Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов детерминации размеров зачатка центральной нервной системы у шпорцевой лягушки

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов детерминации размеров зачатка центральной нервной системы у шпорцевой лягушки"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

На праваг рукописи

ЗАРАИСКШ Андрей Георгиевич

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕТЕРМИНАЦИИ РАЗМЕРОВ ЗАЧАТКА ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

Москва 1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Л. В. Белоусов

Официальные оппоненты: член корреспондент АН СССР В. ы. Васильев доктор биологических наук Л. И. Корочкин

Ведущее учреждение: Институт эволюционной морфологии и экологии животных им. А.Н.Северцова АН СССР

Защита диссертации состоится " £ " ^х-^р^-хЛ 199 2, г. в часов на заседании специализированного совета Д.053.05.68 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: II9899 Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " "__1991 г_

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

Актуальность проблемы. Одна из центральных проблем биологии развития заключается в том, чтобы понять, как на уровне данного эмбрионального зачатка возникает информация о взаимном расположении и размерах различно дифференцированных областей, на которые он подразделяется в ходе развития - позиционная информация по терминологии Вольперта (woipert, i96i,i989). В частности, в случае вычленения нейроэйтодермы из эктодермального зародышевого листка в раннем эмбриогенезе позвоночных важно выяснить, каким образом в этом зародышевом листке возникает информация о положении границы, определявшей размеры нейроэктодермального компартмента.

Согласно современным данным у амфибий такая информация появляется на уровне эктодермального пласта (как целого) не ранее стадии гаструляции (Albers, 1987; Saxen, 1989). В СВЯЗИ С ЭТИМ широко обсуждаются два предполагаемых способа ее возникновения: 1) в результате передачи в явном виде от подстнлэщего эктодерму нейрального индуктора - осевой мезодермы; 2) путем пространственной ' самоорганизации в эктодермальном пласте

(Slack,1983; Nieuwkoop, Albers,1990; Sharpe, Gordon,1Э90; Sive et al., 1990).

Очевидно, что информация, "поступающая" в зачаток в явном виде от осевой мезодермы, должна была бы" представлять собой заранее упорядоченный в пространстве набор значений некоторого параметра(ов) - как бы прообраз будущей организации зачатка. Напротив, при самоорганизации первоначально отсутствует какая-либо пространственная упорядоченность, способная служить прообразом будущей структуры. Согласно общей теории самоорганизующихся систем - синергетике (Хажен, 198о) - такая упорядоченное?! возникает в самой системе на основе действующих в ней механизмов, необходимым условием которых являются дальне-дистантные взаимодействия И локальный автокатализ (Turing, 1952; Николае, Пригожин, 1979; Белинцев, 1983).

В настоящее время все еще отсутствуют данные, позволяющие сделать окончательный выбор в пользу одного из указанных способов детерминации размеров нейрального зачатка, несмотря на то, "что в рамках синергетики уже разработаны достаточно четкие критерии, дающие возможность экспериментально выявлять наличие самоорганизационных эффектов в различных системах.

В случае обнаружения подобных эффектов в эктодермальном

зародышевом листке , было бы также важно определить тип дзлыюдействущей связи, обеспечивающей данную самоорганизацию. В настоящее время считается, что в развивающихся зачатках такая связь вероятнее всего могла бы осуществляться либо посредством механических натяжений, создающихся сократительными системами клеток, либо с тшцью диффузии локально синтезирующихся веществ -морфогенов (Turing,1952; Gierer.Heinhardt,1972; Harris et al.,1984; Belintsev et al.,1987). Эксперименты, ПОЗВОЛЯЩИе

решить вопрос о реальности самоорганизации на базе механических натяжений при детерминации размеров зачатка ЦНС, могли бы быть поставлены на основе предсказаний, полученных' в результате теоретического моделирования такой самоорганизации.

Пели И задачи работы. Основной целью работы было экспериментальное выявление самоорганизационшх эффектов в экгодермальном пласте при детерминации размеров зачатка ЦНС у зародышей шпорцевой лягушки (xenopus laevis). В случае обнаружения таких эффектов планировалось выяснить, являются ли они проявлением самоорганизации, протекающей на основе механических натяжений, или же какого-то иного типа дальнодействия.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1) клонировать матрицу нуклеотидного зонда и подобрать моноклональные антитела для выявления эпидермальных маркеров зародышевой эктодермы: продуктов экспрессии (белка и РНК) кератинового гена xksi (кератин типа I);

2) отработать методику гибридизации in situ , пригодную для работы с серийными срезами ранних зародышей амфибий;

3) изучить .динамику - установления границы, разделявдей в эктодерме область экспрессии кератинового гена XK8I (презумптивный эпидермис) и область, где данный ген не эксцрессируется (презумптивная нейроэктодерма), в период нейруляции;

4) выяснить, демонстрирует ли подразделяющийся на нейроэктодерму и эпидермис эктодермальный пласт один из достаточных признаков самоорганизации: масштабную регуляцию (зависимость размеров образующихся компартментов от общих размеров пласта);

5) Разработать теоретическую модель самоорганизации, эпителиального пласта на основе дальнодействупцих механических натяжений, порождаемых локальной механо-химической активностью

клеток. С помощью модели проанализировать особенности протекания такой самоорганизации в условиях растяжения или сжатия пласта внешней силой.

6) разработать методики, позволяющие на длительный период времени (>10 час.) уменьшать или увеличивать тангенциальные механические натяжения в эктодерме зародышей х. laevis in viva;

7) экспериментально исследовать зависимость окончательного размера зачатка ЦНС от степени тангенциального растяжения. эктодермального пласта в период гаструляции и нейруляции.

Научная новизна И практическая значимость работы.. В результате изучения экспрессии кератинового гена XK8I показано, что в нормальном эмбриогенезе детерминация размеров эпидермального (экспрессируицего данный ген) и нейрального (не экспрессирувдего его) компартментов осуществляется в результате постепенного "дрейфа" границы, разделяющей эти компартменты, к месту своей окончательной локализации. При этом в ходе нейруляции происходит постепенное увеличение компартмента, экспрессируицего кератиновый ген и, соответственно, уменьшение компартмента, в котором экспрессия данного гена не наблюдается.

Впервые показано, что детерминация количества эктодермального материала, образующего зачаток ШС, а также количественная детерминация зачатков хорды и сомитной мезодермы являются результатом самоорганизационных процессов, протекающих в эктодермальном и мезодермальном зародышевых листках в период гаструляции и нейруляций.

Получены данные, опровергающие гипотезу об участии механических натяжений в обеспечении самоорганизационного дальнодействия при детерминации размеров зачатка ЦНС.

Практическая значимость работы определяется : а) возможностью использовать разработанный комплекс методик гибридизации in situ и иммуногистохимии для изучения пространственно-временных закономерностей экспрессии генов в раннем эмбриогенезе, б) возможностью применения разработанного экспериментального подхода (исследование масштабной регуляции, выявление зависимости дай&еренцировки от механических натяжений) . для изучения самоорганизации в других развивающихся системах.

Апробзиия работа. Материалы диссертации представлены, на X Международном конгрессе Международного общества биологов развития

(Лос-Анжелос, США, 1985), Всесоюзном рабочем совещании по немышечной подвижности (Чернигов, 1988), Симпозиуме им. М. Зингера по развитию, регенерации и нейроанатомии (Итака, США, 1990), Европейском конгрессе по биологии развития (Иерусалим, Израиль, 1991), Советско-финском симпозиуме по биологии развития (Суздаль, 1991).

Пубдтпсятпта. ш теме диссертации опубликовано 15 работ..

Материалы и метода

■Яяроттшш- для гибридизации in situ использовали зародышей альбиносной линии лягушек, чтобы избежать трудностей, связанных с выявлением радиоавтографического сигнала. Для иммуногистохимии использовали пигментированных зародышей х. laeris. Для морфометрических опытов в каадом опыте получали икру только от одной пары лягушек. В этих случаях зародышей для экспериментов и для контролей готовили заранее, отбирая под стереомикроскопом икринки одинакового диаметра. Данная процедура является необходимым условием для работ по морфометрии, так как у х.laevis размер икринок даже в одной и той же кладке сильно варьирует. Стадии развития определяли по таблицам Ньюкупа и Фабера

(Nieuwkoop, Faber, 1956).

Микрооперации. Микрооперации на зародышах проводили в стерильном растворе Ныо-Твитти с антибиотиками. Такой же раствор использовали для инкубации оперированных и контрольных зародышей. Эксплантацию и рассечения тканей осуществляли с помощью микроножа и стеклянной палочки. Ин§екции вазелинового масла в бластоцель проводили с помощью микроин§ектора через стеклянную микропипетку с диаметром кончика 10-15 мкм.

Витальное мачениа заппттшай. Витальное мечение зародышей проводили по методике Келлера (Keiler, 1976), вводя в микроразрезы тканей на 4-5 мин. кусочки'агара, окрашенного нейтральным красным.

Гистологические срезы. Для морфометрии об§емов осевых структур зародышей фиксировали жидкостью Буэна, проводили через бутанольную проводку и заключали в парафин. Серийные срезы (14 мкм) окрашивали гематоксилином Эрлиха. Для морфометрии" клеток в эктодерме зародышей фиксировали и заключали в Эпон 812 по стандартной методике для электронной микроскопии (Гайер, 1974). Полутонкие эпоновые срезы (1.5 мкм) окрашивали толуидиновым синим.

Молекулярное клонирований. При клонировании фрагмента кератинового гена XK8I использовали метод амплификации ДНК с ПОМОЩЬЮ термэстабилъной днк-полимеразы (Carman, Kidd, 1989), а также набор стандартных генно-инженерных методик (Maniatis et

al., 1982).

ТЧтбртпизапия ¿д situ.* При оптимизации гибридизации in situ для работы с серийными срезами ранних зародышей шпорцевой лягушки использовали элементы различных описанных в литературе вариантов этого метода , а также следующие изотопы для мечения зонда: Зн, I25r,32p, 33р,. 35s. Для отработки метода, кроме кератинового, использовали также зонды к РНК генов с-тус и р-53 человека, с-суб§едишцы ыа+,к+-лФазы свиньи. Авторадиографию препаратов проводили с помощью эмульсии NTB2 ("Kodak"). После проявления эмульсии препараты окрашивали dapi (i мкг/мл) для визуализации клеточных ядер.

Ишуногистотишя . Зародышей Зиксировали в охлажденном до -70° этаноле в течение 3-х суток и заключали в парафин через бутанольную проводку. Иммунофлуоресцентное окрашивание 14 мкм срезов проводили по следующей методике (Гелыптейн и др.,1985). Стекла с депарафинизированвыми срезами инкубировали в течение I часа с цельной культуральной средой из-под клеток гибридных клонов продуцирующих моноклональные антитела против цитокератинов. В качестве вторичных антител использовали коньюгированные с флуоресцеш-изотиоцианатом антитела против мышиных igG ("sigma"). Так же, как и при гибридизации in situ препараты окрашивали dapi.

Иеяение КЛЕТОК наружного слоя эктодермы. Для прослеживания судьбы клеток наружного слоя эктодермы у зародышей на стадии 10 1/4 проводили мечение поверхности клеток, обращенной во внешнюю среду, путем включения H в состав поверхностных сизловых кислот по следующей методике (Габриэлян и др., 1990): окисление сиаловых кислот 4 mMNaio-4 (1о мин. в темноте), отмывка, восстановление сиаловых КИСЛОТ NaB3H4 ( 0,5 nCi/ml; 30 МИН.).

Морйометрия. Морфометрические измерения, а также их статистическую обработку проводили с помощью автоматического анализатора изображений

Содержание работы

I-Клонирование, йоатоентя штоке.ратинового гена Ш&. Исходя из

опубликованной нуклеотидной последовательности кДНК гена xksi (Jamrich et ai., 1987), были заказаны два противонаправленных праймера к участкам кДНК, расположенным друг от друга на расстоянии 460 нуклеотидов:

5 ' gctggaattctgaataacatgagagctg 3'

EcoRl

5 ' tagggatcctggttctagttgtggatgt 3'

Bi-Hl

Праймеры содержали сайты рестрикции, эндонуклеаз•ecori и BamHi, которые впоследствии использовали для клонирования фрагмента. С помощь» этих прайме ров и термостабильной ДНК полимеразы с первой цепи кДНК, полученной на основе мРНК из зародышей 15 стадии (Nieuwkoop, Faber,1956) , бЫЛ синтезирован фрЭГМвНТ гена ХК81 в количестве, достаточном для клонирования. Клонирование проводили в плазмиде gemí по указанным рестриктазам. • Проверку соответствия клонированной вставки фрагменту гена XK8I осуществляли с помощью рестрикционного анализа и гибридизации in situ.

2.Оптимизация метола гибшттяятптя in situ. Срезы, используемые для гибридизации in situ должны обеспечивать : I) сохранность РНК, 2) доступность РНК для гибридизационного зонда, 3) сохранность морфэлогии. Последнее условие было для нас особенно актуальным в связи с предполагаемыми морфометрическими исследованиями. Поэтому была проведена работа по подбору оптимального способа фиксации и дальнейшей обработки зародышей х. laevis. Среди всех опробованных вариантов (замороженные,срезы без предварительной фиксации зародышей; замороженные срезы зародышей, предварительно фиксированных формалином, глютаровым альдегидом или смесью Карнуа; парафиновые срезы зародышей, фиксированных теми же фиксаторами или путем замещения воды спиртом в замороженном состоянии) наилучшие результаты были получены с парафиновыми срезами зародышей, фиксированных по следующей схеме: быстрое помещение в 96% этанол, охлажденный до -70°с; выдерживание зародышей в этаноле при этой же температуре в течение • 3-4 суток (при этом происходит медленное, существенно не нарушающее морфологии, замещение замороженной воды на спирт); бутанольная проводка фисированного материала и заключение его в парафин. Преимущества данного способа приготовления срезов по сравнению с

другими методиками заключаются, во-первых, в том, что при такой фиксации в дальнейшем нет необходимости обрабатывать срезы протеолитическими ферментами, нарушающими морфологию ранне-эмбриональных тканей (как это требуется при альдегидных фиксациях), и, во-вторых, в том, что имеется возможность легко приготовлять серийные срезы зародышей амфибий со сравнительно хорошей морфологией (чего практически невозможно добиться при изготовлении замороженных срезов).

При подборе изотопа для. мечения преследовали цель получить достаточную для последующей морфэметрии локализацию авторадаографического сигнала при возможно более высокой удельной

О TOR

активности зонда. Из всех опробованных изотопов (H, i, р, 33р, 35s) данным требованиям в наибольшей степени удовлетворял 33р.

Наилучшие результаты (наиболее высокий уровень сигнала, низкий фон, хорошая сохранность срезов) были получены при проведении гибридизации in situ по следующей схеме. Гибридизация в смеси: 50% формамида, 0,5 M Nací, 50 mm трИС-НС1, рН 7,5, 7иМ ЭДТА, 0,1% bsa Лбычий сывороточный альбумин), i мг/мл дрожжевой тРНК. Концентрация зонда составляла 0,05-0,1 мкг/мл при удельной активности 10s импульсов/мин/мкг. Гибридизацию проводили при 40°С в течение 12 ч. После отмывки не связавшейся пробы стекла со срезами покрывали фотоэмульсией и экспонировали 3-4 дня. После проявления эмульсии срезы окрашивали dafi.

Эффективность разработанной модификации метода была оценена при проведении успешных гибридизаций на срезах ранних зародышей х. laeris С зондами к МРНК онкогенов с-тус И р-53, а-суб§единицы Na+,к+-лФазы. Кроме того, адекватность этой модификации была подтверждена при изучении экспрессии одного из желточных генов в оогенезе дрозофилы, генов кристаллшов г-1 и з—4 при регенерации глаза у тритона.

з. Подбор янтитял для иммуногистотимиче пкого матосиповаття грянулtw медш эттргттйпмисом и нейроэктолешой. Для поиска антител, дающих на срезах зародышей 13-ой и 15-ой стадии такое же распределение сигнала, что я описанные в литературе антитела к цитокератину XK8I иммуногистохимически тестировали моноклональные антитела: Си - против кератинов 8 и 13 человека, CI8 - против кератина 7 человека , Е2 - против кератина 8 крыш, CI2 - против

кератина крысы с мол. массой 49 кДа, El - против белков промежуточных фаламентов кишки крысы. Из указанных антител наиболее близкую картину к распределению, характерному для бежа

XK8I (Jamrich et al.,1987; LaFlamme, David,1990) ДЭВЭЛИ ЭНТИТела

CI2. Данные антитела окрашивали клетки, расположенные только в наружном слое эпидермиса, существенно слабее они реагировали с клетками наружного слоя присоски и не взаимодействовали с клетками нейрального зачатка. При сравнении пространственного распределения флюоресценции этих антител с распределением гибридизационного сигнала зонда к мРНК гена XK8I не было выявлейо существенных различий в положении границы между нейральным и эпидермалъным компартментами. Данные аргументы конечно нельзя считать абсолютным доказательством идентичности эпитогов связывания для антител CI2 и антител к кератину XK8I, описанных в цитированных работах. Однако нам достаточно было располагать антителами, четко выявляющими границу между эктодермальным и нейральным компартментами.

A.Ï. Изучение тттосттзанстввнно-врвменкой регионализации яктодешы ifia примере яупттряпстто кенашшаош гена ). Характерным признаком пространственной самоорганизации является волнообразная динамика становления образующейся структур!, выражающаяся в том, что окончательное расположение границ (фронтов), разделяющих соседние компартменты, достигается в результате-постепенного "дрейфа" таких границ к местам их финальной локализации (Николис,Пригожин,1979; Белинцев и др.,1985). При этом, очевидно, последовательно изменяются и размеры самих компартментов.

Чтобы проверить, имеет ли место подобная динамика в случае подразделения зктодермального зародышевого листка на нейроэктодерму и эпидермис, мы исследовали в период нейруляции пространственно-временное распределение продуктов экспрессии кератинового гена XK8I, специфически маркирующих эпидермальный компартмент. При этом основное внимание было уделено выявлению возможных изменений размеров соседнего, не экспрессирующего данный ген, компартмента (презумптивной ЦНС).

Измерение площади сечения наружного слоя эктодермы, не дававшего сигнала при гиоридизации in .situ с зондом к мРНК кератинового гена XK8I и не окрашивающегося антителами CI2, проводили на срезах зародышей 13-ой и 15-ой стадий. Срезы делали на центральном сагиттальном уровне, а также на следующих

анимально-вегетативных уровнях: "головной" - 1/4 часть зародыша от анимального полюса, "центральный" - экватор, "хвостовой" - 1/4 часть диаметра зародыша от вегетативного полюса ( рис. 1а). На каждом из указанных уровней измерения проводили на 10 серийных срезах при помощи полуавтоматического анализатора изображений под микроскопом при ультрафиолетовом освещении в случае иммуногистохимии и при обычном освещении в случае гибридизации in situ (рис 16).В каждом из вышеуказанных вариантов было обмерено по 4-5 зародышей. Подсчет полного количества клеток по ядрам в исследуемой области наружного слоя эктодермы проводили на тех же серийных срезах, что и морфометрию.

Рис.1. Схема ыорфометрических измерений а - уровни, на срезах которых измеряли шошрйъ наружного слоя презумтивной нейроэктодерш (зародыш на стадии нервной пластинки показан с дорсальной стороны), саг - центральный сагиттальный уровень, гол - "головной" уровень, центр - "центральный" уровень, хв - "хвостовой" уровень. Пунктиром и сплошной линией обозначены границу нервной гиасшшки.. Остальные обозначения в тексте.

б - схема измерения площади наружного слоя презумптивной нейроэктодержы на срезах уровней показанных на а. Пунктиром обведена измеряемая площадь, кф - кератиновые филаленш, эн -наружный слой эктодермы,, эв - внутренний слой эктодермы, х -хорда, сом - сомит, почками обозначен сигнал при гибридизации ¿п

вИи.

Как было установлено с помощью гибридизации хп зага, площади

сечений наружного слоя презушггивного нейрального компартмента на всех поперечных уровнях у зародышей 13-ой стадии были больше, чем у зародышей 15-ой стадии. В то же время, площади сечений аналогичной области на сагиттальных срезах зародышей тех же стадий были примерно одинаковы (табл I). Общее число клеток в области наружного слоя эктодермы, соответствующей презумптивному нейральному компартменту, у зародышей 13 стадии развития было больше, чем у зародышей 15 .стадии в среднем на 25%. С учетом того, что в период между 13 и 15 стадиями часть эктодермальных" клеток поделилась,.эта разница, "нормированная" по клеткам 13 стадии, должна быть еще больше.

Аналогичный результат - существенно большие размеры презумптивного нейрального зачатка на 13 стадии развития - был получен и в результате морфометрического анализа и подсчета клеток по ядрам на срезах, окрашенных антителами С12 (тайл I).

Таблица I

Площади сечений и число клеток наружного слоя нейроэктодериы

Измеряемая величина, мкм2 гибридизация IN SITU иммуногистохимия

стадия 13 стадия 15 стадия 13 стадия 15

Бгол. 8004 - 356 3905 - 177 7904 ± 205 3666 - 211

Бцен. 6889 - 533 3754 ± 236 6774 - 346 3544 - 215

SXB. 6344 - 402 3345 - 205 6239 ± 420 3105 ± 122

scar. - - 17329 - 2101 19652 ± 1989

N кл.общ. 1234 ± 84 920 - 68 1180 - 61 915 i 56

Обозначения: Бгап ,2цен_,2хв.'2саг ~ сРедаяя площадь наружного слоя нейроэктодериы на срезах соответствующих уровней (схему расположения уровней см. на рис.1). Нкл о0щ - общее число клеток в наружном слое нейроэктодериы. '

Основной вывод, следующий из этой части работы, состоит в том, что в период между 13-ой (начало нейруляции) и 15-ой' (середина

нейруляцш) стадиями развития х. 1аеУ15 происходит расширение области экспрессии кератинового гена ХК81 в наружном слое клеток зктодермального пласта. Это расширение выражается в том, что на 15-ой стадии развития область экспрессии мРНК и бежа захватывает часть тех, более дорсальных клеток эктодермы, в которых на 13-ой стадии развития данные маркеры еще не обнаруживаются. Поскольку продукты экспрессии гена ' ХК81 специфически маркируют положение границы мевду презумптивными нейральным и эпидермальным компартментами, то полученные данные позволяют предположить, что по крайней мере в период между этими стадиями развития указанная .граница еще Ее детерминирована окончательно, а находится в стадии "дрейфа" к месту своей финальной локализации.

Опыты ш развитию заромтпей £ искусственна уменызеншм количеством тазжиивнош материала эпидермиса и мезодермы боковой пластинки. В данной части работы ставилась задача выяснить, обладает ли подразделяющийся на нейрозктодерму и эпидермис эктодермальный зародышевый листок одним из достаточных признаков самоорганизации: свойством масштабной регуляции (Николис, Пригожин, 1978).

Свойство масштабной регуляции может быть выявлено в экспериментах по искусственному изменению размеров исследуемой системы (в нашем случае зктодермального зачатка) и, в частности, в опытах по удалению части ее материала . При этом операцию по удалению материала следует осуществлять таким образом, чтобы не затрагивать те области презумптивного паттерна дифференцировок, по которым в дальнейшем предполагается судить о наличии или отсутствии дальнодействувдих эффектов - масштабной регуляции (в нашем случае такой областью . являлась презумптивная нейроэктодерма). В противном случае изменения, возникшие в этих областях, невозможно будет истолковать однозначно, т.к. они могут быть следствием не столько самоорганизационных эффектов, сколько результатом удаления части материала из исследуемых компартментов в ходе операции.

Чтобы удовлетворить данному условию, у зародышей х. ¿ае^г? на. последовательных стадиях гаструляции и нейруляцш (стадии 10; II 1/2; 12 1/2; 13 1/2; 15; 18) удаляли вентральную часть презумптивного эпидермиса и, начиная со стадии 12 1/2, вентральную

часть мезодермы боковой пластинки, не затрагивая осевых структур: ЦНС, хорды, сомитной мезодермы (рис 2). Все операции проводили, сверяясь с картами презумптивных зачатков зародыша x.iaeris, составленными Келлером (Keiler,1975,1976). Всего оперировали по 10 зародышей на каждой из указанных стадий. Оперированных , а также неоперированных (контрольных) зародышей инкубировали до стадии 25, после чего фиксировали и на серийных срезах определяли полные объемы зачатка ЩС, хорды и сомитной мезодермы.

ч>ггг

Рис.2. Схема расположения удаляемых участков презумптивного эпидермиса и мезодермы боковой пластинки а - зародыш на стадии. 10 ; Ан - анижиъный полюс; Бег -вегетсшвный полос; дгб - дорсальная губа блаапопора; пункжирол обозначен контур бласиюцеля. б - зародш на стадии 15; нп -нервная тиастмка.

Для того, чтобы убедиться в том,- что в вырезаемых частях отсутствовал материал презумптивных осевых структур, ставили два типа контролей: а) эксплантаты в опытах всех стадий развития культивировали 1п \ritro в течение 3-х суток, после чего заключали в парафин и исследовали гистологически; б) на зародышах, аналогичных с опытными стадий развития, но альбиносной линии, без вырезания эксплантатов проводили витальное мечение отдельных участков "презумптивной" линии разреза с помощью кусочков агара, пропитанных нейтральным красным. После мечения зародышей (по 5 зародышей на каждой стадии) инкубировали до той же стадии, что и опытных, и под бинокуляром анализировали расположение меток.

Важным условием при проведении экспериментов по выявлению масштабной регуляции, является отсутствие влияний на возникающую пространственную структуру оперативного вмешательства как такового. Так, в нашем случае можно было бы предположить, что основной причиной зарегистрированных изменений об§емов осевых структур является не уменьшение количества материала экто-мезодермального пласта, а вызванное оперативным вмешательством нарушение нормальных индукционных взаимодействий между эктодермой и мезодермой. Для выявления подобных эффектов, мы использовали два типа контролей: а) зародыши, у которых с вентральной стороны на стадии 10 был сделан глубокий разрез вдоль центрального меридиана через эктодерму, мезодерму и энтодерму с рассечением краевой зоны,- б) зародыши с аналогичным разрезом на стадии 10 , но с дорсальной стороны (в этих двух сериях контролей меридиональными разрезами имитировали эффект нарушения целостности зародыша при операциях). У всех контрольных зародышей (по 10 в каждой серии), инкубированных параллельно с опытными до стадии 25, определяли об§емы осевых структур.

5.1. Лифрзренциро в ко. эксплантатов и развитие витально леченных зародышей. В эксплантатах всех серий, культивированных в течение 3 суток, ткани осевых структур отсутствовали. Эти данные свидетельствуют о том, что . в момент операции в эксплантируемом материале не было клеток, детерминированных к нейральным, хордальным или сомитным дифференцировкам. Кроме того, с помощью контрольных опытов по витальному мечению контуров эксплантируемых участков было показано, что и в нормальном развитии материал всех эксплантатов не должен был входить в состав осевых структур, а являлся презумптивным эпидермисом и мезодермой боковой пластинки.

5.2. Развитие опытных и оперированных контрольных зародышей. После операции- у опытных зародышей всех стадий развития происходило постепенное уменьшение площади раны за счет стягивания ее краев. Однако этот процесс никогда не завершался полностью и в момент фиксации (на стадии 25) у всех зародышей на вентральной стороне было видно раневое отверстие.

Раны контрольных зародышей, у которых на стадии 10 на вентральной стороне был сделан продольный разрез через эктодерму, мезодерму и энтодерму, так же частично затягивались по ходу

развития. На 25-ой стадии эти зародыши имели аналогичное с опытными небольшое остаточное раневое отверстие на вентральной стороне. Развитие контрольных зародышей, разрезанных на стадии 10 вдоль сагиттальной плоскости на дорсальной стороне, отличалось тем, что раневое отверстие у них не только не затягивалось, а, наоборот, несколько расширялось в ходе гаструляции и нейруляции. При этом левые и правые половины осевых структур развивались соответственно вдоль левого и правого краев раны.

5.3. Объели осевых структур у опытных и контрольных зародышей. а)Централъная нервная систем. У всех типов контрольных зародышей, а также у опытных зародышей, оперированных на стадии 18, объемы ВДС статистически достоверно не различались. В то же время, у опытных зародышей,, оперированных на стадиях 10 1/4, II 1/2, 12 1/2, 13 1/2, и 15, объемы ДОС были достоверно меньше,' чем в контроле (табл 2). б)КорОа. Объемы хорд у большинства опытных и у всех типов контрольных зародышей (кроме контрольных зародышей, разрезанных на стадии 10 с дорсальной стороны, у которых объемы хорд не измеряли ) практически не отличались. Лишь у зародышей, оперированных на стадии 10 , хорды были достоверно меньше, чем в остальных случаях {шобл 2). 6)Солшная лезодерла. У зародышей, оперированных на стадиях 10 и II 1/2, объемы сомитной мезодермы были достоверно шньие, чем в контроле". У остальных типов опытных зародышей, а такяз у всех типов контрольных (кроме контрольных зародышей с дорсальными разрезами, у которых объемы сомитной мезодермы не измеряли), эти объемы статистически достоверно не различались (тбл2).

Главным результатом данной части работы следует считать установление того факта, что с начала гаструляции и вплоть до стадии 18 (поздняя Еейрула) величина нейрального зачатка зависит от общих размеров эктодермального зародышевого листка. В соответствии с указанным выше критерием данный факт свидетельствует о самоорганизационном механизме детерминации размеров нейрального зачатка в период гаструляции - нейруляции.

Свойство масштабной регуляции было также выявлено в отношении мезодермальных осгвых структур - хорды и» сомитной мезодрмы. При этом для зачатка хорды стадией, до которой обнаруживалась подобная регуляция, была средняя гаструла (стадия II 1/2), а для сомитной мезодермы - поздняя гаструла (стадия 12 1/2). Так как на ранних

Таблица 2

т _р

ООъеы (ш х 10 ) осевых структур у контрольных и опытных зародышей

Зачаток Контроль Опыт

Норма Операция на ст.Ю Стадии развития, на которых проводили операцию

Вентр. разрез Доре, разрез 10 II 1/2 12 1/2 13 1/2 15 18

Хорда 0,50 ± 0,03 0,49 ± 0,04 * 0,43 - 0,06 0,49 - 0,08 0,52 ± 0,05 0,51 ± 0,03 0,50 - 0,04 0,51 ± 0,07

Сомит. мезодерма 2,79 - 0,24 2,70 - 0,20 * 1,70 ± 0,17 * .1,81 ± 0,13 3,67 ± 0,18 2,72 - 0,21 2,68 ± 0,15 2,75 ± 0,18

Щ1С 2,65 ± 0,17 2,68 ± 0,21 2,66 ± 0,15 * 2,02 £ 0,26 * 1,95 ± 0,18 * 2,21 - 0,12 * 2,32 ± 0,05 * 2,30 ± 0,12 2,71 ± 0,28

Примечание: звездочками отмечены результаты опытов, статистически достоверно отличающиеся от контролей

стадиях развития (стадии 10 и II 1/2) удаляли материал только презумптивного эпидермиса, то выявленная на этих стадиях регуляция в мезодерме позволяет предположить, что в данный период развития не только эктодерма, но и весь экто-мезодермальный зачаток еще является целостной системой, так что уменьшение эктодермального компартмента "ощущается" всей системой, в том числе, и областью презумптивной мезодермы.

Наличие для каадой из осевых структур определенной стадии развития, вплоть до которой количество материала данной структуры зависит от общих размеров экто-мезодермального зачатка, позволяет предположить, что в нормальном развитии именно к этим стадиям и завершается детерминация окончательного положения границ областей, содержащих материал хорды, сомитной мезодермы и ЦНС. В отличие от состояния качественной детерминации отдельных типов клеток или тканей, выявляемого в опытах по эксплантации, пересадкам и т.п., данное явление можно назвать количественной детерминацией зачатков осевых структур или более кратко - квашифинацией.

Важным результатом работы является установление того факта, что квантификация зачатка ЩС осуществляется значительно позже, чем квантификация зачатков хорды и сомитной мезодермы. Данное обстоятельство позволяет думать, что, по-крайней мере в период между стадиями 12 1/2 и 18, наблюдаемая регуляция размеров зачатка ВДС является проявлением самоорганизационных свойств эктодермального пласта, а не следствием регулирующих воздействий осевой мезодермы (нейральный индуктор).

Изучение детерминации разметов аачатка Ж Е УСЛОВИЯХ измененных тангетгиалъншг механических натяжений а эктолермальном пласте.

Выявленное в вышеописанных опытах свойство экто-мезодермального зачатка "учитывать" свои размеры при компартментализации на материал осевых и неосевых структур является достаточным признаком пространственной самоорганизации-. (Николис, Пригокин,1979). В связи с этим возникает вопрос о возможных механизмах данного процесса.

В настоящее время для биологических объектов наиболее вероятными считаются два типа механизмов пространственной самоорганизации. Основное различие между ними заключается в природе дальнодействующей связи, обеспечивающей целостность

самоорганизующейся системы. Один тип механизмов основан на дальнодействии посредством молекулярной диффузии продуктов локально протекающих автокаталитических реакций - морфогенов (Turing, 1951; Gierer,Meinhardt,1972). Другой - предполагает дальнодействие, осуществляющееся с помощью упругих механических сил, которые возникают в тканях в результате локальной механо-химической активности клеток ( Harris et al.,1984 ).

V ♦

Принципиальные особенности поведения систем, самоорганизующихся на основе этих двух типов механизмов, могут быть исследованы с помощью теоретических моделей. Практическая польза подобных исследований заключается в предсказаниях о поведении самоорганизующихся систем в условиях различных экспериментальных воздействий. В результате появляется возможность экспериментально решить вопрос о реальности того или иного типа самоорганизационного механизма в конкретной системе.

6.1. Теоретическая лоделъ самоорганизации, эпителиального пласта на основе дальноОействухщих механических натяжений.

Самоорганизация, протекающая' на основе данного типа дальнодействия, была исследована наш при помощи теоретической модели. Эта модель, описывающая компартментализацию в зачатках наиболее распространенного вида - в эмбриональных эпителиях, базируется на следующих экспериментальных постулатах: I) на определенном этапе развития - в период компетенции к самоорганизации - клетки данного зачатка приобретают способность спонтанно переходить в одно из двух дискретных и относительно стабильных состояний за счет собственной механо-химической активности : поляризованное, характеризующееся, в частности, вытянутой поперек эпителиального пласта формой клетки, и неполяризованное (клетка, находящаяся в данном состоянии, гораздо менее вытянута поперек.пласта или даже растянута вдоль него). Простейшая функция, описывающая динамику такого перехода, показана на рис. 3 а. Поляризация клетки рассматривается как комплексный механо-химический процесс, способный запускать определенную программу дифференцировки; 2) каждое из двух стабильных состояний катализирует переход в себе подобное в своем ближайшем окружении -явление контактной поляризации клеток - КПК; 3)КПК, распространяющаяся вдоль закрепленного по краям эпителия, создает упругие механические натяжения, передающиеся вдоль пласта на

расстояния, по-крайней мере на порядок превышающие клеточный диаметр, и ингибирущие переход клеток в поляризованное состояние (Белоусов и др., 1975; Черданцев, 1977; Белоусов, Богдановский, 1980; Завалшина и др., 1980; Белоусов, Лучинская, 1983; Петров, Белоусов, 1984).

Как показал математический анализ, данных постулатов в принципе достаточно, чтобы об§яснить спонтанное подразделение изначально однородного эпителия на четко разграниченные компартменты (домены) поляризованных и неполяризованных клеток. Физический механизм такой самоорганизации сводится к следующему. В соответствии с постулатами спонтанный переход некоторой клетки в поляризованное состояние приведет, во-первых, к индукции такого же перехода у соседних клеток (КПК) и, во-вторых, к возрастанию продольного натяжения эпителия (в результате .сжатия клетки в данном направлении при поляризации). Последующее автокаталитическое распространение вдоль пласта фронта волны КПК вызовет дальнейшее нарастание натяжения, которое в конце концов остановит (в соответствии с постулатом 3 ) неограниченное распространение фронта. При этом в простейшем случае эпителий окажется подразделенным на два домена: домен клеток, вытянутых (поляризованных) поперек пласта, и домен клеток, растянутых (деполяризованных) вдоль пласта. Относительные размеры доменов (определенные через отношение числа клеток в поляризованном домене к числу клеток в деполяризованном ) не зависят от общих размеров эпителия (полного числа клеток), а полностью определяются особенностями внутриклеточной динамики поляризации и механическими характеристиками эпителия. В частности, к таким характеристикам относятся натяжения, создаваемые в-эпителиальном пласте внешними силами. В случае модельного одномерного пласта его самоорганизация описывается уравнением, приведенным на рис.3,б. На рис.3 "б и г приведены результаты компьютерного расчета последовательных стадий формирования домена поляризованных клеток в ответ на не специфическую локальную поляризацию в левой части пласта, а также эффект воздействия на сформированный паттерн растяжения эпителия внешней силой.

Как видим, в последнем случае модель предсказывает уменьшение поляризованного домена и увеличение неполяризованного. Обратный эффект - увеличение поляризованного домена и уменьшение

эр а 'Р дь

— = ^(р) + И--кс<р> - кЕ —

at эх2 ь

Рис.3. Результаты математического моделирования самоорганизации, протекающей на основе КПК и упругих механических натяжений

а - вид функции г(р), описывающей бистбилъную диналику поляризации клетки.; р - поляризация клети (величина, пропорциональная отношению длины клеточной оси, перпендикулярной пласту, к длине оси параллельной пласту); ар/аи - скорость поляризации; точки Р0 и Р1 - устойчивые неполяразованное и поляризованное состояния клетки;

б - уравнение, описывахщэе динамику поляризации в лодельнол однолернол эпителии; г(р) - функция бистабилъной динамки поляризации; о з2р/зх2 - член, описывающий влияние на скорость поляризации "диффузии" поляризации из соседних областей в результате КПК; ке<р> - член, описывающий влияние на скорость поляризации механических натяжений, создаваемых всеми клеткам, пласта; кЕ дь/ь - член, описывающий . влияние на скорость поляризации изленения начальной длины пласта, вызванного внешней силой; о - коэффициент, характеризующий скорость распространения КПК вдоль пласта; х - пространственная координата; к, с -феноленологические коэффициент пропорциональности; Е - лодуль упругости эпителия; ь - первоначальная длина эпителия; ль -изленение длины эпителия в результате воздействия внешней силы;

в - формирование■ стабильного распределения поляризации клеток (II) в однолернол (лодельнол) эпителиальном пласте в ответ на неспецифическое поляризущее возмущение (I) в условиях отсутствия внешнего растяжения или сжатия пласта (дь = о);

г - влияние внешнего растяжения (ль > о) на сформировавшееся ранее (в отсутствии растяжения) распределение поляризации. I и II - стабильные распределения поляризации до' и после растяжения соответственно; р - поляризация; х - пространственная координат. Стрелки - перемещения, фронтов поляризации

нетоляризованного - будет наблюдаться при внешнем сжатии.

Логично предположить, что подобный механизм самоорганизации имеет место в случае подразделения эктодермального зародышевого листка на нейроэктодерму и эпидермис, так как известно, что данный процесс сопровождается поляризацией клеток нейрального зачатка, а также постепенным нарастанием натяжений в эктодермальном пласте в ходе гаструляции и нейруляции (Beioussov et ai.1975, Новоселов, Белоусов, 1990). Очевидно, что при этом должны были бы наблюдаться и предсказываемые моделью эффекты внешнего тангенциального растяжения или сжатия эктодермы. Следует заметить, что подобная зависимость образующейся пространственной структуры от внешних механических натяжений является общей особенностью самоорганизационных процессов, протекающих на основе обсуждаемого типа дальнодействия. Данная зависимость была также продемонстрирована в моделях, в которых механические дальнодействущие силы генерировались механизмами, отличными от эпителиальной клеточной поляризации (Oster et al., 1983; Harris et ai., 1984). В то же время, финальный вид паттерна, возникающего на основе молекулярно-диффузионного дальнодействия, может быть значительно менее чувствительным к изменениям механических натяжений, так как последние обычно не влияют на эффективность диффузии.

Данное различие позволяет экспериментально выяснить, какой из указанных двух типов самоорганизационных механизмов наиболее вероятен в случае детерминации размеров нейрального зачатка.

6.2. Экспериментальное изучение колхщтяекташзаит эктодермального зародышевого листка 6 условиях увеличения, а также релаксации тангенциальных механических натяжений.

Данную серию опытов проводили на зародышах стадии II (средняя гаструла). Увеличения тангенциальных натяжений в эктодерме добивались, инъецируя в бластоцель зародышам по 800 - 900 нл стерильного вазелинового масла. Релаксацию тангенциальных

напряжений осуществляли, рассекая вдоль сагиттальной плоскости с вентральной стороны эктодерму, мезодерму и частично энтодерму от анимального полиса до желточной пробки (рис. 4 а). Для того,

Рис.4. Схемы операций и поперечных срезов опытных зародышей а - разрез зародыш на стадии II: ; б - срез зародыша на стадии 15, инъецированного ласлол на стадии II; в - срез зародыша на стадии 25, разрезанного с вентральной стороны, на стадии II

чтобы выявить возможное влияние натяжений на объемы наружного и внутреннего слоев нейроэктодермы, у части зародышей предварительно на стадии 10 проводили мечение поверхности клеток, обращенной во внешнюю среду, путем включения 3Н в состав поверхностных сиаловых кислот. В каждом из указанных вариантов опытов и в контроле использовали по 12 - 14 зародышей, меченых и не меченых 3Н. Зародышей инкубировали параллельно с контрольными (неоперированными ) и фиксировали на стадии 15 в опытах и в контроле: а) по стандартной методике для изготовления полутонких срезов по 3 - 5 немеченых зародышей , б) жидкостью Буэна по • 3

•а

зародыша, меченных Н, с последующим заключением в парафин. На стадии 25 в опытах и в контроле фиксировали жидкостью Буэна с

последующим заключением в парафин по 8 - 9 зародышей, меченных и не меченных 3Н . Серийные срезы (14 мкм) зародышей, меченных 3Н, покрывали фотоэмульсией для авторадиографии. Для количественного'-подсчета метки над срезами ПНС (характеристика, пропорциональная числу клеток наружного слоя эктодермы, вошедших в состав ШС) использовали автоматический анализатор изображений. Морфометрический анализ всех ■ характеристик, отражающих механические напряжения в эктодермальном пласте проводили на полутонких срезах. Полные объемы осевых структур измеряли на серийных срезах (14 мкм) зародышей.

Уменьшение натяжений. Сразу же после разреза края раны в течение приблизительно 2-3 мин интенсивно расходились в стороны. Как было-показано ранее, этот эффект обусловлен пассивной релаксацией механических напряжений, существовавших в зародыше до операции (Белоусов и др., 1974). Дальнейшее расширение раны, по-видимому, осуществлялось за счет активных движений клеток и поэтому протекало более медленно ( приблизительно 20 - 30 мин). По завершении этих процессов длина эктодермального пласта на поперечных сечениях зародыша уменьшалась по сравнению с нормой на 20 - 30 %. Вызванная разрезом релаксация механических напряжений сохранялась длительное время, о чем свидетельствуют данные об избыточном по сравнению с контролем тангенциальном сжатии клеток эктодермы на стадии 15 (табл з).

Как было выяснено в результате авторадиографии срезов зародышей стадии 15, меченных 3Н, релаксация напряжений не приводила к заметному "перемешиванию" клеток наружного и внутреннего слоев эктодермы. Это обстоятельство давало основание утверждать, что любые изменения количества материала -наружного (меченого) слоя, входящего впоследствии в состав нервной трубки, обязательно должны были бы проявиться как изменения количества метки над срезами ВДС.

На стадии 25 (по завершению нейруляции) полные об§емы ЦНС у "релаксированных" зародышей статистически достоверно не отличались от контроля (кабл 3). При этом, как было установлено в экспериментах по мечению наружных клеток зародыша, количество материала наружного слоя эктодермы, входящего в состав ЦНС, в опыте и в контроле также не различалось.

Увеличение натяжений. В ходе гаструляции и нейруляции у

опытных зародышей инъецированное вазелиновое масло оставалось в бластоцеле, который постепенно перемещался с анимальной стороны на вентральную (рис.4 б). Благодаря значительному объему масла периметр эктодермы на экваториальных, а также на центральных сагиттальных сечениях зародышей стадии 15 в опыте был больше, чем в контроле на 17-20 Как показал морфометрический анализ, данное увеличение периметра в основном обусловлено не перегруппировкой клеток эктодермы, а их большей* вытянутостыо вдоль поверхности зародыша по сравнению с контролем ( табл 3 ). Эти данные демонстрируют

Тайлит 3

Деформация клеток нервной пластинки и объеш ЦНС у нормальных и экспериментальных зародышей

Изменение тангенциальных натяжений эктодермы 15 стадия развития 25 стадия развития

отношение радиальной оси клетки к тангенциальной объем структур

наружный слой нейро-эктодермы внутренний слой нейро-эктодермы полный объем ЦНС, лл Зх 10 ~г *объем внутреннего слоя ЦНС, усл.ед.

контроль 1,41 ± 0,07 2,16 ± 0,09 2,34 ± 0,15 4,81 ± 0,60

релаксация 2,01 - 0,19 2,77 ± 0,12 * 2,25 ± 0,21 4,44 - 1,07

растяжение 0,79 ± 0,08 1,44 ± 0,22 2,31 ± 0,18 4,66 - 0,82

* - данная величина пропорциональна сулихрнолу количеству летки нас

срезали ЦНС.

длительное "сохранение" в эктодермальном пласте избыточных механических напряжений, возникших в результате инъекции вазелинового масла в зародыш.

Так же, как и релаксация, растежение не приводило к "перемешиванию" клеток наружного и внутреннего слоев эктодермы. На стадии 25 объеш ЦНС у "растянутых" зародышей так же, как и

у "релаксированных", статистически достоверно не "отличались от контроля. Оставался неизменным и индивидуальный "вклад" наружного слоя эктодермы в объем ЦНС (табл 3).

Вывод, который можно сделать на основании анализа полученных результатов, заключается в том, что изменения механических натяжений не приводят к изменениям финальных размеров зачатка ЦНС по сравнению с нормой. Причем остается неизменным не только объем всей ЩС, но так же и объемы ^наружного и внутреннего слоев нейроэктодермы в составе данной структуры.

■ Эти результаты противоречат предположению о том, что процесс подразделения эктодермального пласта на нейральный и зпидермальный компартменты обеспечивается дальнодействием на основе механических натяжений.

Выводы

, I. Разработан вариант метода гибридизации in situ, позволяющий проводить исследования экспрессии генов на серийных срезах ранних зародышей амфибий. Эффективность методики подтверждена в процессе изучения экспрессии онкогенов с-тус и р-5з, а-суб§единицы Na+,к+-иФазы в- раннем развитии х. laeris, а также цри изучении экспрессии генов у других об§ектов: одного из желточных генов в оогенезе дрозофилы, генов кристаллинов г-1 и г-4 цри регенерации глаза у тритона.

2. С помощью гибридизации in situ и иммуногистохимии установлено, что в в период нейруляции у х. laeris происходит расширение области экспрессии специфического зшдермального маркера - кератинового гена XK8I - в эктодерме и, соответственно, уменьшение той области эктодермального зародышевого листка, в которой данный ген не ' экспрессируется (область презумптивной нейроэктодермы).

3. Разработан экспериментальный подход, позволяющий изучать количественные аспекты детерминации зачатков осевых структур ( ВДС, хорды, сомитной мезодермы ) в условиях искусственно уменьшенного количества презумптивного материала зачатков неосевых структур ( эпидермиса и мезодермы боковой пластинки ).

4. Установлено, что у зародыша х. laeris вплоть до стадии поздней нейрулы количество материала презумптивного зачатка ВДС

находится в положительной зависимости от количества материала презумптивного эпидермиса: удаление в этот период развития части презумптивного эпидермиса приводит к уменьшению зачатка ЦНС.

5) Аналогичная зависимость от количества презумптивного зпидермального материала выявлена для мезодермальных осевых структур: для зачатка хорды - вплоть до стадии средней гаструлы, для сомитной мезодермы - вплоть до стадии поздней гаструлы.

6) В период гаструляции весь экто-мезодермальный зачаток зародыша х. 1аег1я представляет собой единую самоорганизующуюся систему, а в период с конца гаструляции и до стадии поздней нейрулы глобальная пространственная самоорганизация осуществляется только в эктодермальном зародышевом листке, подразделяющемся на нейроэктодерму и эпидермис.

90 Разработана теоретическая модель самоорганизации эпителиального пласта на основе контактной поляризации клеток и дальнодействукщих механических натяжений. С помощью этой модели показано, что в случае подобной самоорганизации финальные размеры образующихся компартментов ' (доменов поляризованных и неполяризованных клеток) должны зависеть от степени растяжения пласта внешними силами.

8) Самоорганизационный механизм, обеспечивающий детерминацию размеров зачатка ЦНС у зародыша х. 1авг1г, не- связан с дальнодействием посредством механических натяжений: количество материала внутреннего и наружного слоев эктодермы, образующего зачаток ЩС, не зависит от степени тангенциального растяжения эктодермального зародышевого листка в период гаструляции нейруляции.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Белинцев Б.Н., Белоусов Л.В., Зарайский А.Г., Волькенштейн Н.В. Упругие напряжения в эмбриональном материале как фактор его самоорганизации - ДАН АН СССР, 1985, т.281, N5, с. 708 - 711.

2. Белинцев Б.Н., Белоусов Л.В., Зарайский А.Г.

Модель эпителиальных морфогенезов на основе упругих сил и контактной поляризации клеток - Онтогенез, 1985, т.16, ni, с. 5-14.

3. Белинцев Б.Н., Белоусов Л.В., Зарайский А.Г.

Модель эпителиальных морфогенезов на основе упругих сил и контактной поляризации клеток. 2. Биологические следствия -Онтогенез, 1985, т.16, N5, с. 437-449.

4. Savich D., Belintsev В., Beloussov L., Zaraysky A.

Cell Polarization and Elasticity As Factors of Self-Organization in Embryonic Epithelia - Tenth International Congress of the International Society of Developmental Biologists, Abstracts, 1985, p. 315, Los Angeles, California.

5. Белинцев Б.Н., Белоусов Л.В., Зарайский А.Г.

Модель самоорганизации эмбриональных клеточных пластов Теоретические и математические аспекты морфогенеза, М.:Наука, 1987, 294 с.

6. Belintsev B.N., Beloussov L.V., Zaraisky A.G.

Model of pattern formation in epitelial morphogenesis - J. Theor. Biol., 1987, V. 129, p. 369 -394.

7. Зарайский А.Г., Лукьянов С.А., Ламан А.Г.

Изучение пространственно-временного распределения мРНК а-суб§единицы на+-к+-АТФазы в раннем развитии шпорцевой лягушки методом гибридизации in situ - Онтогенез, 1989, т.20, N2, с. 128-134.

8. Лукьянов С.А., Иванов А.Н., Зарайский А.Г., Митрофанов В.Г. Исследование экспрессии генов желточных белков у дрозофилы методом гибридизации in situ - "Онтогенез, 1989, т.20,с.273-279.

9. Зарайский А.Г.» Затевахина Г.В.

Иммуногистохимическое исследование раннего эмбриогенеза шпорцевой лягушки xenopus laevis с помощью моноклональных антител к белкам промежуточных фиаментов - Онтогенез, 1990, т.21, N3, с. 267-273.

10. Лукьянов С.А., Зарайский А.Г.

Методические подходы к выявлении мРНК на гистологических срезах - Онтогенез, 1990, т.21, ns, с. 455-465. 11Лукьянов С.А., Зарайский А.Г.

Изучение пространственно-временного распределения мРНК онкогенов с—туе и р-5з в раннем развитии xenopus laevis методом гибридизации in situ - Онтогенез, 1991, т.22, н1, с. 47-52. 12.Mitashov V.I., Lukyanov S.V., Kazanskaya O.V., Zaraisky A.G., Znoiko S.L, Dolgiievitch S.M., Gauss G.G.

Molecular-biological approaches to study of the lens regeneration in the tailed amphibia - in: "Marcus Singer symposium on development, regeneration and neuroanatomy",

1990, p.16, Cornell University, Ithaca. 13.3арайский А.Г.

Самоорганизация при детерминации размеров осевых структур в эмбриогенезе у шпорцевой лягушки - Онтогенез, 991, т.22, на, с. 365-374.

14.Mitashov V.I., Kazanskaya O.V., Lukyanov S.V., Dolgiievitch S.M., Zaraisky A.G., Znoiko S.L., Gause G.G.

Expressions of genes coing for gamma-crystallins during lens regeneration'in the newt - Онтогенез, 1991, Т.22, N4, С. 401-402.

15.Ermakova G.V., Zaraisky A.G.

Wave-Like Character of the Keratin Gene Expression Pattern and Its Dependence to Mechanical Stresses in XENOPUS LAEVIS Neurula - European Developmental Biology Congress, Abstracts,

1991, p.169, Jeurusalem, Israel.