Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние вентральной мезодермы на неиральную дифференцировку у Xenopus laevis

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние вентральной мезодермы на неиральную дифференцировку у Xenopus laevis"

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ имени Н.К. кольцова

Не правах рукописи

КАЗАНСКАЯ Ольга Викторовна

ВЛИЯНИЕ ВЕНТРАЛЬНОЙ ИЕЗОДЕРШ НА НЕИРАЛЬНУЮ ДИФФЕРЕН1ЩРОВКУ У XENOPUS LAEVIS.

ОЗ.00.11-Эмбриология, гистология и цитология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель н.О.н. Зарайский А.Г.

Москва - 1993.

Работа ьшюлнина в Институте биологии развития им.H.H. Кольцова РАН и в Институте омоорганической 1имии им. М.Ы. Шемякина и С.А. Овчинникова РАН .

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Г. Зарайский

Официальрыэ оппоненты: доктор биологических наук, профессор л.В. Белоусов доктор биологических наук, профессор О.Г. Строева

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится _ 199/г.

в часов на заседании специализированного сойота Д 002.85.01. при Институте биологии развития РАН по адресу: Москва, 117806, ул. Вавилова, 26.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития РАН.

Автореферат разослан

9Л* " - 199^ г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

E.U. Протопопова

Актуальность проблемы, В ходе нейральной индукнии эмбриональная эктодерма подразделяется на нейральный и эпидермальный вачатки. Как было показано (Spemann, 1924, Slack.1983), это происходит в результате взаимодействия между инвагинирующэй осевой мезодермой и контактирующей о ней дорсальной эктодермой. Впоследствии стало ясно, что большое значение для формирования правильно организованного нейрального зачатка имеют процессы, разворачивавшиеся на молекулярном уровне в самой эктодерме задолго до того как результат индукции оказывается возможным обнаружить традиционными гистологическими методами. Так, даже при отсутствии нормального контакта между осевой мезодермой и эктодермой, например, в экзогаструлах. происходит правильная регионализация нейроэктодермы, выявляемая с помощью молекулярных маркеров, но с трудом детектируемая на гистологическом уровне. Чтобы понять осноеы этих процессов, необходимо изучение специфических генов, экспрессирующихся в нейральном и эпйдермальном зачатках на возможно более ранней стадии их обособления. Недавно (Zarai3ky et al,1992) был выделен ген, названный XANF-1 (Xenopua Anterior Neural Folde), специфическим обррзом экспрэссирующийся в презумптивной нейроэктодерме уже на стадии средней,гаструлы. Анализ экспрессии XANF-1 показал, что в начале гаструлящш происходит активация этого гена во всей эктодерме, а затем - существенное сужение зоны его экспрессии, так что к концу гаструляции XANF-1 транскрипты обнаруживаются только в головном отделе нейроэктодермы. Однко, к началу гаструляции клетки эктодермы, укэ запрограммированные на активацию ХАНТ-1, ешэ не 1 имеют информации о последующем ингибировании - экспрессии в вентральной области: при

культивировании эксплантатов из вентральной и дорсальной областей бластулы ХАММ активируется в эксплантатах всех тилов. Следовательно, эта информация возникает в результате взаимодействий между эктодермой и мезодермой в период гаструляции. Настоящая работа посвящена анализу этих взаимодействий.

цели и задачи работы. Основной целью работы было исследование с помощью раннего переднеголовного нейральнаго маркера ХАМР-1 влияния на нейральную дифференщровку различных тканей, принимающих участие в процессах нейральной индукции и регионализации нервной пластинки а сопоставление их действия о действием предполагаемого естественного морфогена - ретиноевой 1сислоты. В связи с этим ставились следующие задачи:

1) провести анализ экспрессии ХА.НР-1 в тканевых кон'югатах, выяснить, каким образом влияют на уровень мРНК ХАКР-1 в головной нейроэктодерме средней гаструлы головная, туловищная и вентральная области мезодермы, т.о., области, в норме контактирующие либо с участками, активно экспрессирупдими ХШ-1, либо с участками, где экспрессия этого гена подавлена. Проследить, как изменяется этот эффект во времени; для этого использовать аналогичные тканевые коньюгаты с .головной нейроэктодермой поздней гаструлы.

2) Провести морфологический и морфометрический анализ таких коньюгатов с целью провести' сопоставление уровней экспрессии этого переднеголовного маркера с объемом и качеством образующейся нервной ткани.

3) Исследовать, как влияет на экспрессию ХА№-1 у зародышей и у эксплантатов нейроэктодермы средней и поэдней гаструлы ретиноевая

кислота в различных концентрациях.

4) Провести морфологический и морфометрический анализ вксшшнтатов и зародышей, обработанных РК, чтобы оценить следствия этого влияния на морфологическом уровне. 6) Провести морфометрический анализ эксплантатов нейроэктодермы средней и поздней гаструлы я таких эксплантатов о подлежащей мезодермой, обработанных РК, чтобы выяснить, способна ли осевая мезодерма модифицировать действие РК.

научная нориэнв II практическая значимость рабрты,.

Впервые показано, что экспрессия ХАММ.гена, специфичного для раннего зачатка НС, формируется под действием не только хордо-мэзодермы (нейралыюго индуктора), но и вентральной мезодермы:вентральная мезодерма способна подавлять экспрессию этого гена в нейроэктодерме средней гаструлы.

Показано, что начиная со стадии поздней гаструлы воздействия различных областей мезодермы на влияют сколько-нибудь существенно на экспрессию использованного в работе переднеголовного маркера.

Выявлена способность вентральной мезодермы не только воздействовать на региональный характер формирующейся нервной ткани, но и существенно ингибировать обьем нервной , как абсолютный, так и относительный. Установлено, что такой же способностью изменять соотношение между нервной системой и эпидермисом в эксплантатах обладает ретиноевая кислота.

Показано, что в присутствии головной или осевой мезодермы относительный обьем нервной ткани остается постоянным под воздействием доз РК, существенно уменьшающих обьем переднеголовных структур.

Полученные результаты позволяют предпологшгь, что вентральная мезодерма играет активную роль при установлении передней границы нервной пластинки. Наши данные такие позволяют иродполог.ап'ь в качестве рабочей' гипотезы, что вентральная мезодерма, как и каудельная, является источником авдогешш. ретиноидов, которые в вентральной области подавляют диффервнцировку нервной ткшш, а в туловищной - модифицируют ее.

Практическая значимость работы определяется: а) возможностью использовать разработанную простую методику анализа экспрессии редких генов в небольших по обьему образцах (вплоть до единичного эксплантата), основанную на ПЦР о) возможностью применения разработанного морфома трическогого метода определения объемов нервной системы и другах тканей у эксплантатов и зародышей.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на (Хельсинки, Финляндия) и на XII Международном конгрессе Международного общества биологов развития (Вена, Австрия,1993). Апробация диссертации проведена на заседании отдела гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 18 октября 1993г.

'Публикации■ По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы. структура и обьем работы, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов и выводов и имеет обьем 100 страниц.

Нэтериаяд is метода.

Зародыши. Эксперименты ставили на зародшиях шпорцевых лягушек Sonopus laevla. Производителям (аквариольвая IffiX РАН) «ньецировали хорногоиичвский гонадотрогшн, соотштстроино 700 !Ш - ссмгсо л 400 [/I? - сс.'.щу. Для г.я>рфомвтряч»скюс опытов а «аядш опыте получал! икру только от одной rrapu лягушек. При этом для гзтроошрациП отбирал! под Сшокулярсгл зароджой одинакового разшра. Стадии развития определяли но таблицам Ньпкупа и Фобора. Микрооперации. !'шфооперащм проводили, сверяясь с картами празуштиЕшх зачатков X.laovle, составленных Келлером (Keller, 1985). Шпсроопервции на зародышах проводили в стерильном растворе Киу- Твктти с внтиОкоттшга. При снятш эпидермиса с зародышей поздние стадий использовался раствор Ниу-Твитти с увеличенной вдвое по сравнению с обычной концентрацией NaCl. Зародышевые оболочки снимали в растворе Ниу-Твитта с двумя остроотточешшми игшш. Рассечение и отделение тканей проводились с помощью микронойа и стеклянной палочки. Для удаления остающихся клеток мезодермы использовалсь волосяная петля. Микрооперации проводились в стерильной чашке Петри, дно которой покрывалось 1-% агарозным гелем. Эксплантаты и оперированные зародыши инкубировались в стерильном ежедневно сменяемом растворе Ниу-Твитти с- антибиотиками в течение 2-х или 3-х суток, при 2(9С в стерильных стеклянных чайках Петри.

Типы эксплантатов, использованных в работе. *"" I. 'Эксплантаты нейроэктодерлы разных стадий. Изолировали переднюю половину нейроэктодермы со стадий II - II.Б и 12.5 (см. рис Л). Границы нервной пластинки на этих стадиях еще не видны, поэтому во всех сериях прихватывали латеральные участки

екто дермы, не принимающие участия в формировании нервной пластинки; передняя граница разреза проходила по границе Оластоцеля. Отдельный клетки мезодермы, иногда остающиеся на внутренней поверхности таких эксплантатов", тщательно удаляли волосяной петлей.

II. Тканевые коныогаты. Участки нейроэктодермы для таких кон'югатов во всех случаях орались из той же области, что и (I). При вырезании фрагментов для таких кон'югатов старались, чтобы эти фрагменты были равны между собой (иначе часть вктодермы может оказаться вне влияния исследуемой ткани) и совпадали по размеру с другими фрагментами.

Рис. I. Схема расположения эксплантируемых участков.

1.Передняя половина презумптивной нейроэктодермы, ст.11.

2. Презумптивная головная нейроэктодерма, ст.12,5.

3. Вентральная мезодерма, ст.11.

4. Головная мезодерма, ст.П.

б. Энтодерма дне бластоцеля, ст.П.

6. Туловищная осевая мезодерма, ст.12,5.

7. Вентральная мезодерма, ст.12,6.

Ретирое^ая кислота. Использовалась обработка ретиноевой

кислотой в течение 2-х часов. Выбрали стандартные концентрации НА: 1СГ6, Ю~7 и Ю'8. НА растворяли в диметилсульфоксиде (БйЗО), а затем доводили с помощью р-ра Ниу-Твитти до нужной концентрашш. Контрольные зародыши и эксплантаты обрабатывались только р-ром ШБО.

Гистологические срезы. Для морфометрического анализа зародышей фиксировали падкостью Буэна, выдерживали 3 сут. в 30-% глицерине на 10-% этаноле, проводили через бутанолъную проводку и заключали в парафин. Серийные срезы (7шм для эксплантатов и 14мкн для зародышей) окрашивали гематоксилином Эрлиха.

норФонетрия. Проводили измерение объема присоски и нервной системы отдельно для кввдого эксплантата и некоторых зародышей, а в некоторых, случаях измерялся и обьем нейральных производных, например, глаз, слуховых пузырьков. Кроме того, для каждого эксплантата измерялся и обьем эпидермиса. У зародышей в большинстве случаев измерялся лишь обьем головного мозга. Морфометрические измерения проводили с помощью полуавтоматического анализатора изображений(АКБ, Англия).

Статистический анализ. При анализе полученных данных обнаружили, что значения обьемов некоторых структур относительно постоянны в пределах одной группы эксплантатов.в каждом опыте, а других - сально варьируют. . Так, в эксплантатах нейроэктодермы Ист. с вентральной мезодермой 435 зародышей' имеют присоски, некоторые -почти нормальной величины, а 57% - не имеют. Разбивка этих данных па подгруппы затруднила бы сравнение эксплантатов разных типов. Поэтому ш воспользовались - следующей схемой обработки: в каждом опито для каадого типа эксплантатов суммировали отдельно обьем

прйсоски, ткани глаза, всей нервной ткани, включая ткань глаза, и объем эпидермиса. Затем уже из этих, суммарных объемов, вычислялись следующие показатели:.

Усум эктодермы - сумма Усум присоски, 'нервной жени и эпидермиса.

усум присоски

Уотнприсоски - усумэктодер.,ш Уотн нервн. ткани - 7сумнервн тк

V,,,,,. эктодёшы.

оум "

Таким ш образом вычисляла и У0?н эпвдбр;д:са и Ч07а тканей глаза. Эти показатели - относительные обьещ различных эктодермальных производных - показывают, в каких пропорциях разделяется первоначально однородный актодерлальшД пласт в коныогатах каждого типа. Затем ыевду этими значениями, получешша для одного конкретного типа эксплантатов кездого опыта, определялось среднее и средняя ошибка выборки ). Опредэлэнив достоверности различий между двумя сродшал! проводопа о использованием критерия Стьюдента. Различия мэвд сродш&ш считала достоверными при Р < 0,05

Анализ экспрессии. Анализ экспрессии проводился иэтодом, основанном на ПНР со специфическими праймерами. Суммарную РНК выделяли из эксплантатов и зародышей а буфере, содержащем 4Ы гуанилин, получали кЦНК с помощью реакции обратной транскрипции, и проводили ПЦР продолжительностью 30 циклов о прайыереми следующей структуры:

Х1 5'- АОСТТТСАСТАСАССАСССА Х2 5'- АОСТССААСйСТСТАТСА

Затем ПЦР-продукты разделялись с помощью горизонтального электрофореза в 1,5» агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия и фотографировались.

Содераанне работы. 1.АШШЗ экспрессии XАГ^р— 1 в ?кт<?дерм9

Для исследования распределения мРНК ХА№-1 по стадиям мы использовала эксплантаты, которые целиком состояли из какого-либо одного тала ткани: эктодэрш, мезодермы или энтодермы. В самом ыачага нэЕруляции (ст. 10) экспрессия ХАИР-1 на невысоком уровне наОлэдалвсь во всэй эктодерме. На стадии средней гаструлы (ct.II), когда иэзодарма на дорсальной стороне зародыша уже значительно продвинулась'к аномальному полюсу, -присутствие ХАЖ-1 цРШС Сало отчотлео показано только в зонах 1-4 (рис. 2 ), соотвэтствущпх прэзумптивной нейроэктодерме. Максимальный уровзяь этой мРНИ бил найден в зоне 3, в зоне 4 он был ниже, а в сопах I и 2- очень низким. Согласно картам презумптивных зачагкоа, зоны 3 а 4 содержат материал головных структур: порэднаП части нервной пластинки и зачатка присоски, в то время как кяэтки зон, 1-й . 2 войдут впоследствии -в состав осевых структур. На етадки12 мРНН ХШ-1 танке была обнаружена только в ' нзйроэнтодермэ. (рис.2 ). На стадии средней нейрулы (ст.15) максимальный- уровень ХАНР-1 мРНК наблюдался в области передних варвшгг' валиков. Более низкий уровень экспрессии был отмечен в области 'присоски и. в' районе дна нервной пластинки. Таким образом, после активации гена МПМ во всей' эктодерме в начале гзструляции происходит существенное сукениэ зоны эго экспрессии так, что в конце гаструляции его транскряцты обнаруживаются только в дорсо-антёрнорной зоне нейроэктодермы (рис.3), для

иоьнинония втого явления можно предложить две. альтернативные возможности: оно может быть результатом действия какой-то автономной программы, присутствующей в эктодерме уже на стадии гаструлы, или быть обусловлено мекткшевыш взаимодействиями в период гаструляцш. Оказалось, что эксплантаты и-вентральной, и дорсальной эктодермы ранней гаструлы на стадии, эквивалентной стадии средней нейрулы, экспрессируют ХАКР-1. Таким образом, к началу гаструляции клетки эктодермы, у»е запрограммированные на автономную активацию ШШ- 1, еще не имеют информации о его последующем ннгибировании в эктодерме;

првзумптивные

передние нервные велики

опинная губе блестопора

передние

нервные

валики

ранняя гаструла

средняя иейрула

Рис.2. Схема экспрессии ШУ-1 в эктодерме.

-4.2-

Рис.2- Ггюпк'дрлон'.и- м1 НК ХЛМгМ в эктодермальных тканях в период гастр'улнции н^йруляции. Зоны, взятые для анализа.обведены пунктирной лшш'-П. 'Л)- На диаграмме гфедставлены анализируемые зоны зпродшю на стадии ранло'л гаструлы (сагиттальный срез), аналязииуемш« зоны пронумерованы последовательно начиная от дорсальной губы Олаетопора (справа); (Б)- так же как в (А), но ип стадии с:редной гаструлы; (В) и (Г) - Вид с дорсальной стороны на зародыш на стадии средней нейрулы, (В)-Анализируемые районы пронумерованы в передне-заднем направлении. (Г), 1-прозумптивная присоска, ¿¡-передняя часть перидиего нейрального валика, 3-дно нёйрального плато, 4- осжоьгш масть г?реднего нейральяого валика, ь- прч:'уштивний передний эпидермис.

-132) Экспрессия Щр-1 В. ТКШ>1Ш коныогатах.

Чтобы выяснить, может ли информация об ннгибировании ХАММ в нрезумптивном эпидермисе возникать в результате индукционных взаимодействий между эктодермой и мезодермой в период гвструляции, мы провели серию опытов по совмещению участка, эктодермы, интенсивно экспрессирукшзй ХАНР-1, с районки мезодермы, подстилающей те зоны эктодермы, где в норме этот ген не экспрессируется. Для этого кусочек презумлтивной антераорной нейроэктодермы со стадии II сращивали с больида по размеру кусочком, вырезанным либо из вентральной, либо из осевой туловищной мезодермы со стадии поздней гаструлы (ст.12,5). При этом наблюдалось практически полное подавление экспрессии исследуемого гена. В этой ае серии опытов мы исследовала возможность реактивации экспрессии ХАМР-1 под действием головной мезодермы в областях эктодермы, где экспрессия этого гана была не так давно ингибирована. Для этого участки эктодермы из вентральной и дорсо-каудальной областей сращивались с кусочками головной эктодермы со стадии поздней гаструлы. В 3-х из 5-ти таких комплексов наблюдалась экспрессия ШР-1.

Чтобы выяснить, начиная с. какой стадии уровень экспрессии ХМР-1 в нейроэктодерме детерминирован и не чувствителен к действию вентральной и туловищной мезодермы, аналогичные опыты были проведены о нейроэктодермой стадии поздней гаструлы. Оказалось, что ни вентральная, ни туловищная мезодерма этой стадии, ни туловищная мезодерма стадии 15 практически не изменяют уровень экспрессии ХШ-1.

средляя гаструла

поздняя гаструла

развитие папепых коиыогатовв до стадии вкшталеитной средней нейруле

кктодерма 22231 31777 мезодерма ё> Л 5 5 5 <л Л

XANF-l Ма,К-АТРаге

Рас 4. Экспрессия ХШМ в тканевых коньюгатах различных типов. ,Внизу-результаты ПЦР.

-153) Влияние ца экспрессии XANF-1.

Действие естественных агентов-ингибиторов XAÍIP-1 сравнивалось с действием ретиноевой кислоты (РК). Применялся 2-х часовой реши обработки зародышей и эксплантатов' РК.' При обработка зародышей, эксплантатов нейроэктодерш, , эксплантатов иейроэктодорш с подстилающей мезодермой со стадии ц- 11,5 I0"6 М РК в течение 2 час. - доза, вызывающая у зародышей высокую степень микроцефалии - происходит практически полное подавление XAKF-1. .Такой ¡¡се результат дает обработка зародшзй и эксплантатов нейроэктодерш со стадии 12.5. При использовании 2-х час. обработки ГО""7 М и I0"8 U, шзывощэй болоо слабую степень микроцефалии, уровень 'экспрессии' XAJíF-l снижается по мере увеличения концентрации ГК. У зародышей такая - обработка также снижает уровень экспрессии XAHF- 1.

Мор<юлогический анализ экс плантатор ■ , I. Морфология тканевых коныогатов.

Эксплантаты передней половины ноЯроэктодэрии при культивировании практически не претерпевают удлинения. На рис.4 показаны такие эксплантаты, они имеют xoposo различного прясоски, меланофорц и пигментный эпителий (таОл.1 ), Гистологический анализ показал, что они содержат нэйральную ткань, ткани глаза, актомезенхиму, хрусталики и ткань присоски. В аксплаптатах этого типа часто формируются атипичные мозговые пузыри, честь стенки которых дифференцируется в сетчатку. В таких эксплантатах мы никогда не наблюдали дифЕеранцировки кезодврмалышх осевых структур.

Эксплантаты передней половины нейроэнтодермы ст. 12.5 содержат тот ке набор тканей, что и предыдущий тип, но отличаются более

правилыгай формой мозговых пузнрай и глаз.

Коньвгага передней половины нейроэктодермы с участком вентральной краевой зоны по мере культивирования приобретают несколько удашоплую форму, эпидермис на та поверхности становится утолщенным, складчатым, появляются эктодермалыше складют, подобные плавникам. Присоски у большинства таких ко»!« ; ;л'ов отсутствуют, у остальных - уменьшены. Такие коньюгаты содержат преимущественно неправильно •построенные нейроиды, кэзенхиму 3! утолщенный, фестончатый эпидермис.

Кс:хь:огаты центральной" мезодермы с головной нейроэктодермой Пет., к;:: п контрольное эксплантаты нейроэктодерш, почти не вытягиваются в процесса культивирования (рис. 4 ). Они отличаются от контролей розгам шдаим уменьшением головных структур. Более полоияш .тэ!птх эксплантатов' но кмэют присосок, у части других пр'дсссгд ушшпшш и практически не выделяют характерной слизи (оксплантати, В отличие от контрольных, практически не притаиваются к субстрату). Гистологический анализ показал, что тс:пю коаыогатн, кроме того, реке содержат сетчатку, пигментный эпителий п.хрусталики. Преобладающий тип нервной ткани - нейронд.

Соответствующие коньюгаты с нейроэктодермой поздней гаструлы практически не отличаются от контрольных эксплантатов. Коньюгата нейроэктодерш ст.II с туловижной мезодермой ст. 12.5-13 претерпевают сильное удлинение и часто тлеют эктодермадьные складки типа плавников. Для них характерно отсутствие или уменьшение присосок и глаз и развитие нервной системы по типу спинного мозга. Туловищная мезодерма ст.14-15 оказывает еще более сильное действие на нейроэктодерму ст.II, вызывая полное отсутствие глаз и присосок ( . из-за малого числа таких опытов

морфометрический анализ не проводили ). Коныогаты нейроэктодермы от.12.5 о туловищной мезодермой также вытягиваются, но почти полностью "сохраняют" присоски и глаза. Туловищная зке мезодерма ст.14-15 вызывает более сильный эффект: уменьшение присосок и глаз у большинства эксплантатов.

Таким образом, вентральная мезодерма, как и задние отделы туловищной, вызывает существенное подавление структур шшш комплекса при их комбинации с передней половиной нейроэктодермы средней геструлы. Компетенция . нейроэктодермы к такому каудализующэму действию вентральной мезодермы исчезает на стадии поздней гаструлы. В отличие от этого, компетенция нейроэктодермы к каудализувдему действию туловищной мезодермы на втой стадии еще не исчезает (по данным литературы, такая компетенция исчезает лишь к ст. 14-15), . .

II. Морфология эксплантатов, обработанных РК.

Эксплантаты передней трети нейроэктодермы ст. II, обработанные РК в концентрации ДО"5 М, имели ввд комочков неправильной - форма с многочисленными складками. Присоски'. и пигментный эпителий полностью отсутствовали Нервная система была представлена .нейронном неправильной Форш. При понижении концентрации РК поверхность . эксплантатов .становится менее складчатой: при концентрации; Ю-8 М нервная система типа спинного мозга начинает преобладать над нейровда\к. При этой . концентрации эксплантаты имели . присоски, хотя и сильно уменьшенные. Ни пигментный эпителий, ш сетчатка, ни хрусталики не обнаруживались при зла концентрациях РК.

Обработка РК эксплантатов нейрозктодермы стадии 12.5 давала иную картину. Более половины эксплантатов, обработанных РК

Ю"6 М, имели присоски, пигментный эпителий и сетчатку. Поверхность таких эксплантатов практически нэ имела характерных складок и выростов эпидермиса. Нервная система развивалась преимущественно по головному типу, давая или правильные переднемозговые структуры, или атипичные мозговые пузыри. При понижении концентрации РК эксплантаты приближались по морфологии к контрольным.

Морфология эксплантатов нейроэктодермы с подстилающей головной мезодермой под действием РК претерпевает изменения типа зсаудалнзашш: исчезают присоски и глаза, нервная система форглируотся по типу спинного мозга. При этом в контроле правильно организованные переднемозговые структуры формируются лишь в тех случаях, когда наряду с головной мезодермой в эксплантатах присутствует и ткань хорды.

таКЛИЦА I. Анализ морфологии коньюгатов нейровктодермы стадии II с мезодермой разных типов. В таблицеуназан процент эксплантатов, содержащих структура данного типа, от общего числа"эксплантатов.

коньюгат с * кл.тип - Головная мезодерма ст.12.5 Энтодерма д.бласто-целя 12.5 Ту ЛОВИЛИ, мезодерма ст. 12.5 Вентр. мезодерма ст.12.5 Вентр. краевая 1 зона 12.5

Присоска 100 100 69 II 43 20

Сетчатка 94 100 56 22 II -

Пигм.эпит. 88 100 44 - 7 -

Хрусталик 53 100 25 - 7 -

Нейроид 35 - 31 II 40 60

Передний мозг 35 100 ■ 44 II. 7 -

Атипичные мозговые пузыря 30 - - 7 40

Спинной мозг - - 78 4G -

ТАВЛИЦА 2.Морфология коньюгатов нвйроэктодерш ст.12.б с мезодермой разных типов.

коныогат о IUI. тип* - Энтодерма д.Оласто-целя 12.5 Туловища. мезодерма ст. 12.5 Вентр. мезодерма ст.12.5

Присоска 100 100 100 100

Сетчатка 100 100 4. 100

Пипл.эпит. 68 100 50 88

Хрусталик 75 100 33 50

Нэйроид 25 - 33 13

Передний мозг 50 100 17 75

Атипичные мозговые пузыри 25 - 33 12

Спинной мозг - - 50 -

III. Результаты иорфометрии тканевых коньюгатов.

Морфометрический анализ тканевых коньюгатов позволил выявить достоверное снижение относительного объема нервной ткани в коньюгатах нейро эктодермы ст.II о вентральной мезодермой и вентральной краевой зоной по сравнении - о контролем эксплантатами нейроэктодермы. Коньюгаты с головной и туловищной мезодермой не имеют достоверных отличий от контроля по относительному объему нервной ткани. В то &е время эксплантаты этих типов отличаются друг от друга по таким показателям, как относительный объем присосок и глаз - он минимален в случае коньюгатов с вентральной краевой зоной, далее следуют коньюгаты с вентральной мезодермой, коньюгаты о туловищной мезодермой коньюгаты с энтодермой дна бластоцвля, контрольные эксплантата нейроэктодермы, и наконец, коньюгаты с головной ыэзедэрмоВ. .

IV. Ыорфоиетрия зародышей и эксплантатов, обработанная КС.

Как уже было описано {Durston,1939), PK шзызает у зародаэй уменьшение головных структур: присоски, глаз, всех, отделов ■ головного мозга, кроме заднего мозга. Задний мозг и слуховые пузырьки, напротив, увеличиваются в обьемэ, ото , однако, на компенсирует полностью уменьшение суммарного объема головного мозга. В "чистых" эксплантатах найроэктодэрш. PK приводит к последовательному, по мере увеличения дозы, сокращению относительного объема нервной системы. Воздействие. PK на эксплантаты нейроэктодэрш с подстилавдэй осевой мезодермой пэ приводит к достоверным изменениям объема нервной системы.

Рис. Морфология тканевых коньюгатов.

a.с-вксилантат передней 1/2 нейроэктодермы ст.И.

b.й-коньюгат нейроэктодермы ст.Н.с вентральной мезодермой е-коньюгат нейроэктодермы ст.II с вентральной краевой зоной. ЗГ-коныогат нейроэктодермы ст.12,Б с туловищной мезодермой, в-коньюгат нейроэктодермы ст.II с осевой туловищной мезодермой.

п

50

гЕ-

¡щ

г

г^тЬ

50

нервная ткань

I-1 ЧС-НСрВНЫС

актодершльные производные

1 6 9

I

:ис.5 Соотношение относительных оОьемов нервной ткани и других жтодермальншс производных у тканевых коньгатов и эксплантатов, заработанных ретиноевой кислотой, [--эксплантаты нейроэктодерш II ст.

2-коныогата нейроэктодерш Ист. с вентральной мезодермой Пет. ,

3-коньюгаты нейроэктодермы Ист. с туловищной шзодэркой 12,5 ст.

4-эксплантатц нейроэктодерш ст. 12,5.

4-коньюгаты нейроэктодермы 12,5 от. с вентральной: .мэзодермой. э-эксплантаты нейроэктодермы ет.И., обработанный РК в

—К

сонцонтравди 10 М.

з-эксплантатн нейроэктодерш ст.II с подстилающей мезодермой.

;Опаботанше РК 10

-6

Ы.

-24-Вывода.

1. Показано, что специфический пространственный паттерн экспрессии переднеголовного маркера ХАММ на стадии гаструлы формируется под действием различных регионов мезодермы: вентральная я каудальная мезодерма подавляет экспрессию ХШ-1, а головная иэзодерма активирует его экспрессию.

2. Установлено, что на стадии поздней гаструлы экспрессия ХАЭТ-1 уже не зависит от влияния этих областей мезодермы.

3. Впервые систематически исследовано влияние вентральной мезодермы на дифференцировку нервной системы: в хоньюгатах с нейроэктодерлой средней гаструлы вентральная мезодерма вызывает подавление переднеголовных структур (глаз я присоски) и существенное снижение объема дифференцирующейся нервной ткани.

4. Каудальная мезодерма, вызывая сходное подавление переднеголовных производных, не приводит к снижению обьема нервной систем. Головная мезодерма, вызывая увеличение объема переднеголовных структур, также не изменяет суммарный обьем нервной ткани.

б. Эффекты, сходные с действием вентральной мезодермы на эксплантаты нейроэктодермы средней гаструлы, оказывает ретиноевая кислота,

а)Ретиноевая кислота в физиологических

концентрациях вызывает снижение экспрессии ХШ-1 в таких эксплантатах.

б)На морфологическом уровне действие РК на эксплантаты выражается в существенном снижении обьема нервной системы, степень которого зависит от концентрации РК, и в существенном подавлении головных структур.

6.На стада поздней гаструлы нейроэктодерма перестает отвечать на действие' РК снишнием обьома нервной ткани, а на стадии средней нейрулы прекращается и каудализуювде действие РК.

7. Показано, что осевая мезодерма способна блокировать гшгибирущее действие РК на нейральную даффорэндаровку в цело;,!.

8. Таким образом, в качестве рабочей гипотезы мо.чшо принять, что не только каудальная, как продполагалось ранее (Duraton, 1939), но и вонтральная кеводорма является источником эндогенных ретиноидов. Таким образом, Pli в вентральной области ыоа:ет выступать как ингибитор нэйральной дифференцировки, а в туловищной - как модификатор^ вызывающий развитие нервной ткани по туловищному типу. При этом осевая мезодормэ - нэйральный индуктор - блокирует ингибирущее действие РК на нейральную дифференцировку.

Сш!сок работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. 2aralsky Л.О., luklanov S.A., Vaslllev O.L.. Smirnov Y.4., Bellavaky A.V., KazanskayaO.V. A novel homeobox gene expressed In the anterior part of the neural plate of Xenopua embryo -Developmental Biology, 1992, v. 152. p.373-382.

2. Zaralaky A.G., Luklanov S.A., Vaslllev O.L., Smlmov Y.V., Bellavaky A.V., KazanskayaO.V. Л novel homeobox gene expressed In the anterior part of the neural plate of Xenopus embryo -The 7th International Conference of the International Society of Differentiation, 1992, Helsinki, Finland, abstr.N 260.

3. Zaraleky A.G., Kazanskaya O.V., luklanov S.A.. Ventral mesoderm and retinóle acid can Inhibit differentiation of the neuroectoderm of Xenopus embryo. 14th Congress of ISDB, Vienna, Austria abatr.W 264.