Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транзиторные нейроны трохофорных животных и их роль в регуляции развития

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Транзиторные нейроны трохофорных животных и их роль в регуляции развития"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им Н.К.Кольцова

На правах рукописи

ВОРОНЕЖСКАЯ Елена Евгеньевна

ТРАНЗИТОРНЫЕ НЕЙРОНЫ ТРОХОФОРНЫХ ЖИВОТНЫХ И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

03 00 30 - биология развития, эмбриология

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития им Н К Кольцова РАН (директор - доктор биологических наук, профессор Н Д Озернюк)

Научный консультант:

доктор биологических наук Д А Сахаров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор П М Балабан доктор биологических наук, профессор Л В Белоусов доктор биологических наук, профессор О Г Строева

Ведущая организация:

Институт Биологии Моря ДВО РАН

Защита состоится 13 апреля 2005 г в 14 00 часов на заседании Диссертационного совета Д002 238 01 при Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института 6HOIOI ии развития им Н К Кольцова РАН

Отзывы можно направлять по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 26, Диссертационный совет Факс (095)135-80-12, E-mail vohna@proxima idb ас ru

Автореферат разослан 12 марта 2005г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При решении фундаментальных задач нейробиологии развития исследователи традиционно обращались к относительно просто устроенным модельным беспозвоночным. Данные последних лет, полученные нейробиологами развития с применением современных генетических и молекулярно-биологических методов при изучении эмбрионов различных модельных животных, таких как мыши (Mus musculis), рыбы (Danio rerio), насекомые (Drosophila melanogaster), полихеты (Platynereis dumerilii) и нематоды (Caenorgabditis elegans) показали, что гены, регулирующие развитие, чаще всего являются консервативными у представителей даже далеко отстоящих таксономических групп (обзор Moody, 1999; Arendt et al., 2001, 2004). Эти открытия еще раз показали важность сравнительных исследований и подтвердили существовавшее и раньше представление о том, что фундаментальные механизмы развития едины во всем животном царстве.

Трохофорные животные, выделяемые по присутствию в их жизненном цикле трохофо-ры или трохофороподобной личинки, являются одной из самых многочисленных групп среди Spiralia. Ее представители использовались в качестве экспериментальных моделей в различных областях биологии, и, в частности, нейробиологии. Так, доказательство роли серотонина (5-НТ) как передатчика нервных импульсов было получено на садовой улитке Helix (Gershenfeld and Steni, 1965), а интегративная функция этого медиатора в поведении была продемонстрирована на медицинской пиявке Hirudo (Lent, 1986). Пептид Phe-Met-Arg-Phe-NH2, (FMRFamide) был изначально идентифицирован как возбуждающий сердечные сокращения у моллюсков (Price and Greenberg, 1977). На морских слизнях Tritonia и Aplysia была установлена и плодотворно изучается нейрональная основа поведения, памяти и обучения (Willows, 1967; Kandel, 1976). Множество работ посвящено изучению различных аспектов функционирования дефинитивной нервной системы моллюсков и аннелид. Несмотря на то, что развитие этих животных давно изучается классическими эмбриологическими методами (напр., Raven, 1966; Anderson, 1966; Cumin, 1972; Мещеряков, 1975), данные об их нейрогенезе и особенно о ранних его этапах немногочисленны и часто противоречивы, а понимание функций ларвальных нейронов все еще остается на уровне предположений и в большинстве случаев не имеет экспериментального подтверждения.

В обзоре литературы приводятся данные, существующие до настоящего времени о нейрогенезе моллюсков и аннелид. На основании как ранних гистологических, так и последующих электронномикроскопических и иммуноцитохимических исследований считалось общепринятым, что первые нейроны дифференцируются у моллюсков на стадии велигера, формирование ганглиев происходит в ростро-каудальном направлении, нейроны дифференцируются внутри ганглиев, и их отростки формируют связывающие ганглии коннективы и комиссуры (обзор Croll, 2000). В раннем нейрогенезе моллюсков не были обнаружены такие принципиально важные для других беспозвоночных процессы, как прокладывание путей растущих нервов дефинитивной нервной системы отростками периферических пионерных нейронов, присутствие запрограммированной клеточной гибели и наличие транзиторных нейронов. Представленные в литературе сведения о раннем нейрогенезе полихет хотя и имеют более длительную историю, тем не менее малочисленны и противоречивы. Данные, вошедшие во многие основные труды по сравнительной эмбриологии нервной системы (Беклемишев, 1964; Bullock and Horridge,

1965) о наличии сложного ортогона у поздней трохофоры впоследствии были опровергнуты. Большинство исследователей описывают высокоцентрализованную нервную систему, состоящую из апикального органа, зачатков дефинитивного мозга в эписфере, выходящих из него в ростро-каудальном направлении продольных нервов, протрохального и окологлоточного колец (см. Nielsen, 2001). Не существует единого мнения по вопросу о взаимоотношении ранней (личиночной) и дефинитивной (взрослой) нервной системы. В литературе представлены две диаметрально противоположных точки зрения. Так, согласно одной, дефинитивная нервная система развивается совершенно независимо от личиночной, возникает из других источников, и ее нервы следуют по собственным, отличным от личиночных нервов, путям (Lacalli, 1984). В соответствии с другой точкой зрения большая часть личиночной нервной системы переходит во взрослую (Hay-Schmidt, 1995). Для решения этих вопросов выявление самых ранних нервных элементов и выяснение их судьбы в развитии является принципиальным и необходимым.

Данные о функциях личиночных нейронов отрывочны. Даже по вопросу о роли клеток наиболее давно и подробно изучаемого личиночного апикального органа трохофорных животных у исследователей до настоящего времени нет непротиворечивого аргументированного мнения. Таким образом, имеющиеся данные о раннем нейрогенезе трохофорных животных противоречивы и указывают на существенные отличия в стратегии развития, используемые этой группой животных. Судьба и функциональная роль ранних нейронов личиночной нервной системы не выяснены.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было выяснить стратегию нейрогенеза в различных группах трохофорных животных, применив современные методы клеточного маркирования. Сравнив нейрогенез репрезентативных представителей, выделить общие закономерности формирования личиночной нервной системы. Выяснить морфологические особенности и функциональные взаимодействия ранних нейронов между собой и с формирующейся дефинитивной нервной системой в случае каждого конкретного вида. Выявить роль, которую играют ранние нейроны в нейрогенезе, поведении и развитии.

В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить, какие именно из моноаминов и пептидов семейства РМИРамида присутствуют в развивающихся зародышах гастропод и проследить динамику их экспрессии.

2. Максимально подробно изучить нейрогенез репрезентативных видов различных классов моллюсков и аннелид со времени появления первых нервных элементов до конца формирования ганглиев центральной нервной системы. Проследить судьбу выявленных идентифицированных нейронов.

3. Исследовать и сравнить особенности морфологии ранних нейронов у представителей различных групп трохофорных животных.

4. Исследовать значение ранней экспрессии серотонина в развитии гастропод.

5. Изучить роль идентифицированных октопамин-содержащих нейронов буккального ганглия в формировании пищевого ритма у гастропод.

6. Произвести фармакологическую модуляцию активности ранних нейронов и по возможности выявить естественные стимулы, влияющие на их активность.

7. Исследовать влияние изменения активности ранних нейронов на нейрогенез и развитие зародышей.

Научная новизна работы. У зародышей представителей различных групп моллюсков и аннелид выявлены элементы нервной системы на значительно более ранних стадиях развития, чем предполагалось ранее.

Тела самых ранних развивающихся клеток расположены в двух полярных областях зародыша: в передней и в задней полусферах. Отростки ранних клеток изначально морфологически не пересекаются. Все ранние нейроны расположены субэпителиально и имеют короткий отросток (дендрит), выходящий на поверхность эпителия и несущий реснички, то есть, по-видимому, являются сенсорными. Длинные отростки клеток (аксоны), расположенных в задней полусфере, растут вперед и маркируют пути, по которым в дальнейшем происходит формирование развивающейся дефинитивной нервной системы. Только после того, как эти отростки достигают церебральных плакод, расположенных на переднем конце зародыша, начинается дифференцировка нейронов внутри ганглиев.

Показано, что большинство ранних нейронов является транзиторными, то есть в определенный период развития клетки прекращают синтезировать характерный нейротрансмиттер, их отростки дегенерируют, а тела клеток пропадают, по-видимому, подвергаясь запрограммированной клеточной гибели.

Обнаружены природные химические сигналы, которые испускаются улитками разных возрастов в условиях скученности и отсутствия пищи, улавливаются моноаминергичес-кими апикальными сенсорными нейронами инкапсулированных эмбрионов и обратимо тормозят зародышевое развитие.

Обнаружен новый механизм регуляции личиночного развития моллюсков. Показано, что их развитие находится под слабым тоническим тормозным влиянием апикальных моноаминергических сенсорных нейронов, которые являются частью апикального органа. Моноамины, выбрасываемые этими нейронами, связываются с внутренними эргометрин-чувствительными рецепторами и вызывают торможение развития. В случае неблагоприятных для взрослых моллюсков условий внешней среды апикальные клетки эмбрионов активируются испускаемыми улитками химическими сигналами и увеличивают секрецию и выброс моноамина, который, в свою очередь, усиливает торможение развития.

Научно-теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные коренным образом изменяют представление о нейрогенезе трохофорных животных. Показано, что развитие нервной системы начинается с единичных периферических сенсорных нейронов отростки которых маркируют пути формирования дефинитивной нервной системы. Таким образом, продемонстрировано наличие в развивающейся нервной системе пионерных волокон и нейронов с транзиторной экспрессией медиатора. Таким образом, показано, что в развитии представителей трохофорных используются те же стратегии поведения, что и у других беспозвоночных и позвоночных животных.

Период начальных этапов формирования нервной системы рассматривается с точки зрения участия нервных передатчиков в нейро- и онтогенезе.

Был обнаружен новый механизм химического взаимодействия между взрослыми особями моллюсков и их эмбрионами. Показано, что в основе этого взаимодействия лежит активация нейронов апикального органа, одной из самых консервативных нервных структур, присутствующих в развитии трохофорных и многих не трохофорных животных. Выявленные закономерности внутри- и межвидовой регуляции позволят разработать новый подход воздействия на численность как вредных (например, моллюски-

обрастатели), так и важных в промысловом отношении (например, мидии, морские ежи) беспозвоночных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Самые ранние нервные элементы у моллюсков и аннелид дифференцируются на стадии ранней трохофоры. Ранние нейроны экспрессируют пептиды семейства БМЯРамида и/или серотонин.

2. В раннем развитии пульмонат преобладает экспрессия пентапептидов, в частности ЕРЬШамида. Гептапептиды семейства БМЯРамида начинают экспрессироваться позже нейронами дефинитивной нервной системы.

3. В развивающихся эмбрионах пульмонат биохимически выявляются такие моноамины как серотонин, дофамин и октопамин. Их содержание возрастает в процессе развития.

4. Ранние клетки у личинок всех исследованных видов расположены на периферии и являются сенсорными. Их тела и отростки экспрессируют соответствующий трансмиттер транзиторно, то есть только в течение определенных стадий развития.

5. Нейроны задней полусферы различаются по морфологии, составу нейротрансмиттеров и расположению. У всех изученных видов они являются самыми ранними элементами нервной системы, их отростки маркируют места, где в дальнейшем будут сформированы центральные ганглии дефинитивной нервной системы и пути, по которым пройдут связывающие ганглии комиссуры и коннективы. Таким образом, генеральная стратегия нейрогенеза едина у разных групп трохофорных животных.

6. Октопамин-содержащие нейроны буккального ганглия входят в состав центрального генератора пищевого ритма у пульмонат. Выделяемый ими октопамин оказывает модуляторное влияние на активность генератора.

7. Увеличение синтеза серотонина нейронами задней полусферы у личинок аннелид приводит к торможению развития и дифференцировки других нейронов.

8. Нейроны передней полусферы принадлежат к апикальному органу и являются гомологичными у личинок разных групп. Апикальные нейроны эмбрионов пульмонат активируются химическими веществами (веществом), выделяемыми вылупившимися улитками в условиях голодания и высокой плотности популяции. Повышение эмбриональными клетками синтеза и секреции моноаминов приводит к торможению развития эмбрионов путем активации эргометрин-чувствительных рецепторов.

Апробация работы. Материалы диссертации многократно докладывались на всесоюзных и международных симпозиумах, конференциях и съездах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 статей в реферируемых журналах, из них 6 в отечественных и 24 в международных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация объемом 195 страниц состоит из введения, включающего обзор литературы, описания материала и методов, восьми глав с изложением результатов и их обсуждением, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 308 названий. Работа содержит 7 таблиц и 87 рисунков.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования. Работа выполнена на личинках пресноводных и морских моллюсков и личинках морской полихеты. Эмбрионов пресноводных улиток Ьушпаеа

stagnalis, Helisoma trivolvis и Biomphalaria glabrata (Mollusca: Gastropoda: Pulmonata) получали из кладок, отложенных в лабораторной популяции. Коконы морских моллюсков Aplysia californica, Tritonia diomedea (Mollusca: Gastropoda: Opisthobranchea), Ischnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora) и полихеты Phyllodoce maculata (Polychaeta: Phyllodocida) были получены от отловленных и содержащихся в аквариумах особей.

Для иммуногистохимического изучения и фармакологических экспериментов использовались зародыши, начиная со стадии бластулы, а также постметаморфные особи на различных стадиях развития. Стадии развития определяли по совокупности морфологических, морфометрических и поведенческих признаков, характерных для каждого вида.

Для Lymnaea и Helisoma использовали обозначение стадий по номеру (согласно Мещерякову, 1975) и в процентах от общего времени эмбрионального развития (Marois and Croll, 1992), где 0% (эмбриональная стадия Е0) соответствует первому делению дробления, а 100% (Е100) вылуплению. Стадии развития Lymnaea после выхода из кокона определяли, измеряя длину раковины (Croll and Chiasson, 1989).

Для Aplysia и Tritonia использовали традиционные названия стадий: ранняя, средняя, поздняя трохофора и ранний, средний, поздний велигер. Для Ischnochiton стадии развития указываются в часах после оплодотворения. Для Phyllodoce время развития на стадиях до вылупления указывается в часах после появления первой борозды дробления. Для последующих стадий время указывается в часах после вылупления.

2.2. Иммунохимическое маркирование. Перед фиксацией животных расслабляли инкубацией (личинок) или инъекцией (моллюсков) 50 мкМ раствора MgCl2. На каждой стадии для каждого антитела изучали не меньше, чем по 100 зародышей каждого вида. В случае постэмбриональных стадий выделялись отдельно ЦНС, буккальная масса, пищевод, нога, мантия, губы, щупальца, половые органы. Иммуноцитохимическая реакция проводилась как на тотальных препаратах, так и на 50 мкм серийных микротомных срезах тканей.

Для маркировки клеточных ресничек и элементов нейронального цитоскелета использовались моноклональные антитела против ацетилированного а-тубулина (Т). Для иммунохимического маркирования нервных элементов использовались поликлональные и моноклональные антитела против следующих веществ: серотонин (5-НТ), октопамин (ОА), FMRFaмид (FMRFa), EFLRIamide (EFLRIa), He-FMRFamide-подобный 22-аминокислотный пептид SEQPDVDDYLRDVVLQSEELY ("SEEPLY") и 35-аминокислотный пептид SDPFFRFGKQQVATDDSGELDDEILSRVSDDDKNI ("acidic peptide", АСР), миомодулин-подобный пептид CARP, гамма-аминомаслянная кислота (GABA), фермент синтеза катехоламинов - тирозингидроксилаза (ТН).

В соответствующем разделе диссертации приводится подробная характеристика используемых первичных антител. Общепринято, что иммунореакция с антителами к тубулину выявляет у беспозвоночных отростки и контуры тел всех нервных клеток. Это позволило для обнаружения самых ранних нервных элементов в развитии личинок использовать реакцию на тубулин, совместно с иммунореакцией на такие нейротрансмиттеры, как 5-НТ, дофамин (DA) и FMRFa.

Первичные антитела выявляли при помощи вторичных антител против иммуноглобулинов кролика или мыши, меченных одним из следующих флуоресцентных маркеров: флуоресцеинизотиоцианат (FITC), родамин, Texas Red, Alexa-488, Alexa-546. Для лазерной конфокальной микроскопии использовали только маркеры А1еха-488 и Alexa-

546. Для точного определения тел нейронов при иммунохимической реакции и окрашивании использовали флуоресцентные маркеры ДНК: йодистый пропидий и DAPI.

Препараты изучали и фотографировали при помощи микроскопа проходящего света Jenaval, эпифлуоресцентного микроскопа Axioplan или Aristoplan (Leitz), или лазерного конфокального микроскопа LSM510 (все Zeiss, Germany).

2.3. Глиоксилатная гистохимическая реакция. Для гистохимического выявления моноаминов использовали реакцию с глиоксиловой кислотой (De la Torre, 1980) модернизированную для моллюсков Каботянским и Сахаровым (1989). Для изучения ранних стадий развития (Е20-Е35) использовали целых эмбрионов. Для поздних стадий (Е40-Е100) проводили частичную препаровку. Ткани помещали в свежеприготовленный раствор глиоксиловой кислоты (0.5 М глиоксилата натрия, 150 мМ сахарозы, 50 мМ Трис буфер, рН 7.4) при 4°С. После 30-90 минутной инкубации ткани извлекали из раствора, помещали на предметные стекла и сушили под струей воздуха комнатной температуры 15-30 мин. Затем препараты нагревали до 60 °С 30 мин, заключали в парафиновое масло и изучали под микроскопом Leitz Aristoplan, оборудованном эпифлуоресцентной насадкой (блок фильтров D).

2.4. Формальдегид-глутаральдегидная реакция. Катехоламины в эмбриональных клетках выявляли также модифицированным формальдегид-глутаровым методом (FaGlu, Furness et al., 1977; Croll and Chiasson, 1990). Эмбрионов фиксировали в растворе 4% параформальдегида, 0.5% глутаральдегида и 7% сахарозы в 0.1 М ФБ, рН 7.4. Затем препараты высушивали на воздухе, обезвоживали в спиртах, просветляли в метилсалицилате, заключали в Fluoromount (BDH, Poole, UK) и изучали под микроскопом Leitz Aristoplan, оборудованном эпифлуоресцентной насадкой (блок фильтров D).

Гистологические препараты фотографировали на пленку Kodak TMAX 100 с использованием фотонасадки к микроскопу Leitz Aristoplan. Отпечатки отцифровывали на планшетном сканнере, иллюстрации монтировали при помощи программы Photoshop.

2.5. Внутриклеточное окрашивание. Для внутриклеточного окрашивания в нейрон вводили микроэлектрод, заполненный 3% раствором люцифера желтого (Lucifer Yellow). Краситель инъецировали при помощи гипёрполяризующих толчков тока (5 нА, 1 Гц) в течение 10-20 мин. После инъекции изолированные ганглии фиксировали в 4% парафор-мальдегиде в 0.1 М ФБ, обезвоживали в этаноле и просветляли в метилсалицилате (Elliott and Benjamin 1985a). Реконструкцию строения нейронов проводили по серийным микрофотографиям.

2.6. Объемная реконструкция серийных срезов. Для приготовления серийных срезов только что вылупившихся трохофор, фиксированных обычным образом, обезвоживали, проводя через спирты и пропиленоксид, заливали в Poly/Bed 812 (Polysciences, USA), резали серийные срезы толщиной 2 мкм на ультратоме LKB-4 (LKB, Швеция), используя стеклянные ножи, окрашивали метиленовым синим, изучали и фотографировали под микроскопом Axiovert 200 (Zeiss), оборудованном цифровой фотокамерой.

2.7. Электрофизиологические эксперименты. ЦНС, включающую буккальные ганглии, изолировали и помещали в камеру с нормальным физраствором для Lymnaea (Elliott et al., 1992). Соединительную ткань разрыхляли протеазой (Sigma, type XIV), после чего наружный слой клеток с дорзальной стороны буккальных ганглиев удаляли механически.

Для регистрации электрофизиологической активности нейронов использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные ЗМ КС1 с сопротивлением 8-30 МП.

Нейроны, входящие в буккальный генератор пищевой активности, идентифицировали по их положению, спонтанной активности и/или активности, вызываемой модуляторными интернейронами (Elliott and Benjamin 1985a,b; Yeoman et al. 1995). Используя морфологические и электрофизиологические критерии, а также двойное окрашивание (внутриклеточное окрашивание с последующей иммуноцитохимической обработкой) идентифицировали пару буккальных нейронов, экспрессирующих октопамин, (нейроны ОС) и регистрировали их активность а также влияние на работу других клеток буккального генератора.

2.8. Хроматография под высоким давлением (HPLC). Использовали модифицированный метод HPLC) МакКамана и соавторов (McCaman et al., 1972; 1973) для количественного определения моноаминов. Эмбрионов гомогенизировали в 300 мкл 0.1 М фосфатного буфера (ФБ, рН 7.0), содержащего изопротеренол в качестве внутреннего стандарта. Затем гомогенат центрифугировали при 6000g 15 минут. Амины изолировали го аликвоты супернатанта в 300 мкл хлороформа, содержащего 0.1 М di-(2-etylhexyl)-phosphoric acid. Пробы центрифугировали, органическая фракция промывалась в 0.1 М ФБ, аликвота 250 мкл отбиралась и смешивалась с 80 мкл 0.1 N НС1. Содержимое пробирок интенсивно перемешивали и центрифугировали. Жидкую фракцию отсасывали микропипеткой инъектора WISP712 (Waters Corp. США) и впрыскивали аликвоту 50 мкл в HPLC систему (Waters Corp. США). Амины разделяли на колонке 125/4-mm Nucleosil 5С18 reverse/phase column (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Dueren, Germany).

2.9. Радиоферментный анализ. Концентрацию ОА измеряли на стадиях эмбрионального развития Е60, Е75, Е85, Е90 и Е100, а также у ювенилов. Кусочки ткани гомогенизировали в 0.1 М Tris-HCl буффере (рН 8.6), содержащем 1 мМ ипрониазида, и нагревали на водяной бане до 90°С в течение 5 минут. Затем гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 15 минут и аликвоты супернатанта анализировали дважды. Содержание ОА измеряли радиоферментным методом (McCaman and McCaman, 1978). Использовали phenolethanolamine-N-methyl-transferase и adenosyl-L-methionine, S-/m ethyl-3H/ (специфическая активность 14.2 Ci/ммоль) производства Sigma и DuPont соответственно.

2.10. Фармакологическая модуляция пищевого поведения. Пищевые тесты проводили на группах из 10-15 интактных животных, которых не кормили три дня. Контрольной группе делали инъекции 100 мкл нормального физраствора для Lymnaea (Elliott et al., 1992). Экспериментальным группам инъецировали тот же объем раствора антагониста для достижения финальной концентрации 1-50 мг/кг веса тела. Инъецировали следующие вещества: эрготамин^-тартрат (ROTH), сульпирид, фентоламин гидрохлорид, и NC-7.

Улиток помещали в чашку Петри с раствором сахарозы (10 мМ), который вызывал стандартный пищевой ответ, включающий скребущие движения (Kemenes et al., 1986). Для характеристики пищевого поведения подсчитывали: а) количество улиток, которые совершали скребущее движение в течение 2 минут после помещения в сахарозу; 2) количество скребков за первую минуту после начала питания.

Экспериментальных животных сравнивали с контрольными, которым инъецировали физраствор в той же самой серии экспериментов. Достоверность вычисляли по методу Средние значения уровней пищевой активности (скорость жевания) сравнивали по критерию Стьюдента (/-test). Различия считали достоверными прир < 0.05.

2.11. Фармакологическая модуляция развития. В фармакологических экспериментах использовали вещества, позволяющие модулировать уровень нейрональных моноаминов. Использовали следующие вещества: 5-НТ, DA, 5-hydroxy-L-tryptophan (5-HTP, метаболический предшественник синтеза 5-НТ), L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA, метаболический предшественник синтеза DA), a-methyl-tryptophan and a-methyl-DOPA (a-m-T Mid a-m-DOPA, метилированные аналоги предшественников), 3-hydroxybenzil-hydrazine (блокатор синтеза моноаминов, NSD-1015), L-^-chlorophenylalanine (PCPA), ergometrine maleate (EM, антагонист дофаминовых рецепторов), sulpiride, spiperone hydrochloride (антагонисты DA и 5-НТ рецепторов), mianserin hydrochloride, cyproheptadine hydrochloride, ritanserin, ketanserin tartrate (антагонисты 5-НТ рецепторов). Чашки Петри с эмбрионами держали в темноте и растворы меняли раз в день.

2.12. Регистрация поведения. Основные движения эмбрионов (вращение, ползание, сокращения тела) регистрировали при помощи аппарата, в котором изображение отдельных живых эмбрионов в яйцевых капсулах проецировалось на фоточувствительное сопротивление (Labas et al., 1982). Электрические сигналы с сопротивления подавались на вход самописца Hewlett-Packard (HP-30C). За поведением и сопутствующими ему жевательными движениями буккальной массы следили также под бинокуляром и записывали на ленту самописца при помощи ручного выключателя (время записи 15-20 минут). Дыхательное поведение (открытие и закрытие пневмостома) наблюдали и подсчитывали под бинокуляром в течение 5 минутных интервалов. На каждой стадии развития регистрировали поведение минимум 20 эмбрионов, взятых из различных кладок.

2.13. Приготовление кондиционированной воды. Для кондиционирования 200 ювенильных улиток держали без пищи 24 часа, затем промывали в нескольких сменах фильтрованной прудовой воды (ФПВ), помещали в 10 мл ФПВ и держали без пищи еще 12 часов. Затем кондиционированная вода (conditioned water, CW) фильтровалась через фильтр с ячеей 0,2 мкм (Millipore) и использовалась немедленно или хранилась в холодильнике. В контороле воду аналогичным образом кондиционировали, используя улиток без предварительной пищевой депривации.

Для проверки стабильности CW ее нагревали до 80°С в течение 10 минут, кипятили в течение 10 минут и замораживали до -20°С на срок до 1 месяца. Кроме того, для проверки возможного участия кислорода в феномене торможения развития эмбрионов помещали в ФПВ после кипячения в течение 20 минут, что удаляло из нее кислород. Если вода предварительно нагревалась или замораживалась, то перед использованием ее доводили до 23 °С.

2.14. Измерения и статистическая обработка. Развивающихся эмбрионов Lymnaea раз в день фотографировали цифровой фотокамерой, соединенной с бинокулярным микроскопом МБС-10, и их максимальную длину измеряли компьютерно, используя программу Photoshop (Adobe, США). Для измерения яркости флуоресценции после реакции с глиоксиловой кислотой клетки фотографировали в эпифлуоресцентном микроскопе (Aristoplan) с одинаковой выдержкой и измеряли среднюю яркость тела нейрона при помощи програмы Photoshop (Histogram Tool). Измерения яркости после лазерного конфокального микроскопа проводили, используя штатное программное обеспечение LSM-510. Статистический анализ результатов и построение графиков осуществляли, используя программы Statistica 6 (StatSoft, США) и Grapher 3 (Golden

Software, США). Результаты представлены как средняя ± стандартное отклонение (s.d.). Достоверность отличий между группами оценивали по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Нейрогенез пресноводных легочных моллюсков (Gastropoda, Pulmonata).

3.1.1. Нормальное развитие.

Личиночное развитие пресноводных моллюсков большого прудовика, L. stagnalis, и аквариумной катушки, Н. trivolvis, было детально описано ранее (Rawen, 1966; Мещеряков, 1975; Morrill, 1982; Diefenbach et al., 1991). Каждая стадия развития имеет набор характерных признаков: степень развития раковины, щупалец и ноги, положение сердца, пигментация глазков, ноги и щупалец, частота вращения эмбрионов, активность буккальной массы, частота открывания и закрывания пневмостома и скорость ползания. При этом, увеличение размеров эмбрионов точно соответствует изменению стадий развития. Эмбрионы внутри каждого кокона развиваются синхронно, однако время развития разных коконов может незначительно (и недостоверно) различаться. При температуре 24 ± 1°С время развития со стадии трохофоры (стадия 19) до ювенильного моллюска (стадия 27) составляет 6.6 ± 0.9 дней для катушки и 6.8 ± 1.1 дней для прудовика. Развитие в предварительно прокипяченной воде не отличается от контроля.

3.1.2. FМRFамид-иммунореактивные элементы у большого прудовика, L. stagnalis, и катушек, В. glabrata и Н. trivolvis.

Единичные анти-тубулин-иммунореактивные (аТ-ИР) нервные волокна у большого прудовика и катушек впервые обнаруживаются на стадии перехода от трохофоры к раннему велигеру. Иммунореакция с остальными вышеперечисленными антителами показала, что на этой стадии и у прудовика, и у катушки обнаруживаются только FМRFамид-иммунореактивные (FMRFa-ИР) нервные клетки. Двойное иммуномечение (на одном препарате выявлялись FMRFa и тубулин) продемонстрировало полное соответствие в локализации аТ-ИР и FMRFa-ИР отростков.

Рис. 1. Все самые ранние нервные элементы в нейрогенезе L. stagnalis проявляют иммунореактивность к антителам против FMRFамида. Показана схема колокализа-ции EFLRIa- (I), SEEPLY- (5) acidic peptide (А) и CARP (С) иммунореактивности в ранних нейронах эмбрионов прудовика на стадиях ранней трохофоры и велигера. Вид справа сбоку и спереди; shell - формирующаяся раковина, foot - нога. Ранние периферические транзиторные нейроны экспрессируют иммунореактивность исключительно к группе тетрапептидов.

Первыми на стадии ранней трохофоры, то есть задолго до того, как начинают формироваться зачатки ганглиев, выявляются одна-две FMRFa-ИР клетки в висцеральной области зародыша. Их тела расположены близко друг к другу, и находятся строго центрально в 31% случаев, смещены на правую сторону в 40%, и смещены влево у 29%. Несмотря на такую вариабельность в числе и расположении ранних висцеральных клеток, их морфология и дальнейшая судьба были сходны. Каждая клетка имеет длину 22-25 мкм, и от тела отходят три отростка. Два длинных отростка расходятся латерально и поворачивают вперед. Третий, короткий отросток выходит на поверхность эпителия и несет пучок ресничек. Мы назвали эти клетки c-EFAP {caudal, Early, FMRFa, Anteriorly Projecting). Когда длинные отростки c-EFAP достигают переднего отдела зародыша, иммунореакция в теле и отростках становится более интенсивной. В это время по ходу их следования, примерно в средней части, начинает выявляться симметричная пара нейронов характерной звездчатой формы (диаметр 25-28 мкм), расположенных справа и слева - г-EFAP {right) и l-EFAP {left), соответственно. В этих клетках интенсивность иммунореакции также усиливается по ходу развития. Каждая клетка посылает один из двух своих длинных отростков навстречу такому же отростку другой клетки по вентральной стороне тела эмбриона, а второй длинный отросток следует по ходу отростка клетки c-EFAP в передний отдел зародыша (Рис. 1). Короткие соматические отростки (числом до 7) достигают 25-30 мкм в длину и неравномерны по толщине.Чуть позже в местах пересечения отростков задних клеток начинают выявляться другие FMRFa-ИР клетки, которые впоследствии войдут в состав правого париетального и висцерального ганглиев (Рис. 2). В это же время на переднем полюсе зародыша дорзо-латеральнее ротового отверстия появляется еще пара клеток. Каждый нейрон биполярен, его апикальный отросток заканчивается пучком ресничек, а базальный многократно ветвится недалеко от тела клетки, создавая область тонких отростков с варикозными расширениями. Во время своего появления отростки апикальных нейронов не пересекаются с отростками нейронов задней полусферы. Впоследствии отростки апикальных нейронов входят в состав церебральной комиссуры. При достаточно сходной морфологии, апикальные нейроны прудовика и катушки демонстрируют различный химизм. У прудовика, кроме FMRFa, они содержат преимущественно DA, а также 5-НТ, а у катушки исключительно 5-НТ.

Следует отметить, что ранние нейроны: c-EFAP, r-EFAP и l-EFAP различаются как по морфологии, так и по составу экспрессируемых ими трансмиттеров. r-EFAP и l-EFAP проявляют положительную реакцию только к антителам против FMRFa. В отличие от этого, c-EFAP, помимо иммунореакции к FMRFa, проявляют положительную реакцию к антителам против CARP, а также к пептиду семейства FMRFa - EFLRIa, и не относящемуся к семейству FMRFa пептиду SEEPLY. Таким образом, клетки c-EFAP синтезируют полный набор пептидов, кодируемый экзоном II гена FMRFa, а также какой-то миомодулин-подобный пептид.

На стадии трохофоры отростки всех клеток EFAP объединяются в пучок и подходят снизу к цефалическим пластинкам (зонам эктодермы, из которых образуются церебральные ганглии). На препаратах можно наблюдать локальную инвагинацию эктодермы в этих зонах зародыша, и именно в это время в эктодерме цефалических пластинок начинается пролиферация клеток, образующих впоследствии церебральные ганглии (Nagy et al., 1998). Поэтому вполне вероятно, что именно отростки ранних клеток

(или выделяемые ими вещества) являются индукторами процесса пролиферации и дифференцировки клеток в плакодах.

На стадии раннего велигера отростки клеток EFAP прорастают дальше, поворачивают вентрально в головном отделе и достигают педальных плакод - зон закладки педальных ганглиев. По времени этот момент совпадает с началом пролиферации клеток эктодермы в этих зонах. Ход отростков нейронов EFAP полностью соответствует расположению образующихся в дальнейшем коннектив и комиссур (Рис. 1, 2). И лишь позже, на стадии среднего велигера, в местах формирования церебральных и педальных ганглиев начинают выявляться 5-НТ-, ОА- и ТН-ИР клетки. В процессе развития число клеток в ганглиях увеличивается. На стадии среднего велигера также начинают выявляться периферические нейроны, расположенные в ноге, а затем и в других областях тела зародыша. Отростки всех появляющихся клеток следуют в составе уже сформированных тяжей, образованных отростками клеток EFAP. Ни одна из клеток EFAP не входит в состав ни одного из формирующихся ганглиев дефинитивной нервной системы. Они все перестают иммуноцитохимически выявляться после вылупления ювенильной особи из яйцевых оболочек. Отростки клеток, а затем и тела дегенерируют.

3.1.3-4. Экспрессия пептидов семейства FMRFa в развитии L. stagnatis.

Исследовалось распределение EFLRIa-, SEEPLY-, АСР- и CARP-иммунореактив-ности. Первые EFLRIa- и FMRFa-ИР клетки появляются в ЦНС при начале метаморфоза (Е50). Оба антитела выявляют 3 клетки в формирующемся правом париетальном ганглии (RPaG) и 2 клетки в формирующемся висцеральном ганглии (VG). В каждом ганглии одна из клеток иммунореактивна также и к АСР (EFLRIa/ACP), а остальные (два нейрона в RPaG и один в VG) к SEEPLY (EFLRIa /SEEPLY). Все эти нейроны имеют неправильную форму тела, а их отростки проходят по путям, проложенным ранними клетками. У преметаморфных велигеров (Е45) EFLRIa-ИР клетки в RPaG и VG расположены симметрично на правой и левой стороне эмбриона. При метаморфозе группа в зачатке VG смещается вентрально, а группа в зачатке RPaG смещается направо и дорзально, так что их отростки образуют фигуру, похожую на восьмерку. То есть у постметаморфных, но еще не вылупившихся улиток Lymnaea (стадия Е75) наблюдается пересечение зачатков висцеральных коннектив или так называемая хиастоневрия. В процессе дальнейшего развития все ганглии висцеральной дуги смещаются ростродорзально, частично раскручиваются и, в конце концов, располагаются вокруг пищевода. Таким образом, анатомия ЦНС приобретает характерную для взрослого моллюска организацию только при вылуплении.

На ранней постметаморфной стадии Е65 всего 9 клеток, экспрессирующих пептиды, кодируемые геном FMRFa, выявляется в VG, RPaG и PeG, а в остальных ганглиях присутствуют лишь иммунореактивные отростки в нейропиле (Рис. 2). Все эти нейроны иммунореактивны к антителам против FMRFa. При этом, 2 клетки в PeG также реактивны к EFLRIa, а две другие клетки реактивны к SEEPLY. Два нейрона в RPaG и VG экспрессируют и EFLRIa, и АСР, а три нейрона в RPaG и VG показывают колокализацию иммунореактивности к EFLRIa и SEEPLY. Колокализации иммунореактивности к SEEPLY и АСР не обнаружено ни в одном нейроне. В дополнение к этому, 4 клетки (по одной в каждом CG, одна в RPaG и одна в VG) демонстрируют иммунореактивность к CARP. Это небольшое число центральных нейронов дает множество отростков, идущих на периферию.

EFLRI SEEPLY ACP

Рис. 2. Схема распределения EFLRIa-, SEEPLY- и acidic peptide (АСР) иммунореактив-ных клеток у ранних постметаморфных (Е65, верхний ряд) и поздних постметаморфных (Е90, нижний ряд) эмбрионов прудовика; вид спереди. Ганглии: В буккальный, LPa левый париетальный, RPa правый париетальный, Ре педальный, V висцеральный, а передний, с центральный задний, / левый задний, r правый задний ранние периферические нейроны, ее церебральная комиссура.

В течение последних двух дней перед вылуплением (Е75-Е100) к уже имеющимся иммунопозитивным нейронам в ЦНС добавляется ограниченное число клеток, иммунореактивных к EFLRIa и SEEPLY, но не к АСР (Рис. 2, нижние схемы). Перед вылуплением (Е90-Е95) на периферии появляется больше нейронов и отростков, и этот процесс продолжается у вылупленцев и ювенилов стадии Р1. Иннервация периферии частично исходит от центральных EFLRIa/FMRFa- и CARP-ИР нейронов, частично от появляющихся дополнительных периферических нейронов. Многочисленные биполярные EFLRIa- и CARP-ИР нейроны появляются в ноге, щупальцах и по переднему краю мантии. Периферических клеток, иммунореактивных к SEEPLY или АСР, обнаружено не было. Обильную иннервацию варикозными EFLRIa-ИР отростками можно обнаружить в буккальной массе, слюнных железах, пищеварительном тракте и соединительной ткани, окружающей висцеральный комплекс. Группы EFLRIa-ИР клеток расположены по правой и левой стороне вдоль пищеварительного тракта, исключая желудок. В пищеварительном тракте CARP-ИР элементы не обнаружены, хотя CARP-ИР отростки имеются в соединительной ткани, окружающей висцеральную массу.

На стадии вылупления некоторые из имеющихся нейронов частично меняют первоначальную иммунореактивность, и несколько клеток добавляются к уже существующим популяциям. Два нейрона - один в VG, а другой в RPaG, которые раньше

экспрессировали иммунореактивность к EFLRIa и АСР, теперь экспрессируют исключительно иммунореактивность к АСР. Одиночный SEEPLY-ИР нейрон в LPaG начинает давать и EFLRIa иммуноокрашивание. На основании больших размеров этой клетки (диаметр во время появления 15-18 мкм), характерной морфологии, описанной выше, и локализации мы считаем, что эта клетка, по-видимому, является нейроном LP1 (Benjamin and Ings 1972; Winlow and Benjamin 1976). Еще один АСР-ИР нейрон (диаметр во время появления 20-22 мкм) появляется в VG. На некоторых препаратах у только что появившихся клеток можно видеть характерный разветвляющийся аксон, по которому мы идентифицируем их как нейрон VW1 (Benjamin and Winlow 1981; Santama et al. 1996). Таким образом, в ЦНС вылупленцев имеются 33 иммунореактивные клетки: 16 EFLRIa-ИР, 10 EFLRIa/SEEPLY-ИР, две SEEPLY-ИР и три АСР-ИР (Рис. 3, верхние схемы).

активность к acidic peptide. Стрелки на схемах нижнего ряда обозначают идентифицируемые группы клеток (Winlow and Benjamin 1976; Benjamin and Winlow 1981): Bgp, Egp, Fgp; LP1 левая париетальная клетка 1, VW1 висцеральный белый интернейрон. Ганглии: В буккальный, С церебральный, LPa левый париетальный, RPa правый париетальный, Р1 плевральный, Ре педальный, V висцеральный.

На стадии Р1 появляются многочисленные новые группы иммунопозитивных клеток. Всего обнаруживается до 223 нейронов. Среди них 171 нейрон экспрессирует EFLRIa иммунореактивность, 17 как EFLRIa, так и SEEPLY, 12 являются SEEPLY-ИР, а 23 АСР-ИР. Группы идентифицированных нейронов представлены на рисунке 3 (нижние схемы). Только на этой стадии появляются три группы клеток в VG и RPaG, которые определенно можно идентифицировать как клетки Egp, Fgp и Bgp (Winlow and Benjamin 1976; Benjamin and Winlow 1981; Bright et al. 1993; Benjamin and Burke 1994).

3.1.5-6. 5-НТ-содержащие нейроны у улиток семейств Lymnaeida и Planorbidae.

Характер расположения 5-НТ-ИР клеток был одинаковым у обоих изученных видов лимнеид (L/ stagnalis и Physa fontinalis). В большинстве случаев все тела клеток

EFLRI

SEEPLY

АСР

Рис. 3. Карта распределения нейронов, экспрессирующих EFLRIa, SEEPLY и acidic peptide (АСР) иммунореакти-вность в ЦНС вылупленцев (Н, верхний ряд) и ювенилов стадии PI (P1, нижний ряд) прудовика. Закрашенные клетки расположены на дор-зальной поверхности, а незакрашенные на вентральной поверхности. Стрелки на схемах верхнего ряда обозначают нейроны, в которых на инкапсулированных (эмбриональных) стадиях развития колокализована EFLRIa и acidic peptide иммунореактив-ность, а после вылупления выявляется только иммуноре-

располагались в развивающихся центральных ганглиях. Впервые клетки были обнаружены на стадии ЕЗО. Это была пара нейронов (С4) в антериодорзальном квадранте зародыша (область, соответствующая будущим церебральным ганглиям, CG) и пара нейронов (EPel) в медиальной части ноги (область будущих педальных ганглиев) (Рис. 4). Кольцо ганглиев обычно развивалось на стадии Е60. У обоих видов в процессе эмбриогенеза количество 5-НТ-ИР нейронов увеличивается уже внутри существующих кластеров. В случае неблагоприятных внешних условий (см. главу 8) 5-НТ иммунореактивность проявляется в паре периферических клеток, расположенных дорзолатерально относительно рта. Двойное окрашивание показало, что это те же клетки, которые экспрессируют пептиды семейства FMRFa, а также ТН. Иммунореакция в этих клетках также проявляется если провести предварительную инкубацию эмбрионов в предшественнике синтеза серотонина - 5-НТР.

Рис. 4. Схема распределения 5-НТ имму-нореактивных нейронов у планорбид и лимнеид на трех стадиях эмбриогенеза (30%, 45% и 60% развития). С4 - первые иммунопозитивные клетки в области будущих церебральных ганглиев (CG); EPel - первые иммунопозитивные клетки в области будущих педальных ганглиев (PG); TS1 - транзиторные серотонинерги-ческие клетки, расположенные вне ЦНС.

Паттерн 5-НТ-ИР клеток в эмбриональном развитии планорбид отличается от паттерна лимнеид тем, что у всех трех изученных видов (P. corneus, P. plamorbis и Н. trivolvis) первые иммунореактивные клетки всегда обнаруживаются вне будущей ЦНС. На стадии ЕЗО дорзолате-рально от рта выявляется симметричная пара крупных биполярных клеток. Короткий отросток каждой из них проецируется в переднюю часть головы, проходит сквозь эпителий и оканчивается на поверхности. Длинный отросток проходит в ногу и там ветвится. Медиальные ветви длинного отростка каждой клетки проходят в ногу и оканчиваются варикозной сетью под медиальной ресничной полоской в ноге. Латеральные отростки ветвятся в латеральных областях ноги. На более поздних стадиях развития длинный отросток идет в церебральную комиссуру. Локализация двух ранних 5-НТ-ИР клеток остается постоянной в течение всего эмбриогенеза. Однако незадолго до вылупления (стадия Е90) иммунореакция в них исчезает. Поэтому мы называем эти нейроны транзиторными серотонинергическими TS1 (transient serotonergic 1). Других отличий в развитии серотонинергических нейронов в ЦНС между планорбидами и лимнеидами мы не обнаружили.

3.1.7-8. Катехоламин-содержащие нейроны и катехоламин-зависимое поведение в развитии Ь. stagnalis.

Основными моноаминами, обнаруженными в эмбриогенезе прудовика, были БЛ и 5-НТ, в то время как ни адреналин, ни норадреналин обнаружены не были. Содержание БЛ постепенно, но неравномерно увеличивается в течение эмбрионального развития (Рис. 5).

Рис. 5. Определение содержания моноаминов у Ь. stagnalis. А: Хроматограмма определения 10 пмоль синтетических моноаминергических стандартов: норадреналин (МБ), адреналин (Е), дофамин (БЛ), изопротеренол (18), и серотонин (5-НТ) и определение дофамина, изопротеренола (внутренний стандарт) и серотонина в экстрактах на стадиях Е45, Е85 и Р4. В: Среднее содержание (± стандартная ошибка средней) в эмбрионах на разных стадиях развития. Аппроксимация по методу наименьших квадратов.

Рис. 6 Схема распределения катехоламин-ергических нейронов у L. stagnalis. На стадии Е35 и Е55 нейроны расположены только в наружной стенке тела. Обозначены транзиторные катехоламинергические клетки (ТАС), рот (mouth), раковина (shell), глаз (eye) и нога (foot) На стадии Е75 и Е95 появляются внутренние нейроны (левые рисунки) в центральных ганглиях и пищеводе (Es) Обозначены идентифицированные нейроны RPeDl и С7. Наружные нейроны (правые рисунки) локализованы в стенке тела Обозначены щупальца (Tent), церебральные (CG), педальные (PG) и буккальные ганглии (BG)

Глиоксилат- и FaGlu-индуцированная сине-зеленая флуоресценция была одинаковой и совпадала с распределением иммунореакции против ТН практически на всем протяжении эмбриогенеза Однако на

стадии Е95 появляются несколько клеток в ЦНС, которые проявляют глиоксилат- и FaGlu-индуцированную флуоресценцию, но не иммунореактивны к антителам против ТН. Первые катехоламин (КА)-ергические клетки обнаруживаются на стадии поздней трохо-форы или раннего велигера (Е32-Е35). Это две билатерально симметричные клетки 10-15 мкм в диаметре, расположенные дорзолатерально относительно ротового отверстия. От основания клеток отходят один или два длинных аксона. Они многократно ветвятся и образуют сеть варикозных отростков под ресничной апикальной пластинкой. Одиночный толстый дендритный отросток от апикальной части клетки проходит в эпителий и оканчивается пучком ресничек на границе между апикальной и цефалической пластинкой. Клетки перестают выявляться перед вылуплением, поэтому мы называем их транзиторными апикальными КА-ергическими (ТАК) нейронами. Парные ТАК клетки являются единственными КА-ергическими нейронами у эмбрионов на стадии велигера вплоть до метаморфоза. Только тогда, на стадии Е55, начинают появляться дополнительные КА клетки на периферии. Все эти клетки мелкие (5-8 мкм), биполярные, с коротким апикальным дендритом, который выходит на поверхность эпителия. Длинные базальные аксоны соседних клеток объединяются в пучки и направляются к центральным ганглиям, которые начинают формироваться к этому времени (Рис. 6).

Первые КА-ергические клетки в ганглиях ЦНС были обнаружены после окончания метаморфоза (Е75). По три нейрона выявляются в каждом церебральном ганглии. Одиночная непарная КА-ергическая клетка выявляется в правом педальном ганглии. На основании положения и проекций этой клетки в каудальную область, мы идентифицируем ее как RPeDI - дофаминергический нейрон, хорошо изученный у взрослого прудовика (Haydon and Winlow, 1981). Развитие центральной КА-ергической системы в эмбриогенезе прудовика характеризуется постоянным увеличением числа клеток.

На стадии Е15 эмбрионы начинают вращаться внутри яйцевой капсулы. На стадии Е45 велигеры начинают менять скорость вращения и останавливаться при касании стенки капсулы. Во время метаморфоза (Е55-Е70) эмбрионы постепенно переходят от вращательного движения к ползанью по внутренней поверхности яйца при помощи ноги. У них начинают проявляться частые спонтанные сокращения головы и ноги. Первые движения буккальной массы появляются на стадии Е80. На стадии Е100 животные заполняют практически всю яйцевую капсулу. Периоды полного отсутствия активности, продолжающиеся до 30 мин, сменяются такими же периодами ритмической, буккальной активности. Вылупление происходит, когда зародыш прогрызает отверстие в стенке яйца. Дыхательное поведение не коррелировало ни с каким другим поведением ни на какой стадии развития.

Все КА-ергические нейроны, которые были идентифицированы у вылупленцев, также обнаружены на стадии Р1 после того, как улитки уже вылупились из яиц. Однако на этой стадии в центральных ганглиях появляются дополнительные КА-ергические клетки (Рис. 7). На стадиях РЗ-Р6 в центральном кольце ганглиев не добавляется никаких новых популяций КА-ергических нейронов. Тем не менее, отдельные клетки добавляются к уже имеющимся группам. К стадии Р6 каждая улитка имеет всего 70-85 КА нейронов в различных парных и непарных центральных ганглиях. Кроме вышеописанных нейронов, расположенных в центральных ганглиях, обнаруживается множество периферических КА-ергических клеток, что соответствует большому количеству отростков в нервах. Эти клетки обычно мелкие (5-8 мкм) биполярные или мультиполярные с короткими

отростками, проходящими сквозь эпителий, и длинными отростками, формирующими аксональные тракты, которые идут в центральные ганглии

Рис. 7. Схема распределения ТН+ КА-ерги-ческих нейронов в ЦНС у вылупленцев (А) и на стадии Р5 (В). Церебральная комиссура (ССоm) перерезана, и церебральные ганглии (LCG и RCG) развернуты латерально. Дорзальный вид на буккальные (BG), педальные (PG), левый и правый плевральные (LP1G и ИБЮ), левый и правый париетальные (LPaG и RPaG) и висцеральный ганглий (VG). Вентральный вид на церебральные ганглии и их латеральные доли (LL). Тела ТН+-КА-ергических клеток, расположенных на этих поверхностях, закрашены. Тела клеток на противоположной поверхности не закрашены. Также показаны некоторые нервные стволы: передние педальные нервы (APeN), губные нервы внешний правый париетальный

нерв (ERPaN), внутренний правый париетальный нерв (IRPaN) и анальный нерв Показаны также идентифициро-

ванные клетки RPeDl и С7; СВС, церебро-буккальная коннектива. Линейки 100 мкм.

3.1.9-10. Октопамин в развитии Ь.

Первые октопамин-иммунореактивные (ОА-ИР) нейроны обнаруживаются после завершения метаморфоза на стадии Е85. Их число постепенно увеличивается с 15 на стадии Е85 до 33 на стадии Р6, а расположение сходно у поздних эмбрионов, ювенильных моллюсков и у молодых половозрелых улиток. С момента появления такие клетки обнаруживаются только в буккальных, церебральных и педальных ганглиях, причем наибольшее их число находится в церебральных ганглиях (Рис. 8) Ни одна из ОА-ИР клеток не демонстрирует транзиторной экспрессии нейротрансмиттера Анатомические изменения иммунопозитивных элементов сопровождаются приблизительно десятикратным увеличением концентрации ОА в процессе эмбрионального и постэмбрионального развития.

Начиная со стадии Е85 и до ювенильной стадии, в буккальных ганглиях выявляется пара нейронов и непарный нейрон среднего размера. Положение тела непарного нейрона варьирует: среди 19 исследованных животных непарный ОА-ИР нейрон в 10 случаях располагался в левом буккальном ганглии, а в 9 случаях в правом. Этот факт интересно сопоставить с аналогичный локализацией непарного КА нейрона в буккальных ганглиях. Отростки всех ОА-ИР нейронов на всех стадиях развития остаются внутри кольца ганглиев. Одновременная электрофизиологическая запись от ОА-ИР нейронов буккального ганглия (мы назвали их ОС) и от других нейронов буккального генератора позволила установить, что они участвуют в пищевом поведении (Рис. 9)

Рис. 8. Локализация ОА-ИР нейронов в ЦНС Ь. 81а£рай8 на стадии Р5. Вид с вентральной стороны. BG - буккальные ганглии; CG - церебральные ганглии; PdG -педальные ганглии; PaG - париетальные ганглии; VG - висцеральный ганглий 1 -правый плевральный ганглий; 2 - левый плевральный ганглий; те - церебральная комиссура; cbc - церебро-буккальная коннектива; L - левый ганглий пары; R -правый ганглий пары. Линейка 100 мкм.

Когда в ЦНС отсутствует ритмическая жевательная активность, для нейронов ОС обычно характерна серия возбуждающих синаптических входов или потенциалов действия. После начала жевательного ритма эти входы приводят к возникновению пачек потенциалов действия. Когда внутриклеточная стимуляция одного из модуляторных интернейронов {SO, NIM, или NIL) вызывала фиктивное жевание, нейроны ОС также участвовали в ритмической активности нейронов пищевого генератора. Они сначала затормаживались в фазе N2 (втягивание), затем начинали деполяризоваться и спайковать во время фазы N2 и в течение всей фазы N3 (глотание). Нейроны ОС также демонстрировали комплексное модуляторное воздействие на активность других изученных пищевых мотонейронов (Рис. 9).

Рис. 9. Активность нейронов ОС, зарегистрированная одновременно с активностью нейронов пищевого генератора. А. Одновременная запись от мотонейрона В1 и нейрона ОС демонстрирует корреляцию спонтанной активности. В. За спонтанными пачками в интернейроне NIM следуют серии спайков в нейроне ОС. С. Пищевой ритм, вызванный внутриклеточной стимуляцией модуляторного интернейрона SO, сопровождается пачкой в нейроне ОС. D. Интернейрон SO и нейрон ОС синхронно активны. Фазы пищевого цикла обозначены номерами 1, 2 и 3.

Обсуждение.

Наши данные ясно показывают, что самые первые три FMRFa-ИР клетки {c-EFAP; r-EFAP и 1-EFAP) в нейрогенезе пресноводных пульмонат появляются значительно раньше, чем считалось, а именно на стадии трохофоры, и расположены позади прототроха. Так как антитела против тубулина маркируют отростки всех трех клеток EFAP сразу после их появления, а кроме этого не выявляют никаких других отростков на этих и более ранних стадиях, мы делаем вывод, что c-EFAP; r-EFAP и l-EFAP являются самыми ранними нервными элементами в нейрогенезе пресноводных пульмонат. Обнаруженные торзион, хиастоневрия и деторзион, промаркированные в процессе развития прудовика отростками клеток, иммунореактивных к EFLRIa и FMJRFa, подтверждают, что отростки ранних клеток очерчивают контуры будущей дефинитивной нервной системы. Так как ранние клетки маркируют места и пути, где в дальнейшем будут дифференцироваться ганглии дефинитивной нервной системы и пройдут связывающие их коннективы и комиссуры, мы предполагаем, что они являются пионерными. Эти клетки в определенный период развития прекращают синтезировать характерный нейротрансмиттер, их отростки дегенерируют, и тела клеток пропадают, то есть клетки являются транзиторными.

Расположение ранних FMRFa-ИР нейронов в нейрогенезе планорбид представляет собой зеркальное отражение нейрогенеза лимнеид, и все три клетки EFAP у них легко различимы. То, что у всех видов эти клетки расположены сзади, имеют сходную морфологию, посылают отростки вперед, и пропадают после вылупления, позволяет предположить, что они являются гомологичными для гастропод.

Среди задних нейронов только одна клетка - задняя центральная - была иммунореактивна к трем антителам: EFLRIa, SEEPLY и CARP, в то время как четыре других нейрона были реактивны только к EFLRIa В дополнение к этому, два нейрона в зачатке RPaG и LPaG были иммунореактивны к CARP. Такое распределение иммунореак-тивности к EFLRIa и CARP показывает, что, во первых, антитела против EFLRIaмидa выявляют только пептиды, относящиеся к семейству FMRFa, и не выявляют пептиды семейства миомодулина, по крайней мере, в эмбриональных тканях. Во вторых, на преметаморфных стадиях пептиды семейства FMRFa, по-видимому, коэкспрессируются с пептидами семейства миомодулина в центральном заднем нейроне. Только два передних нейрона и центральный задний, но не левый и правый задние нейроны также иммунореактивны к нейрокальцину, принадлежащему к суперсемейству кальций связывающих белков (Dickinson and Croll, 2001). Такие различия в морфологии и трансмиттерной специфичности позволяют предположить различные функции для центральной и боковых задних клеток.

Ранние периферические транзиторные нейроны прудовика экспрессируют иммуно-реактивность исключительно к группе тетрапептидов. Мы предполагаем, что в этой группе ключевую роль в процессе раннего морфо- и эмбриогенеза играют EFLRIa подобные пептиды.

Всего 32 FMRFa-ИР нейрона было обнаружено у улиток перед вылупленном. Интересно, что два из них экспрессируют иммунореактивность к EFLRIa и АСР, но не маркируются антителами к SEEPLY или CARP. Таким образом, кросс-реактивность антител против EFLRIa с миомодулин-подобными пептидами представляется маловероятной. Более вероятно то, что два транскрипта гена FMRFa - один, кодирующий

первично тетрапептиды, а другой гептапептиды - коэкспрессируются в этих нейронах на инкапсулированных стадиях развития. После вылупления эти клетки сохраняют иммунореактивность только к антителам против АСР. В результате, у молоди и взрослых улиток нейроны взаимоисключающе экспрессируют транскрипт или типа 1, или типа 2, как это было ранее показано для взрослых прудовиков (Bright et al. 1993). После вылупления улиток, число клеток, экспрессирующих FMRFa-подобные пептиды, увеличивется приблизительно в семь раз. Многочисленные клетки и группы клеток появляются на первых ювенильных стадиях, и новые нейроны непрерывно добавляются в ЦНС в процессе дальнейшего развития. Это в корне отличается от онтогенеза других трансмиттерных систем, изученных у прудовика. Практически все идентифицированные группы 5-НТ-, DA - и ОА-содержащих нейронов к моменту вылупления уже появляются, и новые клетки добавляются в уже существующих кластерах (Croll and Chiasson 1989; Elekes et al. 1996; Voronezhskaya et al. 1999; Croll et al. 1999, см. дальше).

Время появления и паттерн развития 5-НТ-ИР клеток в ЦНС схожи у всех изученных видов. В этом плане наши данные подтверждают и дополняют результаты, полученные ранее на L. stagnalis Маруа и Кроллом (Marois and Croll, 1992), а также на Н. trivolvis Гольдбергом и Катером (Goldberg and Kater, 1989). Однако Гольдберг и Катер предположили, что первая пара 5-НТ иммунореактивных клеток у Н. trivolvis - это зачатки церебральных нейронов С1. Это предположение противоречит данным, полученным для других гастропод. Во первых, в эмбриогенезе аплизии и прудовика клетки С1 появляются много позже, чем клетки СЗ-С6 (Marois and Carew, 1989; Marois and Croll, 1992). Bo вторых, наши результаты показывают, что клетки, описанные Гольдбергом и Катером как С1 в действительности локализованы вне ЦНС и иммунореакция в них пропадает перед вылуплением. Эти нейроны явно транзиторные и не соответствуют паре клеток С1. С учетом наших данных в последующих работах вышеназванных авторов ранняя серотонинергическая клетка у Helisoma называется ЕС1 (embryonic cell 1). Мы не смогли обнаружить у лимнеид нейронов, соответствующих клеткам TS1. Однако схожие ранние катехоламинергические клетки описаны нами у Lymnaea.

Окрашивание антителами против 5-НТ не позволяет увидеть процесс постепенной деградации клеток 757. Однако, для гомологичных 5-НТ-ергических клеток апикального органа было доказано, что они редуцируются после метаморфоза (Marois, Carew, 1997). Соответствующая деградация была также отмечена нами для FMRFa- и КА-ергической клетки ТС1 у Lymnaea.

Из всех катехоламинов только DA был обнаружен нами у эмбрионов прудовика методом HPLC. Изменения в концентрации DA в процессе развития коррелируют с появлением основных популяций клеток, демонстрирующих как иммунореакцию к антителам против ТН, так и гистохимическую реакцию с глиоксиловой кислотой и FaGlu.

Одно из сильных отличий КА-ергического фенотипа от других медиаторных фенотипов (например 5-НТ-, FMRFa-, или ОА-ергического), изученных у гастропод, состоит в том, что подавляющее большинство нейронов, которые появляются в эмбриогенезе, расположены на периферии. Первая пара КА-ергических клеток (ТАК нейроны) расположена под апикальной пластинкой, лежащей дорзальнее рта. Время появления и общая морфология этих клеток совпадает с описанными нами FMRFa-ИР клетками. Двойное иммуномечение показало, что они иммунореактивны к антителам против FMRFa и ТН, а также дают слабую реакцию с антителами к 5-НТ. По локализации

и строению ТАК клетки очень похожи на транзиторные 5НТ-ергические клетки (ТС1) описанные нами в эмбриогенезе планорбид. В дополнение к характерному набору нейротрансмиттеров эти клетки имеют определенную морфологию. Наличие толстого дендрита с пучком ресничек позволяет предположить для этих клеток первичную сенсорную функцию. Роль этих нейронов в процессе эмбриогенеза будет обсуждаться далее. И ТАК, и ТС1 клетки располагаются дорзальнее рта и не входят в состав центральных ганглиев. Они имеют относительно большое тело булавовидной формы и реснички на конце первичного дендрита, который выходит на поверхность тела. Эти данные позволяют считать, что эти клетки являются частью апикального органа, редуцированного у этих видов гастропод в связи с инкапсулиованным типом развития. И ТАК клетки у прудовика, и ТС1 клетки у планорбид исчезают перед вылуплением. Пара моноаминергических нейронов, которые появляются до формирования ЦНС, синтезируют серотонин, иннервируют реснички и дегенерируют после метаморфоза, описана у личинок различных моллюсков (Goldberg and Kater, 1989;; Diefenbach et al., 1998; Kempf et al., 1997; Marois and Carew, 1997; Kuang and Goldberg, 2001; Page, 2002; Koss et al., 2003). Общепринято, что эти нейроны являются частью личиночного апикального сенсорного органа - чрезвычайно консервативной нервной структуры, характерной для трохофорных животных.

Следует отметить, что клетки ТАК и ТС1 отличаются друг от друга не только медиаторным содержанием, но и морфологией. Отростки клеток ТАК оканчиваются под ресничной апикальной пластинкой. У планорбид же ресничная апикальная пластинка отсутствует, и клетки ТС1 проецируются под основание ресничных участков развивающейся ноги.

Следующая популяция КА-ергических клеток также появляется на периферии тела эмбриона в эпителии ноги и щупалец, а позже в эпителии губ. Эти клетки появляются раньше любых центральных КА-ергических нейронов и поэтому служат единственным источником катехоламинов в развивающейся ЦНС в течение значительной части эмбриогенеза. Эти клетки несомненно являются сенсорными, но их модальность остается неясной. Очевидна, однако, их важная роль, поскольку они продолжают существовать и после вылупления, а в период эмбриогенеза служат основным источником КА в ЦНС.

Первые центральные КА-ергические нейроны появляются в церебральных и педальных ганглиях на стадии Е75 - уже после завершения метаморфоза. Дополнительные группы нейронов в церебральных, педальных и буккальных ганглиях появляются перед вылуплением. КА-ергические нейроны и группы нейронов прослеживаются у прудовиков от вылупления до половозрелости. В течение постэмбрионального периода происходит мало изменений в их количестве и размерах.

Целью регистрации поведенческих изменений было не только получить данные о развитии КА-ергического контроля поведения, но и попытаться изучить поведенческий аспект нейрогенеза как таковой. Так, первоначально непрерывное вращение ранних эмбрионов, по-видимому, не зависит от нейронального контроля, и появление ТАК клеток не вызывает изменений. Это также отмечалось ранее у планорбид (Diefenbach et al., 1991). Изменения во вращательном движении возникают на стадии Е45 и, по-видимому, связаны с появлением других клеток, таких как первые 5-НТ-ергические нейроны, иннервирующие ресничные участки ноги. Точно так же, возникновение реакции прикрепления ногой и ползания коррелирует с появлением дополнительных 5-НТ-ергических нейронов.

Появление многочисленных сенсорных нейронов на периферии совпадает с появлением локальных сокращений стенки тела и развитием сложных движений, например, поворачивания. Первые спорадические буккальные движения наблюдаются на стадии Е85, когда первые аксоны КА-ергических церебро-буккальных нейронов появляются в буккальных ганглиях. К этому же времени в буккальную область прорастают и отростки 5-НТ-ергической клетки Cl (Marois and Croll, 1992). Буккальный цикл прудовика полностью формируется на стадии Е95, когда первые КА-ергические клетки начинают выявляться в буккальных ганглиях. В это же время, как мы показали, в ганглиях впервые появляются и ОА-ергические нейроны. Первые движения пневмостома регистрируются раньше, чем появляется клетка RPeDl, считающаяся ведущей в генераторе дыхательного ритма (Syed et al., 1990). Однако полное закрытие пневмостома и появление ритмической активности коррелирует с появлением этой клетки. Развитие же более регулярного ритма и последующее подавление ритмичности, чего можно ожидать от улитки под водой, вероятнее всего, обеспечиваются появлением дополнительных нейронов в дыхательной нейрональной цепи.

Наши иммуноцитохимические и биохимические данные показывают, что ОА-ергические нейроны присутствуют в развивающейся ЦНС L. stagnalis. Первые такие нейроны появляются на поздней эмбриональной стадии Е85 и их распределение и проекции не меняются в течение всего эмбрионального и постэмбрионального развития. Расположение клеточных кластеров хорошо согласуется с известным для ЦНС взрослых прудовиков (Elekes et al., 1993). Ни одна из ОА-ИР клеток не демонстрирует транзиторной экспрессии нейротрансмиттера. ОА-ергические нейроны буккальных ганглиев участвуют в модуляции пищевого поведения прудовиков.

Среди гастропод, пресноводные пульмонаты обладают видоизмененным типом развития: они не имеют свободноплавающей личинки, и все развитие проходит внутри яйца. Поэтому необходимо было проверить, существуют ли аналогичные ранние нервные элементы у других гастропод, с более типичным для Trochozoa развитием.

3.2. FMRFaмид, серотонин- и катехоламин-содержащие нейроны в развитии Aplysia californica (Gastropoda, Opisthobranchea).

Впервые две биллатерально симметричные пары FMRFa-ИР клеток появляются у аплизии на стадии трохофоры в задней части зародыша. Отростки отходят ипсилате-рально и вперед от тел правых (F-r1 и F-r2) и левых (F-l1 и F-l2) клеток. На стадии раннего велигера они пересекают среднюю линию, формируют комиссуру в передней части тела, затем поворачивают и заканчиваются в ноге. Первоначально обе пары FMRFa-ИР клеток расположены симметрично, но затем постепенно смещаются, и к стадии велигера все переходят на правую половину тела (Рис. 10).

FMRFa-ИР клетки и отростки также выявляются при помощи антител против EFLRIa. Антитела против SEEPLY и АСР не выявляли никаких структур ни на этой, ни на более поздних стадиях развития. На стадии среднего велигера появляются FMRFa-ИР клетки в областях, ранее идентифицированных как развивающиеся ганглии дефинитивной ЦНС аплизии - церебральные, педальные и плевральные. Судьбу ранних каудальных клеток аплизии нам проследить не удалось С уверенностью можно сказать только, что они не входят в состав формирующихся центральных ганглиев (Рис. 10).

Пять 5-НТ-ИР клеток выявлялось в апикальном органе к стадии велигера. Их отростки образуют плотный нейропиль с варикозами непосредственно над церебральной

комиссурой. На стадиях вплоть до позднего велигера не было обнаружено 5-НТ-ИР иннервации ресничек велума. КА-содержащие клетки выявлялись у велигера исключительно на периферии - около рта и в ноге. Отростки от всех этих клеток отходят в район под апикальным султанчиком ресничек, где расположены FMRFa-ИР комиссура и 5-НТ-ИР нейропиль.

Считалось, что в нервной системе Opisthobranchea отсутствует торзион (поворот ганглиев висцеральной дуги с образованием восьмеркообразной фигуры), так как нейрогенез начинается только после завершения торзиона, которому подвержены другие органы развивающейся личинки (Kandel et ah, 1981). Действительно, возникающие у велигера зачатки ганглиев и развившаяся впоследствии дефинитивная нервная система у этих моллюсков имеют выраженную билатеральную симметрию (Kriegstein, 1977; Schacher et ah, 1979). В нашем исследовании обнаружены клетки и отростки, появляющиеся в развитии до начала торзионного процесса. Следует отметить, что первоначально расположенные симметрично, клетки постепенно сдвигаются на правую сторону, а их отростки, хотя и не перекрещиваются, но образуют перекрученную восьмеркообразную петлю. То есть в развитии ранних нервных клеток присутствует, хотя и в нерезко выраженной форме и торзион, и деторзион, ранее только предположенные для Opisthobranchea на основании филогенетических исследований.

А DAY 2.5 В DAY4 С DAY 5 DDAY9

ТгосЬорЬоге \/еНдег

Рис. 10. Схематическое изображение FMRFa-ИР клеток и отростков у эмбрионов Aplysia californica. Верхний ряд: вид с правой стороны и немного сверху, чтобы показать трехмерную перспективу; нижний ряд: вид с дорзальной стороны. Передний конец эмбрионов повернут направо. А. Две пары расположенных сзади FMRFa-ИР клеток, дающих отростки вперед; 2.5 дня от начала развития. В. FMRFamide-ИР клетки и отростки ко дню 4. Отростки достигли переднего конца тела и формируют плексус под апикальным султанчиком. С. Начиная с пятого дня, FMRFa-ИР клетки расположены несимметричко, клетки слева (И и 2) расположены вентрально, а клетки справа (г1 и г2) дорзально. D. Ко дню 9 появляются дополнительные клетки (ВО-1, ВО-2, ВО-3) в передней части тела.

Таким образом, в процессе эмбрионального развития заднежаберного брюхоногого моллюска A. californica формируется хорошо развитиая личиночная нервная система. Она включает задние FMRFa-ИР клетки, появляющиеся на стадии трохофоры. На стадии велигера появляются 5-НТ-ИР клетки в апикальном огане, а незадолго до вылупления появляются КА-содержащие клетки вокруг рта и в ноге. Первые нейроны в развивающихся ганглиях дефинитивной ЦНС появляются на более поздних стадиях. Такая организация нервных элементов схожа с тем, что было обнаружено нами у репрезентативных представителей легочных гастропод.

3.3. Локализация серотонина и его роль у ранних зародышей Tritonia diomedea (Gastropoda, Opisthobranchea).

Впервые специфическая иммунореакция появляется у эмбрионов тритонии на стадии 1 бластомера. Пятно с более яркой флуоресценцией обнаруживается в цитоплазме на анимальном полюсе у примерно 60% оплодотворенных яиц На стадии 2 и 4 бластомеров реакция выявляется на анимальном полюсе в цитоплазме поблизости от борозды дробления. На стадии 8 и 16 бластомеров реакция обнаруживается в микромерах в цитоплазме, прилегающей к ядру. На стадиях морулы и бластулы иммунореакция выявлялась в группе микромеров на анимальном полюсе. Начиная со стадии ранней гаструлы, никакой специфической иммунореакции не обнаруживалось вплоть до стадии раннего велигера. У 1-3% велигеров выявлялась одна клетка со слабой иммунореакцией в районе формирующегося апикального органа. После прединкубации в 5-НТР в районе апикального органа обнаруживалось три клетки.

Все протестированные агонисты 5-НТ рецепторов, включая АА-5-НТ, ЕРА-5-НТ и DHA-5-HT, в концентрации 50-100 мкМ не оказывали никакого влияния на развитие тритонии по крайней мере до окончания гаструляции. Антагонисты 5НТ2 рецепторов ритансерин (5-20 мкМ) и ципрогептадин (40-80 мкМ) вызывали сильные цитостатические и тератогенные эффекты. Эти лиганды ингибировали или блокировали первые деления дробления и вызывали преждевременное формирование микромеров. Их действие было концентрационно зависимым 5НТ и а-СНз-5-НТ (40-80 мкМ) ослабляли действие этих лигандов и продлевали развитие эмбрионов на один-два клеточных цикла.

5-HTQ и 2-СНз-5-НТ в концентрации до 100 мкМ не уменьшали чувствительность эмбрионов к ритансерину и ципрогептадину. АА-, ЕРА- и DHA-5-HT в концентрации равной или большей, чем концентрация антагонистов 5-НТ, защищали эмбрионов полностью или почти полностью, в то время как более низкие концентрации этих веществ были неэффективными. Антагонисты 5-HT1A и 5-НТз рецепторов, в частности, pindobind-5-HT1a, NAN-190, l-(m-chlorophenyl)-biguanide и tropisetron (RBI, США) в концентрации до 100 мкМ не нарушали раннее развитие тритонии.

Таким образом, впервые была показана специфическая иммунореакция к 5-НТ в ранних зародышах, начиная со стадии одного бластомера. Мы считаем, что эта реакция показывает присутствие эндогенного вещества, вероятно самого 5НТ. Обращает на себя внимание то, что специфическая иммунореакция к 5НТ не распределена гомогенно в цитоплазме на стадии одного бластомера и позже. Сначала она выявляется в основном около анимального полюса, а в дальнейшем (при делениях дробления и образовании бластулы) в микромерах и их потомках, причем концентрируется в цитоплазме около борозд дробления. Схожая локализация 5НТ-подобного вещества вдоль борозд дробления была ранее продемонстрирована авторадиографически в эмбрионах полихеты

Ophryotrocha labronica после инкубации в Н-5-НТР (Emanuelsson 1974, 1992). Обнаруженное нами исчезновение регистрируемых количеств 5-НТ во время гаструляции было также показано ранее в различных группах животных (немертины, полихеты, брюхоногие моллюски и морские ежи) другими методами (Buznikov 1967).

Иммунореактивность к 5-НТ вновь появляется у эмбрионов тритонии после гаструляции на стадии раннего велигера в нейронах формирующегося апикального органа. Ранее для ряда видов моллюсков было показано, что 5-НТ-ергические клетки апикального органа появляются одними из первых (Marois and Carew, 1997a; Kempf et al., 1997; Page and Parries, 2000; и другие). При этом известно, что эти клетки приобретают свою трансмиттерную специфичность через несколько дней после дифференцировки (Marois and Carew, 1997b). На основании наших экспериментов с прединкубацией эмбрионов в 5-НТР мы предполагаем, что биохимический механизм синтеза 5-НТ уже присутствует на стадии раннего велигера. Таким образом, прединкубация в предшественнике синтеза - это удобный способ выявить эти клетки до того, как они начнут синтез 5-НТ в нормальных условиях.

То, что иммунореактивность к 5-НТ меняет свою локализацию в бластомерах в процессе развития, исчезает во время гаструляции, а потом появляется вновь, является косвенным свидетельством того, что эндогенный 5-НТ функционально активен на ранних стадиях эмбриогенеза. То, что реакция локализована вблизи борозд дробления, позволяет предположить возможное участие 5-НТ в регуляции клеточных делений. Фармакологические эксперименты дают прямое доказательство фунциональной активности 5-НТ на донервных стадиях развития эмбрионов тритонии.

3.4. Нейрогенез хитона Ischnochiton hakodadensis (Polyplacophora).

Хитоны являются наиболее примитивными моллюсками и, как следствие этого, представляют большой интерес для понимания основных закономерностей развития и филогении трохофорных животных. Развитие /. hakodadensis типично для хитонов. Из яйца вылупляется трохофора с хорошо развитым прототрохом и апикальным сенсорным органом и начинает плавать апикальным концом вперед, вращаясь вокруг продольной оси. Вскоре на дорзальной стороне появляются семь поперечных валиков, а на вентральной стороне формируется нога. Личинка оседает через 90-100 часов после оплодотворения, прототрох и апикальный орган редуцируются, и молодой моллюск начинает ползать и питаться. Первыми нервными элементами, дифференцирующимися в процессе онтогенеза, являются четыре периферических хемосенсорных нейрона, расположенные попарно по бокам эписферы (rl 1-2; ll 1-2; Рис. 11). Строение этих клеток идентично строению так называемых ампулляторных клеток - хемосенсорных нейронов часто встречающихся у различных трохофорных животных. У хитона эти клетки появляются непосредственно перед вылуплением и демонстрируют иммунореактивность как против 5-НТ, так и FMRFa. Аксоны этих клеток проецируются в зону будущего церебрального ганглия (в основании развивающегся апикального органа), прорастают в контролатеральную половину тела и поворачивают вниз и назад, маркируя положение будущих парных педальных (вентральных) нервных стволов. Таким образом, уже при вылуплении трохофоры аксоны первых хемосенсорных клеток маркируют контур будущих основных нервных центров, которые начнут развиваться значительно позже.

Примерно через пять часов дифференцируются новые нервные клетки. И опять это периферические хемосенсорные нейроны - четыре сенсорные клетки на дорзальной

стороне эписферы, которые также иммунореактивны к FMRFa и 5-НТ (Ых 1-4; Рис. 11-12). Еще через пять часов появляются первые нейроны в апикальном сенсорном органе -четыре FMRFa-ИР сенсорные клетки, восемь 5-НТ-ИР сенсорных клеток, две FMRFa-ИР несенсорные клетки и две несенсорные клетки иммунореактивные к обоим медиаторам (соответственно, клетки ах 1-4; ах 7-14; гЬа 2; 1Ьа 2; гЬа 1; 1Ьа 1 на Рис. 11-12).

Рис. 11. Схема развития FMRFa-ИР нейронов в онтогенезе хитона /. ИакоЫаЫетю. Указано время в часах ф) после оплодотворения. Первыми появляются клетки г1 1-2, II 1-2, и /к 14. Через 30-40 часов после оплодотворения появляются клетки ах 1-6, гЬа 1,2, и 1Ьа 1,2, и набор личиночных нейронов становится полным (впоследствии добавляются только периферические сенсорные клетки в передней полусфере. Начинает развиваться дефинитивная нервная система. Первые клетки в церебральном ганглии и педальных стволах появляются примерно через 40 часов, а в плевровисцеральных стволах через 50 часов. Через 120 часов (10 часов после оседания) все личиночные нейроны исчезают.

До двенадцати клеток меньшего размера появляется в эпителии латеральной и дорзолатеральной части претрохального полушария. В это же время первые FMRFa-ИР волокна начинают прорастать из нейропиля апикального органа в область будущих педальных стволов. Одновременно с этим на вентральной и на дорзальной стороне эписферы появляются две группы из четырех сенсорных 5-НТ-ИР клеток (ш 1-4; /к 5-8; Рис. 12). Вскоре в основании апикального сенсорного органа появляется еще одна пара несенсорных 5-НТ-ИР клеток (гЬа 3 и 1Ьа 3; Рис. 12) и пара дорзолатеральных сенсорных нейронов (гЫЬи ЫЪ; Рис. 12).

В дальнейшем количество FMRFa-ИР нейронов в личиночной нервной системе начинает быстро увеличиваться, и примерно через 10 часов первые FMRFa-ИР нейроны начинают дифференцироваться в формирующемся церебральном ганглии дефинитивной нервной системы. Волокна в педальных стволах дорастают до заднего конца тела, и стволы соединяются, а по ходу этих стволов дифференцируются пять пар FMRFa-ИР сенсорных нейронов.

ventral (С dorsal / Г ventral dorsal

Рис. 12. Схема развития 5-НТ-ИР нейронов в онтогенезе хитона /. hakodadensis. Указано время в часах (Ь) после оплодотворения. Через 24 часа после оплодотворения набор клеток идентичен БМИБа-ИР (г1 1-2, И 1-2, 1-4) плюс клетки as 7-14, vs 1-4 и А 4-8. Через 30 часов появляются клетки гЬа 3, 1Ьа 3, гЫЫ и 1ЫЬ, набор нейронов личиночной нервной системы становится полным, и начинает формироваться дефинитивная нервная система. Первыми появляются нейроны и отростки в педальных стволах (рс), затем в церебральном ганглии и плевровисцеральных стволах рс). Через 50 часов появляется плексус в передней части развивающейся ноги и каудальный плексус. Иммунореакция в клетках г1-2 и II 1-2 исчезает. Через 120 часов (10 часов после оседания) все личиночные рейроны исчезают.

Набор 5-НТ-ИР нейронов личиночной нервной системы, наоборот, остается практически неизменным до самого оседания. Однако начинают появляться первые 5-НТ-ИР нейроны дефинитивной нервной системы. Сначала в формирующихся педальных стволах появляются иммунопозитивные клетки, причем, первые из этих клеток появляются в каудальной части стволов. Их отростки растут вперед, но довольно долго не соединяются с передними 5-НТ-ергическими элементами. Затем появляется первая пара нейронов в церебральном ганглии (с1 и с2; Рис. 12), отростки 5-НТ-ИР клеток прорастают во всю длину вентральных стволов, в плевровисцеральные (латеральные) стволы и поперечные комиссуры, а также образуют плексус вдоль переднего края формирующейся ноги. Таким образом, к этому моменту все главные составные части дефинитивной нервной системы уже сформированы.

Далее в процессе развития БМИБа-ИР волокна появляются по всей формирующейся дефинитивной нервной системе, а именно: в церебральном ганглии, педальных стволах, плевровисцеральных стволах и поперечных комиссурах. Количество нейронов в церебральном ганглии достигает пятидесяти. Начиная с этого времени, больших изменений в строении БМИБа-ИР части нервной системы уже не происходит.

Что касается 5-НТ-ИР нервных элементов, то увеличивается количество нейронов и волокон в развивающемся церебральном ганглии, педальных стволах и плевровисце-

ральных стволах. В дополнение к переднему вентральному плексусу появляется задний вентральный плексус. Параллельно с усилением иммунореакции к FMRFa в телах нейронов rl1-2 и //1-2 происходит постепенное исчезновение реакции к 5-НТ.

Во время, непосредственно предшествующее оседанию личинок, интенсивность иммунореакции к FMRFa в апикальных сенсорных нейронах значительно возрастает, а в остальных клетках личиночной нервной системы, наоборот, уменьшается. После оседания реакция к обоим трансмиттерам во всех личиночных нейронах начинает быстро исчезать и скоро (110-120 часов с начала развития) исчезает совсем. Примечательно, что в клетках rl 1-2 и // 1-2, которые дифференцировались самыми первыми, иммунореакция к FMRFa исчезает всегда в самую последнюю очередь.

Таким образом, у трохофор хитона имеется хорошо развитая транзиторная нервная система, которая состоит из апикальных хемосенсорных нейронов и периферических сенсорных нейронов в эписфере. Мы вполне уверены, что никаких других нервных элементов у только что вылупившихся трохофор не имеется (по иммунореакции с антителами против ацетилированного тубулина). Первые из появившихся нейронов посылают базальные отростки, маркируя пути, по которым впоследствии будет формироваться дефинитивная нервная система, аналогично тому, как это было показано нами ранее для прудовика L. stagnalis (Croll, Voronezhskaya, 1996), морского блюдечка С. fornicata (Dickinson et al., 1999) и морского зайца A. californica (Dickinson et al., 2000). Первые нейроны дефинитивной ЦНС дифференцируются на значительно более поздней стадии. Личиночные нейроны прекращают экспрессировать нейромедиатор сразу после оседания и, вероятно, дегенерируют.

Известно, что строение нервной системы взрослых хитонов больше напоминает таковое полихет, чем моллюсков. Тем не менее, сценарий, по которому происходит развитие нервной системы хитона, полностью повторяет развитие нервной системы гастропод. Таким образом, данные по нейрогенезу одной из наиболее древних и примитивных групп моллюсков - хитонов - подтверждают, что базовые механизмы, лежащие в основе нейрогенеза различных групп моллюсков, крайне консервативны.

Любопытно, что не обнаружено иннервации локомоторных ресничек. Похоже, что FMRFa- и 5-НТ-ергические клетки у трохофор Ischnochiton не участвуют в регуляции локомоции. У всех видов моллюсков, изученных ранее, также не обнаружено 5-НТ иннервации прототроха у трохофор (Barlow and Truman, 1992; Dickinson et al., 1999; 2000). Однако, на стадии велигера, которая у хитонов отсутствует, веллюм уже иннервируется 5-НТ-ергическими клетками (обзор литературы см. Page and Parries, 2000), и показано, что серотонин стимулирует локомоторные реснички (Koshtoyants et al., 1961; Diefenbach et al, 1991; Beiras and Widdows, 1995). По-видимому, ресничная локомоция на стадиях трохофоры и велигера контролируется различными механизмами.

3.5. Нейрогенез полихеты Phyllodoce maculata (Phyllodocidae).

Развитие филлодоце типично для полихет. Из яйца вылупляется сферическая трохофора с экваториально расположенным прототрохом и апикальным султанчиком длинных ресничек. После вылупления появляются дополнительные ресничные структуры: акротрох (ресничный воротничок вокруг апикального султанчика), пять ресничных полей на вентральной стороне эписферы, нейротрох и реснички в пищеводе. Начиная со стадии поздней трохофоры, исчезает апикальный султанчик, и развивается ресничное кольцо вокруг ротового отверстия.

Рис. 13. Схема развития 5-НТ- (А) и БМИБа- (В) ИР нервных элементов в личиночном онтогенезе Р. шасШМа до момента вылупления. Указано время в часах (Ь) после оплодотворения. А. Первый нейрон - это одиночная хемосенсорная каудодорзальная 5-НТ-ИР клетка spl. Затем появляются сенсорные клетки sdl и sd2. Их базальные отростки вместе с отростками клетки spl образуют кольцевой нерв прототроха. Одновременно появляется первый серотонинергический нейрон в апикальном сенсорном органе. Ко времени вылупления (60 часов) появляются еще нейроны в апикальном органе, сенсорные клетки вокруг рта и на заднем конце тела (клетка 8р2), sll - непарный серотонинергический латеральный нейрон; spt - серотонинергическая претрохальная клетка В. Первая РМИРа-ИР сенсорная клетка (/а1). Через 52 часа там же появляются клетки/а2~/а4 и хемосенсорная клетка/\>1. Вскоре (56 часов) появляются две сенсорные клетки на заднем конце тела. Одна из них (р I) посылает базальный отросток, маркирующий положение будущего вентрального ствола и церебрального ганглия, а другая (/р2 очерчивает будущее окологлоточное нервное кольцо, окружающее ротовое отверстие (то).

Первый одиночный 5-НТ-ИР нейрон появляется задолго до вылупления ^р 1, Рис. 13) Это сенсорный нейрон с одним коротким апикальным и двумя тонкими базальными отростками Оба базальных отростка отходят вентролатерально, достигают вентральной области, поворачивают вперед и начинают расти в направлении переднего конца тела. Когда они достигают уровня прототроха, каждый раздваивается и оба отростка идут вдоль прототроха в его основании навстречу друг другу. Антитела против тубулина также маркировали тело и отростки этого нейрона При этом никаких других нервных элементов

обнаружено не было. Поэтому, мы вполне уверены, что эта клетка является первым нейроном, дифференцирующимся в процессе онтогенеза.

В дальнейшем, на дорзальной стороне появляются еще две 5-НТ-ИР сенсорные клетки [sdl и sdl). Базальные отростки этих клеток замыкают нерв прототроха. Еще через 2-4 часа появляется первая 5-НТ-ИР клетка в апикальном сенсорном органе.

Первый нейрон иммунореактивный к FMRFа появляется в апикальном сенсорном органе через 48 часов после оплодотворения (fa1). Вскоре к нему добавляется еще три (fa2-fa4), и их базальные отростки образуют компактный сферический нейропиль в основании органа. Затем на вентральной стороне эписферы появляется крупная одиночная клетка с двумя апикальными сенсорными отростками (Jvl). Ее базальные отростки идут вдоль формирующегося нерва прототроха.

Вскоре две FMRFa-ИР сенсорные клетки появляются на заднем конце тела. Базальный отросток одной из них (fp1) идет вперед вдоль вентральной части правой стороны тела, доходит до района, где будет формироваться будущий церебральный ганглий, переходит на левую сторону и идет назад, маркируя, таким образом, будущие вентральный ствол и церебральный ганглий. Отростки другой клетки (fp2) образуют окологлоточное кольцо. Таким образом, еще до вылупления трохофоры базальные отростки периферических сенсорных клеток fv1, fp1 и fp2 обозначают основные контуры будущей дефинитивной нервной системы, в то время как отростки клеток апикального сенсорного органа на ранних стадиях не проходят дальше апикального нейропиля.

Непосредственно перед вылуплением количество 5-НТ-ИР нейронов начинает быстро увеличиваться, причем, большинство из них являются хемосенсорными: 4-6 клеток появляются в апикальном сенсорном органе, еще одна на заднем конце тела (sp2) и 2-4 клетки вокруг ротового отверстия. К моменту вылупления отростки 5-НТ-ИР нейронов прорастают в шесть меридиональных претрохальных нервов, соединяющих апикальный орган и нерв прототроха, в окологлоточное нервное кольцо и вентральный нервный ствол.

После вылупления новые 5-НТ- и FMRFa-ИР нейроны практически не появляются. Значительно увеличивается лишь число иммунопозитивных отростков в формирующейся дефинитивной нервной системе (церебральный ганглий, нерв прототроха, вентральные стволы и окологлоточное кольцо). Базальные отростки FMRFa-ИР нейронов апикального органа прорастают назад и соединяются с вентральными отделами нервной системы. В дальнейшем, иммунореактивность в нейронах личиночной нервной системы постепенно исчезает.

Кроме описанного выше набора хемосенсорных нейронов и в дополнение к апикальному сенсорному органу, который считается единственным хемосенсорным органом трохофор, нами у вылупившихся трохофор Phyllodoce был обнаружен неизвестный ранее непарный хемосенсорный орган на заднем конце тела. Он расположен в средней части дорзальной стороны гипосферы, и его сенсорная часть направлена назад. Он содержит пять сенсорных клеток, две из которых 5-НТ-иммунопозитивны. Трансмиттерная специфичность остальных нейронов неизвестна. Каждая клетка имеет апикальный дендрит, который идет к поверхности тела и несет одну ресничку. Нейроны этого органа, названного нами по аналогии с апикальным сенсорным органом (apical sensory organ, ASO) «задним сенсорным органом» (posterior sensory organ, PSO), иннервируют нерв прототроха и церебральный ганглий.

В процессе развития орган подвергается постепенной дегенерации, которая начинается через 2 дня после вылупления, а через 5 дней после вылупления от заднего сенсорного органа остаются только следы дегенерировавших клеток, которые вскоре полностью исчезают.

Ранее никаких структур, подобных описанному нами органу у трохофор не было известно. Он не соответствует ни периферическим сенсорным клеткам, описанным ранее Экессоном и Лакалли (АкеББоп, 1967; LacaШ, 1981; 1984; 1986), ни задним периферическим нейронам гастропод (обзор литературы в Сго11, 2000), ни нухальным органам взрослых полихет (РигесЬке 1997; 2002). Скорее всего, задний сенсорный

орган - это специфически личиночная провизорная сенсорная структура.

3.6. Сенсорная природа ранних нейронов.

Подробно исследовалась морфология ранних нейронов у личинок пресноводных гастропод Lymnaea и Helisoma, морской гастроподы Tritonia, хитона Ischnochiton и морской полихеты Phyllodoce.

Апикальные нейроны у всех перечисленных видов появляются на стадии трохофоры и имеют сходную морфологию. Они расположены субэпителиально, биполярны и имеют булавовидную форму. Один отросток выходит на поверхность и несет пучок коротких ресничек, второй отросток идет вглубь тела и вместе с отростками от других апикальных сенсорных клеток образует сеть или клубок отростков с варикозными расширениями над формирующейся церебральной комисурой. У всех изученных видов апикальные клетки экспрессируют 5-НТ. У прудовика эти клетки содержат также DA и пептид семейства FMRFa. У хитона и филлодоце 5-НТ и FMRFa экспрессируются в разных клетках. Кроме апикальных нейронов в передней полусфере хитона присутствует пара клеток, расположенных латерально и несколько ближе к прототроху. Эти клетки характеризуются наличием в дистальной части ампулы с ресничками, соединяющейся с наружной средой через маленькую пору. В этих клетках на ранних стадиях развития экспрессируется и 5-НТ, и FMRFa. Во всех случаях нейроны передней полусферы не входят в состав формирующихся ганглиев, а иммунореактивность в них перестает выявляться после метаморфоза.

Нейроны задней полусферы появляются чуть раньше или одновременно с нейронами передней полусферы. У всех моллюсков эти клетки иммунореактивны к FMRFa. У прудовика и катушки одна или две клетки расположены вентрально под формирующейся раковиной. Один отросток выходит на поверхность и несет пучок коротких ресничек, два длинных отростка идут вперед к апикальным клеткам. У тритонии две пары клеток расположены латерально на вентральной стороне тела личинки. Каждая клетка биполярна, короткий отросток выходит на поверхность и несет пучок длинных ресничек, другой отросток идет вперед в апикальную область У филлодоце в задней полусфере расположены одна 5НТ- и три FMRFa-ИР клетки, а по экватору две 5НТ- и одна FMRFa-ИР клетки. У всех 5-НТ-ергических клеток короткий отросток несет одну-две длинные реснички, а у FMRFa-ергических - густые пучки из ресничек средней длины. Все другие, как периферические, так и центральные нейроны появляются позже описанных выше клеток.

Таким образом, все ранние нейроны в развитии личинок изученных групп трохофорных животных являются сенсорными, о чем свидетельтствует наличие ресничек

на апикальном конце дендрита или в ампульнои полости в случае латеральных клеток личинки хитона.

3.7. Роль нейронов задней полусферы в развитии.

Среди всех изученных нами личинок трохофорных животных, трохофора полихеты РкуПоЫоее была единственной, у которой самый первый нейрон, появляющийся на периферии в каудальной части личинки, содержал 5-НТ. Это дало нам возможность фармакологически модулировать его активность и влияние на мишени. Для этого личинок нкубировали в следующих растворах: 5-НТ (50 и 100 мкМ), 5-НТР (0,5 и 1 мМ), парахлор-фенилаланина - блокатора синтеза серотонина (10 и 20 мкМ), миансерина - антагониста рецепторов серотонина широкого спектра действия (100 мкМ), начиная со стадии бластулы. Личинки во всех растворах развивались параллельно при одинаковых условиях и фиксировались для последующей иммуногистохимической обработки в момент появления пигмента в глазах контрольных (развивающихся в морской воде.) личинок.

Гистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание показало, что контрольные особи на момент фиксации находятся на стадии трохофоры непосредственно перед вылуплением. Поверхностные ресничные структуры а также паттерн 5-НТ- и FMRFa-ИР нейронов соответствуют трохофоре 64 часов развития (см. главу 3.5). Личинки, инкубированные в миансерине ничем не отличались от контрольных. У личинок инкубированных в парахлорфенилаланине паттерн FMRFa-ИР не отличался от контрольных, в то время как яркость 5-НТ-ИР в большинстве клеток и волокон была значительно слабее. Личинки, инкубировавшиеся в 5-НТ и 5-НТР были существенно младше контрольных. Прототрох был или еще не замкнутый (состоял из отдельных ресничных клеток) или был замкнутый, но с короткими ресничками. Иммунореакция против 5-НТ выявлялась только в одной или двух каудальных клетках (хр1 и хр2) и иногда в начальных участках их отростков. Иммунореакция к тубулину позволяла увидеть тело одной клетки в апикальном органе. FMRFa не выявлялся. То есть, в то время, когда контрольные животные находились на стадии непосредственно перед вылуплением (более 64 часов), инкубировавшиеся в 5-НТ и 5-НТР были на стадии ранней трохофоры (соответствует 36-48 часам), при этом эффект торможения развития был концентрационно-зависимым и сильнее проявлялся в больших концентрациях веществ.

Таким образом, потеря чувствительности к серотонину никак не влияла на развитие. Снижение уровня синтеза серотонина в ранних нейронах, выявляемое иммуноцитохимически (то есть приблизительно в два раза) также не оказывало существенного влияния на развитие. В то же время, повышение уровня серотонина (как экзогенного, так и эндогенного за счет повышения синтеза) вызывало выраженное торможение нейрогенеза и развития в целом.

3.8. Влияние активности хемосенсорных нейронов апикального органа на личиночное развитие пресноводных моллюсков.

Инкубация в воде, кондиционированной голодными ювенильными или взрослыми особями, приводила к удлинению продолжительности развития более чем в два раза (Рис.14). То есть в то время, когда контрольные животные уже завершали метаморфоз (стадия 28, 90% эмбрионального развития), инкубирующиеся в кондиционированной воде достигали только стадии велигера (стадия 23, 45% эмбрионального развития). Действие

кондиционированной воды было обратимым, и темп развития восстанавливался при замене кондиционированной воды на обычную воду.

Для того, чтобы доказать, что эффект кондиционированной воды опосредуется именно ранними апикальными хемосенсорными моноаминергическими нейронами, фармакологически варьировали синтез моноамина. Для этого зародышей нкубировали в присутствии биохимических предшественников 5-НТ и ЭЛ (5-НТР и Ь-ЭОРЛ, 1 мМ), метилированных аналогов предшественников моноаминов (а-метил-триптофан и а-метил-ЭОРЛ, 1-4 мМ), блокаторов синтеза (парахлорфенилаланин и гидроксибензилгидразин, 10-50 мкМ), а также различных антагонистов 5-НТ и ЭЛ рецепторов (миансерин, метисергид, ципрогептадин, сульпирид, ритансерин, кетансерин, эргометрин, 1-100 мкМ). Фармакологический анализ показал, что бихимические предшественники действовали на развитие сходным с кондиционированной водой образом: замедляли его более чем в два раза. Тормозное действие было четко видоспецифичным: развитие прудовика удлинялось под действием предшественника ЭЛ, а развитие катушки под действием предшественника 5-НТ. Эта специфичность строго коррелировала с химизмом хемосенсорных нейронов у соответствующего вида. Метилированные предшественники в диапазоне использованных концентраций не оказывали влияния на развитие.

Рис. 14. Влияние химических веществ на продолжительность развития катушки ИеШота и прудовика Ьутпаеа от стадии трохофоры до первой ювенильной стадии (среднее ± стандартное отклонение). По горизонтали - продолжительность развития в % относительно контроля (100% - базовая линия). По вертикали - вещества (С\¥ - кондиционированная вода, 5-НТР - предшественник 5-НТ, Ь-ВОРА - предшественник ВА, а-Ш-Т - а-метил-триптофан; а-т-ООРА - а-метил-ООРА; N30 - блокатор синтеза моноаминов гидроксибензилгидразин, РСРА - специфический блокатор синтеза серотонина парахлорфенилаланин, ЕМ - эргометрин); * - статистически достоверное отличие от контроля; р<0.005.

Гистохимическое и иммуно цитохимическое окрашивание показало, что предшественники повышают, а метилированные аналоги предшественников снижают содержание соответствующего моноамина в апикальных хемосенсорных нейронах. Тормозный эффект кондиционированной воды и биохимических предшественников сильно ослаблялся блокаторами синтеза моноаминов. Из ряда использованных антагонистов рецепторов только эргометрин значительно ослаблял как эффект кондиционированной воды, так и эффект предшественников (Рис. 14).

Таким образом, мы обнаружили новый механизм, регулирующий личиночное развитие пресноводных легочных моллюсков. Нами доказано, что развитие находится под постоянным слабым тормозным влиянием апикальных моноаминергических сенсорных нейронов, которые являются частью апикального сенсорного органа. Моноамины, выбрасываемые этими нейронами, связываются с внутренними эргометрин-чувствительными рецепторами и вызывают торможение развития. В случае неблагоприятных условий внешней среды (скученность и отсутствие пищи) для ювенильных и взрослых улиток, они испускают неизвестный пока химический сигнал, который активирует апикальные клетки эмбрионов. Клетки усиливают секрецию и выброс моноамина, который усиливает торможение развития.

Обнаруженный нами феномен не только показывает новую роль апикальных сенсорных нейронов в регуляции развития, но и открывает новые возможности для изучения связи между сигналами из окружающей среды и регуляцией эмбриогенеза. Личинки моллюсков представляют прекрасную модель, в которой и химический стимул из внешней среды, и сенсорные клетки, и действующий нейромедиатор, и конечный эффект известны и легко поддаются экспериментальным воздействиям. Эта модель предоставляет богатые возможности для изучения нейроэндокринного контроля эмбрионального развития.

ВЫВОДЫ

1. Развитие нервной системы трохофорных животных начинается с дифференцировки периферических нейронов. На стадии трохофоры формируются два изначально не связанных между собой морфологически нервных центра в передней и задней полусферах зародыша. Все ранние нейроны являются сенсорными.

2. Ранние нейроны экспрессируют пептиды семейства БМЯРамида и/или серотонин. Эти клетки являются транзиторными, то есть в определенный момент развития перестают синтезировать характерные для них трансмиттеры, и, вероятнее всего, подвергаются запрограммированной клеточной гибели.

3. Нейроны задней полусферы разнообразны по своей морфологии, составу нейротрансмиттеров и локализации относительно прототроха, поэтому, вероятнее всего, не являются гомологичными, а выполняют единую морфогенетическую функцию у личинок разных видов трохофорных животных.

4. Волокна нейронов задней полусферы являются пионерными и маркируют места, где в дальнейшем будут сформированы центральные ганглии дефинитивной нервной системы и пути, по которым пройдут связывающие ганглии комиссуры и коннективы.

5. В раннем развитии пульмонат преобладает экспрессия пентапептидов, в частности ЕРЬЫамида. Группа EFLRla, по-видимому, участвует в ранних процессах морфо- и эмбриогенеза. Гептапептиды семейства FMRFaмидa начинают экспрессироваться позже, нейронами дефинитивной нервной системы.

6. В развивающихся эмбрионах пульмонат биохимически выявляются такие моноамины как серотонин, дофамин и октопамин. Их содержание возрастает в процессе развития. Серотонин выявляется в развитии трохофорных, начиная со стадии зиготы и присутствует в определенном пуле бластомеров до стадии поздней бластулы. Затем экспрессия серотонина перестает регистрироваться и возникает вновь уже в дифференцированных нервных клетках.

7. Октопамин-содержащие нейроны буккального ганглия входят в состав центрального генератора пищевого ритма у пульмонат. Выделяемый ими октопамин оказывает модуляторное влияние на активность генератора

8. Секретируемый ранними нейронами задней полусферы серотонин оказывает тормозное действие на развитие и дифференцировку других нейронов.

9. Нейроны передней полусферы входят в состав апикального органа и являются гомологичными у личинок разных групп. Секретируемые ими амины (серотонин и дофамин) оказывают тоническое тормозное влияние на развитие личинок.

10. Апикальные нейроны инкапсулированных эмбрионов активируются природным химическим сигналом (сигналами), которые испускаются вылупившимися моллюсками всех возрастов в условиях скученности и отсутствия пищи. Клетки усиливают секрецию и выброс моноамина, который усиливает торможение развития, действуя через эргометрин-чувствительные рецепторы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ \ В реферируемых журналах:

1. Воронежская Е.Е. (1990) Нейрональные катехоламины в эмбриогенезе прудовика Lymnaea stagnalis. Онтогенез. 21(6), 593-597.

2. Воронежская Е.Е., Павлова ГА., Сахаров Д.А. (1992) Возможный контроль эмбриогенеза моллюсков нейрональными катехоламинами. Онтогенез. 23(3), 295.

3. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров ДА. (1993) Развитие эмбриональной моторики у зародышей прудовика Lymnaea stagnalis. Онтогенез. 24(6), 33-39.

4. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров Д.А. (1993) Действие галоперидола и метилэргометрина на эмбриональную моторику и развитие прудовика Lymnaea stagnalis. Онтогенез. 24(6), 40- 47.

5. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. (1994) Chronic haloperidol: Neural correlates of motor disorders in an invertebrate model. Neuroreport. 5(6), 667-670.

6. Voronezhskaya E.E., Elekes K. (1994) Distribution of serotonin-like immununoreactive neurons in the embryonic nervous system of lymnaeid and planorbid snails. Neurobiology. 1, 371-383.

7. Croll R.P., Voronezhskaya E.E. (1995) Early FMRFamide-like immunoreactive cells in gastropod neurogenesis. Acta Biol. Hung. 46(2-4), 295-303.

8. Voronezhskaya E.E., Elekes К. (1996) Transient and sustained expression of FMRFamide-like immunoreactivity in the developing nervous system of Lymnaea stagnalis (Mollusca, Pulmonata). Cell. Mol. Neurobiol. 16, 661-676.

9. Воронежская Е.Е., Кролл Р.П. (1996) Ранние этапы нейрогенеза у легочных моллюсков. Доклады Академии Наук. 2,91-93.

10. Croll R.P., Voronezhskaya E.E. (1996) Early elements in gastropod neurogenesis. Dev. Biol. 173, 344-347.

11. Sakharov DA., Voronezhskaya E E, Nezlin L,P., Baker M.W., Elekes K., Croll R.P. (1996) Tyrosine hydroxylase-negative, dopaminergic neurons are targets for transmitter-depleting action ofhaloperidol in the snail brain. Cell. Mol. Neurobiol. 16(4), 451-461.

12. Elekes K., Voronezhskaya E.E., Hiripi L., Eckert M, Rapus J. (1996) Octopamine in the developing nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis L. Acta Biol. Hung. 47 (14), 73-87.

13. Voronezhskaya E.E., Elekes K. (1997) Expression of FMRFamide gene neuropeptides is partly different in the embryonic nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis L. Neurobiology. 5(1), 91-93.

14. Croll R.P., Baker M.W., Khabarova M.Y., Voronezhskaya E.E. and Sakharov D.A. (1997) Serotonin depletion by chronic chlorpromazine: evidence for a simpler model system. General Pharmacology. 29, 91-96.

15. Croll R.P, Jackson D.L. and Voronezhskaya E.E. (1997) Catecholamine-containing cells in larval and postlarval bivalve molluscs. Biol. Bull. 193, 116-124.

16. Nezlin L.P., Voronezhskaya E.E. (1997) GABA-immunoreactive neurones and interactions of GABA with serotonin and FMRFamide in a peripheral sensory ganglion of the pond snail Lymnaea stagnalis. Brain Res. 772(1-2), 217-225.

17. Vehovszky A., Elliott C.J.H., Voronezhskaya E E., Hiripi L., Elekes K. (1998) Octopamine: a new feeding modulator in Lymnaea. Phil. Trans. R. Soc. London B. 353(1375), 1631-1643.

18.Nagy Т., Ude J., Voronezhskaya E.E., Elekes K. (1998) Ultrastructural and immunogold (FMRFamide) characterization of Lymnaea CNS in two specific developmental stages. Neurobiology. 6, 58-61.

19. Voronezhskaya E.E., Hiripi L., Elekes K. and Croll R.P. (1999) Development of catecholaminergic neurons in the pond snail, Lymnaea stagnalis: I. Embryonic development of dopamine-containing neurons and dopamine-dependent behaviors. J. Сотр. Neurol. 404, 285-296.

20. Croll R.P., Voronezhskaya E.E., Hiripi L. and Elekes K. (1999) Development of catecholaminergic neurons in the pond snail, Lymnaea stagnalis: II. Postembryonic development of central and peripheral cells. J. Сотр. Neurol. 404, 297-309.

21. Dickinson A.J.G., Croll R.P., Voronezhskaya E.E. (2000) Development of embryonic cells containing serotonin, catecholamines and FMRFamide-related peptides in Aplysia cahfornica. Biol. Bull. 199, 305-315.

22. Voronezhskaya E.E., Tyurin S.A., Nezlin L.P. (2002) Neuronal development in larval chiton Ischnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora) J Сотр. Neurol. 444,25-38.

23. Воронежская Е.Е., Хабарова М.Ю. (2003) Функция апикального органа в развитии беспозвоночных. Доклады Академии Наук. 390 (1-6), 231-234.

24. Nezlin L.P., Voronezhskaya E.E. (2003) Novel, posterior sensory organ in the trochophore larvae oiPhyllodoce maculata (Polychaeta) Pros. R. Soc. Lond. В (Suppl.) 270, S159-S162.

25. Voronezhskaya E.E., Elekes K. (2003) Expression ofthe FMRFamide gene encoded peptides by identified neurons in embryos and juveniles of the pulmonate snail Lymnaea slagnalis. Cell Tissue Res. 314, 297-313.

26. Buznikov G.A., Nikitina L.A., Voronezhskaya E.E., Bezuglov V.V., Willows A.O.D., Nezlin L.P. (2003) Localization of serotonin and its possible role in early embryos of Tritonia diomedea (Mollusca: Nudibranchia). Cell Tissue Res. 311(2), 259-266.

27. Voronezhskaya E.E., Tsitrin E.B., Nezlin L.P. (2003) Neuronal development in the larval polychaete Phyllodoce maculata (Phyllodocidae). J Comp Neurol. 455(3), 299-309.

28. Voronezhskaya E.E., Khabarova M.Yu., Nezlin L.P. (2004) Apical sensory neurons mediate developmental retardation induced by conspecific environmental stimuli in freshwater pulmonate snails. Development. 131, 3671-3680.

В сборниках:

29. Croll R.P., Voronezhskaya E.E. (1996) Early FMRFamide-like immunoreactive cells in gastropod neurogenesis. In: Neurobiology of Invertabrates. (Eds. J. Salanki, K.S.-Rosa and K.Elekes), Akademia Kiado, Budapest, 295-303.

30. Croll R.P., Voronezhskaya E.E. (1996) Early neurodevelopment in Aplysia, Lymnaea and Helisoma. Soc. Neurosci. Abstr. 22:, 1948.

Заказ № 280 Подписано в печать 18.02.05 Тираж 100 экз. Усл. п. л. 2,6

ООО "Цифровичок", тел. 741-18-Л, 505-28-72

wiew.cfr.ru Г '

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Воронежская, Елена Евгеньевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Ранний нейрогенез моллюсков.

1.2. Ранний нейрогенез аннелид.

1.3. Двигательные реакции личинок трохофорных животных и участие в них нейронов развивающейся нервной системы.

1.4. Функции нейронов апикального органа в развитии.

1.5. Цели и задачи исследования.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

2.1. Объекты исследования.

2.2. Иммунохимическое маркирование.

2.3. Глиоксилатная гистохимическая реакция.

2.4. Формальдегид-глутаральдегидная реакция.

2.5. Внутриклеточное окрашивание.

2.6. Объемная реконструкция серийных срезов.

2.7. Электрофизиологические эксперименты,.

2.8. Хроматография под высоким давлением (HPLC),.

2.9. Радиоферментный анализ.

2.10. Фармакологическая модуляция пищевого поведения.

2.11. Фармакологическая модуляция развития.

2.12. Регистрация поведения.

2.13. Приготовление кондиционированной воды.

2.14. Измерение размеров и статистическая обработка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Нейрогенез пресноводных легочных моллюсков(Са81горо(1а, Pulmonata).^

3.1.1. Нормальное развитие.

3.1.2. РМКРамид-иммунореактивные элементы у Lymnaea stagnalis, Biomphalaria glabrata и Helisoma trivolvis.

3.1.3. Экспрессия пептидов семейства FMRFамида в развитии Lymnaea stagnalis.

3.1.4. Обсуждение.J.

3.1.5. Серотонин-содержащи? Ьейроны у улиток семейств Lymnaeida и Planorbidae.

3.1.6. Обсуждение.^.

3.1.7. Катехоламин-содержащие нейроны и катехоламин-зависимое поведение в развитии L. stagnalis.

3.1.7.1. Эмбриональное развитие.

3.1.7.2. Постэмбриональное развитие.

3.1.8. Обсуждение.

3.1.9. Октопамин в эмбриональном и постэмбриональном развитии L. stagnalis.

3.1.10. Октопамин как регулятор пищевого поведения у L. stagnalis,.

3.2. FMRFaiviiw-, серотонин- и катехоламин-содержащие нейроны в развитии Aplysia californica (Gastropoda, Opisthobranchea).

3.2.1. Обсуждение.

3.3. Локализация серотонина и его роль у ранних зародышей Т. diomedea.

3.4. Нейрогенез хитона Ischnochiton hakodadensis (Polyplacophora),.

3.4.1. Нормальное личиночное развитие.

3.4.2. РМЯРамид-содержащие нейроны.

3.4.3. Серотонин-содержащие нейроны.

3.4.4. Колокализация иммунореактивности к FMRFa и серотонину.

3.4.5. Колокализация иммунореактивности к FMRFa и тубулину,.

3.4.6. Обсуждение.

3.5. Нейрогенез полихеты Phyllodoce maculata (Phyllodocidae).

3.5.1. Нормальное развитие.

3.5.2. Серотонин-содержащие нейроны,.

3.5.3. РМЯРамид-содержащие нейроны.

3.5.4. Каудальный сенсорный орган,.

3.5.4. Обсуждение.

3.6. Сенсорная природа ранних нейронов.

3.7. Роль нейронов задней полусферы в развитии.

3.8. Роль нейронов апикального органа в развитии.

3.8.1. Внутривидовая химическая сигнализация в эмбриональном развитии пресноводных пульмонат: роль ранних апикальных сенсорных нейронов.

3.8.2. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транзиторные нейроны трохофорных животных и их роль в регуляции развития"

При решении фундаментальных задач нейробиологии развития исследователи традиционно обращались к относительно просто устроенным модельным беспозвоночным. Данные последних лет, полученные нейробиологами развития с применением современных генетических и молекулярно-биологических методов при изучении эмбрионов модельных позвоночных и беспозвоночных, таких как мыши (Mus musculis), рыбы (Danio rerio), насекомые (Drosophila melanogaster) и нематоды (Caenorgabditis elegans) показали, что гены, регулирующие развитие, чаще всего являются консервативными у представителей даже далеко отстоящих таксономических групп (обзор Moody, 1999; Arendt et al., 2001, 2004). Эти открытия еще раз показали важность сравнительных исследований и подтвердили существовавшее и раньше представление о том, что фундаментальные механизмы развития едины во всем животном царстве.

Группа трохофорных животных, выделяемая по присутствию в их жизненном цикле трохофоры или трохофороподобной личинки, является одной из самых многочисленных среди Spiralia. Ее представители использовались в качестве экспериментальных моделей в различных областях биологии, и, в частности, нейробиологии. Так, доказательство роли серотонина (5НТ) как передатчика нервных импульсов было получено на садовой улитке Helix (Gershenfeld and Steni, 1965), а интегративная функция этого медиатора в поведении была продемонстрирована на медицинской пиявке Herudo (Lent, 1986) и морском моллюске Clione limacina (Сахаров, Каботянский, 1986). Пептид Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (FMRFamide) был изначально идентифицирован как возбуждающий сердечные сокращения у моллюсков (Price and Greenberg, 1977). На морских слизнях Tritonia и Aplysia была установлена и плодотворно изучается нейрональная основа поведения, памяти и обучения (Willows, 1967; Kandel, 1979, 2001). Множество работ посвящено изучению различных аспектов функционирования дефинитивной нервной системы моллюсков и аннелид. С другой стороны, их развитие давно и успешно изучается классическими эмбриологическими методами (напр., Raven, 1966; Cumin, 1972; Anderson, 1966; Мещеряков, 1975), которые затрагивают в числе прочих и развитие нервной системы. Тем не менее данные о нейрогенезе, и особенно о самых ранних его этапах, немногочисленны и порой противоречивы, а функции ларвальных нейронов все еще остаются на уровне предположений, и в большинстве случаев не имеют экспериментального подтверждения.

В последнее время все большее признание получает концептуальная модель функциональной значимости множественности нейротрансмиттеров (Сахаров, 1990).

Накапливаются факты, доказывающие, что поведение является трансмиттер-зависимым, то есть определенный трансмиттер может индуцировать комплексную интегрированную программу поведения целого организма (Livingstone et al., 1980; Rravitz, 1983; Sakharov, 1990). Однако вопрос о том, являются ли морфогенетические программы также трансмиттер-зависимыми, остается открытым. Было показано, что трансмиттеры присутствуют и являются функционально значимыми на ранних «донервных» стадиях развития (Бузников, 1987; Buznikov et al., 2001). Для более поздних стадий развития известно участие серотонина в метаморфозе и регуляции биения ресничек личинок (см. ссылки в главах 1.3 и 1.4). Период начальных этапов формирования нервной системы никогда не изучался с точки зрения участия нервных передатчиков в нейро- и онтогенезе.

Личинки трохофорных животных представляют удобную модель для решения подобных задач, так как обладают нервной системой, в которой представлено большинство медиаторов, характерных для дефинитивной ЦНС, и котороя, в то же время, состоит из небольшого числа нейронов (десятки), каждый из которых может быть идентифицирован.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Воронежская, Елена Евгеньевна

5. ВЫВОДЫ

1. Развитие нервной системы трохофорных животных начинается с дифференциров-ки периферических нейронов. На стадии трохофоры формируются два, изначально не связанные между собой морфологически нервных центра: в передней и задней полуферах зародыша. Все ранние нейроны являются сенсорными.

2. Ранние нейроны экспрессируют пептиды семейства РМИРамида и/или серотонин.

3. Эти клетки являются транзиторными, то есть в определенный момент развития перестают синтезировать характерные для них трансмиттеры, и, вероятнее всего, подвергаются запрограммированной клеточной гибели

4. Нейроны задней полусферы разнообразны по своей морфологии, составу нейро-трансмиттеров и локализации относительно прототроха, поэтому, вероятнее всего, не являются гомологичными, а выполняют единую морфогенетическую функцию у личинок разных видов трохофорных животных.

5. Волокна нейронов задней полусферы являются пионерными и маркируют места, где в дальнейшем будут сформированы центральные ганглии дефинитивной нервной системы и пути, по которым пройдут связывающие ганглии комиссуры и коннективы.

6. В раннем развитии пульмонат преобладает экспрессия пенпапептидов, в частности EFLRIaMnaa. Группа EFLRIa, по-видимому, участвует в ранних процессах морфо- и эмбриогенеза. Гептапептиды семейства FMRFaMHaa начинают экспрессироваться позже нейронами дефинитивной нервной системы.

7. В развивающихся эмбрионах пульмонат биохимически выявляются такие моноамины как серотонин, дофамин и октопамин. Их содержание возрастает в процессе развития. Серотонин выявляется в развитии трохофорных, начиная со стадии зиготы и присутствует в определенном пуле бластомеров до стадии поздней бластулы. Затем экспрессия серотонина прекращается, и возникает вновь уже в дифференцированных нервных клетках.

8. Октопамин-содержащие нейроны буккального ганглия входят в состав центрального генератора пищевого ритма у пульмонат. Выделяемый ими октопамин оказывает модуляторное влияние на активность генератора.

9. Секретируемый ранними нейронами задней полусферы серотонин оказывает ингибирующее действие на рост собственных отростков и тормозит дифференцировку других нейронов.

10. Нейроны передней полусферы входят в состав апикального органа и являются гомологичными у личинок разных групп. Секретируемые ими амины (серотонин и дофамин) оказывают тоническое тормозное влияние на развитие личинок.

11. Обнаружен механизм химической сигнализации, посредством которого моллюски регулируют скорость развития эмбрионов своего вида. Природный химический сигнал (сигналы) испускаются вылупившимися моллюсками всех возрастов в условиях скученности и отсутствия пищи и детектируются апикальными нейронами инкапсулированных эмбрионов.

12. Апикальные нейроны активируются этим природным сигналом и, в свою очередь, усиливают секрецию и выброс моноамина, который усиливает торможение развития, действуя через эргометрин-чувствительные рецепторы.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией сравнительной физиологии ИБР РАН Д.А.Сахарову за многолетнее научное руководство, Л.П.Незлину за помощь в подготовке диссертации, Н.И.Незлиной за редакторскую работу, а также своим соавторам: Г.А.Бузникову, Л.А.Никитиной и Е.Б.Цитрину (ИБР РАН), М.Ю.Хабаровой (Тульский Педагогический Университет), С.А.Тюрину (ИБМ ДВО РАН), Г.А.Павловой (МГУ), Р.П.Кроллу, М.Бэкеру и А.Дикинсон (Университет Дальхаузи, Канада), К.Элекешу, Л.Хирипи и А.Веховски (Балатонский Лимнологический институт, Венгрия).

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно нашим данным, первые элементы нервной системы пресноводных пульмонат большого прудовика, Lymnaea stagnalis, и аквариумной катушки, Helisoma trivolvis, появляются на стадии трохофоры - раннего велигера, то есть, намного раньше, чем какие бы то ни было нейроны, описанные ранее. Первые три клетки у эмбрионов прудовика и катушки иммунореактивны к антителам против нейропептида РМИРамида и тубулина. Их тела расположены в задней области зародыша, а не в передней, как должно было бы быть в соответствии с существующими представлениями о нейрогенезе моллюсков. Отростки, которые эти клетки посылают вперед, образуют контур или «скелет», вдоль которого позже развиваются центральные ганглии и соединяющие их комиссуры и коннективы. Первые серотонин-, дофамин-, и FMRFaMHfl- иммунореактивиые клетки появляются на стадии позднего велигера в местах будущей закладки ганглиев центральной нервной системы только после того, как ее основная схема будет сформирована отростками ранних нейронов. Один из трех каудальных нейронов (c-EFAP) проявляет иммунореактивность как минимум к четырем антителам: против РМИРамида, ЕРЫНамида, 22-аминокислотного не-FMRFaMHUHoro пептида "SEEPLY", и миомодулин-подобного CARP. И у прудовика, и у катушки только этот нейрон имеет выходящий на поверхность отросток с щеточкой коротких ресничек, то есть, является сенсорным. Два других нейрона (r-EFAP и /-EFAP) имеют характерную амебо-подобную форму, иммунореактивны только к антителам против FMRFaMHfla и не имеют ресничек. Такие морфологические различия позволяют предположить разную функцию этих клеток в процессе развития.

Два апикальных нейрона дифференцируются в передней области у зародышей пресноводных пульмонат несколько позже, чем описанные ранее каудальные нейроны. Они экспрессируют дофамин, серотонин и пептид семейства FMИРамида у прудовика, и исключительно серотонин у катушки. Эти нейроны имеют короткий отросток, который идет к поверхности тела и несет пучок ресничек; несколько коротких отростков, не выходящих на поверхность и не несущих реснички; а также длинный базальный отросток, который многократно ветвится под ресничной апикальной пластинкой, создавая сеть отростков с варикозными расширениями. Апикальные клетки не входят в состав ганглиев и перестают иммуноцитохимически выявляться после выхода эмбриона из яйца. Время появления, расположение, характерная морфология, состав трансмиттеров и последующая судьба апикальных клеток позволяют нам считать их частью личиночного апикального органа.

Таким образом, ни один из ранних нейронов не входит в состав формирующихся ганглиев дефинитивной нервной системы. Иммунореактивность в них пропадает перед выходом эмбриона из яйца, а отростки дегенерируют. Мы считаем эти клетки транзи-торными, подразумевая под этим временную экспрессию нейротрансмиттера только на определенном отрезке эмбриогенеза. Морфологические данные позволяют предположить, что ранние клетки дегенерируют полностью, возможно подвергаясь запрограммированной клеточной гибели, после того, как выполнят свою морфогенетическую функцию.

В формирующихся ганглиях прудовика 30 нейронов экспрессируют пентапептиды и три — гептапептиды семейства FMRFaMHfla. Интересно, что два из них экспрессируют иммунореактивность к ЕБЫНамиду и acidic peptide, но не маркируются антителами к SEEPLY или CARP. Вероятно, два транскрипта гена FMRFaMUfla - один, кодирующий первично тетрапептиды, а другой гептапептиды - коэкспрессируются в этих нейронах на инкапсулированных стадиях развития. После вылупления эти клетки сохраняют иммунореактивность только к антителам против acidic peptide. В результате, у молоди и взрослых улиток нейроны взаимоисключающе экспрессируют транскрипт или типа 1, или типа 2, как это было ранее показано для взрослых прудовиков. После вылупления число иммунореактивных нейронов в ЦНС резко возрастает (до 223), с доминированием пентапептид-содержащих клеток (91%). Следует отметить, что три группы клеток в висцеральном и париетальных ганглиях, которые определенно можно идентифицировать как клетки групп Egp, Fgp и Bgp, и известные своим участием в регуляции многих физиологических функций, начинают экспрессировать характерные для них пептиды только на первой ювенильной стадии, в то время как соответстующие функции проявляются уже у инкапсулированных зародышей. Многочисленные клетки и группы РМИЕамид иммунореактивных клеток появляются на первых ювенильных стадиях, и новые нейроны непрерывно добавляются в ЦНС в процессе дальнейшего развития. Интересно отметить, что две группы FMRFaMHfl иммунореактивных нейронов (одна в церебральных и другая в педальных ганглиях) перестают экспресировать пептид непосредственно перед половым созреванием. Мы предполагаем вовлеченность этих клеток в формирование полового поведения прудовиков.

Ни у эмбрионов, ни у ювенильных прудовиков не было обнаружено периферических клеток, иммунореактивных к гептапептидам, в то время как множество нейронов, по всей видимости, сенсорных, в губах, мантии и ноге экспрессировали пентапептиды. В процессе развития формируется интенсивная FMRFaмид-epгичecкaя иннервация периферических тканей, включая ногу, мантию, слюнные железы, пищеварительный тракт и сердце.

Серотонин выявляется у пресноводных пульмонат в паре апикальных нейронов на стадии раннего велигера. Следует отметить, что в то время, как у зародышей катушки интенсивная иммунореактивность характерна для апикальных нейронов во время всех стадий инкапсулированного развития, у зародышей прудовика слабая иммунореактивность появляется в апикальных клетках только в случае неблагоприятных условий внешней среды (см. ниже) или же может быть вызвана фармакологически, путем инкубации яиц в предшественнике серотонина. Время появления и паттерн серотонин-иммунореактивных клеток в центральных ганглиях прудовика и катушки был сходным. Клетки выявляются на стадии велигера сначала в церебральных, а затем в педальных ганглиях. Отростки этих нейронов иннервируют ресничный эпителий подошвы и вентральной поверхности губных щупалец, а также проецируются в коллумелярный нерв. В процессе развития увеличивалось как число групп серотонин-содержащих клеток, так и количество клеток внутри уже существующих групп.

Хроматографический анализ показал, что сновными моноаминами, обнаруженными в эмбриогенезе прудовика, являются дофамин и серотонин, в то время как ни адреналин, ни норадреналин обнаружены не были. Отметим, что впервые дофамин выявляется хроматографически несколько раньше, чем иммуноцитохимически выявляются первые дофамин-содержащие клетки (пара апикальных нейронов). На всех постэмбриональных стадиях развития, от вылупления до полового созревания, дофамин и серотонин присутствуют в высокой концентрации в ганглиях центральной нервной системы. Норадреналин обнаруживается в низкой концентрации (приблизительно 20% от уровня дофамина) только у молодых неполовозрелых улиток. Перед наступлением полового созревания его содержание в ганглиях значительно снижается. Дофамин является доминирующим моноамином, присутствующим в ноге и пищеводе прудовиков во время всего постэмбрионального развития. Его общее содержание в тканях постепенно увеличивается по мере развития, при этом концентрация в пересчете на массу соответствующей ткани практически не изменяется.

Все обнаруженные нами у эмбрионов прудовика катехоламин-содержащие нейроны, выявленные методом глиоксилат- и альдегид-индуцированной флуоресценции, также были иммунореактивны к антителам против фермента синтеза катехоламинов - тирозин гидроксилазе. У половозрелых прудовиков небольшое количество клеток в педальных, левом и правом париетальном ганглиях содержали дофамин, но при этом не содержали тирозин гидроксилазу.

В эмбриогенезе прудовика большинство дофамин-содержащих клеток появляется на периферии. Самой первой дифференцируется пара сенсорных апикальных клеток (см. детальное описание выше), которые у прудовика содержат также один из пептидов семейства FMRFaMima и, при определенных условиях, серотонин. Затем множество сенсорных клеток появляются в ноге, щупальцах и губах. Аксоны этих клеток проецируются в ЦНС и входят в состав нейропиля церебральных и педальных ганглиев. Эти клетки появляются раньше любых центральных катехоламинергических нейронов и служат единственным источником дофамина в развивающейся ЦНС в течение значительной части эмбриогенеза. Первые центральные дофаминергические нейроны появляются в церебральных и педальных ганглиях уже после завершения метаморфоза. Последующее увеличение числа групп центральных нейронов происходит в течение 23 дней непосредственно перед вылуплением. Во время всего последующего развития новые (немногочисленные) клетки добавляются только внутри уже существующих групп, за исключением нескольких областей, связанных с формированием половых органов во время полового созревания.

Все центральные дофаминергические нейроны и группы нейронов прослеживаются у прудовиков от вылупления до половозрелости. Таким образом, постэмбриональное развитие центральных дофаминергических нейронов у прудовика разительно отличается от развития систем, содержащих серотонин и РМБРамид. В двух последних случаях значительно увеличивается как число групп, так и количество нейронов внутри групп на всех постэмбриональных стадиях, а также появляется много нейронов, которые быстро растут и становятся гигантскими. Что касается катехоламинергической системы, то почти все группы клеток появляются на последних стадиях эмбриогенеза, число нейронов в группах существенно не увеличивается, a RPeDI - это единственная гигантская дофамин-содержащая клетка.

В противоположность относительно небольшому увеличению числа центральных нейронов, несколько сотен катехоламин-содержащих клеток появляются в различных периферических тканях на постэмбриональных стадиях развития. Эти мелкие нейроны с аксонами, идущими в ЦНС, концентрируются в губах, пищеводе, переднем крае ноги и различных областях мужской и женской половой системы. Их общее количество многократно увеличивается вместе с ростом органов, в которых они находятся, и половозрелые прудовики имеют несколько тысяч дофамин-содержащих клеток, разбросанных по всему телу. Эти клетки несомненно являются сенсорными, и хотя их модальность остается неясной, несомненно их важное участие в восприятии внешних стимулов и модуляторное влияние на активность нейронов центральных генераторов.

Первые октопамин-иммунореактивные нейроны появляются на относительно поздней эмбриональной стадии развития, только после прохождения метаморфоза. Их расположение и проекции отростков одинаковы у эмбрионов и половозрелых улиток. В процессе вылупления и на ювенильных стадиях развития количество октопамин-иммунореактивных нейронов увеличивается только в вентромедиальных группах церебральных ганглиев. Постепенно увеличивается количество и протяженность иммунопозитивных отростков с варикозами в ЦНС. Периферических проекций октопамин-иммунореактивных нейронов не обнаружено. Увеличение числа октопамин-иммунореактивных нейронов и ветвления аксонов на постэмбриональных стадиях развития сопровождается быстрым экспоненциальным увеличением содержания октопамина в ЦНС прудовика. Мы предположили возможную роль октопамин-ергических нейронов в регуляции определенных физиологических функций, которые активны только начиная с поздних стадий эмбрионального развития. Так, было выявлено, что октопамин-содержащие нейроны буккальных ганглиев участвуют в модуляции пищевого ритма.

Таким образом, последовательность появления РМИРамид-, серотонин-, дофамин-, и октопамин-содержащих клеток в центральных ганглиях пресноводных гастропод была различной. Так, РМИРамид- иммунореактивные нейроны появляются сначала в висцеральном и париетальных ганглиях, затем в педальных и церебральных; серото-нин-иммунореактивные - в церебральных, а затем в педальных ганглиях; дофамин-иммунореактивные - сначала в педальных и церебральных, а затем в буккальных ганглиях; октопамин-иммунореактивные — одновременно в буккальных, церебральных и педальных ганглиях. То есть, классическая схема дифференцировки ганглиев гастропод в ростро-каудальном направлении верна только в случае серотонин-содержащих клеток.

Первыми в развитии морской гастроподы, Aplysia californica, на стадии трохофоры появляются две РМИТамид/ЕРЬГиамид-иммунореактивные клетки, расположенные на каудальном конце зародыша. Отростки этих клеток направляются вперед, поворачивают под апикальной областью и заканчиваются в ноге. Затем, на стадии велигера, появляются серотонин-иммунореактивные клетки в апикальном органе. РМКРамид- и серотонин-иммунореактивные, нейроны в ганглиях начинают появлятья на стадии позднего велигера, в местах, которые были маркированы отростками ранних периферических клеток. . Дофамин-содержащие клетки обнаруживаются на периферии - в области рта и в ноге. На момент выхода велигера из яйца ранние каудальные и апикальные клетки сохряняют иммунореактивность. С уверенностью можно сказать, что они не входят в состав формирующихся центральных ганглиев. Обнаруженные нами каудальные пептид-содержащие нервные клетки и их отростки, появляются в развитии аплизии до начала торзионного процесса. Первоначально расположенные симметрично, клетки постепенно сдвигаются на правую сторону, а их отростки, хотя и не перекрещиваются, но образуют перекрученную восьмеркообразную петлю. То есть, миграция ранних клеток показывает что в развитии морских гастропод присутствует, хотя и в нерезко выраженной форме и торзион, и деторзион, ранее только предположенные для Opisthobranchea на основании филогенетических исследований.

Серотонин (5-НТ) иммуноцитохимически выявляется на самых ранних стадиях развития морской гастроподы Tritonia diomedea. На стадииях от одного до восьми бластомеров серотонин обнаруживается в цитоплазме вблизи анимального полюса. На стадиях морулы и бластулы он концентрируется в группе микромеров на анимальном полюсе. Начиная со стадии гаструлы иммунореактивность к серотнину перестает проявляться и возникает опять на стадии раннего велигера уже к нейронах апикального органа. Антагонисты 5-НТг рецепторов (ритансерин и ципрогептадин), а также липофильные дериваты дофамина блокировали деления дробления и нарушали их нормальный паттерн. Эти эффекты снимались серотонином, его высоколипофильными дериватами и серотонинамидами полиенольных жирных кислот, но не гидрофильными (четвертичными) аналогами 5-НТ и 5-HTQ. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что у голожаберных моллюсков эндогенный серотонин в эмбрионах на донервных стадиях действует как регулятор делений дробления.

Представители класса Polyplacophora - хитоны — являются наиболее примитивными моллюсками и поэтому представляют большой интерес для понимания основных закономерностей развития и филогении трохофорных животных. Самые ранние нервные элементы в развитии хитона, Ischnochiton hakodadensis — это периферические сенсорные РМИРамид- и серотонин-содержащие нейроны, появляющиеся в передней полусфере у только что вылупившихся трохофор, и посылающие отростки в апикальный орган. Среди них имеются две пары особых крупных латерально расположенных клеток (коэкспрессирующих БМИРамид и серотонин), которые, по-видимому, прокладывают пионерные пути для последующего развития дефинитивной нервной системы. Апикальный орган хитона содержит самое большое число нейронов, по сравнению с апикальными органами всех других изученных до настоящего времени личинок моллюсков. Кроме того, множество претрохально расположенных нейронов окружают апикальный орган. Эти нейроны экспрессируют или РМИРамид, или серотонин. Прототрох не иннервируется ларвальными нейронами. Первые РМИРамиди серотонин-иммунореактивные нейроны в развивающейся взрослой ЦНС появляются значительно позже в церебральном ганглии и педальных стволах. Ни один нейрон из личиночной нервной системы не сохраняется во взрослой ЦНС, и все они прекращают синтез нейромедиатора и дегенерируют после оседания. Таким образом, несмотря на то, что строение центральной нервной системы взрослых хитонов больше напоминает таковое полихет, чем гастропод, генеральный сценарий развития их нервной системы повторяет схему развития нервной системы гастропод, а не полихет.

Существующие представления о нейрогенезе полихет, как начинающемся в зачатках центральных ганглиев и только потом распространяющемся на периферию, были опровергнуты нашими исследованиями. В личиночном развитии морской полихеты, Phyllodoce maculate, первый нейрон дифференцируется задолго до вылупления, на стадии ранней трохофоры. Это одиночная серотонин-иммунореактивная периферическая сенсорная клетка, которая находится на дорзальной стороне заднего конца тела зародыша. Этот нейрон посылает вперед базальные отростки, которые маркируют район формирования будущих вентральных нервных стволов и кольцевого нерва прототроха. Вскоре после этого появляется еще две серотонин-иммунореактивные дорзальные сенсорные клетки и три РМКРамид-иммунореактивные периферические сенсорные клетки. Базальные отростки этих клеток маркируют контур будущей дефинитивной нервной системы (церебральный ганглий, вентральные стволы, кольцевой нерв прототроха и окологлоточное нервное кольцо) уже на стадии ранней трохофоры до ее вылупления из яйца. Затем, непосредственно перед вылуплением развивается личиночная нервная система, включающая в себя апикальный орган, меридианальные нервы в эписфере и посттрохальные нервы, иннервирующие стоматогастрический комплекс.

Формируется сенсорный орган, расположенный на дорзальной стороне и состоящий из двух серотонин-содержащих нейронов и трех нейронов неидентифицированной ергичности (но не РМЯРамид-иммунореактивных), имеющих каждый по одной ресничке. Одиночное нервное волокно идет в дорзальный сенсорный орган из апикального органа.

После вылупления зачатки дефинитивной нервной системы начинают развиваться вдоль путей, проложенных первыми периферическими сенсорными нейронами. Таким образом, генеральная стратегия нейрогенеза у изученного нами типичного представителя полихет повторяет стратегию моллюсков. Первый дифференцирующийся нейрон — это также периферическая сенсорная клетка, расположенная в задней части зародыша.

Подробное морфологическое исследование ранних клеток всех изученных групп трохофорных животных показало, что они или несут пучок ресничек, выходящий на поверхность (прудовик, катушка, тритония, филлодоце), или являются ампуллятор-ными и содержат реснички в специальной полости (хитон), то есть, практически всегда являются сенсорными.

Обобщая полученные данные, можно заключить, что у всех исследованных видов моллюсков и полихет самые ранние нервные элементы выявленные в развитии обладают рядом общих свойств. Они начинают экспрессировать серотонин и/или пептид семейства РМИРамида на стадии трохофоры, то есть значительно раньше, чем нейроны в формирующихся центральных ганглиях. Маркирование антителами против а-тубулина доказало, что обнаруженные нами ранние клетки являются единственными нервными элементами, присутствующими у личинок на стадии трохофоры - раннего велигера. Тела ранних нейронов расположены на периферии, при этом все клетки являются сенсорными. Ход отростков ранних клеток маркирует контур дефинитивной нервной системы, характерный для каждого вида, и лишь после того, как такой «остов» будет создан, вдоль него начинают формироваться центральные ганглии и связывающие их коннективы и комиссуры. Ранние клетки не входят в состав ни одного из дефинитивных ганглиев и перестают экспрессировать свойственные им трансмиттеры после определенного периода рзвития, то есть являются транзиторными. Исходя из этого, можно заключить, что стратегия раннего нейрогенеза сходна в разных группах трохофорных животных. Это позволяет по новому взглянуть на цепь событий, происходящих в раннем нейрогенезе трохофорных. То, что первые нейроны расположены, в большинстве случаев, в задней полусфере личинки и посылают отростки вперед, опровергает общепринятые представления о происхождении эмбриональных нейронов и о формировании нервной системы в ростро-каудальном направлении, а также изменяет взгляд на вероятные механизмы аксональной навигации, важные для развития нервной системы. В частности, то, что «остов» нервной системы сначала обозначается отростками ранних периферических клеток, позволяет предположить, что аксоны дифференцирующихся позже в центральных ганглиях нейронов только следуют вдоль уже существующих путей, но не прокладывают новые траектории между ганглиями. То-есть, механизмы, лежащие в основе навигации отростков ранних клеток, в свою очередь, определяют всю структуру нервной системы соответствующего вида трохофорных.

С другой стороны, ранние нейроны различаются по числу, медиаторной специфичности и по их расположению относительно прототроха. У большинства моллюсков они расположены исключительно позади прототроха и экспрессируют FMRFaMHfl. У хитона, однако, они все расположены претрохально и экспрессируют и серотонин, и FMRFaMRfl. А у филлодоце часть клеток расположена позади прототроха, часть на уровне прототроха, а одна впереди него. При этом некоторые из ранних клеток являются серотонинергическими, в то время, как другие экспрессируют исключительно FMRFaMHfl. Таким образом, гомология ранних нейронов у трохофор аннелид и моллюсков находится под вопросом. Более вероятно, что у всех трохофорных животных эти негомологичные нейроны выполняют аналогичную морфогенетическую функцию и играют схожую роль в регуляции развития.

Фармакологические эксперименты на личинках полихет показали, что активация синтеза серотонина в ранних нейронах приводит к общему торможению развития, а также блокирует рост отростков и дифференцировку нервных клеток. Экспериментально показано, что развитие пресноводных пульмонат находится под постоянным слабым тормозным влиянием апикальных моноаминергических сенсорных нейронов, которые являются частью апикального сенсорного органа. Моноамины, синтезируемые и выбрасываемые этими нейронами, связываются с эргометрин-чувствительными рецепторами внутри тела зародыша и вызывают торможение развития. В случае неблагоприятных условий внешней среды (скученность и отсутствие пищи), апикальные клетки активируются химическим сигналом (сигналами), испускаемым ювенильными улитками. В ответ на активацию клетки усиливают секрецию и выброс моноамина, который, в свою очередь, усиливает торможение развития. Таким образом, был обнаружен новый механизм, регулирующий личиночное развитие трохофорных животных, и доказана роль моноаминергических апикальных нейронов как опосредующих действие сигналов из внешней среды на развитие личинки.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Воронежская, Елена Евгеньевна, Москва

1. Беклемишев В.Н. 1964. Основы сравнительной анатомии беспозвоночных. Т 1-2. М., Наука.

2. Бузников Г.А. 1987. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе. М. Наука.

3. Бузников Г.А. Низкомолекулярные регуляторы эмбрионального развития. М. Наука.

4. Бузников Г.А., Маркова Л.Н., Милошевич И., Ракич Л., Турпаев Т.М. 1986. Локализация серотонин-подобного вещества в эмбрионах с мозаичным типом развития. Доклады Академии Наук СССР. 287, 1506-1508.

5. Волохов А.А. 1951. Закономерности онтогенеза нервной деятельности в свете эволюционного учения. Москва-Ленинград. Изд-во АН СССР.

6. Воронежская Е.Е. 1990. Нейрональные катехоламины в эмбриогенезе прудовика Lymnaea stagnalis. Онтогенез. 21, 593-597.

7. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров Д.А. 1992. Возможное влияние нейрональных катехоламинов на эмбриогенез моллюска. Онтогенез 23, 295.

8. Воронежская Е.Е., Хабарова М.Ю. 2003. Функция апикального органа в развитии беспозвоночных. Доклады Академии Наук. 390, 231-234.

9. Иванова-Казас О.М. 1977. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Трохофорные, щупальцевые, щетинкочелюстные, погонофоры. М. Наука.

10. Иванова-Казас ОМ. 1995. Эволюционная эмбриология животных. Ст-Петербург. Наука.

11. Каботянский Е.А., Сахаров Д. А. 1989. Катехоламинергические нейроны крылоного молюска Clione limacina. Журн. Эвол. Биохим. Физиол., 25, 295-304.

12. Малахов В.В, Медведева Л.А. 1985. Эмбриональное и раннее личиночное развитие двустворчатого моллюска Mylilus edulis (Mytilida, Mytilidae) Зоол. Журн. 64, 1808-1815.

13. Мещеряков В.Н. 1975. Прудовик Lymnaea stagnalis L. В книге: Объекты биологии развитияю М. Наука, С53-92.

14. Сахаров Д.А. 1990 Множественность нейротрансмиттеров: функциональное значение. Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 26, 733-740.

15. Сахаров Д.А., Каботянский Е.А. 1986. Интеграция поведения крылоного моллюска дофомином и серотонином. Журн. Общ. Биол. 47, 161-166

16. Сотников О.С., Богута К.К., Голубев А.И., Миничев Ю.С. 1994. Механизмы структурной пластичности нейронов и филогенез нервной системы. Ст-Петербург. Наука.

17. Шеперд Г.М. 1987. Нейробиология. Т. 1-2. Москва. Мир.

18. Akesson В. 1967. On the nervous system of the Lopadorhynchus larva (Polychaeta). Arkiv For Zoologi 20, 55-78.

19. Anderson DT. 1966. The comparative embryology of the Polychaeta. Acta Zoologica 47, 1-42.

20. Arkett, SA, Chia F-S, Goldberg JI, Koss R. 1989. Identified settlement receptor cells in a nudibranch veliger respond to specific cue. Biol Bull 176, 155-160.

21. Audesirk G, McCaman RE, Willows AOD. 1979. The role of serotonin in the control of pedal ciliary activity by identified neurons in Tritonia diomedea. Comp Biochem Physiol 62, 87-91.

22. Bahls, F. H. 1990 Analysis of a long-duration hyperpolarization produced by octopamine in an identified ejector neuron of Helisoma. Neurosci. Lett. 120, 131.

23. Baker, M. W., Vohra, M. M. and Croll, R. P. (1993). Serotonin depletors, 5,7-dihydroxytryptamine and p-chlorophenylalanine, cause sprouting in the CNS of the adult snail. Brain Research 623, 311-315.

24. Baldessarini RJ. 1996. Drugs and the treatment of psychiatric disorders. In: Hardman JG, Limbird LE, editors. Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed. New York. McGraw-Hill. P399-430.

25. Baldwin NS, Newell RIE. 1995. Feeding rate responses of oyster larvae (Crassostrea virginica) to seston quantity and composition. J Exp Mar Biol Ecol 189, 77-91.

26. Bargmann CI, Horvitz HR. 1991. Control of larval development by chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Science 251, 1243-1246.

27. Barlow LA, Truman JW. 1992. Patterns of serotonin and SCP immunoreactivity during metamorphosis of the nervous system of the red abalone, Haliotis rufescens. J Neurobiol 23, 829-844.

28. Bartolomaeus T. 1989. Larvae nierenorgane bei Lepidochiton cinereus (Polyplacophora) und Aeolidiapapillosa (Gastropoda). Zoomorphology 108, 297-307.

29. Bate, С. M. 1976. Pioneer neurons in an insect embryo. Nature 260: 54-55.

30. Batta S, Walker RJ, Woodruj GN. 1979. Pharmacological studies on Helix neuron octopamine receptors. Comp Biochem Physiol 64C, 43-51.

31. Baxter GT, Morse DE. 1992. Cilia from abalone larvae contain a receptor-dependent G protein transduction system similar to that in mammals. Biol Bull 183, 147-154.

32. Bayne BL. 1971. Some morphological changes that occur at the metamorphosis of the larvae of Mytilus edulis. In: Fourth European Marine Biology Symposium,. Crisp DS, editor. London. Cambridge University Press. P259-280

33. Beiras R, Widdows J. 1995. Effects of the neurotransmitters dopamine, serotonin, and norepinephrine on the ciliary activity of mussel (Mytilis edulis) larvae. Mar Biol 122, 597-603.

34. Benjamin PR, Burke JF. 1994. Alternative mRNA splicing of the FMRFamide gene and its role in neuropeptidergic signalling in a defined neural network. BioAssays 16, 335342.

35. Benjamin PR, Elliott CJH. 1989. Snail feeding oscillator: the central pattern generator and its control by modulatory interneurons. In: Jacklet JW, editor. Neural and cellular oscillators. New York, Basel. Marcel Dekker. PI 73-214.

36. Benjamin PR, Elliott CJH. 1989. Snail feeding oscillator: the central pattern generator and its control by modulatory interneurons. In: Jacklet J, editor. Cellular and Neuronal Oscillators. New York. Marcel Dekker. p 173-214.

37. Benjamin PR, Ings C. 1972. Golgi-Cox studies on the central nervous system of a gastropod mollusc. Z Zellforsch 128, 564-582.

38. Benjamin PR, Rose RM, Slade CT, Lacy MG. 1979. Morphology of identified neurones in the buccal ganglia of Lymnaea stagnalis. J Exp Biol 80, 119-135.

39. Benjamin PR, Rose RM, Slade CT, Lacy MG. 1979. Morphology of identifed neurones in the buccal ganglia of Lymnaea stagnalis. J Exp Biol 80, 119-135.

40. Benjamin PR, Rose RM. 1979. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J Exp Biol 80, 93-118.

41. Benjamin PR, Winlow W. 1981. The distribution of three wide-acting synaptic inputs to identified neurons in the isolated brain of Lymnaea stagnalis (L.). Comp Biochem Physiol 70A, 293-37.

42. Benjamin PR. 1983. Gastropod feeding: behavioural and neural analysis of a complex multicomponent system. In: Roberts A, Roberts B, editors. Neural origin of rhythmic movements. Cambridge. Cambridge University Press. PI59-193.

43. Bhup R, Marsden JR. 1982. The development of the central nervous system in Capitella capitata (Polychaeta, Annelida). Can J Zool 60, 2284-2295.

44. Blake JA. 1975. The larval development of Polychaeta from the Nortern California Coast. III. Eighteen species of errantia. Ophelia 14, 23-84.

45. Boettcher AA, Targett NM. 1998. Role of chemical inducers in larval metamorphosis of queen conch, Strombus gigas Linnaeus: relationship to other marine invertebrate systems. Biol Bull 194, 132-142.

46. Bonar DB, Coon SL, Walch M, Weiner M, Fitt W. 1990. Control of oyster settlement and metamorphosis by exogenous chemical cues. Bull Mar Sci 46, 484-498.

47. Bonar DB. 1978. Ultrastructure of a cephalic sensory organ in larva of the gastropod Phestilla sibogae (Aeolidacea, Nudibranchia). Tissue Cell 10, 153-165.

48. Bright K, Kellett E, Saunders SE, Brierley M, Burke JF, Benjamin PR. 1993. Mutually exclusive expression of alternatively spliced FMRFamide transcripts in identified neuronal systems of the snail Lymnaea. JNeurosci 13, 2719-2729.

49. Bullock TH, Horridge GA. 1965. Structure and function in the nervous systems of invertebrates. Vol. 1-2. San Francisco, London. Freeman and Co.

50. Bustamante J, Krasne FB. 1991. Effects of octopamine on transmission at the first synapse of the crayfish lateral giant escape reaction pathway. J Comp Physiol 169A, 369-377.

51. Butschli O. 1912. Vorlesungen iiber vergleichende Anatomie. 2 Lief. Leipzig. W. Engelmann.

52. Buznikov GA, Bezuglov VV. 2000. 5-Hydroxytryptamides and 3-hydroxytyramides of polyenoic fatty acids as a tool for studying the pre-nervous biogenic monoamines functions. Russ J Physiol 86, 1093-1108.

53. Buznikov GA, Lambert HW, Lauder JM. 2001. Serotonin and serotonin-like substances as regulators of early embryogenesis and morphogenesis. Cell Tissue Res 305, 177-186.

54. Buznikov GA. 1990. Neurotransmitters in embryogenesis., Chur, Switzerland. Harwood Academic Press.

55. Buznikov GA., Shmukler YB, Lauder JM. 1996. From oocyte to neurone: do neurotransmitters function in the same way throughout development? Cell Mol Neurobiol 16, 533-559.

56. Candiani S, Augello A, Oliveri D, Passalacqua M, Pennati R, De Bernardi F, Pestarino M. 2001. Immunocytochemical localization of serotonin in embryos, larvae and adults of the lancelet, Branchiostoma floridae. Histochem J 33, 413-420.

57. Carlberg M, Jegril B, Lindbladh C, Rosengren E. 1984. Enzymatic 5-hydroxylation of L-DOPA by a tyrosinase isolated from the sea anemone Metridium senile. Gen Pharmacol 15,301-307.

58. Carpenter DO, Gaubatz GL. 1974. Octopamine receptors on Aplysia neurones mediate hyperpolarisation by increasing membrane conductance. Nature 252, 483-485.

59. Carus CY. 1828. Das Drehen des Embrio im Ei der Schnecken. Ztschr f organ Physic, Eisenach, 2, 470. Цит. no Preyer, 1885.

60. Caudy M, Bentley D. 1986. Pioneer growth cone steering along a series of neuronal and non-neuronal cues of different affinities. J Neurosci 6, 1781-1795.

61. Cazaux C. 1969. Etude morphologique du dёveloppement larvaire d'anndlides polychetes II. Phyllodocidae, Syllidae, Nereidae. Arch Zool Exp Gen 110, 145-202.

62. Cazaux C. 1975. Reproduction et developpement larvaire de Phyllodoce laminosa. Cah Biol Mar 26, 541-549.

63. Chia FS, Koss R. 1984. Fine structure of the cephalic sensory organ in the larva of the nudibranch Rostanga pulchra (Mollusca, Opisthobranchia, Nudibranchia). Zoomorphology 104,131-139.

64. Chia FS, Rice ME, editors. 1978. Settlement and Metamorphosis of Marine Invertabrate Larvae. New York. Elsevier.

65. Christiansen M. 1954. Life history of Lepidopleurus asellus. Nytt Mag Zoologi 2, 5272.

66. Colas JF, Launay JM, Maroteaux L. 1999a. Maternal and zygotic control of serotonin biosynthesis are both necessary for Drosophila germband extension. Mech Dev 87:6776

67. Colas JF, Launay JM, Vonesch JM, Hickel P, Maroteaux L. 1999b. Serotonin synchronises convergent extension of ectoderm with morphogenetic gastrulation movements in Drosophila. Mech Dev 87, 77-91.

68. Conklin EG. 1897. The embiyology of Crepidula. J Morphol 13,1 -230.

69. Coon SL, Bonar DB. 1986. Norepinephrine and dopamine content of larvae and spat of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Biol Bull 171, 632-639.

70. Cooper JR, Bloom FE, Roth RH. 1996. The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 7th ed. New York, Oxford University Press.

71. Cooper JM, Leise EM. 1996. Serotonin injections induce metamorphosis in larvae of the gastropod mollusc Ilyanassa obsoleta. Biol Bull 191, 178-186.

72. Cornea-Hebert V, Riad M, Wu C, Singh SK, Descarries L. 1999. Cellular and subcellular distribution of the serotonin 5-НТгА receptor in the central nervous system of adult rat. J Comp Neurol 409, 187-209.

73. Cragg SM, Crisp DC. 1991. The biology of scallop larvae. In: Shumway SE, editor. Scallops: Biology, Ecology and Aquaculture. Amsterdam. Elsevier Science Publishers. P75-132.

74. Croll RP, Baker MW, Khabarova MY, Voronezhskaya EE, Sakharov DA. 1997. Serotonin depletion after prolonged chlorpromazine treatment in a simpler model system. Gen Pharmacol 29, 91-96.

75. Croll RP, Chiasson BJ. 1989. Postembryonic development of serotoninlike immunoreactivity in the central nervous system of the snail, Lymcmea slagnaJis. J Comp Neurol 280, 122-142.

76. Croll RP, Chiasson BJ. 1990. Distribution of catecholamines and of immunoreactivity to substances like vertebrate enzymes for the synthesis of catecholamines within the central nervous system of the snail, Lymnaea stagnalis. Brain Res 525, 101-114.

77. Croll RP, Jackson DL, Voronezhskaya EE. 1997. Catecholaminecontaining cells in larval and post-larval bivalve molluscs. Biol Bull 193, 116-124.

78. Croll RP, Van Minnen J, Smit AB, Kits KS. 1991. APGWamide: Molecular, histological and physiological examination of a novel neuropeptide. In: Kits KS, Boer HH, Joose J, editors. Molluscan Neurobiology. Amsterdam: North-Holland. P248-254.

79. Croll RP, Voronezhskaya EE, Hiripi L, Elekes K. 1999. Development of catecholaminergic neurons in the pond snail, Lymnaea stagnalis: II. Postembryonic development of central and peripheral cells. J Comp Neurol 404, 297-307.

80. Croll RP, Voronezhskaya EE. 1995. Early FMRFamide-like immunoreactive cells in gastropod neurogenesis. Acta Biol Hung 46, 295-303.

81. Croll RP, Voronezhskaya EE. 1996a. Early elements in gastropod neurogenesis. Dev Biol 173, 344-347.

82. Croll RP, Voronezhskaya EE. 1996b. Early neurodevelopment in Aplysia, Lymnaea and Helisoma. Soc Neurosci Abstr 22, 1948.

83. Croll RP. 1983. Gastropod chemoreception. Biol Rev 58, 293-319.

84. Croll RP. 1987. Distribution of monoamines in the central nervous system of the nudibranch gastropod Hermissenda crassicornis. Brain Res 405, 337-347.

85. Croll RP. 1988. Distribution of monoamines within the central nervous system of the pulmonate snail Achatina fulica. Brain Res 460, 29-49.

86. Croll, R. P. 2000. Insights into early molluscan neuronal development through studies of transmitter phenotypes in embryonic pond snails. Microsc Res Techniq 49, 570-578.

87. Culliney JL. 1974. Larval development of the giant scallop Placopecten magellanicus (Gmelin). Biol Bull 147, 321-332.

88. Cumin R. 1972. Normantafel zur Organogenese von Limnaea stagnalis (Gastropoda, Pulmonata) mit besonderer Beriicksichtigung der Mittekdarmdriise. Rev Suisse Zool 79, 709-774.

89. D'Asaro CN. 1969. The comparative embryogenesis and early organogenesis of Bursa corrugata Perry and Distorsio clathrata (Gastropoda: Prosobranchia). Malacologia 9, 349-389.

90. Daniels SA, Ailion M, Thomas JH, Sengupta P. 2000. egl-4 acts through a transforming grows factor-p/SMAD pathway in Caenorhabditis elegans to regulate multiple neuronal circuits in response to sensory cues. Genetics 156, 123-141.

91. David J-C, Coulon J-F. 1985. Octopamine in invertebrates and vertebrates. A review. Progr Neurobiol 24, 141-185.

92. De Boer PACM, Jansen RF, Ter Maat A. 1996. Copulation in the hermaphroditic snail Lymnaea stagnalis: A review. Invert Reprod Dev 30, 166-176.

93. De la Torre JC. 1980. An improved approach to histofluorescence using the SPG method for tissue monoamones. J Neurosci Methods 3, 1-5.

94. Del Rio MJ, Velez-Pardo C, Ebinger G, Vauquelin G. 1995. Serotonin binding proteins "SBP": target proteins and tool for in vitro neurotoxicity studies. Gen Pharmacol 26, 1633-1641.

95. Delaney K, Gelperin A. 1990. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limax maximus. III. Integration of sensory inputs. J Comp Physiol 166A, 311-326.

96. Desai C, Garriga G, Mclntire SL, Horvitz HR. 1988. A genetic pathway for the development of the Coenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature 336, 638-646.

97. Dickinson AJG, Croll RP, Voronezhskaya EE. 2000. Development of embryonic cells containing serotonin, catecholamines and FMRFamide-related peptides in Aplysia californica. Biol Bull 199, 305-315.

98. Dickinson AJG, Croll RP. 2001. Neurocalcin-like immunoreactivity in embryonic stages of the gastropod molluscs Aplysia californica and Lymnaea stagnalis. Invert Biol 120, 206-216.

99. Dickinson AJG, Nason J, Croll RP. 1999. Histochemical localization of FMRFamide, serotonin and catecholamines in embryonic Crepidula fornicata (Gastropoda, Prosobranchia). Zoomorphology 119, 49-62.

100. Diefenbach TJ, Koehncke NK, Goldberg JI. 1991. Characterization and development of rotational behavior in Helisoma embryos: role of endogenous serotonin. J Neurobiol 22, 922-934.

101. Diefenbach TJ, Koss R, Goldberg JI. 1998. Early development of an identified serotonergic neuron in Helisoma trivolvis embryos: serotonin expression, de-expression, and uptake. J Neurobiol 34, 361-376.

102. Diefenbach TJ, Sloley BD, Goldberg JI. 1995. Neurite branch development of an identified serotonergic neuron from embryonic Helisoma: evidence for autoregulation by serotonin. Dev Biol 167, 282-293.

103. Doe CQ, Goodman CS. 1985. Early events in insect neurogenesis. I. Development and segmental differences in the pattern of neuronal precursor cells. Dev Biol 111, 193-205.

104. Doherty MD, Pickel VM. 2000. Ultrastructural localization of the serotonin 2A receptor in dopaminergic neurons in the ventral tegmental area. Brain Res 864, 176-185.

105. Eernisse DJ, Reynolds PD. 1994. Polyplacophora. In: Harrison FW, Kohn AJ, editors. Microscopic anatomy of invertebrates. Vol. 5. Mollusca I. New York. Wiley-Liss.

106. Ekstrom P, Honkanen T, Borg B. 1991. Development of tyrosine hydroxylase- and dopamine b-hydroxylase-immunoreactive neurons in a teleost, the three-spined stickleback. J Chem Neuroanat 5,481-501.

107. Elekes K, Eckert M, Rapus J. 1993. Small sets of putative interneurons are octopamine-immunoreactive in the central nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Brain Res 608, 191-197.

108. Elekes K, Eckert M, Rapus J. 1993. Small sets of putative interneurons are octopamine-immunoreactive in the central nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Brain Res 608, 191-197.

109. Elekes K, Kemenes G, Hiripi L, Geffard M, Benjamin PR. 1991. Dopamineimmunoreactive neurons in the central nervous system of the pond snail Lymnaea stagnalis. J Comp Neurol 307, 214-224.

110. Elekes K, Voronezhskaya EE, Hiripi L, Eckert M, Rapus J. 1996. Octopamine in the developing nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Acta Biol Hung 47, 73-87.

111. Elekes K,Voronezhskaya EE, Hiripi L, Eckert M, Rapus J. 1996. Octopamine in the developing nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis L. Acta Biol Hung 47, 73-87.

112. Elliott CJH, Benjamin PR. 1985a. Interactions of pattern-generating interneurons controlling feeding in Lymnaea stagnalis. J Neurophysiol 54, 1396-1411.

113. Elliott CJH, Benjamin PR. 1985b. Interactions of the slow oscillator interneuron with feeding pattern-generating interneurons in Lymnaea stagnalis. J Neurophysiol 54, 14121421.

114. Elliott CJH, Stow RA, Hastwell C. 1992 Cholinergic interneurons in the feeding system of the pond snail Lymnaea stagnalis. I. Cholinergic receptors on feeding neurons. Phil Trans R Soc bond В 336, 157-166.

115. Elphick MR., Kemenes G, Staras K, Oshea M. 1995 Behavioral role for nitric-oxide in chemosensory activation of feeding in a mollusc. J Neurosci 15, 7653-7664.

116. Emanuelsson H. 1974. Localization of serotonin in cleavage embryos of Ophryotrocha labronica La Greca and Bacci. Roux Arch Entwickl Mech 175, 253-271.

117. Emanuelsson H. 1992. Autoradiographic localization in polychaete embryos of tritiated mesulergine, a selective antagonist of serotonin receptors that inhibits early polychaete development. Int J Dev Biol 36, 293-302.

118. Evans PD. 1985. Octopamine. In: Kerkut GA, Gilbert L, editors.Comprehensive insect physiology. VI1. Oxford. Pergamon. P499-529.

119. Fickbohm DJ, Katz PS. 2000. Paradoxical actions of the serotonin precursor 5-hydroxytryptophan on the activity of identified serotonergic neurons in a simple motor circuit. J Neurosci 20, 1622-1634.

120. Flyachinskaya LP. 2000. Localization of serotonin and FMRFamide in the bivalve mollusc Mytilus edulis at early stages of its development. J Evol Biochem Physiol 36, 66-70.

121. Fujiwara-Sakata M, Muneoka Y, Kobayashi M. 1991. Action and immunoreactivity of neuropeptides in the buccal neuromuscular system of a prosobranch mollusc, Rapana thomasiana. Cell Tissue Res 264, 57-62.

122. Furness JB, Costa M,Wilson AJ. 1977.Water-stable fluorophores, produced by reaction with aldehyde solutions, for the histochemical localization of catechol- and indolethylamines. Histochemistry 52, 159-170.

123. Gardner CR, Walker RJ. 1982. The roles of putative neurotransmitters and neuromodulators in annelids and related invertebrates. Progr Neurobiol 18, 81-120.

124. Gerhardt CC, Van Heerikhuizen H. 1997. Functional characteristics of heterologously expressed 5-HT receptors. Eur J Pharmacol 311, 1-23.

125. Gerschenfeld HM, Stefani E. 1965. 5-Hydroxytryptamine receptors and synaptic transmission in molluscan neurones. Nature 205(4977), 1216-1218.

126. Goldberg JI, Kater SB. 1989. Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system. Dev Biol 131,483-495.

127. Goldberg JI, Koehncke NK, Christopher KJ, Neumann C, Diefenbach TJ. 1994. Pharmacological characterization of a serotonin receptor involved in an early embryonic behavior of Helisoma trivolvis. J Neurobiol 25, 1545-1557.

128. Goodman CS, Shatz CJ. 1993. Developmental mechanisms that generate precise patterns of neuronal connectivity. Cell 72, 77-98.

129. Grant RE. 1827. Die Wimpem junger Gastropoden und die Ursache der Spiralform einschaliger Schaltiere. Ztschr f organ Physic. Цит. no Preyer, 1885.

130. Grave B. 1932. Embryology and life history of Chaetopleura apiculata. J Morphol 54, 153-160.

131. Greenberg MJ, Price DA. 1992. Relationships among the FMRFamide-like peptides. In: Joosse J, Buis RM, Tilders FJH editors. The peptidergic neuron. Progress in Brain Research 92. Cambridge. Elsevier. P25-37.

132. Guthrie PB, Neuhoff V, Osborne NN. 1975. Dopamine, norepinephrine, octopamine and tyrosine-hydroxylase in the gastropod Helixpomatia. Comp Biochem Physiol 52C, 109111.

133. Hadfield MG. 1978. Metamorphosis in marine molluscan larvae: an analysis of stimulus and response. In: Chia FS, Rice M, editors. Settlement and metamorphosis of marine invertebrate larvae. North-Holland, New York. Elsevier. PI65-175.

134. Hadfield, M. G., Meleshkevitch, E. A.and Boudko, D. Y.(2000). The apical sensory organ of a gastropod veliger is a receptor for settlement cues. Biol. Bull. 198, 67-76.

135. Haszprunar G, Friedrich S, Wanninger A, Ruthensteiner B. 2002. Fine structure and immunochemistry of a new chemosensory system in the chiton larva (Mollusca: Polyplacophora). J. Morphol. 251,210-218.

136. Haszprunar G, Salvini-Plawen L, Rieger RM. 1995. Larval planktotrophy: a primitive trait in the Bilateria? Acta Zool (Stockh) 76, 141-154.

137. Haydon PG, WinlowW. 1981. Morphology of the giant dopamine-containing neurone R.Pe.D.l in Lymnaea stagnalis revealed by Lucifer Yellow CN. J Exp Biol 94, 149-158.

138. Hay-Schmidt A. 1995. The larval nervous system of Polygordius lacteus Schneider, 1968 (Polygordiae, Polychaeta): Immunocytochemical data. Acta Zool (Stockh) 76, 121-140.

139. Hemadi L, Juhos S, Elekes K. 1993. Distribution of tyrosine-hydroxylaseimmunoreactive and dopamine-immunoreactive neurons in the central nervous system of the snail, Helix pomatia. Cell Tissue Res 274, 503- 513.

140. Hernadi L, Terano Y, Muneoka Y, Kiss T. 1995. Distribution of catch-relaxing peptide (CARP)-like immunoreactive neurons in the central and peripheral nervous system of Helixpomatia. Cell Tissue Res 280, 335-348.

141. Hessling R, Westheide W. 1999. CLSM analysis of development and structure of the central nervous system of Enchytraeus crypticus ("Oligochaeta", Enchytraeidae). Zoomorphology 119,37-47.

142. Hessling R, Westheide W. 2002. Are echiura derived from a segmented ancestor? Immunohistochemical analysis of the nervous system in developmental stages of Bonellia viridis. J Morphol 252, 100-113.

143. Hickmott PW, Carew TJ. 1991. An autoradiographic analysis of neurogenesis in juvenille Aplysia californica. J Neurobiol 22, 313-326.

144. Hiripi L, Juhos S, Downer RGH. 1994. Characterization of tyramine and octopamine receptors in the insect (Locusta migratoria migratorioides) brain. Brain Res 663, 119126.

145. Hiripi L,Vehovszky A, Juhos S, Elekes K. 1998. An octopaminergic system in the CNS of gastropod snails, Lymnaea stagnalis and Helix pomatia. Phil Trans R Soc Lond В 353, 1621-1629.

146. Hyman LH. 1967. The Ivertebrates. Vol. VI. Mollusca I. New York, London, Sydney. McGraw-Hill Book Company.

147. Inoue T, Thomas JH. 2000. Targets of TGF-P signalling in Caenorhabditis elegans dauer formation. Dev. Biol. 217, 192-204.

148. Jackson AR, MacRae TH, Croll RP. 1995. Unusual distribution of tubulin isoforms in the snail Lymnaea stagnalis. Cell Tissue Res 281, 507-515.

149. Jacob MH. 1984, Neurogenesis in Aplysia californica resembles nervous system formation in vertebrates. J Neurosci 5, 388-407.

150. Jelsing J. 2002. Ultrastructural investigations on the cephalic and metameric nuchal organs of Spio cf.filicornis (Polychaeta, Spionidae). Zoomorphology 121, 213-220.

151. Juel C. 1983. Pre- and postsynaptic effects of dopamine antagonists on dopamine synaptic transmisson in Helix pomatia. Comp Biochem Physiol 76C, 203-208.

152. Juhos Sz, Hiripi L, Elekes K. 1996. An octopamine system in the sentral nervous system of gastropods: a biochemical and immunocytochemical study. Neurochem. Int -смотреть том и старницы в WWW

153. Kandel ER, Kriegstein A, Schacher S. 1981. Development of the central nervous system of Aplysia in terms of the differentiation of its specific identifiable cells. Neuroscience 5, 2033-2063.

154. Kandel ER. 1979. Behavioral Biology of Aplysia. Freeman. San Francisco.

155. Kandel ER. 2001. The molecular biology of memory storage: A dialog between genes and synapses. Nobel Lecture, 8 December, 2000. Bioscience Reports 21, 565-611.

156. Kellett E, Saunders SE, Li KW, Staddon JW, Benjamin PR, Burke JF. 1994. Genomic organization of the FMRFamide gene in Lymnaea• multiple exons encoding novel neuropeptides. J Neurosci 14, 6564-6570.

157. Kemenes G, Elliott CJH, Benjamin PR. 1986 Chemical and tactile inputs to the Lymnaea feeding system effects on behavior and neural circuitry. J Exp Biol 122, 113137.

158. Kemenes G, Hiripi L, Benjamin PR. 1990. Behavioural and biochemical changes in the feeding system of Lymnaea induced by the dopamine and serotonin neurotoxins 6-hydroxydopamine and 5,6-dixydroxytryptamine. Phil Trans R Soc Lond В 329, 243255.

159. Kemenes G, Staras K, Benjamin PR. 1997. In vitro appetitive classical conditioning of the feeding response in the pond snail Lymnaea stagnalis. J Neurophysiol 78, 23512362.

160. Kempf SC, Chun GV, Hadfield MG. 1992. An immunocytochemical search for potential neurotransmitters in larvae of Phestilla sibogae (Gastropoda, Opistobranchia). Comp Biochem Physiol 101C, 299-305.

161. Kempf SC, Mashinovsky B, Willows AOD. 1987. A simple neuronal system characterized by a monoclonal antibody to SCP neuropeptides in embryos and larvae of Tritonia diomedea. J Neurobiol 18, 217-236.

162. Kempf SC, Page LR, Pires A. 1997. Development of serotonin-like immunoreactivity in the embryos and larvae of nudibranch mollusks with emphasis on the structure and possible function of the apical sensory organ. J Comp Neurol 386, 507-528.

163. Kleinenberg N. 1886. Die Entstehung des Annelids aus der Larve von Lopadorhynchus. Z WissZool 44, 1-227.

164. Koshtoyants KS, Buznikov GA, Manukhin BN. 1961. The possible role of 5-hydroxy-tryptamine in the motor activity of embryos of some marine gastropods. Comp Biochem Physiol 3, 20-26.

165. Koss R, Diefenbach TJ, Kuang S, Doran SA, Goldberg J I. 2003. Coordinated development of identified serotonergic neurons and their target ciliary cells in Helisoma trivolvis embryos. J Comp Neurol 457, 313-325.

166. Kowalevski AO. 1879. Uber die Entwicklung der Chitonen. Zool Anz 37, 469-473.

167. Kravitz EA. 1983. The well-modulated lobster.Trends Neurosci 6, 346-349.

168. Kriegstein AR. 1977. Development of the nervous system of Aplysia californica. Proc Natl Acad Sci USA 74, 375-378.

169. Kuang S, Doran SA, Wilson RJA, Goss GG, Goldberg JI. 2002. Serotonergic sensory-motor neurons mediate a behavioral response to hypoxia in pond snail embryos. J Neurobiol 52, 73-83.

170. Kuang S, Goldberg JI. 2001. Laser ablation reveals regulation of ciliary activity by serotonergic neurons in molluscan embryos. J Neurobiol 47, 1-15.

171. Kyriakides MA, McCrohan CR. 1989. Effect of putative neuromodulators on rhythmic buccal motor output in Lymnaea stagnalis. J Neurobiol 20, 635-650.

172. Labas YA, Belousov LV, Badenko LA, Letunov VN. 1982. The method of registration of cell mass growth and movements in multicellular animals and plants. Cytology 24, 973-979.

173. Lacalli ТС, Gilmour THJ. 2001. Locomotory and feeding effectors of the tornaria larva of Balanoglossus biminiensis. Acta Zool (Stockh) 82, 117-126.

174. Lacalli TC, Marsden JR. 1977. A reticulum of nerve-like cells from trochophores of Phyllodoce mucosa (Polychaeta). Experientia 33, 952-954.

175. Lacalli TC. 1981. Structure and development of the apical organ in trochophores of Spirobranchus polycerus, Phyllodoce maculata, and Phyllodoce mucosa. Proc R Soc Lond В 212, 381-402.

176. Lacalli TC. 1984. Structure and organization of the nervous system in the trochophore larva of Spirobranchus. Philos Trans R Soc Lond В 306, 79-135.

177. Lacalli TC. 1986. Prototroch structure and innervation in the trochophore larva of Phyllodoce (Polychaeta). Canad J Zool 64, 176-184.

178. Lacalli TC. 1988. The larval reticulum in Phyllodoce (Polychaeta, Phyllodocida). Zoomorphology 108, 61-68.

179. Lacalli TC. 1994. Apical organs, epithelial domains and origin of the chordate central nervous system. Am Zool 34, 533-541.

180. Leise EM, Thavaradhara K, Durham NR, Turner BE. 2001. Serotonin and nitric oxide regulate metamorphosis in the marine snail llyanassa obsoleta. Amer Zool 41, 258-267.

181. Lent C. 1986. New medical and scientific uses of the leech. Nature 323(6088), 494.

182. Lewenhock. 1722. Opera omnia senarcana naturae. Lugd Vatav. Цит. no Preyer, 1885.

183. Lin MF, Lease EM. 1996. Gangliogenesis in the prosobranch gastropod llyanassa obsoleta. J Comp Neurol 374, 194-203.

184. Linard B, Bennani S, Jego P, Saligaut C. 1996. Tyrosine hydroxylase activity and dopamine turnover of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) brain: The special status of the hypothalamus. Fish Physiol Biochem 15, 41-48.

185. Livingstone MS, Harris-Warrick RM, Kravitz EA. 1980. Serotonin and octopamine produce opposite postures in lobsters. Science 208, 76-79.

186. Marois R, Carew TJ. 1989. Pre-metamorphic development of serotonin immunoreactivity in Aplysia. Soc Neurosci Abstr 15, 1121.

187. Marois R, Carew TJ. 1990. The gastropod nervous system in metamorphosis. J Neurobiol 7, 1053-1071.

188. Marois R, Carew TJ. 1997a. Ontogeny of serotonergic neurons in Aplysia californica. J Comp Neurol 386,477-490.

189. Marois R, Carew TJ. 1997b. Fine structure of the apical ganglion and its serotonergic cells in the larva of Aplysia californica. Biol Bull 192, 388- 398.

190. Marois R, Carew TJ. 1997c. Projection patterns and target tissues of serotonergic cells in larval Aplysia californica. J Comp Neurol 386, 491- 506.

191. Marois R, Croll RP. 1991. Hatching asynchrony within the egg mass of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Invertebr Reprod Developm 19, 139-146.

192. Marois R, Croll RP. 1992. Development of serotonergic cells within the embryonic central nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis. J Comp Neurol 322, 255265.

193. Mayerhofer A, Smith GD, Danilchik M, Levine JE, Wolf DP, Dissen GA, Ojeda SR. 1998. Oocytes are a source of catecholamines in the primate ovary: evidence for a cell-cell regulatory loop. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10990-10995.

194. McAllister LB, Scheller R, Kandel ER, Axel R. 1983. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science 222, 800-808.

195. McCaman MW, McCaman RE, Lees GJ. 1972. Liquid cation exchange a basis for sensitive radiometric assays for aromatic amino acid decarboxylases. Anal Biochem 45, 242-252.

196. McCaman MW, McCaman RE. 1978. Octopamine and phenylethanolamine in Aplysia ganglia and in individual neurones. Brain Res 141, 347-352.

197. McCaman MW, Ono JK, McCaman RE. 1984. 5-Hydroxytryptamine measurements in molluscan ganglia and neurons using a modified radioenzymatic assay. J Neurochem 43, 91-98.

198. McCaman MW, Weinreich D, McCaman RE. 1973. The determination of picolmole level of 5-hydroxytyptamine and dopamine in Aplysia, Tritonia and leech nervous tissues. Brain Res 53, 129-137.

199. Mescheriakov VN. 1990. The common pond snail Lymnaea stagnalis L. In: Dettlaff DA, Vassetzky SG, editors. Animal species for developmental studies. New York, London. Plenum Press. P69-132.

200. Meyer A. 1901. Studien tiber den Korperbau der Anneliden. Mitt Zool Stat Neapel 14, 247-585.

201. Meyer A. 1939. Der Rogen (Spawn) und die Entwicklung der Trochophora von Eulalia viridis (Phyllodocidae). Biologia Generalis 14, 334-389.

202. Moody SA, editor. 1999. Cell lineage and fate determination. San Diego. Academic Press.

203. Moroz LL, Park JH, Winlow W. 1993. Nitric oxide activates buccal motor patterns in Lymnaea stagnalis. Neuroreport 4, 643-646.

204. Morrill JB. 1982. Development of the pulmonate gastropod, Lymnaea. In: Harrison FW, Cowden RR, editors. Developmental Biology of the Freshwater Invertebrates. New York. Alan Liss. P399-483.

205. Mtiller MC, Westheide W. 2002. Comparative analysis of the nervous systems in presumptive progenetic dinophilid and dorvilleid polychaetes (Annelida) by immunohistochemistry and cLSM. Acta Zoologica 83, 33-48.

206. Nagy T, Elekes K. 2002. Ultrastructure of neuromuscular contacts in the embryonic pond snail, Lymnaea stagnalis L. Acta Biol Hung 53, 125-139.

207. Nagy T, Ude J, Voronezhskaya EE, Elekes K. 1998. Ultrastructural and immunogold (FMRFamide) characterization of Lymnaea CNS in two specific developmental stages. Neurobiology 6, 58-61.

208. Newlin SA, Schlapfer WT, Barondes SH. 1980. Separate serotonin and dopamine receptors modulate the duration of post-tetanic potentiation at an Aplysia synapse without effecting other aspects of synaptic transmission. Brain Res 181, 89-106.

209. Nezlin LP, Elofsson R, Sakharov DA. 1994. Transmitter-specific subsets of sensory elements in the prosobranch osphradium. Biol Bull 187, 174-184.

210. Nezlin LP, Voronezhskaya EE. 1997. GABA-immunoreactive neurones and interactions of GABA with serotonin and FMRFamide in a peripheral sensory ganglion of the pond snail Lymnaea stagnalis. Brain Res 772, 217-225.

211. Nezlin LP, Voronezhskaya EE. 2003. Novel, posterior sensory organ in the trochophore larvae of Phyllodoce maculata (Polychaeta) Proc R Soc Lond В (Suppl) 270, S159-162.

212. Nielsen C. 1994. Larval and adult characters in animal phylogeny. Am Zool 34, 492501.

213. Nielsen C. 1995. Animal evolution: interrelations of living phyla. Oxford. Oxford University Press.

214. Nielsen C. 1998. Origin and evolution of animal life cycles. Biol Rev Cambridge Philos Soc 73, 125-155.

215. Nielsen C. 2001. Animal evolution: Interrelationships of the living phyla, 2nd ed. Oxford. Oxford University Press.

216. Oppenheim RW. 1999. Programmed cell death. In: Zigmond MJ, Bloom FE, Landis SC, Roberts JL, Squire LR, editors. Fundamental neuroscience. San Diego. Academic Press, P581-610.

217. Orrhage L, Eibye-Jacobsen D. 1998. On the anatomy of the central nervous system of Phyllodocidae (Polychaeta) and the phylogeny of phyllodocid genera: a new alternative. Acta Zool (Stockh) 79, 215-234.

218. Osada M, Nomura T. 1989. Seasonal variations of catecholamine levels in the tissues of the Japanese oyster, Crassostrea gigas. Comp Biochem Physiol 93C, 171-173.

219. Osborne NN, Priggmeier E, Neuhoff V. 1975. Dopamine metabolism in characterized neurones of Planorbis corneus. Brain Res 90, 261-271.

220. Osborne NN. 1984. Phenylethanolamine-N-transferase and dopamine-bhydroxylase immunoreactivity and the occurrence of noradrenaline and adrenaline in the nervous system of the snail, Helix aspersa. Cell Tissue Res 237, 605-608.

221. Page LR, Parries SC. 2000. Comparative study of the apical ganglion in planktrotrophic caenogastropod larvae: ultrastructure and immunoreactivity to serotonin. J Comp Neurol 418,383-401.

222. Page LR, Parries SC. 2000. Comparative study of the apical ganglion in planktotrophic caenogastropod larvae: ultrastructure and immunoreactivity to serotonin. J Comp Neurol 418,383-401.

223. Page LR. 1992. New interpretation of a nudibranch central nervous system based of ultrastructural analysis of neurodevelopment in Melibe leonina. I. Cerebral and visceral loop ganglia. Biol Bull 182, 348-365.

224. Page LR. 1993. Developmental analysis reveals labial and subradular ganglis and the primary framework of the nervous system in nudibranch gastropods. J Neurobiol 24, 1443-1459.

225. Page LR. 2002a. Comparative structure of the larval apical sensory organ in gastropods and hypotheses about function and developmental evolution. Inv Repr Dev 41, 193-200.

226. Page LR. 2002b. Apical sensory organ in larvae of the patellogastropod Tectura scutum. Biol Bull 202, 6-22.

227. Pani AK, Croll RP. 1995. Distribution of catecholamines, indolamines, and their precursors and metabolites within the scallop Placopecten megellanicus. (Bivalvia, Pectinidae). Cell Mol Neurobiol 15, 371-386.

228. Pani AK, Croll RP. 1998. Pharmacological analysis of monoamine synthesis and catabolism in the scallop, Placopecten magellanicus. General Pharmacology 31, 67-73.

229. Pavlova GA. 2001. Effects of serotonin, dopamine and ergometrine on locomotion in the pulmonate mollusc Helix lucorum. J Exper Biol 204, 1625-1633.

230. Pechenik JA, Marsden ID, Pechenik O. 2003. Effects of temperature, salinity, and air exposure on development of the estuarine pulmonate gastropod Amphibola crenata. J Exp Mar Biol Ecol 292, 159-176.

231. Pires A, Coon SL, Hadfield MG. 1997. Catecholamines and dihydroxyphenylalanine in metamorphosing larvae of the nudibranch Phestilla sibogae Bergh (Gastropoda: Opisthobranchia). J Comp Physiol 181 A, 187-194.

232. Pires A, Croll RP, Hadfield MG. 2000a. Catecholamines modulate metamorphosis in the opisthobranch gastropod Phestilla sibogae. Biol Bull 198, 319-331.

233. Pires A, Guilbault TR, Mitten JV, Skiendzielewski JA. 2000b. Catecholamines in larvae and juveniles of the prosobranch gastropod, Crepidula fornicata. Comp Biochem Physiol С 127, 37-47.

234. Preyer W. 1885. Specielle Physiologie des Embryo. Untersuchungen uber die Lebenserscheinungen vor der Geburt. Leipzig.

235. Price DA, Greenberg MJ. 1977. Structure of a molluscan cardioexcitatory neuropeptide. Science 197(4304), 670-671.

236. Purschke G. 1997. Ultrastructure of nuchal organs in polychaetes (Annelida) new results and review. Acta Zool (Stockh) 78, 123-143.

237. Quinlan EM, Arnett ВС, Murphy AD. 1997. Feeding stimulants activate an identified dopaminergic intemeuron that induces the feeding motor program in Helisoma. J Neurophysiol 78, 812-824.

238. Raven CP. 1966. Morphogenesis: the analysis of molluscan development. Oxford. Pergamon Press.

239. Renaud F, Parisi E, Capasso A, De Prisco P. 1983. On the role of serotonin and 5-methoxy-tryptamine in the regulation of cell division in sea urchin eggs. Dev Biol 98, 37-46.

240. Rodriguez JJ, Doherty MD, Pickel VM. 2000. N-Methyl-d-aspartate (NMDA) receptors in the ventral tegmental area: subcellular distribution and colocalization 5-hydroxytryptamine2A receptors. J Neurosci Res 60, 202-211.

241. Roeder T, Gewecke M. 1990. Octopamine receptors in locust nervous tissue. Biochem Pharmacol 39, 1793-1797.

242. Roeder T. 1995. Pharmacology of the octopamine receptor from locust central nervous tissue (OAR3). Br J Pharmacol 114, 210-216.

243. Rowe SJ, Messenger NJ, Warner AE. 1993. The role of noradrenaline in the differentiation of amphibian embryonic neurons. Development 19, 1343-1357.

244. Ruppert EE, Barnes RD. 1994. Invertebrate zoology. 6th ed. New York, London, Sydney. Saunders College Publishing.

245. Sakharov DA, Salanki J. 1982. Effects of dopamine antagonists on snail locomotion. Experientia 38, 1090-1091.

246. Sakharov DA, Voronezhskaya EE, Nezlin L, BakerMW, Elekes K, Croll RP. 1996. Tyrosine hydroxylase-negative, dopaminergic neurons are targets for transmitter-depleting action of haloperidol in the snail brain. Cell Mol Neurobiol 16, 449-459.

247. Sakharov DA. 1990. Integrative function of serotonin common to distantly related invertebrate animals. In: Gustafsson M, Reuter M, editors. Early Brain. Abo. Abo Akademi Press. P73-88.

248. Sakharov DA. 1991. Use of transmitter precursors in gastropod neuroethology. In: Kits KS, Boer HH, Joose J, editors. Molluscan neurobiology. Proc 3rd Symp Mollusc Neurobiol. Amsterdam. North-Holland. P236-242.

249. Salimova NB, Sakharov DA, Milosevic I, Turpaev TM, Rakic L. 1987. Monoamine-containing neurons in the Aplysia brain. Brain Res 400, 285- 299.

250. Santama N, Benjamin PR, Burke JF. 1995a. Alternative RNA splicing generates diversity of neuropeptide expression in the brain of the snail Lymanea: In situ analysis of mutually exclusive transcripts of the FMRFamide gene. Eur J Neurosci 7, 65-76.

251. Santama N, Li KW, Geraerts WPM, Benjamin PR, Burke JF. 1996. Post-translational processing of the alternative neuropeptide precursor encoded by the FMRFamide gene in the pulmonate snail Lymnaea stagnalis. Eur J Neurosci 8, 968-977.

252. Sawada M, Maeno T. 1987. Forskolin mimics the dopamine-induced K+ conductance increase in identified neurons of Aplysias kurodai. Jap J Physiol 37, 459-478.

253. Schacher S, Kandel ER, Woolley R. 1979. Development of neurons in the abdominal ganglion of Aplysia californica. I. Axosomatic contacts. Dev Biol 71, 163-175.

254. Schackwitz WS, Inoue T, Thomas JH. 1996. Chemosensory neurons function in parallel to mediate a pheromone response in C. elegans. Neuron 17, 719-728.

255. Schaefer K, Ruthensteiner B. 2001. The cephalic sensory organ in pelagic and intracapsular larvae of the primitive opisthobranch genus Haminoea (Mollusca: Gastropoda). Zool Anz 240, 67-80.

256. Schwartz LM, Oppenheim RW, Shatz CJ, editors. 1992. Neuronal cell death (Special Issue). J Neurobiol 23, 1111-1352.

257. Sedden CB.Walker RJ, Kerkut GA. 1968. The localization of dopamine and 5-hydroxy-tryptamine in neurons of Helix aspersa. Symp Zool Soc Lond 22, 19-32.264265266267268269.270271.272,273.274,275.276.277.278.279.280.281.

258. Serafeim A, Grafton G, Chamba A, Gregory CD, Blakely LD, Bowery NG, Barnes NM, Gordon J. 2002. 5-Hydroxytryptamine drives apoptosis in biopsylike Burkitt lymphoma cells: reversal by selective serotonin reuptake inhibitors. Neoplasia 99, 2545-2553

259. Shozushima M, Matsumoto M, Sasaki K, Sato M. 1987. Blocking action of serotonin on three types of dopamine receptors in Aplysia ganglion cells. In: Boer HH, editor. Neurobiology, molluscan models. Amsterdam. North-Holland. PI69-171.

260. Shozushima M. 1984. Blocking effect of serotonin on inhibitory dopamine receptor activity of Aplysia ganglion cells. Jap J Physiol 34, 225-243.

261. Slade CT, Mills J, Winlow W. 1981. The neuronal organization of the paired ganglia of Lymnaea stagnalis (1). Comp Biochem Physiol 69a, 789-803.

262. Sloley BD, Orikasa S. 1988. Selective depletion of dopamine, and 5-hydroxytryptamine in the nervous tissue of the cockroach (Periplaneta americana). J Neurochem 51, 535541.

263. Stefano GB, Hiripi L, Catapane EJ. 1978. The effects of short and long term temperature stress on serotonin, dopamine and norepinephrine concentrations in molluscan ganglia. J Therm Biol 3,79-83.

264. Stiebel S. 1815. Uber die Entwicklung der Teichornschnecken (Limneus stagnalis). Arch F D Physiol v Meckel 1,423-426.

265. Strathmann RR, Strathmann MF. 1995. Oxygen supply and limits on aggregation of embryos. J Mar Biol Assoc United Kingdom 75, 413-428.

266. Susswein AJ, Kupfermann I. 1975. Bulk as a stimulus for satiation in Aplysia. Behav Biol 13, 203-209.

267. Swammerdam. 1752. Bibel derNatur. Leipzig. Цит. no Preyer, 1885.

268. Syed N1, Lukowiak K, Bulloch AGM. 1990. In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea. Science 250, 282-285.

269. Sze JY, Victor M, Loer C, Shi Y, Ruvkun G. 2000. Food and metabolic signalling defects in a Caenorhabditis elegans serotonin-synthesis mutant. Nature 403, 560-564.

270. Takayanagi H, Takeda N. 1988. Dynamics of FMRFamide immunoreactivity in response to physiologically active substances in the central nervous system of the snail, Achatina fulica. Comp Biochem Physiol 91 A, 609-612.

271. Teyke T, Rosen SC, Weiss ICR, Kupfermann I. 1993. Dopaminergic neuron B20 generates rhythmic neuronal activity in the feeding motor circuitry of Aplysia. Brain Res 630,226-237.

272. Thomas JH. 1993. Chemosensory regulation of development in C. elegans. Bioessays 15, 791-797.

273. Torrence SA, Law MI, Stuart DK. 1989. Leech neurogenesis. II. Mesodermal control of neuronal pattern. Dev Biol 136, 40-60.

274. Trapido-Rosenthal HG, Morse DE. 1986a. Regulation of receptor-mediated settlement and metamorphosis in larvae os a gastropod mollusc (Haliotis rufescens). Bull Mar Sci 39, 383-392.282283284285,286,287,288,289,290,291,292.293,294,295,296,297,298.

275. Trapido-Rosenthal HG. and Morse DE. 1986b. Availability of chemosensory receptors in down-regulated by habituation of larvae to morphogenetic signal. Proc Natl Acad Sci 83, 7658-7662.

276. Treseder SA, Rose S, Summo L, Jenner P. 2003. Commonly used L-amino acid decarboxylase inhibitors block monoamine oxidase activity in the rat. J Neural Transm 110, 229-238.

277. Trimble DL, Barker DL. 1984. Activation by dopamine of pattern motor output from the buccal ganglia of Helisoma trivolvis. J Neurobiol 15, 37-48.

278. Voronezhskaya EE, Elekes K. 1994. Distribution of serotonin-like immununoreactive neurons in the embryonic nervous system of lymnaeid and planorbid snails. Neurobiology 1,371-383.

279. Voronezhskaya EE, Elekes K. 1996. Transient and sustained expression of FMRFamide-like immunoreactivity in the developing nervous system of Lymnaea stagnalis (Mollusca, Pulmonata). Cell Mol Neurobiol 16, 661-676.

280. Voronezhskaya EE, Elekes K. 1997. Expression of FMRFamide gene neuropeptides is partly different in the embryonic nervous system of the pond snail, Lymnaea stagnalis L. Neurobiology (Budapest) 5, 91-93.

281. Voronezhskaya EE, Elekes K. 2003. Expression of the FMRFamide gene encoded peptides by identified neurons in embryos and juveniles of the pulmonate snail Lymnaea stagnalis. Cell Tissue Res 314, 297-313.

282. Voronezhskaya EE, Hiripi L, Elekes K, Croll RP. 1999. Development of catecholaminergic neurons in the pond snail, Lymnaea stagnalis: I. Embryonic development of dopamine-containing neurons and dopamine-dependent behaviors. J Comp Neurol 404, 297-307.

283. Voronezhskaya EE, Khabarova MYu, Nezlin LP. 2004. Apical sensory neurons mediate developmental retardation induced by conspecific environmental stimuli in freshwater pulmonate snails. Development 131, 3671-3680.

284. Voronezhskaya EE, Tsitrin EB, Nezlin LP. 2003. Neuronal development in larval polychaete Phyllodoce maculata (Phyllodocidae). J. Comp. Neurol. 455, 299-309.

285. Voronezhskaya EE, Tyurin SA, Nezlin LP. 2002. Neuronal development in larval chiton Ischnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora). J Comp Neurol 444, 25-38.

286. Walker JR, Ralph KL, Woodruff GN. 1972. The presence of octopamine in the brain of Helix aspersa and its action on specific neurons. Experientia 28, 1173-1174.

287. Walker RJ. 1986. Transmitters and modulators. In: Willows AOD, editor. The Mollusca. Vol. 9. Orlando. Academic Press. P279-485.

288. Wallace JA. 1982. Monoamines in the early chick embryo: demonstrationof serotonin synthesis and the regional distributionof serotonin-concentrating cells during morphogenesis. Am J Anat 165, 261-276.

289. Wanninger A, Haszprunar G. 2003. The development of the serotonergic and FMRF-amidergic nervous system in Antalis entalis (Mollusca, Scaphopoda). Zoomorphology 122, 77-85.

290. Weisblat DA, Harper G, Stent GS, Sawyer RT. 1980. Embryonic cell lineages in the nervous system of the glossophonid leech Helobdella triserialis. Dev Biol 76, 58-78.

291. Weisblat DA, Shankland M. 1985. Cell lineage and segmentation in the leech. Phil Trans R Soc Lond В 312, 39-56.

292. Wieland SJ, Gelperin A. 1983. Dopamine elicits feeding motor program in Limax maximus. J Neurosci 3, 1735-1745.

293. Wieland SJ, Jahn E, Gelperin A. 1987. Localization and synthesis of monoamines in regions of Limax CNS controlling feeding behavior. Comp Biochem Physiol 86C, 125130.

294. Willmer P. 1990. Invertebrate relationships. Patterns in animal evolution. Cambridge. Cambridge Univ Press.

295. Willows AOD. 1967. Behavioral acts elicited by stimulation of single, identifiable brain cells. Science 157(3788), 570-574.

296. Winlow W, Benjamin PR. 1976. Neuronal mapping in the brain of the pond snail Lymnaea stagnalis (L) In: Salanki J, editor. Neurobiology of invertebrates. Gastropoda brain. Budapest. Akademiai Kiado. P41-59.

297. Wodicka LM, Morse DE. 1991. cDNA sequences reveal mRNAs for two Ga signal transducing proteins from larval cilia. Biol Bull 180, 318-327.

298. Yeoman MS,Vehovszky A, Kemenes G, Elliott CJH, Benjamin PR. 1995. Novel interneuron having hybrid modulatory-central pattern generator properties in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J Neurophysiol 73, 112-124.

299. Young SH, Poo M-M. 1983. Spontaneous release of transmitter from growth cones of embryonic neurones. Nature 305, 634-637.

300. Zavarzina EG, Tzetlin AB. 1991. Breeding and larval morphology of Ophryotrocha dimorphica Zavarzina & Tzetlin (Polychaeta: Dorvilleidae). Ophelia Suppl 5, 411-420.