Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте"

Ha i

Васильева Ольга Валерьевна

Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ОКТ 2015

Казань-2015

005563953

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гунин Андрей Германович

Официальные оппоненты:

Анисимов Владимир Николаевич - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории канцерогенеза и старения Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова" Минздрава России.

Гумерова Аниса Азатовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры морфологии и общей патологии Федерального государственного автономного учреждения высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «18» декабря 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 б) и на сайте: www.kgmu.kcii.ru.

Автореферат разослан года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. На протяжении долгого времени исследователи занимаются изучением механизмов старения организма. Было выдвинуто множество теорий, однако ни одна из них в настоящее время не может полноценно объяснить тонкие механизмы, происходящие в организме в процессе старения (Cohen А., 2015; Libertini G. , 2015). Бесспорный интерес в рамках проблемы старения организма человека представляет возрастные изменения кожи (Zouboulis С. С. et al., 2008; Nikolakis G. et al., 2013). Кожа непосредственно испытывает на себе воздействие факторов окружающей среды - ультрафиолетового и ионизирующего излучения, воздействия высоких и низких температур, загрязнения внешней среды и т.д. (Ferguson J., 2006). Все это приводит к изменению структуры, цвета кожи, потере эластичности и растяжимости, появлению морщин (Nkengne A. et al., 2012). Несмотря на интенсивное развитие медицины, преодолеть в полной мере появление признаков старения кожи на сегодняшний день невозможно. Для решения этой непростой проблемы необходимо знать механизмы, приводящие к возрастным изменениям, которые еще недостаточно изучены. Установлено, что с возрастом в коже происходит морфофункциональная и структурная перестройка, связанная с уменьшением количества фибробластов - основных продуцентов внеклеточного матрикса дермы, изменяется их функциональная активность (Kim Е., 2013; Eklouh-Molinier С. et al., 2015). Однако варьирование численности фибробластов и их пролиферативной активности в процессе старения от феталыюго периода до старости практически не описаны. Имеющиеся в литературе сведения либо охватывают короткий промежуток времени, либо характеризуют изменения, происходящие в дерме на модели искусственного старения (Kwon Oh et al., 2008; Toyokuni S. et al., 2011; Latimer J. et al., 2015). Общеизвестно, что функционирование органов и тканей в физиологических и патологических условиях зависит от регулярной доставки к ним кислорода кровеносными сосудами. Образование кровеносных сосудов в эмбриональный период происходит за счет васкулогенеза и ангаогенеза, связанного с ремоделированием и созреванием новых сосудов (Risau W., 1997). На протяжении постнаталыюго периода онтогенеза человека также постоянно происходят процессы физиологического, патологического и репаративного ангиогенеза. Одну из главных ролей в процессе формирования новых сосудов

играют регуляторы аигиогеиеза, в частности сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), регулирующий митоз эндотелиальных клеток сосудов и проницаемость сосудистой стенки (Dvorak H., 2002); компоненты Notch-регуляторного пути - дельтаподобный лиганд 4 (D114) и Jagged-1 (Jag-1), влияющие на пролиферацию эндотелиоцитов (Li D. et al., 2014); ангиомотин, который играет ключевую роль в миграции и определении полярности клеток эндотелия (Boosani С, 2011; Moleirinho S. et al., 2014); фрагмент коллагена XVIII типа - эндостатин, ингибирующий пролиферацию эндотелиальных клеток (Dixelius J. et al., 2002; Xiao L. et al., 2015); фактор роста соединительной ткани (CTGF), регулирующий адгезию, миграцию эндотелиальных клеток (Starke R., 2013). Хорошо изучена роль этих молекул в регуляторных путях в процессе формирования новых кровеносных сосудов при опухолевом росте (Prabhakar N. et al., 2012; Guo Z. et al., 2015; Alahuhta I. et al., 2015; Mose R. et al., 2015). Однако, роль молекул, принимающих участие в формировании сосудистой системы, в возрастных изменениях кровоснабжения кожи в физиологических условиях остается неизвестной (Starke R., 2011). Еще одним малоисследованным аспектом этой проблемы является отсутствие данных о биологической взаимосвязи между состоянием сосудистой системы и фибробластами дермы (Lee J. et al, 2010; Kim J.H. et al., 2011). Кроме того, исследования, проведенные в этой области, также охватывают определенный период жизни, отсутствуют длительные наблюдения от эмбрионального этапа до глубокой старости (Lecce L. et al., 2014). Классические морфологические методы визуализации не всегда позволяют корректно оценить морфологическое и функциональное состояние различных типов клеток, что ведет к недостаточной изученности тонких механизмов функционирования. Но с внедрением иммуногистохимических методов значительно расширились возможности идентификации клеток и оценки их функционального состояния.

Таким образом, исследование возрастных аспектов сосудистого обеспечения кожи, несомненно, актуально и может оказаться полезным в выявлении новых механизмов старения, а также в разработке способов его коррекции.

Исходя из этого, целью настоящей работы явилось изучение возрастных изменений содержания и распределения регуляторов ангиогенеза в дерме человека.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание и распределение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в дерме человека в возрастном аспекте.

2. Изучить возрастные изменения в распределении дельтаподобного лиганда 4 (D114) в дерме человека.

3. Изучить содержание и распределение Jagged-1 (Jag-1) в дерме человека в онтогенезе.

4. Изучить распределение ангаомотина в дерме человека в возрастном аспекте.

5. Изучить возрастные изменения содержания эндостатина в дерме человека.

6. Исследовать возрастные изменения содержания фактора роста соединительной ткани (CTGF) в дерме человека.

Научная новизна. Впервые выявлено, что уменьшение количества фибробластов дермы как основных продуцентов внеклеточного матрикса, происходящее в процессе физиологического старения, связано с ухудшением кровоснабжения дермы. Новыми являются данные о содержании регуляторов ангиогенеза в коже человека в возрастном аспекте. Приоритетными следует признать сведения о том, что возрастное увеличение содержания VEGF в кровеносных сосудах дермы не ведет к увеличению количества сосудов дермы. В работе впервые доказано влияние компонентов Notch пути на активность ангиогенеза в дерме человека на протяжении от эмбрионального периода до старости. Новыми являются сведения о негативном влиянии уменьшения содержания D114, происходящее после 20 лет, на степень кровоснабжения дермы. Новизной обладают данные о возрастном увеличении содержания Jag-1 в сосудах дермы. Это, вероятно, является одним из механизмов ухудшения ангиогенеза дермы. Приоритетными являются данные о роли эндостатина в процессе формирования кровеносных сосудов дермы. Показано постепенное планомерное возрастное увеличение содержания эндостатина, ведущее к ухудшению ангиогенеза дермы. Новыми являются сведения о распределении ангиомотина в кровеносных сосудах дермы человека в возрастном аспекте. Впервые продемонстрировано снижение уровня ангиомотина в дермальных сосудах, что является одним из механизмов, приводящих к ухудшению ее кровоснабжения в возрастном аспекте. Новизной обладают данные о том, что с

возрастом в фибробластах и кровеносных сосудах дермы отмечается повышение содержания CTGF, что взаимосвязано с ухудшением кровоснабжения дермы.

Таким образом, впервые, используя методы иммуногистохимии, были получены новые знания о содержании регуляторов ангиогенеза в дерме в возрастном аспекте.

Научно-практическая значимость. Проведенное исследование механизмов ангиогенеза в коже человека существенно расширяет и дополняет знания о морфологических и структурных изменениях в дерме человека, происходящих в процессе физиологического старения. Впервые определены механизмы, ведущие к возрастным изменениям в ангиогенезе в коже человека. Полученные данные могут быть полезны для разработки клинических подходов в профилактике и терапии возрастных изменений кожи. Практическая значимость настоящей работы заключается в использовании полученных данных о возрастной регуляции ангиогенеза в дерме при проведении научных исследований в гистологии, патологической анатомии и геронтологии. Они дополняют существующие данные в области возрастной гистологии и могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий на медицинских и биологических факультетах вузов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Содержание в кровеносных сосудах дермы человека сосудистого эндотелиалыюго фактора роста (VEGF), Jagged-1 (Jag-1), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и эндостатина увеличивается, ангиомотана -уменьшается от 20 недель беременности до 85 лет жизни, а дельтаподобного лиганда 4 (D114) - увеличивается от 20 недель беременности до 20 лет с последующим снижением к 85 годам жизни.

2. Возрастные изменения содержания в кровеносных сосудах дермы человека регуляторов ангиогенеза (VEGF, D114, Jag-1, анпюмотин, эндостатин и CTGF) сопровождаются уменьшением численности кровеносных сосудов и фибробластов в дерме в онтогенезе.

Апробация работы. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации, представлялись на ежегодных итоговых конференциях медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова (2010-2014 гг.), международной научной конференции «Актуальные

проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения» (Чебоксары, 2012 г.), VIII международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 2013 г.), The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting «Healthy Ageing and Regenerative Medicine» (Israel, 2013 г.), научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии», посвященной 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук (Санкт-Петербург, 2014 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них две в зарубежных и четыре в отечественных ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, шесть тезисов докладов Международных и Всероссийских конференций и конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения и выводов. Объем диссертации - 153 страницы машинописного текста. Работа содержит 44 рисунка. Список цитированной литературы включает 7 отечественных и 261 зарубежный источник.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили кусочки кожи нижней части передней поверхности шеи (верхний угол стандартного разреза при аутопсии), полученные при аутопсии плодов человека, умерших от различных причин на сроке 20-40 недель беременности, и людей, умерших от различных причин в возрасте от 1 дня до 85 лет. Отобранные кусочки кожи были без видимых признаков повреждения, воспаления, наличия родимых пятен, рубцов.

Все случаи сгруппированы по возрастному принципу: группа 1 - плоды на сроке беременности 20-40 недель, группа 2 - люди в возрасте от 1 дня до 20 лет, группа 3 - люди в возрасте 21-40 лет, группа 4 - люди в возрасте 41-60 лет, группа 5 - люди в возрасте 61-85 лет.

Для определения D114 исследовали 150 кусочков кожи (72 женщины и 78 мужчин): группа 1 - 24 случая, группа 2-41 случай, группа 3-33 случая, группа 4-25 случаев, группа 5-27 случаев. Для выявления Jag-1 использовали 120 кусочков кожи (58 женщин и 62 мужчин): группа 1 - 21 случай, группа 2 -

25 случаев, группа 3-21 случай, группа 4-25 случаев, группа 5-28 случаев. Для выявления VEGF использовали 128 кусочков кожи (59 женщин и 69 мужчин): группа 1-21 случай, группа 2-31 случай, группа 3-26 случай, группа 4-24 случая, группа 5-26 случаев. Для исследования ангиомотина было использовано 115 кусочков кожи (57 женщин и 58 мужчин): группа 1 - 22 случая, группа 2-26 случаев, группа 3-19 случаев, группа 4-21 случай, группа 5-27 случаев. Для исследования экспрессии эндостатина было использовано 99 кусочков кожи (46 женщин и 53 мужчины): группа 1-17 случаев, группа 2-23 случая, группа 3-16 случаев, группа 4-20 случаев, группа 5-24 случая. Для исследования CTGF было использовано 97 кусочков кожи (47 женщин и 50 мужчин): группа 1-18 случаев, группа 2-21 случая, группа 3-17 случаев, группа 4-19 случаев, группа 5-22 случая. Для определения числа PCNA положительных клеток было изучено 139 кусочков кожи (104 мужчины и 35 женщин): группа 1 - 25 случаев, группа 2-33 случая, группа 3-40 случаев, группа 4-26 случаев, группа 5-15 случаев. Для исследования CD31-позитивных кровеносных сосудов было использовано 94 кусочка кожи (60 мужчин и 34 женщины): группа 1 - 23 случая, группа 2-14 случаев, группа 3-24 случая, группа 4-15 случаев, группа 5-18 случаев. Для подсчета числа фибробластов было исследовано 357 кусочков кожи (218 мужчин и 139 женщин): группа 1 - 57 случаев, группа 2-55 случаев, группа 3 - 99 случаев, группа 4-84 случая, группа 5-64 случая.

Методы исследования

Непрямым иммуногистохимическим методом определяли следующие антигены: D114 (АНР1274, AbDSerotec, Великобритания), Jag-1 (NBP1-90208, NovusBiologicalsInc., США), VEGF (NBP1 -22844, NovusBiologicalsInc., США), ангиомотин (ab85143, Abeam, США), эндостатин (ab53702, Abeam, США), CD31 (М 0823, DakoCytomation, Дания), CTGF (АНР 1278, AbDSerotec, Великобритания), PCNA (АНР1419, AbDSerotec, Великобритания).

После завершения основного протокола постановки иммуногистохимических реакций докрашивали срезы гематоксилином. Визуализацию фибробластов проводили в препаратах, окрашенных гематокислином и эозином, а также в срезах с иммуногистохимическими реакциями, где ядра докрашивались гематоксилином.

Количественную оценку результатов исследования осуществляли с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений, включающей в себя световой микроскоп Olympus СХ-21, цифровую камеру Olympus Camedia 4040z, персональный компьютер и программу SigmaScanPro 5.0 (SPSS Inc., США). Используя световой микроскоп, мы находили участки дермы без волосяных фолликулов, которые фотографировали при увеличении объектива 40х (Gunin А. et al, 2004). Затем полученные фотографии переносили на компьютер и оценивали интенсивность окрашивания VEGF, DU4, Jag-1, ангиомотина, эндостатина в кровеносных сосудах в 3-5 случайно выбранных полях зрения в каждом срезе. Интенсивность окраски определяли вслепую без знания исходных данных о возрасте и половой принадлежности субъекта, у которого был взят кусочек кожи для исследования. Интенсивность окрашивания квалифицировали по 4 степеням: без окрашивания, со слабым окрашиванием, со средним окрашиванием и с сильным окрашиванием (Seidal T.et al, 2001; Gunin A. et al, 2014). Затем данные по интенсивности окрашивания сопоставляли с возрастом и половой принадлежностью и рассчитывали процент случаев с каждой степенью окрашивания в каждой возрастной группе. Для определения числа кровеносных сосудов дермы с положительной окраской эндотелия на антиген CD31, количества фибробластов с положительной окраской на PCNA и общего числа фибробластов, фибробластов и сосудов с положительной окраской на CTGF вычисляли площадь сфотографированных участков и подсчитывали количество сосудов или соответствующих клеток в них (Гунин А.Г. и соавт, 2014; Gunin А. et al, 2014). Как минимум 10 случайно выбранных срезов фотографировались у каждого человека и 3-5 полей зрения были сфотографированы в каждом срезе.

Достоверность изменений интенсивности окрашивания сосудов на D114, Jag-1, VEGF, ангиомотин и эндостатин оценивали с помощью непараметрического критерия По каждой группе данных для CTGF, CD31, PCNA и фибробластов рассчитывались средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (т). Достоверность влияния возраста или пола на исследуемые параметры кожи оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Взаимосвязи между возрастом и параметрами кожи оценивались с применением непараметрического рангового корреляционного

анализа Сиирмеиа. Корреляционный анализ проводился без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В срезах кожи человека, окрашенных на УБвР, мы выявили УЕОР-позитивные сосуды по всей толщине дермы у плодов и лиц во всех возрастных периодах от 0 до 85 лет. Положительно окрашивались на УЕОР преимущественно эндотелиальные клетки. Анализ степени окрашивания сосудов проводили по всей толщине дермы во всех сосудах без разделения на типы. Результаты работы показали преобладание у плодов (группа 1) случаев с не окрашенными на УЕОР сосудами, что составило 42,86%, а случаев со слабой, средней и сильной окраской сосудов на УЕОР было соответственно 33,33%, 19,05%, 4,76%. В группе 2 (0-20 лет) отмечено превалирование объектов наблюдения со слабо окрашенными сосудами на УЕОР, что равнялось 35,48%. Случаев с не окрашенными на УЕОР сосудами в группе 2 было 29,03%, со средней степенью окрашивания - 22,58%, с сильной окраской -12,9%. В возрастном периоде от 21 до 40 лет (группа 3) количество исследованных объектов со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на УЕОР было преобладающим, что составило 34,62%. Случаев с не окрашенными на УЕОР сосудами в группе 3 было 19,23%, со слабой степенью окрашивания -30,77%, с сильной окраской -15,38%. В четвертой группе (41-60 лет) доля исследованных объектов со средней иммунореактивностью сосудов на УЕОР составила 37,5%, а случаев с не окрашенными на УЕОР сосудами было 12,5%, со слабой - 29,17%, с сильной - 20,83%. В возрастном периоде 61-85 лет (группа 5) отмечено также преобладание препаратов со средней интенсивностью окрашивания сосудов, что составило 38,46%. А доля исследованных образцов кожи с негативным окрашиванием сосудов на УЕОР составила 7,69%, со слабым - 30,77%, с сильным - 23,08%. Таким образом, с возрастом мы наблюдали планомерное уменьшение числа случаев с отсутствием окрашивания кровеносных сосудов дермы человека на УЕОР на 35,17% и увеличением доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания на 18,32% и 19,41% соответственно. Это свидетельствует об увеличении содержания УЕОР в сосудах дермы от 20 недель беременности до 85 лет (рисунок 1).

100

ыыуу

20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет беременности

■ нет окрашивания

■ среднее окрашивание

41-60 лет

61-85 лет

□ слабое окрашивание О сильное окрашивание

Рисунок 1 - Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на VEGF в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 - р <0,001; между группами 2 и 3 - р<0,01. Отличия между группами 3 и 4, группами 4 и 5 недостоверны (критерий х2)

Результаты работы демонстрируют наличие DlM-позитивных кровеносных сосудов по всей толщине дермы как плодов, так и людей во все возрастные периоды. Исследование показало преобладание случаев со слабой окраской сосудов дермы на D114 во все возрастные периоды. В группе 1 (плоды на сроке беременности 20-40 недель) она составила 75%, в группе 2 (0-20 лет) - 56,09%, в возрастном периоде 21-40 лет (группа 3) - 57,58%, в группе 4 (41-60 лет) -88%, в возрастном периоде 61-85 лет (группа 5) - 81,48%. Не окрашенные на D114 сосуды дермы присутствовали в группах 1-3, количество таких препаратов составило 16,67%, 4,88% и 3,03% соответственно. Случаи со средней иммунореактивностью сосудов преобладали в группе 2 - 29,27% и в группе 3 -36,36%. Объекты исследования с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы составили в группе 2 - 9,76%, в группе 3 - 3,03%, в группе 4 -4%, в группе 5 - 3,71%. Результаты исследования продемонстрировали, что содержание D114 в кровеносных сосудах дермы увеличивается от 20-40 недель беременности до 20 лет, что проявляется возрастанием числа объектов наблюдения со средней и сильной степенью окрашивания на D114 на 20,94% и 9,76% соответственно. С дальнейшим увеличением возраста интенсивность

окрашивания кровеносных сосудов на D114 снижается, о чем свидетельствует снижение доли исследованных случаев со средней и сильной степенью окрашивания на D114 на 14,46% и 6,05% соответственно (рисунок 2).

ю -

20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет

а нет окрашивания о слабое окрашивание

■ среднее окрашивание □ сильное окрашивание

Рисунок 2 - Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на DI14 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 - р <0,01; между группами 2 и 3 - р<0,01; между группами 3 и 4 - р<0,01 (критерий Отличия между группами 4 и 5 статистически недостоверны (критерий %2)

В срезах кожи человека, окрашенных на Jag-1, нами были выявлены Jag-1 позитивные кровеносные сосуды во всей толщине дермы как плодов, так и людей всех исследованных групп. Мы установили, что в разных возрастных группах количество случаев с разной степенью окрашивания сосудов на Jag-1 было неодинаковым. У плодов (группа 1) преобладали объекты с неокрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами, что составило 65,6%. В группе 2 (0-20 лет) превалировали препараты со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы на Jag-1, что равнялось 54,2%. Однако в группе 2 отмечается увеличение доли исследованных образцов со средней иммунореактивностью сосудов дермы к Jag-1 (25,8%). В третьей группе (21-40 лет) сохраняется тенденция к увеличению доли случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на Jag-1, что составило 49,8%. В группе 4 (41-60 лет) превалировали препараты со средней степенью окрашивания сосудов, а группе 5 (61-85 лет) - срезы кожи с сильной

иммунореактивностью сосудов к что составило 62,2% и 68%

соответственно. В исследовании мы наблюдали возрастное увеличение процента исследованных образцов кожи, в которых сосуды дермы имели большую иммунореактивность к ^-1. Доля исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на 1а§-1 увеличивается от 20 недель беременности до 85 лет на 21,43% и 64,29% соответственно. Это свидетельствует об увеличении содержания ^-1 в сосудах дермы от 20 недель беременности до 85 лет (рисунок 3).

юо

90 80 ш 70

I 60

Х- 50 за

1 40 а.

я зо 20 10 О

Рисунок 3 - Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на ^-1 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 - р<0,01; между группами 2 и 3 -р<0,01; между группами 3 и 4 - р<0,01; между группами 4 и 5 - р<0,05 (критерий х )

В коже человека позитивное окрашивание на ангиомотин имели клетки эпидермиса, фибробласты дермы, гландулоциты потовых желез и базальные клетки сальных желез. Соединительнотканные волокна дермы были иммунонегативны. Кровеносные сосуды с положительной окраской на ангиомотин встречались в коже человека во всех возрастных периодах. Ангиомотин-позитивные структуры в составе оболочки сосудов дермы были представлены преимущественно эндотелиоцитами. Исследование показало превалирование препаратов со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин (группа 1 - 40,9%, группа 2 - 42,3%, группа 3 - 57,8%, группа 4 - 47,61%). В группе 5 (61-85 лет) наблюдалось снижение иммунореактивности

20-40 недель 0-20 лет 21-40лет А1-БО лет

к® нет окрашивания ™ слабое окрашивание

ЕЭ среднее окрашивание ш сильное окрашивание

кровеносных сосудов дермы на ангиомотин. В этой группе мы выявили 11,11% случаев со слабой интенсивностью окрашивания на ангиомотин (рисунок 4).

20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет

□ нет окрашивания и слабое окрашивание

□ среднее окрашивание ■ сильное окрашивание

Рисунок 4 - Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на ангиомотин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 2 и 3 - р<0,01; между группами 4 и 5 -р<0,001 (критерий х2)- Отличия между группами 1 и 2, группами 3 и 4 статистически недостоверны (критерий %2)

Таким образом, содержание ангиомотина в кровеносных микрососудах дермы человека снижается от 20 недель беременности до 85 лет жизни, что подтверждается уменьшением доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на ангиомотин от 20 недель беременности до 85 лет на 11,29% и 16,16% соответственно.

Наше исследование показало наличие в дерме человека эндостатин-позитивных структур, которые были представлены кератиноцитами эпидермиса, фибробластами, гландулоцитами потовых желез и базальными клетками сальных желез. Кровеносные сосуды с положительной окраской на эндостатин выявлялись в коже человека во всех возрастных группах и имели характерное специфическое коричневое окрашивание преимущественно в эндотелиальных клетках. Мы наблюдали, что у плодов (группа 1) препараты со слабым окрашиванием кровеносных сосудов на эндостатин составили 41,18%. В группе 2 (0-20 лет) и группе 3 (21-40 лет) преобладали образцы кожи, в которых кровеносные сосуды дермы имели слабое окрашивание на эндостатин,

что составило 43,48% и 66,67% соответственно. В группе 4 (41-60 лет) и группе 5 (61-85 лет) отмечается увеличение доли исследованных случаев со средней иммунореактивностью сосудов на эндостатин до 50% и 37,5% соответственно. Таким образом, интенсивность окрашивания сосудов дермы на эндостатин увеличивалась с возрастом, о чем свидетельствует увеличение доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на эндостатин от 20 недель беременности до 85 лет на 25,73% и 21,57% соответственно (рисунок 5).

20-40 недель 0-20 лет 21-40 л«т 41-й» лет

га нет окрашивания ез слабое окрашивание

т среднее окрашивание и сильное окрашивание

Рисунок 5 - Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на эндостатин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Отличия между группами 1 и 2 статистически недостоверны (критерий х )• Достоверность отличий между группами 2 и 3 - р<0,001; между группами 3 и 4 - р<0,001; между группами 4 и 5 - р<0,01 (критерий х2)

Результаты работы демонстрируют увеличение процента кровеносных сосудов дермы с положительной окраской на СТвБ в период от 20 недель беременности до 85 лет на 16,39%. У плодов на сроке беременности 20-40 недель (группа 1) 74,73±2,11% (М±т) кровеносных сосудов дермы имели позитивное окрашивание на СГОР, а в пятой группе (61-85 лет) - 91,13±1,67%. В составе оболочки сосудов дермы положительное окрашивание на СТвБ имели преимущественно эндотелиальные клетки. Обращает на себя внимание, что плотность распределения сосудов дермы меняется от антенатального периода до 85 лет. Так, у плодов (группа 1) кровеносные сосуды, позитивные к СТСР, распределены равномерно по всей толщине дермы, в то время как в

коже пожилых людей в возрасте от 61 до 85 лет СТСР-положительные кровеносные сосуды локализуются преимущественно под эпидермисом небольшими группами. Корреляционный анализ установил наличие положительной достоверной взаимосвязи между возрастом и процентом позитивных к СТОГ кровеносных сосудов дермы (1=0,39; р<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил достоверное влияние (р<0,001) возраста на изменение процента кровеносных сосудов дермы, положительно окрашенных на СТСР (рисунок 6).

100

•л

£ 60 -

Q =

V П

® 40 -

х

н

% 20 -

20-40 недель 0-20лет 21-4Пл«т 4160 лет (>|-85лет

Рисунок 6 - Процент кровеносных сосудов дермы, содержащих клетки с положительным окрашиванием на CTGF (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ

Исследование параметров кровоснабжения кожи в онтогенезе с помощью маркера межклеточных контактов CD31 показало возраст-зависимое уменьшение численности кровеносных сосудов дермы. Максимальное количество сосудов в дерме на единицу площади мы определили в антенатальном периоде - 162,93±7,84 (М±ш) на 1 мм2, минимальное - в возрасте 85 лет - 75,68±5,32 на 1 мм2. Корреляционный анализ между изменениями возраста и числа кровеносных сосудов в дерме показал наличие отрицательной достоверной взаимосвязи (г=-0,68; р<0,01). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменения численности CD31 положительных кровеносных сосудов в дерме (рисунок 7). Возможно ухудшение кровоснабжения кожи, происходящее с возрастом, ведет к дисфункции фибробластов.

Наше исследование показало, что в дерме человека от 20 недель беременности до 85 лет наблюдается увеличение процента фибробластов, имеющих положительную окраску на CTGF, на 17,43%. В группе 1 (20-40 недель беременности) 73,94±4,95% (М±ш) фибробластов дермы имели положительную окраску на CTGF, а в группе 5 (61-85 лет) процент CTGF-положительных фибробластов составил 91,37±1,62% (рисунок 8).

200

Л

та 180

8 I 160

9 В-£ (4 140

ей « | 1120 -1 i 100 -

1 % 80

S I 60

У 40 Da

§ 20 Ы

О

20-40 недель 0-20 лет 21-40лет 41-60лет Ы-8Ь лет

беременности

Рисунок 7 - Численность CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ

-I:

I-

20-40 недель 0-20лет 21-40лет 41-60лет 61-аь лет

Рисунок 8 - Процент фибробластов дермы с положительным окрашиванием на CTGF (M±m). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ

Корреляционный анализ между изменениями общего числа фибробластов и фибробластов с положительной окраской на CTGF показал наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (г=-0.45; р<0,05). Корреляционный

анализ показал наличие положительной достоверной взаимосвязи между возрастом и процентом иммуно-позитивных к СТСР фибробластов (г=0,39; р<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния (р<0,001) возраста на изменение процента фибробластов, положительно окрашенных на СТСР в дерме.

Результаты исследования демонстрируют, что с возрастом происходит прогрессивное снижение численности фибробластов дермы. Нами было установлено, что уменьшение численности фибробластов дермы в зависимости от возраста носит нелинейный характер. Так, имеются критические возрастные периоды - 30-40 недель беременности и возраст между 11-ю и 20-ю годами, в которых мы отметили значительное снижение численности фибробластов дермы (рисунок 9).

8000 8 I 7000

£ з

6000 -

ё 2

г г 5ооо -« ~

8 % 4000 -

и Z 3000 S я

а £ 2000 -

в -

§ iL 1000 -

М 37

4 о

¡¡¡и

Iii

20-40 недель

0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85лет

Рисунок 9 - Численность фибробластов в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ

Исследование пролиферативной активности фибробластов дермы показало прогрессивное снижение РСЫА-положительных фибробластов по отношению к общему числу фибробластов в возрасте от 20 недель беременности до 85 лет (рисунок 10).

Корреляционный анализ между изменениями возраста и количества РСИА-положительных клеток в дерме человека показал наличие высокой отрицательной достоверной взаимосвязи (г=-0,54; р<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменения численности РСЫА-положительных фибробластов в дерме

(р<0,001). Мы также проводили корреляционный анализ между изменениями числа РСЫА-положительных фибробластов и числа СТСБ-положительных фибробластов. Он показал наличие достоверной высокой отрицательной взаимосвязи (г=-0,47; р<0,05).

+

50 -|

а

É

i 40 -

ей в

Ъ в

В « 30 -

z; о л.

s 'I й 20 -i

20-40 педель 0-20 лет

Рисунок 10 - Процентное соотношение PCNA-положительных фибробластов к общему числу фибробластов в дерме людей различного возраста (М±ш). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ

В исследовании использовали кусочки кожи плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Был проведен анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение интенсивности окрашивания на VEGF, D114, Jag-1, анпюмотин, эндостатин, количества CD31 -позитивных сосудов дермы, процента фибробластов и сосудов дермы с позитивным окрашиванием на CTGF, процента фибробластов с положительной окраской на PCNA в дерме.

Таким образом, в работе охарактеризован комплекс возрастных изменений содержания ангиогенных факторов в коже человека. Увеличение содержания и распределения D114 в возрасте от 0 до 20 лет, вероятно, способно индуцировать ингибирование ангиогенеза, происходящее с возрастом за счет уменьшения чувствительности эндотелиальных клеток к VEGF (Leslie J. et al., 2007; Camelo S. et al., 2012). Также следует отметить, что высокий уровень D114 и Jag-1 замедляет пролиферацию эндотелиальных клеток (Liebler S. et al., 2012).

Этот факт объясняет снижение числа кровеносных сосудов дермы, которое, вероятно, связано с увеличением содержания Jag-1. Показанное в данной работе увеличение уровня VEGF в кровеносных сосудах дермы, происходящее в течение жизни, можно рассматривать в качестве компенсаторной реакции в ответ на снижение численности рецепторов для получения возможности реализации собственных эффектов (Thomas J. et al, 2013; Pedrosa A. et al, 2015; Zarkada G et al, 2015). Результаты нашей работы демонстрируют уменьшение содержания аншомотина в кровеносных сосудах. Учитывая тот факт, что данный протеин оказывает стимулирующее влияние на процессы миграции и пролиферации эндотелиоцитов (Mercenne G. et al, 2015; Chen L. et al, 2015), снижение его содержания, вероятно, также вносит вклад в возраст-зависимое уменьшение численности кровеносных сосудов дермы. Интересным является факт, что высокий уровень D114 блокирует активацию киназы Yap сигнального пути Hippo, являющейся кофактором ангиомотина (Tschaharganeh D. et al, 2003). Вероятно, именно подобное перекрестное взаимодействие двух консервативных сигнальных путей лежит в основе снижения активности ангиогенеза в возрастном аспекте. Следует отметить, что высокий уровень эндостатина в кровеносных сосудах дермы, как одного из ключевых ингибиторов ангиогенеза, также блокирует стимулирующее влияние VEGF на процесс ангиогенеза. Негативное влияние CTGF на рост и регенерацию кровеносных сосудов в дерме, происходящее с возрастом, имеет тканевую специфичность (Chen С. et al, 2009). Ингибирование пролиферации фибробластов и ангиогенеза, вероятно, связано с активацией апоптоза, синтеза протеинов, замедляющих прохождение клеток по клеточному циклу (Chen S. et al, 2007). Также способность CTGF связываться с VEGF, вероятно, является одним из механизмов, приводящих к снижению проангиогенного эффекта VEGF (Inoki I. et al, 2002).

Таким образом, работа в целом показала, что изменения содержания ангиогенных факторов, происходящие с возрастом, сопровождаются ухудшением кровоснабжения дермы и снижением общей численности фибробластов и их пролиферативной активности.

ВЫВОДЫ

1. Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в кровеносных сосудах дермы человека увеличивается от 20-ти недель беременности до 85-ти лет, что подтверждается планомерным возрастным уменьшением числа случаев с отсутствием окрашивания кровеносных сосудов на VEGF на 35,17% и увеличением доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания на 18,32% и 19,41% соответственно.

2. Содержание дельтаподобного лиганда 4 (D114) в кровеносных микрососудах дермы человека увеличивается от 20-ти недель беременности до 20-ти лет (число объектов наблюдения со средней и сильной степенью окрашивания кровеносных сосудов на D114 на 20,94% и 9,76% соответственно), а затем неуклонно снижается к 85-ти годам жизни (число случаев со средней и сильной степенью окрашивания кровеносных сосудов на D114 на 14,46% и 6,05% соответственно).

3. Экспрессия Jagged-1 (Jag-1) в кровеносных сосудах дермы человека существенно возрастает от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни, что подтверждается увеличением доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на Jag-1 на 21,43% и 64,29% соответственно.

4. Содержание ангаомотина в кровеносных микрососудах дермы человека снижается от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни, о чем свидетельствует уменьшение доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на ангиомотин на 11,29% и 16,16% соответственно.

5. Содержание эндостатина в кровеносных микрососудах дермы человека увеличивается от антенатального периода до 85-ти лет (число случаев с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на эндостатин возрастает на 25,73% и 21,57% соответственно).

6. Количество фибробластов и кровеносных сосудов с положительной окраской на фактор роста соединительной ткани (CTGF) в дерме человека планомерно возрастает от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни на 16,39% и 17,43% соответственно. Возрастное увеличение содержания GTGF в кровеносных сосудах и фибробластах дермы имеет отрицательную

корреляционную взаимосвязь с возрастным уменьшением численности кровеносных сосудов и фибробластов в дерме человека.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные знания об ухудшении ангиогенеза в дерме человека необходимо учитывать в клинических подходах к профилактике и терапии возрастных изменений кожи.

2. Использовать полученные результаты настоящей работы о возрастных изменениях экспрессии регуляторов ангиогенеза - VEGF, D114, Jag-1, ангиомотин, эвдостатин, CTGF - при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии медицинских и биологических факультетах вузов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильева О.В. Пролиферация фибробластов кожи в процессе физиологического старения / О.В. Васильева, В.В. Петров, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Клиническая и экспериментальная медицина. Сборник научных трудов. - Чебоксары, 2010. - С. 30-31.

2. Gunin A.G. Age-related changes in proliferation, the numbers of mast cells, eosinophils, and cd45-positive cells in human dermis / A.G. Gunin, N.K.' Kornilova, O.V. Vasilieva, V.V. Petrov // J Gerontol A Biol Sei Med Sei -2011. - Vol. 66A, № 4. - P. 385-392.

3. Петров B.B. Тучные клетки, эозинофилы, С045-положительные клетки в коже человека при физиологическом старении / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Морфология в теории и практике: сб.' материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д.С.Гордон). -Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2012. - С. 248-250.

4. Петров В.В. Влияние тучных клеток в дерме на процесс старения кожи человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, А.Г. Гунин // Актуальные проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения. Материалы международной научной конференции -Чебоксары, 2012. - С.205-208.

5. Петров В.В. Возрастные изменения содержания CD45+ клеток в дерме человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Успехи геронтологии. - 2012. - Т. 25, № 43. - С. 598-603.

6. Петров В.В. Возрастные изменения числа тучных клеток и эозинофилов в коже человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Онтогенез. - 2013. - Т. 44, № 3. - С. 179-185.

7. Vasilieva O.V. Age-related changes in the number of vessels positively stained with CD31 and vWF antigens in human dermis / O.V. Vasilieva, V.V. Petrov,

N.N. Golubtzova, A.G. Gunin // The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting, Beer Sheva - Dead Sea, Israel, 2013.-P. 89.

8. Петров B.B. Степень активности трансмембранного лиганда DLL4 и его взаимодействие с фибробластами в коже человека в процессе старения / В.В. Петров, О.В. Васильева, H.H. Голубцова, А.Г. Гунин // "Научная дискуссия: инновации в современном мире": материалы VIII международной заочной научно-практической конференции. Часть II. (15 января 2013 г.). Москва: Изд. «Международный центр науки и образования», 2013. - С. 182-185.

9. Голубцова H.H. Возрастные изменения факторов ангиогенеза и пролиферации в коже человека / H.H. Голубцова, В.В. Петров, О.В. Васильева, А.Г. Гунин // Материалы научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» посвященный 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук, 5-9 июня, г. Санкт-Петербург, Успехи геронтологии, 2014. -Т. 27, № 2. - С. 30.

10. Гунин А.Г. Возрастные изменения численности и пролиферации фибробластов в коже человека / А.Г. Гунин, Н.К. Корнилова, В.В. Петров, О.В. Васильева // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1. - С. 43-47.

11. Гунин А.Г. Кровеносные сосуды в дерме человека в процессе старения / А.Г. Гунин, В.В. Петров, О.В. Васильева, H.H. Голубцова II Успехи геронтологии. - 2014. - Т. 27, № 1. - С. 54-61.

12. Gunin A.G. Age-related changes in angiogenesis in human dermis / A.G. Gunin, V.V. Petrov, N.N. Golubtzova, O.V. Vasilieva, N.K. Kornilova // Experimental Gerontology. - 2014. - Vol. 55. - P. 143-151.

13. Васильева О.В. Исследование клеточного состава дермы человека в онтогенезе / О.В. Васильева, В.В. Петров, H.H. Голубцова, А.Г. Гунин // Морфологические науки и клиническая медицина: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения доцента Бриллиантовой Анны Николаевны. - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2015. - С. 41-44.

14. Голубцова H.H. Морфологическое обоснование возрастных изменений кожи человека / H.H. Голубцова, О.В. Васильева, В.В. Петров, Ф.Н. Филиппов, А.Г. Гунин // Морфологические науки и клиническая медицина: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения доцента Бриллиантовой Анны Николаевны. - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2015.-С. 56-59.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CTGP - фактор роста соединительной ткани (connective tissue growth factor) D114 - дельтаподобный лиганд 4 (delta like ligand 4)

Jag-1 - Jagged-1

■I? 10

i

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen)

TBS - трис-буферный раствор (tris buffered saline)

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor)

Подписано в печать 12.10.2015 г. Формат 60*84 1/16. Печ. л. 1,25. Бумага офсетная. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Заказ № 1034 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. H.H. Ульянова» 428015, г. Чебоксары, пр. Московский, д. 15