у самок -ориентировочно-исследовательского. В последнем случае действие гептапептида может быть интерпретировано как проявление

антидепрессантных и анксиолитических свойств з-К-7.

25

20

15

ГА

О 25

20 15 10

САМЦЫ

ВА

1

80 120 САМКИ 31ВА

120

Lj 1

2

5

— контроль

р-К-7

Рис.6. Влияние хронического введения ß-K-7 на гориэонтальну (ГА) и вертикальную (ВА) двигательную активность детенышей в открытом поле при действии сенсорных

раздражителей. Значимые отличия от контроля * р < 0.05,

6. Влияние з-казоморфина-7 на некоторые параметры физиологического состояния организма экспериментальных животных.

В-К-7 в дозах 5 и 20 мг/кг за 5 минут до начала тестирования не оказывал влияния на уровень пищевой мотивации экспериментальных животных.

В тестах "Вертикальная сетка" и "Вращающийся стержень"

животные, получавшие 5 мг/кг гептапептида, продемонстрировали больше времена удержания по сравнению с контрольными. В обоих случаях доза 20 мг/кг оказалась неэффективной.

В дозах 1, 5 и даже анальгетически активной 20 мг/кг в-К-7 не влиял на длительность и вариабельность кардиоинтервалов. Таким образом, кардиотропное действие системно вводимого в-К-7 проявляется, по-видимому, в существенно более высоких дозах, чем необходимы для развития анальгетических и нейротропных эффектов.

Введение в-К-7 в дозах 5 и 20 мг/кг не выявило ни про-, ни антиконвульсантных свойств препарата при вызывании у животных электросудорожного шока (длительность пачки стимулов 1 сек, частота стимулов 50 Гц, напряжение 100 в).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог проделанной работе, можно сделать некоторые заключения о роли в-К-7 в организме, а также о перспективах дальнейшего изучения гептапептида и его синтетических аналогов.

/З-К-7

контроль

0-К-7

ЛП,с

отходы от стенки

0-К-7

(з-к-7

Рис.?. Половые различия в действии хронически вводимого 0 -К-7 на поведение детенышей в стрессогенной модификации открытого поля. Значимые отличия самцов от самок р < 0.05.

При введении в относительно высоких дозах (20 мг/кг) в-К-7 проявляет свойства характерные для типичного опиоидного пептида: вызывает обезболивающий эффект и угнетает двигательную активность экспериментальных животных. В то же время в меньших количествах (1 и 5 мг/кг) в-К-7 оказывает значительное воздействие на поведение животных. Так., исследованный пептид облегчает обучение пищедобывательным навыкам и, напротив, ухудшает выработку навыков избегания у взрослых животных. Влияние хронического введения в-К-7 детенышам крыс в период раннего постнатального развития носит антистрессорный характер.

На основании полученных результатов можно предположить, что в основе антистрессорного эффекта ß-K-7 и его влияния на процессы обучения лежит один и тот же механизм: ослабление уровня оборонительной мотивации. В результате действие пептида в стрессогенных условиях на взрослые особи трудно считать благоприятным, тогда как детеныши, напротив, ведут себя более адекватно. При этом адалтогенное действие в-К-7 оказывает преимущественно на детеньпвей-самок, что еще раз подтверждает гипотезу о важном физиологическом значении ß-казоморфинов именно для женского организма (Teschemacher and Koch, 1990).

Известно, что в формировании целенаправленного поведения важную роль играет мезолимбическая дофаминергическая система (Bals-Kubik. 1993). Результаты, полученные при исследовании эффектов в-К-7 в норме и на фоне фармакологического нарушения функционирования системы биогенных аминов мозга, позволяют предположить, что эффекты гептапептида осуществляются, хотя бы частично, путем модуляции функций дофаминергической системы.

Широкий спектр нейротропных эффектов, показанный в наших экспериментах для системно вводимого ß-K-7, наглядно доказывает, что олигопептиды пищевого происхождения могут быть мощными регуляторами функций центральной нервной системы. Судя по всему, казоморфины играют важную физиологическую роль в организме, по крайней мере, в двух случаях; в ранний постнзтальный период жизни млекопитающих при питании исключительно молоком и при патологиях пищеварения либо нарушениях целостности кишечного эпителия, когда в результате анормального катаболизма казеина в кровь поступают избыточные количества фрагментов с опиоидной активностью.

- 20 -выводы

1. Гептапептид в-казоморфин-7, фрагмент бычьего в-казеина (60-66), обладает нейротропной активностью при внутрибрюшинном способе введения в дозах 1-20 мг/кг.

2. В дозах 10 и 20 мг/кг в-казоморфин-7 вызывает анальгезию в течение 0.5-1 часа после инъекции, которая может быть заблокирована предварительным введением 1 мг/кг налоксона. Величина эффекта зависит от уровня исходной болевой чувствительности животных. Введение 5 мг/кг пептида неэффективно.

3. При введении в дозе 20 мг/кг В-казоморфин-7 угнетает горизонтальную и вертикальную компоненты двигательной активности, причем предварительная инъекция 1 мг/кг налоксона потенциирует эффекты гептапептида. В дозах 1 и 5 мг/кг пептид не влияет на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных.

4. При обучении в лабиринте с пищевым подкреплением введение в-казоморфина-7 в дозах 1 и 5 мг/кг перед сеансом обучения вызывает ускорение выработки навыка, а в дозе 20 мг/кг - торможение. Облегчающее действие в-казоморфина-7 может быть заблокировано предварительным введением 1 мг/кг налоксона. Инъекции гептапептида во всех исследованных дозах сразу после обучения неэффективны.

5. При обучении с отрицательным подкреплением В-казоморфин-7 в дозах 1 и 5 мг/кг до сеанса обучения вызывает ухудшение выработки навыков пассивного и активного избегания. Введение пептида сразу после обучения неэффективно.

6. Исследование нейротропных эффектов в-казоморфина-7 в норме и на фоне фармакологического нарушения функционирования системы биогенных аминов мозга показало, что эффекты гептапептида осуществляются, хотя бы частично, путем модуляции функций дофаминергической системы.

7. Эффекты хронического введения в-казоморфина-7 детенышам крыс носят адаптогенный характер, снижая уровень тревожности и повышая устойчивость к стрессогенным факторам у самок.

3. Исследование нейротропной активности аналогов в-казоморфина-7, . лишенных Ы-концевого тирозина,

продемонстрировало, что в дозах 1 и 5 мг/кг они, не обладая анальгетической активностью, воздействуют на двигательную активность и видоспецифическое поведение животных.

- 21 -

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕ№ ДИССЕРТАЦИИ

1. ДубынинВ.А., Маклакова А. С., Алфеева Л.Ю., Незавибатько В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Действие в-казоморфина-7 на ноцицепцию крыс при системном введении // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 1992,- N9,-с.284-286.

2. Маклакова А. С., СтрюковС.Н., ДубынинВ.А., Незавибатько В.Н., Каменский А.А. Нейротропные эффекты дез-Tyr аналогов В-казоморфина-7 // Тезисы докладов Российской научной конференции "Создание лекарственных средств".- М.,1992. -с.122-123.

3. Маклакова А.С. , Дубынин В.А., Левицкая Н.Г., Незавибатько В.Н., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Поведенческие эффекты в-казоморфина-7 и его дез-Туг-аналогов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 1993.- N8.- с.155-158.

4. Maklakova, A.S., Dubinin, V.A., Kamensky, A.A. and Nezavibatko, V.N. Beta-casomorphin decreases the influence of different stressoeenic factors in rats // Abstracts XXXI1 Congress of tne International Union of Physiological Sciences.- Glasgow, 1993.- p.256.

5. Маклакова А. С., ДубынинВ.А., Незавибатько В. H., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А. Влияние и-казоморфина-7 и его производных на болевую чувствительность крыс при системном введении // Тезисы докладов I конференции Российской Ассоциации по изучению боли "Патофизиология и фармакология боли",- М., 1993.- с.141.

6. Каменский А.А. , Левицкая Н.Г., Маклакова А.С., Сарычева Н.Ю., Дубынин В.А., Незавибатько В.Н. Компенсаторное действие пептидов различных групп в условиях стресса // Материалы научной конференции "Организованный мозг".- М., 1993.- с.45.

7. Maklakova A.S., Dubinin V.A., Kamensky A.A., Nezavibatko Y.N., Alfeeva L.Yu. and Ashmarin I.P. Possible mechanisms of B-casomorphLn influence on locomotor activity, learning Drocess and nociception in rats // Abstracts of International Symposium "Physiological and biochemical basis of brain activity".- St.Peterburg, 1994.- p.44.

8. Дубынин В.А., Незавибатько В.Н., Маклакова А.С., Каменский

A.А. Психотропные эффекты фрагментов пищевых белков // Материалы I Международного научного конгресса "Традиционная медицина и питание",- М., 1994.- с.444.

9. Dubinin V.A., Maklakova A.S., Nazarenko I.V., Nezavibatko V.N., Alfeeva L.Yu. and Kamensky A.A. Influence of B-casomorphin-7 on different kinds of learning in white rats // Abstract book of the First European Congress of Pharmacology.- Milan, 1995.- p.260.

10. Маклакова А.С., Дубынин В.А., Алфеева Л.Ю., Назаренко И.В. .Незавибатько В.Н., Каменский А. А. Действие З-казоморфина-7 на различные виды обучения белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 1995.-т.120.- N11.- с.499-502.

11. Маклакова А. С., Назаренко И.В., ДубынинВ.А., Незавибатько

B.Н., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А. Влияние в-казоморфина-7 на уровень пищевой и оборонительной мотиваций при различных видах обучения // Журнал ВНД им.И.П.Павлова.- 1995,- N6.-с.1143-1150.

12. Маклакова А. С., ДубынинВ.А., Назаренко И. В., Соханенкова

Н.Ю., Незавибатько В.Н., Алфеева Л.Ю., Каменский A.A. Нейротропная активность анальгетически неэффективных доз фрагмента ß-казеина - ß-казоморфина-7 // Тезисы докладов I съезда Российского научного общества фармакологов.-Волгоград, 1995.- с.263.

13. Назаренко И.В., Маклакова A.C. Влияние ß-казоморфина-7 на обучение белых крыс // Тезисы международной студенческой конференции по фундаментальным наукам "Воробьевы горы - 95".

- М., 1995.- в печати.

14. Маклакова A.C., Дубынин В.А., Сарычева Н.Ю., Незавибатько В.Н., Алфеева Л.Ю., Каменский A.A. Зависимые от пола различия в действии хронически вводимого ß-казоморфина-7 на поведение детенышей белых крыс // Журнал ВНД им.И.П.Павлова.- 1996.- т.46.- N3.- с.610-613.

15. Sokhanenkova N., Dubinin V., Maklakova A., Nezavibatko V., Alfeeva L., Kamensky A. Cardiotropic and behavioural effects of 3-casomorphins under normal and stressogenic conditions // Behavioral Pharmacology.- 1996.- v.7, Suppl 1.

- p.106-107.

16. Maklakova A.S., Dubinin V.A., Kamensky A.A. and Nezavibatko V.N. Effects of ß-casomorphin-7 on motor behaviour and individual anxietv-phobic levels in rats in early postnatal period // Abstracts of 1. Kongreb der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft.- Berlin, 1996.- p.231.

17. Maklakova A.S., Dubinin V.A., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. The delayed effects of ß-casomorphin-7, given chronically, on locomotion and individual anxiety-pnobic levels in rat pups // Abstract Book of the 2nd Meeting of European Neuroscience.- Strasbourg, 1996.- p.199.

18. Маклакова A.C., Асмакова Л.С., Соханенкова Н.Ю., Беспалова Ж.Д., Незавибатько В.Н., Дубынин В.А., Каменский A.A. Адаптивно благоприятные и адаптивно неблагоприятные физиологические эффекты различных доз экзорфинов // Тезисы докладов Первого Российского Конгресса по патофизиологии с международным участием.- М., 1996.- с.22.

Издательство АО "Диалог-МГУ". ЛР N 063999 Подписано к печати 22.10.96г. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 80 экз. Заказ N 444. Тел. 939-38-90, 939-38-91. Факс 939-38-93. 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ