Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров

Юдина, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров"

На правах рукописи

ЮДИНА Анна Юрьевна

МЕТОДЫ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ В ИЗУЧЕНИИ АНГИОГЕНЕЗА И ЕГО МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

Специальности 03.00.02 - Биофизика, 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена в Центре магнитной томографии и спектроскопии МГУ

им. MB Ломоносова, в Гарвардской медицинской школе и Massachusetts General

Hospital (США), а также на кафедре биофизики физического факультета.

Научные руководители д.ф-м.н, проф. Ю. А. Пирогов,

ЦМТС МГУ им. МВ Ломоносова д.ф-м.н, проф. В. А. Твердислов, физический ф-т МГУ

Научный консультант к.х.н., проф., А. А. Богданов мл.,

Гарвардская Медицинская Школа

Официальные оппоненты:

д .ф-м.н, член-корр. РАН. Г. В. Гурский, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН,

г. Москва

д .ф-м.н, проф. Г. Е. Добрецов, Институт физико-химической медицины, г. Москва

Ведущая организация Институт химической физики РАН им. Н. Н. Семенова

Защита состоится «_6_» _апреля_2006 г. в П~0О ч. на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет, аудитория ^ .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. Ломоносова

Автореферат разослан «__3_» (ЛСьрТХк/ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08

к.ф-м.н Хомутов Г.Б.

/¿¿¿>6А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ангиогенез - это процесс формирования сосудистой сети на базе существовавших ранее сосудов. Нерегулируемый интенсивный ангиогенез характерен для патологических процессов: псориаза, диабетической ретинопатии, раковых заболеваний. Поэтому изучение ангиогенеза и механизмов его регуляции имеет большое значение. Основные положения теории взаимосвязи ангиогенеза и онкогенеза заключаются в следующем: (1) большинство первичных солидных опухолей проходит через стадию небольшой аваскулярной массы (размерами 1-2 мм в диаметре), могущей длительное время находиться в неактивном, «спящем» состоянии. При этом кислород и питательные вещества доставляются в процессе пассивной диффузии; (и) эти микрообразования каким-то образом могут «включить» ангиогенез, заставляя окружающие сосуды выпускать «ростки» в сторону опухоли, которые впоследствии интегрируются в опухолевую массу. Этим самым новообразование получает возможность роста и метастазирования (через кровоток); (ш) ангиогенный «переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов роста; (IV) рост опухоли можно остановить путем блокирования ангиогенеза, либо через «переключатель» либо напрямую разрушая эндотелиальные клетки новых сосудов. Последний подход предполагает, что новообразованные сосуды по своей структуре и клеточному составу отличаются от зрелых «обычных» сосудов. В настоящее время известны многие про- и анти-ангиогенные факторы, ключевые биохимические реакции и пути трансдукции. Однако механизмы взаимодействия между ними, роль отдельных белков и способы регуляции «ангиогенного переключателя» остаются малоизученными.

Одним из ключевых факторов ангиогенеза является сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБвР) и его рецептор 2 типа (\TEGFR2, Р1к-1/ЮЖ). Среди про-ангиогенных факторов можно также назвать фактор некроза опухоли (ЮТ-а), эпителиальный фактор роста (ЕвР) и его рецептор (БвРЯ), фактор роста фибробластов (РвР), ангиопоэтин-2. Аномально активные ЕвР рецепторы, характерные для ряда раковых клеток, посылают постоянный митогенетический (возникающий при клеточном делении) сигнал и повышают экспрессию УЕОБ. Поскольку ангиогенез зависит от сложного каскада реакций с участием этих факторов, их изучение представляет большой интерес. Известно, что подавлении опосредованной УЕОРЯ-2 передачи сигнала ведет к

мощному анти-ангиогенному эффекту, который может быть использован при патологическом ангиогенезе (в частности, в случае раковых новообразований). В идеале, дозируя препарат, можно добиться либо «нормализации сосудистой сети» (что улучшит доставку лекарств к опухоли) либо ее регрессии (что приведет к уменьшению опухоли и ее возращеню в латентное состояние). Действительно, первый анти-VEGF препарат (bevacuzimab, Genentech, Inc., San Francisco, CA) уже одобрен для лечения метастатического рака кишечника совместно с химиотерапией, еще десятки находятся на различных стадиях клинических испытаний.

В свзязи с этим возникает потребность в определении надежных биомаркеров раннего ответа не анти-ангиогенную терапию, по которым можно будет предсказать последующий клинический эффект. Такие биомаркеры будут полезны не только для облегчения клинических исследований новых препаратов, но и для определения индивидуальной схемы лечения для каждого пациента. Несмотря на то, что клинический ответ на терапию ингибиторами ангиогенеза является медленным, некоторые метаболические и физиологические изменения можно зафиксировать уже вскоре после начала лечения. Поскольку терапия ингибиторами ангиогенеза направлена на аномальные опухолевые сосуды, то естественно предположить на роль маркеров такие гемодинамические параметры, как объем крови в опухоли, поток крови через опухоль, проницаемость опухолевых сосудов и их плотность. Еще одним подходом является дизайн контрастных агентов, взаимодействующих с упомянутыми выше молекулярными маркерами ангиогенеза, которые представляют собой диагностическую и прогностическую ценность.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) является незаменимым инструментом при изучении ангиогенеза in vivo, поскольку а) это неинвазивная методика б) она позволяет делать множество повторных снимков с хорошим анатомическим разрешением в) не сопровождается ионизирующим излучением г) позволяет измерять ряд гемодинамических параметров, изменение которых предшествует регрессии опухоли. Современные достижения в молекулярной МРТ также позволяют неинвазивно исследовать молекулярные мишени, однако возможности визуализации молекулярных биомаркеров рака пока являются ограниченными.

Цель данной работы заключается в изучении методами МРТ биомаркеров ангиогенеза и раннего ответа на анти-аигиогенную терапию в карциномах человека на животных моделях.

Для достижения этой цели поставлено ряд задач.

1. Разработать животную модель (ксенографты человеческой карциномы ободочной кишки) и чувствительный протокол для MP-экспериментов по изменению гемодинамических параметров в ответ на терапию ингибитором тирозин-киназной активности VEGFR-2.

2. Определить содержание эритроцитов для нахождения поправки по распределению контрастного МР-агента.

3. Иммуногистохимическими методами показать соотвествие данных МРТ сопровождающим анти-ангиогенную терапию и ангиогенез изменениям.

4. Оптимизировать методику синтеза и очистки конъюгатов ферментов (глюкозоксидазы и пероксидазы хрена) и антитела (анти-EGFR или анти-Ь6) с целью их дальнейшего использования в экспериментах по визуализации соответствующих молекулярных мишеней.

5. Применить метод магнитно-резонансной амплификации для визуализации EGF-рецептора, который регулирует активность VEGFR и L6 - маркера карциномы кишечника.

Защищаемые положения

1) Благодаря магнитному полю семи неспаренных электронов парамагнитный внутрисосудистый контрастный Т1-агент PGC-Gd активно изменяет релаксационные свойства окружающих протонов. Он укорачивает время спин-решеточной релаксации (Т1) накапливающих его областей, благодаря чему при использовании Т1-взвешенной последовательности их изображение становится ярче. По причине большого гидродинамического диаметра концентрация PGC-Gd в сосудистом русле остается постоянной на все время MP-исследования, что позволяет рассчитать объем крови в опухоли по изменению интенсивности МР-сигнала.

2) Рассчитанные по изменению интенсивности MP-сигнала после внутривенного

введения PGC-Gd гемодинамические параметры (абсолютный объем крови в

опухоли) позволяют неивазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии.

3) В присутствии перекиси водорода и фермента-оксиредукгазы (например, пероксидазы хрена) парамагнитный субстрат Gd-DTPA-diSer олигомеризуется с образованием продуктов, укорачивающих Т1 накапливающих их областей в большей степени, нежели мономер (эффект магнитно-резонансной амплификации).

4) Система конъюгатов пероксидаза хрена-антитело и глюкозоксидаза-антитело обеспечивает селективный эффект магнитно-резонансной амплификации путем доставки оксиредуктазы и генерирования Н202 in situ. Предварительная инъекция системы биоконъюгатов обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности МР-сигнала в присутствии маркеров-мишеней in vitro и in vivo.

Новизна работы

На примере экпериментального тирозин-киназного ингибитора VEGF-рецептора второго типа показано, что разработанный МРТ-метод может применяться для оценки ранних анти-ангиогенных эффектов в ксенографтах аденокарциномы кишечника человека.

Впервые осуществлена эктопическая животная модель аденокарциномы кишечника человека.

Оптимизирована схема метода визуализации молекулярных маркеров, основанная на селективном связывании системы антитело-фермент, вызывающей олигомеризацию парамагнитного субстрата.

Впервые показана эффективность in vitro и in vivo визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза (EGFR, L6) методом магнитно-резонансной амплификации.

Практическая ценность работы

Представленные в диссертационной работе методы МРТ позволяют достоверно оценивать как гемодинамические, так и молекулярные маркеры анти-ангиогенеза в опухоли.

Так, примененный MP-подход позволяет неинвазивно оценивать ранние эффекты

анти-ангиогенной терапии (изменение объема крови), предшествующие

морфологическим изменениям (регрессу опухоли). При внедрении в клинику данная схема позволит проводить мониторинг анти-ангиогенного лечения и корректировать терапевтическую схему, исходя из ответа конкретного пациента.

Разработанная в диссертации ортотопическая животная модель аденокарциномы ободочной кишки человека может использоваться для дальнейшего изучения этого заболевания и пре-клинических испытаний направленных против него препаратов.

Осуществленный подход к МРТ-визуализации молекулярных мишеней (магнитно-резонансная амплификация) имеет перспективы в диагностике и мониторинге лечения различных заболеваний. В частности, применение указанного метода может использоваться для типирования и «молекулярного окрашивания» раковых новообразований in vivo, для проведения испытаний новых анти-ангиогенных препаратов и определения их оптимальных доз.

Исследование ангионеза и антн-ангиогенеза, проведенное в данной работе, имеет большое значение для понимания причин, ведущих к активации этих процессов. Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на 11 научных конференциях, в том числе на 5й ежегодной конференции Society for Molecular Imaging (SMI-2005, Кельн), на 2й международной летней школе по медицинской физике («Методы ядерной физики и ускорители в биологии и медицине», Познань, 2003), 8й, 9й и 1 Ой Всероссийских конференциях студентов-физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 2002; Красноярск, 2003; Москва, 2004), а также на международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2002-2003 гг.). Принят тезис на 14ю международную конференцию International Society for Magnetic Resonance in Medicine (ISMRM-14, Сиэтгл, 2006). Был сделан доклад на семинаре ЦМТС МГУ «Магнитный резонанс в биологии, химии и медицине». Публикации

По материалам диссертационной работы было опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи и 2 препринта. Структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы с постановкой задачи, описания методик теоретических расчетов и экспериментов, описания результатов, их обсуждения

и выводов, а также списка цитируемой литературы. Диссертация включает 111 страниц текста, 37 рисунков и 11 таблиц. Список литературы содержит 120 наименований. Общее примечание

Особая благодарность выражается профессору Ю.А. Пирогову (директору ЦМТС МГУ им. М.В.Ломоносова), под чьим руководством автор осваивала теорию и методики исследований в области магнитно-резонансной томографии. Автор выражает признательность за все рекомендации и указания, а также поддержку во время выполнения части экспериментов в руководимом им центре. Следует также поблагодарить А.В.Петряйкина и Д.А. Куприянова за комментарии и советы по поводу постановки экспериментов по релаксометрии и фантомным исследованиям. Автор выражает признательность профессору В.А. Твердислову (заведущему каф. биофизики, физический факультет МГУ) за общее руководство работой и ценные замечания. Научная идея использования эффекта магнитно-резонансной амплификации для визуализации молекулярных маркеров-мишеней принадлежит A.A. Богданову мл. Часть данной работы была выполнена под его руководством в Центре по исследованиям в области молекулярной томографии (CMIR) Гарвардской Медицинской Школы (Бостон, США) и в Университете Массачусетса (Вустер, США) во время годичной стажировки автора. Автор выражает личную признательность А. А. Богданову за ценные практические указания при изучении молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза и полезные критические замечания по работе. Ощутимую помощь при выполнении данной работы оказали также др. М. Керол (синтез парамагнитных субстратов), Ж-Л. Фигуэрейдо (имплантация клеток в стенку ободочной кишки) и др. Й. Ким (метод измерения объема крови в опухоли, анализ данных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации и сформулирована цель

работы. Глава I представляет собой литературный обзор. В разделе 1.1 патологический

нерегулируемый ангиогенез рассматривается как необходимое условие роста опухоли.

Рассмотрены механизмы ангиогенеза, а также отличия опухолевой сосудистой сети от

нормальной. Раздел 1.2 посвящен биохимии ангиогенеза. Так называемый «ангиогенный

переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов

роста. Ключевыми факторами ангиогенеза является сосудистый эндотелиальный фактор

роста (VEGF) и его рецепторы. Подробно рассмотрено семейство этих белков, регуляция их экспрессии и биологическое действие. Описаны также и другие про-ангиогенные факторы, в частности, эпительальный фактор роста и его рецепторы, ангиопоэтин-2, фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста и другие. В разделе 1.3 рассматривается анти-ангиогенез и анти-ангиогенная терапия, которая является эффективной стратегией, направленной на селективный коллапс опухолевых неопластических сосудов, что потенциально ведет к регрессу самой опухоли. Описаны как эндогенные, так и синтетические ингибиторы ангиогенеза, приведен список лекарственных препаратов, проходящих в настоящее время клинические испытания. Обозначены гемодинамические и молекулярные маркеры анти-ангиогенеза, которые могут быть исследованы методами МРТ с целью оценки эффективности анти-ангиогенной терапии и составления индивидуального профиля опухоли.

Глава П посвящена описанию методик теоретических расчетов и экспериментов.

В разделе П.1 описаны клеточные культуры, а в разделе II.2 - флуоресцентные пробы,

которые использовались в данной работе. В разделе П.З рассмотрены контрастные МР-

агенты, которые использовались для изучения гемодинамических (Gd-PGC) и

молекулярных (Gd-DTPA-diSer) маркеров анти-ангиогенеза, а также использовавшийся в

качестве контроля Gd-DTPA («Магневист»), Раздел П.4 посвящен описанию одной из

методик, которая широко использовалась в данной работе - релаксометрии (измерению

времен релаксации тканей Т1 и Т2), а также применяющихся при этом РЧ-

последовательностей. В разделе П.5 рассматривается Т1 -метод оценки

гемодинамических параметров и последовательность SPGR. Также описываются

животные модели, на которых проводились MP-эксперименты. Атимусным мышам были

имплантированы клетки MV522 человеческой карциномы ободочной кишки

эктопически и ортотопически; животным была проведено МРТ-исследование после 1-

дневного или 7-дневного курса терапии ингибитором тирозин-киназной активности

VEGFR. Описывается радиоизотопное исследование по определению фракции

эритроцитов для коррекции значений абсолютного объема крови, а также

гистологические методы для подтверждения соответствия данных МРТ происходящим в

тканях процессам. В разделе П.6 рассматривается стратегия магнитно-резонансной

амплификации, основанная на селективной олигомеризации парамагнитного субстрата

Gd-DTPA-diSer в присутствии системы конъюгатов фермент-антитело к нужном маркеру

(EGFR - маркер ангио- и онкогенеза и L6 - маркер карциномы). Приведены протоколы синтеза и очистки биоконъюгатов необходимых для селективной визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза, а также протоколы их in vitro и in vivo испытаний.

В главе Ш представлены результаты работы. В разделе ГО.1 исследуется объем опухолей и соответствующий сосудистый объем в экспериментальной и контрольной группах.

1 день 7 дней

Рис. I. Объем опухоли и объем крови в опухоли как факторы прогноза эффективности анти-ангиогенной терапии. Как видно из Рисунка 1А, между объемом опухоли после 2 доз препарата АйО 13925 и плацебо нет статистически достоверной разницы (она появляется только после недели лечения). В то же время отличие в объеме крови опухоли велико уже после 2 доз препарата (Рис. 1В) и усиливается после 7 дней анти-ангиогенной терапии.

Наблюдения за объемом опухоли велись традиционным методом (при помощи мерного циркуля) и МРТ. Измерения мерным циркулем не показали уменьшения объема опухолей в экспериментальной группе по сравнению с контрольной после двух доз ингибитора VEGF (Рис.1 А). Разница в объемах опухолей была очевидна только между группами 3 и 4, получавшими соответственно AG013925 или плацебо на протяжении 7 дней. Однако MP-измерения объема крови в тех же опухолях показали статистически достоверную разницу (Р<0.001) между группами уже после двух доз препарата, введенных в течение 24 часов (Рис1В, а также Табл.1). После семи дней соответствующих режимов эта разница, как и следовало ожидать, усилилась.

. - '-л*.

Объем крови Vb "" Объемкровн Vb Тетитифш;

Ортотопические > (% эритроцитов по

Ir ,• i***ruiinyvctuic - UUIUI UlWICthHC _____

.....In ^ . . .: *jt- ^^¡^f*""

^бп^мль7''ТЗВРжюп?^¡"дЦЩ^Р

шватж

2.4+0.1*, 2.6+0.1, - - 31+2**, 41+1,

Эксперимент п=20 п=14 п=9 п=5

, 1 д Tsw^^mwwf ЩЯ^ФЩЙЕ^Ъ

gj§23ЙШ^ ЕвуДЗШЫ ¿Аteeshfeagad шйайег! LffiSkLb 4.2+0.1», 3.2+0.1, 11.9**+2.0 3.9+0.2, п=20 п=16 , п=4 п=4

Эксперимент ЩЩ^ЩЩ^Ш ГЩШ^Т- Щ^тЩеЩр*^

Табл. 1. Объем крови, измеренный в ксенографтах MV522 и данные коррекции по гематокриту. Животные из плацебо-группы в течение 1 дня (группа 1) или 7 дней (группа 3) дважды в день получали 0,5% раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), а животные из экспериментальной группы в течение I дня (группа 2) или 7 дней (группа 4) ежедневно получали 2 дозы ингибитора VEGF-TKI2 - AG013925, гомогенизированного в 0,5% КМЦ из расчета 25 мг/кг.

В случае ортотопически имплантированных опухолей МРТ высокого разрешения (Bruker 9,4 Тл) показала наличие небольших новообразований на ободочной кишке и вокруг нее, хорошо заметных на аксиальных срезах (Рис. 2А, стрелка). Н&Е окрашивание кольцеобразных срезов препарата ободочной кишки выявило примерно совпадающие по размеру, форме и расположению опухолевые участки (Рис. 2В). Перед MP-исследованием присутствие и примерное расположение этих опухолей было выяснено при помощи колоноскопии (Рис. 2С и 2D). Поскольку для имплантации

использовалась клеточная линия аденокарциномы ободочной кишки МУ522, экспрессирующая флуоресцентный маркерный белок ОвкесО, наличие и локализацию опухоли эндоскопическое исследование обозначило совершенно однозначно. Оно также облегчило задачу выбора срезов, на которых опухоли были бы видны наиболее отчетливо.

Рис. 2. МРТ и гистология ортотопически имплантированных опухолей МУ522-Ов11ес12. А. Ободочная кишка и опухоль, МРТ, поперечный срез. В. Окрашенный гематоксилином и эозином поперечный срез ободочной кишки (аналогичный видимому на Рис. ЗА). С. Колоноскопия ободочной кишки в белом свете и Э - в «красном» В8Кес12 канале (флуоресценция возбуждалась ксеноновой лампой на 300Вт). Е. Совместное окрашивание срезов опухоли на гематоксилин/эозин и СО31. Стрелками показаны С031-положительные микрососуды.

Совместное окрашивание срезов на С1331 (маркер эндотелиальных клеток) и Н&Е обработка позволяют видеть множество микроопухолей, окруженных васкуляризованной стромой (Рис. 2Е). Очень хорошо видна инвазия опухоли в мышечную ткань.

Анализируя интенсивность сигнала томограмм мы получили значения объема

крови для разных флип-углов (40°, 60°, 80°). Самое точное значение объема крови

внутри опухоли достигается при использовании максимального угла (80°), очень

короткого (минимального) ТЕ и ТЯ=30 мс. Данные при всех трех углах позволили

исследовать зависимость объема от обмена протонами (то есть предоставили

информацию об изменении барьерной функции сосудов опухоли в результате лечения ингибитором ангиогенеза). Мы выяснили, что самый медленный обмен протонами через стенку сосудов был характерен для «пролеченных» опухолей, что согласуется с известными свойствами ингибиторов VEGFR уменьшать вызванную сверхэкспрессией сосудистого эндотелиального фактора роста гиперпроницаемость сосудов. В разделе Ш.2 приведены поправочные коэффициенты по гематокриту в опухолевой и мышечной ткани, обусловленные возможной разницей концентрации контрастного агента PGC-Gd в опухолевой и мышечной ткани путем количественной оценки фракции эритроцитов (см. Табл. 1). В разделе П1.3 представлены результатам гистологических исследований, целью которых было подтвердить соответствие МРТ-данных об изменении объема крови опухоли изменению плотности сосудов и архитектуры сосудистой сети. In vivo инъекция специфичного к фукозе меченого флуоресцентной меткой лектина позволила нам получить срезы с яркой флуоресценцией стенок сосуда в зеленом канале. Параллельно для выявления претерпевших апоптоз клеток было выполнено окрашивание TUNEL (красная флуоресценция, СуЗ-меченные анти-дигоксигенином F(ab')2 фрагменты). Такое

«двойное» окрашивание на одних и тех же срезах позволяет соотнести плотность и расположение сосудов с количеством и локализацией апоптотических клеток. Нам удалось установить, что в контрольной (плацебо) группе количество флуоресцентных (апоптотических) ядер в районе опухоли было относительно низким (7+3 клеток на 1 мм2 площади опухоли, Рис. ЗА). Плотность же сосудов в опухоли, наоборот, была чрезвычайно высока (63+20 лектин-положительных сосудов на 1 мм2 площади опухоли, Рис. ЗВ). Эти данные были подтверждены альтернативным методом определения плотности сосудов - при помощи антитела к CD31 - 80+22 сосудов/мм2. Расхождение между двумя методами определения плотности сосудов - in vivo маркировка флуоресцентным лектином и окрашивание с помощью анти-СОЗ! - не превышает 16%.

Рис. 3. Гистология контрольных опухолей (плацебо, группа 1), полученных после прижизненной инъекции животным меченного Alexa 488 лектина L. esculentum. А. Флуоресцентная микроскопия окрашенного на TUNEL (апоптоз) среза опухоли MV522. В. Окрашивание флуоресцентным лектином, отражающее плотность сосудов опухоли MV522. Отрезок, 400 мкм.

Для экспериментальной группы животных (анти-ангиогенная терапия ингибитором VEGFR2) гистологическими методами показано 7-кратное увеличение числа апоптотических клеток (48+6 клеток/мм2, Рис. 4А). Параллельно установлено 3-кратное уменьшение плотности сосудов в районе опухоли (20+10 сосудов/мм2, Рис.5В). При этом в прилегающей к опухоли мышечной ткани наблюдалась незатронутая лечением нормальная структура сосудистой сети. Следует заметить, что на границе опухоль-мышечная ткань видны TUNEL-положительные (апоптотические) клетки, выстилающие меченые лектином сосуды.

Рис. 4. Гистология опухолей MV522, подвергшихся анти-антиангиогенной терапии ингибитором VEGFR AG01395, 25 мкг/кг, перорально (группа 2), полученных после прижизненной инъекции животным меченого Alexa 488 лектина L. esculentum. А. Флуоресцентная микроскопия окрашенного на TUNEL (апоптоз) среза опухоли MV522. В. Окрашивание флуоресцентным лектином, отражающее плотность сосудов опухоли MV522. Отрезок, 400 мкм.

На срезах хорошо заметна высокая васкуляризованность мышечной ткани и почти полное отсутствие сосудов в опухоли после анти-ангиогенной терапии. Вдоль сосуда на периферии опухоли видны апоптотические клетки, схожие с клетками эндотелия, что подтверждает данные МРТ и согласуется с действием ингибитора VEGFR2-TKI (смещение баланса от выживания к апоптозу путем увеличения экспрессии белков-факторов апоптоза при неизменном уровне факторов выживаемости). Действительно, при высоком увеличении подобная картина характерна для периферии опухоли. В области лектин-положительных эндотелиальных клеток стенки сосудов небольшого диаметра (зеленый канал) видны TUNEL-положительные (красная флуоресценция) апоптотические клетки, морфологически схожие с клетками эндотелия. Таким образом, предположительно мы можем наблюдать не только свидетельства апоптоза опухолевых клеток, но и инициирующий этот процесс апоптоз эндотелиальных клеток, обусловленный анти-ангиогенной тератией ингибитором VEGFR. После 7-дневного курса лечения замечено больше TUNEL-положительных клеток, чем после 2-разового. Хорошо видно, что свободные от апоптоза области опухоли располагаются вокруг лектин- и CD31-положительных сосудов. В разделе Ш.4 представлена характеристика и релаксационные свойства парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer. Исходя из предварительных экспериментов с пероксидазой хрена в качестве модельного фермента при температуре 25°С и рН=7,4 на основании данных масс-спектроскопии (MALDI-MS с комплексами европия) мы предположили, что формируются продукты со степенью олигомеризации (N) от 2 до 7. Данные об увеличении релаксивности Gd-DTPA-disSer в присутствии ферментов пероксидазы хрена (HRP) и миелопероксидазы (МРО) представленные в Табл. 2.

' Конц., ivi "Т1,мс ТЯДШ?^-^

0.001 222 176 114

ЩШ^^'Т: [ЯГ"' nr^^ffw^prvmvm

0.0005 435 390 220

Табл. 2. Значения Т1 мономера и олигомера (в присутствии ферментов) Gd-DTPA-diSer, GE 1,5Т.

Предварительные МР-эксперименты показали, что в присутствии субстрата С(ЮТРА-с^ег и ферментной системы ПХ/ГО пероксидаза хрена может быть обнаружена в концентрации 0.04-0.4 единицы (10-100 нг). Раздел Ш.5 посвящен характеристике биоконьюгатов для специфичной визуализации молекулярных маркеров с помощью парамагнитного субстрата в(Н)ТРА-(Н8ег. Приведены типичные результаты определения молярного соотношения замещения при синтезе конъюгатов СЮ-ЗНЫН и НИР-БШИ (Табл. 3).

йО-БГОШ 6 модификаций / фермент

к И^^■ ■ ■ || I ииии—г» Д

Табл. 3. Типичные результаты определения молярного соотношения замещения при синтезе конъюгатов вО-ЗИМН и ЖР-БНЫИ.

Состав продуктов подтвержден гель-электрофорезом (Рис 6).

1 2 3 4 5

Рис. 6. Гель-электрофорез конъюгатов, исходных и промежуточных соединений. Справа: 1 - глюкозоксидаза (GO); 2,7 - mab425; 3,5- неочищенные конъюгаты, 3 -GO-mab425, 5 - HRP-mab425; 4,6 - очищенные конъюгаты (4 - GO-mab425, 6 - HRP-mab425), 8 - пероксидаза хрена (HRP). Слева - градиентный 4-15% гель-электрофорез: 1 - шаЬ425; 2-GO-SHNH; 3 - GO-mab425, 4 - HRP-SHNH, 5- HRP-mab425.

Для очистки конъюгатов (удаления не прореагировавшего антитела) применялась гель-фильтрация (колонка Superdex 200, GE). Мы убедились, что после очистки биоконъюгаты не содержат свободное антитело, которое, в случае присутствия, конкурировало бы с конъюгатами за рецепторы. В разделе Ш.6 представлены результаты исследования работы системы биоконъюгаты-парамагнитный субстрат in

vitro. Целью in vitro экспериментов было получить конъюгаты с пероксидазы

хрена/глюкозоксидазы с активным высокоспецифичным антителом к

свехэкспрессируемому в опухоли рецептору эпителиального фактора роста (EGFR) и к

семейству белков L6, являющихся маркером карциномы. Для начала мы провели

сравнительные ELISA-тесты конъюгатов для клеток, экспрессирующих EGFR на

высоком уровне (человеческая плоскоклеточная карцинома А431) и клеток, не

экспрессирующих высокий уровень EGFR (MDCK, клеточная линия эпителия почки).

Полученные результаты подтверждают активность антитела. Используя меченое 1251

антитело мы установили, что клетки А431 экспрессируют в среднем 0,91-0,92 млн

рецепторов EGFR на клетку и 1.5-2 млн антигена L6 на клетку. Дальнейшее

исследование зондов фермент-антитело исследовались на клетках А431,

экспрессирующих EGRF и L6. Был проведен ELISA-тест на клетках А431 по Протоколу

5 с целью оптимизировать концентрацию конъюгатов. Мы определили, что

концентрации в диапазоне 12,5 - 50 мкг/мл для обоих конъюгатов вполне достаточна для

полного насыщения ELISA-сигнала (и, следовательно, клеточных рецепторов).

Максимум сигнала не приходится на максимальные концентрации конъюгатов. По-

видимому, избыток HRP-mab425 конкурирует с системой HRP-GO, что приводит к

наблюдаемому уменьшению оптической плотности. Следующим этапом была

визуализация эффекта от взаимодействия бинарной системы фермент-антитело с

парамагнитным субстратом (Gd-DTPA-diSer) на суспензии клеток и клеточном осадке.

Проведенная релаксометрия показала стабильное уменьшение значений Т1 по

сравнению с контролем. Раздел Ш.7 посвящен визуализации молекулярных мишеней in

vivo. В контрольных опухолях после инъекции парамагнитного HRP субстрата Gd

DTPA-diSer наблюдалось быстрое увеличение интенсивности сигнала и постепенное

вымывание контрастного агента из опухоли (Рис. 7, вверху, кружочки) с медленным

удалением остаточного субстрата. В случае экспериментальной группы (с

предварительным введением конъюгатов с антителом против L6) наблюдалась

противоположная картина: после инъекции на протяжении всего времени исследования

происходило усиление интенсивности сигнала (Рис. 7, вверху, квадратики), соразмерное

с увеличением релаксивности субстрата в присутствии системы HRP/GO (160% через 55

минут после инъекции). На Рис. 7 (внизу) видны различия в контрасте опухоли в случае

введения GO-L6 и HRP-L6 (верхний ряд) и контроля (нижний ряд). Приведены

изображения до контраста (А) и последнее изображение после контраста, 12-е по счету (В). При «вычитании» этих изображений мы получаем изображения (С). Мы полагаем, что эта разница в контрасте на изображениях (С) обусловлена специфичным связыванием антитела с маркером-мишенью (Ь6) в случае инъекции вО-Ьб и НКР-Ь6 и его отсутствием для контрольной опухоли. Таким образом, участки с повышенной интенсивностью сигнала (Рис. 7 внизу, верхний ряд, (С), соответствуют областям накопления конъюгатов и, следовательно, парамагнитного субстрата.

<Е 130

О 130

(О "О

о?

I I

ггт

Т--

-М-т

Рис. 7. Вверху. Зависимость интенсивности МР-сигнала в опухоли, экспрессирующей маркер Ь6. Черные квадратики - инъекция бинарной системы 00-Ь6 и НЯР-Ьб, белые кружочки -контроль. Внизу. МР-изображения опухоли, экспрессирующей Ь6, до инъекции парамагнитного субстрата (А), после 55 минут (В) и «разность» изображений (А) и (В). Верхний ряд - инъекция бинарной системы вО-Ьб и НИР-Ьб, нижний - контроль.

Глава IV представляет собой обсуждение результатов и выводы. Раздел 1У.1 посвящен обсуждению результатов по мониторингу ранних гемодинамических эффектов анти-ангиогенной терапии с использованием внутрисосудистого Т1-агента. Сравнение изменений в объеме опухоли и объеме крови в опухоли в ответ на анти-ангиогенную терапию показало, что в то время, как ответ по объему крови был чрезвычайно быстрым

(после двух доз УЕОР112-ТК1 кровоснабжение опухоли уменьшилось вдвое), уменьшение объема опухоли наблюдалось только после 7 дней (14 доз) терапии. Более того, качественный анализ соотношений водного обмена через стенку сосудов в тканях контрольных и пролеченных животных выявил тканезависимую разницу в его скорости между опухолью и прилежащей мышечной тканью. Эти результаты предполагают, что УЕОРМ-ТШ эффективно подавляет рост опухолевых сосудов и самой опухоли как в эктопической, так и в ортотопической моделях карциномы ободочной кишки человека. Исключение парамагнитного РСгС-0<3 из эритроцитов в местном кровотоке могло потенциально вызвать тканезависимые неточности измерений абсолютного объема крови по причине локальных отличий в гематокрите нормальных и опухолевых сосудов. Исследование с мечеными радиоизотопом эритроцитами показало увеличение фракции красных кровяных телец в оставшихся после анти-ангиогенной терапии опухолевых сосудах. В мышечной ткани фракция эритроцитов оставалась постоянной вне зависимости от лечения ингибитором \TEGFR2. Мы полагаем, что пониженное содержание эритроцитов в опухолях у животных контрольной (плацебо) группы обусловлено аномальной архитектурой неопластических сосудов. По нашему мнению, есть два объяснения повышению содержания эритроцитов в гематокрите пролеченных опухолей. Во-первых, структурно и морфологически аномальные опухолевые сосуды могут испытывать частичную «нормализацию» в результате анти-ангиогенной терапии, приобретая схожие с нормальными свойства. Этот эффект наблюдался при помощи интравитальной микроскопии в случае терапии различными ингибиторами ангиогенеза. Вторым объяснением мы считаем возможность присутствия в опухоли фракции «захваченных» нормальных сосудов с низким степенью пролиферации эндотелиальных клеток. Такие сосуды не затрагиваются анти-ангиогенной терапией, следовательно, именно эта фракция «выживает» в процессе лечения. Следует заметить, что относительное уменьшение объема крови в ортопопических опухолях было выражено слабее, чем в эктопических. Мы полагаем, что это обусловлено изначально высокой васкуляризацией стенки толстого кишечника и, следовательно, относительно меньшему количеству неопластических сосудов с активно пролиферирующими клетками эндотелия, против которых направлена анти-ангиогенная терапия. В разделе ГУ.2 обсуждаются результаты визуализации молекулярных маркеров. Мы наблюдали селективное усиление МР-сигнала в результате совместного применения специфичного

TI-агента (Gd-DTPA-diSer) и системы биоконъюгатов фермент-антитело in vitro и in vivo. На модели подкожно имплантированной мышам карциномы А431 по сравнению с контролем (только Gd-DTPA) предварительная инъекция конъюгата дала 160%-е селективное пост-контрастное усиление сигнала: видны области накопления контраста, соответствующие связыванию антитела со своим антигеном (маркер карциномы L6). Следует заметить, что накопление контраста происходит на периферии опухоли, а не в ее центре. Это согласуется с современными представлениями об активных процессах на периферии опухоли (ангиогенез, пролиферация) и недостатке сосудов и некрозе в ее центре. В разделе FV.3 рассмотрены итоги работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработана животная модель карциномы ободочной кишки человека с эктопической (подкожной) и ортотопической (в стенку ободочной кишки) имплантацией клеток MV-522DsRed2. Ортотопическая модель осуществлена впервые и может в дальнейшем применяться в пре-клинических исследованиях.

2. Проведен МРТ-анализ анти-ангиогенных эффектов, вызванных ингибитором тирозин-киназной активности рецептора второго типа энд отели ального сосудистого фактора роста (VEGFR2-TKI). Установлено, что характерное только для опухоли уменьшение объема крови совпадает с одновременным массированным апоптозом раковых / эндотелиальных клеток, снижением плотности сосудов и их проницаемости, а также увеличением фракции эритроцитов в остаточном кровотоке опухоли. Данные результаты показывают, что использованный MP-протокол позволяет проводить неинвазивный мониторинг ранних изменений в гомеостазе опухоли, вызванных ингибиторами ангиогенеза и может быть полезен при прогнозе ответа на определенный препарат.

3. Оптимизирована методика синтеза и очистки конъюгатов ферментов (глюкозоксидазы и пероксидазы хрена) и антитела (анти-EGFR или анти-Ь6) с целью их дальнейшего использования в экспериментах по визуализации соответствующих молекулярных мишеней.

4. Установлено, что предварительная инъекция системы фермент-антитело обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности MP-сигнала in vitro и in vivo в присутствии маркеров-мишеней (EGFR, L6). На модели подкожно имплантированной мышам карциномы А431 по сравнению с контролем (Gd-DTPA), вымывающимся из кровотока, предварительная инъекция конъюгата дала 160%-е селективное пост-контрастное усиление сигнала через 55 минут. Таким образом, показана возможность in vivo визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза, что может быть использовано для изучения этих процессов, а также для «типирования» и in vivo «молекулярного окрашивания» опухолей.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. Юдина А. Ю. Магнитно-резонансная томография в диагностике и лечении рассеянного склероза. Сборник тезисов Восьмой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», 2002, Екатеринбург, с. 609-610.

2. Юдина А. Ю. Оптимизация методик магнитно-резонансной томографии на основе ткань-эквивалентного фантома. Сборник тезисов Восьмой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», 2002, Екатеринбург, с. 611.

3. Юдина А. Ю. Магнитно-резонансная томография в диагностике и лечении рассеянного склероза (особенности применения препарата "Магневист"). Сборник тезисов международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002», секция «Физика», Москва, 2002, с. 110-111.

4. Юдина А. Ю. Оптимизация параметров последовательности FLAIR в магнитно-резонансной томографии на основе ткань-эквивалентного фантома. Сборник публикаций материалов международной научной конференции "Молодые ученые-2002", Москва, с. 211-214.

5. Юдина А. Ю., Куприянов Д. А., Пирогов, Ю. А. Оптимизация методик контраста в магнитно-резонансной томографии на основе ткань-эквивалентного фантома. Препринт, типография физического ф-та МГУ им. MB Ломоносова, 2002.

6. Юдина А. Ю., Куприянов Д. А., Пирогов, Ю. А. Количественный мультюсомпонентный Т2-анализ на примере молочного фантома. Препринт, типография физического ф-та МГУ им. MB Ломоносова, 2002.

7. Юдина А. Ю. Изучение патологических процессов в головном мозге при помощи МР-релаксометрии. Сборник тезисов Девятой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», Красноярск, 2003, с. 863-865.

8. Yudina, A, Pirogov Y. Multicomponent T2-analysis and MR relaxometry methods in evaluating plaque activity. Book of abstracts of the Second International Summer

Student School "Nuclear Methods and Accelerators in Biology and Medicine. Poznan, Poland, 19-30 June 2003.

9. Юдина А. Ю., Оценка степени поражения вещества мозга при рассеянном склерозе и болезни Альцгеймера методами МРТ. Сборник тезисов Десятой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», Звенигород, 2004, с. 873-874.

Ю.Юдина А. Ю., Центр магниторезонансной томографии и спектроскопии МГУ: опыт и перспективы. Сборник тезисов Десятой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», Звенигород, 2004, с. 874-876.

11. Kim, Y, Yudina, A, Figuereido, J-L, Reichardt, W, Hu-Lowe, D, Petrovsky, A, Kang, HW, Torres, D, Mahmood, U, Weissleder, R, Bogdanov, AA, Jr. Detection of Early Antiangiogenic Effects in Human Colon Adenocarcinoma Xenografts: In vivo Changes of Tumor Blood Volume in Response to Experimental VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor. Cancer Res 2005; 65: (20). October 15,2005, pp 9253-9260.

12. Yudina A., Torres D., Bogdanov A.A. Amplification Strategy for EGF Receptor Imaging: In Vitro Optimization Proc. 4th Mtg. SMI 2005. Cologne.

13. Юдина, А, Керол, M, Чен, Д, Богданов, А. А. мл. Специфичный к миелопероксидазе контрастный MP-агент для определения активных атеросклеротических бляшек. Медицинская физика, 2005, Ms4, стр. 50-53.

14. Raman, V, Artemov, D, Winnard, P, Yudina, A, Pathak, AP, Bogdanov, A, Jr, Bhujwalla, ZM. Hypoxic regions are characterized by low vascular volume and high permeability: A combined MR and optical imaging study of a human prostate cancer model. Cancer Res, In Press

15. Bogdanov, A Jr., Kang, HW, Bennett, D, Querol, M, Yudina, A, Verel, A, Sotak, S. Tumor-targeted enzyme mediated MR signal amplification using paramagnetic substrates. Abstract for ISMRM-06, Seattle.

»-432*

Подписано к печати рг.Уб

Тираж /00 Заказ

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Юдина, Анна Юрьевна

Введение.стр.

Глава I. Литературный обзор

1.1 Ангиогенез: непременное условие для роста ракового новообразования.стр.

1.1.1 Ангиогенез и онкогенез.стр.

1.1.2 Механизмы ангиогенеза.стр.

1.1.3 Особенности опухолевых сосудов.стр.

1.2 Биохимия ангиогенеза.стр.

1.2.1 Ангиогенный переключатель.стр.

1.2.2 Основной игрок: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецепторы.стр.

1.2.2.1 VEGF— ключевой фактор ангиогенеза

1.2.2.2 Семейство VEGF

1.2.2.3 Рецепторы VEGF

1.2.2.4 Регуляция экспрессии VEGF

1.2.2.5 Биологическое действие VEGF

1.2.3 Эпителиальный фактор роста и его рецептор.стр.

1.2.4 Прочие про-ангиогенные факторы.стр.

1.3 Анти-ангиогенез.стр.

1.3.1 Эндогенные анти-ангиогенные факторы.стр.

1.3.2 Обоснование анти-ангиогенной терапии.стр.

1.3.3 Обзор современных анти-ангиогенных препаратов.стр.

1.3.4 Гипотеза о нормализации сосудов. Потребность в надежных биомаркерах раннего ответа на анти-ангиогенную терапию.стр.

Глава И. Материалы и методы

II. 1 Клеточная культура.л.стр.

11.2 Флуоресцентные пробы.стр.

11.3 Контрастные MP-агенты.стр.

11.3.1 Gd-DTPA («Магневист»)

11.3.2 PGC-Gd

И.3.3 Gd-DTPA-diSer

11.4 МР-релаксометрия в изучении ангиогенеза.стр.

11.4.1 Метод релаксометрии.стр.

11.4.2 Описание РЧ-последовательностей для релаксометрии.стр.

11.5 MP-оценка изменения объема крови в опухоли, проницаемости сосудов и прочих параметров методами МРТ.стр.

11.5.1 Т1-метод оценки гемодинамических параметров. Описание последовательности SPGR.стр.

11.5.2 Опухолевые модели.'.стр.

И.5.3 Магнитно-резонансное исследование мышей и анализ данных.стр.

11.5.4 Радиоизотопное исследование по определению фракции эритроцитов для коррекции значений абсолютного объема крови.стр.

11.5.5 Коррекция.значений Vb.стр.

11.5.6 Гистологические методы для подтверждения соответствия данных МРТ происходящим в тканях процессам.стр.

II.6 Визуализация молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза методом магнитно-резонансной амплификации.стр.

11.6.1 Метод магнитно-резонансной амплификации.стр.

11.6.2 Синтез конъюгатов HRP-mab425 и GO-mAb425 (mAb Clone 425, anti-EGFR, Merck R&D).стр.

11.6.3 Определение концентрации белка методом ВСА.стр.

11.6.4 Электрофорез SDS-PAGE (с додецилсульфонатом натрия).стр.

11.6.5 Определение молярного соотношения замещения (Molar Substitution Ratio - MSR) для промежуточных продуктов GO-SHNH, HRP-SHNH, mab-SFB).стр.

11.6.6 Гель-фильтрация (гель-хроматография).стр.

11.6.7 Количественное определение EGFR на клеточной культуре (методом ELISA).стр.

11.6.8 Тест конъюгатов на клеточной культуре (МРТ).стр.

11.6.9 In vivo MP-эксперимент. Визуализация маркера карциномы L6.стр.

Глава III. Результаты

III. 1. Объем опухоли и объем крови в опухоли. Магнитно-резонансная томография ангиогенеза.'."„.'.'.стр.

III.2 Поправочные коэффициенты по гематокриту в опухолевой и мышечной ткани.стр.

Ш.З Результаты гистологических исследований (изменения микрососудов в ответ на анти-ангиогенную терапию VEGFR2-TKI).'.стр.

111.3.1 Гистология препаратов контрольной группы.стр.

111.3.2 Гистология препаратов экспериментальной группы (терапия VEGFR2-TK1).стр.

111.4 Характеристика и релаксационные свойства парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer.стр.

111.5 Характеристика биоконъюгатов для специфичной визуализации молекулярных маркеров с помощью парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer.стр.

111.6 In vitro исследования работы системы биоконъюгаты-парамагнитный субстрат.стр.

111.7 Визуализация молекулярных мишеней in vivo.стр.

Глава 4. Обсуждение результатов и выводы

IV.1 Обсуждение результатов по анализу гемодинамических параметров.стр.

IV.2 Обсуждение результатов по визуализации молекулярных маркеров.стр.

IV.3 Основные итоги работы.стр.

Общее примечание.стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров"

Ангиогенезом называют формирование новых сосудов на базе существовавших ранее. Более 25 лет назад Judah Folkman впервые сформулировал основные положения теории взаимосвязи ангиогенеза и онкогенеза [1]: (i) большинство первичных солидных опухолей проходит через стадию небольшой аваскулярной массы (размерами 1-2 мм в диаметре), могущей длительное время находиться в неактивном, «спящем» состоянии. При этом кислород и питательные вещества доставляются в процессе пассивной диффузии; (п) эти микрообразования каким-то образом могут «включить» ангиогенез, заставляя окружающие сосуды выпускать «ростки» в сторону опухоли, которые впоследствии интегрируются в опухолевую массу. Этим самым новообразование получает возможность роста и метастазирования (через кровоток); (iii) ангиогенный «переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов роста; (iv) рост опухоли можно остановить путем блокирования ангиогенеза, либо через «переключатель» либо напрямую разрушая эндотелиальные клетки новых сосудов. Последний подход предполагает, что новообразованные сосуды по своей структуре и клеточному составу отличаются от зрелых «обычных» сосудов; (v) будучи успешным, такой терапевтический подход направлен на лишение раковой опухоли возможности расти и метастазировать; в лучшем случае это может привести к ее регрессу до 1-2 мм в диаметре и достижению «спящей» стадии, когда выживание уже не зависит от наличия кровеносной сети.

В настоящее время анти-ангиогенная терапия является одним из самых перспективных направлений в терапии раковых заболеваний, причем особенно эффективен «двойной удар» -совместно с цитотоксической терапией, направленной против опухолевых клеток. Идут клинические испытания эндогенных ингибиторов ангиогенеза (эндостатин, ангиостатин, тромбоспондин), антител против ключевых ангиогенных факторов (VEGF, интегрины) и низкомолекулярных ингибиторов' тирозин-киназной активности их рецепторов (VEGFR2-TKI). Первый анти-VEGF препарат (bevacuzimab, Genentech, Inc., San Francisco, CA) уже одобрен в США для лечения метастатического рака кишечника совместно с химиотерапией, десятки находятся на различных стадиях клинических испытаний.

Особо остро встает вопрос об эффективном мониторинге действия анти-ангиогенных препаратов при клинических испытаниях для определения оптимальной биологически активной дозы и «временного окна» для введения. Пока, несмотря на явные положительные результаты, клинические исследования ингибиторов ангиогенеза не оправдали радужных перспектив, возникших после пре-клинических исследований. По крайней мере, частично, это обусловлено сложностью дизайна клинических исследований в этой области. Терапия не цитотоксична - это благоприятно для пациента, но определение оптимальных биологически активных доз и оценка ответа на терапию представляют большую проблему. Подход, применяемый в химиотерапии - максимально возможная доза - является неприемлемым для анти-ангиогенной терапии, поскольку а) побочные эффекты этих лекарств все еще непредсказуемы и б) наиболее эффективная доза может быть намного меньше максимальной. С другой стороны, оценка оптимальной дозы по измерению уменьшения размеров опухоли или времени прогресса болезни не представляется практически обоснованной, поскольку сам механизм действия анти-ангиогенных препаратов таков, что до появления видимого уменьшения размеров опухоли могут пройти многие месяцы и даже годы. Кроме того, в большинстве случаев раковые опухоли крайне гетерогенны и поэтому индивидуальные особенности будут иметь очень большое влияние на исход терапии. Следовательно, для получения статистически достоверных результатов нужны систематические, охватывающие большое число пациентов, а, следовательно, очень дорогостоящие клинические исследования.

Таким образом, возникает потребность в определении надежных биомаркеров раннего ответа на анти-ангиогенную терапию, по которым можно будет предсказать последующий клинический эффект. Такие биомаркеры будут полезны не только для облегчения клинических исследований новых препаратов, но и для определения индивидуальной схемы лечения для каждого пациента.

Выше уже упоминалось длительное время, необходимое для видимых морфологических изменений в опухоли. Несмотря на то, что клинический ответ на терапию ингибиторами ангиогенеза является медленным, некоторые метаболические и физиологические изменения можно зафиксировать уже вскоре после начала лечения. Поскольку терапия ингибиторами ангиогенеза направлена на аномальные опухолевые сосуды, то естественно предположить на роль маркеров такие гемодинамические параметры, как объем крови в опухоли, поток крови через опухоль, проницаемость опухолевых сосудов и их плотность. Еще одним подходом является дизайн контрастных агентов, взаимодействующих с молекулярными маркерами ангиогенеза. Поскольку ингибиторы ангиогенеза специфичны по отношению к определенным ангиогенным молекулам (VEGF, EGFR, aVp3 ) или же косвенным способом направлены па их подавление их активности, то оценка изменения количества в опухоли даст представление о ходе терапии. Также показано, что эти факторы могут представлять собой диагностическую и прогностическую ценность. Помимо прочего, для индивидуализации терапии было бы крайне ценным так называемое «типирование» опухолей, то есть создание индивидуального профиля по ключевым молекулярным маркерам. Мониторинг этих факторов в процессе лечения был бы также крайне полезен.

Самым простым способом, позволяющим следить за терапевтическим эффектам, является биопсия опухоли. Однако частое взятие биопсийного материала из опухоли миогие врачи считают слишком обременительным для пациентов. Намного более предпочтительной была бы неинвазивная методика исследования новообразования. При биопсии гетерогенность опухоли не позволяет надеяться увидеть картину в целом, а не локально, да и погрешность в зависимости от области опухоли будет велика. Возникает потребность в воспроизводимой методике, которая бы позволяла проводить мониторинг всей опухоли в целом или отдельных ее областей.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) является незаменимым инструментом при изучении ангиогенеза in vivo, поскольку а) это неинвазивная методика б) она позволяет делать множество повторных воспроизводимых снимков с хорошим анатомическим разрешением в) не сопровождается ионизирующим излучением г) позволяет измерять абсолютный объем крови, изменение которого предшествует регрессии опухоли. Современные достижения в молекулярной МРТ также позволяют неинвазивно исследовать молекулярные мишени, однако возможности визуализации молекулярных биомаркеров рака пока являются ограниченными.

Цель данной работы заключается в изучении методами МРТ биомаркеров ангиогенеза и раннего ответа на анти-ангиогенную терапию в карциномах человека на животных моделях.

Для достижения этой цели поставлено ряд задач.

2. Определить содержание эритроцитов для нахождения поправки по распределению контрастного МР-агента.

3. Иммуногистохимическими методами показать соответствие данных МРТ сопровождающим анти-ангиогенную терапию и ангиогенез изменениям.

Защищаемые положения

2) Рассчитанные по изменению интенсивности MP-сигнала после внутривенного введения PGC-Gd гемодинамические параметры (абсолютный объем крови в опухоли) позволяют неивазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии.

3) В присутствии перекиси водорода и фермента-оксиредуктазы (например, пероксидазы хрена) парамагнитный субстрат Gd-DTPA-diSer олигомеризуется с образованием продуктов, укорачивающих Т1 накапливающих их областей в большей степени, нежели мономер (эффект магнитно-резонансной амплификации).

4) Система конъюгатов пероксидаза хрена-антитело и глюкозоксидаза-антитело обеспечивает селективный эффект магнитно-резонансной амплификации путем доставки оксиредуктазы и генерирования Н202 in situ. Предварительная инъекция системы биоконъюгатов обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности MP-сигнала в присутствии маркеров-мишеней in vitro и in vivo.

Новизна работы

На примере экспериментального тирозин-киназного ингибитора VEGF-рецептора второго типа показано, что разработанный МРТ-метод может применяться для оценки ранних анти-ангиогенных эффектов в ксенографтах аденокарциномы кишечника человека.

Впервые осуществлена эктопическая животная модель аденокарциномы кишечника человека.

Практическая ценность работы

Так, примененный MP-подход позволяет неинвазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии (изменение объема крови), предшествующие морфологическим изменениям (регрессу опухоли). При внедрении в клинику данная схема позволит проводить мониторинг анти-ангиогенного лечения и корректировать терапевтическую схему, исходя из ответа конкретного пациента.

Исследование ангионеза и анти-ангиогенеза, проведенное в данной работе, имеет большое значение для понимания причин, ведущих к активации этих процессов. Апробация работы

Москва, 2004), а также на международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2002-2003 гг.). Принят тезис на 14ю международную конференцию International Society for Magnetic Resonance in Medicine (ISMRM-14, Сиэтл, 2006). Был сделан доклад на семинаре ЦМТС МГУ «Магнитный резонанс в биологии, химии и медицине». Публикации

Работа состоит из введения, обзора литературы с постановкой задачи, описания методик теоретических расчетов и экспериментов, описания результатов, их обсуждения и выводов, а также списка цитируемой литературы. Диссертация включает 111 страниц текста, 37 рисунков и 11 таблиц. Список литературы содержит 120 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Юдина, Анна Юрьевна

IV.3 Основные результаты работы

2. Проведен МРТ-анализ анти-ангиогенных эффектов, вызванных ингибитором тирозин-киназной активности рецептора второго типа эндотелиального сосудистого фактора роста (VEGFR2-TKI). Установлено, что характерное только для опухоли уменьшение объема крови совпадает с одновременным массированным апоптозом раковых / эндотелиальных клеток, снижением плотности сосудов и их проницаемости, а также увеличением фракции эритроцитов в остаточном кровотоке опухоли. Данные результаты показывают, что использованный МР-протокол позволяет проводить неинвазивный мониторинг ранних изменений в гомеостазе опухоли, вызванных ингибиторами ангиогенеза и может быть полезен при прогнозе ответа на определенный препарат.

4. Установлено, что предварительная инъекция системы фермент-антитело обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности MP-сигнала in vitro и in vivo в присутствии маркеров-мишеней (EGFR, L6). На модели подкожно имплантированной мышам карциномы А431 по сравнению с контролем (Gd-DTPA), вымывающимся из кровотока, предварительная инъекция конъюгата дала 160%-е селективное постконтрастное усиление сигнала через 55 минут. Таким образом, показана возможность in vivo визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза, что может быть использовано для изучения этих процессов, а также для «типирования» и in vivo «молекулярного окрашивания» опухолей.

Общее примечание

Особая благодарность выражается профессору Ю.А. Пирогову (директору ЦМТС МГУ им. М.В.Ломоносова), под чьим руководством автор осваивала теорию и методики исследований в области магнитно-резонансной томографии. Автор выражает признательность за все рекомендации и указания, а также поддержку во время выполнения части экспериментов в руководимом им центре. Следует также поблагодарить А.В.Петряйкина и Д.А. Куприянова за комментарии и советы по поводу постановки экспериментов по релаксометрии и фантомным исследованиям. Автор выражает признательность профессору В.А. Твердислову (заведущему каф. биофизики, физический факультет МГУ) за общее руководство работой и ценные замечания. Научная идея использования эффекта магнитно-резонансной амплификации для визуализации молекулярных маркеров-мишеней принадлежит А.А. Богданову мл. Часть данной работы была выполнена под его руководством в Центре по исследованиям в области молекулярной томографии (CMIR) Гарвардской Медицинской Школы (Бостон, США) и в Университете Массачусетса (Вустер, США) во время годичной стажировки автора. Автор выражает личную признательность А. А. Богданову за ценные практические указания при изучении молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза и полезные критические замечания по работе. Ощутимую помощь при выполнении данной работы оказали также др. М. Керол (синтез парамагнитных субстратов), Ж-Л. Фигуэрейдо (имплантация клеток в стенку ободочной кишки) и др. Й. Ким (метод измерения объема крови в опухоли, анализ данных).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

6. Юдина А. Ю., Куприянов Д. А., Пирогов, Ю. А. Количественный мультикомпонентный Т2-анализ на примере молочного фантома. Препринт, типография физического ф-та МГУ им. MB Ломоносова, 2002.

8. Yudina, A, Pirogov Y. Multicomponent T2-analysis and MR relaxometry methods in evaluating plaque activity. Book of abstracts of the Second International Summer Student School "Nuclear Methods and Accelerators in Biology and Medicine. Poznan, Poland, 1930 June 2003.

10. Юдина А. Ю., Центр магниторезонансной томографии и спектроскопии МГУ: опыт и перспективы. Сборник тезисов Десятой Всероссийской Научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, секция «Биофизика и медицинская физика», Звенигород, 2004, с. 874-876.

12. Yudina A., Torres D., Bogdanov A.A. Amplification Strategy for EGF Receptor Imaging: In Vitro Optimization Proc. 4th Mtg. SMI 2005. Cologne.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Юдина, Анна Юрьевна, Москва

1. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971 ;285:1182— 6.

2. Tziana Tonini, Francesca Rossi and Pier Paolo Claudio. Molecular basis of angiogenesis and cancer. Oncogene (2003) 22, 6549-6556.

3. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. V6/3. P.289-395.

4. Р. Т. Нигматуллин, Ш. С. Минигазимов. Экспериментально-морфологические исследования стимулятора ангиогенеза. Регенеративная хирургия, 2005 №1.

5. Folkman, J., Shing, Y. Angiogenesis. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 267, No. 16, Issue of June 5. pp. 10931-10934,1392.

6. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. Vol.438 (Dec 2005).

7. Kerbel, R.S. Tumor angiogenesis: past, present and near future. Carcinogenesis. Vol. 21, #3,pp 505-515,2000.

8. Yancopoulos, G, Davis, S, Gale, NW, Rudge, JS, Wiegand, SJ, Holash, J. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. Vol. 407, pp 242-248 (2000).

9. О. E. Новак, И. О. Лисняк, В. Ф. Чехун. Ангиогенез в развитии злокачественных опухолей: теоретические и практические аспекты. Онкология. Т. 4. №4 2002, стр. 244-251

10. Бокерия А.А., Еремеева М.В. Современные состояния и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сосудистая хирургия .- 2000.- №2,- С. 57 61.

11. Manoj Kumar Gupta, Ren-Yi Qin. Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis. World J Gastroenterol 2003;9(6):1144-1155

12. Baish, J. W. & Jain, R. K. Fractals and cancer. Cancer Res. 60, 3683-3688 (2000).

13. Jain, R. Molecular regulation of vessel maturation. Nature Medicine, Vol. 9/6, P. 685693,2003.

14. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M. & Jain, R. K. Interstitial pH and p02 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Med. 3,177—182 (1997).

15. Hanahan D., Folkman, J. Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch during Tumorigenesis. Cell, Vol. 86,353-364, 1996).

16. O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Chen, C., and Folkman, J. (1996). Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Med. 2, 689-692.

17. Miquerol, L., Langille, B. L. & Nagy, A. Embryonic development is disrupted by modest increases in vascular endothelial growth factor gene expression. Development 127, 3941— 3946 (2000).

18. Gerber, H. P. et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126,1149-1159(1999).

19. Alon, T. et al. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nature Med. 1, 1024-1028 (1995).

20. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, et al: Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 219:983-985, 1983)

21. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, et al: Vascular, endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 246:1306-1309,1989)

22. Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnurch H, et al: High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell 72:835-846, 1993).

23. Ferrer FA, Miller LJ, Lindquist R, et al: Expression of vascular endothelial growth factor receptors in human prostate cancer. Urology 54:567-572,1999.

24. Price DJ, Miralem T, Jiang S, et al: Role of vascular endothelial growth factor in the stimulation of cellular invasion and signaling of breast cancer cells. Cell Growth Differ 12:129-135,2001).

25. Hiratsuka S, Minowa O, Kuno J, et al: Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 95:9349-9354,1998.

26. Dunk C, Ahmed A: Vascular endothelial growth factor receptor-2-mediated mitogenesis i negatively regulated by vascular endothelial growth factor receptor-1 in tumor epithelial cells. Am J Pathol 158:265-273, 2001.

27. Barleon B, Sozzani S, Zhou D, et al: Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood 87:3336-3343,1996.

28. Chen WS, Kitson RP, Goldfarb RH: Modulation of human NK cell lines by vascular endothelial growth factor and receptor VEGFR-1 (FLT-1). In Vivo 16:439-445,2002).

29. Autiero M, Waltenberger J, Communi D, et al: Role of P1GF in the intra- and intermolecular cross talk between the VEGF receptors Fltl and Flkl. Nat Med 9:936-943, 2003),

30. Hicklin, DJ, Ellis, LM. Role of the Vascular Endothelial Growth Factor

31. Pathway in Tumor Growth and Angiogenesis. Journal of Clinical Oncology, Vol. 23, #5 (2005). .

32. Akagi M, Kawaguchi M, Liu W, et al: Induction of neuropilin-1 and vascular endothelial growth factor by epidermal growth factor in human gastric cancer cells. Br J Cancer 88:796-802,2003.

33. Kumar R, Yarmand-Bagheri R: The role of HER2 in angiogenesis. Semin Oncol 28:2732,2001.

34. Yang W, Klos K, Yang Y, et al: ErbB2 overexpression correlates with increased expression of vascular endothelial growth factors A, C, and D in human breast carcinoma. Cancer 94:2855-2861,2002).

35. Eller JL, Longo SL, Hicklin DJ, et al: Activity of anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody C225 against glioblastoma multiforme. Neurosurgery 51:10051014,2002).

36. Yano S, Muguruma H, Sone S: Non-small cell lung cancer: 1) Molecular-target therapy. Nippon Naika Gakkai Zasshi 92:318-323,2003.

37. Reinmuth N, Liu W, Fan F, et al: Blockade of insulin-like growth factor 1 receptor function inhibits growth and angiogenesis of colon cancer. Clin Cancer Res 8:3259-3269, 2002

38. Akagi Y, Liu W, Zebrowski B, et al: Regulation of vascular endothelial growth factor expression in human colon cancer by insulin-like growth factor-I. Cancer Res 58:40084014,1998).

39. Dong J, Grunstein J, Tajada M, et al: VEGF-null cells require PDGFR signaling mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis. EMBO J 23:2800-2810,2004)

40. Gately S: The contributions of cyclooxygenase- 2 to tumor angiogenesis. Cancer Metastasis Rev 19:19-27, 2000.

41. Yao M, Kargman S, Lam EC, et al: Inhibition of cyclooxygenase-2 by rofecoxib attenuates the growth and metastatic potential of colorectal carcinoma in mice. Cancer Res 63:586-592,2003.

42. Tsujii M, Kawano S, Tsuji S, et al: Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells. Cell 93:705-716, 1998.

43. Копнин, Б. П. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров, Инет).

44. Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al: Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Am J Pathol 146:1029-1039,1995.

45. Dvorak HF: Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: A critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy. J Clin Oncol 20:4368-4380, 2002.

46. Zachary I, Gliki G: Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res 49:568-581,2001.

47. Zachary I: Signaling mechanisms mediating vascular protective actions of vascular endothelial growth factor. Am J Physiol Cell Physiol 280:C1375-C1386,2001.

48. Zhang H, Wu J, Meng L, et al: Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors KDR and Flt-1 in gastric cancer cells. World J Gastroenterol 8:994-998,2002

49. Ferrara N: VEGF: An update on biological and therapeutic aspects. Curr Opin Biotechnol 11:617-624, 2000.

50. Bates DO, Harper SJ: Regulation of vascular permeability by vascular endothelial growth factors. Vascul Pharmacol 39:225-237,2002.

51. Kumar R, Yoneda J, Bucana CD, et al: Regulation of distinct steps of angiogenesis by different angiogenic molecules. Int J Oncol 12:749-757, 1998.

52. Ferrara N, Davis-Smyth T: The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev 18:4-25, 1997.

53. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9:669-676,2003.

54. Gerber H, McMurtrey A, Kowalski J, et al: Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival by the PI3-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-l/KDR activation. J Biol Chem 273:30336-30343,1998.

55. Gerber HP, Dixit V, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in vascular endothelial cells. J Biol Chem 273:13313-13316,1998.

56. B.A. Бурлев, A.C. Гаспаров, H.C. Аванесян, Н.И. Волков, Д.А. Стыгар. Факторы роста и их роль в регуляции репродуктивной функции у больных с синдромом поликистозных яичников. Проблемы репродукции, N3-1998, с.17-25.

57. Alroy I, Yarden Y. The ErbB signaling network in embryogenesis and oncogenesis: signal diversification through combinatorial ligand-receptor interactions. FEBS Lett 1997;410:83-6.

58. Ullrich A, Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 1990;61:203-12.

59. Shoelson SE. SH2 and PTB domain interactions in tyrosine kinase signal transduction. Curr Opin Chem Biol 1997;1:227-34.

60. Prenzel N, Fischer OM, Streit S, Hart S, Ullrich A. The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification. Endocr Relat Cancer 2001;8:11-31.

61. Davis RJ. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. Cell 2000;103:239-52.

62. Ballif BA, Blenis J. Molecular mechanisms mediating mammalian mitogen- activated protein kinase (МАРК) kinase (MEK)-MAPK cell survival signals. Cell Growth Differ 2001;12:397-408.

63. D'Errico A, Barozzi C, Fiorentino M, Carella R, Di Simone M, Ferruzzi L, et al. Role and new perspectives of transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) in adenocarcinoma of the gastro-oesophageal junction. Br J Cancer 2000;82:865-70.

64. Yacoub L, Goldman H, Odze RD. Transforming growth factor-alpha, epidermal growth factor receptor, and MiB-1 expression in Barrett'sassociated neoplasia: correlation with prognosis. Mod Pathol 1997;10:105-12.

65. Humphrey PA, Gangarosa LM, Wong A J, Archer GE, Lund-Johansen M, Bjerkvig R, et al. Deletion-mutant epidermal growth factor receptor in human gliomas: effects of type II mutation on receptor function. Biochem Biophys Res Commun 1991;178:1413-20.

66. Moscatello DK, Montgomery RB, Sundareshan P, McDanel H, Wong MY, Wong AJ. Transformational and altered signal transduction by a naturally occurring mutant EGF receptor. Oncogene 1996;13:85-96.

67. Grunvald, V., Hidalgo, M. Developing Inhibitors of the Epidermal Growth Factor Receptor for Cancer Treatment. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 95, No. 12, June 18,2003.

68. Suri, C. et al. Requisite role of Angiopoietin-1, a ligand for the Tie2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell SI, 1171-1180 (1996).

69. Stratmann, A., Risau, W. & Plate, К. H. Cell type-specific expression of Angiopoietin-1 and Angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis. Am. J. Pathol. 153, 1459-1466 (1998).

70. Zagzag, D. et al In Situ expression of angiopoietins in astrocytomas identifies angiopoietin-2 as an early marker of tumor angiogenesis. Exp. Neurol. 159, 391-400 (1999).

71. Huang, Z, Bao S-D. Roles of main pro- and anti-angiogenic factors in tumor angiogenesis. World J Gastroenterol 2004; 10(4):463-470.

72. Sun X, Kanwar JR, Leung E, Lehnert K, Wang D, Krissansen GW. Angiostatin enhances B7.1-mediated cancer immunotherapy independently of effects on vascular endothelial growth factor expression. Cancer Gene Ther 2001; 8: 719-727.

73. Dixelius J, Larsson H, Sasaki T, Holmqvist K, Lu L, Engstrom A, Timpl R, Welsh M, Claesson-Welsh L. Endostatin-induced tyrosine kinase signaling through the shb adaptor protein regulates endothelial cell apoptosis. Blood2000; 95: 3403-3411.

74. Jimenez B, Volpert OV, Crawford SE, Febbraio M, Silverstein RL, Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med2000', 6:41-48.

75. Jimenez B, Volpert OV, Crawford SE, Febbraio M, Silverstein RL, Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 2000;6:41-48.

76. Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann Surg 1972;175:409-16.

77. Folkman J. Successful treatment of an angiogenic disease. N Engl J Med 1989;320:1211-2.

78. Eskens, F. Angiogenesis inhibitors in clinical development; where are we now and where are we going? British Journal of Cancer (2004) 90(1), 1 7.

79. Фильченков A.A. Терапевтическое использование модуляторов апоптоза в онкологической практике: реалии и перспективы. Труды научно-практической конференции «Онкология-XXI», Киев, 9-10 окт. 2003.

80. Folkman, J. Clinical Applications Of Research On Angiogenesis. Seminars in Medicine Of the Beth Israel Hospital, Boston. Vol. 333 No. 26, pp 1757-1753.

81. Dupont J, Camastra D, Gordon M, Mendelson D, Murren J, Hsu A, Lucarelli A, Cedarbaum J, Spriggs D (2003) A phase I study of VEGF trap in patients with solid tumors and lymphoma. Proc Am Soc Clin Oncol 22: 194 (abstract 776).

82. E. В. Степанова. Антиангиогенная терапия: новые возможности лечения злокачественных заболеваний. Практическая онкология, Т.З, №4-2002, стр. 246-252.

83. Ma J, Pulfer S, Li S, Chu J, Reed K, and Gallo JM (2001) Pharmacodynamic-mediated reduction of temozolomide tumor concentrations by the angiogenesis inhibitor TNP-470. Cancer fles 61:5491-5498.

84. Murata R., Nishimura Y., Hiraoka M. An antiangiogenic agent (TNP-470) inhibited reoxygenation during fractionated radiotherapy of murine mammary carcinoma. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 37: 1107-1113,1997.

85. Jain, R. Normalization of Tumor Vasculature: An Emerging Concept in Antiangiogenic Therapy. Science. Vol. 307 (2005), pp. 58-62.

86. Miller , CJ, Pien, HH, Sahani , D, Sorensen , AG, Thrall, JH. Imaging Angiogenesis: Applications and Potential for Drug Development. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 97, No. 3, 2005.

87. Petrovsky A, Schellenberger E, Josephson L, Weissleder R, Bogdanov A, Jr. Near-infrared fluorescent imaging of tumor apoptosis. Cancer Res 2003;63:1936-42.

88. Чернышова Т. П., Фантомное моделирование ЯМР-свойств головного мозга на основе агарозного геля с добавлением Gd-DTPA, дипломная работа, Москва, 2000.

89. Петряйкин А. В., Изучение биофизических основ отека головного мозга методом магнитно-резонансной томографии, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Москва, 1996.

90. Коновалов А. Н., Корниенко В. Н., Пронин И. Н., Магнитно-резонансная томография в нейрохирургии, 1997.

91. Bogdanov A, Jr., Weissleder R, Frank HW, et al. A new macromolecule as a contrast agent for MR angiography: preparation, properties, and animal studies. Radiology 1993;187:701-6.

92. Bogdanov A, Jr., Marecos E, Cheng HC, et al. Treatment of experimental brain tumors with thrombospondin-1 derived peptides: an in vivo imaging study. Neoplasia 1999;1:438-45.

93. Querol M, et al. DTPA-bis-amide based MR sensor agents for peroxidase imaging. Org Lett, 17: 1719 (2005).

94. Ринк П. А. «Магнитный резонанс в медицине», 1993.

95. A. Fransson, A Ericsson, B.Jung, U. Henriksson, Resolution of Biexponential Transverse Relaxation in Magnetic Resonance Imaging. Phys. Med. Biol. 34(3), 305-314 (1989).

96. Анисимов, HB, Пирогов, ЮА, Губский, JIB, Гладун, ВВ. Управление контрастом и информационные технологии в магнитно-резонансной томографии, 2005.

97. Jones С. К., Quantitative Multi-Component Тг Analysis Using Fast Spin-Echo MRI; Master of science degree, University of British Columbia, Sep 1997.

98. Shalinsky DR, Brekken J, Zou H, et al. Marked antiangiogenic and antitumor efficacy of AG3340 in chemoresistant human non-small cell lung cancer tumors: single agent and combination chemotherapy studies. Clin Cancer Res 1999;5:1905-17.

99. Funovics MA, Weissleder R, Mahmood U. Imaging enzyme activity and gene expression in vivo through a 2.7F catheter. Radiology 2004;231:659-66.

100. Cox R. AFNI: Software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Comput Biomed Res 1996;29:162-73

101. Bremer, C, Mustafa, M, Bogdanov, A, Jr, Ntziachristos, V, Petrovsky, A, Weissleder, R. Steady-State Blood Volume Measurements in Experimental Tumors with Different Angiogenic Burdens—A Study in Mice. Radiolody, Vol.226 (1), 2002, pp214-220.

102. Donahue KM, Weisskoff RM, Chesler DA, et al. Improving MR quantification of regional blood volume with intravascular T1 contrast agents: accuracy, precision, and water exchange. Magn Reson Med 1996;36: 858-67.

103. Kim Y, Rebro K, Schmainda K. Water exchange and inflow affect the accuracy of Tl-GRE blood volume measurements: implication for the evaluation of tumor angiogenesis. Magn Reson Med 2002;47:1110-20.

104. Юдина, А, Керол, M, Чен, Д, Богданов, А. А. мл. Специфичный к миелопероксидазе контрастный мр-агент для определения активных атеросклеротических бляшек. Медицинская физика, 2005, №4, стр. 50-53.

105. Yudina A., Torres D., Bogdanov А.А. Amplification Strategy for EGF Receptor Imaging: In Vitro Optimization Proc. 4th Mtg. SMI 2005. Cologne.

106. Bogdanov, A Jr., Kang, HW, Bennett, D, Querol, M, Yudina, A, Verel, A, Sotak, S. Tumor-targeted enzyme mediated MR signal amplification using paramagnetic substrates. Abstract for ISMRM-06, Seattle.

107. McDonald DM, Choyke PL. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med 2003;9:713-25.

108. Furman-Haran E, Margalit R, Grobgeld D, Degani H. Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging reveals stress-induced angiogenesis in MCF7 human breast tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:6247-51.

109. Demsar F, Roberts TP, Schwickert HC, et al. A MRI spatial mapping technique for microvascular permeability and tissue blood volume based on macromolecular contrast agent distribution. Magn Reson Med 1997;37:236-42

110. УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И ЕДИНИЦЫ ИЗМЕРЕНИЯ

111. MPT магнитно-резонансная томография РЧ - радиочастотная последовательность SE - спин-эхо

112. Tl, Т2 спин-решеточное и спин-спиновое время релаксации

113. TR время повторения, ТЕ - время эхо (параметры РЧ последовательности)1. ROI регион интереса

114. ЭКМ экстраклеточный матрикс

115. VEGF сосудистый эндотелиальный фактор роста

116. VEGFR2 рецептор второго типа сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR2-TKI - ингибитор тирозин-киназной активности VEGFR2

117. EGF эпителиальный фактор роста EGFR - рецептор EGF

118. PDGF выделенный из тромбоцитов фактор роста

119. FGF фактор роста фибробластов

120. TGF трансформ ирущий фактор роста1. ГО глкжозоксидаза (GO)

121. ПХ пероксидаза хрена (HRP)i.p. внутрибрюшинное (введение препарата)к число степеней свободы (статистика)рН водородный показатель кислотности среды

122. Р статистический уровень достоверности различий

123. Х2 статистический критерий соответствия хи-квадрат

124. А ангстремы, Мм - миллиметры, см - сантиметрымл миллилитры, М - моли, мМ - миллимоли, МкМ - микромолинг- нанограммы, мкг- микрограммы, мг- миллиграммы, г граммыкг килограммымВ- милливольты

Информация о работе

Юдина, Анна Юрьевна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы