Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы формирования кровеносных сосудов и сосудоподобных структур в эмбриональных тканях Xenopus Laevus

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы формирования кровеносных сосудов и сосудоподобных структур в эмбриональных тканях Xenopus Laevus"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени II.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК: 591.413: 597.812

ФЕСЕНКО Ирина Валерьяновна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И . СОСУДОПОДОБНЫХ СТРИКТУР в ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ' ХЕНОРЧБ ЛАЕШБ .

03.(К).11 - эмбриология и гистология

и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологический'наук

Москва - 1992 '/>

7Г

• Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Белоусов /I.D.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Медвинский A.A., доктор биологических наук Савельев C.B.

Ведущая организаций - Институт биологии развитии Российской Академии Наук.

^ Защита диссертации состоится —£_— 1992 г. в

'^^часов на заседании специализированного совета Д.053.05.68 при Москоьском государственном университете им. М.В.Ломоносов по адресу: 119899 Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией момно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплено значительное количество данных о формировании кровеносных сосудов у эмбрионов позвоночных, главным образом, птиц. В эмбриогенезе птиц полости кровеносных сосудов образуются за счет межклеточного пространства (Hirakou, Hiruna, 1983). Однако известно, что они могут иметь не только межклеточное, но и внутриклеточное происхождение (Hagner, 1980)! С помощью иммунологических меток эмбриональное сосудообразование подробно прослежено у'перепелиных эмбрионов с момента сегрегации ангиобластов, предшественников сосудистого эндотелия, от других мезенхимных клеток и до образования основного сосудистого древа. Кровеносные сосуды в теле эмбриона возникают независимо от кровяных островков желточного мешка и закладки кровяных клеток (Pardanaud et al., 1987, Coffin, Poole, 1988, Noden, 1989 ).*B этом случае образованию кровеносного сосуда, представляющего собой тонкостенную трубку, предшествует формирование многоклеточного тяжа, внутри которого затем постепенно возникает полость (Hoser et al,, 1961, Pardanaud et al., 1987, Coffin, Poole, 1988). Однако остаются малопонятными механизмы, лежащие в основе этих преобразований. Объяснения, базирующиеся на участии осмотических механизмов и роли гидростатического давления (Hynes, Rodbard, 1962, Gonsales-Crussi, 197.1) далеко не всегда оказываются удовлетворительными (Hirakou, Hiruaa, 1983). Важную роль могут играть взаимодействия клеток между собой и с внеклеточным'матриксом (Coffin, Poole, 1988). В то же время,показано, что механические, т. е. зависимые.от натяжения, взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс могут играть решающую роль в обрлзовании сети сосудоподобных , трубок эндотелиальными клетками in vitro СIngber, Folkaan, 1989а)'.

Таким образом, изучение клеточных механизмов образования полостей эмбриональных кровеносных сосудов и роли механических факторов в этом процессе представляет особый интерес. Способность эмбриональных тканей Xenopus laevls хорошо развиваться в экто-ме-зодермальных эксплантатах дает возможность использовать последние в качестве моделей для изучения влияния различных факторов на эмбриональные ткани.

Цель и задачи работы. Основной целью данного исследования бы-

ло изучение формирования кровеносных сосудов в эмбрионах Хепориз 1ае'Лз и использование экто-мезодермальных эксплантатов как модельных объектов для изучения роли механических натяжений в этом процессе. В связи с этим, были поставлень следувщие задачи:

1. Проследить на клеточном и ультраструктурном уровне за образованием полостей кровеносных соЬудов в интактных эмбрионах.

2. Выяснить возможность участия клеточных вакуолей в формировании полостей кровеносных сосудов у интактных зародышей.

3. Описать тонкостенные сосудоподобные полости в мезенхиме эксплантате,

4. Изучить роль механических натяжений в формировании тонкостенных полостей в эмбриональной мезенхиме,.

Научная новизна работы. В настоящем исследовании впервые обнаружено, что в образовании полостей эмбриональных кровеносных сосудов наряду с межклеточными полостями могут участвовать и клеточные вакуоли.

Впервые продемонстрирована роль механических натяжений в образовании и ориентации сосудоподобных трубок в эмбриональной мезенхиме, а также в образовании крупных тонкостенных полостей из более мелких, . . ' .

Показано, что механическое растяжении мезенхимного внеклеточного матрииса мовет вызывать довольно быстрые формообразвательные процессы ь эмбриональной мезенхиме. "

Наччно-практическое значение. Впервые описанные в дрнной работе быстрые формообразовательные реакции клеток в трехмерном внеклеточном матриксе на мехайические воздействия могут быть использованы в клеточной и органной биотехнологии для конструирования сосудистых структур ^'."'ЛЬго,

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ им. Н.В.Ломоносова,

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура работы. Работа построена по общепринятому плану, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исс-• ледования, раздела, в котором изложены собственные результаты, обсуждения и выводов, Работа изложена на страницах машинопис-

- з -

ного текста, содержит fr? рисинка и 2 таблицы. Указатель литературы включает'7^ наименования работ.

2. Методы исследования. Исследования проводили на зародышах африканской шпорцевой лягушки Xenopug laevls-Daudln. Для изучения морфологии формирующихся ' и сформировавшихся, кровеносных сосудов интактных зародышей фиксировали на стадиях поздней хвостовой почки, 32-37/38 и 42 (Hieuukoop. Faber. 1938). '

Для эксплантаций использовали зародывей на стадии 16-17 (Hieuukoop, Faber, 1935) - средняя нейрула. В состав эксплантатов входили мезодерма и прилегавшая к ней эктодерма.

Эксплантаты культивировали в течение 5ти суток в модифицированном растворе Слека - Формана (Slack, Fornan, 1980), что по времени примерно соответствует 46~47й стадиям развития интактных зародышей (Hieuukoop, Faber, 1956).

Иеханическоиу воздействии подвергали эксплантаты из вентральной' области. Их деформировали, придавливая покровным стеклом на пластилиновых'ноаках или сдавливая ме*ду двумя параллельными покровными стеклами. В последнем случае стекла крепились на браниах специального приспособления, снабженного винтом, позволяющим регулировать расстояние ме»ду ними. Это давало возможность при периодических деформациях сохранять неизменной ориентации эксплантата. Величина деформации.была такова, что плоцадь центрального сечения эксплантата в плоскости деформации увеличивалась примерно в 1,6 - 1,8 раза:

Для светооптических исследований материал фиксировали «ид-костьв Буэна,' заливали, в парафин, делали гистологические, срезы толщиной 5 г 7 мкм и окравивали их гематоксилином по Эрлиху.

Для получения зпоновых полутонких срезов.и для трансмиссионной электронной микроскопии материал фиксировали 1*-ным глптаро-вым альдегидом-и {¡5%-ной четырехокисьв осмия, затем заливали в эпон. Полутойкие эпоновые срезы тол*иной 5мкм окраяивали толчиди-новым синим. Затем с тех «е блоков делали ультратонкие срезы и ркрамивали их цитратом свинца и уранилацетатом.

Для изучения морфологии сосудоподобных полостей в .эксплантатах отобранные для злектронномикроскопического исследования полу-

тонкие срезы наклеивали на эпоновые блоки и делали с них ультра-тошле срезы, которые такяе окрашивали цитратом свинца и уранилацегатом.

Математическую обработку результатов проводили с использованием методов регрессионного анализа. Коэффициенты регрессии вычисляли по алгоритму Иейтса, значимость полученных коэффициентов определяли графическим методом (Максимов,1980).

31 Результаты.

3.1. Формирование кровеносных сосудов у интакных зародышей. Ми наблюдали за формированием кровеносных сосдов у интакных эмбрионов на 32 - 35/36 стадиях развития. Наблюдения проводили на тех сосудах, места локализации которых легко определить. Таковыми, в частности, являются мевсомитные сосуды,, проходящие в бороздках меяду сомитами с наруяной их стороны, и дорсальная аорта, располагающаяся в пространстве между хордой, сомитами и кишечной трубкой. Это позволило с большой долей вероятности утверндать, что наблюдаемые нами клетки являются ангиобластами - предшественниками эндотелиальных клеток кровеносных сосудов - или клетками эндотелия недавно сформировавшихся кровеносных сосудов. По общей морфологии и ультрастурктуре эти клетки сходны с недифференцированными мезенхимными клетками, так яе, как и у эмбрионов птиц :Н1гакои, Шгиша. 1981 , 1983).

В процлссе образования сосудистой полости ангиобласты используют в качестве субстрата поверхность окружающих тканей и волокна интерстициального внеклеточйого матрикса, Как и в куриных эмбрионах Шгакои, Шгиша, 1983), в эмбрионах Хепори 1аеу15 ангиобласты, образуя просветы будуших сосудов,устанавливают друг с другом контакты, уплощаются с.и таким образом отгораяивают часть межклеточного пространства. Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что с плазматической мембраной ангиобластов соседствуют фибриллы внеклеточного матрикса, в том числе фибриллы коллагена. Их ориентация часто совпадает с ориентацией микрофиламентов в клетке. На светооптическом уровне видно, что ангиобласты, имеюцио более или менее уплощенную форму, и их отростки ориентируются вдоль волокон интерстициального внеклеточного матрикса, которые, переплетаясь, образуют ячейки полигональной

формы (рисЛа). Причем появление этих ячей предиествует окончательному формированию полостей кровеносных сосудов. Образуя полость сосуда и при этом ориентируясь вдоль стенок ячеек-ыногоу-гольников, клетки образуют кольцевые структуры в плоскости, соответствующей плоскости поперечного сечения будущего сосуда (рис.16).

Рис.1. Схема образования просвета межсомитного кровеносного сосуда: а. - ангиобласт ориентируется вдоль волокон внеклеточного матрикса; б. - сформированный просвет сосуда. Зп - эпидермис, С -сомит, йб - ангиобласт, Энд - эндотелиальная клетка. •

Канал дорсальной аорты, являющейся одним из самых крупных сосудов зародыиа. по-видимому, образуется за счет слияния полостей меньшего размера: на стадии 33/34 на серии поперечных и сагги-тэльных срезов в месте образования в среднетуловищной области эародыва обнаруживается, последовательность из клеточных тяжей и различного размера трубок и круглых полостей. Л уже на следующей стадии 35/36 дорсальная аорта представляет собой единый сосуд.

В ангиобластах, как впрочем и в других мезенхимных клетках, на светооптическом-уровне обнаруживаются крупные вакуоли, заключающие желтЬчные гранулы. На стадиях 32-33/34 крупные желточные гранулы обнаружены нами в просветах, о/раниченных телами и отростками клеток в местах прохождения будущих межсомитных сосудов и дорсальной аорты. Встречаются также картины, позволяющие предполагать, что. желточные гранулы могут выходить в уже оформившуюся

сосудистую полость, а занимаемые ими вакуоли присоединяются к этой полости.

Данные трансмиссионной электронной микроскопии говорят о том. что, действительно, на этих стадиях в анг.юбластах вокруг некоторых желточных гранул образуются полости, В них вокруг желточных гранул иногда появляются мембранные структоры. Количество и разнообразие мембранных структур значительно возрастает на слодующих стадиях (35/36 - 37/38),

Такие вакуоли с желточными гранулами могут открываться в межклеточное пространство. Обраэоваввиеся при этой клеточные отростки контактируют с соседними клетками, в том числе со стенками аналогичных вакуолей,или с отростками клеток, образующих просвет будущего сосуда,

3.2. ДиФФерениировка 1 мезодермы в эксплантатах из вентральной и латаральных областей. Изучали способность мезодермы эмбрионов Xenopus laevls к образованию сосудоподобных структур при efe диф-Ференцировке в эксплантатах, С этой целью вырезали эксплантаты из б областей зародыша'(рис,2); сомитной области (S), двух дорсола-теральных областей (D-L I , D-L II), двух вентролатеральных областей (U-L I, V-L II), вентральной области Ш - области заклад1-, ки кровяных островков (Nieuukoop, Faber, 1936),

Эксплантаты после 5 суток культивации представляют'сббой замкнутые эпителиальные образования сферической или эллипсоидной формы. Внутри имеется крупная центральная полость, Остальное пространство внутри эксплантата заполнено мезенхимой, волокна ее внеклеточного матрикса , как и в эмбрионе, образуют полигональную сеть,

Данные о типах и количестве обнаруженных в эксллантатах дифференцировок и Рис.2. наличии сосудоподобных полостей предста-

влены в таблице,

Серия Кол-во экспл. Структуры пронефроса Гладко- мышечные клетки Кровяные клетки Мезенхима Сосудопо-дойные структуры

Кол- во X Кол- во % Кол-во X Кол-во 7. Кол-во X

V 11 3 27 0 0 11 100 10 91 10 91

V-LI 27 26 93 7 26 6 22 26 96 23 85

V-LII 19 1S 79 2 11 8 42 17 89 14 74

D-LI 24 23 98 5 21 0 0 24 100 19 79

D-LII 30 27 90 20 67 3 10 29 97 22 73

S 10 10 100 10 100 0 0 10 100 0 0

3.3. Сосудоподобные полости. В эксплантатах из вентральной и латеральных областей среди мезенхимы, заполняющей основную часть его объема, располагаются полости, которые мы назвали сосудопо-добными за сходства их морфологии на световом уровне с морфологией кровеносных сосудов зародыша. В некоторых из «их заключены кровяные клетки. Но вообще, как видно из таблицы, наличие в эксплантате сосудоподобных полостей не связано с наличием в нем клеток крови. Стенки полостей образованы одним слоем уплощенных клеток, которые отростками связаны друг с другом и с волокнами внеклеточного ыатрикса мезенхимы и ориентированы вдоль них. Мощно выделить следующие типы таких структур:

(а) часто встречающиеся округлые полости различного размера, напоминающие поперечные'срезы кровеносных сосудов зародыша. Так же как и ангиобласты, клетки, образующие стенки полостей, ориентированы вдоль стенок ячеек-многоугольников, ' образованных волокнами мезенхимного внеклеточного матрикса, что прямо подтверждает -ся электронномикроскопическими картинами. Встречаются и образованные клетками кольца, не являющиеся частью полостей.

(б) значительно реже встречающиеся вытянутые, трубчатые полости.Они сходны с продольными срезами кровеносных сосудов зародышей;

(в), отростки, образованные вытянутыми цилиндрическими клетками, и отходящие от стенок полостей, как и от стенок кровеносных

сосудов.

Ультраструктура клеток, образующих такие полости, сходна с ультраструктурой ангиобластов, эндотелиальных и мезенхимных клеток зародыша. Трансмиссионная электронная микроскопия также показала, что, как и в эмбрионе, часть заполняющего эксплантат внеклеточного матрикса представлена коллагеновыми фибриллами, А ориентация фибрилл внеклеточного матрикса, окружаищих клетку, часто совпадает с ориентацией в ней микрофиламентов и иногда - микротрубочек.

Сосцдоподобные полости обнаружены в 91% случаев в вентральных эксплантатах. В эксплантатах из всех четырех областей боковой пластинки процент встречаемости сосудоподобных структур также высокий и примерно одинаковый (от ?ЗХ в О-Ь II до 85% в и -Ь I).

В эксплантатах из соиитноП области в 100'/. случаев обнаруживаются гладкомышечные клетки и структуры пронефроса, что совпадает с данными, полученными ранее на зародышах хвостатых амфибий (7атайа, 1940). Эксплантаты заполнены слабо развитой мезенхимой. Кровяные клетки и сосудоподобные" полости в них отсутствуют,

3.4. Результаты механического воздействия на эксплантаты, Благодаря морфологическому сходству тонкостенных полостей в эксплантатах с эмбриональными кровеносными сосудами мы предположили, что в основе их формирования могут лежать общие механизмы. Для изучения роли механических натяжений в формировании тонкостенных полостей в эмбриональной мезенхиме были использованы эксплантаты из вентральной области, Их сдавливали между двумя параллельными плоскостями, что'дриводило к растявению мезенхимного внеклеточного матрикса в плоскости деформации в радиальном, от центра к периферии, и тангенциальном, параллельно поверхности, направленях.

Было поставлено 7 серий опытов, в которых использовано 70 эксплантатов.

Серия 1 - эксплантаты деформировали в течение 3-х мин., а затем в деформированном не состоянии и фиксировали.

Серия ('.Т| - эксплантаты деформировали в течение 50ти мин..

после чего срази фиксировали.

Серия 25 - эксплантаты деформировали в течение 50ти мин., инкубировали в растворе Слека - Формана в течение 40 минут и затем фиксировали.

Серия 3 - эксплантаты деформировали дважды по 50 минут с 50 -минутным же интервалом.,

Серии 4 и 5 аналогичны серии 3, но в них экспантаты деформировали по 3 и 4 раза соответственно. '

Серия 6 - эксплантаты деформировали с периодическим (через 10 минут) усилением и ослаблением давления в течение 1,5 часа.

В сериях 3 - б, как и в серии 2Б, после снятия экспериментального воздействия эксплантаты инкубировали 40 мин. в раствори Слека - Формана, а затем фиксировали. При этом за время инкубации эксплантаты, почти полностыб восстанавливали свою премнюю форму.

Контролем служили эксплантаты, культивированные в тех яе условиях, но не подвергавшиеся механическим воздействиям. Срезы деформированных эксплантатов ориентировали как в плоскости давления, так и перпендикулярно к ней.

3.4.1. Влияние деформации эксплантатов на с остдяни е_ _м езешм-ного внеклеточного матрикса. В контрольных эксплантатах, не подвергавшихся механическим воздействиям, мезенхимный внеклеточный матрикс имеет вид слабо.и/или неравномерно натянутой сети.. На парафиновых срезах деформированных эксплантатов, сделанных параллельно плоскости давления, внеклеточный матрикс имеет вид сети, растянутой в радиальном и/или тангенциальном направлении. При этом полигональная структура сети становится более выраженной. Либо волокна внеклеточного матрикса выстраиваются линейно, в тангенциальном, направлении. Следует отметить, что на срезах, сделанных перпендикулярно плоскости давления, в тех участках, где наряду с тангенциальным растяжением происходит радиальное сжатие, волокна внеклеточного матрикса ориентированы именно гак, т.е. в направлении, растяжения.

Эксплантаты из серий 1 (3-х минутная деформация) и 2А (50 минутная деформация без последующей инкубации), кроме описанных вы-ее изменений в состоянии внеклеточного матрикса. ни в чем нё отличаются от контрольных.Эксплантаты остальных серий значительно

отличаются от контрольных, но между разными сериями принципиальных различий нет, отчего мы будем описывать их в совокупности,

3.4.2. Образование тонкостенных сосудоподобных трубок в плоскости растяжения, В эксплантатах из серии 2Б, 3-6 на срезах, параллельных плоскости деформации, т.е. в плоскости растяжения внеклеточного матрикса, значительно возрастает число тонкостенных сосудоподобных трубок. К тому же среди них появляются капилляро-подобные структуры. • которые вовсе отсутствуют в контроле. Количество сосудоподобных трубок подсчитывали на гистологических срезах эксплантатов контрольной серии и в эксплантатах всех опытных серий на срезах, ориентированных параллельно плоскости деформации.

Трубки обнаружены

- в 18,8/! контрольных эксплантатов, при этом в среднем на срез приходится 0,009 трубки;

- в 60Х эксплантатов из серий 2Б, 3-6, при этом в среднем на срез приходится 0,081 трубки, что в 9 раз превышает аналогичную величину для контроля; трубки ориентированы премиущественно в радиальном и тангенциальном направлении.

В пользу того, что трубки сформировались.в результате воздействия свидетельстует и их ориентация параллельно плоскости, в которой растягивался внеклеточный ыатрикс. При этом в эксплантатах из серьй 1 и 2fl обнаружены лишь единичные трубки.

3.4.3. Образование кольцевых структур в плоскости рас яжения. Другая особенность эксплантатов этих серий состоит в увеличении числа кольцевых структур на срезах, сделанных параллельно плоскости деформации. Клетки в этих структурах ориентируются вдоль образующих ячеи волокон внеклеточного матрикса и образуют округлые просветы во внеклеточном матриксе мезенхимы подобно тому, как это делают ангиобласты при формировании просвета кровеносных сосудов (рис.1),

Число кольцевых структур подсчитывали в эксплантатах контрольной серии и серий 1, 2fl и 2Б на парафиновых срезах, ориентированных параллельно плоскости давления. Учитывали только структуры. имеющие хорошо выраженную замкнутую стенку, в состав которой входит тело хотя бы одной клетки. Для сравнения результа--

тов использовали показатель N. равный отношению числа кольцевых структур к общему числу мезенхимных клеток на данном срезе. 8 каядой серии подсчеты проводили на восьми срезах: на двух случайным образом выбранных срезах четырех случайным образом выбранных эксплантатов. Результаты экспериментов представлены на рисунке 3. Величины N. полученные в контрольной серии, сравнивали с величинами N. полученными в сериях 1, 2А или 2Б с помощью регрессионного анализа. Графический анализ значимости коэффициентов регрессии показал, что использованные нами выборки однородны, а такае выявил достоверные различия меиду серией 2Б и контролем. Мекду тем достоверных различий между контролем и сериями 1 и 2Й обнаружить не удалось.

На сериях срезов, сделанных параллельно плоскости давления, видно, что, как и в контрольных эксплантатах, кольцевые структуры могут быть частью полостей или существовать независимо. Кроме того, располагаясь одна под другой, они могут образовывать капали, проходящие перпендикулярно плоскости среза. Подтверкдаючие это наблюдение картины встречаются на срезах, ориентированных перпендикулярно плоскости растяжения.

-В'эксплантатах, подвергавшихся периодическому усилению и ослаблению давления (серия 6), в занятом мезенхимой пространстве встречаются тангенциально ориентированные трубки довольно больного диаметра, а такяе крупные полости, круглые или тангенциально вытянутые, часто связанные между собой. Крупные полости обнаружены также в эксплантатах из серии 5 (четырехкратная деформация;.

3.4.4. Ультраструктура клеток. Ультраструктура клеток в длительно деформированных эксплантатах мало изменена по сравнению с контролем. Отметим только, что микрофиламенты и, микротрубочки часто ориентированы параллельно направлению вытяжения клеточных тел ил,, отростков, которое обычно совпадает с направлением действующего на них натяжения. Ориентация иикрофиламентов параллельно направлению натяяения наблюдалась также у подвижных эпителиальных клеток в культуре СКо1еаа. 1986).

4. Обсуядение.

4.1. Формирование полостей кровеносных сосудов у интактных зародышах Хепориг 1аеу!5. На зародышах птиц обнаружено, что эмб-

N

0.4

0.1 • О

Т

а. N

0.4

0.1

К 1

К 2А

0.5

0.1

0

К

в. Н

0.5

2Б

0.1 0

К

•2Б

Рис.3. Результаты опытов по механическому воздействию на эксплантаты: а. - контрольная (К) и 1 серия; б. - контрольная (К) и 2А серия; в., г, - контрольная (К) и 25 серия, два идентичных опыта, поставленных в разное время. N - отношение числа кольцевых структур к числу мезеихимных клеток на срезе,, горизонтальная линия - среднее значение.

б

0

риональные кровеносные сосуды Формируются при участии двух механизмов: васкулогенеза, сборки in situ из отдельных клеток и их групп, мигрировавших к месту образования сосуда, и ангиогенеэа -образования новых сосудов за счет отрастания от уже существующих (Pardanaud etal., 198?, Risauetal., 1980, Coffin, Poole, 1988). В обоих случаях образованию сосуда предшествует образование многоклеточного тяка, постепенно преобразующегося в трубку (Houser et al., 1961, Pardanaud et al.. 1987, Coffin, Poole. 1988). Это преобразование связано с формированием единой тонкостенной полости внутри тяжа. Клеточные механизмы, лежащие в основе ее формирования, остаются малоизученными. На основе многочисленных наблюдений на живых организмах и в культурах зндотелиальных клеток, сложилось представление о двух возможных способах формирования полости кровеносного сосуда:

(1) межклеточном, осуществляемом за счет образования контактов между уплощенными клетками;

(2) внутриклеточном, происходящем путем слияния выкуолей соседних клеток (Hagner, 1980),

Наблюдения на куриных эмбрионах свидетельствуют, что полости эмбриональных сосудов имеют у них межклеточное 'происхождение (Houser et al., 1951, Hirakou, Hiruaa, 1981, 1983). Однако наши наблюдения за формированием просветов эмбриональных кровеносных сосудов у Xenopus laevis на сввтооптииескои уровне позволяет предполагать, что в данном случае в формировании их полости принимают участие также и внутриклеточные вакуоли. Причем роль естественного маркера в наших исследованиях выполняли желточные гранулы.

Злектронномикрос'копические картины дают представление о том, как мог бы работать этот механизм, Образование в клетках вакуолей связан^ с переработкой желточных гранул, о чем свидетельствует появление вокруг них мембран (Jurand, Sellsan, 1964, Uan der Hal. 1975). Образование полости, в частности, нонет быть вызвано поступлением воды, а оно, в свои очередь, повышением осмотического давления вокруг желточной гранулы вследствие гидролиза ее белкового компонента (Elbers, 1S59). Эти вакуоли иногда открываются в межклеточное пространство. Определенную роль в этом процессе мо-

жет играть гидростатическое давление (Niles, 1989), а также контакт клеточных поверхностей, как при контактно индицированном эк-зоцитозе (Lauson et al., 1978)). В результате за счет объединения полостей двух соседних клеток может возникнуть новая полость. В других случаях такая внутриклеточная полость может присоединиться к межклетнику или уже сформированной полости. Сходный механизм возникновения полости наблюдался при образовании сосудоподобных структур в культурах зндотелиальных клеток капилляров (Folkman, Handenschild. 1980). ft полость такого крупного сосуда, как дорсальная аорта, судя по гистологическим картинам, возникает, как и у эмбрионов птиц (Hirakou, Hiruma, 1981), посредством объединения более мелких полостей.

Такии образом, при образовании полости ранних кровеносных сосудов в эмбрионах Xenopus laevis, вероятно, могут сочетаться межклеточный и внутриклеточный механизмы. При этом возникающие в процессе переработки желтка в эмбриональных клетках вакуоли принимают участие в эмбриональных, формообразовательных процессах.

Объяснения того, каким образом контактирующие друг с другом ангиобласт-ы образуют-тонкостенную полость , обычно базируются на предположениях о работе осмотических сил и роли гидростатического • давления (Haynes et al., 1962, Gonsales-Crussi, 19-71), Однако они далеко не всегда оказываются удовлетворительными, поскольку, например, при формировании парных дорсальных аорт в курином эмбрионе все эти преобразования происходят тогда, когда их каналы во многих местах остаются незамкнутыми (Hirakou, Н1гиша, 1983), Наши наблюдения говорят о том, что до того, как образуется сосудистая трубка, в межклеточном пространстве появляются волокна интерсти-циального внеклеточного матрикса, образующие полигональную сеть. Основным' компонентом внеклеточного матрикса .является коллаген, в частности интерстициальными коллагенами являются коллагены 1го и Шго типов (Kuhn,. 1987). Показано, что наличие трехмерного кол-лагенового матрикса может быть критическим фактором для формирования сети сосудоподобных трубок эндотелиальными клетками In vitro (Montesano et al., 1983). В культуре клеток эндотелия капилляров появление на поверхности монослоя волокон внеклеточного матрикса, вдоль которых ориентируются располагающиеся на поверх-

ности монослоя клетки, также предшествует образованию ими сети сосудоподобных трубок (Iniber, Folknan, 1989а). Способность клеток ориентироваться и перемещаться вдоль волокон внеклеточного матрикса известна как контактов ведение (contact guidance) (Helss, 1953), Так например, параллельно ориентированные натянутые коллагеновые волокна направляют движение фибробластов в культуре (Stopak, Harris, 1982 ).Возможность учагтия контактного веде-.ния в формировании сосудов отмечалась у зародышей птиц (Poole, Coffin, 1989), Мы предполагаем, что образованные волокнами внеклеточного матрикса полигональные ячеи, появление которых предшествует формированию сосудистой трубки, могут так ориентировать клетки и направлять-их движение, что они образуют просвет сосуда. В пользу этого предполоаения говорит и то, что нами обнаружены коллагеновые фибриллы поблизости от ангиобластов. Злектронноыик-роскопические картины сосудоподобных полостей в эксплантатах прямо указывают на то, что ячеи внеклеточного матрикса могут использоваться как каркас при образовании клетками стенок этих полостей,

4.2. Тонкостенные сосцдоподобные полости в эксплантатах и роль механических натяжений в их формировании и ориентации. Результаты эксплантаций из различных об ластей средней нейрулы ' Хепориз laevlS показали, что при дифференцировке мезодермы из области закладки кровяных островков, а также большей части латеральной пластинки в мезенхиме образуются тонкостенные полости. Они сходны с полостями кровеносных сосудов на светооптическом и ультраструктурном уровне, часть из них содержит кровяные клетки.

В вентральной области, где закладываются кровяные островки, в ходе нормального развития часть клеток дифференцируется в кровяные, а часть - в клетки эндотелия кровеносных сосудов (Карлсон, 1983), Так что можно предполагать, что по крайней мере часть этих полостей образована ангиобластами. С большой вероятностью это можно утверждать о полостях, содержащих кровяные клетки. Сходные структуры - кольца, различной формы тонкостенные полости и трубки образуют эндотвлиальные клетки при культивировании в сгустке коагулировавшей плазмы (Jakob et ah, 1987 ), Образование небольших круглых .полостей также типично для птичьих ангиобластов, мигриро- ,

- Iß -

вавших из тканей трансплантата в ткани эмбриона-хозяина (Noden, 1989 ).

Бее вышесказанное можно отнести и к эксплантатам из латеральных областей. Об ангиобластических потенциях мезодермы амфибий известно крайне мало. Однако на птичьих эмбрионах показано, что источником ангиобластов, из которых формируются сосуды собственно зародыша, служит именно латеральная пластинка, причем дифференци-ровка ангиобластов в ней, за редким исключением, не связана с дифференцировкой кровяных клеток (Coffin, Poole, 1988; Pardanaud et al., 1989). Кроме того, существуют наблюдения об участии клеток из дорсальных краев спланхнотома амфибий в образовании эндотелия дорсальной аорты (Ruckert, Mollier, 1906). Так что наличие в эксплантатах из латеральных областей сосудподобных полостей может свидетельствовать об ангиобластических потенциях латераль ой мезодермы нейрулы Xenopus laevis.

Однако независимо от природы клеток, образующих описанные нами полости, формообразовательные процессы, имеющие место при их формировании сходны с теми, что происходят в эмбриональном васку-логенезе:. сборка тонкостенных полостей их мезенхимных клеток в трехмерном внеклеточном матриксе. Мы предположили, что в основе этих проессов могут лежать сходные механизмы и использовали эксплантаты из вентральной области в качестве модели для изучения роли механических натяжений в формировании тонкостенных полостей в мезенхиме.

Показано, что механические натяжения, действующие на клетки в том или ином режиме, могут влиять на их ориентацию (Buck, 1980), состояние цитоскелета (Kolega, 1986), синтетическую активность . (Brünett е, 1984, Koffiuro et.al., 1990) и ряд других параметров. Известно также, что механические натяжения стимулируют рост аксонов (Brav. 1984) и приводят к образованию функционирующих мыжц из эмбриональных птичьих миобластов In vitro (Uanflenburgh et.al., 1991).

В наших экспериментах мы заставляли растягиваться мезенхимный внеклеточный матрикс в эксплантате. Такие деформации можно рассматривать как пассивную вязкоупругую реакцию матрикса на натяжения, возникающие в плоскости, перпендикулярной направлению сдав-

ливания, Сравнивая эксплантаты из разных серий, мы могли убедиться, что наблюдаемые нами конечные морфологические эффекты являются результатом активной клеточной реакциии, требующей опре-деленого времени, а не быстрым пассивным ответом клеток на растяжение внеклеточного матрикса. Причем проявляются они, главным образом, уже после снятия экспериментального воздействия. Реакции клеток на растяжение субстрата выражаются в образовании в плоскости растяжения сосудоподобных трубок, ориентированных в направлении растяжения матрикса и кольцевых структур. Образование из кольцевых структур каналов, проходящих перпендикулярно плоскости давления, напоминает формирование межсомитных сосудов в интакных зародышах, когда клетки также выстраиваются вдоль стенок образованных натянутыми волокнами ячеек.

Появление в эксплантатах тангенциально ориентированных аиро-ких трубок, наряду с крупными полостями другой формы при многократном растяжении говорит о том, что в данном случае натяжение приводит к объединению мелких полостей в более крупные, и в том числе в трубки. • -

Факт, что внеклеточный матрикс выглядит растянутым не только в эксплантатах из серий 1.и 2А, но и в эксплантатах из остальных серий, исходная форма которых почти полностью восстанавливалась к моменту фиксации, возможно, указывает на то, что, перемещаясь и образуя сосудоподобные структуры, клетки способны поддерживать волокна внеклеточного матрикса в растянутом состоянии, а возможно, и растягивать , создавая таким образом условия для ориентации и перемещения других клеток. Показано, что ползущие клетки способны натягивать и ориентировать волокна в коллагеновон геле (Harris et.al. ,1981)'; на основе таких, опосредованных субстратом взаимодействий между клетками оказалась возможна их самоорганизация в гпределенные структуры (Harris et.al.,1984). Возможно, что именно эта способность клеток приводит к тому, что результаты растяжения матрикса закрепляются и усиливаются после снятия экспериментального воздействия таким образом, что приводят к формообразовательным процессам.

Проводя параллели между образованием сосудоподобных трубок в эксплантатах и кровеносных сосудов в интактных эмбрионах Xenopus

- IB -

laevis, мы предполагаем, что механическое растяжение поверхности тканей или мезенхимного внеклеточного матрикса, которые ангиоб-ласты используют в качестве субстрата, может играть существенную роль при формировании кровеносных сосудов зародыша. Причем на образование сосудистой трубки могут влиять как натяжения, ориентированные ■ вдоль формирующейся трубки, так и в перпендикулярной к ней плоскости. Кроме того, натяжения могут приводить к слиянию полостей, что имеет место, например, при формировании дорсальной аорты. Между тем, рядом авторов установлено не только.наличие механических натяжений в эмбриональных тканях, но и их роль в ряде важных морфогенетических процесов, том числе и у амфибий (Beloussov et al., 1973, Kucera, Konnat-Tshudi,198?, Uanderburch, Karlisch, 1989). Возникать механические натяжения могут возникать. например, в результате роста и/или формообразования в эмбриональных тканях, а также быть результатом движения клеток, как это наблюдалось In vitro (Harris et,al., 1981, 1994, Stopak, Harris, 1962).

С другой стороны, в исследованиях ангиогенеза in vitro, проводимых на культурах -эндотелиальных клеток, было обнаружено. что механическое взаимодействие эндотелиальных клеток с внеклеточным матриксом и друг с другом может играть решающую роль при образовании сети сосудоподобных трубок в культуре клеток. (Ineber. Folknan, 1989а,б). Роль механического фактора, в частности, механического растяжения субстрата, отмечалась в ряде случаев in vivo, например при наблюдении роста капилляров in vivo в прозрачных камерах (Clark, Clark, 1934). Отмечалось также, что при затягивании раны на коже кровеносные сосуды у ее края ориентируются вдоль линий натяжения в дерме (Ryan, Barnhill, 1983). В растянутом костном регенерате наблюдается интенсивное образование новых кровеносных сосудов, ориентированных вдоль направления-растяжения (Илизаров и др., 1-984).

Известно, что в сосудообразовании важную роль играют химические факторы (FolkMan, Klagsbrun, 1987). Известно также, что ряд эмбриональных тканей выделяет ангиогенЬые факторы (Risau, 1986, Risau, Ekblo«, 1986). Однако оказывается, что характер ответа, например, эндотелиальных клеток на действие ростового фактора

(ТФР) в культуре определяется условиями, в которых они находятся, в том числе механическими взаимодействиями клеток между собой и с субстратом. В частности, реакция их может меняться от роста монослоем до образования сети разветвленных трубок (Ingber.Folkaan, 1989а,б). Обнаружено также, что при трансплантациях у зародыией птиц паттерн кровеносных сосудов, независимо от способа их образования, определяется условиями в окружающих их тканях (Hoden, 1989).

ВЫВОДУ

1. Обнаружено, что волокна интерстициального внеклеточного матрикса служат каркасом при формировании просвета кровеносного сосуда.

2. В экто-мезодермальных эксплантатах эмбрионов Xenopus laevls, содержащих мезодерму из вентральной и латеральной областей возникают тонкостенные сосудоподобные полости, которые могут содержать кровяные клетки.

3. Показано, что механическое растяжение внеклеточного матрикса заполнявшей эксплантат мезенхимы приводит

(а) к образованию сосудоподобных трубок в плоскости растяжения, ориентированных, главным образом,.в направлении растяжения;

(б) к образованию мезенхимными клетками в плоскости растяжения кольцевых структур, подобных тем, что образуют ангиобласты при формировании просвета кровеносного сосуда; при этом мезенхим-ные клетки, как и ангиобласты ориентируются вдоль образующих полигональную сеть волокон мехенхимного внеклеточного матрикса.

Наблюдаемые эффекты являются результатом активной клеточной реакции, требующей определенного времени и проявляются,, главным образом, уже после снятие экспериментального воздействия.

4. Обнаружено, что многократное механическое растяжение внек-леточн матрикса в эксплантатах вызывает образование крупных тонкостенных полостей за счет объединения более мелких.

5. В формировании полостей эмбриональных кровеносных сосудов у Xenopus laevls наряду с межклеточными полостями могут участвовать и клеточные вакуоли; последние возникают в процессе переработки желточных гранул и открываются затем в межклеточное пространство..

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фесенко И.В. Формирование кровеносных сосудов у зародыявй шпорцевой лягушки Xenopus laevis. // Вестник МГУ, - 1992,- Серия 16, Биология. - Н 3, - С.18-23,

2. Фесенко И.В. Способности мезодермы нейрулы Xenopus laevis к образованию сосудоподобных структур in vitro. // Онтогенез.-1992. - Т.23. - N 1. - С. 23-29.

3. Фесенко И.В. Роль механических натяжений в образовании и ориентации сосудоподобных структур в эксплантатах эмбрионов Xenopus laevis. // Онтогенез. - В печати.

Подписано в печать 13.II.1992 г. Зак. 609. Формах 60x84/16. Тир. 100.

Москва. Типография РАСХН.