Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция заключительных стадий оогенеза у низших позвоночных животных

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гончаров, Борис Федорович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.Кольцова

•рукописи

I; (решение от" pf УДГ59Ц465.12

I ——-—_____ ГОНЧАРОВ Бош»с Федорович А ,

И наук !>

// ..________________________ВАК России ¡;

гормональная РЁггтт^м^т^^шшх Ышй ООГЕНЕЗА У НИЗШИХ позвоночных животных

(ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03.00.11 эмбриология, гистология, цитология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степеш1^Д0кт0ра би0]10гических наук в форме научного доклада

Москва 1998

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Института биологии развития им. Н.К.Кольцона РАН, в Лаборатории обшей и сравнительной физиологии Музея естественной истории (Париж, Франция), в Лаборатории биологии размножения рыб Университета Бордо I (Франция) и в Национальном центре по совершенствованию управления сельским хозяйством, лесными и водными ресурсами, группа Бордо (Франция).

г*(

действительный член РАМН доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

И.Г.Акмаев Л. В. Белоусов М.С.Чебанов

Ведущая организация:

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН

Защита состоится

Защита состоится "2^ "

1998 г. в II часов

на заседании Диссертационного совета

Институте биологии развития им. по адресу: 117808, Москва, ул. Вавилог

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Гормональная регуляция оогенеза низших позвоночных животных на протяжении многих десятилетий остается в поле зрения многочисленных исследователей. Многие аспекты этой проблемы неоднократно освещались в обзорах, в том числе и в последнее время (Jalabert et а!., 1991; Redding, Patino, 1993; Nagahama, 1994; Specker, Sullivan, 1994; Nagahama et al., 1995; Tyler, Sumpter, 1996).

Несмотря на существенные успехи в исследовании механизмов гормональной регуляции двух заключительных этапов оогенеза - вителлогенеза и созревания ооцитов, малоизученным и малопонятным остается механизм, регулирующий переход от одного процесса к другому. Известно, что оба эти процесса происходят только при наличии в крови гонадотропного гормона (ГТГ). В период вителлогенеза ГТГ стимулирует образование стероидогенными клетками яичника эстрогенов, которые, в свою очередь, запускают и поддерживают синтез вителлогенина в печени. Вителлогенин поступает в яичник по кровеносной системе и поглощается ооцитом с помощью специфических рецепторов. Созревание ооцитов и овуляция у большинства видов запускается внешним стимулом, или стимулами, такими как фотопериод, температура, наличие нерестового субстрата, брачного партнера и т. д.. Этот внешний стимул, воспринимаемый нервной системой через органы чувств, активирует деятельность отделов гипоталамуса, вырабатывающих и секретирующих гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ). Он стимулирует синтез и секрецию ГГГ, и концентрация ГТГ в крови за относительно короткий срок повышается в десятки п сотни раз. Этот выброс гормона и вызывает два сопряженных но времени процесса -созревание ооцита и овуляцию.

Благодаря тому, что уже достаточно давно сначала для амфибий, а зачем и л ля рыб, созревание ооцитов научились воспроизводить in \iiro. исследователям удалось выяснить механизм действия ГТГ в этот период. Было показано, что ГТГ действует не прямо на ооцит, а опосредованно, стимулируя образование и секрецию клетками ленки фолликула (ооцита, одетого оболочками) мейоз-индунирующего стероида, который запускает цепь теперь уже хорошо известных биохимических реакций.

преобразующих ооцит в зрелую яйцеклетку (Nagahama et al., 1995). Показано, что у большинства изученных видов амфибий в этой роли выступает прогестерон, а у рыб 17а,20р-дигидрокси-4-прегнен-3-он (17а,20р-ДГП) (Jalabert et al., 1991).

Однако оставалось неясным, почему до определенного периода 1ТГ поддерживает процесс вителлогенеза, а в какой-то момент запускает процессы созревания и овуляции ооцитов. Теоретически можно было допустить существование четырех альтернативных механизмов перехода ооцитов от вителлогенеза к созреванию.

1. Каждый из этих процессов регулируется своим специфическим ГТТ, и в определенный момент оогенеза происходит смена индуктора.

2. ГГГ один. Характер же процесса, происходящего при его участии, определяется количеством гормона.

3. Гонадотропин или гонадотропины не вызывают переход от одного процесса к другому, а лишь регулируют скорость процессов. Сама же смена процессов происходит благодаря изменению ответа реагирующей системы, происходящему в результате самодифференцировки фолликула.

4. Роль ГТГ та же, что и в предыдущей модели, однако изменение ответа реагирующей системы происходит под влиянием какого-то (не относящегося к гонадотропинам) эндогенного, либо экзогенного фактора (например, температуры).

Для проверки этих гипотез необходимо было получить в очищенном виде и изучить свойства ГТГ.

Начиная с 60-х годов начали появляться работы по очистке ГТГ рыб, при этом авторы обнаруживали только один гормон, способный как поддерживать вителлогенез, так и индуцировать созревание и овуляцию ооцитов (Bursawa-Gerard, Fontaine, 1965; Yamazaki, Donaldson, 1968). Таким образом, казалось, что первая гипотеза может больше не приниматься в расчет. Однако позднее были получены неоспоримые доказательства существования у рыб двух ГТГ, различающихся как по структуре, так и по некоторым биологическим свойствам (см. Tyler, Sumpter, 1996). Тем не менее, их роль в регуляции вителлогенеза и созревания ооцитов остается

пока не вполне выясненной. Два ГТГ, гомологичные фолликулостимулирующему (ФСГ) и лютеинизируюшему (ЛГ) гормонам млекопитающих и других высших позвоночных, были найдены и у амфибий еще раньше, однако их роль в регуляции гаметогенеза также остается малопонятной (Polzonettimagni et al., 1998).

Рассматриваемое направление исследований всегда было тесно связано с практикой разведения видов, используемых в народном хозяйстве, или в учебных и исследовательских целях. Неудачи, периодически возникающие при использовании методов гормональной стимуляции созревания половых продуктов, со всей очевидностью показывают несовершенство наших знаний в этой области.

Цели исследования

Целью нашего исследования было изучение гормональной регуляции заключительных этапов оогснеза у представителей двух классов низших позвоночных животных - амфибий и рыб, в частности, осетровых. Была поставлена задача выявить закономерности становления компетенции созревания и попытаться выяснить, какие эндогенные и экзогенные факторы влияют на этот процесс. Для изучения механизма действия ГТГ у осетровых рыб представлялось важным получить гормон в очищенном виде, изучить его физико-химические и биологические свойства и сравнить их со свойствами ГТГ карпа, как наиболее изученного ГТГ костистых рыб. Для проведения этих исследований необходимо было разработать высокочувствительный метод определения гонадотропной активности, а для изучения механизма действия ГТГ подобрать среду культивирования фолликулов осетровых рыб, которая позволяла бы in vitro получать индуцированное ГТГ созревание ооцитов.

Предполагалось также, опираясь на полученные результаты, разработать новые методические подходы, позволяющие повысить эффективность искусственного размножения низших позвоночных животных и, в частности, осетровых рыб

Научная новизна

При изучении становления способности фолликула в целом и ооцита в отдельности реагировать на соответствующие гормональные стимулы впервые обнаружено подавляющее действие гормонов гипофиза на созревание оонитон

травяной лягушки, вызываемое in vitro прогестероном. Выяснено, что этот эффект воспроизводится и на других видах амфибий и на осетровых рыбах. Показано, что подавляющий эффект, так же как и стимулирующий, опосредован активностью клеток стенки фолликула. Получены данные, указывающие на то, что посредником подавляющего действия может быть цАМФ.

Впервые получен в высокоочищенном виде ГТГ представителя осетровых рыб -севрюги и изучены его физико-химические и биологические свойства. Обнаружено явление полиморфизма ГТГ севрюги. Получены фракции гормона, не содержащие общих изоформ, и показано, что в их действии есть качественные различия. Проведено сравнение ГТГ карпа и севрюги и показаны различия их физико-химических свойств и качественные различия к биологическом действии. Показано, что один и тот же ГТГ оказывает и подавляющее и стимулирующее действие на созревание ооцитов.

Впервые обнаружена высокая чувствительность осетровых рыб к структурному аналогу гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) млекопитающих.

Сформулированы представления, согласно которым основной механизм регуляции перехода ооцитов к созреванию сходен у позвоночных животных и связан с существованием более или менее выраженного периода компетенции созревания, во время которого ГТГ оказывает двойное (стимулирующее и подавляющее) действие, а созревание ооцита происходит, когда их соотношение меняется в пользу стимулирующего действия.

Практическая ценность

Разработан высокоточный и высокочувствительный метод сравнительного количественного определения гонадотропной активности гипофизов низших позвоночных, и, в частности, осетровых рыб. Предложен критерий отбора самок осетровых рыб, пригодных для получения качественных половых продуктов. Разработан и внедрен в практику промышленного осетроводства новый метод получения зрелых половых продуктов, основанный на применении суперактивного синтетического аналога ГнРГ. Разработаны методы гормональной стимуляции

процессов размножения для ряда видов амфибий, в том числе редких и исчезающих.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Межлабораторном эмбриологическом семинаре ИБР, на Международных (Москва, 1969, Патрас, 1980) и Всесоюзных эмбриологических конференциях (Москва, 1981). на Всесоюзных совещаниях по осетроводству (Астрахань, 1969, 1979, 1984, 1986), на Всесоюзной конференции по раннему развитию рыб (Киев, 1978), на Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985), на Международных конференциях и симпозиумах по сравнительной эндокринологии (Монпелье, 1971; Найроби, 1974; Левен, 1990; Руан, 1996), на Конференциях европейских герпетологов (Прага, 1985; Будапешт, 1991), на Всемирном конгрессе по герпетологии (Кентербери, 1989). на Международных симпозиумах по осетровым рыбам (Бордо, 1989; Москва, 1993; Пьяченца, 1997), на Всесоюзном совещании по зоокультуре (Москва, 1986), на Всесоюзном совещании по репродуктивной физиологии рыб (Минск, 1991), на Международной конференции по разнообразию и сохранению осетровых рыб (Нью-Йорк, 1994), а также в ряде отечественных и зарубежных научно-исследовательских институтов.

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П.Филатова Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, в Лаборатории общей и сравнительной физиологии Музея естественной истории (Париж, Франция), в Лаборатории биологии размножения рыб Университета Бордо 1 (Франция) и в Национальном центре по совершенствованию управления сельским хозяйством, лесными и водными ресурсами (СЕМАОЯЕР), группа Бордо (Франция).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Основные опыты, связанные с изучением механизма гормональной регуляции заключительных этапов оогенеза, выполнены на

фолликулах осетровых рыб (севрюги Acipenser stellalus\ русского A. gueldenstaedti, сибирского A. baeri и персидского A. persicus осетров) и амфибий (травяной лягушки Rana temporaria и зеленой жабы Bufo viridis). Этих представителей разных классов позвоночных животных объединяет не только сходное строение ооцитов, но и четкая сезонность процесса размножения. Процессы вителлогенеза и созревания ооцитов у них разделены во времени. Достигшие дефинитивного размера ооциты долгое время (для амфибий - это большая часть периода зимовки, а для осетровых -период миграции на нерестилища) находятся в состоянии компетенции созревания, то есть способны реагировать созреванием на воздействие гормонов. Выбор этих объектов исследования был связан с тем, что путем сопоставления закономерностей и механизмов гормональной регуляции у достаточно удаленных в таксономическом плане видов можно выявлять общие и, следовательно, наиболее консервативные элементы системы, возможно, участвующие в регуляции этих процессов у более широкого круга позвоночных животных. С другой стороны, изучение видов, имеющих экономическую ценность, к которым несомненно относятся осетровые рыбы, могло дать результаты, полезные для практики их искусственного разведения.

В ходе исследований возникала необходимость проверки выявленных закономерностей или решения определенных задач на более широком круге объектов. В связи с этим некоторые работы были проведены и на нескольких видах костистых рыб. Особенно же круг объектов был расширен, когда возникла необходимость разработки универсального метода для индукции процессов размножения у редких, исчезающих и «проблемных» видов амфибий.

Культивирование фолликулов амфибий и осетровых рыб. При проведении опытов in vitro для культивирования фолликулов бесхвостых амфибий был использован раствор Рингера для холоднокровных (Rugh, 1962), а для осетровых рыб сначала среда, предложенная М.Н.Скоблиной (1971), а затем модификация раствора Рингера (Гончаров, 1978). Фолликулы осетровых рыб и амфибий культивировали в маленьких чашках Петри или стеклянных пузырьках в 7,5, 5, или 2 мл среды по возможности при постоянной температуре. Прогестерон вносили в сухие чашки в виде спиртового раствора и после испарения спирта заполняли чашки средой.

Прогестерон использовали в концентрации 5 или I мкг/мл. Экстракт гипофиза ('31) готовили из гомогенизированных гипофизов, либо непосредственно перед этим извлеченных, либо ацетонированных. Время экстракции составляло около 1 ч при комнатной температуре В случае амфибий культивировали небольшие фр;н менты яичника, содержащие от одного до шести фолликулов, а в случае осетровых рыб одиночные фолликулы. Критерием созревания служило разрушение оболочки зародышевого пузырька (ядра ооцита), которое регистрировали при разрезании под бпнокуляром фиксированных кипячением ооцитов. В некоторых случаях использовали дополнительные критерии созревания, такие как способность созревшего ооцита не повреждаться при помещении в воду и способность к активации уколом. Продолжительность процесса созревания ооцитов измеряли в астрономических единицах, если температура культивирования была постоянной, или в т„ (см. Ое11аП и а!.. 1993) при переменной температуре культивирования.

Определение продолжительности гормонозависимого периода (ГЗП) созревания ооцита. Сначала продолжительность ГЗП у осетровых рыб определяли путем двукратной отмывки фолликулов модифицированным раствором Рингера Однако после того, как были найдены условия, при которых П'Г не может осуществлять свое действие, а прогестерон способен это делать, был разработан метод (Гончаров, 1978; Гончаров и др., 1997), основанный на переносе фолликулов из модифицированного для осетровых рыб раствора Рингера, содержащего ГТГ, » обычный раствор Рингера для холоднокровных. Поскольку было показано, что продолжительность ГЗП зависит от дозы гормона (Гончаров, 1971а), а стандартных гонадотропных препаратов для низших позвоночных не существует, для получении сопоставимых результатов использовали маточный порошок ацетонированных гипофизов или препарат ГТГ севрюги (с-ГГГ).

Очистка гонадотропного гормона гипофиза севрюги. Для очистки с-ГТГ использовали обычные методы, используемые для очистки белков и, в частности", гликопротеинов. Так, были использованы: спиртовое просачивание, гель-фильтрация, хроматография на ионообменниках, препаративный электрофоре! и

абсорбционная хрома roi рафия. Для определения гонадотропной активное m н ходе очистки использовали реакцию спермиации прудовой лягушки (Строганов и Алпатов, 1950; Fontaine, Cliauvel, 1961) и реакцию созревания ооцитов амфибий in vitro ( Iornton, 1971; Гончаров, 1971а).

Характеристика физико-химических свойств гонадотроиного гормона гипофиза севрюги. Молекулярную массу очищенного с-ГТГ определяли методом электрофореза в присутствии додецил сульфата натрия (Fairbanks et ai., 1971). Электрофоретическую подвижность фракций с-ГТГ определяли при постановке диск-электрофореза в полиакриламидном геле (7,5%). Аминокислотный состав определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе. Изоэлектрические точки (р!) фракций с-ГТГ определяли с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) (Winter et al., 1977). После кислотного гидролиза препарата определяли содержание гексоз (Tsugita, Akabori, 1959) и сиаловой кислоты (Warren, 1959). N-концевые аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии (Woods, Wang. 1967).

Статистический анализ.