Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние периферического введения лоперамида на центральные механизмы пищевого поведения крыс

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние периферического введения лоперамида на центральные механизмы пищевого поведения крыс"

На правах рукописи УДК 581.1

Чумакова Юлия Алексеевна

ВЛИЯНИЕ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ЛОПЕРАМИДА НА ЦЕНТРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПИЩЕВОГО ПОВЕДЕНИЯ КРЫС

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 С ОЕЗ 2012

Москва - 2012

005010208

Работа выполнена в лаборатории физиологии подкрепления (руководитель д.м.н., член-корреспондент РАМН, профессор С.К. Судаков) ФГБУ "Научноисследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (директор - д.м.н., член-корреспондент РАМН, профессор С.К. Судаков).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Судаков Сергей Константинович

доктор фармацевтических наук,

профессор Бунятян Наталья Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Серова Ольга Николаевна

институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН

доктор биологических наук, профессор Смирнов Виктор Михайлович заведующий кафедрой нормальной физиологии РГМУ

Ведущая организация: Биологический Факультет Московского

Государственного Университета им. М.ВЛомоносова

Защита диссертации состоится «1» марта 2012 года в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр.4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ФГБУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН

Автореферат разослан «27» января 2012 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета, /

кандидат медицинских наук . / / Захаров Николай Дмитриевич

Актуальность проблемы. Проблема формирования целенаправленной деятельности человека и животных занимает особое место среди важнейших и нерешенных проблем современной физиологии. Согласно теории функциональных систем Анохина П.К., системомобилизующим фактором поведенческих актов является доминирующая мотивация, формирующаяся на основе ведущей потребности организма (Анохин П.К. 1978). Особое положение среди биологических мотиваций принадлежит мотивации голода, строящейся на ведущей метаболической потребности организма (Судаков К.В., 1995).

Нарушения пищевого поведения - один из факторов риска многих медико-социальных заболеваний во всем Мире, таких как артериальная гипертония, инсулиннезависимый сахарный диабет, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца и др. (Bray G. A., 1998).

Нынешняя эпидемия ожирения частично обусловлена чрезмерным потреблением вкусной пищи и как следствие, формированием патологического подкрепления к ней (Blundell J.E., Gillett A., 2001; Bray G.A. et al., 1992; Hill J.O., Peters J.C., 1998; Ludwig D.S. et al., 2001). Переедание является важной проблемой общественного здравоохранения в силу своей сильной ассоциации с другими медицинскими и психическими расстройствами, в первую очередь ожирением и депрессией. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в странах Европы 30-80% населения имеют избыточную массу тела. За последние 20 лет число детей и подростков с избыточной массой тела увеличилось в 2 раза (Kromeyer-Hauschild K. et al., 1999). Установлено, что если бы человечеству удалось решить проблему избыточного веса, средняя продолжительность жизни увеличилась бы на 4 года.

Широкое распространение нарушений пищевого поведения наряду с недостаточной эффективностью имеющихся лекарственных средств, делает актуальной проблему поиска новых лекарственных препаратов с целью

создания безопасных анорексигенных препаратов. Перспективным инновационным терапевтическим подходом лечения нарушений пищевого поведения считается создание безопасных антагонистов избирательного действия ц-опиоидных рецепторов, влияющих на процессы пищевого поведения (Zhang J. et ah, 2006; Nathan PJ. Bullmore E.T., 2009).

В 1983 году Carr K.D. and Simon EJ. обнаружили, что (х-опиоидные рецепторы эндогенной опиоидной системы участвуют в регуляции пищевой мотивации. Однако прямое воздействие на центральные опиоидные рецепторы сопровождается рядом нежелательных эффектов, основным из которых является формирование зависимости. Данная работа основывается на гипотезе о реципрокном взаимодействии центрального и периферического звеньев эндогенной опиоидной системы (Судаков С.К., Тригуб М.М., 2008). Согласно этой гипотезе подавление активности периферического звена ЭОС приводит к активации центрального звена, а активация периферических опиоидных рецепторов ЭОС подавляет активность центральных. В связи с этим выявление роли опиоидов в механизмах регуляции контроля аппетита и других аспектов пищевого поведения представляется одной из самых актуальных задач современных биомедицинских исследований (Adam Т.С., Epel E.S., 2007).

На протяжении десятилетий опиоидергические препараты широко используются для обезболивания (Метелица В.И., 1996) и реже обсуждается их влияние на пищевое поведение. Исследованию роли эндогенной опиоидной системы в патогенезе нарушений пищевого поведения к моменту начала диссертационного исследования были посвящены немногочисленные публикации (Gadd С.А. et al., 2003; Jabourian М. et al., 2005). Вместе с тем, важнейшая роль ЭОС в регуляции пищевого поведения не вызывает сомнений (Will M.J. et al., 2003).

Фармацевтические препараты для лечения ожирения, присутствующие сегодня на мировом лекарственном рынке, могут быть отнесены к двум группам: средства центрального действия, снижающие аппетит или

способствующие быстрому появлению чувства насыщения, и лекарства, действие которых обусловлено уменьшением абсорбции компонентов пищи.

В фармакотерапии нарушений пищевого поведения чаще всего используют препараты, воздействующие на ЦНС, действие которых сопряжено с риском возникновения побочных эффектов (Харкевич Д.А., 2002). В настоящее время на современном рынке фармацевтических препаратов «идеального» средства для коррекции веса нет. Существует высокая потребность в эффективных фармакологических средствах для лечения расстройств пищевого поведения, которые были бы достаточно безопасны и могли бы применяться длительное время.

В связи с этим, целью настоящей работы являлось изучение участия ц- опиоидных рецепторов, располагающихся в желудке в организации пищевого поведения, а также эффектов воздействия на эти рецепторы.

В ходе исследования решались следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

2. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

3. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на динамику массы тела крыс молодого возраста, имеющих ограниченный и неограниченный доступ к корму.

4. Исследовать изменения выделения Р-эндорфина в перинейрональное пространство передней поясной коры и области вентральной покрышки мозга крыс при периферическом воздействии агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида.

5. Исследовать изменения характеристик центральных ц-опиоидных рецепторов при периферическом воздействии агониста опиоидных рецепторов лоперамида.

Положения, выносимые на защиту:

1. Периферическое введение лоперамида эффективно подавляет пищедобывательное поведение в зависимости от дозы, способа введения препарата.

2. Хроническое внутрижелудочное введение лоперамида приводит к существенному снижению массы тела крыс при свободном неограниченном доступе к корму у животных.

3. Активация периферических опиоидных рецепторов лоперамидом приводит к подавлению активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, за счет достоверного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга и среднем мозге крыс.

4. Введение лоперамида и активация ц-опиоидных рецепторов желудка стимулирует процессы пищевого подкрепления.

Научная новизна. Все полученные нами результаты являются новыми и не имеют аналогов в литературе.

Впервые проведено изучение периферического влияния лиганда ц-опиоидных рецепторов лоперамида на пищевое поведение. Получены новые данные об участии эндогенной опиоидной системы в регуляции пищевого поведения.

Впервые было выявлено, что активация, периферических опиоидных рецепторов агонистом ц-опиоидных рецепторов лоперамидом в дозе 5 мг/кг, существенно не влияя на уровень Р-эндорфина в мозге, приводит к подавлению активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, за счет достоверного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга и среднем мозге крыс.

Установлено, что снижение активности центрального звена ЭОС приводит к уменьшению положительно-подкрепляющих свойств пищи, что,

по-видимому, вызывает подавление инструментального пищевого поведения крыс, уменьшение потребления корма и как следствие снижение массы тела крыс.

Обнаружено ранее неизвестное влияние агониста р-опиоидных рецепторов лоперамида, не проникающего через ГЭБ, оказывающее анорексигенное действие на пищевое поведение крыс.

Установлена принципиальная возможность и перспективность нового подхода к фармакотерапии нарушений пищевого поведения, связанного с активацией опиоидной системы путем воздействия на ц-опиоидные рецепторы.

Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли ЭОС в регуляции пищевого поведения.

Практическая значимость результатов исследования. Поскольку опиоидная система участвует в регуляции широкого спектра функций организма, предполагается целесообразным расширение показаний к использованию лоперамида в целях терапии нарушений пищевого поведения, характеризующихся значимыми изменениями этой системы. Полученные данные об анорексигенном эффекте лоперамида свидетельствуют о перспективности его использования при лечении нарушений пищевого поведения. Практический интерес представляют также данные о роли эндогенной опиоидной системы в формировании пищевого поведения, которые могут послужить вкладом в дальнейшее изучение новых лекарственных средств для лечения расстройств пищевого поведения. Данные этой работы могут быть использованы для решения теоретических и практических проблем нарушения веса и, что особенно важно, применяться в качестве экспериментального обоснования нового фармацевтического влияния лигандов опиоидных рецепторов периферического действия, а также расширить уже существующие возможности лечения расстройств пищевого поведения.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на конференции молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2009), на Международной научной конференции, посвященной 80-летию Азербайджанского медицинского Университета (Баку, 2010), на Российской конференции XXI Съезда Физиологов (Калуга, 2010), на Международном научно-практическом симпозиуме «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии», (Хошимин-Фантьен, Вьетнам, 2010), на 58-й научно-практической конференции Таджикского государственного медицинского университета «Внедрение достижений современной науки в медицину» (Душанбе, 2010). Результаты представлены и обсуждены на совместном расширенном заседании отдела системных механизмов поведения Учреждения Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН 24 ноября 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-00780).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 4 таблицы и 15 рисунков. Список литературы включает 34 отечественных и 263 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 228 крысах самцах линии «\Vistar», имеющих средний вес около 200 г. перед началом эксперимента. Животные содержались в группах по 8 особей при постоянном доступе к стандартному комбинированному корму и воде при свето-темновом режиме 12:12 часов.

Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказа №267 М3 РФ (19.06.2003 г.), а также в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Учреждение Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, протокол №1 от 3.09.2005 г.).

В наших экспериментах мы использовали введение растворов объемом

0,1 мл на 100 г массы тела крыс: животные контрольных групп получали дистиллированную воду или физ. р-р в эквивалентном объеме, крысы исследуемых групп - растворы лоперамида (Sigma-Aldrich, USA) в дозах 3, 5,7 и 10 мг/кг в дистиллированной воде или в физ. растворе.

Инструментальное пищевое поведение. Для определения периферического внутрибрюшинного и внутрижелудочного влияния лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс проведены эксперименты на 96 крысах-самцах линии «Wistar».

За сутки до начала эксперимента животных подвергали 24-часовой пищевой депривации. Эксперимент проводили в инструментальной камере Скиннера (Lafayette Instruments Inc., США), которая представляет собой индивидуальную камеру, оснащенную педалью, кормушкой и световым стимулом. В инструментальную камеру крыса помещалась ежедневно на 1 час, где за это время животное имело возможность нажимать на педаль, расположенную справа от кормушки, после чего в кормушку поступала 45-миллиграммовая гранула витаминизированного корма (P.S. Noyes Company Inc., США). В 1-ый день проводили обучение животных, поэтому перед посадкой в камеру в кормушке оставляли 2 гранулы витаминизированного корма. По результатам нажатий на педаль в инструментальной камере первого дня все животные были рандомизированы на группы. В каждой группе было по 8 животных. Начиная со 2-го дня животным за 30 мин. до посадки вводили исследуемые растворы, гранул корма в камере уже не оставляли.

В первой серии экспериментов изучали влияние внутрибрюшинного введения растворов: исследуемой группе - лоперамид в дозе 10 мг/кг, контрольной группе физ. раствор в объеме 0,1 мл на-100 г массы тела крыс.

Во второй серии экспериментов изучали влияние внутрижелудочного введения растворов: исследуемым группам - лоперамид в дозах 3, 7 и 10 мг/кг, контрольной группе дистиллированную воду в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс.

В течение первых четырех дней инструментального пищевого поведения крысы получали вознаграждение (1 гранулу корма) после одного нажатия на педаль. Таким образом, первый этап заканчивали через 4 дня, когда у всех крыс было сформировано стойкое пищедобывательное поведение.

В следующих экспериментах мы изучали инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным обучением, при этом изменились условия вознаграждения, т.е. количество нажатий на педаль для получения 1 гранулы корма. Так на 5-ый день крыса получала вознаграждение только после

2 нажатий на педаль, на 6-ой день - после 4 нажатий, на 7-ой день - после 8 нажатий, на 8-ой день - после 16 нажатий, на 9-ый день - после 32 нажатий, на 10-ый день - после 64 нажатий, на 11-ый день - после 128 нажатий. В течение этой серии эксперимента животные находились в условиях ограниченного кормления, т.е. каждое животное вне часовой экспериментальной процедуры ежедневно получало по 12 г стандартного комбинированного корма, согласно ранее использованной методики (Судаков С.К, 2002).

С помощью компьютера регистрировали количество нажатий на педаль за вознаграждение и количество съеденных гранул в кормушке инструментальной камеры Скиннера.

Статистическая обработка выполнялась в соответствии со стандартными алгоритмами вариационной статистики с использованием

статистических программ Microsoft Exei, 2007; Biostatistica, 1998. Диагностическую ценность определяли с помощью метода проверки статистических гипотез, использовали t-критерий Стьюдента.

Исследование динамики массы тела крыс выполнены на 80 крысах -самцах линии «Wistar» в возрасте 2 и 3 месяцев при длительных внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях раствора лоперамида (Sigma-Aldrich, USA) в дозах 3, 5, 7 и 10 мг/кг. В первой серии экспериментов животные находились в индивидуальных клетках и имели ограниченный доступ к пищи (12 г комбинированного корма в день на 1 крысу), во второй серии экспериментов животные имели свободный неограниченный доступ к пище. Ежедневно фиксировали изменения массы тела животных.

Статистическая обработка выполнялась в соответствии со стандартными алгоритмами вариационной статистики с использованием статистических программ Microsoft Exei, 2007; Biostatistica,,, 1998. Диагностическую ценность определяли с помощью метода проверки статистических гипотез, использовали t-критерий Стьюдента.

Исследование содержания ß-эндорфина в ППК и в области вентральной покрышки мозга крыс проводилось при помощи микродиализа на 36 свободно-подвижных крысах линии «Wistar». За 48 часов до проведения микродиализа крысам под ксилазин-кетаминовым наркозом (кетамин 100 мг/кг и ксилазин 100 мг/кг) стереотаксически вживляли направляющую силиконизированную пластиковую канюлю для последующего введения микродиализного зонда (СМА 12, СМА Microdialysis, Швеция) в область передней поясной коры по координатам атласа (А +1,6 мм; L -1,8 мм; Н -2,2 мм), в область вентральной покрышки среднего (А +6,0 мм; L -1,8 мм; Н -7,3 мм). Канюлю укрепляли стоматологическим акрилом и привинчивали к черепу винтом из нержавеющей стали. В день эксперимента через канюлю вводили микродиализный зонд (СМА 12, СМА Microdialysis, Швеция) с длинной

мембраны 2 мм, размером пор мембраны 20 кДа. Мембранная часть зонда после вживления была расположена в исследуемых областях мозга. Локализацию кончика зонда контролировали морфологически путем изготовления серийных срезов мозга на замораживающем криотоме и окраски срезов крезил виолетом. Зонды перфузировали раствором искусственной цереброспинальной жидкости. Скорость перфузии составляла 1 мкл/мин. Диализат, полученный впервые 2 часа, после вживления исключали из дальнейших определений. После вживления зондов крысы находились в условиях свободного поведения в индивидуальных клетках. За 30 минут до начала сбора диализата крысам в желудок вводили стальной зонд, через который осуществляли инстилляцию одного из следующих растворов объемом 0,1 мл на 100 г массы тела: крысы контрольных групп получали дистиллированную воду, крысы исследуемых групп - раствор лоперамида (Sigma-Aldrich, USA) в дистиллированной воде 5 мг/кг массы тела. Диализат собирали в условиях свободного поведения крыс в течение 1 часа. В полученном диализате определяли содержание p-эндорфина с помощью иммуноферментного анализа с использованием набора для иммуноферментного анализа p-эндорфина крыс (Peninsula Laboratories, LLC, cat.# S-1264) с диапазоном измерений 0-25 нг/мл. Значения оптической плотности стандартных разведений P-эндорфина после проведения реакций иммуноферментного анализа служили для построения кривой зависимости оптической плотности и концентрации p-эндорфина. По формуле данной кривой рассчитывали концентрацию p-эндорфина в исследуемом диализате.

Данные были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Статистическую обработку проводили с использованием многофакторного дисперсионного анализа с помощью Student-Newman-Keuls post hoc теста.

Радиорецепторный метод. Методом радиолигантного связывания изучали характеристики центральных ц-опиоидных рецепторов на 16 крысах самцах линии «Wistar», при внутрибрюшинном введении раствора

лоперамида (Sigma-AIdrich, USA) в дозе 5мг/кг веса. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили эквивалентный объём 0,9% раствора хлорида натрия. Через 30 минут после введения вышеперечисленных веществ животных забивали декапитированием. Извлекали головной мозг, помещали его дорзальной поверхностью на чашку Петри во льду и проводили выделение отделов мозга: среднего мозга, гипоталамуса и

фронтальной коры.

Специфическое взаимодействие меченного тритием ДАГО с ц-опиоидных рецепторов определяли как разницу количества связанной с мембранами радиоактивности при общем связывании (в отсутствии немеченого ДАГО) и при неспецифическом связывании (в присутствии 1000-кратного избытка немеченого ДАГО). Радиоактивность подсчитывали на сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1219 (LKB, Швеция) с эффективностью счета не ниже 30%. В качестве критериев связывающей способности рецепторов использовали Kd (константу диссоциации) -величину, обратную сродству рецепторов к лиганду, и Вшах, или число мест связывания лиганда. Определение белка производили по методу Lowry с использованием предварительной обработки суспензии мембран дезоксихолатом натрия.

Математическую обработку результатов радиорецепторного анализа проводили с помощью программы LIGAND. Диагностическую ценность определяли с помощью метода проверки статистических гипотез, использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние периферического внутрибрюшинного и

внутрижелудочного введения лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

В результате изучения инструментального пищевого поведения с фиксированным нажатием на педаль за вознаграждение (1 гранулу корма) нам удалось выявить, что внутрибрюшинное введение лоперамида в дозе 10 мг/кг оказывает более слабое действие на пищедобывательное поведение животных, чем внутрижелудочное введение лоперамида в той же дозе. Наши исследования показали значительное уменьшение количества нажатий на педаль в группе животных, получающих внутрибрюшинное введение лоперамида в дозе 10 мг/кг только на второй день (Рис. 1).

В эксперименте же с внутрижелудочным введением лоперамида в дозе 10 мг/кг снижение пищедобывательного поведения в инструментальной камере мы наблюдали на второй и третий дни введения препаратов (Рис. 2).

Следует отметить, что положительное подкрепление пищи у животных, получающих внутрибрюшинное и внутрижелудочное введение лоперамида, было снижено. Несмотря на ограниченное кормление животных, группы крыс, получающих внутрибрюшинное введение лоперамида в дозе 10 мг/кг и внутрижелудочное введение лоперамида в дозах 3 мг/кг и 7 мг/кг, оставляли корм в кормушке инструментальной камеры.

исходный 12 3

дни эксперимента

Рис, 1. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида в дозе 10 мг/кг на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным нажатием на педаль для получения вознаграждения (1-й гранулы корма)

N=8 крыс в каждой группе. Достоверность различий: * - р<0,05, по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрибрюшинное введение физ. раствора в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Данные на графике представлены в %-тах к исходному значению количества нажатий на педаль (первый день обучения животных, до введения исследуемых растворов).

По вертикали - количество нажатий на педаль в инструментальной камере.

По горизонтали - дни эксперимента. _

Кривая а - внутрибрюшинное введение физ. р-ра; кривая б - внутрибрюшинное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг в эквивалентном объеме.

исходный 12 3

дни эксперимента

Рис. 2. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида в дозах 3, 7 и 10 мг/кг на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным нажатием на педаль для получения вознаграждения (1-й гранулы корма)

N=8 крыс в каждой группе. Достоверность различий: * - р<0,05, по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс.

Данные на графике представлены в %-тах к исходному значению количества нажатий на педаль (первый день обучения животных, до введения исследуемых растворов).

По вертикали - количество нажатий на педаль в инструментальной камере.

По горизонтали - дни эксперимента.

Кривая а - внутрижелудочное введение дистиллированной воды из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела крыс; кривая б - внугрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 3 мг/кг; кривая в - внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 7 мг/кг; кривая г - внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг в эквивалентном объеме.

Влияние периферического внутрибрюшинного и

внутрижслудочного введения лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

Задачей настоящего раздела стало изучение влияния периферического введения лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным обучением, т.е. для получения вознаграждения (1 гранулы корма) животным нужно было нажимать на педаль в инструментальной камере 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 раз. В эксперименте по исследованию прогрессивного пищевого поведения с внутрибрюшинным введением лоперамида в дозе 10 мг/кг, соотношение нажатия на педаль для получения корма значимо не отличались от контрольной группы. Полученные результаты этого эксперимента свидетельствует о том, что внутрибрюшинное введение лоперамида в дозе 10 мг/кг не оказывает влияние на пищедобывательное поведение животных (Рис. 3).

Изучая, прогрессивное пищевое поведение животных, получающих внутрижелудочное введение лоперамида, мы наблюдали достоверные изменения пищедобывательного поведения вплоть до 7-ых суток, когда животные должны были за 1 гранулу корма нажать на педаль 8 раз (Рис.4).

В литературе встречаются немногочисленные работы, исследующие влияние ЭОС на регуляцию пищевого поведения (Kelley А.Е., 2004; Levine _ A.S. et al., 1985). В наших экспериментах изучая прогрессивное пищевое поведение крыс, в результате влияния лоперамида, мы обнаружили, что препарат эффективно подавляет пищедобывательное поведение в том случае, когда оно не требует больших энергетических затрат. В случае, когда затраты на получение подкрепления перекрывают его пищевую ценность, то и контрольные, и экспериментальные животные резко снижают уровень пищедобывательного поведения, и различия между группами исчезают. Такие результаты могут свидетельствовать о том, что введение лоперамида в

большей степени воздействует не мотивационные процессы, а скорее механизмы оценки подкрепления.

количество нажатий на педаль за 1 гранулу корма

Рис. 3. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида в дозе 10 мг/кг на получение вознаграждения (1-й гранулы корма) при прогрессивном обучении крыс

N=8 крыс в каждой группе. Группа контроля - животные, получающие внутрибрюшинное введение физ. р-ра в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Исследуемая группа -животные, получающие внутрибрюшинное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг массы тела крыс. Данные на графике представлены в %-тах к исходному значению количества нажатий на педаль (первый день обучения животных, до введения исследуемых растворов).

По вертикали - общее количество нажатий на педаль в инструментальной камере.

По горизонтали - количество нажатий на педаль для получения вознаграждения (1-й гранулы корма).

Кривая а - внутрибрюшинное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг; кривая б -внутрибрюшинное введение физ. р-ра в эквивалентном объеме.

300

>

Прогрессивное обучение

1250 -

X

X

1100'

5

X

О

а

б

г

в

■нн-лоперлмцЗ МГ'КГ ---лолерамцТ мгуг

■лопфлмцз 10 мгът

вода

2

4 8 16 32 64 128

количество нажатий на педаль за 1 гранулу корма

Рис. 4. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида в дозах 3, 7 и 10 мг/кг на получение вознаграждения (1-й гранулы корма) при

прогрессивном обучении крыс

N=8 крыс в каждой группе. Достоверность различий: * - р<0,05, по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Данные на графике представлены в %-тах к исходному значению количества нажатий на педаль (первый день обучения животных, до введения исследуемых растворов).

По вертикали - общее количество нажатий на педаль в инструментальной камере.

По горизонтали - количество нажатий на педаль для получения вознаграждения (1-й гранулы корма). ~

Кривая а - внутрижелудочное введение дистиллированной воды; кривая б -

внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 3 мг/кг; кривая в -

внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 7 мг/кг; кривая г -

внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг в эквивалентном объеме.

Следует отметить, что положительное подкрепление пищи у животных, получающих внутрижелудочное введение лоперамида, было снижено. Несмотря на ограниченное кормление животных, в ходе прогрессивного

обучения, нами было замечено, что группы крыс, получающих лоперамид в дозах 7 мг/кг и 10 мг/кг, оставляли корм в «домашней» клетке несъеденным.

Полученные результаты этой серии экспериментов могут быть объяснены различиями в способе введения препарата. По-видимому, при внутрибрюшинном введении лоперамида может происходить, как активация ц-опиоидных рецепторов желудка и 12-перстной кишки, так и других внутренних органов животного, такой механизм действия лоперамида отмечен многими авторами (Heel R.C. et al., 1978; Heykants J. et al., 1974). При внутрижелудочном же введении лоперамида происходит непосредственно активация ц-опиоидных рецепторов желудка. Вследствие этого внутрижелудочное введение лоперамида в дозе 10 мг/кг оказывает более сильное действие, приводящее к изменению пищевого поведения животных, чем внутрибрюшинное введение лоперамида в той же дозе.

Таким образом, результаты экспериментов позволяют заключить, что лоперамид, вводимый внутрибрюшинно и внутрижелудочно оказывает влияние на пищевое поведение. При этом стоит отметить, что эффекты лоперамида, скорее всего, реализуются через периферическую активацию ц-опиоидных рецепторов желудка.

Кроме влияния способа введения лоперамида, нами была обнаружена и разная сила действия препарата на пищевое поведение и вес животных в зависимости от дозы. Так внутрижелудочное введение лоперамида в низкой дозе 3 мг/кг не влияет на инструментальное пищевое поведение животных, однако приводит к значительному снижению пищевого подкрепления пищи, о чем свидетельствовала несъеденная пища. По-видимому, доза лоперамида

3 мг/кг, является пороговой, а дозы 7 и 10 мг/кг являются высшими. Так как именно внутрижелудочное введение лоперамида в дозах 7 и 10 мг/кг приводит к значительному снижению пищедобывательного поведения животных (Рис. 2, 4). Так же стоит отметить, что наибольшее снижение пищедобывательного поведения мы наблюдали в группе животных,

получающих внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 7 мг/кг, по сравнению с группой контрольных животных.

Влияние периферического введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при ограниченном и неограниченном доступе к корму.

Изучение динамики массы тела молодых крыс, имеющих ограниченное кормление и получающих внутрибрюшинное и внутрижелудочное введение лоперамида в разных дозах показало отсутствие достоверных различий колебаний веса исследуемых групп животных в сравнении с группой контроля (р>0,05), была замечена лишь тенденция к снижению массы тела крыс получающих лоперамид (Рис. 5, 6).

340 330 320 310 3 300

о

п

г 290 280 270-

-лопераьоц 10 мг/кг -физ. р-р

2 3 4 5 6 7

дни эксперимента

Рис. 5. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида в дозе 10 мг/кг на динамику массы тела молодых крыс (3 месяца) в условиях ограниченного кормления

N=8 крыс в каждой группе. Группа контроля - животные, получающие внутрибрюшинное введение физ. р-ра в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Кривая а -

внутрибрюшинное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг; кривая б -

внутрибрюшинное введение физ. р-ра в эквивалентном объеме.

По вертикали - масса тела крыс. По горизонтали - дни эксперимента.

Рис. 6. Влияние внутрижелудочного введения растворов лоперамида в дозах 3, 7 и 10 мг/кг по сравнению с дистиллированной водой на динамику массы тела молодых крыс (2 месяца) в условиях ограниченного кормления

N=8 крыс в каждой группе. Группа контроля - животные, получающие внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Исследуемые группы - животные, получающие внутрижелудочное введение растворов лоперамида в дозах 3,7,10 мг/кг массы тела крыс в эквивалентном объеме.

По вертикали - масса тела крыс. По горизонтали - дни эксперимента.

-----ь отмена введения растворов.

В этой серии экспериментов мы не обнаружили существенных изменений в весе животных. Однако все крысы в этих экспериментах были ограничены в корме, поэтому динамика веса даже у контрольных крыс не могла отражать естественные колебания веса.

В связи с вышеизложенным, для того, что бы выявить влияние лоперамида на динамику массы тела крыс, в серии следующих экспериментов мы исследовали массу тела животных, имеющих неограниченный доступ к пище. После сравнения данных, полученных в ходе этой серии экспериментов, выяснилось, что внутрибрюшинное введение

лоперамида в дозе 10 мг/кг оказывает слабое влияние на динамику массы тела молодых крыс в условиях неограниченного кормления. Только на 12-й день внутрибрюшинного введения лоперамида в дозе 10 мг/кг по сравнению с контрольной группой, получающей эквивалентный объем физ. р-ра мы наблюдали достоверную разницу в весе крыс р<0,05. Последующие дни разницы в весе мы не наблюдали (Рис. 7).

350 -340 -330 -

и

¿ 320 -х п

5 зю ■

н

(О

£ 300 -£

290 -280 -270 -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

дни эксперимента

Рис. 7. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида в дозе 10 мг/кг на динамику массы тела молодых крыс (3 месяца) в условиях неограниченного кормления

N=8 крыс в каждой группе. Достоверность различий: * -р<0,05,_по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрибрюшинное введение физ. р-ра в объеме из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела крыс.

По вертикали - масса тела крыс. По горизонтали - дни эксперимента.

Кривая а - внутрибрюшинное введение раствора лоперамида в дозе 10 мг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс; кривая б - внутрибрюшинное введение физ. р-ра в эквивалентом объеме.

-лоперамид 10 мг/кг -физ. р-р

В следующем эксперименте исследовали массу тела молодых крыс (2 месяца), имеющих неограниченный постоянный доступ к корму и воде и получающих внутрижелудочное введение исследуемого препарата лоперамида в минимальной эффективной дозе 5 мг/кг, основываясь на результатах предыдущих экспериментов. В каждой исследуемой группе было по 8 животных, крысы одной группы находились в общей клетке. Эксперимент проводился 24 дня из них последние 10 дней без введения препаратов. Ежедневно осуществляли взвешивание животных. Уже к концу первой недели эксперимента отмечалось достоверное снижение массы тела крыс, получающих внутрижелудочное введение лоперамида в дозе 5 мг/кг по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрижелудочное введение дистиллированной воды из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела крыс ( р<0,05), данная закономерность отмечалась в течение 2-ой недели эксперимента. Обращает на себя внимание тот факт, что даже после отмены введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида, достоверные различия в массе тела экспериментальных крыс и контрольной группы исчезают лишь на 20-ый день наблюдений (6-ой день после отмены введения лоперамида) (р<0,05) (Рис. 8).

на динамику массы тела молодых крыс (2 месяца) в условиях неограниченного кормления

N=8 крыс в каждой группе. Достоверность различий: * - р<0,05, # - р<0,01, по сравнению с группой контрольных животных, получающих внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс.

По вертикали - масса тела крыс. По горизонтали - дни эксперимента.

Кривая а - внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме ОД мл на 100 г массы тела крыс; кривая б - вну1рижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 5 мг/кг в эквивалентном объеме.

-----► - отмена введения растворов.

Результаты, представленные на рисунке 8, свидетельствуют о том, что хроническое (14 дней) внутрижелудочное введение лоперамида в дозе 5 мг/кг, существенно снижает массу тела животных, что, по-видимому, происходит за счет нарушений в механизмах оценки пищевого подкрепления.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что не проникающий через ГЭБ агонист ц-опиодных рецепторов лоперамид, оказывает влияние на пищедобывательное поведение крыс приводя к значительному снижению их массы тела.

Исследование центральных механизмов, лежащих в основе периферического влияния лоперамида на центральное звено ЭОС.

В настоящее время предполагается, что влияние опиоидов на пищевое поведение связано с активацией системы положительного подкрепления мозга (Gosnell В.A.. Levine A.S.. 2009), что, по-видимому, обусловлено модуляцией активности опиоидных рецепторов (Chen R.Z. et al., 2004; Olszewski P.K. et al., 2002; Yuan C.S. et al., 2009).

Для выяснения механизмов, лежащих в основе воздействия лоперамида на центральное звено ЭОС были определены следующие серии опытов:

1. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида на изменения уровня В-эндорфина в передней поясной коре и области вентральной покрышки мозга крыс. Фармакологические свойства лоперамида в настоящее время ограничены его локальным действием на рецепторы желудочно-кишечного тракта. Однако участие центральных механизмов, в частности, протекающих в передней поясной коре и области вентральной покрышки мозга в механизмах действия периферически введенного лоперамида совершенно не исследовано.

Согласно гипотезе реципрокного взаимодействия опиоидной системы, мы предполагали, что периферическое введение агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида, может привести к изменению содержания Р-эндорфина в ЦНС. Поэтому нами была выдвинута задача изучить индивидуальные особенности влияния лоперамида на содержание Р-эндорфина в перинейрональном пространстве ППК и области вентральной покрышки мозга крыс. Для решения поставленной задачи был использован метод прижизненного микродиализа у свободноподвижных крыс.

В эксперименте по изучению высвобождения p-эндорфина в передней поясной коре мозга крыс было обнаружено, что при внутрижелудочном введении лоперамида в дозе 5 мг/кг снижение было незначительным (р>0,05) (Рис. 9).

Изменение (Рэвдорфнна в передней поясной коре моыга

1 -0,9 -

0,8 -0,7 -

концентрация 0 ^

р-шдорфинд НГ мл '

0.5 -

0,4 -0,3 -0.2 -од -о -

вода лопер амид 5 мг/кг

Рис. 9. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида в дозе 5 мг/кг на содержание р-эндорфина в межклеточном пространстве передней поясной коры мозга крыс

N=9 крыс в каждой группе. Группа контроля - животные, получающие внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Исследуемая группа - животные, получающие внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 5 мг/кг массы тела крыс в эквивалентном объеме. В фоновом диализате контрольных животных содержалось 0,6 нг/мл Р-эндорфина.

По вертикали - концентрация р-эндорфина нг/мл. По горизонтали - исследуемые препараты.

В эксперименте по изучению высвобождения р-эндорфина в области вентральной покрышки мозга крыс было обнаружено, что при внутрижелудочном введении лоперамида в дозе 5 мг/кг содержание Р-эндорфина в межклеточном пространстве не изменяется (р>0,05) (Рис. 10).

Изменение р-эндорфина в области вентральной покрышки мозга

кошктрлшш |?-'>НДОрф1Ш нгмл

■ вода

■ я опер амид 5 мгкг

лоперлмнд С' мгкг

Рис. 10. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида в дозе 5 мг/кг на содержание р-эндорфина в межклеточном пространстве области вентральной покрышки мозга крыс

N=9 крыс в каждой группе. Группа контроля - животные, получающие внутрижелудочное введение дистиллированной воды в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела крыс. Исследуемая группа - животные, получающие внутрижелудочное введение раствора лоперамида в дозе 5 мг/кг массы тела крыс в эквивалентном объеме. В фоновом диализате контрольных животных содержалось 1,58 нг/мл р-эндорфина.

По вертикали - концентрация Р-эндорфина нг/мл. По горизонтали - исследуемые препараты.

По-видимому, активация периферических опиоидных рецепторов агонистом ц-опиоидных рецепторов, не оказывает влияния на уровень р-зндорфина в передней поясной коре и области вентральной покрышки мозга крыс.

2. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида на характеристики ц-опиоидных рецепторов в ЦНС. Принимая во внимание имеющиеся данные литературы о том, что активация центральной ц-опиоидной системы усиливает пищедобывательное поведение (Kelley А.Е., 2004), можно, предположить, что согласно гипотезе реципрокного взаимодействия центрального и периферического отделов эндогенной опиоидной системы (Судаков С.К., Тригуб М.М., 2008), активация периферических ц-опиоидных рецепторов должна приводить к снижению активности центральной ц-опиоидной системы.

Для подтверждения этого факта и выявления возможного механизма периферического действия агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на центральные механизмы пищевого поведения было проведено исследование характеристик ц-опиоидных рецепторов методом радиорецепторного анализа. Известно, что ЭОС участвует в регуляции пищевого поведения за счет влияния множественных механизмов (Levine A.S., Billington C.J., 2004). Действительно, обнаруженное нами подавление пищевого подкрепления, согласуется с результатами, полученными методом радиорецепторного анализа. В гипоталамусе, где располагается мотивационный центр голода, изменений, обнаружено не было. А в коре и среднем мозге, структурах задействованных в механизмах пищевого подкрепления (NakayaT Y. et al., 1994; Pickel V.M. et al., 2000; Gadd C.A. et al., 2003; Jabourian M. et al., 2005; Poulin J.F. et al., 2006), мы наблюдали значительное подавление активности. Это проявлялось в том, что однократное внутрибрюшинное введение агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида в дозе 5 мг/кг привело к достоверному снижению числа рецепторов этого подтипа в среднем мозге и коре мозга крыс. В среднем мозге число мест связывания лиганда уменьшилось в 3 раза, во фронтальной коре в 2 раза (Табл. 1).

В экспериментах на животных и при изучении больных наркоманией было установлено, что активность опиоидных рецепторов существенно

влияет на потребление пищи (Avena N.M. et al., 2008). При формировании опийной наркомании изменяется количество рецепторов, сродство рецепторов с лигандами и свойства систем передачи сигнала в зависимости от вида наркотика. Следует отметить, что в нашем эксперименте по изучению характеристик центральных ц-опиоидных рецепторов используя метод радиолигандного связывания изменения сродства рецепторов к лиганду при внутрибрюшинном введении лоперамида в дозе 5 мг/кг, мы не обнаружили (Табл. 1).

Таблица 1.

Связывающая активность ц-опиоидных рецепторов при однократном введении лоперамида в дозе 5 мг/кг

Группы животных/ структуры мозга Kd(HM) Втах(фмоль/мг белка)

Средний мозг

Контроль 5,2 ±1,0 157±б0

Лоперамид 4,2±0,7 51±18* Je 3 раза

Г ипоталамус

Контроль 2,9±0,9 77±38

Лоперамид 3,7±1,5 90±45

Фронтальная кора

Контроль 4,4±0,6 281±75

Лоперамид 3,7±0,4 Ю7±39* je 2 раза

Достоверность различий: * - р<0,05 по сравнению с контролем.

К<1(кМ) - константа диссоциации - величина обратная сродству рецепторов к лиганду. Вшах (фмоль/мг белка) - отражает число мест связывания лиганда. N=8 крыс в каждой группе.

По-видимому, согласно гипотезе реципрокного взаимодействия центрального и периферического звеньев эндогенной опиоидной системы, периферическое введение лоперамида вызывает подавление активности центрального звена, что выражается в существенном снижении количества активных ц-опиоидных рецепторов.

Вероятно, снижение активности центрального звена опиоидной системы приводит к уменьшению положительно-подкрепляющих свойств пищи, что и вызывает подавление инструментального пищевого поведения крыс, уменьшение потребления корма и снижение их массы тела.

Анализ литературы, позволяет заключить, что важным условием, необходимым для проявления влияния ЭОС на пищевое поведение, является изменение количества активных ц-опиоидных рецепторов в коре мозга. Результаты собственных экспериментов подтверждают данное предположение.

Проведенные исследования указывают на наличие определенной зависимости между способностью пищи активировать систему положительного подкрепления и способностью лоперамида подавлять эту зависимость. По-видимому, подавляющий эффект лоперамида на пищевое поведение животных опосредуется через медиаторные системы мозга, главным образом через мезолимбический путь. Подтверждением этого является множество экспериментальных- работ отмечающих, что область вентральной покрышки среднего мозга и прилежащее ядро являются ключевым звеном в реализации подкрепляющих эффектов системы награды мозга (Wise R.A., 2005, Duvauchelle C.L. et al., 1996; Koob G.F., 1992).

Таким образом, обнаруженное нами угнетающее действие лоперамида на пищевое поведение крыс, позволяет предположить, что лоперамид ослабляет положительно-подкрепляющие свойства пищи, модифицируя ЭОС путем уменьшения активных ц-опиоидных рецепторов в ЦНС. Следовательно, лоперамид может снижать влечение к пище и препятствует развитию различных эффектов пищи, вызывающих зависимость.

Результаты настоящего исследования позволяют также сделать предположение о периферических опиоидергических механизмах пищевого насыщения. Сенсорное насыщение является физиологическим механизмом, прекращающим пищевое поведение при попадании пищи в желудок. Этот механизм в норме предохраняет организм от потребления излишнего количества пищи, несмотря на то, что питательные вещества еще не поступили в кровь и не достигли центральных, чувствительных к ним отделов, обеспечивающих истинное насыщение. Несомненно, в этих механизмах ведущую роль играют рецепторы, расположенные в желудке. Известно, что это механорецепторы, реагирующие на растяжение желудка пищевыми массами (Davison J.S., Clarke G.D., 1988). Тем не менее, в различных отделах желудка были обнаружены и опиоидные рецепторы (Dashwood M.R. et al., 1985; Nishimura E. et al., 1986). Функция, которых до настоящего времени не ясна (Holzer Р., 2009). Известно, что некоторые основные виды пищи содержат пептидные факторы, оказывающие активирующее воздействие на ц-опиоидные рецепторы. В частности, таким веществом является казоморфин, содержащийся в молочных продуктах (Teschemacher H. et al., 1997; Дубынин В.А. и др., 1998). Не исключено, что в процессе расщепления белков пищи, образуются опиоидоподобные пептидные молекулы, также способные активировать опиоидные рецепторы, располагающиеся в стенке желудка, возможно на механорецепторах. Таким образом, воздействие опиоидов из пищи на желудочные рецепторы может лежать в основе механизмов сенсорного насыщения. На рисунке 11 обозначена схема сенсорного насыщения, обусловленного активацией эндогенных опиоидных рецепторов белковыми фрагментами пищи.

Рис.11. Функциональная система сенсорного насыщения

По-видимому, информация о активации ц-опиоидных рецепторов, посредством нервной, предположительно вагусной афферентации, поступает в ЦНС, где осуществляется подавление активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, ответственной за организацию пищедобывательного поведенческого акта. В результате этого, происходит подавление пищевого поведения. Таким образом, воздействие опиоидов из пищи на желудочные рецепторы может лежать в основе механизмов сенсорного насыщения. ~

Полученные нами результаты, а также экспериментальные данные других исследователей, свидетельствующие о регуляции пищевого поведения при воздействии на ц-опиоидные рецепторы желудка не только открывает новый путь в понимании нейробиологических основ пищевого поведения, но и подтверждают ранее выдвинутую гипотезу о реципрокном взаимодействии центрального и периферического звеньев ЭОС (Судаков С.К., Тригуб М.М., 2008).

34

ВЫВОДЫ

1. Периферическое введение лоперамида эффективно подавляет пищедобывательное поведение в зависимости от дозы и способа введения лоперамида. Внутрижелудочное введение в дозах 5-7 мг/кг оказывает более выраженное действие, чем внутрибрюшинное из-за возможного прямого влияния на ц-опиоидные рецепторы желудка.

2. Хроническое внутрижелудочное введение лоперамида в дозе 5 мг/кг приводит к существенному снижению массы тела молодых крыс при свободном неограниченном доступе к корму.

3. Активация периферических опиоидных рецепторов агонистом ц-опиоидных рецепторов лоперамидом в дозе 5 мг/кг, существенно не влияя на уровень ß-эндорфина, приводит к подавлению активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, за счет достоверного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга и в среднем мозге крыс.

4. Введение лоперамида и активация ц-опиоидных рецепторов желудка стимулирует процессы пищевого подкрепления.

5. Возможно применение агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида в качестве средства для коррекции пищевого поведения и снижения массы тела.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Проскурякова Т.В., Шохонова В.А., Чумакова Ю.А., Башкатова В.Г., Судаков С.К. Воздействие на периферические опиоидные рецепторы изменяет концентрацию мю-опиоидных рецепторов в мозге // Бюллетень эксперим. биол. и медицины. - 2009. - Т.148. - №9. - С. 244246. *

2. Судаков С.К., Сотников С.В., Чекмарева Н.Ю., Колпаков A.A., Чумакова Ю.А., Умрюхин А.Е. Изменения уровня бета-эндорфина в поясной коре мозга крыс при периферическом введении лоперамида и

метилналоксона в покое и во время эмоционального стресса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т.149. -№2.-С. 124-126.*

3. Чумакова Ю.А., Башкатова В.Г., Судаков С.К.. Изменения пищевого поведения крыс при периферическом введении лоперамида // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150. -№10. - С. 368-370. *

4. Судаков С.К., Чумакова Ю.А., Башкатова В.Г. Участие эндогенной опиоидной системы в механизмах сенсорного насыщения // Экспериментальная и прикладная физиология. «Системная саморегуляция функций организма». - 2011. Т. 16. С. 39-47.

5. Башкатова В.Г., Чумакова Ю.А., Колпаков A.A. Гипотеза реципрокного взаимодействия центральных и периферических нейропептидных систем // Материалы Международной научной конференции, посвященной 80-летию Азербайджанского медицинского Университета. Баку. - 2010. - С. 479.

6. Судаков С.К., Чумакова Ю.А., Башкатова В.Г. Роль периферической опиоидной системы в механизмах мотиваций и эмоций // Материалы XXI Съезда Физиологов России. Калуга. - 2010. - С. 583.

7. Судаков С.К., Башкатова В.Г., Чумакова Ю.А., Колпаков A.A. Лигандьгпериферических пептидных рецепторов, как новый класс психофармакологических средств // Материалы Международного научно-практического симпозиума « Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии». Хошимин-Фантьен. Вьетнам. - 2010. -С.61

8. Судаков С.К., Башкатова В.Г., Чумакова Ю.А., Колпаков A.A. Нейропептиды в ЦНС и на периферии. Взаимодействие разделенных систем // Материалы 58 научно-практической конференции Таджикского государственного медицинского университета

«Внедрение достижений современной науки в медицину». Душанбе. -2010.-С. 222.

* Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Подписано в печать: 26.01.2012 Объем: 1 усл.п.л.

Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет»

119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чумакова, Юлия Алексеевна, Москва

61 12-3/550

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НИИ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ ИМЕНИ П.К. АНОХИНА РАМН

На правах рукописи УДК 581.1

Чумакова Юлия Алексеевна

ВЛИЯНИЕ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ЛОПЕРАМИДА НА ЦЕНТРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПИЩЕВОГО ПОВЕДЕНИЯ КРЫС

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Судаков Сергей Константинович

доктор фармацевтических наук, профессор Бунятян Наталья Дмитриевна

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Список сокращений, принятых в диссертации...............................................5

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................13

1. Эндогенная опиоидная система...........................................................13

1.1. Структура и функции опиоидных пептидов.......................................13

1.2. Синтез и локализация опиоидных пептидов в организме.................18

1.3. Структура и функции опиоидных рецепторов..................................21

1.4. Локализация опиоидных рецепторов.................................................23

1.5. Особенности функционирования опиоидной системы.....................27

1.6. Изомерия опиоидных рецепторов......................................................299

1.7. Эндогенная опиоидная система и пищевое поведение.....................33

1.8. Эндогенная опиоидная система и подкрепление...............................37

1.9. Взаимодействие центрального и периферического звеньев................

эндогенной опиоидной системы.................................................................42

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................46

1. Метод изучения инструментального пищевого поведения.......47

1.1. Инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным количеством нажатий на педаль для получения вознаграждения...........48

1.2. Инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным соотношением нажатий на педаль для получения вознаграждения......52

2. Изучение влияния периферического введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс.....................................................55

2.1. Исследование динамики массы тела крыс при ограниченном доступе к корму...........................................................................................................57

2.2. Исследование динамики массы тела крыс при свободном неограниченном доступе к корму...............................................................59

3. Нейрохимические методы анализа................................................61

3.1. Исследование содержания ß-эндорфина с использованием метода прижизненного микродиализа на свободноподвижных крысах.............61

3.2. Радиорецепторный метод....................................................................67

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........70

1. Влияние периферического внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения...........................................70

2. Влияние периферического внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения............................................76

3. Влияние периферического внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при ограниченном и свободном неограниченном доступе к корму...........................................................................................82

3.1. Изучение влияния внутрибрюшинного введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при ограниченном доступе к корму..............................................................................................................83

3.2. Изучение влияния внутрибрюшинного введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при свободном неограниченном доступе к корму ...........................................................................................85

3.3. Изучение влияния внутрижелудочного введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при ограниченном доступе к корму..............................................................................................................87

3.3. Изучение влияния внутрижелудочного введения лоперамида на динамику массы тела молодых крыс при свободном неограниченном доступе к корму............................................................................................89

4. Исследование механизмов, лежащих в основе периферического влияния лоперамида на центральное звено ЭОС............................92

4.1. Влияние внутрижелудочного введения лоперамида на содержание уровня (3-эндорфина в передней поясной коре и области вентральной покрышки мозга крыс..................................................................................92

4.2. Влияние внутрибрюшинного введения лоперамида на характеристики ц-опиоидных рецепторов в ЦНС................................................................95

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА V. ВЫВОДЫ...........................................................................

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ.......................................

..97 108 109

Список сокращений, принятых в диссертации

АКТГ - Адренокортикотропный гормон

ГЭБ - Гематоэнцефалический барьер

ЖКТ - Желудочно-кишечный тракт

ИФА - Иммуноферментный анализ

ЛП - Латентный период

ПАВ - Психоактивные вещества

ПКМС - Подвздошная кишка морской свинки

ПНС - Периферическая нервная система

ПОМК - Проопиомеланокортин

ППК - Передняя поясная кора

СПМ - Семявыносящий проток мыши

цАМФ - Циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - Центральная нервная система

ЭОС - Эндогенная опиоидная система

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Проблема формирования целенаправленной деятельности человека и животных занимает особое место среди важнейших и нерешенных проблем современной физиологии. Согласно теории функциональных систем Анохина П.К., системомобилизующим фактором поведенческих актов является доминирующая мотивация, формирующаяся на основе ведущей потребности организма (Анохин П.К. 1978). Особое положение среди биологических мотиваций принадлежит мотивации голода, строящейся на ведущей метаболической потребности организма (Судаков К.В. 1995).

Нарушения пищевого поведения — один из факторов риска многих медико-социальных заболеваний во всем Мире, таких как артериальная гипертония, инсулиннезависимый сахарный диабет, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца и др. (Bray G. А., 1998).

Нынешняя эпидемия ожирения частично обусловлена чрезмерным потреблением вкусной пищи и как следствие, формированием патологического подкрепления к ней (Blundell J.E., Gillett А., 2001; Bray G.A. et al., 1992; Hill J.O., Peters J.C., 1998; Ludwig D.S. et al., 2001). Переедание является важной проблемой общественного здравоохранения в силу своей сильной ассоциации с другими медицинскими и психическими расстройствами, в первую очередь ожирением и депрессией. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в странах Европы 30-80% населения имеют избыточную массу тела. За последние 20 лет число детей и подростков с избыточной массой тела увеличилось в 2 раза (Kromeyer-Hauschild К. et al., 1999). Установлено, что если бы человечеству удалось решить проблему избыточного веса, средняя продолжительность жизни увеличилась бы на 4 года.

Широкое распространение нарушений пищевого поведения наряду с недостаточной эффективностью имеющихся лекарственных средств, делает актуальной проблему поиска новых лекарственных препаратов с целью создания безопасных анорексигенных препаратов. Перспективным инновационным терапевтическим подходом лечения нарушений пищевого поведения считается создание безопасных антагонистов избирательного действия ц-опиоидных рецепторов, влияющих на процессы пищевого поведения (Zhang J. et al, 2006; Nathan P.J. Bullmore E.T., 2009).

В 1983 году Carr K.D. and Simon E.J. обнаружили, что ц-опиоидные рецепторы эндогенной опиоидной системы участвуют в регуляции пищевой мотивации. Однако прямое воздействие на центральные опиоидные рецепторы сопровождается рядом нежелательных эффектов, основным из которых является формирование зависимости. Данная работа основывается на гипотезе о реципрокном взаимодействии центрального и периферического звеньев эндогенной опиоидной системы (Судаков С.К., Тригуб М.М., 2008). Согласно этой гипотезе подавление активности периферического звена ЭОС приводит к активации центрального звена, а активация периферических опиоидных рецепторов ЭОС подавляет активность центральных. В связи с этим выявление роли опиоидов в механизмах регуляции контроля аппетита и других аспектов пищевого поведения представляется одной из самых актуальных задач современных биомедицинских исследований (Adam Т.С., Epel E.S., 2007).

На протяжении десятилетий опиоидергические препараты широко используются для обезболивания (Метелица В.И., 1996) и реже обсуждается их влияние на пищевое поведение. Исследованию роли эндогенной опиоидной системы в патогенезе нарушений пищевого поведения к моменту начала диссертационного исследования были посвящены немногочисленные публикации (Gadd С.А. et al., 2003; Jabourian М. et al., 2005). Вместе с тем, важнейшая роль ЭОС в регуляции пищевого поведения не вызывает сомнений (Will MJ. et al., 2003).

Фармацевтические препараты для лечения ожирения, присутствующие сегодня на мировом лекарственном рынке, могут быть отнесены к двум группам: средства центрального действия, снижающие аппетит или способствующие быстрому появлению чувства насыщения, и лекарства, действие которых обусловлено уменьшением абсорбции компонентов пищи.

В фармакотерапии нарушений пищевого поведения чаще всего используют препараты, воздействующие на ЦНС, действие которых сопряжено с риском возникновения побочных эффектов (Харкевич Д.А., 2002). В настоящее время на современном рынке фармацевтических препаратов «идеального» средства для коррекции веса нет. Существует высокая потребность в эффективных фармакологических средствах для лечения расстройств пищевого поведения, которые были бы достаточно безопасны и могли бы применяться длительное время.

В связи с этим, целью настоящей работы являлось изучение участия (I- опиоидных рецепторов, располагающихся в желудке в организации пищевого поведения, а также эффектов воздействия на эти рецепторы.

В ходе исследования решались следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с фиксированным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

2. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на инструментальное пищевое поведение крыс с прогрессивным соотношением нажатия на педаль для получения вознаграждения.

3. Изучить влияние периферического введения агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида на динамику массы тела крыс молодого возраста, имеющих ограниченный и неограниченный доступ к корму.

4. Исследовать изменения выделения (3-эндорфина в перинейрональное пространство передней поясной коры и области вентральной покрышки мозга крыс при периферическом воздействии агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида.

5. Исследовать изменения характеристик центральных ц-опиоидных рецепторов при периферическом воздействии агониста опиоидных рецепторов лоперамида.

Положения, выносимые на защиту:

1. Периферическое введение лоперамида эффективно подавляет пищедобывательное поведение в зависимости от дозы, способа введения препарата.

2. Хроническое внутрижелудочное введение лоперамида приводит к существенному снижению массы тела крыс при свободном неограниченном доступе к корму у животных.

3. Активация периферических опиоидных рецепторов лоперамидом приводит к подавлению активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, за счет достоверного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга и среднем мозге крыс.

4. Введение лоперамида и активация ц-опиоидных рецепторов желудка стимулирует процессы пищевого подкрепления.

Научная новизна

Все полученные нами результаты можно квалифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе.

Впервые проведено изучение периферического влияния лиганда ¡1-опиоидных рецепторов лоперамида на пищевое поведение. Получены новые данные об участии эндогенной опиоидной системы в регуляции пищевого поведения.

Впервые было выявлено, что активация, периферических опиоидных рецепторов агонистом (1-опиоидных рецепторов лоперамидом в дозе 5 мг/кг, существенно не влияя на уровень (3-эндорфина в мозге, приводит к подавлению активности центрального звена эндогенной опиоидной системы, за счет достоверного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга и среднем мозге крыс.

Установлено, что снижение активности центрального звена ЭОС приводит к уменьшению положительно-подкрепляющих свойств пищи, что, по-видимому, вызывает подавление инструментального пищевого поведения крыс, уменьшение потребления корма и как следствие снижение массы тела крыс.

Обнаружено ранее неизвестное влияние агониста ц-опиоидных рецепторов лоперамида, не проникающего через ГЭБ, оказывающее анорексигенное действие на пищевое поведение крыс.

Установлена принципиальная возможность и перспективность нового подхода к фармакотерапии нарушений пищевого поведения, связанного с активацией опиоидной системы путем воздействия на (1-опиоидные рецепторы.

Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли ЭОС в регуляции пищевого поведения.

Практическая значимость результатов исследования

Поскольку опиоидная система участвует в регуляции широкого спектра функций организма, предполагается целесообразным расширение показаний к использованию лоперамида в целях терапии нарушений пищевого поведения, характеризующихся значимыми изменениями этой системы. Полученные данные об анорексигенном эффекте лоперамида свидетельствуют о перспективности его использования при лечении нарушений пищевого поведения. Практический интерес представляют также данные о роли эндогенной опиоидной системы в формировании пищевого поведения, которые могут послужить вкладом в дальнейшее изучение новых лекарственных средств для лечения расстройств пищевого поведения. Данные этой работы могут быть использованы для решения теоретических и практических проблем нарушения веса и, что особенно важно, применяться в качестве экспериментального обоснования нового фармацевтического влияния лигандов опиоидных рецепторов периферического действия, а также расширить уже существующие возможности лечения расстройств пищевого поведения.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на конференции молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2009), на Международной научной конференции, посвященной 80-летию Азербайджанского медицинского Университета (Баку, 2010), на Российской конференции XXI Съезда Физиологов (Калуга, 2010), на Международном научно-практическом симпозиуме «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии», (Хошимин-Фантьен, Вьетнам, 2010), на 58-й научно-практической конференции Таджикского государственного медицинского университета «Внедрение достижений современной науки в медицину». (Душанбе, 2010). Результаты представлены и обсуждены на совместном расширенном заседании отдела системных механизмов поведения Российской академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН 24 ноября 2011 г.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 4 таблицы и 15 рисунков. Список литературы включает 34 отечественных и 263 иностранных источников.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эндогенная опиоидная система

Эндогенная опиоидная система была открыта и описана в 1970-е годы. Важнейшим стимулом к изучению эндогенной опиоидной системы (ЭОС) явилось открытие в 1974-1975 гг. в мозговой ткани эндогенных опиоидоподобных соединений, которые по химической природе оказались нейропептидами - энкефалинами и эндорфинами (Hughes J. et al., 1975).

1.1. Структура и функции опиоидных пептидов

Открытие опиоидных пептидов - это крупнейшее достижение для фармакологии опиоидов в 70-80-х годов, которое способствовало не только исследованию путей направленного воздействия наркотических анальгетиков, но и позволило сделать шаг вперед в изучении нейрохимических механизмов восприятия боли, памяти и поведенческих реакций.

В настоящее время выделены новые группы опиоидных пептидов (динорфины, неоэндорфины и др.). Синтезировано большое число их аналогов, которые применяются, главным образом, в экспериментальных исследованиях. Их изучение способствовало появлению новых направлений в исследовании функции мозга, а также определило новые подходы к лечению ряда нервных и психических заболеваний (Ашмарин И. П., 1982; Булаев В. М., 1982; Reisine T. Pasternak G., 1995).

Вначале предполагалось, что (3-эндорфин является длительно дейст